WO2009120022A2 - 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 hpv 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 hpv 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an immunological peptide and a composition for preventing or treating HPV-related diseases comprising the peptide. More specifically, the composition for preventing or treating HPV-related diseases comprising an E7 protein derived from E7 protein of HPV type 16 and the peptide. It is about.
  • cervical cancer is the second most common malignancy among women, with more than 350,000 patients dying from cervical cancer every year worldwide, and the number continues to increase (zur Hausen H .: Nat Rev Cancer. 2002. 2 (5): 342-50)
  • HPV human papilomavirus
  • HPV type 16 and HPV type 18 infections play an important role in the development of cervical cancer.
  • HPV type 16 infections have been found to be the most common (Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ and Meijer CJ. N. Engl. J. Med. 2003. 348 : 518-527).
  • E6 and E7 are potent oncoproteins that inhibit the actions of tumor suppressors, p53 and rb gene, and thus normal cervix. It is known to induce the cytoplasmic transformation of cancer cells in cells and to promote the continued growth of cancer cells (Werness BA, Levine AJ and Howley PM. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science. 1990. 248: 76-79; Dyson N, Howley PM, Munger K. and Harlow E. Science.1989. 243: 934-937).
  • E7 inhibits the function of the tumor suppressor rb (Kiyono T, Foster SA, Koop JI, McDougall JK, Galloway DA and Klingelhutz AJ. Nature. 1998. 396: 84-88), and the S-phase gene during the cell growth cycle. Cyclin A and cyclin E (Zerank K, Schulze A, Spitkovsky D, Friedman V, Henglein B and Jansen-Durr PJ Virol. 1995. 69: 6389-6399.), And also cyclin-dependent kinase inhibitors.
  • CTLs cancer-specific cytotoxic T lymphocytes
  • NCI National Cancer Institute
  • the most important and first step in the development of specific cancer-specific immune cell therapy using CTLs is the discovery of cancer-specific target antigens that can strongly induce human anticancer immune responses among cancer cell proteins.
  • this study used a method of developing peptide antigens in cancer cell proteins that bind to each human leukocyte antigen (HLA) class I epitope, which is the smallest unit that triggers the immune response in human body. .
  • HLA human leukocyte antigen
  • HLA class I epitopes one of the smallest immune response units of these target antigens, react with peptide antigens with specific amino acid sequences according to each HLA type.
  • the present invention has been made by the above necessity, an object of the present invention to provide a peptide for the prevention or treatment of HPV-related diseases.
  • the present invention provides a peptide having at least 9 amino acid sequences derived from HPV type 16 E7 protein.
  • the peptide is preferably 9 to 17 sequences, and most preferably 15 are not limited thereto.
  • the peptide sequence preferably comprises an amino acid sequence of LCVQSTHVD (SEQ ID NO: 15), but is not limited thereto.
  • the peptide sequence is preferably CDSTLRLCVQSTHVD (SEQ ID NO: 10) or LCVQSTHVDIRTLED (SEQ ID NO: 11), and most preferably, but not limited to, LCVQSTHVDIRTLED (SEQ ID NO: 12).
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 15.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 10 or the peptide of SEQ ID NO: 11, respectively.
  • the nucleic acid sequence encoding the peptide of SEQ ID NO: 15 is preferably a nucleic acid of SEQ ID NO: 17 (ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac), and the nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 10 is a nucleic acid of SEQ ID NO: 18 (tgt).
  • nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 11 is a nucleic acid of SEQ ID NO: 19 (ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac att cgt act ttg gaa) gac) is preferred, but the sequence can be changed in consideration of degeneracy and the like.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (a) the peptide and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition is for the treatment of HPV infection related diseases such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papilloma, cervical dysplasia, cervical cancer, vulval cancer, or prostate cancer. Or useful for prevention, but not limited thereto.
  • HPV infection related diseases such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papilloma, cervical dysplasia, cervical cancer, vulval cancer, or prostate cancer.
  • the composition is characterized in that the HLA-A * 2402 type patient specific.
  • the peptides or nucleic acids of the invention may also optionally be incorporated into microparticles, liposomes, or immune stimulating complexes (ISCOM) (which may include only saponins as active ingredients) or other carriers suitable for supplying the peptides of the invention to a subject. It may be formulated. When using microparticles it preferably has a polymer matrix which is a copolymer such as poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA).
  • PLGA poly-lactic-co-glycolic acid
  • an immune response e.g., a cellular immune response comprising an MHC class I-mediated or class II-mediated immune response
  • an immune response is a mammal having an MHC molecule to which an immunogenic peptide binds, ie humans, apes, dogs, cats, and animals. It can be triggered by administering immunogenic peptides to cows, mice, and rats.
  • the peptide of the present invention may be administered as a microparticle, liposome, or ISCOM, or as part of a solution.
  • Another method of administering a peptide of the invention is to use an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the peptide of the invention.
  • the nucleic acid sequence may optionally encode a signal sequence linked to the above peptide of the present invention.
  • the nucleic acid encodes a signal sequence, preferably it is a signal sequence Met Ala Ile Ser Gly Val from HLA-DR.alpha. Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID NO: 16).
  • the sequence of the present invention may have the sequence of SEQ ID NO: 11 or 12, for example.
  • the nucleic acid does not contain the viral gene causing the nucleic acid infection and does not encode the intact E7 protein.
  • Nucleic acids of the invention can be included in the plasmid and optionally provided in microparticles comprising a polymer matrix.
  • the polymer matrix consists essentially of a copolymer of PLGA.
  • the microparticles have a diameter of, for example, 0.02 to 20 microns or less than about 11 microns.
  • the plurality of microparticles has a diameter of 0.02 to 20 microns or less than about 11 microns.
  • Cells containing the plasmid of the present invention are also within the scope of the present invention.
  • the cell can be, for example, a B cell or other antigen presenting cell (APC).
  • APC antigen presenting cell
  • the cell is cultured or maintained under conditions that allow peptide expression from the plasmid encoding it.
  • Nucleic acids and plasmids of the present invention are useful in methods of inducing an immune response in mammals, eg, humans, by administering the aforementioned plasmids to the mammal, eg, as "naked DNA.”
  • the mammal may have a risk or disease of HPV infection, cervical dysplasia, and / or cervical cancer.
  • Nucleic acids and plasmids of the invention can also be inserted into microparticles, liposomes, ISCOMS, or other suitable means of transport as described above.
  • Peptides disclosed herein and nucleic acids encoding the peptides can be used to elicit an immune response against HPV E7 protein.
  • the peptide of the present invention may be linked to a transporting sequence that carries the peptide to intracellular organs.
  • the transport sequence is an amino acid sequence that functions to regulate intracellular transport (directing movement from organelles to organelles or to the cell surface) of the peptide to which it is attached.
  • Such transport sequences can transport the polypeptides to ER, lysosomes or endosomes and signal peptides (N-terminal sequences that direct the protein to the ER during translation), for example ER retention sequences such as KDEL, and KFERQ, Or a lysosomal target sequence such as QREFK.
  • Short amino acid sequences can act as signals to target proteins to specific intracellular organs. For example, a hydrophobic signal peptide is found at the amino terminus of the protein towards ER.
