WO2016006873A1 - 인유두종바이러스 펩타이드의 자궁경부암 진단 및 치료 용도 - Google Patents

인유두종바이러스 펩타이드의 자궁경부암 진단 및 치료 용도 Download PDF

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임종백
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연세대학교 산학협력단
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    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to the use of human papillomavirus peptides for diagnosing and treating cervical cancer, which can be overlapped with four HLA classes.
  • Cervical cancer is the second most common malignancy among women, with more than 350,000 patients dying from cervical cancer every year worldwide (Pisani P, et al. Int J). Cancer 2002; 97 (1): 72-81).
  • the main cause of cervical cancer is known as human papillomavirus (HPV), and 40 of the more than 100 HPV have been found to work in the female genital organs (de V Amsterdam EM, et al. Virology 2004; 324: 17-27).
  • HPV type 16 and HPV type 18 are most commonly found in cervical cancer patients and can be predicted to be important in tumor development (Munoz N, et al. N Engl J Med 2003; 348 (6)). : 518-27).
  • E6 and E7 are potent oncoproteins that inhibit the actions of tumor suppressors, p53 and RB. It has been shown to promote the progression and sustained growth of the furnace (zur Hausen H. Nat Rev Cancer 2002; 2 (5): 342-50). E7 inhibits the function of RB, a tumor suppressor, and promotes the activities of the S-phase genes cyclin A and cyclin E (zur Hausen H. et al.
  • HPV epitopes are peptides that can bind to a single human leukocyte antigen (HLA) class, and there is a problem of deteriorating therapeutic effects due to cognitive decline of immune cells. Indeed, in the United States, 32% of adolescents vaccinated with cervical cancer did not develop therapeutic effects on cervical infections or lesions (Hildesheim A et al. JAMA 2007; 298: 743-753; EMA. Annex I Summary of Product). Characteristics for the HPV Vaccine 'Gardasil' 2008. Updated 2012. www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Product_Information/human/000703/WC500021142.pdf).
  • HPV peptides capable of overlapping with various HLA classes is required.
  • HPV peptide capable of overlapping four types of HLA class (HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303) It includes, as an active ingredient, a composition for treating cervical cancer or a diagnostic composition using the same.
  • a peptide is a polymer of amino acids, and the linkage between amino acids means a polymer consisting of an amide bond or a peptide bond.
  • a nucleic acid is a polymer organic material in which nucleotides are polymerized in a long chain shape and is genetic information encoding a peptide of the present invention.
  • Peptides disclosed in the present invention and the nucleic acid encoding the peptide can be used as a prophylactic or therapeutic vaccine in a subject known to be infected by HPV, suspected to be infected by HPV, or can be infected by HPV. Other suitable subjects include those who exhibit symptoms of, or are likely to develop, HPV related diseases. Peptides and vaccines of the invention may be used to treat diseases associated with infection of HPV strain 18, such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papillomas, cervical dysplasia, cervical cancer, and vulvar cancer. vulval cancer, or as a vaccine to treat or prevent prostate cancer.
  • the ability of the peptides and nucleic acids of the invention to elicit an immune response can be analyzed using methods for measuring immune responses well known in the art.
  • the generation of cytotoxic T cells can be expressed using MHC tetramers, measuring intracellular cytokine expression or in a standard 51Cr release assay.
  • Standard assays such as ELISA or ELISPOT can also be used to determine cytokine profiles that contribute to T cell activation.
  • T cell proliferation can also be measured using other assays known in the art and assays such as the 3H-thymidine uptake.
  • B cell responses can be measured using an assay such as ELISA.
  • an antibody means a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the HPV peptide of the present invention.
  • Such an antibody is used to clone a protein encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. Can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding.
  • vaccine refers to a composition used for the prevention or treatment of certain diseases.
  • the vaccine may contain peptides as antigens or may be able to express antigens to induce an immune response to the antigens.
  • Vaccines comprising the peptides of the present invention can be used for the prevention or treatment of infection, transmission and spread of diseases that can be infected by HPV.
  • Diagnosis in one embodiment of the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition, for the purpose of the present invention the diagnosis is to determine whether or not HPV infection. It is contained in samples from patients suspected of HPV infection (clinically cells, blood, sap, pleural fluid, ascites, joint fluid, pus, secretions, bile, pharyngeal mucus, urine, bile, feces, etc.). HPV infection can be diagnosed by using an antibody corresponding to the HPV peptide or by directly detecting the HPV nucleic acid.
  • Diagnostic means using antigen-antibody binding include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket ( rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), protein chip, etc.
  • Direct detection of nucleic acids may include reverse transcriptase, RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, and RNase protection.
  • RNase protection assay RNase protection assay (RPA), Northern blotting, or DNA chips, but are not limited thereto.
  • kits of the present invention means a set of compositions and accessories necessary for a specific purpose.
  • the diagnostic kit of the present invention is to determine whether HPV infection.
  • Kits of the present invention may include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for assays as well as primers, probes or optionally peptide recognition antibodies for determining HPV infection.
  • the pharmaceutical composition means a composition administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is to destroy cells infected with HPV, immune cells sensitized by HPV peptides, substances capable of inducing increased activity of immune cells and pharmaceutically acceptable carriers, excipients Or diluents.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains 0.1 to 50% by weight of the active ingredient corresponding to the peptide of the present invention based on the total weight of the composition.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • when formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, water, or the like in a polysaccharide or taro extract.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Administration in one embodiment of the invention means introducing the composition of the invention to the patient in any suitable manner, the route of administration of the composition of the invention being administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the effective amount is defined as the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type and formulation of the patient and the age, body weight, general health condition, sex and diet, time of administration, route of administration And various factors, including the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used concurrently.
  • the therapeutic pharmaceutical composition can be administered once in the body in an amount of 50ml ⁇ 500ml, 0.1ng / kg-10mg / kg for a compound, 0.1ng / for a monoclonal antibody to the protein. It may be administered at a dose of kg-10 mg / kg.
  • Dosing interval may be 1 to 12 times a day, if 12 times a day may be administered once every two hours.
  • the peptides or nucleic acids of the invention can also be administered alone or as other therapies known in the art, such as chemotherapeutic agents, radiation and surgery, for the treatment of HPV infection or diseases associated with HPV infection.
  • Peptides and nucleic acids of the invention can also be administered in combination with other therapies designed to enhance an immune response, for example adjuvant or cytokines (or nucleic acids encoding cytokines), as is well known in the art. .
  • Other standard delivery methods may be used, such as biolistic delivery or ex vivo treatment.
  • antigen presenting cells for example, antigen presenting cells (APCs), dendritic cells, peripheral blood mononuclear cells, or bone marrow cells
  • APCs antigen presenting cells
  • dendritic cells dendritic cells
  • peripheral blood mononuclear cells peripheral blood mononuclear cells
  • bone marrow cells can be obtained from a patient or a suitable donor and activated in vitro with the present immune composition and then administered to the patient. have.
  • the peptide of the present invention can be administered to a subject through lipids, dendrimers or liposomes well known in the art for the purpose of promoting the activity of immune cells.
  • liposomes carrying an immunopeptide or nucleic acids encoding the peptide are known to cause a CTL response in vivo (Reddy et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148: 3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89: 5157, 1992).
  • the peptides and nucleic acids of the invention can also be administered using Immune Stimulating Complexes (ISCOMS), a 30-40 nm sized (-) occupied cage-like structure produced by the simultaneous mixing of saponin alone or cholesterol and Quil A (saponin) simultaneously. Can be. Peptides and nucleic acids of the invention can be administered simultaneously or separately from ISCOMS.
