KR20010030969A

KR20010030969A - 유두종 비루스 캡소미어 백신 제제 및 그것의 사용방법

Info

Publication number: KR20010030969A
Application number: KR1020007003721A
Authority: KR
Inventors: 기스만러츠; 뮬러마틴
Original assignee: 로욜라 유니버시티 오브 시카고
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2001-04-16
Also published as: NZ503830A; EP1021547B1; US20090028894A1; CZ302351B6; DE69836753T2; JP4520034B2; US6228368B1; JP2010095530A; PT1021547E; JP2013147507A; US20050031636A1; CA2305382A1; US7371391B2; IL190554A0; ES2280104T3; PL195332B1; EP1021547A1; NO20001768D0; EP1690941B1; JP2001519161A

Abstract

본 발명은 비루스 캡소미어를 포함하는 백신 제제와 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그 백신 제제에 대한 치료 방법 및 예방 방법도 개시한다.

Description

유두종 비루스 캡소미어 백신 제제 및 그것의 사용방법{PAPILLOMA VIRUS CAPSOMERE VACCINE FORMULATIONS AND METHODS OF USE}

인간의 음부 유두종 비루스(HPV)의 일부 고위험 균주(예를 들면, HPV 16, 18 또는 45)에의 감염은 항문성기 관(管)의 악성 종양의 형성에 있어서 주요 위험 인자인 것으로 여겨진다. 가능한 악성 종양 중에서 자궁경부암이 가장 흔하다. 세계 보건 기구(WHO)의 추산에 따르면, 해마다 상기 질환의 거의 50만가지의 새로운 사례가 발생된다. 이러한 질환이 발생되는 빈도때문에, HPV 감염과 자궁경부암 사이의 연관성이 광범위하게 조사되어 무수한 사실들이 알려지게 되었다.

예를 들면, 자궁경부 상피내 신생조직 형성(cervical intraepithelial neoplasia;CIN)의 전구 장해는 유두종 비루스 감염에 의해 야기되는 것으로 알려졌다[Crum, New Eng. J. Med. 310:880-883(1984)]. 예컨대 균주 16, 18, 33, 35 및 45를 포함하여 일부 HPV 타입의 게놈의 DNA는 상기 장해를 갖는 환자의 종양생검의 95% 이상에서, 그리고 상기 종양으로부터 배양된 일차 세포주에서 검출되었다. 생검된 CIN 종양세포의 대략 50 내지 70%가 단지 HPV 16에서만 유도되는 DNA를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

HPV 16 및 HPV 18의 초기 유전자(early gene) E6 및 E7의 단백질 생성물은 자궁경부암 세포주에서 그리고 시험관내에서 형질전환된 인간의 케라틴 생성세포에서 검출되었으며[Wettstein, et al., PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, Pfister(Ed.), CRC Press;Boca Raton, FL 1990 pp 155-179], 자궁경부암 환자의 상당 수가 항-E6 또는 항-E7 항체를 가졌다. E6 및 E7 단백질은 인간 세포에서의 세포성 DNA 합성의 유도, 인간의 케라틴 생성세포와 다른 세포 타입의 형질전환, 및 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서의 종양형성에 관여하는 것으로 보여진다[Arbeit, et al., J. Virol., 68:4358-4364(1994); Auewarakul, et al., Mol. Cell. Biol.. 14:8250-8258(1994);Barbosa, et al., J. Virol. 65:292-298(1991); Kaur, et al., J. Gen. Virol. 70:1261-1266(1989);Schlegel, et al., EMBO J., 7:3181-3187(1988)]. HPV-양성 종양의 형질전환 상태를 유지하는데 E6/E7 단백질의 계속적인 발현이 필요한 것으로 보인다.

생체내에서 그리고 시험관내에서 일부 HPV 균주의 신생물형성 표현형 유도능에도 불구하고, 여전히 다른 HPV 타입은 첨형(尖形) 콘딜로마 같은 양성 음부 사마귀를 일으키며 단지 드물게만 악성 종양과 연관되어 있다[Ikenberg, Gross, et al., (eds.) GENITAL PAPILLOMA VIRUSES INFECTION. Springer Verlag:Berlin, pp., 87-112]. 이러한 타입의 낮은 위험을 갖는 균주에는 가령 HPV 6 및 11이 포함된다.

대부분 흔히 음부 유두종 비루스는 성교 중에 사람사이에서 전염되며 많은 경우 이것은 항문생식기 점막에 지속적인 감염을 일으킨다. 이러한 발견은 일차 감염이 부적절한 면역 반응을 유도하거나 또는 비루스가 면역시스템을 피할 수 있는 능력을 발달시킨다는 것을 제안하지만, 다른 관찰 결과는 면역시스템이 일차 징후시 그리고 유두종 비루스 감염의 악성 진행 동안에 활성이 있다는 것을 제안한다[Altmann et al., VIRUSES AND CANCER, Minson et al., (eds.) Cambridge University Press, (1994) pp. 71-80].

예를 들면, 토끼 및 소 유두종 비루스에 의한 일차 감염의 임상 징후는 사마귀 추출물 또는 비루스 구조 단백질로의 백신접종에 의해 억제할 수 있다[상기 Altmann, et al.; Campo, Curr. Top. In Microbial and Immunol. 186:255-266(1994); Yindle and Frazer, Curr. Top. In Microbial and Immunol. 186:217-253(1994)]. HPV 16 초기 단백질 E6 또는 E7을 암호화하는 백시니아 재조합체로 사전에 접종되거나 또는 합성 E6 또는 E7 펩티드로 접종된 설치류는 HPV 16 형질전환된 자가이식 세포로 접종한 후 종양형성으로부터 유사하게 보호된다[상기 Altmann, et al. ; 상기 Campo, et al. ; 상기 Yindle and Frazer, et al. 참조]. 동물 유두종 비루스 감염후 퇴화(regressor) 동물로부터 림프구의 전이에 의해 사마귀의 퇴화가 유도될 수 있다. 마지막으로, 예컨대 기관 이식체의 수용자 또는 HIV로 감염된 개체와 같이 면역억제된 환자에서는 음부 사마귀, CIN 및 항문생식기 암의 발생이 높아진다.

오늘날까지 예방 및 치료 목적에 적합한 캡소미어(capsomere) 형태의 인간 유두종 비루스 후기(late) L1 단백질을 포함하는 어떤 HPV 백신접종도 개시되지 않았다. L1 단백질은 악성 음부 질환에서도 존재하지 않기 때문에, L1 단백질로의 백신접종은 이들 환자에서 어떤 치료 가능성을 갖지 않는다. L1 단백질 및 예컨대 E6 또는 E7 단백질의 아미노산 잔기들을 포함하는 키메라 단백질을 제조하여 키메라 캡소미어를 제조하면 백신의 예방 및 치료 기능을 조합할 수 있게 된다. 따라서 키메라 캡소미어를 높은 레벨로 생성하는 방법은 예방 및 치료 목적상 그러한 백신에 의해 제공되는 가능한 이점을 고려할 때 특히 바람직할 것이다.