  • Such a transport sequence may be the HLA-DR.alpha leader sequence Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID NO: 16). If that portion is sufficient to transport the polypeptide of the invention to the ER, it may comprise only a portion of the above specified 25 residue sequences (eg at least 10 amino acid residues) of the signal peptide.
  • Standard techniques can be used to construct DNA encoding the peptides of the invention (see eg the technique described in WO 94/04171).
  • the construct can be located on additional sequences that increase expression in human cells, such as appropriate promoters, RNA stable 5 'and 3' sequences of coding sequences, introns (5 'or 3' in the sequence being encoded).
  • poly (A) addition sites, as well as their constructs may include replication origin and selection markers that allow for selection and replication for prokaryotic and / or eukaryotic hosts.
  • the plasmid of the present invention may have a kanamycin resistance gene (519-1313 site), an SV40 early promoter (131-484 site), and a thymidine kinase (TK) polyadenylation site (1314-1758 site).
  • Kanamycin resistance genes and related regulatory sequences are for selection purposes only and can be removed from the plasmid if selection is not required or desired.
  • the peptides and nucleic acids of the invention can be used as prophylactic or therapeutic vaccines in subjects known to be infected by HPV, suspected of being infected by HPV, or susceptible to infection by HPV. Other suitable subjects include those who exhibit or are likely to develop symptoms of HPV-related diseases.
  • the peptides and vaccines of the present invention are useful for treating diseases associated with infection of HPV strain 16, such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papillomas, cervical dysplasia, cervical cancer, and vulvar cancer. vulval cancer, or as a vaccine to treat or prevent prostate cancer.
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be administered alone or in combination with other therapies known in the art, such as chemotherapeutic agents, radiation and surgery to treat HPV infection or diseases associated with HPV infection.
  • Peptides and nucleic acids of the invention can also be administered in combination with other therapies designed to enhance an immune response, for example adjuvant or cytokines (or nucleic acids encoding cytokines), as is well known in the art. .
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be used in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of HPV infection or a disease associated with HPV infection.
  • the delivery systems of the present invention can be used to deliver a peptide or DNA construct that expresses the peptide to appropriate cells that are intended to promote an immune response against HPV.
  • Peptides of the invention or nucleic acids encoding the peptides are standard methods, for example Donnelly et al., J. Imm. Methods 176: 145, 1994, and Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95: 341, may be administered using a method such as that described in 1995.
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be injected in a form known in the art to a subject, such as intramuscular injection, intravenous injection, arterial injection, intradermal injection, intraperitoneal injection, intranasal, intravaginal, enema, subcutaneous or they For example, it may be administered to the gastrointestinal tract, mucosa or respiratory tract by inhalation of a powder or solution containing microparticles. Administration can be local (eg cervical or other infectious site) or systemic.
  • the peptides of the present invention or nucleic acids encoding the peptides can be carried in pharmaceutically acceptable carriers such as colloidal suspensions, powders, saline, lipids, liposomes, microspheres, or nanospheres. They may be complexed with, associated with, or naked with a vehicle and may be lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, catalyzers, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids. The delivery can be carried out using a delivery system known in the art.
  • a dose of about 0.1 to 100 micromoles of peptide or about 1 to 200 micrograms of DNA is administered per kg of body weight once.
  • a dose for a given patient may be based on a number of factors including the patient's height, body surface area, age, the specific compound administered, sex, time and route of administration, general health and other agents administered simultaneously. Depends on Determination of the appropriate dosage is skillful within the capabilities of pharmacists of ordinary skill.
  • APCs antigen presenting cells
  • dendritic cells dendritic cells
  • peripheral blood mononuclear cells or bone marrow cells
  • APCs antigen presenting cells
  • bone marrow cells can be obtained from a patient or a suitable donor and activated in vitro with the present immune composition and then administered to the patient. have.
  • Microparticles including those described in US Pat. No. 5,783,567, can be used as vehicles for transporting macromolecules such as DNA or peptides into cells. They contain macromolecules enclosed within the shell of the polymer or entered into the polymer matrix. Microparticles act to maintain the properties of macromolecules, for example to keep the DNA intact. Microparticles can also be used for pulsed delivery of macromolecules and for delivery to specific locations or to specific cells or target cell populations.
  • the polymer matrix may be a biodegradable copolymer such as poly-lactic-co-glycolic acid, starch, gelatin or chitin.
  • Microparticles can be used in particular to maximize the transport of DNA molecules into the phagocytes of the subject. Or the microparticles can be injected or implanted into tissue.
  • Peptides of the invention can be administered to a subject via lipids, dendrimers or liposomes well known in the art.
  • liposomes carrying an immunopeptide or nucleic acids encoding the peptide are known to cause a CTL response in vivo (Reddy et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148: 3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89: 5157, 1992).
  • Peptides and nucleic acids of the invention can be administered using Immune Stimulating Complexes (ISCOMS), a 30-40 nm sized (-) occupied cage-like structure produced by mixing saponin alone or cholesterol and Quil A (saponin) simultaneously. have. Peptides and nucleic acids of the invention can be administered simultaneously or separately from ISCOMS.
  • ISCOMS Immune Stimulating Complexes
  • the ability of the peptides and nucleic acids of the invention to elicit an immune response can be analyzed using methods for measuring immune responses well known in the art.
  • the generation of cytotoxic T cells can be expressed using MHC tetramers, measuring intracellular cytokine expression or in a standard 51 Cr release assay.
  • Standard assays such as ELISA or ELISPOT can also be used to determine cytokine profiles that contribute to T cell activation.
  • T cell proliferation can also be measured using other assays known in the art and assays such as the 3 H-thymidine uptake.
  • B cell responses can be measured using an assay such as ELISA.
  • the purpose of the present invention is to develop an E7 peptide vaccine that reacts with HLA class I epitope, which is the smallest unit that induces cell immune response among HPV type 16 E7 proteins, and among them, E7 peptide vaccine suitable for HLA-A * 2402 type.
  • Flow cytometry was performed using HPV type 16 E7 peptides synthesized to develop specific HPV type 16 E7 epitopes that induce the production of cytotoxic T lymphocytes.
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
  • CTL and cervical cancer cells which were mass-produced using E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptide and Interleukin (IL) 2, were cultured together to measure CTL's cancer cell killing ability. Cytotoxicity experiments confirmed that E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptides were effective in causing cell death of cervical cancer cells.
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
  • LCVQSTHVDIRTLED was confirmed to be more powerful.
  • CD8 + T cells cytotoxic T cells
  • effectors of the anticancer immune response studies are underway to identify target antigens recognized by CD8 + T cells, which are the key to treatment in certain cancers (Boon T, Coulie PG, Van Den Eynde BJ and Van Der BP. Annu Rev Immunol. 2006. 24: 175-208; Rosenberg SA. Nature. 2001. 411: 380-384).