  • ISCOMS Immune Stimulating Complexes
  • screening is to select a substance having a specific characteristic of interest from a candidate group consisting of various substances by a specific manipulation or evaluation method.
  • screening of the present invention results in the inhibition of CD8 + T cell responses sensitized by a protein coated with the peptide of the present invention or a nucleic acid of the present invention after administration of a candidate substance for treating cervical cancer to a subject suspected of cervical cancer.
  • the screening method of the cervical cancer therapeutic agent which determines a candidate substance as a cervical cancer therapeutic agent.
  • Means such as molecular biological assays, digital imaging, cytological magnifications and histological examination can be used to determine the effect of the peptides and nucleic acids of the invention on papilloma virus related lesions or papilloma virus levels.
  • the purpose of the present invention is to develop an E7 peptide vaccine that reacts with the HLA class I epitope, which is the smallest unit that induces cell immune response among E7 proteins of HPV type 18, and specifically, HLA-A * 0201, A * 2402, A A vaccine was developed that was a single E7 peptide vaccine capable of double binding to four HLA types, * 1101 and A * 3303.
  • Flow cytometry was performed using HPV type 18 E7 peptides synthesized to develop specific HPV type 18 E7 epitopes that induce the production of cytotoxic T lymphocytes.
  • # 21 DDLRAFQQLFLNTLS
  • # The 23 LFLNTLSFVCPWCAS
  • peptides having a total length of 15mer are sequentially separated by 8-by-amino acid N- and C-terminal amino acids. Residue peptides having 14 amino acid sequences were developed and the effects of the residue peptides were analyzed in the same manner as above.
  • # 21-1 DLRAFQQLFLNTLS
  • # 21-1 DLRAFQQLFLNTLS
  • the amino acid at position is the most important for CD8 + CTL cell stimulation.
  • # 23-10 LFLNTLSFVCPW
  • Amino acid at position 100 and 103 was used for CD8 + CTL cell. It was found to be the most important for stimulation.
  • a peptide comprising SEQ ID NO: 1
  • the present invention provides a peptide comprising SEQ ID NO: 6, and provides a peptide further comprising one amino acid at the C terminus of SEQ ID NO: 6, wherein the peptide provides a peptide having SEQ ID NO: 7 , Provides a peptide further comprising two amino acids at the C-terminal of SEQ ID NO: 7, the peptide provides a peptide of SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid encoding any one or more of the above peptides is provided.
  • an antibody binding to any one or more of the above peptides there is provided an antibody binding to any one or more of the above peptides.
  • a vaccine composition comprising any one or more of the above peptides.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of HPV infection-related diseases comprising any one or more of the peptides and pharmaceutically acceptable carriers, wherein the HPV infection-related diseases are Bowen It provides a pharmaceutical composition, characterized in that it is bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papilloma, cervical dysplasia, cervical cancer, vulval cancer, or prostate cancer,
  • the composition provides a pharmaceutical composition for CD8 + T cell stimulation and sensitivity enhancement, wherein the pharmaceutical composition is any one or more HLA class types of HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303.
  • compositions that are patient specific.
  • microparticles, liposomes, or immune stimulating complexes comprising any one or more of the above peptides are provided.
  • microparticles, liposomes, or immune stimulating complexes comprising the above nucleic acids are provided.
  • a cervical cancer diagnostic kit comprising any one or more of the above peptides.
  • a cervical cancer diagnostic kit comprising the nucleic acid.
  • a cervical cancer diagnostic kit comprising the above antibody.
  • a method for providing information on diagnosing HPV infection as a result of a reaction of a sample from a patient suspected of HPV infection with the at least one peptide is provided.
  • a method for providing information on diagnosing HPV infection as a result of a reaction of a sample from a patient suspected of HPV infection and a substance capable of detecting the nucleic acid in another embodiment, there is provided a method for providing information on diagnosing HPV infection as a result of a reaction of a sample from a patient suspected of HPV infection and a substance capable of detecting the nucleic acid.
  • a method for providing information on diagnosing HPV infection as a result of a reaction from a sample from a patient suspected of having HPV infection and said antibody is provided.
  • the present invention provides a biomarker for diagnosing human papilloma virus infection comprising any one or more of the peptides.
  • step (b) is higher than the PBMCs activity in step (a), wherein the sample to be analyzed is determined to be a combination antiviral agent. to provide.
  • Cervical cancer is the second most common malignancy among women, and although HPV epitopes used in vaccine development have been identified as single HLA, the majority of the causes are attributed to infections of HPV type 16 and HPV type 18. (Human leukocyte antigen) Since it is a peptide capable of binding to the class, there is a problem of low therapeutic effect.
  • the EV peptide of the HPV type 18 of the present invention is a single HPV peptide capable of double binding to four HLA classes (HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303), and is easily uterine with high efficiency. It is expected to be of great use as a composition for treating cervical cancer or a diagnostic composition using the same.
  • Figure 1a-d is a result of measuring the IFN- ⁇ + spot formation rate of 15mer length HPV candidate peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a-d is a result of measuring the increase in folding of CD8 + T cells for 15mer length HPV candidate peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a-d is the result of measuring the cell lysis rate of EBV-BLCs of # 21 and # 23 peptide sensitized PBMCs according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a-b is a result of measuring the lysis rate of cervical cancer cell lines of # 21 and # 23 peptide sensitized PBMCs according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a-d is a result of measuring the IFN- ⁇ + spot formation rate of the specific residue peptides (truncated peptides) of # 21 and # 23 peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a-d is the result of measuring the EBV-BLCs cell lysis rate of PBMCs sensitized with # 21 detailed residue peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a-d is the result of measuring the EBV-BLCs cell lysis rate of PBMCs sensitized with # 23 sub residue peptides according to an embodiment of the present invention.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303 Immunoglobulin G
  • IgM immunoglobulin M
  • HCMV antibodies present in the blood of each donor were analyzed using manual latex aggregation (CMVSCAN kit, Becton Dickinson microbial system).
  • MHC Major histocompatibility complex
  • the entire amino acid sequence of human papillomavirus type 18 E7 protein was synthesized by using computer algorithms to overlap each of the sizes of 15mers, and then a high performance liquid chromatography (HPLC) instrument was used. A total of 24 peptides having a purity of 95% or more were synthesized. After selection of immunodominant candidate peptides, a 15-amino acid peptide candidate group capable of binding four types (HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303) to HLA class I was synthesized. It was stored at minus 80 ° C. in a diethylpyrocarbonate solution containing% dimethyl sulfoxide.
  • Example 3 From PBMC Autologous dendritic cells ( Autologous dendritic generation of cells)
  • PBMC obtained by centrifugation was incubated for 2 hours at 37 °C in RPMI culture (10% FBS, 5% antibiotics). Thereafter, the cells were cultured by adding interleukin-4 (IL-4, 1200U / ml) and macrophage stimulating factor (GM-CSF, 1500U / ml) to 5 ⁇ 10 6 cells / ml of cells (monocyte). Freshly added IL-4 and GM-CSF at 2, 4 and 6 days after start. At 5 days after the start of the culture, tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ , 10 ng / ml) was added for maturation of the dendrites (Lim JB, et al. Exp Hematol 2006; 34 (3): 296-). 307; Provenzano M, et al. J Immunother 2002; 25: 342-351). After maturation, dendritic cells and peptides were sensitized for at least 6 hours.
  • IL-4 interleukin-4
  • PBMC Frozen PBMC is thawed to 2 x 10 6 Cells were placed in a 2 well RPMI culture medium in each well of a 24 well culture vessel.