따라서 HPV 감염을 예방하거나 또는 치료할 수 있는 백신제제의 필요성이 당업계에서 존재한다. 재조합 HPV 단백질 발현 및 정제와 연관된 당업계에서 알려진 문제들을 극복하는 백신제제의 제조방법은 이미 HPV로 감염된 개체 집단을 치료하는데 유용할 것이며 뿐만아니라 HPV 감염에 민감한 개체 집단을 면역화시키는데 유용할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 키메라 인간 유두종 캡소미어(chimeric human papilloma capsomer)를 포함하는 치료 및 예방 백신 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 HPV로 감염된 환자의 치료를 위한 치료 방법 및 감염될 수 있는 개인의 HPV 감염을 예방하기 위한 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 캡소미어 및 단백질의 제조 및 정제 방법이 또한 고려된다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 유두종 비루스의 구조 단백질 L1 및 L2를 포함하는 HPV 감염의 예방을 위한 예방 백신 접종이 고려된다. 유두종 비루스는 적정 역가로 세포 배지 또는 다른 실험 시스템에 전파되어 경제적인 백신 생산을 위하여 충분한 양의 비루스 단백질을 제공할 수 없기 때문에, 상기 유형의 백신의 발달은 상당한 장해에 직면한다. 또한, 단백질의 발현을 위한 재조합 방법은 항상 수월한 것은 아니며, 종종 낮은 단백질 수율로 귀결된다. 최근에, 재조합 백신 또는 바쿨로비루스를 사용하여 비루스 단백질 L1 및 L2(또는 L1 단독)의 발현에 따라 Sf-9 곤충 세포 중에 형성된 비루스 캡시드 구조와 유사한 비루스-유사 입자(VLPs)가 기술되었다. VLPs의 정제는 CsCl 또는 슈크로스 구배의 원심분리 수단에 의하여 매우 간단하게 수행할 수 있다[Kimbauer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 99:12180-12814(1992): Kimbaurer, et al., J. Virol. 67:6929-6936(1944); Proso, et al., J. Virol. 6714:1936-1994(1992): Sasagawa, et al., Virology 2016:126-195(1995): Volpers, et al., J. Virol. 69:3258-3264(1995); Zhou, et al., J. Gen. Virol. 74:762-769 (1993): Zhou, et al., Virology 185:251-257(1991)]. WO 93/02184는 비루스-유사 입자(VLPs)를 유두종 비루스에 의하여 야기된 감염에 대한 백신으로서 또는 진단 적용을 위하여 사용하는 방법을 기술한다. WO 94/00152는 인간 및 동물의 유두종 비리온에 대한 에피토프를 중성화한 배열을 모방한 L1 단백질의 재조합 생성을 기술한다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 치료적 백신 접종은, 예를 들어, 유두종 비루스 감염에 의한 자궁 경부 암종 또는 전구체 손상의 합병증을 경감시켜, 예방 개입에 대한 대안을 제시한다. 이러한 유형의 백신 접종은 긴 잠복기로 감염된 세포 중에서 발현된 초기 유두종 비루스 단백질, 주로 E6 또는 E7을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 백신 투여에 따라 세포 독성 T-세포는 생식기 손상에서 긴 잠복기로 감염된 세포에 대해 활성화될 수 있다고 추측된다. 치료적 개입을 위한 목표 집단은 HPV-관련 예비-악성 또는 악성 생식기 손상을 갖는 환자이다. PCT 특허 출원 WO 93/20844는 HPV 또는 BPV로부터의 유두종 비루스의 초기 단백질 E7 및 그의 항원 단편이 퇴행에 있어서 치료적으로 유효하나, 포유 동물의 유두종 비루스 종양의 예방에는 그렇지 않음을 공개한다. 초기 HPV 단백질이 E. 콜리 또는 적당한 진핵 세포 유형 중의 재조합 발현에 의하여 생성되는 반면, 재조합 단백질의 정제는 고유의 낮은 용해도 및 일반적으로 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과법 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단계의 조합을 요하는 복잡한 정제 공정 때문에 어려운 것으로 증명되었다.

본 발명에 따르면 (i) 2차 단백질로부터의 아미노산 잔기의 일부분을 포함하는 융합 단백질로서 발현된 손상되지 않은 비루스 단백질인 1차 단백질; (ii) 절단형 비루스 단백질; (iii) 2차 단백질로부터의 아미노산 잔기의 일부분을 포함하는 융합 단백질로서 발현된 절단형 비루스 단백질; 또는 (iv) 상기 3개 유형의 단백질의 일정 배합물을 포함하는 유두종 비루스 캡소미어를 포함하는 백신 제제가 제공된다. 본 발명에 따르면, 소의 유두종 비루스(BPV) 및 인간의 유두종 비루스의 캡소미어를 포함하는 백신 제제가 제공된다. 바람직한 소의 비루스 캡소미어는 소의 유두종 비루스 유형 I로부터의 단백질을 포함한다. 바람직한 인간의 비루스 캡소미어는 인간 유두종 비루스 균주 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 및 HPV45 중의 임의의 하나로부터의 단백질을 포함한다. 가장 바람직한 백신 제제는 HPV16으로부터의 단백질을 포함하는 캡소미어를 포함한다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명의 캡소미어 백신 제제는 2차 단백질로부터 추가의 아미노산 잔기를 갖는 융합 단백질로서 발현된 1차의 손상되지않은 비루스 단백질을 포함한다. 바람직한 손상되지 않은 비루스 단백질은 구조 유두종 비루스 단백질 L1 및 L2이다. 손상되지 않은 비루스 단백질 융합체를 포함하는 캡소미어는 L1 및 L2 단백질을 함께 사용하거나, L1 단백질만을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직한 캡소미어는 완전히 L1 융합 단백질로 만들어진다. 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 나타내지며, SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된다. 2차 단백질의 아미노산은, 1차 단백질에 대한 2차 단백실 아미노산 잔기의 부가가 캡소미어의 형성을 허용하는 한, (1차 단백질로부터의 아미노산 잔기를 포함하는) 다수의 출처로부터 유도될 수 있다. 바람직하게, 2차 단백질 아미노산 잔기의 부가는 손상되지 않은 비루스 단백질의 능력을 억제하여 비루스-유사 입자 구조를 형성한다; 가장 바람직하게, 2차 단백질 아미노산 잔기는 캡소미어 형성을 촉진한다. 본 발명의 하나의 실시 양태에 있어서, 2차 단백질은 신생물 또는 전염성 질병 상태에 대한 면역 반응을 자극하는데 중요한 임의의 인간 종양 항원, 비루스 항원 또는 박테리아 항원일 수 있다. 바람직한 실시 양태에 있어서, 2차 단백질은 또한 유두종 비루스 단백질이다. 2차 단백질이 유두종 비루스 초기 유전자의 발현 생성물인 것이 또한 바람직하다. 그러나, 2차 단백질이 E1, E2, E3, E4, E5, E6 및 E7로부터 선택되고, 초기 유전자 생성물이 유두종 비루스 균주 HVP6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 또는 HPV45의 게놈에서 암호화되는 것이 또한 바람직하다. 2차 단백질이 HPV16 E7 유전자[SEQ ID NO: 3의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)]에 의하여 암호화되는 것이 가장 바람직하다. 융합 단백질 서브유닛으로부터 조립된 캡소미어는 본원에서 키메라 캡소미어(chimeric capsomer)로 언급된다. 하나의 실시 양태에 있어서, 본 발명의 백신 제제는 L1 단백질 아미노산 잔기가 총 융합 아미노산 잔기의 약 50 내지 99%로 구성되는 키메라 캡소미어를 포함한다. 다른 실시 양태에 있어서, L1 아미노산 잔기는 총 융합 단백질 아미노산 잔기의 약 60 내지 90%로 구성된다; 특히 바람직한 실시 양태에 있어서, L1 아미노산은 융합 단백질 아미노산 잔기의 약 80%를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 비루스-유사 입자의 형성을 위해 필요한 1 이상의 아미노산 잔기가 결실된, 절단형 비루스 단백질로 구성된 캡소미어 백신 제제를 제공한다. 아미노산의 결실은 절단형 단백질에 의한 캡소미어의 형성을 저해하지 않음이 바람직하고, 결실이 캡소미어 형성을 용이하게 하는 것은 더욱 바람직하다. 이 유형의 바람직한 백신 제제는 L2 비루스 단백질이 있든 또는 없든간에 잘려진 L1을 포함하는 캡소미어를 포함한다. 특히 바람직한 캡소미어는 잘려진 L1 단백질로 구성된다. 본 발명에 의해 설명되는 잘려진 단백질은 단백질의 카르복시 말단에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기, 또는 단백질의 아미노 말단에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기, 또는 단백질의 내부(즉, 말단이 아니라)에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기를 가진 것을 포함한다. 바람직한 캡소미어 백신 제제는 카르복시 말단에서 잘려진 단백질로 구성된다. HPV16에서 유도된 L1단백질을 포함하는 제제에, 1에서 34까지의 카르복시 말단 아미노산 잔기가 결실됨이 바람직하다. 또한 상대적으로 더 짧은 결실은 형성된 캡소미어 및 L1 단백질의 항원성을 조금 변화시키는 장점을 제공하는 것으로 생각된다. 그러나, 서열번호 2에 제시된 HPV 16의 아미노산 472에서 505에 대응하는 34 아미노산 잔기가 L1 서열에서 결실되고, 서열번호 1에 제시된 인간 HPV 16 L1 코딩 서열의 핵산 1414에서 1516에 대응하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것이 더욱 바람직하다.

