CZ302351B6

CZ302351B6 - Ockovací prípravek obsahující kapsomer lidského papilomaviru a jeho použití

Info

Publication number: CZ302351B6
Application number: CZ20001244A
Authority: CZ
Inventors: Gissmann@Lutz; Müller@Martin
Original assignee: Loyola University Of Chicago
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2011-03-30
Also published as: NZ503830A; EP1021547B1; US20090028894A1; DE69836753T2; JP4520034B2; US6228368B1; JP2010095530A; PT1021547E; JP2013147507A; US20050031636A1; CA2305382A1; US7371391B2; IL190554A0; ES2280104T3; PL195332B1; EP1021547A1; NO20001768D0; EP1690941B1; JP2001519161A; IL135528A0

Abstract

Ockovací prípravek obsahující kapsomer lidského papilomaviru, který zahrnuje fúzní protein obsahující aminokyselinové zbytky zkráceného proteinu L1 lidského papilomaviru sousedící s aminokyselinovými zbytky druhého proteinu, pricemž uvedený fúzní protein inhibuje tvorbu virum podobných cástic a uvedený ockovací prípravek vyvolává imunitní odpoved neutralizující viriony lidského papilomaviru. Rešení se dále týká použití ockovacího prípravku pro výrobu farmaceutického prostredku pro lécení nebo prevenci HPV infekce a chorob s ní souvisejících.

Description

Očkovací přípravek obsahující kapsomer lidského papilomaviru a jeho použití

Oblast techniky

Předložený vynález se týká očkovacích přípravků s obsahem papilomavirových proteinů ve formě fuzních proteinů. Dále se vynález zabývá způsoby přípravy kapsomer obsažených ve farmaceutických přípravcích.

Dosavadní stav techniky

Předpokládá se, že u člověka je infekce určitými vysoce rizikovými kmeny genitálních papilomavirů u lidí (HPV), například HPV16, 18 nebo 45, hlavním rizikovým faktorem při vzniku zhoubných nádorů anogenitálního traktu. Zdaleka nej frekventovanějším zhoubným nádorem tohot? typ hrdla· nndle nrfťzkiirrm Světnvé zdravotnické organizace (WHO) se objevuje každoročně téměř 500 000 nových případů tohoto onemocnění. Díky vysoké frekvenci, s jakou se tento patologický stav objevuje, byla souvislost mezi infekcí HPV a karcinomem děložního hrdla podrobně prostudována a byly učiněny některé obecné závěry. Například je známo, že prekurzorové leze cervikální intraepitelíální neoplázie (CÍN) jsou způsobeny infekcí papilomavirem [Crum, New Eng. J. Med. 310: 880-883 (1984)]. DNA pocházející z genomu určitých typů HPV, včetně například kmenů 16, 18, 33, 35 a 45, byla detekována ve více než 95 % nádorových biopsií od pacientů s tímto onemocněním, stejně jako v primárních buněčných liniích, kultivovaných ze zmíněných nádorů. Bylo zjištěno, že přibližně 50 až 70 % biopsií z CIN nádorů obsahuje DNA pocházející výhradně z HPV16. Proteiny E6 a E7, produkty časných genů virů HPV16 a HPV18, byly detekovány v buňkách karcinomu děložního hrdla, stejně jako v lidských keratinocytech transformovaných in vitro [Wettstein et al., in Papilloma Viruses and Human Cancer, Pfister (Ed.), CRC Press: Boča Raton, FL 1990, pp 155-179] a u významného procenta pacientů s karcinomem děložního hrdla byly detekovány anti-E6 a anti-E7 protilátky.

Bylo zjištěno, že se proteiny E6 a E7 účastní indukce syntézy buněčné DNA v lidských buňkách, transformace lidských keratinocytů a dalších typů buněk a vzniku nádoru u transgenních myší [Arbelt et al., J. Virol., 68:4358-4364 (1994); Auewarakul et al., Mol. Cell. Biol. 14: 8250-8258 (1994); Barbosa et al., J. Virol. 65:292-298 (1991); Kaur et al., J. Gen. Virol. 70:1261-1266 (1989); Schlegel et al., EMBO J. 7:3181-3187 (1988)]. Konstitutivní exprese E6/E7 proteinů se zdá být nezbytná pro udržení transformovaného stavu HPV pozitivních tumorů. Přestože mají některé kmeny HPV schopnost indukovat neoplastický fenotyp in vivo i in vitro, jiné typy HPV způsobují benigní bradavice jako například condylomata acuminata a jen zřídka jsou asociovány s maligními nádory [Ikenberg, in Gross et al., (eds.) Genital Papillomavirus Infections, Springer Verlag: Berlin, pp 87-112]. Mezi málo rizikové kmeny tohoto typu patří například HPV6 a

HPV11.

Nejčastější cestou přenosu genitálních papilomavirů u lidí je pohlavní styk. V mnoha případech se poté rozvine trvalá infekce anogenitální sliznice. Zatímco zmíněné poznatky naznačují, že primární infekce buď indukuje neadekvátní imunitní odpověď, nebo že se u viru vyvinula schopnost nějakým způsobem uniknout pozornosti imunitního systému, výsledky jiných výzkumů předpokládají, že imunitní systém je aktivní jak během primární manifestace virové nákazy, tak i během maligní progrese papilomavirové infekce [Altmann et al., in Viruses and Cancer, Minson et al., (eds.), Cambridge University Press, (1994) pp 71—80].

Například klinické manifestaci primární infekce králičími nebo hovězími papilomaviry lze předejít očkováním extrakty z bradavic nebo strukturními virovými proteiny [Altmann et al, supra; Campo, Curr. Top. in Microbiol. and Immunol. 186: 255-266 (1994); Yindle and Frazer, Curr. Top. in Microbiol. and Immunol. 186:217-253 (1994)].

- 1 CZ 302351 B6

Hlodavci, preventivně očkovaní rekombinantními viry vakcínie, kódujícími časné proteiny HPVI6 E6 nebo E7, nebo syntetickými peptidy E6 nebo E7, jsou podobně chráněni před vznikem nádoru v důsledku ínokulace autologními buňkami transformovanými HPV 16. [Altmann et al.. supra; Campo, supra; Yindle and Frazer, supra]. Regrese bradavic může být indukována přenosem lymfocytů z organizmu regresora a následnou infekcí odpovídajícími živočišnými papilomaviry. Konečně u imunosuprimovaných pacientů, jako jsou například pacienti po transplantaci nebo jedinci infikovaní virem HIV, byl zjištěn zvýšený výskyt genitálních bradavic, CIN a rakoviny anogenitálního traktu.

Ve Verilogy 234, 1997, strany 93-111 se popisují způsoby výroby chimémích papilomavirům podobných částic sestávajících z HPV 16L1 a E7 fúzních proteinů. Li at al (1997), J. Virology 71, 2988-2995 uvádí získání kapsomer trypsinovým štěpením.

Až dosud nebyla popsána žádná očkovací látka, která by ve formě kapsomer obsahovala pozdní Ll protein lidského papilomaviru, a která by byla vhodná jak pro preventivní, tak i pro terapeutické účely. Vzhledem ktomu, že protein Ll není přítomen v maligních genitálních lezích, nemá u takových pacientů očkování Ll proteinem žádný léčebný účinek. Konstrukce chimémích proteinů obsahujících aminokyselinové zbytky proteinu Ll a například proteinu E6 nebo E7 vede ke vzniku chimémích kapsomer, které v sobě spojují preventivní i terapeutickou funkci vakcíny. Metoda produkce chimémích kapsomer ve velkém měřítku je tedy vzhledem k možným výhodám, jaké taková vakcína nabízí jak pří preventivním, tak při terapeutickém použití, velmi žádoucí.

Vyvstala tedy potřeba navrhnout očkovací prostředek pro prevenci a léčbu infekcí HPV. Metody přípravy očkovacích přípravků, které by překonaly obecně známé problémy s expresí rekombinantních HPV proteinů a jejich purifíkací, by byly zjevně velmi užitečné při léčbě populací i jedinců, kteří již byli nakaženi HPV, stejně jako při imunizaci populací nebo jedinců, kteří jsou k infekci HPV vnímaví.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká očkovacího přípravku obsahujícího kapsomer lidského papilomaviru, který zahrnuje fúzní protein obsahující aminokyselinové zbytky zahrnující zkrácený protein Ll lidského papilomaviru sousedící k aminokyselinovým zbytkům druhého proteinu, přičemž uvedený fúzní protein ínhibuje tvorbu virům podobných částic a uvedený očkovací přípravek vyvolává imunitní odpověď neutralizující viriony lidského papilomaviru,

Vynález se dále týká použití očkovacího přípravku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci HPV infekce a chorob s ní souvisejících. Zvažovány jsou rovněž způsoby výroby a purifikace kapsomer a proteinů podle vynálezu.

V jednom z aspektů předloženého vynálezu je uvažován preventivní očkovací přípravek pro prevenci HPV infekce, který obsahuje strukturní proteiny papilomaviru Ll a L2. Při vývoji vakcíny tohoto typu musely být překonány značné obtíže, neboť papilomaviry nemohou být v buněčné kultuře ani dalších experimentálních systémech pomnoženy na odpovídající titry, umožňující získání virových proteinů v množství dostatečném pro ekonomickou výrobu očkovací látky. Navíc metody exprese rekombinantních proteinů nejsou vždy přímé a často je výsledkem nízký výtěžek požadovaného proteinu.