  • HPV18 E7 peptide 10 g / mL / well
  • 1000 IU / Ml of recombinant human IL-2 rhIL-2; PeproTech
  • rhIL-2 recombinant human IL-2
  • PeproTech was added per well.
  • dendritic cells (4-10 x 10 6 / well) generated by the above-mentioned method were added to the PBMCs, and the PBMCs treated with the dendritic cells were incubated for another week.
  • Phycoerythrin (PE) conjugated anti-interferon-gamma (anti-IFN- ⁇ ), APC-Cy7 conjugated anti-CD44, FITC conjugated anti-CD3, PerCp-Cy5.5 conjugated Anti-CD4 and APC conjugated anti-CD8 were purchased from BD Biosciences, CA. In each sample, 1 ⁇ 10 5 cells passed through the gate of flow cytometer (BD Biosciences, NJ), and positive cells were expressed as percentages for each total cell. PBMCs stimulated with phytohemagglutinin (PHA, Sigma) and peptide sensitized (1 ⁇ 10 6 cells / ml) and PBMCs stimulated with autologous dendritic cells were used as positive and negative controls, respectively.
  • PHA phytohemagglutinin
  • peptide sensitized 1 ⁇ 10 6 cells / ml
  • autologous dendritic cells were used as positive and negative controls, respectively.
  • IFN- ⁇ Antibody (Clone AN-18, Ebioscience, San Diego, Calif.) ELISPOT plates were coated overnight at 4 ° C. In the antibody-coated plates, cryopreserved PBMCs were thawed in medium (RPMI 1640 with 10% FBS), and 5 ⁇ 10 5 cells were incubated in each well. HPV18 E7 peptide was then added and incubated for 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • medium RPMI 1640 with 10% FBS
  • Biotinylated anti-mouse IFN- ⁇ detection antibody 100 ⁇ L; 1 ⁇ g / mL in PBS was added to each well, and after PBS washing, 100 ⁇ l of streptavidin-alkaline phosphatase 1: 1,000 dilution was added. It was. The plate is then incubated for 1 hour at room temperature and 100 ⁇ L of NBT solution (Bio-Rad, Berkeley, Calif.) And 100 ⁇ L of BCIP solution (Bio-Rad) are added to 10 ml of Tris-MgCl 2 buffer. One chromogenic reagent was added. Plates were dried and quantified with ELISPOT reader (software version 3.5, AID ELISpot Reader System, Strassberg, Germany).
  • ELISPOT reader software version 3.5, AID ELISpot Reader System, Strassberg, Germany.
  • a sample containing 2.5 ⁇ g / mL of Phytohemagglutinin (PHA) and a non-peptide-sensitized PBMC sample were used as a positive control and a negative control, respectively.
  • PHA Phytohemagglutinin
  • Example 7 Cervical cancer cell line culture
  • HLB-34 for HLA-A * 0201, SNU-1160 for HLA-A * 2402 Human cervical cancer cell lines (HTB-34 for HLA-A * 0201, SNU-1160 for HLA-A * 2402) were purchased from the Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) and DMEM at 37 ° C, 5% CO 2 Cultured in medium (10% FBS and 1% antibiotic addition).
  • HLA class I restricted (Dr. David Stroncek, in NIH) immortal Epstein-Barr virus-B lymphoblastic cell line (EBV-BLC) was run on 37 ° C, 5% CO 2 Incubated with% FBS and 1% antibiotic). Cells were periodically tested for mycoplasma infection.
  • Cytotoxicity experiments were performed using the 51Cr release detection method using cervical cancer cell lines as target cells. Briefly, 51Cr (100 mCi / 10 6 cells; Perkin Elmer, Waltham, Mass.) was added to each HLA class I restricted 4 x 10 3 cells / well cervical cancer cell line and incubated for 45 minutes at 37 ° C. Peptide sensitized PBMC as effector was added to the target cells in the ratio of 10: 1, 30: 1, 50: 1, and 100: 1, and the supernatant of the cultured cell medium was added to the WIZARD2 Automatic Gamma Counter, Perkin. Elmer).
  • cytotoxic T cell specific target cell death was calculated using the formula [(experimental cpm-spontaneous cpm) / (maximum cpm-spontaneous cpm)] ⁇ 100 (Bao L, et al. Biol Blood Marrow Transplant 2008; 14: 1156-1162).
  • HLA-A * 0201, A * 1101 and A * 3303 the # 23 and # 21 peptides showed the first and second highest IFN- [gamma] + spot formation, respectively (FIGS. 1A, 1C, 1D).
  • # 21 showed slightly higher spot formation than # 23 peptide (FIG. 1B).
  • # 21 and # 23 peptides showed at least 3-fold higher spot formation than negative controls, indicating that the tested peptides exhibited high sensitization to PBMCs at levels close to the positive controls. .
  • EBV-BLCs HLA-matched Epstein Barr virus-B lymphoblastoid cells
  • Toxicity experiments were conducted.
  • EBV-BLCs cells have an HLA-peptide complex that can bind to # 21 and # 23 peptides on the surface.
  • all HLA class I type CTLs cells sensitized by # 21 and # 23 peptides lysed more EBV-BLCs cells loaded with # 21 and # 23 peptides (FIG. 3).
  • the ratio of PBMCs sensitized by # 23 peptide to lyse EBV-BLCs cells loaded with # 23 peptide was slightly higher than that of # 21. As a result, it was found that # 21 and # 23 peptides were successfully recognized by CD8 + CTLs cells.
  • the # 21 and # 23 peptides are effective in both naturally occurring cervical cancer cell lines, and are useful as HLA-A * 0201 and HLA-A * 2402 type immunogenic epitopes (epitopes). .
  • HLA-matched Epstein Barr virus-B lymphoblastoids as target cells. cell, EBV-BLCs
  • EBV-BLCs EBV-BLCs
  • # 21 peptide FIG. 6
  • CD8 + CTL cells of HLA-A * 0201 and A * 2402 types were EBV sensitized by peptides of # 21-1, # 21-8 and # 21-10 compared to the negative control.
  • -BLCs cells were more lysed (FIGS.
  • CD8 + CTL cells of HLA-A * 0201, A * 1101 and A * 3303 types had more EBV-BLCs cells sensitized by the peptides of # 23-10 compared to the negative control.
  • 7A, 7C-D, and HLA-A * 2402 type CD8 + CTL cells lysed more EBV-BLCs cells sensitized by peptides of # 23-9 and # 23-10 (FIG. 7B). .
  • SEQ ID NO: 6 LFLNTLSFVCPW
  • SEQ ID NO: 7 LFLNTLSFVCPWC
  • SEQ ID NO: 8 LFLNTLSFVCPWCAS
  • HPV type 18 E7 peptide of the present invention is a single HPV peptide capable of double binding to four HLA classes (HLA-A * 0201, A * 2402, A * 1101 and A * 3303), and is easily and efficiently efficacious in cervical cancer. It is expected that a large use as a therapeutic composition or a diagnostic composition using the same.
  • SEQ ID NO: 6 LFLNTLSFVCPW
  • SEQ ID NO: 7 LFLNTLSFVCPWC
  • SEQ ID NO: 8 LFLNTLSFVCPWCAS

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Abstract

본 발명은 HPV type 18의 E7 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드를 자궁경부암 치료용 백신으로 이용하는 경우, 4 종류의 HLA 클래스(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)에 중복 결합 가능하므로 효과적인 자궁경부암 항체 생성 및 치료에 큰 활용이 기대된다.