캡소미어 백신 제제는 내부 결실이 있는 단백질로 구성된 경우, 결실된 아미노산 서열은 단백질의 핵 위치 부위를 포함하는 것이 바람직하다. HPV 16의 L1 단백질에서 핵 위치 신호는 아미노산 잔기 499내지 아미노산 잔기 505에서 발견되었다. 캡소미어 구조의 조립이 숙주 세포의 세포질에서 일어난 후, NLS가 결실된 L1 단백질의 발현이 뒤따른다. 결과적으로, 캡소미어의 정제는, 고유의 L1 단백질이 캡소미어로 조립되는 핵 대신에 원형질에서 가능하다. 추가된 아미노산 서열이 결실된 단백질 서열을 대체하지 못하는, 잘려진 단백질의 조립에서 유래되는 캡소미어가 자연계에서 반드시 키메라(Chimera)인 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제2의 단백질에서 융합 단백질로서 가까운 아미노산 잔기를 발현하는 잘려진 비루스 단백질을 포함하는 캡소미어 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 바람직한 잘려진 비루스 단백질은 구조적 유두종 비루스 단백질 L1 및 L2이다. 잘려진 비루스 단백질 융합체를 포함하는 캡소미어는 L1 및 L2 단백질 성분이 함께 또는 L1 단백질 단독을 사용하여 제작될 수 있다. 바람직한 캡소미어는 L1 단백질 아미노산 잔기로 구성된 것이다. 융합 단백질의 잘려진 비루스 단백질 성분은 단백질의 카르복시 말단에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기 또는 단백질의 아미노 말단에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기 또는 단백질 내부(즉, 말단이 아님)에서 결실된 1이상의 아미노산 잔기를 가진 것이다. 바람직한 캡소미어 백신 제제는 카르복시 말단이 잘려진 단백질로 구성되었다. HPV16에서 유도된 L1 단백질을 포함하는 제제에서 1에서 34 카르복시 말단 아미노산 잔기가 결실됨이 바람직하다. 또한 상대적으로 짧은 결실은 형성된 캡소미어 및 융합 단백질의 L1 단백질 성분의 항원성을 조금 변화시키는 장점을 제공하는 것으로 생각된다. 그러나, 서열번호 2에 제시된 HPV 16의 아미노산 472에서 505에 대응하는 34 아미노산 잔기가 L1 서열에서 결실되고, 서열번호 1에 제시된 인간 HPV 16 L1코딩 서열의 핵산 1414에서 1516에 대응하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것이 더욱 바람직하다. 캡소미어 백신 제제는 내부 결실이 있는 단백질로 구성된 경우, 결실된 아미노산 서열은 단백질의 핵 위치 영역 또는 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

제 1 단백질에 제 2 단백질 아미노산 잔기의 추가가 캡소미어의 형성을 허용하는한, 제2 단백질의 아미노산은 많은 출처에서 유도될 수 있다. 바람직하게, 제 2 단백질 아미노산의 추가는 캡소미어 형성을 촉진하거나 용이하게 한다. 제 2 단백질의 아미노산 잔기는 제1 단백질에서 아미노산 잔기를 포함하여, 많은 출처에서 유도될 수 있다. 또한 제2 단백질은 유두종 비루스 초기 유전자의 발현 산물임이 바람직하다. 그러나, 가장 바람직하게는, 제2 단백질은 유두종 비루스 E1, E2, E3, E4, E5, E6, 및 E7 유전자에 의해 암호화되는 초기 유전자 단백질 군에서 선택되는 것이다. 한 실시예에서, 본 발명의 백신 제제는, L1 단백질 아미노산 잔기가 총 융합 단백질 아미노산 잔기의 약 50내지 99%를 구성하는 키메라 캡소미어로 구성된다. 또 다른 실시예에서 L1 아미노산 잔기는 총 융합 단백질 잔기의 약 60내지 90%를 구성한다;특히 바람직한 실시예에서 L1 아미노산은 융합 단백질 아미노산 잔기의 약 80%를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 백신 제제의 단백질은 재조합형의 계통적 분류학에 의해 제조되나, 고유의 비루스 단백질을 포함하는 제제에서 단백질은 자연적 출처에서 분리될 것이다. 자연적 출처에서 분리된 고유의 단백질은 당해 기술 분야에서 일상적으로 실행되고 잘 알려진 공유적 변형 기술을 사용하여 본 발명의 융합 단백질을 제공하기 위해 추가적 아미노산 잔기를 포함하도록 시험관에서 변형될 것이다. 유사하게, 절단형 비루스 단백질을 포함하는 제제에서 단백질은 고유의 단백질로서 자연적 출처에서 분리되고, 많은 위치 특이적 프로테아제 또는 일반적 프로테아제로 화학적 가수분해 또는 효소적 분해를 사용하여 시험관 내에서 가수분해될 것이다. 따라서 본 발명의 절단형 융합 단백질을 제공하기 위해, 상기에서 설명되었듯이, 추가적 아미노산 잔기를 포함하도록 절단형 단백질이 변형되었다.