  • the most basic condition of anti-cancer immunotherapy is that certain antigens that are specifically expressed in the cancer cells to be treated must be present. Cervical cancer cells have been shown to contain target antigens that can strongly induce a human immune cell response. It has been one of the targets of immune cell therapy using CTL (CD8 +). HPV type 16 and HPV type 18 are the most common types of HPV, which are known to cause cervical cancer. E5 has been shown to stimulate cell proliferation among several viral proteins expressed when HPV is infected. , E6 and E7 are found in cervical cancer cells and their role in carcinogenesis is well known.
  • HPV type 16 is found in almost all races and is known to have the highest risk of development, which is why research for the treatment of cancer caused by HPV type 16 is an important part (18).
  • E5, E6 and E7, which are expressed in HPV type 16 infected cervical cancer cells, are the main targets of this treatment, and in particular, are the key targets of adoptive CD8 + T cell therapy that requires the recognition of specific antigens.
  • HPV type 16 E7 is known as a major protein that causes tumorigenesis and growth together with E6, and it has been shown that the interaction between two proteins or carcinogenesis alone (Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM and Schlegel). RJ Virol. 1989. 63: 4417-4423; McDougall JK. Curr. Top.
  • PBMCs are supplied from normal HLA-A * 2402 type blood donors, treated with synthesized E7 peptides, and cultured for 1 or 2 weeks to measure the expression level of IFN- ⁇ and CD69 to differentiate into CD8 + T cells. Candidates for inducing peptides were selected, and the actual anticancer effect was confirmed using the cytotoxicity test 51 Cr release assay.
  • the E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptides among the 14 peptides synthesized showed higher levels of IFN- ⁇ production compared to other E7 peptides. It could be expected to have an effective immunogenicity.
  • CD69 an antigen expressed on the surface when T cells are activated, is known to play a role in causing T cell activity and proliferation (Ziegler SF, Ramsdell F and Alderson MR. Stem Cells. 1994. 12 (5): 456- 65).
  • CD69 Since CD69 is differentiated and found in mature T cells, CD69 can be used for selection of E7 peptides that induce differentiation into CD8 + T cells through the expression level of CD69.
  • the expression level of CD69 using fluid cytometry showed that E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptides induced higher levels of CD69 production than other E7 peptides. ( Figure 3).
  • the E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) epitope whose expression level of IFN- ⁇ and CD69 were similar to the E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) epitope in fluid cytometry, was unexpectedly affected by the cell death effect of E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED). It was lower than the epitope (FIGS. 4 and 5). This result is expected to be due to the different degree of immunity to actual cervical cancer cells due to the difference in amino acid sequence of the two E7 epitopes.
  • E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptide and HPV type 16 E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) peptide were used to develop HLA-A * 2402 type cervical cancer vaccine and adoptive immune cell therapy through fluid cytometry and cytotoxicity experiments. It was found that the epitope was effective in producing toxic T lymphocytes.
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
  • FIG. 1 and 2 are measurements of IFN- ⁇ expression in specific HLA-A * 2402 type CD8 + T cells induced by HPV type 16 E7 epitopes using fluid cytometry.
  • FIG. 1 shows Donor 1: HLA-A. * 2402/2601,
  • FIG. 2 shows Donor 2: HLA-A * 2402/3001).
  • Figure 3 is a measure of the degree of CD69 expression of specific HLA-A * 2402 type CD8 + T cell surface induced by HPV type 16 E7 epitope using fluid cytometry.
  • Donor 3 HPV type 16, HLA-A * 2402/3001
  • FIGS. 4 and 5 are measurements of the killing effect of HLA-A * 2402 type cervical cancer cells by HPV type 16 E7 epitopes 11 and 12 using 51 Cr release assay
  • Figure 4 is a Donor 4: HLA -A * 2402/3303
  • Figure 5 shows Donor 5: HLA-A * 2402/2601.
  • each peptide was treated with PBMCs of blood donor for 1 week. Later cultured IL-2 (negative control), pp65 328-336 (A24, QYDPVAALF, positive control: SEQ ID NO: 20), pp65 495-493 (A02, NLVPMVATV, negative control: SEQ ID NO: 21) and E6 29-38 ( E6A2, TIHDIILECV, negative control: SEQ ID NO: 22) were compared with the control group.
  • IL-2 negative control
  • pp65 328-336 A24, QYDPVAALF, positive control
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
  • E6 29-38 E6A2, TIHDIILECV
  • Negative control peptides were treated, and each peptide was treated once again with dendritic cells of the same patient cultured one week later, and after 5 hours incubation, CD69 production levels were analyzed by fluid cytometry.
  • HLA-A * 2402 type cervical cancer cells act and kill, they were analyzed using 51 Cr release assay.
  • E6A2 TIHDIILECV, negative control
  • HPV type 16 E7 protein The total amino acid sequence of HPV type 16 E7 protein was synthesized by using computer algorithms to overlap each of 15mer in size, and then purified using high performance liquid chromatography (HPLC). A total of 14 peptides were synthesized by finally selecting more than 95% of the peptides (Table 1). Peptides synthesized in this way are dissolved in 1% DMSO PBS and stored frozen at -20 ° C and thawed at room temperature immediately before use.
  • Table 1 shows the synthesized HPV type 16 E7 peptide sequence.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • Table 2 is a table for the HLA-A * 2402 type blood donor.
  • Example 3 Generation of autologous dendritic cells from PBMC
  • PBMC obtained by centrifugation is placed in a T75 flask containing RPMI culture (10% FBS, 5% antibiotics) and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After that, the suspended cells are removed and Interleukin-4 (IL-4, 1000 U / ml) and granulocyte-macrophage stimulating factor (GM-CSF, 800 U / ml) are added to the monocytes attached to the flask. 2-4 days after the start of culture, IL-4 (1000U / ml) and GM-CSF (1600U / ml) are added. Change RPMI cultures from time to time as the cells grow. At 5 days after the start of the culture, tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ , 1000u / ml) is added.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • dendritic cells and cytotoxic T cells to which the peptide was added are incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • PHA phytohemagglutinin
  • BFA brefeldin A
  • cells are collected from each well and washed with PBS (phosphate-buffered saline). After washing, PBS containing 1 mM EDTA was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the cells were washed twice with PBS containing 5% FBS, and the fluorescently labeled perdinin-chlorophyll-protien (PerCP) -conjugated mouse anti-human CD3 + antibody and phycoerythrin (PE) -conjugated mouse anti-human Put CD8 + antibodies in a ratio of 1: 100, respectively, and incubate in dark at 4 ° C. for 15 minutes.
  • the lysing solution and the permeabilization solution were treated separately, and fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated mouse anti-human IFN- ⁇ antibody was added and incubated in dark at 4 ° C for 30 minutes.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Cytotoxicity experiments were performed using a 51 Cr release assay using cervical cancer cell lines as target cells. Briefly, 0.1 mCi Na 2 51 CrO 4 was added to HLA-A * 2402 type cervical cancer cell line cultured in RPMI culture and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. After washing twice with PBS, an appropriate number of target cells are put in various ratios to cytotoxic T cells and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After incubation, centrifuge at 1500 rpm for 5 minutes and transfer 100 ⁇ l to the prepared ⁇ -counter tube. Measure and analyze using ⁇ -ray counter. The extent of cytotoxic T cell specific target cell death is calculated using the formula [(experimental cpm-spontaneous cpm) / (maximum cpm-spontaneous cpm)] ⁇ 100.