V poslední době byly popsány virům podobné částice (VLP), jejichž struktura je podobná virové kapsidě, které byly připraveny po expresi virových proteinů Ll a L2 (nebo pouze Ll) v hmyzích buňkách Sf-9 s použitím rekombinantního viru vakcínie nebo bakuloviru. VLP mohou být poté snadno purift kovány centrifugací v CsCI nebo sacharózovém gradientu [Kimbauer et ak, Proč. Nati. Acad, Sci. (USA), 99: 12180-12814 (1992); Kimbauer et ak, J. Virok 67: 6929-6936

-2CZ 302351 B6 (1994); Proso et al., J. Virol. 6714:1936-1944 (1992); Sasagawa et al., Virology 2016:126-195 (1995); Volpers et ak, J. Virol. 69:3258-3264 (1995); Zhou et ak, J. Gen. Virok 74: 762-769 (1993); Zhou et ak, Virology 185:251-257 (1991)]. WO 93/02184 popisuje metodu, ve které jsou papilomaviru podobné částice (VLP) použity pro diagnostické aplikace nebo jako vakcína proti infekcím způsobeným papilomaviry. WO 94/00152 popisuje rekombinantní techniky přípravy LI proteinu, který napodobuje konformační neutralizační epitop na virionech lidských a živočišných papilomavirů.

Dalším z aspektů navrhovaného vynálezu jsou terapeutické vakcinace prováděné za účelem io zmírnění komplikací, které jsou důsledkem infekce HP V, například pre kurzorových lézí karcinomu děložního hrdla. Tato metoda tedy představuje alternativu k preventivnímu zásahu. Vakcíny tohoto typu mohou obsahovat časné proteiny papilomavirů, konkrétně E6 nebo E7, které jsou exprimovány v trvale infikovaných buňkách. Předpokládá se, že po podání vakcíny tohoto typu by mohly být aktivovány cytotoxické T-buňky, namířené proti trvale infikovaným buňkám v genitálních lezích. Cílovou populací pro terapeutickou intervenci jsou pacienti s HPV-asocio* ma I ioním i CTenitálními léyprni PCT natentová nřihláŠka . — .j .... _r. - ------------- — ..

WO 93/20844 popisuje, že časný protein E7 a jeho antigenní fragmenty, pocházející z papilomavirů HPV nebo BPV, jsou u savců terapeuticky účinné pro regresi, ale nikoliv prevenci nádorů vyvolaných infekcí papilomavirů. Časné HPV proteiny byly produkovány rekombinantní expresí v E. coli nebo ve vhodných eukaiyotických buňkách. Purifikace rekombinantních proteinů se ovšem ukázala jako velmi obtížná díky obecně nízké rozpustnosti exprimovaných proteinů a vysoké komplexnosti purifikačního postupu, který obecně nezbytně zahrnuje kombinaci mnoha kroků včetně iontoměničové chromatografie, gelové filtrace a afinitní chromatografie.

Předmětem předloženého vynálezu jsou očkovací přípravky s obsahem papilomavirových kapsomer, které obsahují buď (i) první protein, kterým je intaktní virový protein, exprimovaný jako fúzní protein, složený z části z aminokyselinových zbytků druhého proteinu; (ii) zkrácený virový protein; (iii) zkrácený virový protein exprimovaný jako fúzní protein, složený zčásti z aminokyselinových zbytků druhého proteinu, nebo (iv) některou kombinaci výše uvedených tří typů proteinů. Předmětem vynálezu jsou tedy očkovací přípravky obsahující kapsomery hovězího papilomaviru (BPV) a lidského papilomaviru. Kapsomery hovězího papilomaviru obsahují s výhodou protein z hovězího papilomaviru typu I. Lidské virové kapsomery obsahují s výhodou proteiny z kteréhokoliv z lidských kmenů papilomavirů HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 a HPV45. Nejvhodnější očkovací přípravky zahrnují kapsomery obsahují protei35 ny z lidského viru HPV16.

V jednom z provedení vynálezu zahrnují očkovací prostředky kapsomery s obsahem intaktního virového proteinu exprimovaného ve formě fúzního proteinu s aminokyselinovými zbytky druhého proteinu. Zmíněnými intaktními virovými proteiny jsou s výhodou strukturní proteiny papilo40 mavirů LI a L2. Kapsomery tvořené fúzními proteiny íntaktních virových proteinů mohou být připraveny s použitím dvojice proteinů LI a L2, nebo s použitím proteinu LI samotného. Nejvhodnější kapsomery jsou připraveny výhradně z LI fúzních proteinů, jejichž aminokyselinová sekvence je zde uvedena jako SEQ ID NO:2 a odpovídající kódující polynukleotidová sekvence jako SEQ ÍD NO:L Aminokyseliny druhého proteinu mohou pocházet z různých zdrojů (včetně aminokyselinových zbytků prvního proteinu). Podmínkou je, že přidání aminokyselinových zbytků druhého proteinu k sekvenci prvního proteinu umožní tvorbu kapsomer. Je s výhodou, pokud přidání aminokyselinových zbytků druhého proteinu inhibuje schopnost intaktního virového proteinu tvořit částice podobné virovým partikulím. Vůbec nej výhodnější je, pokud aminokyselinové zbytky druhého proteinu tvorby kapsomer přímo podněcují. V jednom z provedení navrhovaného vynálezu může být druhým proteinem kterýkoliv lidský nádorový antigen, virový antigen nebo bakteriální antigen, kterýje důležitý pro stimulaci imunitní odpovědi při neoplastických nebo infekčních stavech. Je s výhodou, pokud je druhý protein také papilomavirovým proteinem. Dále je s výhodou, pokud je druhý protein produktem exprese časných papilomavirových genů. Také je ovšem s výhodou, pokud je druhý protein vybrán ze skupiny obsahující El, E2, E3,

E4, E5, E6 a E7 - produkty časných genů kódované genomy papilomavirů HPV6, HPV11,

-3 CZ 302351 B6

HPV 18, HPV33, HPV35 a HPV45. Vůbec nejvýhodnější je, pokud je druhý protein kódovaný genem E7 viru HPV16. Odpovídající ORF je zde znázorněn jako SEQ ID NO:3.

Kapsomery tvořené podjednotkami z fúzních proteinů jsou zde nazývány chimémími kapsomerami. V jednom z provedení je předmětem navrhovaného vynálezu očkovací látka tvořená chimémími kapsomerami, kde aminokyselinové zbytky proteinu LI tvoří asi 50 až 99% celkových aminokyselin fúzních proteinů. V dalším z provedení vynálezu tvoří aminokyselinové zbytky proteinu LI asi 60 až 90% celkových aminokyselin fúzních proteinů a vůbec nejraději tvoří aminokyselinové zbytky proteinu LI 80 % celkových aminokyselin fúzních proteinů. Předmětem navrhovaného vynálezu jsou dále očkovací látky tvořené kapsomerami s obsahem zkrácených virových proteinů, u kterých byl deletován alespoň jeden aminokyselinový zbytek, nezbytný pro tvorbu virové částice. Je výhodné, pokud aminokyselinová delece neinhibuje schopnost zkrácených proteinů tvořit kapsomery a vůbec nej vhodnější je, pokud zmíněná delece tvorbu kapsomer podporuje. Vhodné očkovací látky tohoto typu zahrnují kapsomery tvořené zkrácenými LI proteiny samotnými nebo spolu s proteiny L2. Zvláště vhodné kapsomery jsou tvořeny zkrácenými LI proteiny. Zkrácené proteiny podle navrhovaného vynálezu jsou takové, u kterých byl deletován alespoň jeden aminokyselinový zbytek z karboxy-konce (C-konce) proteinu, nebo u kterých byl deletován alespoň jeden aminokyselinový zbytek z amino-konce (N-konce) proteinu, nebo u kterých byl deletován alespoň jeden aminokyselinový zbytek z vnitřní oblasti proteinu (tedy ani z jednoho konce). Vhodné kapsomemí očkovací látky jsou tvořeny proteiny, zkrácenými naC-konci. U očkovacích látek obsahujících protein LI z viru HPV 16 je s výhodou, pokud je z C-konce proteinu deletováno 1 až 34 aminokyselin. Uvažovány jsou také relativně kratší delece, kde je s výhodou fakt, že dochází jen k malým modifikacím antigenních vlastností LI proteinů a jimi tvořených kapsomer. Vůbec nejvhodnější je delece 34 aminokyselinových zbytků ze sekvence LI HPV16, odpovídající aminokyselinám 472 až 505 SEQ ID NO:2, kódovaným nukleotidy 1414 až 1516 polynukleotidové sekvence HPV 16 LI, uvedené zde jako SEQ ID NO:1.

Je-li kapsomemí očkovací látka tvořena proteiny nesoucími interní deleci, je výhodné, pokud deletovaná aminokyselinová sekvence zahrnuje oblast proteinu, nutnou pro lokalizaci v jádře. U proteinu LI HPV 16 je jaderný lokalizační signál umístěn v oblasti mezi aminokyselinami 499 a 505. Po expresi LI proteinů, u kterých byl NLS (jaderný lokalizační signál) deletován, dochází k sestavení kapsomemích struktur v cytoplazmě hostitelské buňky. Vzniklé kapsomery jsou tedy purifikovány zcytoplazmy hostitelských buněk namísto z jader, kde dochází k tvorbě kapsomer z intaktních LI proteinů. Kapsomery vzniklé sestavením ze zkrácených proteinů, kde doplněná aminokyselinová sekvence nenahrazuje deletovanou proteinovou sekvenci, nemusí být nutně chimémí povahy.

Dalším z aspektů navrhovaného vynálezu je kapsomemí vakcína tvořená zkráceným virovým proteinem exprimovaným ve formě fúzního proteinu s přilehlými aminokyselinovými zbytky druhého proteinu. Preferovanými zkrácenými virovými proteiny podle vynálezu jsou strukturní proteiny papilomavirů LI a L2. Kapsomery tvořené zkrácenými fúzními virovými proteiny mohou být vytvořeny s použitím obou proteinů LI a L2, nebo jen s použitím proteinu LI. Vhodnější kapsomery jsou ty, které jsou tvořeny aminokyselinovými zbytky proteinu LL Mezi zkrácené proteinové složky fúzních proteinů patří ty, které mají deleci alespoň jedné aminokyseliny ze svého C-konce, alespoň jedné aminokyseliny ze svého N-konce nebo alespoň jedné aminokyseliny z vnitřní části proteinu (tj. nikoliv z koncových oblastí). Nej vhodnější kapsomemí vakcíny jsou tvořeny proteiny zkrácenými na Ckonci. U očkovacích látek obsahujících protein LI z viru HPV 16 je výhodné, pokud je z C-konce proteinu deletováno 1 až 34 aminokyselin. Uvažovány jsou také relativně kratší delece, kde je výhodný fakt, že dochází jen k malým modifikacím antigenních vlastností LI proteinů a jimi tvořených kapsomer. Vůbec nej výhodnější je delece 34 aminokyselinových zbytků ze sekvence LI HPV16, odpovídající aminokyselinám 472 až 505 SEQ ID NO:2, kódovaným nukleotidy 1414 až 1516 polynukleotidové sekvence HPV 16 LI, uvedené zde jako SEQ ID NO:L Je-li kapsomemí očkovací látka tvořena proteiny nesoucími

-4 CZ 302351 B6 interní deleci, je výhodné, pokud deletovaná aminokyselinová sekvence zahrnuje oblast proteinu nebo sekvenci, nutnou pro lokalizaci v jádře.