캡소미어 제조에 있어서, 목적하는 천연 단백질, 절단형 단백질 또는 절단형 융합 단백질 중 하나를 암호화하는 DNA를 제조하는데 재조합 분자 생물학 기술을 이용할 수 있다. 목적하는 단백질을 암화화하는 DNA를 제조하는데 필요한 재조합 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있으며 일반적으로 실시되고 있다. 예를 들어, 실험 메뉴얼로는 문헌 Sambrook 등(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 뉴욕(1989) 및 Ausebel 등, Protocols In Molecular Biology, John Wiley $ Sons, Inc.(1994-1997)에 필요한 DNA 조작을 수행하는데 요구되는 기술이 상세히 기재되어 있다. 키메라 캡소미어를 보다 큰 규모로 제조하기 위해, 비루스 벡터 또는 진핵 벡터 중 하나를 이용하여 단백질을 발현시킬 수 있다. 바람직한 벡터에는 잘 알려져 있는 임의의 원핵 발현 벡터, 재조합 바큘로비루스, COS 세포 특이적 벡터, 백신 재조합체, 또는 효모 특이적 발현 구조물이 포함된다. 제조합 단백질을 사용하여 본 발명의 캡소미어를 제공하는 경우, 일차적으로 그 단백질을 그 발현 숙주 세포로부터 분리시키고 그 후에 자가-조립을 허용하는 조건하에서 배양하여 캡소미어를 제공할 수 있다. 또 다른 방법으로서, 캡소미어가 숙주 세포에서 형성되는 조건하에서 단백질을 발현시킬 수 있다.

또한 본 발명은 백신 제제의 캡소미어를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 방법으로서, L1 단백질 암호화 서열의 카르복실 말단기에서 6개의 부가 히스티딘을 암호화하는 DNA로부터 L1 단백질을 발현시킨다. 부가 히스티딘(His L1 단백질)로 발현된 L1 단백질들은 이.콜리에서 발현되는 것이 가장 바람직하고 His L1 단백질은 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 세포 용해질 중의 His L1 단백질을 예를 들어 6 M 구아니딘 히드로클로라이드와 같은 변성 완충액 또는 등가의 변성력을 갖는 완충액에 현탁시키고 나서, 니켈 크로마토그래피 처리한다. 니켈 크로마토그래피 처리에서 용리된 단백질을 예를 들어, 150 mM NaCl, 1mM CaCl₂0.01% 트리톤(Triton)-X 100, 10mM HEPES (N-2-히드록시에틸 피페라진-N'-2 에탄 술폰산), pH 7.4 중에서 변성시킨다. 본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 정제된 단백질을 투석시킨 후, 바람직하게는 150 mM NaCl, 25 mM Ca²⁺, 10% DMSO(디메틸 설폭사이드), 0.1 % 트리톤-X 100, pH값이 5.0인 100 mM 트리스[트리스-(히드록시메틸)아미노-메탄]아세트산에 대해 투석시킨 후에 캡소미어 조립체를 발생시킨다.

캡소미어의 형성을 전자 현미경에 의해 검사할 수 있는데 예를 들어, 상기 캡소미어는 융합 단백질로 구성되어 있으며, 조립된 캡소미어 중의 여러 단백질 성분의 존재는 특이적 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 분석에 의해 확인할 수 있다.

본 발명에 따라, 그 필요에 따라 백신이 필요한 환자의 HPV 감염 수준을 감소시키기 위해 본 발명 백신 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 HPV로 감염된 개체의 치료 방법이 제공된다. 또한 본 발명은 HPV 감염을 방지하기 위해 HPV에 감염될 수 있는 개체에게 본 발명 백신 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 HPV에 감염될 수 있는 개체에 대한 예방적 치료 방법을 제공한다. 감염된 개체는 표준 길항작용법을 사용하여 쉽게 확인할 수 있으며, 예를 들어, 감염된 개체와의 성 관계에 연루된 개체와 같이, 감염될 수 있는 개체도 확인할 수 있다. 하지만, HPV 감염의 빈도가 높기 때문에, 모든 성행위를 하는 사람은 유두종 비루스에 감염될 수 있다.

투여되는 백신 제제는 약학적 허용가능 담체, 희석제, 면역보강제, 및/또는 완충액과 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 백신은 1회 또는 다수회로 투여할 수 있다. 예를 들어, 구강, 정맥, 근내, 비강, 직장, 경피, 질, 피하 및 복강내 투여를 포함하는 다양한 경로를 통해 본 발명의 백신 제제를 전달할 수 있다.

본 발명의 백신 제제는 종래의 백신 제제에 비해 수많은 장점을 제공한다. 치료적 백신화의 일부로서, 캡소미어는 예를 들어 CIN 또는 경부암이 있는 환자의 영구 감염된 세포의 제거를 촉진시킬 수 있다. 또한, 이런 유형의 치료적 백신화는 재감염으로 인한 CIN 병변으로부터 환자를 보호할 예방적 목적으로 수행될 수도 있다. 추가적인 장점으로서, 캡소미어는 미리 존재하는 안티캡시드 항체와 그에 따른 보유에 의한 중화를 피할 수 있다.

키메라 캡소미어를 포함하는 백신 제제는 캡소미어가 형성되는 융합 단백질의 단백질 성분 둘다의 증가된 항원성의 또 다른 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, VLP에서, VLP 그 자체 내부에 위치하는 결과로 하부 켑소미어의 단백질 성분이 전체 구조물에 매립될 수 있다. 유사하게, 캡소미어와 캡소미어가 접촉하고 이에 따라 면역 반응을 유도할 수 있도록 접근할 수 없어짐으로써 단백질 성분의 에피토프가 입체적으로 방해받을 수 있다. L1/E7 융합 단백질을 사용하여 VLP를 생성하는 주요한 결과는 어떤 항체 반응도 E7 성분에 대해 검출되지 않았다는 점에서 이 위치를 지지한다. 이 관찰 결과는 L1의 카르복실 말단부가, 캡시드 내에 캡소미어 조립체가 존재할 수 있게 하는 펜타머 상호간 암(inter-pentameric arm) 구조를 형성한다는 것을 나타내는 이전 결과와 일치한다[Garcia 등, J. Virol. 71: 2988-2995 (1997)]. 키메라 캡소미어 구조물에 있어서, 융합 단백질 하부구조물의 양 단백질 성분은 면역 반응을 일으키기 위해 접근할 수 있다. 따라서 캡소미어 백신은 예를 들어, L1 아미노산 서열을 갖는 융합체로서 표현되는, 다른 비루스 단백질로부터 에피토프를 중화시키는 것과 같은, 임의의 단백질 성분에 대해 증가된 항원성이라는 부가적인 장점을 제공한다.