Description

인유두종바이러스 펩타이드의 자궁경부암 진단 및 치료 용도
본 발명은 4 종류의 HLA 클래스와 중복 결합 가능한 인유두종바이러스 펩타이드의 자궁경부암 진단 및 치료 용도에 관한 것이다.
자궁경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높은 것으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁경부암으로 사망하고 있으며, 그 수가 계속 증가하고 있다(Pisani P, 등. Int J Cancer 2002;97(1):72-81). 자궁경부암의 주원인은 인유두종 바이러스(human papillomavirus : HPV)로 알려져 있으며, 100여종이 넘는 HPV 중 40여종이 여성 생식기에서 작용하는 것으로 밝혀졌다(de Villiers EM, 등. Virology 2004;324:17-27). 여러 종류의 HPV 중에서 특히 HPV 타입 16과 HPV 타입 18이 자궁경부암 환자에게서 가장 흔하게 발견되어 종양발생에 중요하게 관여하고 있음을 예측할 수 있다(Munoz N, 등. N Engl J Med 2003;348(6):518-27).
HPV가 정상 세포에 감염되면 viral oncogene이 숙주세포(host cell)의 유전자에 삽입되어 여러 viral protein을 발현하게 되는데, 그 중 E6와 E7은 강력한 oncoprotein으로서 tumor suppressor인 p53과 RB의 작용을 억제하여 암세포로의 진행과 지속적인 성장을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(zur Hausen H. Nat Rev Cancer 2002;2(5):342-50). E7은 tumor suppressor 인 RB의 기능을 억제하며, S-phase 유전자인 cyclin A 와 cyclin E의 활성을 촉진하고(zur Hausen H. 등. Nat Rev Cancer 2002;2(5):342-50;Phelps WC, 등. Cell 1988;53(4):539-47), 또한 cyclin-dependent kinase inhibitor인 CIP1(p21)과 KIP1(p27)의 기능을 억제하는 등의 작용으로 감염된 세포의 apoptosis를 저해하고 종양으로의 전환을 유발하는 것으로 알려 졌다(Funk JO, 등. Genes Dev 1997;11(16):2090-100;Zerfass-Thome K, 등 Oncogene 1996; 13(11):2323-30). 이러한 viral oncoprotein들은 정상 세포에서는 발견되지 않아 다양한 종류의 암을 대상으로 하는 면역치료에 있어서 아주 유력한 target이 되고, 따라서 자궁경부암의 치료가 가능한 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte: CTL)를 생성하기 위해 HPV 펩타이드를 규명하고자 하는 연구가 진행되고 있는 추세이다.
그러나 현재 개발된 HPV 에피토프들은 단일 HLA(Human leukocyte antigen) 클래스에 결합 가능한 펩타이드로서, 면역세포의 인지 저하에 따른 치료 효과 저하의 문제점이 있다. 실제로, 미국에서는 자궁경부암 예방 백신을 접종한 청소년의 32%에서 자궁 경부 감염 또는 병변에 대한 치료 효과가 발생되지 않았다(Hildesheim A 등. JAMA 2007;298:743-753; EMA. Annex I Summary of Product Characteristics for the HPV Vaccine ‘Gardasil’ 2008. Updated 2012. www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Product_Information/human/000703/WC500021142.pdf).
이와 같이, 자궁경부암의 진단, 치료, 백신 및 스크리닝 효율 증진을 위하여, 다양한 HLA 클래스에 중복 결합 가능한 HPV 펩타이드의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 4 종류의 HLA 클래스(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)에 중복 결합 가능한 단일 HPV 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 자궁경부암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 펩타이드란, 아미노산의 중합체로서, 아미노산 간의 연결은 아미드 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 핵산이란, 뉴클레오타이드가 긴 사슬 모양으로 중합된 고분자 유기물로서, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 유전 정보이다.
본 발명에서 개제된 펩타이드들과 그 펩타이드를 코딩하는 핵산은 HPV에 의하여 감염된 것으로 알려졌거나, HPV에 의하여 감염된 것이 의심스럽거나, HPV에 의하여 감염될 수 있는 대상에서 예방 또는 치료적인 백신으로 사용될 수 있다. 다른 적당한 대상들은 HPV 관련 질환의 증상을 나타내거나 질환이 발생할 것 같은 사람들을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 백신은 HPV 균주 18의 감염과 관련된 질환들, 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암을 치료하거나 예방하는 백신으로 사용될 수 있다. 면역 반응을 야기하는 본 발명의 펩타이드 및 핵산의 능력은 당업계에 주지된 면역 반응을 측정하는 방법들을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 세포 독성T 세포들의 생성은 MHC 테트라머를 사용하거나 세포내 사이토카인 발현을 측정하거나 표준 51Cr release 분석에서 나타낼 수 있다. ELISA 또는 ELISPOT와 같은 표준 분석도 T 세포 활성화에 기여하는 사이토카인 프로화일을 측정하는데 사용될 수 있다. T 세포 증식은 또 당업계에 공지된 다른 분석들과 3H-thymidine 업테이크와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다. B 세포 반응들은 ELISA와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 HPV 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서 백신이란, 특정 질병의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 조성물을 말한다. 백신은 항원으로서의 펩타이드를 포함하고 있든지, 또는 항원 발현이 가능하여 항원에 대한 면역응답을 유도할 수 있다. HPV에 의하여 감염될 수 있는 질병의 감염, 전파 및 유행의 예방 또는 치료를 위해 본 발명의 펩타이드를 포함하는 백신을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 진단이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 HPV 감염 여부를 확인하는 것이다. HPV 감염 의심 환자로부터의 검체(임상적으로는 세포, 혈액, 수액, 흉수, 복수, 관절액, 농(膿), 분비액, 담,인두점액, 요(尿), 담즙, 대변 등) 내에 포함되어 있는 HPV 펩타이드에 대응하는 항체를 이용하는 방법 또는 HPV 핵산을 직접 검출하는 방법으로 HPV 감염 여부를 진단할 수 있다. 항원-항체 결합을 이용한 진단적 수단으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 핵산을 직접 검출하는 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 진단키트란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단키트는 HPV 감염 여부를 확인하는 것이다. 본 발명의 키트에는 HPV 감염 여부를 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 펩타이드를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학 조성물은 HPV에 감염된 세포를 파괴하는 것이며, HPV 펩타이드에 의해 감작된 면역세포, 면역세포의 활성 증가를 유도할 수 있는 물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 펩타이드에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 고분자 다당체 또는 토란추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 펩타이드는 면역세포의 활성을 촉진하는 목적으로 당업계에 주지된 지질, 덴드리머 또는 리포좀을 통하여 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어 면역 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들을 운반하는 리포좀들은 인 비보에서 CTL 반응을 야기하는 것으로 알려졌다(Reddy et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148:3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89:5157, 1992). 또한 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 사포닌 단독 또는 콜레스테롤 및 Quil A (사포닌)을 동시에 혼합하여 생성된 30-40 nm 크기의 (-) 차지된 케이지 유사 구조인 Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 ISCOMS와 동시 또는 별도로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 스크리닝이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 자궁경부암 의심 개체에 자궁경부암 치료용 후보 물질의 투여 후 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 핵산이 코팅하는 단백질에 의해 민감화된 CD8+ T세포 반응이 저해되는 경우에, 후보 물질을 자궁경부암 치료제로 결정하는 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법이다. 