Aminokyseliny druhého proteinu mohou pocházet z různých zdrojů, pokud přidání aminokyseli5 nových zbytků druhého proteinu k sekvenci prvního proteinu umožní tvorbu kapsomerů. Aminokyseliny druhého proteinu mohou pocházet z různých zdrojů včetně aminokyselinových zbytků prvního proteinu. Je s výhodou, pokud je druhý protein také papilomavirovým proteinem. Dále je výhodné, pokud je druhý protein produktem exprese časných papilomavirových genů. Vůbec nejraději je druhý protein vybrán ze skupiny obsahující produkty časných papilomavirových genů io El, E2, E3, E4, E5, E6 a E7. V jednom z provedení je předmětem předloženého vynálezu očkovací látka tvořená chimémími kapsomerami, kde aminokyselinové zbytky proteinu LI tvoří asi 50 až 99 % celkových aminokyselin fúzních proteinů. V dalším z provedení vynálezu tvoří aminokyselinové zbytky proteinu LI asi 60 až 90% celkových aminokyselin fúzních proteinů a vůbec nej raděj i tvoří aminokyselinové zbytky proteinu LI 80 % celkových aminokyselin fúzních proteinů.

V jednom z výhodných provedení předloženého vynálezu jsou proteiny tvořící očkovací látku připravovány rekombinantními technikami, ale u přípravků obsahujících intaktní virové proteiny mohou být tyto proteiny izolovány z přirozených zdrojů. Intaktní proteiny izolované z přiroze20 ných zdrojů mohou být modifikovány in vitro za vzniku fúzních proteinů podle vynálezu. Tyto úpravy jsou prováděny technikami kovalentní modifikace, které jsou v oboru dobře známy a rutinně užívány. Podobně u přípravků obsahujících zkrácené virové proteiny mohou být použity proteiny izolované z přirozeného zdroje, které jsou dále upraveny in vitro chemickou hydrolýzou nebo enzymatickým štěpením některou z mnoha místně specifických nebo i nespecifických proteáz. Takto zkrácený protein může být dále modifikován adicí dalších aminokyselinových zbytků tak, jak je to popsáno výše, za vzniku zkráceného fúzního proteinu podle vynálezu.

Při přípravě kapsomer mohou být pro produkci DNA, kódující požadovaný intaktní protein, zkrácený protein nebo zkrácený fúzní protein, použity techniky rekombinantní molekulární biologie.

Rekombinantní techniky, použité pro přípravu DNA kódující požadovaný protein jsou mezi odborníky dobře známé a rutinně používané. Techniky nezbytné pro provádění požadovaných manipulací s DNA jsou popsány v laboratorních příručkách, například Sambrook et al., (eds.), Molecular Clon ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) a Ausbel et al., (eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne. (199435 1997). Pro produkci chimémích kapsomer ve velkém mohou být proteiny exprimovány s použitím virových nebo eukaryotních vektorů. Mezi vhodné vektory patří všechny dobře známé prokaryotické expresní vektory, rekombinantní bakuloviry, COS specifické vektory, rekombinantní viry vakcinie, nebo kvasinkově-specifické expresní konstrukty.

Jsou-li pro produkci kapsomer podle vynálezu použity rekombinantní proteiny, jsou tyto nejprve izolovány z hostitelské buňky, ve které byly exprimovány, a poté jsou inkubovány za podmínek, které umožní jejich samosestavení ve funkční kapsomery. Alternativně mohou být proteiny exprimovány za podmínek umožňujících tvorbu kapsomer přímo v hostitelské buňce.

Vynález se dále zabývá způsobem přípravy kapsomemích očkovacích přípravků. Jedním ze způsobů je exprese proteinů LI z DNA, kódující na C-konci LI kódující sekvence navíc šest histidinových zbytků. LI proteiny, exprimované se zmíněnými šesti histidiny na C-konci (His LI proteiny), jsou nejraději exprimovány v E. coli a His LI proteiny jsou poté purifikovány s použitím niklové afinitní chromatografie.

His LI proteiny v buněčném lyzátu jsou suspendovány v denaturačním pufru například v 6M guanidinhydrochloridu nebo v pufru odpovídající denaturační kapacity, a poté jsou purifikovány chromatografií na niklové koloně. Proteiny eluované z niklové kolony jsou dále renaturovány, například 150mM NaCl, ImM CaCl₂, 0,01% Triton-X 100, lOmM HEPES (N-2-hydroxyethyl55 piperazin“N'-2-ethansulfonová kyselina), pH 7,4. Zvláště vhodným způsobem podle vynálezu je

- 5 CZ 302351 B6 sestavení kapsomer následně po dialýze puntíkovaných proteinů, nejraději po dialýze proti !50mM NaCl. 25 mM Ca2+, 10% DMSO (dimethylsulfoxid), 0,1% Triton-X 100, lOmM Tris [tris-<hydroxymethyl)aminornethan] kyselina octová pH 5,0.

? Tvorba kapsomer může být sledována elektronovou mikroskopií a, v případech kdy jsou kapsomery tvořeny fúzními proteiny, je přítomnost různých proteinových složek v sestavené kapsomeře potvrzena western blot analýzou s použitím odpovídajícího specifického antiséra.

Předmětem navrhovaného vynálezu jsou dále způsoby terapeutické léčby jedinců infikovaných ιο HPV, zahrnující podání očkovací látky podle vynálezu v množství účinném pro redukci HPV infekce jedinci, jehož stav takovou léčbu vyžaduje. Dále jsou předmětem vynálezu způsoby preventivní léčby jedinců vnímavých k HPV infekci zahrnující podání očkovací látky podle vynálezu v množství účinném pro prevenci HPV infekce jedinci, který je k HPV infekci vnímavý.

Zatímco infikovaní jedinci mohou být snadno identifikovány standardními diagnostickými tech15 nikami, vnímaví jedinci mohou být identifikováni například jako sexuální partneři infikovaných jedinců. Ovšem díky značnému rozšíření HPV infekce mohou být do skupiny jedinců vnímavých k infekci papilomaviry zařazeny všechny sexuálně aktivní osoby.

Podání očkovací látky může zahrnovat jednu nebo více dalších složek jako jsou farmaceuticky přijatelné nosiče, rozpouštědla, adjuvans a/nebo pufry. Vakcína může být podána jedenkrát, nebo může být podání několikrát opakováno. Očkovací látka podle vynálezu může být podávána různými způsoby, například orálně, intravenózně, intramuskulárně, nasálně, rektálně, transdermálně, vaginálně, subkutánně a intraperitoneálně. Očkovací látka podle vynálezu nabízí ve srovnání s konvenčními očkovacími přípravky celou řadu výhod. V případě terapeutického očkování

2> mohou, například u pacientů s CIN nebo karcinomem děložního hrdla, kapsomery vyvolávat eliminaci trvale infikovaných buněk. Dále může terapeutické očkování tohoto typu sloužit i jako prevence při ochraně pacientů s CÍN lézemi před opakovanou infekcí. Další výhodou je skutečnost, že kapsomery nejsou citlivé kjiž existujícím neutralizačním protilátkám, a tudíž vykazují ve srovnání s chimémími virům podobnými částicemi delší poločas života v krevním oběhu.

Další výhoda očkovacích přípravků s obsahem chimémích kapsomer spočívá ve zvýšené antigenicitě obou proteinových složek fůzních proteinů, ze kterých se kapsomera skládá. Například u VLP mohou být proteinové složky kapsomery skryty v celkové struktuře kapsomery, což je výsledkem internalizované pozice v rámci samotné VLP. Podobně mohou být epitopy jednotli35 vých proteinových složek stéricky chráněny následkem kontaktu kapsomera-kapsomera a tudíž mohou být nedosažitelné pro vyvolání imunitní odpovědi. Předběžné výsledky získané s VLP sestavené z L1/E7 fůzních proteinů tento fakt potvrdily, neboť proti E7 složce fúzního proteinu nebyla zaznamenána žádná protilátková odpověď. Toto zjištění se shoduje s již dříve publikovanými výsledky které ukazují, že C-koncová oblast Ll tvoří vnitřní pentamerní struktury, které ιο umožňují uspořádání kapsomer do kapsid [Garcia et al., J. Virol. 71: 2988-2995 (1997)].

U chimérních kapsomerních struktur jsou pravděpodobně obě proteinové složky fúzního proteinu, ze kterého je kapsomera sestavena, dostupné, a tudíž schopné vyvolat protilátkovou odpověď. Kapsomerní vakcíny tedy nabízejí další výhodu, kterou je zvýšená anti genie i ta kterékoliv z proteinových složek včetně například neutralizačních epitopů dalších virových proteinů exprimováných ve formě fúzního proteinu s Ll aminokyselinovými sekvencemi.

Detailní popis vynálezu:

Navrhovaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady.