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED

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Abstract

본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HPV type 16의 E7 단백질 유래 E7 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HPV type 16의 E7 단백질 유래 E7 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 자궁 경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높은 것으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁 경부암으로 사망하고 있으며, 그 수가 계속 증가하고 있다 (zur Hausen H.: Nat Rev Cancer. 2002. 2(5):342-50) 또한, 자궁 경부암의 주원인은 인유두종 바이러스(human papilomavirus : HPV)로 알려져 있으며, 100여종이 넘는 HPV 중 40여종이 여성 생식기 감염을 유발하며 (de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU and zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004. 324: 17-27) 그 중에서 HPV type 16과 HPV type 18 감염이 자궁 경부암 발생에 중요한 역할을 담당하고 있으며 특히 HPV type 16 감염이 가장 흔한 것으로 밝혀져 있다 (Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ and Meijer CJ. N. Engl. J. Med. 2003. 348: 518-527).
HPV가 정상 세포에 감염되면 viral oncogene이 숙주세포의 유전자에 삽입되어 여러 viral protein을 발현하게 되는 데, 그 중 E6와 E7은 강력한 oncoprotein으로서 tumor suppressor인 p53과 rb gene의 작용을 억제하여 정상 자궁경부세포에서 암세포의 세포형질 변환을 유도하며 또한 암세포의 지속적인 성장을 촉진함이 알려져 있다(Werness BA, Levine AJ and Howley PM. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science. 1990. 248: 76-79; Dyson N, Howley PM, Munger K. and Harlow E. Science. 1989. 243: 934-937).
특히 E7은 tumor suppressor 인 rb의 기능을 억제하여 (Kiyono T, Foster SA, Koop JI, McDougall JK, Galloway DA and Klingelhutz AJ. Nature. 1998. 396: 84-88), 세포성장 주기 중 S-phase 유전자인 cyclin A 와 cyclin E의 활성을 촉진하고( Zerfass K, Schulze A, Spitkovsky D, Friedman V, Henglein B and Jansen-Durr P. J. Virol. 1995. 69: 6389-6399.), 또한 cyclin-dependent kinase inhibitor인 CIP1(p21)과 KIP1(p27)의 기능을 억제하는 등(Jones DL, Alani RM and Munger K. Genes Dev. 1997. 11: 2101-2111; Funk JO, Waga S, Harry JB, Espling E, Stillman B, Galloway DA. Genes Dev. 1997. 11: 2090-2100; Zerfass-Thome K, Zwerschke W, Mannhardt B, Tindle R, Botz JW, Jansen-Durr P. Oncogene. 1996. 13: 2323-2330)의 작용으로 HPV 감염된 세포의 apoptosis를 저해하고 종양으로의 전환을 유도할 뿐만 아니라 자궁경부암 환자의 종양면역반응을 강력히 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
최근 들어 종양면역학의 급속한 발달로 인체면역력을 이용한 인체 각종 암치료법들이 개발되고 있으며 특히 암 특이 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T lymphocyte : CTL)를 이용한 종양 특이 면역세포치료법 개발에 대한 연구가 미국 국립암센터 (National Cancer Institute : NCI)를 중심으로 활발히 진행되고 있다. CTL을 이용한 특정 암 특이 면역세포치료법 개발에 있어 가장 중요하고도 우선적인 것은 대상 암세포 단백질 중에서 인체 항암면역반응을 강력하게 유도할 수 있는 암특이 표적항원을 발굴하는 것이다. 표적 항원을 개발하는 여러 가지 방법 중 본 연구에서는 표적항원이 인체 내 면역 반응을 유발하는 최소 단위인 각 human leukocyte antigen (HLA) class I 에피토프과 결합하는 peptide 항원을 암세포내 단백질에서 개발하는 방법을 이용하였다. 이러한 표적 항원의 최소 면역반응 단위 중 하나인 HLA class I 에피토프은 각각의 HLA type에 따라 특정 아미노산 서열을 갖는 peptide 항원과 반응하게 된다. 본 발명에서는 자궁 경부암 치료를 위한 CTL 대량생산을 위해 HPV type 16의 E7 항원 내에서 HLA-A*2402형 에피토프과 반응하는 peptide 항원 아미노산 서열을 밝혔다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 HPV 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 펩타이드를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HPV 타입 16 E7 단백질로부터 유래한 9개 이상의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 9개에서 17개의 서열인 것이 바람직하고 15개인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 LCVQSTHVD(서열번호 15)의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 CDSTLRLCVQSTHVD(서열번호 10) 또는 LCVQSTHVDIRTLED(서열번호 11)인 것이 바람직하며, LCVQSTHVDIRTLED(서열번호 12)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 서열번호 15의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또 본 발명은 상기 서열번호 10의 펩타이드 또는 서열번호 11의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산을 제공한다.
상기 서열번호 15의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산(ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac)이 바람직하고, 상기 서열 번호 10의 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 18의 핵산(tgt gac tct acg ctt cgg ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac)이 바람직하며, 상기 서열 번호 11의 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 19의 핵산(ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac att cgt act ttg gaa gac)이 바람직하나 degeneracy 등을 고려하여 그 서열은 변화될 수 있다.
또한 본 발명은 (a)상기의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학용 조성물을 제공한다.
상기의 조성물은 HPV 감염 관련 질환 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암의 치료 또는 예방에 유용하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*2402 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산은 선택적으로 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)(활성성분으로 사포닌만을 포함할 수도 있는) 또는 본 발명의 펩타이드를 투여 대상에 공급하기에 적합한 다른 운반수단 속에 제제화될 수 있다. 미세입자를 사용하는 경우 그것은 바람직하게는 poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA)와 같은 공중합체인 중합체 매트릭스를 갖는다.
포유류에서 면역반응(예를 들어 MHC class I-매개 또는 class II-매개 면역 반응을 포함하는 세포 면역 반응)은 면역원성 펩타이드가 결합하는 MHC 분자를 가지는 포유류, 즉 인간, 유인원, 개, 고양이, 또끼, 소, 쥐에 면역원성 펩타이드를 투여하여 촉발될 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드는 미세입자, 리포좀, 또는 ISCOM, 또는 용액의 일부로 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 투여하는 또 다른 방법은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 이용하는 것이다. 그 핵산 서열은 선택적으로 상기의 본 발명의 펩타이드에 연결된 신호 서열을 코딩할 수도 있다.그 핵산이 신호 서열을 코딩할 때 바람직하게는 그것은 HLA-DR.alpha로부터 온 신호 서열 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala(서열번호 16)을 코딩한다. 그 경우에 본 발명의 서열은 예를 들어 서열번호 11 또는 12의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 그 핵산은 핵산 감염을 일으키는 바이러스 유전자를 포함하지 아니하고 인택트 E7 단백질을 코딩하지 아니한다.