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 수단적 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서는 HPV 타입 18의 E7 단백질 중 세포면역반응을 유발하는 가장 최소단위인 HLA class I 에피토프과 반응하는 E7 펩타이드 백신을 개발하는 데 그 목적이 있으며, 특별히 HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303의 4종류의 HLA형에 중복 결합 가능한 단일 E7 펩타이드 백신인 것을 특징으로 하는 백신을 개발하였다. 세포 독성 T 림프구를 생성을 유도하는 특정한 HPV 타입 18 E7 에피토프를 개발하기 위해 합성된 HPV 타입 18 E7 펩타이드를 이용하여 유체 세포측정법(flow cytometry)을 실행한 결과 E7 펩타이드 가운데 #21(DDLRAFQQLFLNTLS)과 #23(LFLNTLSFVCPWCAS) 펩타이드가 높은 세포 독성 T 세포의 분화 및 활성을 유도 하는 것을 알 수 있었다. 그리고 실제 #21과 #23 펩타이드로 감작된 CTL과 자궁경부암 세포를 함께 배양하여 CTL의 암세포 살상능력을 실제 측정하는 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통해 #21과 #23 펩타이드가 자궁경부암 세포의 세포 사멸을 유발하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, CD8+ CTLs 세부에 인식 가능한 #21과 #23번 펩타이드의 세부 잔기(residue)를 분석하기 위해서, 전체 15mer 길이의 펩타이드들은 순차적으로 N- 과 C- 말단의 아미노산을 하나씩 떼어내는 방법으로 8 내지 14개의 아미노산 서열을 가지는 잔기 펩타이드들을 개발하였으며, 상기와 같은 방법으로 잔기 펩타이드들의 효과를 분석하였다. HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303의 4종류의 HLA형에 대하여, #21 펩타이드의 경우에는 #21-1(DLRAFQQLFLNTLS)이 가장 유용한 효과를 보임으로서 94번과 95번 위치의 아미노산이 CD8+ CTL 세포 자극을 위해 가장 중요하다는 것을 알 수 있었으며, #23 펩타이드의 경우에는 #23-10(LFLNTLSFVCPW)이 가장 유용한 효과를 보임으로서 100번과 103 위치의 아미노산이 CD8+ CTL 세포 자극을 위해 가장 중요하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1을 포함하는 펩타이드를 제공하고, 서열번호 1의 N말단에 아미노산 아스파르트산(Aspartic acid, D)를 추가로 포함하는 펩타이드를 제공하며, 서열번호 1의 C말단에 2개의 아미노산을 추가하고, 상기 2개의 아미노산 중 어느 하나가 류신(Leucine, L)인 펩타이드를 제공하며, 서열번호 1의 N말단에 아미노산 아스파르트산(Aspartic acid, D)를 추가하고, C말단에 2개의 아미노산을 추가하며, 상기 2개의 아미노산 중 어느 하나가 류신(Leucine, L)인 펩타이드를 제공하며, 서열번호 1의 C말단에 3개의 아미노산을 추가하고, 상기 3개의 아미노산은 순차적으로 트레오닌(Threonine, T), 류신(Leucine, L), 세린(Serine, S)인 펩타이드를 제공하며, 상기 펩타이드는 서열번호 제 2, 3, 4 및 5 중 어느 하나인 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 6을 포함하는 펩타이드를 제공하고, 서열번호 6의 C말단에 1개의 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드를 제공하며, 상기 펩타이드는 서열번호 7인 펩타이드를 제공하며, 서열번호 7의 C말단에 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드를 제공하며, 상기 펩타이드는 서열번호 8인 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드와 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드 및 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고, 상기의 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 CD8+ T세포 자극 및 민감성 향상용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303의 어느 하나 이상의 HLA 클래스 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 핵산을 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 자궁경부암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 핵산을 포함하는 자궁경부암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 항체를 포함하는 자궁경부암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 상기 어느 하나 이상의 펩타이드의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 상기의 핵산을 검출할 수 있는 물질의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 상기의 항체의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 인유두종 바이러스 감염 진단용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) HPV 감염 의심 환자에 항바이러스제를 투여한 후 HPV 펩타이드로 감작된 PBMCs의 활성을 측정하는 단계; (b) HPV 감염 의심 환자에 상기 항바이러스제 및 분석할 시료를 투여한 후 HPV 펩타이드로 감작된 PBMCs의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) (a) 단계에서의 PBMCs 활성보다 (b)단계에서의 PBMCs 활성이 더 높을 경우 상기 분석할 시료는 병용투여용 항 바이러스제로 판단하는 단계를 포함하는 병용투여용 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
자궁경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높고, 발병 원인의 대부분이 HPV 타입 16과 HPV 타입 18의 감염에 의한 것으로 밝혀져 있음에도 불구하고, 백신 개발에 사용된 HPV 에피토프들이 단일 HLA(Human leukocyte antigen) 클래스에 결합 가능한 펩타이드이므로 치료 효과가 낮은 문제점이 있다. 그러나 본 발명의 HPV 타입 18의 E7 펩타이드는 4 종류의 HLA 클래스(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)에 중복 결합 가능한 단일 HPV 펩타이드로서, 용이하게 효율이 높은 자궁경부암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물로의 큰 활용이 기대된다.
도 1a-d는 본 발명의 일 실시예에 따른 15mer 길이의 HPV 후보군 펩타이드들의 IFN-γ+ 스팟 형성율을 측정한 결과이다.
도 2a-d는 본 발명의 일 실시예에 따른 15mer 길이의 HPV 후보군 펩타이드들에 대한 CD8+ T 세포의 접힘 증가를 측정한 결과이다.
도 3a-d는 본 발명의 일 실시예에 따른 #21과 #23 펩타이드 감작된 PBMCs의 EBV-BLCs 세포 용해율을 측정한 결과이다.
도 4a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 #21과 #23 펩타이드 감작된 PBMCs의 자궁경부암 세포주 용해율을 측정한 결과이다.
도 5a-d는 본 발명의 일 실시예에 따른 #21과 #23 펩타이드의 세부 잔기 펩타이드들(truncated peptides)의 IFN-γ+ 스팟 형성율을 측정한 결과이다.
도 6a-d은 본 발명의 일 실시예에 따른 #21 세부 잔기 펩타이드들로 감작된 PBMCs의 EBV-BLCs 세포 용해율을 측정한 결과이다.
도 7a-d는 본 발명의 일 실시예에 따른 #23 세부 잔기 펩타이드들로 감작된 PBMCs의 EBV-BLCs 세포 용해율을 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 말초혈액 단핵구의 준비
말초 혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 네 종류(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)의 HLA 클래스 I을 가지는 건강한 공여자로부터 기증되었다. 각 공여자의 혈액에 존재하는 면역 글로불린 G(IgG) 또는 면역 글로불린 M(IgM) HCMV 항체는 수동 라텍스 응집(CMVSCAN 키트, 벡톤 디킨슨 미생물 시스템)을 사용하여 분석하였다. 거대 세포 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 혈청 검사 양성 공여자로부터의 거대 세포 바이러스(CMV) 특이 항원 결정기(epitope)가 양성 대조군으로서 사용되었다. 주요 조직 적합성 복합체(Major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I 유전자형은 게놈 DNA를 이용한 염기 서열 특이 중합 효소 연쇄 반응(sequence-specific polymerase chain reaction)으로 분석하였고, 이것은 서울 의과학 연구소(서울, 한국)의 HLA 실험실에서 수행하였다. PBMC는 파마시아 바이오텍社의 피콜 시약(Ficoll-Hypaque 1.077, Pharmacia Biotech)을 사용하여 밀도 구배 원심 분리를 통해 분리하였고, 10% 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSA, 시그마)를 포함하는 인간 AB + 혈청에 담긴 채로 영하 160℃에서 동결 보존 하였다. 본 명세서 상에 기재된 모든 연구는 공여자의 서면 동의를 받고, 연세대학교 연구윤리위원회의 승인을 얻어 실시되었다.