발명은 하기의 실시예에 의해 설명된다. 실시예 1은 융합, 또는 키메라 비루스 단백질을 생성하기 위한 발현 벡터의 제조를 설명한다. 실시예 2는 비루스 단백질의 발현을 위한 재조합 바큘로비루스의 생성에 관한 것이다. 실시예 3은 캡소미어의 정제를 설명한다. 실시예 4는 항혈청 및 단일클론 항체의 생성을 위한 면역화 과정을 설명한다. 실시예 5는 캡소미어 형성을 정량화하기 위한 펩티드 ELISA를 제공한다. 실시예 6은 캡소미어 형성을 정량화하기 위한 항원 포획 ELISA를 설명한다. 실시예 7은 중화 항체의 유도를 분석하기 위한 헤마글루티닌 분석을 제공한다.

본 발명은 융합 단백질, 절단형(truncated) 단백질, 또는 절단형 융합 단백질로서 유두종 비루스 단백질을 함유하는 백신 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 제제의 캡소미어의 제조방법, 뿐만아니라 그것을 사용한 예방 및 치료 방법을 포함한다.

실시예 1

키메라 L1 유전자의 제조

HPV 16L1 오픈 리딩 프레임을 암호하는 DNA를, BglII를 이용하여 플라스미드 16-114/k-L1/L2-pSyntxtVI^-[Kirnbauer et al., J.Virol. 67:6929-6936(1994)]로부터 잘라낸 후, 그 단편을 하나뿐인 BamHI 절단 부위에서 선형화된 pUC19(New England Biolabs, Beverly, MA)에 서브클로닝했다. 융합 단백질 발현을 위해 DNA를 삽입하할 수 있는 두 개의 기본적인 발현 구조체를 생성했다. 하나의 구조체는 아홉개의 아미노산 결실을 갖는 HPV 16L1△310을 암호했다. 결실된 영역은 모든 다른 유두종 비루스 L1 단백질들과 낮은 상동성을 나타내는 것으로 알려졌다. 두 번째 구조체인 HPV 16L1△C는 카르복시 말단 L1 잔기의 34 아미노산 결실을 갖는 단백질을 암호했다. 다른 구조체들은 다른 단백질 서열들을 암호하는 DNA의 삽입을 촉진하기 위해 결실 부위에 Eco RV 제한 부위를 포함한다. Eco RV 부위의 첨가는 두 개의 비-L1 단백질 아미노산인 아스파르트산과 이소루이신을 암호한다.

A. HPV 16L1△310 발현 구조체의 생성

pUC19 벡터 및 서열번호 1의 뉴클레오티드 916 내지 942를 제외한 완전한 HPV 16 L1 암호 서열을 증폭시키기 위해 두 개의 프라이머(서열 번호 5와 6)을 고안했다. 또한 증폭 생성물의 말단에 하나의 Eco RV 제한 부위(서열 번호 5와 6에서 밑줄침)를 도입하기 위해 프라이머를 합성했다.

CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG 서열번호 5

CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG 서열번호 6

생성된 PCR 생성물을 Eco RV로 절단하여 상보성 말단을 생성하고 결찰시켜 절단 생성물을 환형화시켰다.

결찰된 DNA를 표준 기법을 사용하여 E.coli에 형질전환시키고 생성된 콜로니로부터 얻은 플라스미드를 Eco RV 제한 부위의 존재에 대해 선별했다. HPV 16L1△310으로 표시된 하나의 클론이 적절한 27 뉴클레오티드 결실을 가지는 것으로 확인되었으며 이 구조체를 이용하여 다른 HPV 16 단백질을 암호하는 DNA 단편을 하기한 바와 같이 Eco RV 부위에 삽입했다.

B. HPV 16L1△C 발현 구조체의 생성

HPV 16 L1 오픈 리딩 프레임에 상보적인 두 개의 프라이머(서열 번호 7과 8)를 고안하여, 그 프라이머들이 서로 인접하여 pUC19내의 HPV 16 L1-암호 서열을 포함하는 원형 DNA에서 역방향으로 증폭되도록 하였다.

AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC 서열번호 7

AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG 서열번호 8

각 프라이머는 증폭 생성물의 말단에 Eco RV 제한 부위를 도입했다. 하부 프라이머(서열 번호 8)에서, 환형화를 위한 Eco RV 말단의 결찰시에 증폭 생성물이 34 카르복시 말단 L1 아미노산의 결실을 포함하도록 하기 위해, Eco RV 부위에 TAA 번역 종결 코돈이 이어진다. PCR을 수행하여 부분 L1 오픈 리딩 프레임과 완전한 벡터를 증폭시켰다. 증폭 생성물을 Eco RV로 절단하고, T4 DNA 리가아제로 환형화시킨 후 E.coli DH5 α세포로 형질전환시켰다. 생존 클론으로부터 얻은 플라스미드를 플라스미드의 선형화를 가능하게 하는 Eco RV 부위의 존재에 대해 분석했다. pUCHPV16L1△C로 표시되는 양성 구조체를 확인하여, Eco RV 부위를 이용하여 다른 HPV 16 단백질로부터의 DNA를 삽입하기 위해 이용했다.

C. HPV16L1△310과 HPV16L1△C로의 DNA 단편의 삽입.

HPV16L1△310과 HPV16L1△C 변형 서열내로의 단편의 삽입을 촉진하기 위해 말단 5'Eco RV를 도입한 프라이머를 이용하여 서열 번호 4의 아미노산 1-50, 1-60, 1-98, 25-75, 40-98, 50-98을 암호하는 HPV 16 E7의 단편들을 증폭시켰다. 다양한 증폭 반응에서, 프라이머 E7.1(서열 번호 9)을 프라이머 E7.2(서열 번호 10)과 함께 이용하여 E7 아미노산 1-50을 암호하는 DNA 단편을 생성했으며, 프라이머 E7.3(서열 번호 11)과 함께 이용하여 E7 아미노산 1-60을 암호하는 DNA 단편을 생성했으며; 또는 프라이머 E7.4(서열 번호 12)과 함께 이용하여 E7 아미노산 1-98을 암호하는 DNA 단편을 생성했다. 다른 증폭 반응에서는, 프라이머 쌍 E7.5(서열 번호 13)과 E7.6(서열 번호 14)을 이용하여 E7 아미노산 25-75를 암호하는 DNA 단편을 증폭시켰으며, E7.7(서열 번호 15)과 E7.4(서열 번호 12)를 이용하여 E7 아미노산 40-98을 암호하는 DNA 단편을 증폭시켰으며, E7.8(서열 번호 16)과 E7.4(서열 번호 12)를 이용하여 E7 아미노산 50-98을 암호하는 DNA 단편을 증폭시켰다.

프라이머 E7.1 서열번호 9

AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC

프라이머 E7.2 서열번호 10

TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC

프라이머 E7.3 서열번호 11

TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCC

프라이머 E7.4 서열번호 12

AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC

프라이머 E7.5 서열번호 13

TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG

프라이머 E7.6 서열번호 14

TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC

프라이머 E7.7 서열번호 15

TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC

프라이머 E7.8 서열번호 16

TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTG

이와 유사하게, 인플루엔자 매트릭스 단백질을 암호화하는 DNA로부터 얻은 뉴클레오티드(서열번호 17)를 서열번호 19 및 20로 설정한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다. 양 프라이머 모두 증폭 생성물 내에 EcoRV 제한 부위를 도입시킨다.

TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC 서열번호 19

TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG 서열번호 20

각 증폭 반응으로부터 얻은 PCR 생성물은 EcoRV를 사용하여 분할하고, 이를 동일한 효소를 사용하여 앞에서 선형화한 서열 HPV 16 L1Δ310 및 HPV 16 L1 ΔC 서열 중 하나의 EcoRV 부위 내로 삽입하였다. E7 아미노산 25-75 및 50-98을암호화하는 플라스미드 및 인플루엔자 매트릭스 단백질을 포함하는 플라스미드 내의 삽입물 배향을 결정하기 위해, ClaI 분해를 이용하였는데, 이는 새롭게 형성되는 EcoRV 제한 부위(GATATCGAT)와 중첩하는 제한 부위를 이용하고 상류 프라이머 내에 포함된다. HPV16 E7의 개시용 메티오닌을 비롯한 세개의 발현 작제물에 대해서, E7 암호 영역 내의 NslI 제한 부위를 사용하여 삽입물 배향을 결정하였다.

적당한 삽입물을 갖는 발현 작제물이 확인되면, L1 및 삽입된 아미노산 모두에 대한 단백질 암호 영역을 제한 효소 XbaI 및 SmaI을 사용하여 단위물로서 절제하고, 분리된 DNA는 플라스미드 pVL1393(인비트로겐)내로 결찰시켜서 재조합 바큘로비루스(baculoviruses)를 생성하였다.

D. 발현 작제물 내의 EcoRV 제한 부위의 제거

HPV 16 L1 ΔC 서열은 야생형 L1 폴리펩티드에서 통상적으로 발견되지 않는 아미노산의 형질전환을 일으키는 EcoRV 부위로부터 얻어지는 DNA를 포함한다. 따라서, 인공 EcoRV 부위를 제거한 일련의 발현 작제물이 고안되었다. 이러한 발현 작제물 계열에 대한 L1 서열을 HPV 16 L1 ΔC^*로 표시하였다.

HPV 16 L1 ΔC^*서열을 함유하는 발현 작제물을 형성하기 위해, 두개의 PCR 반응을 수행하여 E7 아미노산 1-50을 암호화하는 pUC-HPV16 L1 ΔC로부터 두개의 중첩 단편들을 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편들은 L1/E7 경계 위치에서 중첩하였으나, 두개의 EcoRV 제한 부위를 함유하지 않았다. 단편 1은 프라이머 P1(서열번호 21) 및 P2(서열번호 22)를 이용하여 형성되었으며 단편 2는 프라이머 P3(서열번호 23) 및 P4(서열번호 24)를 이용하여 형성되었다.

프라이머 P1 서열번호 21

GTTATGACATACATACATTCTATG

프라이머 P2 서열번호 22

CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC

프라이머 P3 서열번호 23

CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC

프라이머 P4 서열번호 24

CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG

처음 두개의 증폭 반응 후, 두개의 정제 생성물을 프라이머 P1 및 P4만을 사용하는 또 다른 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. 얻어진 증폭 생성물을 효소 EcoNI 및 HindIII로 분해시킨 후 전술한 HPV 16L1ΔC 발현 작제물 내로 삽입된 동일한 효소로 분해시켰다. 얻어진 발현 작제물은, 두개의 내부 EcoRV 제한 부위를 잃음으로써 L1 및 E7 아미노산 1-50을 암호화하는 DNA를 갖는 원래의 HPV16L1ΔC 작제물과는 상이하였다. 첫번째 EcoRV 부위는 이 위치에서 천연 L1 알라닌 및 글리신 아미노산을 암호화하는 DNA로 대체되며 두번째 EcoRV 부위는 해독 정지 신호로 대체된다. 또한, HPV 16L1ΔC^*E7 1-52로 표시되는 발현 작제물은 또한 E7 아미노산을 암호화하는 프라이머 P4를 사용한 결과 51 위치에 히스티딘이, 52 위치에 티로신이 잔류하므로 HPV 16 E7의 첫번째 52개의 아미노산들을 함유하였다. 그 후, HPV 16L1ΔC^*E7 1-52을 사용하여, 프라이머 P5(서열번호 25), 프라이머 쌍 P1 및 P6(서열번호 26)을 갖는 E7 아미노산 1-60, 및 프라이머 쌍 P1 및 P7(서열번호 27)을 갖는 E7 아미노산 1-65와 조합 상태의 프라이머 P1(서열번호 21)을 사용하여 E7 아미노산 1-55를 암호화하는 DNA를 추가로 포함하는 추가의 HPV 16L1ΔC발현 작제물을 형성시켰다. 증폭 생성물 내에서 DNA 서열을 암호화하는 추가의 아미노산은 소정의 아미노산에 대한 추가 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 디자인으로부터 생겨난다.

프라이머 P5 서열번호 25

CATCTGAAGCTTAACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

프라이머 P6 서열번호 26

CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

프라이머 P7 서열번호 27

CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

이와 유사하게, HPV 16L1ΔC^*E7 1-66을 암호화하는 주형 DNA 및 프라이머 쌍 P1 및 P8(서열번호 28)을 사용하여 HPV 16L1ΔC^*E7 1-70을 형성시켰다.

프라이머 P8 서열번호 28

CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG

각 PCR 반응 후, 증폭 생성물을 EcoNI 및 HindIII로 분해시키고 동일한 효소로 앞에서 분해시킨 HPV16L1ΔC 내로 삽입하였다. 디데옥시뉴클레오티드 말단에 형광 사슬을 갖는 응용 바이오시스템 프리즘(Applied Biosystems Prism) 377 서열용 도구를 사용하여 각 작제물의 서열을 결정하였다[프루버(Prober) 등., Science 238:336-341(1987)].

실시예 2

재조합 바큘로비루스의 생성

27℃에서, 10% 송아지 태아 혈청 및 2 mM 글루타민이 보충된 TNMFH 배지(시그마) 중에서 현탁액 또는 단층 배양물 상태로 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda; Sf9) 세포를 성장시켰다. HPV 16 L1을 주성분으로 하는 재조합 바큘로비루스 구조물의 경우, Sf9 세포를 선형화된 바큘로-골드 DNA(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 PharMingen에서 입수 가능) 2 ㎍과 함께 전이 플라스미드 10 ㎍으로 감염시켰다. 제조자의 제안된 프로토콜에 따라 재조합 비루스를 정제하였다.

HPV 16 L1 단백질의 형질 발현을 시험하기 위해서, 10⁵Sf9 세포를 감염 다중도(m.o.i) 5 내지 10으로 재조합된 바큘로비루스로 감염시켰다. 28℃에서 3 내지 4일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세정하였다. 세포를 SDS 샘플 완충액에 용리시키고 항-HPV 16 L1 및 항-HPV 16 E7 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅법으로 분석하였다.

키메라 L1 단백질 형질 발현 구조물이 캡소미어를 우선적으로 생산하는지를 확인하기 위해서, 형질 전환된 세포로부터의 추출물에 대해 구배식 원심 분리를 수행하였다. 구배식 원심 분리에 의해 얻은 분획들의 L1 단백질 함량은 웨스턴 블롯팅법으로, VLP 형성은 전자 현미경으로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 1에 요약한다.