Příklad 1 popisuje konstrukci expresních vektorů pro produkci fůzních nebo chimérních virových proteinů. Příklad 2 se zabývá přípravou rekombinantních bakulovirů pro expresi virových proteinů. Příklad 3 popisuje purifikaci kapsomer. Příklad 4 popisuje imunizační protokol pro přípravu antiséra a monoklonálních protilátek. Příklad 5 se zabývá ELISA testy pro kvantifikaci tvorby

-6CZ 302351 B6 kapsomer. Příklad 6 popisuje další z ELISA metod („antigen capturc ELISA, tj. ELISA metodu založenou na vychytávání antigenu z roztoku pomocí specifické monoklonální protilátky, kde jsou takto imobilizované antigeny kvantifikovány stanovením intenzity barevné reakce konjugátu sekundární protilátky s enzymem a se substrátem zmíněného enzymu, pozn. překladatele), vhod5 nou pro kvantifikaci tvorby kapsomer. Příklad 7 popisuje hemaglutinační test pro stanovení indukce neutralizujících protilátek.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce chimémích Ll genů.

DNA kódující HPV16 Ll otevřený čtecí rámec byla s použitím restrikčního enzymu BglII vystři15 žena z plazmidů 16-114/k-Ll/L2-pSynxtVI [Kimbauer et al., J. Virol. 67; 6929-6936 (1994)] a . ij/, hi/i ciihL·Innrtván Hn vpktnrit nIlC.19 /New F.neland Biolabs. Beverlv, MA), ’ ‘~ J ----- _{É x v} který byl předem linearizován rozštěpením v unikátním BamHl restrikčním místě. Nejprve byly připraveny dva základní expresní konstrukty umožňující postupnou inzerci DNA a následnou expresi fúzního proteinu. První konstrukt kóduje HPV16 Ll 310 s 9 aminokyselin dlouhou dele20 cí, kde zmíněná delece vykazuje jen nízkou homologii s ostatními papilomavirovými LI proteiny. Druhý konstrukt HPV16LI C kóduje Ll protein, u kterého bylo na jeho C-konci deletováno 34 aminokyselin. Další konstrukty nesou v místě delece EcoRV restrikční místo, usnadňující inzerci DNA kódující další proteinové sekvence. Přidáním EcoRV místa je do genu vnesena sekvence pro další dvě aminokyseliny, kyselinu asparagovou a leucin, které nepochází ze sekvence

Ll proteinu.

A) Příprava HPV16 Ll 310 expresního konstruktu:

Byly navrženy dva primery (SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:ó), umožňující amplifikaci vektoru p(JC19 a kompletní HPVI6 Ll kódující sekvence s výjimkou nukleotidů 916 až 942 podle SEQ ID NO:L Primery byly syntetizovány tak, aby výsledné produkty amplifíkace nesly na svých koncích unikátní EcoRV restrikční místo (v sekvencích SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6 označeno podtržením).

CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG SEQ ID NO;5

CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTAC ACCTAGTG SEQ ID NO:6

Výsledný PCR produkt byl opracován enzyme EcoRV za vzniku komplementárních konců a tento produkt byl církularizován ligací. Ligovaná DNA byla standardní metodou transformována do E. coli a plazmidová DNA ze získaných kolonií byla testována na přítomnost EcoRV restrikčního místa. U jednoho z klonů, nazvaného HPV 16 Ll 310 byla prokázána odpovídající 27 nukleotidů dlouhá delece a tento konstrukt byl použit pro inzerci DNA fragmentů kódujících další HPV16 proteiny do EcoRV místa tak jak je to popsáno v následujícím textu.

B) Příprava HPV16L1 C expresních konstruktů.

Byly navrženy dva primery (SEQ ID NO:7 a SEQ IDNO:8), komplementární k HPV 16 Ll ote45 vřenému čtecímu rámci tak, že oba primery na sebe nasedají a umožňují tak amplifikaci templátové DNA nesoucí HPV 16 LI kódující sekvenci v pUC19, popsaném výše, v obou směrech.

-7CZ 302351 B6

AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGA AAC SEQ ID NO.7

AAAGATATCTAATCTACCTCTAC AACTGCTA AACGC AA AAA ACG SEQ ID NO:8

Každý z primerů vnáší na konec amplifíkaČního produktu EcoRV restrikční místo. U downstream primerů (SEQ ID NO:8) následuje za EcoRV místem sekvence TAA, tj. translační stop kodon, umístěná tak, že po lígaci EcoRV konců (cirkularizaci) je Ll sekvence zkrácena na svém C5 konci o 34 aminokyselin. Pomocí PCR byla amplifíkována částečná sekvence LI ORF a kompletní sekvence vektoru. Amplifikační produkt byl opracován EcoRV restrikčním enzymem, cirkularizován T4 DNA ligázou a transformován do E. coli DH5ot buněk. Plazmidy z životaschopných klonů byly analyzovány na přítomnost EcoRV místa, jehož rozštěpením dochází u zmíněných plazrnidů k linearizaci. Byl identifikován jeden pozitivní konstrukt, který byl nazván io pUCHPVlóLl C, a ten byl dále používán pro inzerci dalších HPVI6 proteinů. Pro inzerci DNA bylo opět využito EcoRV místo.

C) Inzerce DNA fragmentů do HPVÍ6 Ll 310 a HPV16L1 C vektorů.

is DNA fragmenty kódující HPVI6 E7 aminokyselinové sekvence 1 až 50, 1 až 60, 1 až 98, 25 až 75, 40 až 98 a 50 až 98 podle SEQ ID NO:4 byly amplifikovány s pomocí primerů, které vnesly na konce amplifikovaných sekvencí EcoRV restrikční místo, které usnadnilo inzerci zmíněných fragmentů do modifikovaných vektorů HPV16 Ll 310 a HPV16 Ll C. V různých amplifikačních reakcích byl použit primer E7.1 (SEQ ID NO:9) v kombinaci s primerem E7.2 (SEQ ID NO: 10) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny 1 až 50; v kombinaci s primerem E7.3 (SEQ ID NO:11) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny 1 až 60; nebo v kombinaci s primerem E7.4 (SEQ ID NO: 12) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny 1 až 98. V dalších amplifikačních reakcích byly použity dvojice primerů E7.5 (SEQ ID NO: 13) a E7.6 (SEQ ID NO: 14) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny

25 až 75; E7.7 (SEQ ID NO:15) a E7.4 (SEQ ID NO: 12) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny 40 až 98 a E7.8 (SEQ ID NO:16) a E7.4 (SEQ IDNO:12) pro přípravu DNA fragmentu kódujícího E7 aminokyseliny 50 až 98.

Primer E7.1 SEQ ID NO:9

AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC

Primer E7.2 SEQ ID NO:10

TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC

Primer E7.3 SEQIDNO:11

TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCC

Primer E7.4 SEQ ID NO: 12

AAA AGATATCTGGTTTCTGAGAAC AG ATGGGGC AC

Primer E7.5 SEQ ID NO:13

TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGAC AGCTCAG

Primer E7.6 SEQ ID NO:14

TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC

-8CZ 302351 B6

Přiměř E7.7 SEQ ID NO:15

TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC

Přiměř E7.8 SEQ ID NO:16

TTTTGATATCGATGCCC ATTAC AATATTGTA ACCTTTTG

Podobně byly amplifikovány nukleotidy z DNA kódující protein chřipkového viru (SEQ ID NO: 17) s použitím dvojice primerů SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO:20. Oba příměry byly navrženy tak, aby výsledný amplifikační produkt nesl na svých koncích EcoRV restrikční místa.

TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC SEQ ID NO:19

Ί l’GA ΓΑ i CG t ttrl I JUtjAlCCCCAI IČCCÁJ i cj SEQ ID NO:20

PCR produkty z každé amplifikační reakce byly opracovány EcoRV a zaligovány do EcoRV io místa HPV16 LI 310 nebo HPV16 LI C vektoru, předem linearízovaného EcoRV enzymem. Pro zjištění orientace inzertů v plazmidech kódujících E7 aminokyseliny 25 až 75 a 50 až 98 a v plazmidů nesoucím chřipkový matrixový protein byla provedena restrikce enzymem Clal, využívající výhody překryvu tohoto místa s nově vytvořeným EcoRV restrikčním místem (GATATCGAT), obsaženým v upstream primerů. U tří expresních konstruktů, nesoucích inici15 ační methionin HPVI6 E7 byla orientace inzertu stanovena štěpením NslI místa, které se nachází v E7 kódující oblasti.

Když byly nalezeny expresní konstrukty s odpovídajícími inzerty, byly oblasti kódující jak proteiny LI, tak i vložené aminokyseliny vystřiženy jako jediný úsek DNA pomocí enzymů Xbal a

Smál a izolovaná DNA byla ligována do plazmidů pVL1393 (Invitrogen) za vzniku rekombinantních bakulovirů.

D) Eliminace EcoRV restrikční ho místa z expresních vektorů.

HPV16 LI C sekvence obsahuje DNA EcoRV místa. Translací takové sekvence vzniká LI protein obsahující aminokyseliny, které se u divokého typu LI proteinu nevyskytují. Byla tedy připravena série expresních konstruktů, u kterých bylo toto umělé EcoRV místo eliminováno. LI sekvence pro tuto sérii expresních konstruktů byla nazvána HPV16 LI C*.

Pro přípravu expresních konstruktů nesoucích HPV16 LI C* sekvenci byly pomocí PCR amplifikovány dva překrývající se fragmenty zpUC HPV16 LI C kódujícího E7 aminokyseliny 1 až 50. Výsledné PCR fragmenty se překrývaly v místě spojení L1/E7, ale neobsahovaly dvě EcoRV restrikční místa. Fragment 1 byl připraven pomocí primerů PÍ (SEQ ID NO:2l) a P2 (SEQ ID NO:22), fragment 2 s pomocí primerů P3 (SEQ ID NO:23) a P4 (SEQ ID NO:24).