실시예 2: 펩타이드 (peptide) 합성
인유두종바이러스 18 타입 E7 단백질의 전체 아미노산 서열을 컴퓨터 알고리즘(computer algorithms)을 이용하여 각각 15mer의 크기로 중복(overlapping)되도록 나누어 합성한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC)기기를 이용하여 순도가 95% 이상 되는 펩타이드를 총 24개를 합성하였다. 면역 우세한 후보 펩타이드의 선별 후에, 네 종류(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)의 HLA 클래스 I과 결합 가능한 15-아미노산 펩타이드 후보군이 합성되었으며, 합성된 펩타이드는 1%의 디메틸설폭사이드가 포함된 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate) 용액에 담긴 채로 영하 80℃에서 보관하였다.
실시예 3: PBMC로부터 자가 수지상 세포( Autologous dendritic cell)의 생성
원심분리를 통해 얻어진 PBMC를 RPMI 배양액(10% FBS, 5% antibiotics) 내에서 37℃ 온도에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 5 X 106 세포/ml 농도의 세포(monocyte)에 인터루킨-4(IL-4, 1200U/ml)와 거대세포 자극 인자(GM-CSF, 1500U/ml)를 첨가하여 배양하고, 배양 시작 후 2일, 4일 및 6일째 되는 때에 IL-4와 GM-CSF를 신선하게 첨가해 주었다. 배양 시작 후 5일째 되는 때에, 수시상세포의 성숙을 위해 종양괴사인자-α(TNF-α, 10 ng/ml)를 첨가하였다(Lim JB, 등. Exp Hematol 2006;34(3):296-307;Provenzano M, 등. J Immunother 2002;25:342-351). 성숙 후에는, 최소 6시간 동안 수지상세포와 펩타이드를 감작시켜 주었다.
실시예 4: 펩타이드에 특이적인 polyclonal 세포 독성 T 세포의 생성
동결된 PBMC는 해동시켜 2 x 106 개의 세포를 24 well 배양용기의 각 well에 2ml의 RPMI 배양액과 함께 넣어주었다. PBMC 배양액에는 HPV18 E7 펩타이드 (10g/mL/well)와 1000 IU/Ml의 재조합 인간 IL-2(rhIL-2; PeproTech)가 첨가되었고, 이틀에 한 번씩 배양액 내에 rhIL-2를 추가로 첨가하였다. PeproTech)가 well 마다 첨가되었다. 배양 시작 후 7일째 되는 때에 위에 언급한 방법으로 생성된 수지상 세포(4-10 x 106/well)가 PBMC에 더해졌고, 수지상 세포가 처리된 PBMC는 일주일 더 배양하였다.
실시예 5: 유체 세포측정법(flow cytometry)를 이용한 분석
피코에리트린(Phycoerythrin ,PE) 컨쥬게이션 된 안티-인터페론-감마(anti-IFN-γ), APC-Cy7 컨쥬게이션 된 안티-CD44, FITC 컨쥬게이션 된 안티-CD3, PerCp-Cy5.5 컨쥬게이션 된 안티-CD4 및 APC 컨쥬게이션 된 안티-CD8은 BD 바이오사이언스(BD Biosciences, CA)에서 구입 하였다. 각 시료에서, 1 × 105 개의 세포가 유세포측정기(BD Biosciences, NJ)의 게이트를 통과하였고, 양성 세포는 각각의 전체 세포에 대한 비율로 표현하였다. phytohemagglutinin(PHA, Sigma)로 자극되고 펩타이드 감작된 PBMC (1 × 106 세포 / ㎖)와 자가 수지상세포로 자극된 PBMC가 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용되었다. 펩타이드 자극 1시간 후, 10 마이크로그램(μg)의 brefeldin A(BFA)를 각각 첨가해 준 뒤, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그 후, 각각의 well에서 세포를 채취하여 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척해 주었다. 세척 후 1mM 농도의 EDTA가 들어 있는 PBS를 넣어 주고 37℃에서 10분간 배양하였다. 배양이 끝나면, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고, 형광 표지된 항체인 안티-CD3, 안티-CD8, 안티-CD4, 안티-CD44 및 안티-인터페론-감마를 첨가한 뒤 4℃에서 15분간 빛을 가린 상태로 배양하였다.
실시예 6: 감마 인터페론( IFN -γ) 효소-연결 면역스팟 분석( ELISPOT )
안티-마우스 감마 인터페론(IFN-γ) 항체(Clone AN-18, Ebioscience, San Diego, CA) ELISPOT 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅 하였다. 항체 코팅된 플레이트에, 동결 보존하였던 PBMC를 배지(RPMI 1640 with 10% FBS)로 해동하여 각 well마다 5 × 105 cells개씩 넣고 배양하였다. 이어, HPV18 E7 펩타이드를 첨가하고 37°C, 5% CO2 환경에서 48시간 동안 배양하였다. 바이오틴화 안티-마우스 IFN-γ 검출항체(100 μL; 1 μg/mL in PBS)을 각각의 웰에 첨가하고, PBS 세척 후, 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제 1:1,000 희석액 100 ㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하고, 플레이트에 10ml의 Tris-MgCl2 buffer 에 100 μL의 NBT 용액(Bio-Rad, Berkeley, CA)과 100 μL의 BCIP 용액(Bio-Rad)을 첨가한 발색 시약을 첨가하였다. 플레이트는 건조 후에 ELISPOT 리더(software version 3.5, AID ELISpot Reader System, Strassberg, Germany)로 정량화 하였다. 시험에는 2.5 μg/mL의 Phytohemagglutinin (PHA) 가 첨가된 시료와 펩타이드 감작되지 않은 PBMC 시료를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 7: 자궁경부암 세포주 배양
인간의 자궁경부암 세포주(HTB-34 for HLA-A*0201, SNU-1160 for HLA-A*2402)는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구매하였고, 37°C, 5% CO2 환경에서 DMEM 배지(10% FBS 및 1% 항생제 첨가)로 배양하였다. 각각의 HLA class I 제한된(kindly gifted from Dr. David Stroncek, in NIH) 불멸성 Epstein-Barr 바이러스-B 림프아구성 세포주(EBV-BLC)는 37°C, 5% CO2 환경에서 RPMI 배지(10% FBS 및 1% 항생제 첨가)로 배양하였다. 세포들은 정기적으로 마이코플라즈마(mycoplasma) 감염 여부를 시험하였다.
실시예 8: 세포 독성 실험( cytotoxicity assay)
자궁경부암 세포주를 표적 세포(target cell)로 하여 51Cr 방출 검출법을 사용하여 세포 독성 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, 각각의 HLA 클라스 I 제한된 4 x 103 cells/well의 자궁경부암 세포주에 51Cr(100 mCi/106 cells; Perkin Elmer, Waltham, MA)를 첨가하여 37℃에서 45분간 배양하였다. Effector 로서 펩타이드 감작된 PBMC가 목표 세포에 10:1, 30:1, 50:1, 및 100:1의 비율로 첨가하였고, 배양된 세포 배지의 상층액을 WIZARD2 자동 감마 카운터기(Automatic Gamma Counter, Perkin Elmer)로 측정하였다. 세포 독성 T 세포 특이적인 목표 세포 사멸의 정도는 [(experimental cpm-spontaneous cpm)/(maximum cpm-spontaneous cpm)]×100의 공식을 이용하여 산정하였다(Bao L, 등. Biol Blood Marrow Transplant 2008;14:1156-1162).