완전 HPV L1 단백질뿐만 아니라, 형질 발현 생성물 HPV 16 L1Δ310 및 HPV 16 L1ΔC는 각각 동일 비율의 캡소미어와 비루스형 입자를 생산하는 것으로 나타났다. E7 암호화 서열을 HPV 16 L1Δ310 벡터에 삽입하는 경우, E7 아미노산 1 내지 50을 포함하는 융합 단백질만이 검출 가능한 캡소미어를 형성하였다.

E7 암호화 DNA를 HPV 16 L1ΔC 벡터에 삽입하는 경우, 모든 융합 단백질은 캡소미어를 생산하는 것으로 나타났는데, E7 아미노산 잔기 40∼98을 포함하는 키메라 단백질은 캡소미어 구조물만을 가장 높은 비율로 생산하였다. E7 아미노산 1∼98과 25∼75를 포함하는 키메라 단백질은 양자 모두 캡소미어를 주로 생산하는데, 비루스형 입자의 형성도 관찰되었다. E7 아미노산 1∼60을 포함하는 키메라 단백질은 거의 동일한 비율로 캡소미어와 비루스형 입자를 생산하였다.

E7 서열을 HPV 16 L1Δ*C 벡터에 삽입하면, 모든 융합 단백질이 캡소미어를 생산하는 것으로 나타났다. DNA 암호화 E7 잔기 1∼52, 1∼55 및 1∼60을 삽입하면, 가장 높은 비율의 캡소미어를 생산하였으며, 동일 비율의 비루스형 입자의 형성도 관찰되었다. DNA 암호화 E7 잔기 1∼65, 1∼70, 25∼75, 40∼98을 삽입하면 비교적 낮은 비율 또는 검출 불가능한 비율로 캡시드가 생산되었으나, 캡소미어는 다량 생산되었다.

키메라 HPV L1 단백질의 캡소미어 및 캡시드 형성 능력

L1 형질 발현 구조물	삽입 아미노산	캡소미어 수율	캡시드 수율
HPV 16 L1	-	+++++	+++++
HPV 16 L1Δ310	-	+++	++
HPV 16 L1ΔC	-	++++	++++
HPV 16 L1Δ310	E7 1∼98	-	-
HPV 16 L1Δ310	E7 1∼50	++	-
HPV 16 L1Δ310	E7 25∼75	-	-
HPV 16 L1Δ310	E7 50∼98	-	-
HPV 16 L1ΔC	E7 1∼98	+++	+
HPV 16 L1ΔC	E7 25∼75	+++	+
HPV 16 L1ΔC	E7 50∼98	+	+
HPV 16 L1ΔC	E7 1∼60	+++++	+++++
HPV 16 L1ΔC	E7 40∼98	++++	-
HPV 16 L1ΔC	인플루엔자	+++	+
HPV 16 L1Δ*C	E7 1∼52	+++++	+++++
HPV 16 L1Δ*C	E7 1∼55	+++++	+++++
HPV 16 L1Δ*C	E7 1∼60	+++	++++
HPV 16 L1Δ*C	E7 1∼65	++	-
HPV 16 L1Δ*C	E7 1∼70	++	-

실시예 3

캡소미어의 정제

트리코펄시아 니(TN) 하이 파이브 셀을 엑스 셀(Ex-Cell) 405 무혈청 매질(JRH 바이오사이언시스 제품) 내에서 약 2 x 10⁶세포/ml의 밀도로 증식시켰다. 약 2 x 10⁸개의 세포를 1000 x g으로 15 분동안 원심 분리시켜 펠릿화하고, 20 ml의 매질 중에 재현탁시킨 후, 실온 하에 1 시간동안 2 내지 5의 다중 감염도(m.o.i.)로 재조합 바쿨로비루스에 의해 감염시켰다. 200 ml의 매질을 첨가한 후, 세포를 평판 배양하고 3일 내지 4일동안 27℃에서 항온 처리하였다. 항온 처리후, 세포를 수거하여 펠릿화한 후 10 ml의 추출 완충액 중에 재현탁시켰다.

하기 단계를 4℃에서 수행하였다. 세포를 60 와트에서 45 초동안 초음파 처리하고, 생성된 세포 여액을 소발(Sorval) SS34 회전기 내에서 10,000 rpm으로 원심 분리시켰다. 상등액을 제거하여 보유시키는 한편, 생성된 펠릿은 6 ml의 추출 완충액 중에 재현탁시키고, 60 와트에서 다시 3초 동안 초음파 처리한 후 다시 원심 분리시켰다. 이 2개의 상등액을 혼합하고, 8 ml의 CsCl 용액(추출 완충액 중 8 ml 당 CsCl 4.6 g 함유) 상부에 14 ml의 40% 수크로즈를 함유하는 2 단계 구배로 성층화시킨 후, 소발 AH629 스윙 버켓 회전기 내에서 10℃ 하에 27,000 rpm으로 2 시간동안 원심 분리시켰다. CsCl 완전층과 함께 CsCl과 수크로즈 사이의 계면 영역을 13.4 ml의 켁실 튜브(베크만) 내로 수거하고 추출 완충액을 첨가하여 부피를 13.4 ml로 조절하였다. 샘플을 베크만 70 TI 회전기에서 20℃ 하에 50,000 rpm으로 밤새 원심 분리시켰다. 21 게이지 니들을 사용하여 튜브의 상부 및 하부에 구멍을 뚫어 구배물을 분별 분류하였다(분류물 당 1 ml). 분류물을 각 튜브로부터 수거하고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 항-HPV16 L1 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅 기술을 이용하여 각 분류물 2.5 ㎕을 분석하였다.

10% 내지 50% 수크로즈 구배 상에서 침전법을 통해 상기 분별물로부터 비루스 유형의 입자 및 캡소미어를 분리시켰다. CsCl 구배로부터 피크 분류물을 수거하여 5 mM HEPES(pH 7.5)에 대해 2 시간동안 투석시켰다. 이 투석물 절반에 EDTA(최종 농도 50 mM), EGTA(50 mM), DTT(30 mM), NaCl(100 mM) 및 트리스/HCl(pH 8.0, 10 mM)을 첨가하여 밤새 미처리 VLP를 분해시킴으로써 캡소미어를 제조하였다. 대조예에서는, 나머지 절반의 투석물에 NaCl 및 트리스/HCl만을 첨가하였다.

분해된 VLP로부터 제조된 캡소미어를 분석하기 위해, EDTA, EGTA 및 DTT(이들 각각의 최종 농도는 5 mM임)를 수크로즈 완충액에 첨가하고 4℃에서 2 시간 내지 4 시간동안 250,000 x g으로 원심 분리시켰다. 튜브의 하부에 구멍을 뚫어 분류물을 수거하였다. 그 후, 각 분류물의 1:10 희석액을 항원 포획 ELISA로 분석하였다.

실시예 4

폴리클로날 항혈청 및 모노클로날 항체의 제조를 위한 면역화 프로토콜

Balb/c 마우스에 대해 4 주마다 3회씩 완전 또는 불완전 프로인트 보조액(총 100 ㎕)과 1:1 혼합된 HPV 키메라 캡소미어 약 60 ㎍을 피하 투여하여 면역화시켰다. 3회 면역화 처리한 지 6 주후 마우스를 죽인 다음, 심장에 구멍을 뚫어 혈액을 수거하였다.