본 발명의 핵산은 프라즈미드 내에 포함될 수 있고, 선택적으로 중합체 매트릭스를 포함하는 미세입자 내에 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서 중합체 매트릭스는 필수적으로 PLGA의 공중합체로 구성된다. 바람직하게 그 미세입자는 예를 들어 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다. 바람직하게는 복수의 미세입자들이 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다.
본 발명의 프라즈미드를 포함하는 세포도 본 발명의 범위 내이다. 그 세포는 예를 들어 B 세포 또는 다른 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 그 세포는 그것을 ㅋ코딩하는 프라즈미드로부터 펩타이드 발현을 가능하게 하는 조건에서 배양되거나 유지된다.
본 발명의 핵산 및 프라즈미드는 예를 들어 "naked DNA"로 포유류에 상기 언급한 플라즈미드를 투여하여 포유류 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법에 유용하다. 그 포유류는 HPV 감염, 자궁경부 이형성증, 및/또는 자궁경부암의 위험이나 또는 질환을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산 및 플라즈미드도 미세 입자, 리포좀, ISCOMS, 또는 상기에 기재된 것과 같은 다른 적당한 운반 수단에 삽입될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에 개재된 펩타이드들과 그 펩타이드를 코딩하는 핵산은 HPV E7 단백질에 대한 면역 반응을 야기하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 세포내 기관으로 그 펩타이드를 운반하는 수송(trafficking) 서열이 연결될 수 있다. 그 수송서열은 그것이 부착된 펩타이드의 세포내 수송(소기관에서 소기관으로 또는 세포 표면으로 이동을 지시)을 조절하는 기능을 하는 아미노산 사열이다. 그러한 수송 서열들은 ER, 리소좀 또는 엔도좀으로 그 폴리펩타이드들을 수송할 수 있고 시그널 펩타이드들(번역 동안 ER에 단백질을 지시하는 N-말단 서열), 예를 들어 KDEL 과 같은 ER 체류 서열, 및 KFERQ, 또는 QREFK와 같은 와 같은 리소좀 타겟 서열을 포함할 수 있다.
짧은 아미노산 사열들은 특정세포내 기관으로 단백질을 타겟하는 시그널로 작용할 수 있다. 예를 들어 ER로 가는 단백질의 아미노 말단에서 소수성 시그널 펩타이드가 발견된다.
그러한 수송 서열은 HLA-DR.알파 리더 서열인 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (서열번호 16)일 수 있다. 만약 그 부분이 본 발명의 폴리펩타이드를 ER로 수송하는데 충분하다면, 그 시그널 펩타이드의 상기 특정된 25개의 잔기 서열 중 일부분(예를 들어 적어도 10개의 아미노산 잔기)만을 포함할 수 있다.
일부 경우에는 시그널 펩티데이즈에 의한 가공(즉 절단)을 가능하게 하기 위하여 본 발명의 HPV E7 항원성 펩타이드를 코딩하는 서열과 수송 서열을 연결하는 부분은 변형되는 것이 바람직하다. 시그널 펩타이드들에 대한 인식 서열들은 Von Heijne, NAR 14:4683, 1986에 기재된다.
본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 구축하는데 표준 기술이 사용될 수 있다(예를 들어 WO 94/04171에 기재된 기술을 참고). 그 구축물은 인간 세포들에서 발현을 증가시키는 부가적인 서열들 예를 들어 적당한 프로모터, 코딩 서열의 RNA 안정 5' 과 3' 서열, 인트론(코딩되는 서열 내에 5' 또는 3' 어느 쪽에도 위치될 수 있음), 및 폴리(A) 부가 자리뿐만 아니라 그 구축물이 원핵 및/또는 진핵 숙주에 대한 선택 및 복제를 가능하게 하는 복제 오리진 및 선택 마커들을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라즈미드 내에는 가나마이신 저항 유전자(519-1313 부위), SV40 얼리 프로모터(131-484 부위) 및 thymidine kinase (TK) 폴리아데닐레이션 자리(1314-1758 부위)를 가질 수 있다. 가나마이신 저항 유전자 및 관련 조절 서열은 단지 선택의 목적을 위한 것이고 만약 선택이 필요하지 않거나 바람직하지 않으면 플라즈미드로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및 핵산은 HPV에 의하여 감염된 것으로 알려졌거나, HPV에 의하여 감염된 것이 의심스럽거나, HPV에 의하여 감염될 수 있는 대상에서 예방 또는 치료적인 백신으로 사용될 수 있다. 다른 적당한 대상들은 HPV-관련 질환의 증상을 나타내거나 질환이 발생할 것 같은 사람들을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 백신은 HPV 균주 16의 감염과 관련된 질환들, 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암을 치료하거나 예방하는 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 운반 시스템들은 HPV에 대한 면역 반응을 촉진시키려는 적당한 세포들에 펩타이드 또는 그 펩타이드를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 운반하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 표준 방법, 예를 들어 Donnelly et al., J. Imm. Methods 176:145, 1994, 및 Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 대상에 당업계에 공지된 형태, 예를 들어 근육주사, 정맥주사, 동맥주사, 피내주사, 복강주사, 코의내부, 질내, 관장내, 피하내 주사될 수 있거나 그들은 예를 들어 미세입자를 포함하는 분말 또는 용액의 흡입에 의하여 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(예를 들어 자궁경부 또는 다른 감염자리) 또는 전신성일 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노구형입자와 같은 약학적으로 수용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 그들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련되거나 또는 네이키드될 수 있고 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축하반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 운반될 수 있다.
약 0.1에서 100 마이크로몰의 펩타이드 용량 또는 약 1에서 200 마이크로그램의 DNA의 용량이 1회 체중 kg 당 투여되는 것이 바람직하다. 물론 당업계에 주지된 바와 같이 주어진 환자에 대한 용량은 환자의 키, 체표면적, 나이, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약제를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 적정 투여량의 결정은 통상의 지식을 가진 약사들의 능력 범위내에서 능숙하다.
바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
미국 특허 제 5,783,567에 기재된 것을 포함하는 미세입자들이 세포 속으로DNA, 또는 펩타이드와 같은 거대분자를 운반하기 위한 운송수단으로 사용될 수 있다. 그들은 폴리머의 쉘 내에 둘러 쌓여 있거나 폴리머 매트릭스에 들어간 거대분자들을 포함한다. 미세입자들은 예를 들어 들어있는 DNA를 분해되지 않은 상태로 유지하는 것과 같은 거대분자의 특성을 유지하는 작용을 한다. 미세입자들은 또 거대분자들의 펄스된 운반 및 특정 위치에 운반 또는 특정 세포 또는 타겟 세포군으로 운반에 사용될 수 있다.
폴리머 매트릭스는 poly-lactic-co-glycolic acid, 전분, 젤라틴 또는 키틴과 같은 생분해성 공중합체일 수 있다. 미세입자들은 대상의 식세포로 DNA 분자들의 이동을 최대화하는데 특히 사용될 수 있다. 또는 그 미세입자들은 조직에 주사되거나 이식될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 주지된 지질, 덴드리머 또는 리포좀을 통하여 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어 면역 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들을 운반하는 리포좀들은 인 비보에서 CTL 반응을 야기하는 것으로 알려졌다(Reddy et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148:3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89:5157, 1992).