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
(1) Th1 세포와 반응 특이적인 15mer 길이의 HPV 타입 18 E7 펩타이드의 스크리닝
총 24개 종류의 15mer 길이의 후보군 펩타이드를 민감화된 PBMCs에 처리하였고, IFN-γ+ 스팟 형성율(spot forming unit,SFU)을 ELISpot법을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 [도 1]에 나타내었다. 24 종류의 15mer 길이의 펩타이드 서열을 표 1에 나타내었다.
번호 아미노산 위치 아미노산 서열
#1 1-15 MHGPKATLQDIVLHL
#2 5-19 KATLQDIVLHLEPQN
#3 9-23 QDIVLHLEPQNEIPV
#4 13-27 LHLEPQNEIPVDLLC
#5 17-31 PQNEIPVDLLCHEQL
#6 21-35 IPVDLLCHEQLSDSE
#7 25-39 LLCHEQLSDSEEEND
#8 29-43 EQLSDSEEENDEIDG
#9 33-47 DSEEENDEIDGVNHQ
#10 37-51 ENDEIDGVNHQHLPA
#11 41-55 IDGVNHQHLPARRAE
#12 45-59 NHQHLPARRAEPQRH
#13 49-63 LPARRAEPQRHTMLC
#14 53-67 RAEPQRHTMLCMCCK
#15 57-71 QRHTMLCMCCKCEAR
#16 61-75 MLCMCCKCEARIKLV
#17 65-79 CCKCEARIKLVVESS
#18 69-83 EARIKLVVESSADDL
#19 73-87 KLVVESSADDLRAFQ
#20 77-91 ESSADDLRAFQQLFL
#21 81-95 DDLRAFQQLFLNTLS
#22 85-99 AFQQLFLNTLSFVCP
#23 89-103 LFLNTLSFVCPWCAS
#24 93-107 TLSFVCPWCASQQ
HLA-A*0201, A*1101 및 A*3303에서, #23과 #21 펩타이드들은 각각 1번째, 2번째로 높은 IFN-γ+ 스팟 형성을 나타내었다(도 1a, 1c, 1d). HLA-A*2402에서는, #21이 #23 펩타이드보다 조금 더 높은 스팟 형성을 보여주었다(도 1b). 그러나 모든 HLA 패밀리에서 #21과 #23 펩타이드들은 음성 대조군에 비하여 적어도 3배 이상의 높은 스팟 형성을 나타내었고, 이것으로 시험된 펩타이드가 양성 대조군에 거의 근접한 수준으로 PBMCs에 높은 감작을 보임을 알 수 있었다.
(2) CD8+ CTL 세포와 15mer 길이의 HPV 타입 18 E7 펩타이드의 반응 측정
후보 펩타이드들이 공여자의 PBMCs의 HLA 클라스 I (HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)을 자극하여 IFN-γ을 생산하는 것을 측정함으로서, 펩타이드에 민감화된 PBMCs가 CD8+ CTL 반응을 유도할 수 있는가를 알 수 있다. PBMCs로부터 유도된 자가 수지상세포를 6시간 동안 재감작 후, CD8+ CTL 세포(CD3+CD8+IFN-γ+)의 IFN-γ 생산을 유세포 계측기로 측정하였다(도 2). 시험된 모든 HLA 패밀리에서, IFN-γ 생산을 유도하는 CD8+ T 세포의 접힘 증가는 #21과 #23이 다른 펩타이드들에 비하여 월등히 높았으며, 음성대조군에 비해서는 2-2.5배 이상 높게 나타났다. 이러한 결과로 #21과 #23 펩타이드가 PBMC로부터 효과적인 CD8+ CTL 반응을 이끌어낼 수 있음을 알 수 있었다.
(3) #21과 #23 펩타이드 독성 분석
각각의 HLA 클라스 I 에 대한 #21과 #23 펩타이드의 효과를 확인하기 위해서, 타겟 세포로서 HLA 매칭된 엡스테인바 바이러스-B림프구(Epstein Barr virus-B lymphoblastoid cell, EBV-BLCs)를 이용하여 세포독성 실험을 실시하였다. EBV-BLCs 세포는 표면에 #21과 #23 펩타이드에 결합 가능한 HLA-펩타이드 복합체(HLA-peptide complex)를 가지고 있다. 시험 결과, #21과 #23 펩타이드에 의해 감작된 모든 HLA class I 종류의 CTLs 세포는 #21과 #23 펩타이드를 로드(load)한 EBV-BLCs 세포를 더 많이 용해하였다(도 3). 세부적으로, #23 펩타이드에 의해 감작된 PBMCs 가 #23 펩타이드를 로드한 EBV-BLCs 세포를 용해하는 비율이 #21의 경우에 비하여 조금 더 높았다. 이러한 결과로, #21과 #23 펩타이드가 CD8+ CTLs 세포에 의해 성공적으로 인식됨을 알 수 있었다.
(4) #21과 #23 펩타이드로 감작된 PBMCs의 자궁경부암 세포주에 대한 독성 분석
#21과 #23 펩타이드로 감작된 PBMCs 가 자궁경부암 세포주에 미치는 세포 독성을 분석하기 위해서, 2 종류의 HLA 클라스 I(HLA-A*0201, A*2402) 타입 자궁경부암 세포주를 이용하여 51Cr 방출 검출법을 실시하였다. 시험 결과, #21과 #23 펩타이드로 감작된 PBMCs는 비감작된 세포에 비하여 더 많은 자궁경부암 세포를 용해하였다(도 4). HLA-A*0201 제한된 HTB-34 자궁경부암 세포주(도 4a)와 HLA-A*2402 제한된 SNU-1160 자궁경부암 세포주(도 4b)에서 같은 결과를 나타내었다. 이러한 결과로, #21과 #23 펩타이드가 자연 발생된 두 종류의 자궁경부암 세포주에서 모두 유효하며, HLA-A*0201과 HLA-A*2402 타입의 면역 항원결정기(에피토프)로서 유용함을 알 수 있었다.
(5) CD8+ CTLs세포에 인식 가능한 #21과 #23 펩타이드의 세부 잔기 (residue) 분석
CD8+ CTLs 세부에 인식 가능한 #21과 #23 펩타이드의 세부 잔기(residue)를 분석하기 위해서, 전체 15mer 길이의 펩타이드들은 순차적으로 N- 과 C- 말단의 아미노산을 하나씩 떼어내는 방법으로 잘려졌고, 만들어진 잔기 펩타이드들을 표 2에 나타내었다.