-9CZ 302351 B6

Primer Pl

Primer P2

Primer P3

Primer P4

SEQ ID NO.21

GTTATGACATACATACATTCTATG

SEQ ID NO:22

CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC

SEQ ID NO:23

CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC

SEQ ID NO:24

CATCTG AAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG

Po prvních dvou amplifikačních reakcích byly purifikované produkty použity jako tem pláty pro další PCR reakci s použitím primerů Pl a P4. Výsledný amplifikační produkt byl opracován enzymy EcoNI a HindlII a nakloňován do HPV16 LI C expresního konstruktu popsaného výše, předem opracovaného stejnými enzymy. Výsledný expresní konstrukt se od původního HPV16L1 C konstruktu kódujícího LI a E7 aminokyseliny 1 až 50 lišil absencí dvou interních EcoRV restrikčních míst První EcoRV místo bylo nahrazeno DNA kódující v této pozici nativní LI aminokyseliny alanin a glycin, druhé místo bylo nahrazeno translačním stop kodonem. io Expresní konstrukt nazvaný HPV16 LI C* E7 1—52 kóduje dokonce prvních 52 aminokyselin HPV16 E7, neboť použití primerů P4 má za následek vnesení sekvence pro aminokyselinu histidin v pozici 51 a tyrozin v pozici 52 sekvence E7. HPV16 LI C* E7 1-52 byl dále použit pro přípravu dalších HPV16 LI C expresních konstruktů, které obsahují DNA kódující E7 aminokyseliny 1 až 55 (s použitím dvojice primerů Pl (SEQ ID NO:21) a P5 (SEQ IDNO;25)), E7 aminokyseliny 1 až 60 (s použitím dvojice primerů Pl (SEQ ID NO:21) a P6 (SEQ ID NO.26)) a E7 aminokyseliny 1 až 65 (s použitím dvojice primerů Pl (SEQ ID NO:21) a P7 (SEQ ID NO:27)). Další aminokyseliny kódující DNA sekvence jsou výsledkem amplifikace DNA s použitím nově navržených primerů obsahujících DNA kódující požadované aminokyseliny.

Primer P5 SEQ ID NO:25

CATCTGAAGCTTAACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG _2o Primer P6 SEQ ID NO:26

CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

Primer P7 SEQ ID NO:27

CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

Podobně HPV16 LI C* E7 1-70 byl připraven s použitím templátové DNA kódující HPV16 LI C* E7 1-66 a páru oligonukleotidových primerů Pl a P8 (SEQ ID NO:28).

Primer P8 SEQ ID NO:28

C ATCTGAAGCTTATTGTACGCACAAC-CGAAGCGTAG AGTC ACACTTG

Po každé PCR reakci byly produkty amplifikace opracovány EcoNI a HindlII enzymy a vneseny HPV16 LI C vektoru, předem opracovaného stejnými enzymy. Sekvence každého z konstruktů byla ověřena pomocí Applied Biosystems Prism 377 sekvenačního přístroje s použitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů [Prober et al., Science 238: 336-341 (1987)].

- 10CZ 302351 B6

Příklad 2: Příprava rekombinantních bakulovirů.

Buňky Spodoptera frugiperda (Sť9) byly kultivovány v suspenzi nebo v jednovrstvé kultuře při 27 °C vTNMFH médiu (Sigma) doplněném 10% fetálním telecím sérem a 2mM glutaminem.

Pro přípravu rekombinantních bakulovirů s HPV 16 LI konstrukty byly buňky transfekovány 10 pg transferového plazmidu spolu se 2 μg linearizované Baculo-Gold DNA (PharMingen, San Diego, CA). Rekombinantní viry byly purifikovány podle protokolu doporučeného výrobcem. Pro testování exprese HPV16 Lt proteinu bylo 10⁵ Sf9 buněk infikováno rekombinantními bakuloviry pri multiplicitě infekce (m.o.i.) 5 až 10. Po tří- až čtyřdenní inkubaci při 28 °C bylo io médium odstraněno a buňky byly promyty PBS. Buňky byly poté lyžovány v SDS vzorkovém pufru a analyzovány pomocí SDS-PAGE a western blotu s použitím anti-HPV16 LI a antiHPV16 E7 protilátek.

Za účelem stanovení, který z expresních konstruktů nesoucích chimérní LI protein preferenčně produkuje kapsomery, byly extrakty z transfektovaných buněk podrobeny gradientově centrifug?c«_ Prnkrp* 7 gradientu bvlv analyzovány na přítomnost LI proteinu metodou western blot a na tvorbu VLP elektronovou mikroskopií. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

U intaktního HPV LI proteinu, stejně jako u expresních produktů HPV16 LI 310 a HPV16 LI C, byla prokázána produkce kapsomer a VLP v ekvivalentních množstvích. U HPV 16 LI 310 vektorů nesoucích E7 kódující sekvenci byla detekována tvorba kapsomer jen v případě E7 sekvence kódující aminokyseliny 1 až 50. U HPV 16 LI C vektorů nesoucích E7 kódující sekvenci byla detekována tvorba kapsomer u všech fúzních proteinů, přičemž nej vyšší hladinu výhradně kapsomemích struktur vykazoval konstrukt kódující chimérní protein obsahující E7 aminokyseliny

40 až 98. Chimérní proteiny obsahující E7 aminokyseliny 1 až 98 a 25 až 75 produkovaly také převážně kapsomery, ale v tomto případě byla pozorována i tvorba VLP. Chimérní protein obsahující E7 aminokyseliny 1 až 60 vykazoval téměř ekvivalentní tvorbu kapsomer a VLP.

U HPV 16 LI C* vektorů nesoucích E7 sekvence bylo zjištěno, že všechny fúzní proteiny produ30 kují kapsomery. Nejvyšší hladina produkce kapsomer byla zjištěna u E7 sekvencí kódujících aminokyseliny 1 až 52, 1 až 55 a 1 až 60, ale ve všech třech případech byla zjištěna i ekvivalentní produkce VLP. Inzerce E7 DNA kódující aminokyseliny 1 až 65, 1 až 70, 25 až 75 a 1 až 98 měla za následek výrazně nižší produkci kapsid, nebo tato nebyla vůbec stanovitelná, zatímco kapsomery byly produkovány ve značných množstvích.

Schopnost chimérních HPV LI proteinů tvořit kapsomery a kapsidy.

LI expresní konstrukt Inzert

Kapsomery (výtěžek)

Kapsidy (výtěžek)

HPV16L1 žádný +++++ +++++

HPV16L1 310 žádný +++ ++

HPV16L1 C ++++ f ť++

- 11 CZ 302351 B6

HPV16L1 310 E7 1-98

HPV16L1 310 E7 1-50 ++

Κ) HPV16L1 310 E7 25-75

HPV16L1 310 E7 50-98

HPV16L1 C E7 1-98 +++ +

HPV16L1 C E7 25-75 +++ +

HPV16L1 C E7 50-98 + +

HPV16L1 C E7 1-60

4() +++++

HPV16L1 C E7 40-98 ++++

HPVI6L1 C virus chřipky +++ +

HPV16L1 *C E7 1-52 +++++ +++++

- 12CZ 302351 B6

HPV16L1 *C E7 1-55 +++++

-H-+++

HPV16L1 *C E7 1—60 +++ io ++++

HPV16L1 *C E7 1-65 ++

HPV16L1 *C E7 1-70 ++

Příklad 3: Purifikace kapsomer.

Buňky Trichopulsia ni (TN) High Five byly kultivovány do hustoty přibližně 2 x 10⁶ buněk/ml v Ex-Cell 405 bezsérovém médiu (JRH Biosciences).

Asi 2 x 10⁸ buněk bylo centrifugováno při 1000 g po dobu 15 minut a poté resuspendováno ve 20 ml média. Suspenze byla infikována rekombinantními bakuloviry při m.o.i. 2 až 5 po dobu

1 hodiny při pokojové teplotě. Po přidání 200 ml média byly buňky vysety a inkubovány pří teplotě 27 °C po dobu 3 až 4 dnů. Po ukončení inkubace byly buňky sklizeny centrifugaci a pelet byl resuspendován v 10 ml extrakčního pufru. Všechny následující kroky byly prováděny při 4 °C. Buňky byly sonikovány 45 s při 60 W a vzniklý buněčný lyzát byl centrifugován při 10 000 rpm v rotoru Sorval SS 34. Supematant byl odebrán a uschován a pelet byl resuspendován v 6 ml extrakčního pufru, znovu sonikován 3 s při 60 W a znovu centrifugován. Supematanty byly spojeny, navrstveny na dvojvrstevný gradient tvořený 14 ml 40% sacharózy (svrchní vrstva) a 8 ml roztoku CsCl (4,6 g CsCl v 8 ml extrakčního pufru) (spodní vrstva) a centrifugovány ve výkyvném rotoru Sorval AH629 po dobu 2 hodin při 27 000 rpm a 10 °C. Rozhraní mezi CsCl a sacharózou spolu s CsCl vrstvou bylo odebráno do 13,4 ml Quickseal kyvety (Beckman) a objem byl doplněn do 13,4 ml extrakčním pufrem. Vzorky byly centrifugovány přes noc v rotoru 70 TI (Beckman) při 50 000 rpm, 20 °C. Gradienty byly frakcionovány (1 ml frakce). Frakce byly odebírány ze dna a z povrchu kyvety napíchnutím injekční jehlou (vel. 21). Frakce byly odebrány z každé kyvety a 2,5 μΙ z každé frakce bylo dále analyzováno na 10% SDS-PAGE a metodou western blot s použitím anti~HPV16 LI protilátky.

VLP částice a kapsomery byly od výše zmíněných frakcí odděleny sedimentací v 10% až 50% sacharózovém gradientu. Pozitivní frakce z CsCl gradientu byly spojeny a 2 hodiny dialyzovány proti 5mM HEPES (pH 7,5). Polovina dialyzátu byla použita pro přípravu kapsomer rozložením intaktních VLP inkubací přes noc s přídavkem EDTA (v konečné koncentraci

50mM), EGTA (50mM), DTT (30mM), NaCl (lOOmM) a Tris/HCl pH 8,0 (lOmM). Jako kontrola posloužila druhá polovina pouze s přídavkem Tris/HCl a NaCl. Pro analýzu kapsomer, připravených rozložením VLP byly k sacharózovému podkladu přidány EDTA, EGTA a DTT (všechny v konečné koncentraci 5mM). Vzorky byly centrifugovány 2 až 4 hodiny při 250 000 g a 4 °C. Napíchnutím centrifugačních kyvet u dna byly odebrány frakce. Vzorek z každé frakce, ředěný 1:10 byl dále analyzován ELISA testem (konkrétně metodou „antigen capture ELISA“).