본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 사포닌 단독 또는 콜레스테롤 및 Quil A (사포닌)을 동시에 혼합하여 생성된 30-40 nm 크기의 (-) 차지된 케이지 유사 구조인 Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 ISCOMS와 동시 또는 별도로 투여될 수 있다.
보호면역은 항원에 대한 운반 수단으로 ISCOMS을 사용한 톡소플라스마증 및 Epstein-Barr 바이러스 유도된 종양들을 포함하는 감염의 여러 실험 모델에서 생성되어 왔다(Mowat et al., Immunology Today 12:383-385, 1991). ISCOMS에서 캡슐화된 1ug의 낮은 항원 용량이 클래스 I 매개된 CTL 반응을 생성하는 것이 발견되었다(Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990).
면역 반응을 야기하는 본 발명의 펩타이드 및 핵산의 능력은 당업계에 주지된 면역 반응을 측정하는 방법들을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 세포 독성T 세포들의 생성은 MHC 테트라머를 사용하거나 세포내 사이토카인 발현을 측정하거나 표준 51Cr release 분석에서 나타낼 수 있다. ELISA 또는 ELISPOT와 같은 표준 분석도 T 세포 활성화에 기여하는 사이토카인 프로화일을 측정하는데 사용될 수 있다. T 세포 증식은 또 당업계에 공지된 다른 분석들과 3H-thymidine 업테이크와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다. B 세포 반응들은 ELISA와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 다른 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서는 HPV type 16의 E7 단백질 중 세포면역반응을 유발하는 가장 최소단위인 HLA class I 에피토프과 반응하는 E7 peptide 백신을 개발하는 데 그 목적이 있으며 그 중에서도 HLA-A*2402형에 적합한 E7 peptide 백신을 개발하였다. 세포 독성 T 림프구를 생성을 유도하는 특정한 HPV type 16 E7 에피토프을 개발하기 위해 합성된 HPV type 16 E7 펩타이드를 이용하여 유체 세포측정법(flow cytometry)을 실행한 결과 E7 펩타이드 가운데 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 높은 세포 독성 T 세포의 분화 및 활성을 유도 하는 것을 알 수 있었다. 그리고 실제 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) peptide와 인터류킨 (Interleukin: IL) 2을 이용해 대량생산된 CTL과 자궁경부암 세포를 함께 배양하여 CTL의 암세포 살상능력을 실제 측정하는 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통해 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 자궁 경부암 세포의 세포 사멸을 유발하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 HLA-A*2402 형을 갖는 자궁경부암 환자의 치료 및 백신 개발에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였으며, 특히 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)의 효과가 더욱 강력함을 확인하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
최근 많은 연구진들에 의해 항암 면역 반응의 작동자 (effector)로 알려진 세포 독성 T 세포(CD8+ T 세포)를 이용한 암 치료와 관련하여 분자 혹은 세포 수준에서 일어나는 여러 가지 기전들이 점차 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되고 있으며 , 또한 특정 암에 있어서 치료의 핵심이 되는, CD8+ T 세포에 의해 인식되는 표적항원을 밝혀 내기 위한 연구들도 활발히 진행되고 있다(Boon T, Coulie PG, Van Den Eynde BJ and Van Der BP. Annu Rev Immunol. 2006. 24: 175-208; Rosenberg SA. Nature. 2001. 411: 380-384).
항암 면역치료의 가장 기초적인 조건은 치료의 대상이 되는 암세포에 특이적으로 발현되는 특정 항원이 존재해야 된다는 것인데, 자궁경부암 세포에는 인체 면역세포반응을 강력하게 유발할 수 있는 표적항원의 존재가 밝혀져 있어 CTL (CD8+)을 이용한 면역세포치료의 대상 중 하나가 되고 있다. 자궁 경부암을 일으키는 주원인으로 알려진 인유두종 바이러스(HPV) 중 HPV type 16과 HPV type 18은 가장 발병 위험도가 높은 type으로 HPV가 감염되었을 때 발현되는 여러 바이러스 단백질 가운데 세포 증식을 자극하는 역할을 하는 것으로 밝혀진 E5, E6 그리고 E7은 자궁 경부암 세포에서 발견되며, 발암 과정에서의 역할이 잘 알려져 있다.
HPV type 16은 거의 모든 인종에서 발견되어 발병 위험도가 가장 높은 것으로 알려져 있고, 이런 이유에서 HPV type 16에 의해 발생되는 암의 치료를 위한 연구가 중요한 부분을 차지하고 있다(18). HPV type 16이 감염된 자궁 경부암 세포에서 발현되는 E5, E6 그리고 E7은 이러한 치료의 주요 대상이 되며, 특히 특정 항원의 인식이 필요한 adoptive CD8+ T 세포치료의 핵심적인 target이 되어 있다. HPV type 16 E7은 E6와 함께 종양형성 및 성장을 일으키는 주요 단백질로 알려져 있으며, 두 단백질간의 상호작용 또는 단독으로도 발암작용이 가능한 것으로 밝혀져 있다(Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM and Schlegel R. J. Virol. 1989. 63: 4417-4423;McDougall JK. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. 186: 101-119; Band V, Zaychowski D, Kulesa V and Sager R. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. 87: 463-467;Halbert CL, Demers GW and Galloway DA. J. Virol. 1991. 65: 473-478.19-22).
그 동안 이루어진 HPV type 16 E7을 대상으로 하는 adoptive CD8+ T 세포치료에 관한 연구는 HLA-A*0201 type을 갖는 백인종(cacasian)을 위주로 진행되어 항암효과를 나타내는 몇몇의 특이적인 E7 에피토프을 밝혀 내었다. 그러나, 전세계 인구의 절반 이상을 차지하고 있는 아시아인종(asian) 중 다수를 차지하는 HLA-A*2402 type 환자의 adoptive CD8+ T 세포치료를 위해 진행되어 나타난 HPV type 16 E7 에피토프의 연구 결과물은 거의 없는 실정이다.
본 발명에서는 정상 HLA-A*2402 type 혈액 증여자에게서 PBMC를 공급받아 합성된 E7 펩타이드를 처리하여 1주 혹은 2주간 배양한 후 IFN-γ 및 CD69의 발현 정도를 측정하여 CD8+ T 세포로의 분화를 유도하는 펩타이드의 후보를 선정하고, 세포 독성 실험인 51Cr release assay 을 사용하여 실제적인 항암 효과를 확인해 보았다.
도 1과 2에서 알 수 있는 바와 같이, 합성된 14개의 펩타이드 중 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 나타냄으로써 효과적인 면역성(immunogenic)을 가지고 있음을 예상할 수 있었다. T 세포가 활성화되면 표면에 발현되는 항원인 CD69는 T 세포의 활성과 증식을 야기시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ziegler SF, Ramsdell F and Alderson MR. Stem Cells. 1994. 12(5): 456-65). CD69는 분화가 일어나 성숙된 T 세포에서 발견되기 때문에 CD69의 발현 정도를 통해 CD8+ T 세포로의 분화를 유발하는 E7 펩타이드의 선별에 이용될 수 있다. 유체 세포측정법을 사용하여 CD69의 발현 정도를 확인한 결과, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 CD69의 생성을 유도하는 것으로 나타나는 것을 알 수 있었다 (도 3).