번호 아미노산 위치 아미노산 서열 번호 아미노산 위치 아미노산 서열
#21-1 82-95 DLRAFQQLFLNTLS #23-1 90-103 FLNTLSFVCPWCAS
#21-2 83-95 LRAFQQLFLNTLS #23-2 91-103 LNTLSFVCPWCAS
#21-3 84-95 RAFQQLFLNTLS #23-3 92-103 NTLSFVCPWCAS
#21-4 85-95 AFQQLFLNTLS #23-4 93-103 TLSFVCPWCAS
#21-5 86-95 FQQLFLNTLS #23-5 94-103 LSFVCPWCAS
#21-6 87-95 QQLFLNTLS #23-6 95-103 SFVCPWCAS
#21-7 88-98 QLFLNTLS #23-7 96-103 FVCPWCAS
#21-8 81-94 DDLRAFQQLFLNTL #23-8 89-102 LFLNTLSFVCPWCA
#21-9 81-93 DDLRAFQQLFLNT #23-9 89-101 LFLNTLSFVCPWC
#21-10 81-92 DDLRAFQQLFLN #23-10 89-100 LFLNTLSFVCPW
#21-11 81-90 DDLRAFQQLFL #23-11 89-99 LFLNTLSFVCP
#21-12 81-89 DDLRAFQQLF #23-12 89-98 LFLNTLSFVC
#21-13 81-88 DDLRAFQQL #23-13 89-97 LFLNTLSFV
#21-14 81-87 DDLRAFQQ #23-14 89-96 LFLNTLSFV
#21과 #23 펩타이드에서, 각각 총 14개씩의 잔기 펩타이드를 만들었고, IFN-γ + 스팟 형성율(spot forming unit,SFU)을 ELISpot법을 이용하여 측정하였다(도 5). #21 펩타이드의 경우, 모든 종류의 HLA 타입에서, N 말단의 순차적 잘림은 잔기 82의 제거 이후에 Th1 응답이 감소하였다(도 5a-d). 이러한 결과는 N 말단의 81과 82번 위치의 아미노산이 PBMCs 자극을 위해 중요하다는 것을 시사한다. C 말단의 경우에는, 92, 94, 및 95번 위치의 아미노산이 HLA-A*0201과 A*2402 타입의 CD8+ CTL 세포를 자극하는데 중요한 것으로 나타났으며(도 5a-b), HLA-A*1101과 A*33:03 타입의 CD8+ CTL 세포 자극을 위해서는 94와 95번 위치의 아미노산이 중요한 것으로 나타났다(도 5c-d).
#23 펩타이드의 경우, HLA-A*0201, A*1101 및 A*3303 타입의 CD8+ CTL 세포 자극을 위해서 C 말단의 100과 103 위치의 아미노산이 항원결정기(에피토프)로서 중요하다(도 5a, 5c-d). 그러나 HLA-A*2402 타입 CD8+ CTL 세포 자극을 위해서는 C 말단의 100, 101 및 103번 잔기의 존재가 중요한 것으로 나타났다(도 5b).
(6) #21과 #23 펩타이드의 세부 잔기의 세포독성 분석
각각의 HLA class I 에 대한 #21과 #23 펩타이드로부터 생성된 세부 잔기 펩타이드(Truncated peptides)의 효과를 확인하기 위해서, 타겟 세포로서 HLA 매칭된 엡스테인바 바이러스-B림프구(Epstein Barr virus-B lymphoblastoid cell, EBV-BLCs)를 이용하여 세포독성 실험을 실시하였다. #21 펩타이드의 경우(도 6), HLA-A*0201과 A*2402 타입의 CD8+ CTL 세포는 음성 대조군에 비하여 #21-1, #21-8 및 #21-10의 펩타이드에 의해 감작된 EBV-BLCs 세포를 더 많이 용해하였고(도 6a, 6b), HLA-A*1101과 A*3303 타입의 CD8+ CTL 세포는 #21-1과 #21-10 의 펩타이드에 의해 감작된 EBV-BLCs 세포를 더 많이 용해하였다(도 6c, 6d).
#23 펩타이드의 경우(도7), HLA-A*0201, A*1101 및 A*3303 타입의 CD8+ CTL 세포는 음성 대조군에 비하여 #23-10의 펩타이드에 의해 감작된 EBV-BLCs 세포를 더 많이 용해하였고(도 7a, 7c-d), HLA-A*2402 타입의 CD8+ CTL 세포는 #23-9와 #23-10의 펩타이드에 의해 감작된 EBV-BLCs 세포를 더 많이 용해하였다(도 7b).
#21 펩타이드 및 #23 펩타이드의 세부 잔기(residue) 분석으로부터 얻어진 주요 아미노산 서열은 하기와 같다.
서열번호 1: DLRAFQQLFLN
서열번호 2: DDLRAFQQLFLN
서열번호 3: DDLRAFQQLFLNTL
서열번호 4: DLRAFQQLFLNTLS
서열번호 5: DDLRAFQQLFLNTLS
서열번호 6: LFLNTLSFVCPW
서열번호 7: LFLNTLSFVCPWC
서열번호 8: LFLNTLSFVCPWCAS
본 발명의 HPV 타입 18의 E7 펩타이드는 4 종류의 HLA 클래스(HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303)에 중복 결합 가능한 단일 HPV 펩타이드로서, 용이하게 효율이 높은 자궁경부암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물로의 큰 활용이 기대된다.
서열번호 1: DLRAFQQLFLN
서열번호 2: DDLRAFQQLFLN
서열번호 3: DDLRAFQQLFLNTL
서열번호 4: DLRAFQQLFLNTLS
서열번호 5: DDLRAFQQLFLNTLS
서열번호 6: LFLNTLSFVCPW
서열번호 7: LFLNTLSFVCPWC
서열번호 8: LFLNTLSFVCPWCAS

Claims (28)

  1. 서열번호 1을 포함하는 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1의 N말단에 아미노산 아스파르트산(Aspartic acid, D)를 추가로 포함하는 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1의 C말단에 2개의 아미노산을 추가하고, 상기 2개의 아미노산 중 어느 하나가 류신(Leucine, L)인 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1의 N말단에 아미노산 아스파르트산(Aspartic acid, D)를 추가하고, C말단에 2개의 아미노산을 추가하며, 상기 2개의 아미노산 중 어느 하나가 류신(Leucine, L)인 펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1의 C말단에 3개의 아미노산을 추가하고, 상기 3개의 아미노산은 순차적으로 트레오닌(Threonine, T), 류신(Leucine, L), 세린(Serine, S)인 펩타이드.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 제 2, 3, 4 및 5 중 어느 하나인 펩타이드.
  7. 서열번호 6을 포함하는 펩타이드.
  8. 제 7항에 있어서,
    서열번호 6의 C말단에 1개의 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 7인 펩타이드.
  10. 제 9항에 있어서,
    서열번호 7의 C말단에 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 8인 펩타이드.
  12. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나의 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  13. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나의 펩타이드와 결합하는 항체.
  14. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 백신 조성물.
  15. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드 및 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 CD8+ T세포 자극 및 민감성 향상용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 HLA-A*0201, A*2402, A*1101 및 A*3303의 어느 하나 이상의 HLA 클래스 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  20. 제 12항의 핵산을 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  21. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 자궁경부암 진단 키트.
  22. 제 12항의 핵산을 포함하는 자궁경부암 진단 키트.
  23. 제 13항의 항체를 포함하는 자궁경부암 진단 키트.
  24. HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법.
  25. HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 제 12항의 핵산을 검출할 수 있는 물질의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법.
  26. HPV 감염 의심 환자로부터의 검체와 제 13항의 항체의 반응 결과로 HPV 감염 여부를 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법.
  27. 제 1항 내지 11항 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는, 인유두종 바이러스 감염 진단용 바이오 마커.
  28. (a) HPV 감염 의심 환자에 항바이러스제를 투여한 후 HPV 펩타이드로 감작된 PBMCs의 활성을 측정하는 단계;
    (b) HPV 감염 의심 환자에 상기 항바이러스제 및 분석할 시료를 투여한 후 HPV 펩타이드로 감작된 PBMCs의 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) (a) 단계에서의 PBMCs 활성보다 (b)단계에서의 PBMCs 활성이 더 높을 경우 상기 분석할 시료는 병용투여용 항 바이러스제로 판단하는 단계를 포함하는 병용투여용 항바이러스제 스크리닝 방법.
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