- 13 CZ 302351 B6

Příklad 4: Imunizační protokol pro přípravu polyklonálního antiséra a monoklonálních protilátek.

Myši kmene Balb/c byly ve čtyřtýdenních intervalech 3 x subkutánně imunizovány 60 pg HPV chimérních kapsomer smíšených 1:1 s kompletním nebo nekompletním Freundovým adjuvans. Celkový objem očkovací látky byl 100 pl. Šest týdnů po třetí imunizaci byly myši usmrceny a krev byla odebrána punkcí ze srdce.

to Příklad 5: Peptidová ELISA pro kvantifikaci tvorby kapsomer.

Mikrotitrační destičky (Dynatech) byly přes noc potaženy 50 pl peptidu E701 (10 pg/ml v PBS) [Muller et aL, 1982]. Jamky byly blokovány 100 pl pufru PBS s 5% BSA a 0,05% Tween 20 po dobu 2 hodin při 37 °C. Dále byly jamky 3x promyty PBS s přídavkem 0,05% Tween 20. Po třetím promytí bylo do každé jamky přidáno 50 pl séra ředěného 1:5000 v BSA/Tween 20/PBS a destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny. Destičky byly znovu promyty (viz výše) a bylo přidáno 50 pl kozí anti-myší protilátky konjugované s peroxidázou, ředěné 1:5000. Po další hodině byly destičky promyty a obarveny s použitím ABTS substrátu (0,2 mg/ml 2,2-Azino-bis-(3ethylbenzthiazoline)sulfonová kyselina v 0,1 M Na-acetát-fosfátovém pufru (pH 4,2) se 4 pl

30% LLO₂ / 10 ml). Extinkce byla měřena po 1 hodině inkubace při vlnové délce 490 nm na automatickém analyzátoru mikrotitračních destiček Dynatech.

Příklad 6: „Antigen capture“ ELISA pro kvantifikaci tvorby kapsomer.

Pro relativní kvantifikaci viru podobných částic a kapsomer ve frakcích z CsCl gradientů byla používána „antigen capture“ ELISA. Mikrotitrační destičky byly přes noc potaženy myší monokl onál ní protilátkou (50 μΙ/jamku), purifi kovanou pomocí proteinu A, imunospecifickou pro HPV 16 LI (protilátky 25/C, MM07 a Ritti 1 byly získány z myší imunizovaných HPV 16 V LP) jo ředěnou 1:5000 v PBS (finální koncentrace 2 pg/ml). Destičky byly blokovány 1 hodinu 5% mlékem v PBS, Dále bylo přidáno 50 pl frakcí zCsCI gradientu ředěných 1:300 5% mlékem v PBS a destičky byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C. Dále byly jamky 3 x promyty PBS/0,05 %

Tween 20 a poté bylo přidáno polyklonální králičí antisérum (50 pl/jamku), ředěné 1:3000 v PBS s mlékem, připravené proti HPV16 VLP, a destičky byly inkubovány další hodinu při teplotě

37 °C. Poté byly destičky znovu promyty a následně inkubovány 1 hodinu s 50 pl kozí anti-králičí protilátky konjugované s peroxidázou (Sigma) ředěné 1:5000 v PBS s 5% mlékem.

Po závěrečném promytí byly destičky barveny ABTS substrátem. Po 30 minutové inkubaci byla měřena extinkce při vlnové délce 490 nm (automatický analyzátor Dynatech). Jako negativní kontrola v tomto pokusu sloužily jamky potažené pouze PBS.

Pro testování spec i fi ty monoklonálních protilátek vůči kapso merám byly použity VLP s EDTA/DTT, jež virům podobné částice dezintegrují. Takto opracované vzorky VLP byly testovány metodou antigen capture ELISA a výsledky byly porovnány s kontrolními vzorky, které nebyly opracovány EDTA/DTT. Za účelem dezintegrace bylo 40 pl VLP inkubováno pres noc při 4 °C v 500 pl disrupčního pufru obsahujícího 30mM DTT, 50mM EGTA, 60mM EDTA, lOOmM NaCl a lOOmM Tris/HCI pH 8,0. Alikvoty opracovaných a neopracovaných částic byly použity pro testování výše popsanou ELISA metodou v ředěních 1:20 až 1:40.

Příklad 7: Hemaglutinační inhibiční test.

Za účelem stanovení intenzity, s jakou chimémí kapsomemí vakcíny vyvolávají produkci neutralizačních protilátek, byl proveden hemaglutinační inhibiční test, který je stručně popsán v násle- 14CZ 302351 B6 dujícím textu. Tento test je založen na již dříve získaném poznatku, že virům podobné částice jsou schopné hemaglutinovat červené krevní buňky.

Myši byly imunizovány některou z chimémích kapsomemích vakcín ajejich sérum bylo získáno tak jak to bylo popsáno v příkladu 4. Jako pozitivní kontrola posloužily HPV 16 Ll VLP a hovězí PV1 (BPV) Ll VLP, které byly testovány paralelně schimémími kapsomemími přípravky. Pro stanovení základní hranice pozitivity byly nejprve HPV 16 nebo BPV 1 VLP inkubovány sa nebo bez séra z imunizovaných myší. Poté byly přidány červené krevní buňky. Míra, do jaké preinkubace s myším sérem inhibuje hemaglutinaci červených krevních buněk, určuje neutralizační kapacitu myšího séra. Experimenty byly poté zopakovány s použitím chimémích kapsomer za účelem stanovení neutralizační kapacity myšího séra na použité vakciny. Dále následuje stručný protokol hemaglutinačního inhibičního testu.

K 1 ml čerstvé myší krve bylo přidáno 100 μΐ heparinu (1000 usp jednotek/ml). Červené krevní buňky byly 3 x promyty PBS, centrifugovány a resuspendovány v objemu 10 ml. Dále byly erytrec'!'' ^{v 0} 5 PRSl a nlnženv nři 4 °C no dobu 3 dnů. Při hemaslutinačním testu bylo použito 70 μΐ suspenze na každou jamku 96 jamkové mikrotitrační destičky.

Alikvoty chimémích kapsomer z CsCI gradientů byly 1 hodinu dialyzovány proti lOmM HEPES (pH 7,5). Dále byly připraveny série dvojnásobných ředění těchto alikvotů v PBS a vždy 100 μΙ takto připraveného vzorku bylo přidáno k myším erytrocytům v jamkách 96-jamkové mikrotitrační destičky (jamky s kulatým dnem). Destičky byly inkubovány 3 až 16 hodin při teplotě 4 °C. Pro hemaglutinaění inhibiční test byly kapsomery inkubovány 60 minut při pokojové teplotě s protilátkami ředěnými v PBS a poté byly přidány k erytrocytům. Míra hemaglutinace erytrocytů a tím i přítomnost neutralizačních protilátek, byla stanovena standardními metodami.

Podle předběžných výsledků myší sérum po imunizaci chimémí kapsomemí vakcínou s obsahem HPV16 LI C v kombinaci s E7 aminokyselinami 1 až 98 inhibovalo hemaglutinaci sHPV16 VLP, ale nikoliv s BPV VLP. Myší sérum bylo tedy shledáno pozitivním na přítomnost neutralizačních protilátek proti lidským VLP a tato diferenciální neutralizace byla velmi pravděpodobně výsledkem specifity protilátek pro epitopy, proti kterým byly tyto protilátky připraveny.

Odborníkům je jistě zřejmé, že existují četné modifikace a variace výše uvedených příkladů provedení navrhovaného vynálezu. V souvislosti s tím je nutné uvést, že vynález je limitován výhradně rozsahem patentových nároků.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ ÍNFORMACE:

(i) ŽADATEL:

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Očkovací přípravek obsahující kapsomery lidského papilomaviru a způsob léčby a prevence HPV infekci.

(iii) POČET SEKVENCÍ: 27 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESA: Marshall, OToole, Gerstein, Myrray & Borun (B) ULICE: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 60606-6402 (v) POČÍTAČOVĚ ZPRACOVATELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní

- 15CZ 302351 B6 (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Retease # 1.0, verze #1.30 (vi) DATA O SOUČASTNÉ ŽÁDOSTI:

	(A)	ČÍSLO ŽÁDOSTI:
5	(B)	DATUM PODÁNÍ:
	(C)	KLASIFIKACE:
	(viii) ÚDAJE O PRÁVNÍM ZASTOUPENÍ:
	(A)	JMÉNO: Williams Jr„ Joseph A.
	(B)	ČÍSLO REGISTRACE: 38,659
10	(C)	REFERENCE/ČÍSLO SPISU: 27013/34028

(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312^174-0448 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1518 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: CDS (B) LOKALIZACE: 1 ... 1518 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: I:

atg tct ctt tgg ctg cct agt gag gcc act gtc tac ttg cct cct gtc Met Ser Leu Trp Leu pro ser Glu Ala Thr val Tyr Leu Pro Pro val

10 15

- 16CZ 302351 B6

CCA GTA TCT AAG GTT 6TA AGC ACG GAT GAA TAT Git GCA CGC ACA AAC 96 pro val Ser Lys val val ser Thr Asp Glu Tyr val Ala Arg Thr Asn