이 결과는 IFN-γ의 생성 정도를 확인한 실험과 함께 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 매우 유력한 백신(vaccine)개발 및 adoptive CD8+ T 세포치료에 있어서 매우 유력한 E7 에피토프 후보임을 확인 할 수 있었다.
유체 세포측정법을 사용하여 선별한 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프가 실제로 HLA-A*2402 type의 자궁 경부암 세포에 대해 항암효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 기법을 이용하여 세포 사멸효과를 측정해 본 결과, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프을 처리한 실험군에서 pp65 328-336(A24, QYDPVAALF) 펩타이드를 처리한 양성대조군보다 월등히 높은 세포 사멸효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 반면, 유체 세포측정법에서 IFN-γ와 CD69의 발현 정도가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프와 유사하게 나타난 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 에피토프는 예상과 달리 세포 사멸 효과가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프에 비해 낮게 나타났다(도 4 및 도 5). 이러한 결과는 두 E7 에피토프의 아미노산 서열 차이에서 기인하는 실제 자궁 경부암 세포에 대한 면역성 유발 정도가 다르기 때문에 나타난 것으로 예상된다.
따라서 유체 세포측정법과 세포 독성 실험을 통해 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드와 HPV type 16 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 펩타이드가 HLA-A*2402 type 자궁 경부암의 백신 개발과 adoptive 면역세포치료에 필요한 세포 독성 T 림프구 생성에 효과적인 에피토프임을 규명할 수 있었다.
본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 매우 유력한 백신(vaccine)개발 및 adoptive CD8+ T 세포치료에 있어서 매우 유력한 E7 에피토프 후보임을 확인할 수 있었다.
도 1 및 2는 유체 세포측정법을 이용한 HPV type 16 E7 에피토프에 의해 유도되는 특이적인 HLA-A*2402 type CD8+ T 세포내의 IFN-γ 발현 정도의 측정한 그림으로 도 1은 Donor 1 : HLA-A*2402/2601, 도 2는 Donor 2 : HLA-A*2402/3001)를 나타낸다.
도 3은 유체 세포측정법을 이용한 HPV type 16 E7 에피토프에 의해 유도되는 특이적인 HLA-A*2402 type CD8+ T 세포표면의 CD69 발현 정도의 측정한 그림. Donor 3 (HPV type 16, HLA-A*2402/3001)
도 4 및 도 5는 51Cr release assay 기법을 이용한 HPV type 16 E7 에피토프 11번과 12번에 의한 HLA-A*2402 type 자궁 경부암 세포의 사멸 효과의 측정한 그림으로, 도 4는 Donor 4 : HLA-A*2402/3303, 도 5는 Donor 5 : HLA-A*2402/2601를 나타낸다.
(1) 유체 세포측정법을 이용한 HPV type 16 E7 에피토프 특이적인 IFN-γ의 생성확인
합성된 14개의 HPV type 16 E7 펩타이드 가운데 HLA-A*2402 type 환자 특이적으로 세포 독성 T 세포 생성을 유도하는 E7 에피토프의 후보를 선정하기 위해, 혈액 증여자의 PBMC에 각각의 펩타이드를 처리해 주고 1주일 후에 배양된 IL-2(음성대조군), pp65 328-336(A24, QYDPVAALF, 양성대조군:서열번호 20), pp65 495-493 (A02, NLVPMVATV, 음성대조군:서열번호 21)와 E6 29-38(E6A2, TIHDIILECV, 음성대조군:서열번호 22)을 각각 처리한 대조군과 비교하여 보았다. 도 1과 2에서 나타났듯이, 14개의 펩타이드 모두 IL-2만을 처리한 대조군 보다 높은 IFN-γ 의 생성을 유도하였고, 두 가지의 음성대조군(negative control)보다 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 보이는 펩타이드 중 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 실험군에서 양성대조군(positive control)에 거의 근접한 수준으로 IFN-γ의 생성수치가 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 따라서, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 유력한 특이적 E7 에피토프으로 예상할 수 있었다.
(2) 유체 세포측정법을 이용한 HPV type 16 E7 에피토프 특이적인 CD69의 생성확인
유체 세포측정법을 사용하여 선별한 11번과 12번 E7 펩타이드의 특이적인 세포 독성 T 세포 생성효과를 재확인하기 위해서 또다른 세포 독성 T 세포의 활성 표식자로 알려진 CD69의 생성을 유체 세포측정법을 이용하여 확인하였다(Ziegler SF, Ramsdell F and Alderson MR. Stem Cells. 1994. 12(5): 456-6513). 혈액 증여자의 PBMC에 IL-2(음성대조군), pp65 328-336(A24, QYDPVAALF, 양성대조군), E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)과 E6 29-38(E6A2, TIHDIILECV, 음성대조군) 펩타이드를 각각 처리해 주고 1주일 후에 배양된 동일 환자의 수지상 세포와 함께 각각의 펩타이드를 다시 한번 처리해 준 뒤 5시간 배양 후에 CD69의 생성수치를 유체 세포측정법을 실시하여 분석하였다. 결과를 분석해 보면, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 실험군에서 A24를 처리한 양성대조군에 근접한 수치의 CD69 생성이 유발되는 것을 확인 할 수 있었다.(도 3)
(3) HPV type 16 E7 에피토프 특이적인 자궁 경부암 세포 독성 실험
실제로 HLA-A*2402 type 자궁 경부암 세포에 작용하여 사멸시키는 효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 법을 이용해 분석해 보았다. 혈액 증여자의 PBMC에 IL-2, pp65 328-336(A24, QYDPVAALF, 양성대조군), E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)과 E6 29-38(E6A2, TIHDIILECV, 음성대조군) 펩타이드를 각각 처리해 주고 1주일 후에 배양된 동일 환자의 수지상 세포와 함께 각각의 펩타이드를 다시 한번 처리해 준 뒤 1주일간 배양 후, 51Cr이 표지된 HLA-A*2402 type 자궁 경부암 세포와 섞어 5시간 동안 배양하고 감마방사선 측정기를 이용하여 분석하였다. 분석한 결과를 살펴 보면, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 실험군의 사멸 효과가 IL-2나 E6 29-38(TIHDIILECV) 등을 처리한 음성대조군은 물론, 양성대조군인 pp65 328-336(QYDPVAALF)을 처리한 것보다도 월등히 높은 수치의 세포 사멸 효과를 보여 주었다. E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 펩타이드를 처리한 실험군은 pp65 328-336을 처리한 양성대조군에 근접한 사멸 효과 수치를 나타내었지만 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드의 효과에는 미치지 못하는 것을 알 수 있었다. (도 4 및 도 5)
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되지 아니한다.
실시예 1: 펩타이드(peptide) 합성
HPV type 16 E7 단백질의 전체 아미노산 서열을 컴퓨터 알고리즘(computer algorithms)을이용하여 각각 15mer의 크기로 중복(overlapping)되도록 나누어 합성한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC)기기를 이용하여 순도가 95% 이상 되는 펩타이드를 최종적으로 선택하여 총 14개를 합성하였다(표 1). 이런 식으로 합성된 펩타이드는 1% DMSO PBS에 녹인 후 -20℃에 냉동 보관한 후 사용 직전에 실온에서 해동하여 사용한다.
표 1
펩타이드 번호(서열번호) 아미노산 위치 아미노산 서열
1(1) 1-15 MHGDTPTLHEYMLDL
2(2) 7-21 TLHEYMLDLQPETTD
3(3) 13-27 LDLQPETTDLYCYEQ
4(4) 19-33 TTDLYCYEQLNDSSE
5(5) 25-39 YEQLNDSSEEEDEID
6(6) 31-45 SSEEEDEIDGPAGQA
7(7) 37-51 EIDGPAGQAEPDRAH
8(8) 43-57 GQAEPDRAHYNIVTF
9(9) 49-63 RAHYNIVTFCCKCDS
11(10) 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
12(11) 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
13(12) 73-87 HVDIRTLEDLLMGTL
14(13) 79-93 LEDLLMGTLGIVCPI
15(14) 85-99 GTLGIVCPICSQKP
상기 표 1은 합성된 HPV type 16 E7 펩타이드 서열이다.
실시예 2: 세포의 준비
연구 동의서에 서명한 HLA-A*2402 type 혈액 증여자(표 2)의 혈액에서 원심분리(centrifugation)를 이용해 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리한다. 간략히 설명하면, Ficoll-Hypaque 1.077를 사용하여 농도기울기(density-gradient)를 형성한 후 그 위에 증여자의 혈액을 조심스럽게 흘려 넣은 뒤 2000 rpm의 속도로 상온에서 15분간 원심분리를 실시한 후 백혈구 층(buffy coat)만을 채취하여 PBS로 2회 세척하여 실험에 사용한다.
표 2
혈액 증여자(donor) 성별 HLA-A HLA-B HLA-C
1 남 A*2402/2601 15, 35 03, 04
2 남 A*2402/3001 13, 55 01, 06
3 남 A*2402/3001 13, 40 06, 08
4 남 A*2402/3303 07,44 07,07
5 남 A*2402/2601 13,40 03,03
상기 표 2는 HLA-A*2402 type 혈액 증여자에 대한 표이다.
실시예 3: PBMC로부터 자가 수지상 세포(autologous dendritic cell)의 생성
원심분리를 통해 얻어진 PBMC를 RPMI 배양액(10% FBS, 5% antibiotics)이 들어 있는 T75 플라스크에 넣어 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 그 후, 부유된 세포들을 제거하고 플라스크에 고착된 단핵 세포(monocyte)에 Interleukin-4(IL-4, 1000U/ml)와 granulocyte-macrophage stimulating factor(GM-CSF, 800U/ml)를 첨가한다. 배양 시작 후 2일, 4일째 되는 때에 IL-4(1000U/ml)와 GM-CSF(1600U/ml)을 각각 넣어 준다. 세포의 성장에 맞춰 수시로 RPMI 배양액을 교체해 준다. 배양 시작 후 5일째 되는 때에 tumor necrosis factor-α(TNF-α, 1000u/ml)를 첨가한다.
실시예 4: 펩타이드에 특이적인 polyclonal 세포 독성 T 세포의 생성
초저온 동결 되어 있는 HLA-A*2402 type 혈액 증여자의 PBMC를 해동시켜 각 well당 2ml의 RPMI 배양액이 채워진 24 well 배양용기에 적정한 수의 세포를 넣어 준다. 배양 시작 후 1일째 되는 때에 시험하고자 하는 펩타이드(10μg/ml)와 Interleukin-2(IL-2, 100U/ml)를 각 well에 첨가해 준다. 배양기간 중 이틀 간격으로 IL-2(1000U/ml)을 넣어주고 배양액을 교체해 준다. 배양 시작 후 7일째 되는 때에 위에 언급한 방법으로 생성된 수지상 세포(세포 독성 T 세포 수의 최소 10분의 1 이상의 세포 수)와 펩타이드(20μg/ml)를 첨가해 준다.
실시예 5: 유체 세포측정법(flow cytometry)를 이용한 세포내 Interferon-γ(IFN-γ) 생성측정
배양 시작 후 7일째 되는 때에 수지상 세포와 펩타이드가 첨가된 세포 독성 T 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이때, 실험군 중 한 그룹에 phytohemagglutinin(PHA, 0.25 μg/ml)을 넣어 준다. 배양 후 10 μg의 brefeldin A(BFA)를 각각 첨가해 준 뒤, 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 그 후, 각각의 well에서 세포를 채취하여 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척해 준다. 세척 후 1mM 농도의 EDTA가 들어 있는 PBS를 넣어 주고 37℃에서 10분간 배양한다. 배양이 끝나면, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고, 형광표지된 항체인 perdinin-chlorophyll-protien(PerCP)-conjugated mouse anti-human CD3+항체와 phycoerythrin(PE)-conjugated mouse anti-human CD8+ 항체를 각각 1:100의 비율로 넣어 준 뒤 4℃에서 15분간 dark상태로 배양한다. 배양 후, lysing solution과 permeabilization solution을 각각 처리해 주고, fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human IFN-γ 항체를 첨가해 준 뒤 4℃에서 30분간 dark상태로 배양한다. 이 후, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고 1% formaldehyde로 고정시킨 뒤 FACS(fluorescence activated cell sorting)장비를 이용해 측정하여 분석한다.
실시예 6: 세포 독성 실험(cytotoxicity assay)
자궁 경부암 세포주를 목표 세포(target cell)로 하여 51Cr release assay를 사용하여 세포 독성 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, RPMI 배양액에서 배양된 HLA-A*2402 type의 자궁 경부암 세포주에 0.1 mCi 의 Na2 51CrO4를 첨가하여 37℃에서 45분간 배양한다. PBS로 2회 세척한 후, 적정수의 목표 세포를 세포 독성 T 세포에 다양한 비율로 넣어 주고 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 배양이 끝나면 1500 rpm으로 5분간 원심분리를 해주고 미리 준비한 γ-counter tube에 100μl씩 옮겨 넣는다. γ-ray counter를 이용해 측정하여 분석한다. 세포 독성 T 세포 특이적인 목표 세포 사멸의 정도는 [(experimental cpm-spontaneous cpm)/(maximum cpm-spontaneous cpm)]×100 의 공식을 이용하여 산정한다.
본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 매우 유력한 백신(vaccine)로 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. LCVQSTHVD(서열번호 15)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 CDSTLRLCVQSTHVD(서열번호 10) 또는 LCVQSTHVDIRTLED(서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제 1항의 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 17의 염기서열을 가진 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 2항의 서열번호 10의 펩타이드 또는 서열번호 11의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열을 가진 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. (a)제1항의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. (a)제2항의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제 7항 또는 제8항에 있어서, 상기의 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  11. 제3항 내지 제 6항 중 임의의 어느 한 항의 핵산을 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  12. 제 7항 또는 제8항에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*2402 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
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