25 30

ATA TAT TAT CAT GCA GGA ACA TCC AGA CTA CTT GCA GTT GGA CAT CCC 144

Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala val Gly His Pro

TAT TTT CCT ATT AAA AAA CCT AAC AAT AAC AAA ΑΤΑ TTA GTT CCT AAA 192

Tyr phe pro ile Lys Lys pro Asn Asn Asn Lys ile Leu val pro Lys

55 60

GTA TCA GGA TTA CAA TAC AGG GTA TTT AGA ATA CAT TTA CCT GAC CCC 240

Val ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro asd Pro 65 70 75 80

AAT AAG TTT GGT TTT CCT GAC ACC TCA TTT TAT AAT CCA GAT ACA CAG 288

Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin

90 95

CGG CTG GTT TGG GCC TGT GTA GGT GTT GAG GTA GGT CGT GGT CAG CCA 336

Arg Leu val Trp Ala cys val Gly val Glu val Gly Arg Gly Gin Pro

100 105 110

TTA GGT GTG GGC ATT AGT GGC CAT CCT TTA TTA AAT AAA TTG GAT GAC 384

Leu Gly val Gly ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu asp Asp

115 120 125

ACA GAA AAT GCT AGT GCT TAT GCA GCA AAT GCA GGT GTG GAT AAT AGA

Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly val Asp Asn Arg

130 135 HO

GAA

Glu

145

TGT ATA TCT ATG GAT TAC AAA CAA ACA CAA TTG TGT Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys

150 155

TTA ATT GGT Leu Ile Gly

160

480

TGC aaa CCA CCT ATA GGG GAA CAC TGG GGC AAA GGA TCC Cys Lys Pro pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly ser

165 170

CCA TGT ACC Pro C^s Thr

528

AAT GTT GCA GTA AAT CCA GGT GAT TGT CCA CCA TTA GAG TTA ATA AAC 576

Asn val Ala val Asn pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn

17CZ 302351 B6

180

IBS

190

ACA GTT ATT CAG GAT Thr val lle Gin asp 195

GGT GAT ATG GTT GAT ACT Gly Asp Met val Asp Thr

200

GGC TTT GGT GCT ATG Gly phe Gly Ala Met

205

624

GAC TTT ACT ACA TTA CAG GCT AAC AAA AGT GAA Asp Phe Thr Thr Leu Gin Ala Asn Lys ser Glu

210 215

GTT CCA CTG GAT ATT val pro Leu Asp lle 220

672

TGT cys

225

ACA TCT ATT TGC AAA Thr ser lle cys L^s

TAT CCA GAT Tyr pro Asp

TAT

Tyr

ATT lle

235

AAA ATG GTG TCA GAA Lys Met val ser Glu

240

720

CCA TAT GGC GAC AGC TTA TTT TTT TAT TTA CGA AGG GAA CAA ATG TTT 768

Pro Tyr Gly ASP Ser Leu phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe

245 250 255

STl íSn ní lil ^{agc GCT} GTT GGT gaa aat gta cca val Arg his Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala val Gly Glu Asn Val pro

265 270

816

GAC GAT ASp Asp

TTA TAC ATT Leu Tyr lle 275 TAT TTT CCT Tyr Phe Pro

AAA GGC TCT GGG TCT ACT GCA AAT TTA GCC AGT Lys Gly ser Gly ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser

ACA Thr

2S0

TCT Ser

285

TCA Ser

AAT Asn 290

CCT Pro 295

AGT GGT ser Gly

ATG Met

GTT val 300

ACC Thr

TCT ser

GAT Asp

GCC Ala

CAA

ATA

TTC

AAT

AAA

CCT

TAT

TGG

TTA

CAA

CGA

GCA

CAG

GGC

CAC

AAT

Gin

ile

Phe

Asn

Lys

pro

Tyr

Trp

Leu

Gin

Arg

Ala

Gin

Gly

His

Asn

305

310

315

320

AAT

GGC

ATT

TGT

TGG

GGT

AAC

CAA

CTA

TTT

GTT

ACT

GTT

GAT

ACT

Asn

Gly

lle

cys

Trp

Gly

Asn

Gin

ueu

phe

val

Thr

val

A$p

Thr

325

330

335

864

912

960

1008

ACA

CGC

AGT

ACA

AAT

ATG

TCA

TTA

TGT

GCT GCC

ATA

TCT

ACT

TCA

GAA

Thr

Arg

Ser

Thr

Asn

Met

ser

Leu

Cys

Ala Ala

lle

ser

Thr

Ser

Glu

340

345

350

ACT

ACA

TAT

AAA

AAT

ACT

AAC

TTT

AAG

GAG TAC

CTA

CGA

CAT

GGG

GAG

1056

1104

- 18CZ 302351 B6

Thr mr Tyr tys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Are 355 360 365 hts Gíy Glu

GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CAA CTG TGC AAA ATA ACC TTA ACT 1152

Glu Tyr asp Leu Gin Phe Xle Phe Gin Leu cys Lys Ile Thr Leu Thr

370 375 380

GCA GAC GTT ATG ACA TAC ATA CAT TCT ATG AAT TCC ACT ATT TTG GAG 1200

Ala Asp val Met Thr Tyr xle His ser Met Asn Ser Thr ile Leu Glu

385 390 395 400

r.tr TGG AAT TTT GGT CTA CAA CCT CCC CCA GGA GGC ACA CTA GAA GAT 1248 asp Trp Asn Phe Gly Leu cln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu asp

405 410 415

ACT TAT AGG TTT GTA ACC TCC CAG GCA ATT GCT TGT CAA AAA CAT ACA 1296

Thr Tyr Arg Phe val Thr Ser Gin Ala ile Ala cys Gin Lys His Thr

420 425 «0

CCT CCA GCA CCT AAA GAA GAT CCC CTT AAA AAA TAC ACT TTT TGG GAA 1344 pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr phe Trp Glu

435 440 445

GTA AAT TTA AAG GAA AAG TTT TCT GCA GAC CTA GAT CAG TTT CCT TTA 1392 val Asn Leu Lys Glu Lys Phe ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe pro Leu

450 455 460

GGA CGC AAA TTT TTA CTA CAA GCA GGA TTG AAG GCC AAA CCA AAA TTT 1440

Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe

465 470 475 480

ACA TTA GGA AAA CGA Thr Leu Gly Lys Arg

AAA GCT ACA CCC ACC ACC TCA TCT ACC TCT Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser ser Thr Ser

490 495

ACA

Thr

1488

ACT GCT AAA CGC AAA AAA CGT AAG CTG TAA Thr Ala Lys Arg tys Lys Arg Lys Leu

500 505 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 506 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární

- 19CZ 302351 B6 (ii)TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:2:

Met 1

ser

Leu

Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr val

Tyr Leu pro Pro 15

val

5

10

Pro

val

ser

tys

val

ser

Thr

ASP

Glu

Tyr

val

Ala

Arg

Thr

Asn

20

25

30

lle

Tyr

Τξ

His

Ala

Gly

Thr

Ser 40

Arg

Leu

Ala

val 45

Gly

HiS

pro

Tyr

phe 50

ΡΓΟ

lle

Lys

Pro 55

Asn

Lys

lle 60

Leu

val

Pro

Lys

val

ser

Gly

Leu

Gin

Tyr

Arg

val

Phe

Arg

lle

HiS

Leu

Pro

ASp

Pro

65

70

75

80

Asn

Lys

Phe Gly

phe

pro

ASp

Thr

Ser

Phe

Tyr

Asn

Pro

ASp

Thr

Gin

85

90

95

Arg

Leu

val

Trp 100

Ala

cys

val

Gly

val 105

Glu

val

Gly

Arg

πδ

Gin

pro

Leu

Gly

val 115

Gly

lle

Ser

Gly

His 120

pro

Leu

Asn

Lys 125

Leu

ASp

Thr

Glu

Asn

Ala

Ser

Ala

Tyr

Ala

Asn

Ala

Gly

Val

Asp

Asn

Arg

130

135

140

Glu

cys

lle

Ser

Met

ASp

Tyr

Lys

Gin

Thr

Gin

Leu

cys

Leu

lle

Gly 160

145

150

155

Cys

Lys

Pro

pro

Xle 165

Gly

Glu

HiS

Trp

Sž

Lys

Gly

Ser

Pro

cys 175

Thr

Asn

Val

Ala

val

Asn

Pro

Gly

Asp Cys

Pro

Leu

Glu

Leu

lle

Asn

180

185

190

Thr

val

lle 195

Gin

ASp

Gly

ASP

Met 200

val

Asp Thr Gly

Phe 205

Gly

Ala

Met

Asp

Phe

Thr

Leu

Gin

Ala

Asn

Lys

Ser Glu Val

Pro

Leu

Asp

lle

210

215

220

cys

Thr

Ser

lle

cys

Lys

Tyr

Pro

ASp

Tyr xle

Lys

Met

val

Ser

Glu

230 23S 240

Pro

Tyr

Gly

ASp

ser 245

Leu

Phe

Tyr

Leu 250

Arg

Glu

Gin

Met 255

phe

val

Arg

His

ueu 260

Phe

Asn

Arg

Ala

a

Ala

val

Gly

Glu

A$n 270

val

pro

ASp

Asp

Leu

Tyr

lle

Lys

Gly

Ser

dy

Ser

Thr

Ala

Asn

Leu

Ala

ser

275

280

285

Ser

Asn

Tyr

Phe

Pro

Thr

Pro

Ser

Gly

Ser

Met

val

Thr

Ser

Asp

Ala

290

295

300

-20CZ 302351 B6

Gin 305

Ile

Phe

Asn

Lys

Pro 310

Tyr

Trp

Leu

Gin Arg 315

Ala

Gin

cly

His

Asn 320

Asn

Gly

ile

cys

Trp 325

cly

Asn

Gin

Leu

Phe val 330

Thr

val

ASp 335

Thr

Arg

Ser

Thr

Asn

Met

ser

Leu

cys

Ala Ala

ile

Ser

Thr

Ser

Glu

340

345

350

Thr

Tyr 355

Lys

Asn

Thr

Asn

Phe 360

Lys

Glu Tyr

Leu

$8

His

Gly

Glu

Glu Tyr asp Leu Gin Phe ile Phe Gin Leu Cys Lys ile Thr Leu Thr 370 375 380

Ala Asp val Met Thr Tyr ile His Ser Met Asn ser Thr ile Leu Glu

385 390 395 400

Asp Trp

Thr Tyr

Asn Phe Gly Leu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu

405 410

Arg Phe val Thr ser Gin Ala Ile Ala cys Gin lys 425 430

Glu ASp 415

His Thr

pro Pro

Ala 435

pro

Lys

Glu

Asp Pro 440

Leu

Lys

Tyr

Thr 445

Phe

Trp

Glu

val Asn 450

Leu

Lys

Glu

Lys

Phe Ser 455

Ala

Asp

Leu

Asp 460

Gin

Pne

Pro

Leu

Gly Arg 465

Lys

Phe

Leu

Leu 470

Gin Ala

Gly

Leu

Lys 475

Ala

Lys

Pro

Lys

Phe 480

Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser ser Thr Ser Thr

485 490 495

Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu

500 505 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 297 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: CDS (B) LOKALIZACE: 1 ... 297 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:3:

-21 CZ 302351 B6

ATG

CAT

GGA GAT ACA

CCT

ACA

TTG

CAT GAA

TAT

ATG

TTA

GAT

TTG

CAA

48

Met

HÍS

Gly Asp Thr

Pro

Thr

Leu

His Glu

Tyr

Met

Leu

Asp

Leu

Gin

1

5

10

15

CCA

GAG

ACA ACT GAT

CTC

TAC

TGT

TAT GAG

CAA

TTA

AAT

GAC

AGC

TCA

96

pro

Glu

Thr

ASp

Leu

Tyr

cys

Tyr

Glu

Gin

Leu

Asn

ASp

Ser

20

25

30

GAG

GAT

GAA

ATA

GAT

GGT

CCA

GCT

GGA

CAA

GCA

GAA

CCG

GAC

Glu

Asp

Glu

Ile

Asp

Gly

Pro

Ala

Gly

Gin

Ala

Glu

Pro

ASp

35

40

45

AGA

GCC

CAT

TAC

AAT

ATT

GTA

ACC

TTT

TGT

TGC

AAG

TGT

GAC

TCT

ACG

Arg

Ala

HÍS

Tyr

Asn

Ile

Val

Thr

Phe

Cys

cys

Lys

cys

Asp

Ser

Thr

50

55

60

144

192

CTT CGG TTG TGC GTA CAA AGC ACA CAC CTA GAC ATT CGT ACT TTG GAA 240

Leu Arg Leu cys val Gin Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

70 75 S0

GAC CTG TTA ATG GGC ACA CTA GGA ATT GTG TGC CCC ATC TGT TCT CAG Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile val Cys Pro Ile Cys Ser Gin

90 95

AAA CCA TAA

Lys Pro

238

297 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 98 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:4:

Met	His	Gly	ASp	Thr	Pro	Thr	Leu
1			5
pro	Glu	Thr	Thr 20	ASp	Leu	Tyr	cys
Glu	Glu	Glu	ASp	Glu	Ile	Asp	Gly
		35					4Q
Arg	Ala 50	His	Tyr	Asn	Ile	val 55	Thr
Leu 65	Arg	Leu	Cys	val	Gin 70	Ser	Thr
ASp	Leu	Leu	Met	Gly 85	Thr	Leu	Gly
Lys	Pro

His	Glu Tyr 10	Met	Leu	Asp	Leu 15	Gin
η.	Glu	Gin	Leu	Asn	Asp 30	ser	Ser
pro	Ala	Gly Gin	Ala 45	Glu	Pro	Asp
Phe	cys	Cys	Lys 60	cys	ASp	Ser	Thr
His	val	ASp 75	Ile	Arg	Thr	Leu	Glu 80
Ile	val 90	cys	ΡΓΟ	ile	Cys	Ser 95	Gin

-22 CZ 302351 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 34 párů bází
5	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

CCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG 34 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:6:

CCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ IDNO:7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

AAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 44 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
40	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii)TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

AAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A) (B)	DÉLKA: 35 párů bází TYP: nukleová kyselina
50	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

-23 CZ 302351 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

AAAAGATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC ATTGC 35 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A) (B)	DÉLKA: 34 párů bází TYP: nukleová kyselina
10	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii)TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:10:

TTTTGATATC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC 34 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 44 párů bází
20	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii)TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

TTTTGATATC CTTGCAACAA AAGGTTACAA TATTGTAATG GGCC ⁴⁴ (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

30	(A)	DÉLKA: 35 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA 35 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

AAAAGATATC TGGTTTCTCA GAACAGATGG GGCAC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

TTTTGATATC GATTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCAG 38

-24CZ 302351 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 35 párů bází
5	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

TTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

TTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGACAAGCA GAACCGGAC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ IDNO:16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

TTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 294 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: CDS (B) LOKALIZACE: 1 ...294 (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID NO: 17:

-25CZ 302351 B6

ATG AGT CTT Met Ser Leu

TGC AAA TGC Cys Lys Cys

CTA

ACC

GAG

GTC

GAA

ACG

CTT

ACC

AGA

AAC

GGA

TGG

GAG

Leu

Thr

GlU

val

Gl u

Thr

Leu

Thr

Arg

Asn

Gly

Trp

Glu

5

10

15

AGC

GAT

TCA

agt

GAT

CCT

CTC

ATT

ATC

GCA

GCG

AGT

ATC

Ser 20

Asp

ser

Ser

ASp

pro 25

Leu

ile

lle

Ala

Ala 30

Ser

ile

ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT TTT TAT CGT CTT TTC TTC 144 lle Gly lle Leu His Leu lle Leu Trp ile Phe Tyr Arg Leu Phe Phe

40 45

AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTG Lys Cys lle Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu

55

AAA AGA GGG CCT TCT Lys Arg Gly Pro Ser

192

ACG GAA GGA GCG CCT GAG TCT ATG AGG GAA GAA TAT CGG CAG GAA CAG 240

Thr Glu Gly Ala ργο Glu ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gin Glu Gin

70 75 80

CAG AGT GCT GTG GAT GTT GAC GAT GTT CAT TTT GTC AAC ATA GAG CTG Gin ser Ala val Asp val asp Asp val His Phe val Asn ile Glu Leu

90 95

GAG TAA

Glu

288

294 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

Met

Ser

Leu

Thr

Glu

val

Glu

Thr

Leu

Thr

Arg

Asn

Gly

Trp

Glu

1

5

10

15

cys

Lys

cys

Ser

ASp

Ser

ASp

pro

Leu

Ile

Ala

Ser

Ile

20

25

30

Ile

Gly

lle

Leu

HiS

Leu

Ile

Leu

Trp

Ile

Phe

Tyr

Arg

Leu

Phe

35

40

45

Lys

Cys 50

lle

Tyr

Arg

teu 55

Lys

Tyr

Gly

Leu

Lys 60

Arg

Gly

Pro

ser

Thr

Glu

Gly

Ala

Pro

Glu

Ser

Met

Arg

Glu

Tyr

Arg

Gin

Glu

Gin

65

70

75

80

Gin

ser

Ala

val

Asp

val

Asp

ASp

val

His

Phe

val

Asn

Ile

Glu

Leu

85

90

95

Glu

-26CZ 302351 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 40 párů bází
5	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID ΝΟ.Ί9:

io

TTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AAGACCAATC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO.20:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

15	(A)	DÉLKA: 35 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA 20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

TTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:2I:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE;

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

GTTATGACAT ACATACATTC TATG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ IDNO.22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:22:

CCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová

-27CZ 302351 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

CTACAAGCAG GAATGCATGG AGATACACC 29 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 36 párů bází
10	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY; DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:24:

CATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG 36 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

20	(A)	DÉLKA: 38 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:25:

CATCTGAAGC TTATCAATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:26:

3o (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CATCTGAAGC TTACTTGCAA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 69 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
45	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:

-28CZ 302351 B6

CATCTGAAGC TTAAAGCGTA GAGTCACACT TGCAACAAAA GGTTACAATA TTGTAATGGG 60

CTCTGTCCG 69 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

5	(A)	DÉLKA: 47 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:28:

CATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Očkovací přípravek obsahující kapsomer lidského papilomaviru, vyznačující se tím, že kapsomer zahrnuje fúzní protein obsahující aminokyselinové zbytky zkráceného proteinu LI lidského papilomaviru sousedící s aminokyselinovými zbytky druhého proteinu, přičemž uvedený fúzní protein inhibuje tvorbu virům podobných částic a uvedený očkovací přípravek vyvolává imunitní odpověď neutralizuj ící viriony lidského papilomaviru.

2. Očkovací přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že LI protein je kódován v genomu lidského papilomaviru, vybraného ze skupiny sestávající se z HPV6, HPV1I, HPV 16, HPV18, HPV33, HPV35 a HPV45.

30

3. Očkovací přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že papilomavirem je

HPV 16.

4. Očkovací přípravek podle nároku 3, vyznačující se tují karboxy-koncové aminokyselinové zbytky.

tím, že z proteinu LI se dele35

5. Očkovací přípravek podle nároku 4, vyznačující se tují 1 až 34 karboxy-koncové aminokyselinové zbytky.

tím, že z proteinu L1 se dele40

6. Očkovací přípravek podle nároku 5, vy z n ač u j í c í se tím tují 34 karboxy-koncové aminokyselinové zbytky.

že z proteinu LI se dele

7. Očkovací přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím tují aminokyselinové zbytky z vnitřní části sekvence.

že z proteinu LI se dele45

8. Očkovací přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky deletované ze sekvence proteinu LI zahrnují jaderný lokalizační signál.

9. Očkovací přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použijí aminokyselinové zbytky druhého proteinu, které jsou odvozeny od proteinu lidského papilomaviru.

-29CZ 302351 B6

10. Očkovací přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že protein lidského papilomaviru je časný protein lidského papilomaviru.

11. Očkovací přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že časný protein 5 lidského papilomaviru je vybrán ze skupiny sestávající z El, E2, E3, E4, E5, E6 a E7.

12. Použití očkovacího přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení infekce lidského papilomaviru a chorob s ní souvisejících.

ío

13. Použití očkovacího přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci infekce lidského papilomaviru a chorob s ní souvisejících.