실시예 5

캡소미어 형성량을 측정하기 위한 펩티드 ELISA

미량 역가 평판(다이나테크 제품)을 PBS 중의 10 ㎍/ml 농도의 펩티드 E701(뮬러 등, 1982) 50 ㎕로 밤새 코팅하였다. PBS 중의 5% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 완충액 100 ㎕로 웰을 37℃ 하에 2 시간동안 차단시킨 후 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 3 회 세척하였다. 3회 세척 후, BSA/Tween 20/PBS 중에 1:5000으로 희석된 혈청 50 ㎕을 각 웰에 첨가하고 1 시간동안 항온 처리하였다. 평판을 전술한 바와 같이 다시 세척하고, 1:5000의 희석 비율로 염소-항-마우스 퍼옥시다아제 결합체 50 ㎕를 첨가하였다. 1 시간 후, 평판을 세척하고 ABTS 기질[0.2 mg/ml, 10 ml 당 30% H₂O₂4 ㎕를 함유하는 0.1 M Na-아세테이트-인산염 완충액(pH 4.2) 중의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-β-설폰산]을 사용하여 염색하였다. 다이나테크 자동화 평판 판독기에서 490 nm 하에 1 시간이 경과한 후 흡광도를 측정하였다.

실시예 6

캡소미어 형성을 정량화하기 위한 항원 포착 ELISA

CsCl 구배 분율에서의 비루스형 입자와 캡소미어의 상대적 정량화를 얻기 위해, 항원 포착 ELISA를 사용하였다. HPV 16 L1(항체 25/C, MM07 및 Ritti 1은 HPV 16 L1 VLP로 면역화시킨 마우스로부터 얻었음)에 대한 면역 특이성을 갖는 단백질 A 정제된 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 미량역가 평판을 1:500 희석의 50 ㎕/웰(최종 농도는 PBS중의 2 ㎍/㎖)로 밤새 코팅시켰다. 5% 밀크/PBS를 사용하여 평판을 1 시간 동안 블로킹시키고, 1:300 희석(5% 밀크/PBS)을 사용하여 CsCl 구배의 분율 50 ㎕를 1 시간 동안 37℃에서 첨가하였다. PBS/0.05%의 Tween 20으로 3회 세정후, HPV 16 VLP에 대해 배양된 폴리클로날 토끼 항혈청(밀크/PBS중의 1:3000 희석) 50 ㎕를 첨가하고, 평판을 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 평판을 다시 세정한 후, 5% 밀크를 함유하는 PBS중의 1:5000 희석한 염소-항-토끼 퍼옥시다제 공액물(시그마) 50 ㎕를 1 시간 동안 추가로 배양시켰다. 최종 세정후, 평판을 30 분 동안 ABTS 기재로 염색시키고, Dynatech 자동화 평판 판독기에서 490 ㎚에서 흡광이 측정되었다. 음성 대조군으로서, 분석물은 PBS만으로 코팅된 웰을 포함하였다.

모노클로날 항체의 캡소미어 특이성을 테스트하기 위해, EDTA/DTT를 포함하는 VLP를 입자로 분해하였다. 처리한 입자 제제를 항원-포착 ELISA로 분석하였으며, 판독치를 무처리 대조군과 비교하였다. 분해를 위해서는 VLP 40 ㎕를 30 mM의 DTT, 50 mM의 EGTA, 60 mM의 EDTA, 100 mM의 NaCl 및 100 mM의 Tris/HCl을 함유하는 분열 완충액(pH 8) 500 ㎕ 중에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 처리된 입자 및 무처리된 입자의 분액을 1:20∼1:40의 희석으로 상기 포획 ELISA중에 사용하였다.

실시예 7

적혈구 응집소 억제 분석

키메라 캡소미어 백신이 항체의 중화 반응을 유발하는 정도를 측정하기 위해, 적혈구 응집소 억제 분석을 간략하게 전술한 바와 같이 수행하였다. 이 분석은 비루스형 입자가 적혈구 세포를 적혈구 응집시킬 수 있다는 전술한 관찰을 토대로 한다.

임의의 키메라 캡소미어 백신을 사용하여 마우스를 면역화시키고, 이 혈청을 실시예 4에 기재된 바와 같이 하여 수집하였다. 양성 대조군으로서, HPV16 L1 비루스형 입자(VPL) 및 소의 PV1 (BPV) L1 VLP를 키메라 캡소미어 제제를 사용하여 평행 분석하였다. 양성의 기준선을 설정하기 위해, 적혈구 세포를 첨가한 후, 면역화된 마우스로부터 HPV 16 또는 BPV1 VLP를 혈청을 사용하거나 또는 혈청을 사용하지 않고 배양시켰다. 마우스 혈청을 사용한 예비배양이 적혈구 세포 적혈구 응집을 방해하는 정도는 마유스 혈청의 중화력을 나타낸다. 그후, 백신에 대한 마우스 혈청의 중화 효과를 측정하기 위해 키메라 캡소미어를 사용하여 실험을 반복하였다. 적혈구 응집 억제 분석에 대한 간략한 프로토콜을 하기에 기재한다.

1 ㎖의 신선한 마우스의 혈액에 헤파린 100 ㎕(1000 usp/㎖)를 첨가하였다. 적혈구 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 원심분리하고, 10 ㎖ 부피로 재현탁시켰다. 그다음, PBS 0.5 ㎖ 중의 적혈구를 재현탁한 후, 3 일 이하 동안 4℃에서 저장하였다. 적혈구 응집소 분석의 경우, 96-웰 평판상의 웰당 현탁액 70 ㎕를 사용하였다.

CsCl 구배로부터의 키메라 캡소미어 분액을 1 시간 동안 10 mM의 Hepes (pH 7.5)에 대해 투석시키고, PBS 중의 2 배의 연속 희석물 100 ㎕를 3∼16 시간 동안 4℃에서 추가로 배양하였다. 적혈구 응집 억제의 경우, 캡소미어를 실온에서 60 분 동안 PBS 중에서 항체 희석물로 배양한 후, 적혈구에 첨가하였다. 적혈구의 적혈구 응집도 및 항체 중화의 존재를 표준 기법으로 측정하였다.

임시의 결과로는, E7 아미노산 잔기 1-98과 결합된 HPV16L1ΔC 단백질을 포함하는 키메라 캡소미어에 대해 생성된 마우스 혈청은 HPV16VLP에 의해 적혈구 응집을 억제하기는 하나, BPV VLP에 의해서는 억제하지 못하는 것으로 관측되었다. 그래서, 마우스 혈청은 사람의 VLP에 대한 항체를 중화시키는데 있어서 양성을 나타내며, 이러한 특이한 중화는 대부분 항체가 형성되는 것에 대한 에피토프에 대한 항체 특이성으로 인한 것에 기인한다.

상기의 예시적인 실시예에 의해 설명된 바와 같은 본 발명의 다양한 변형예 및 수정예는 당업자에게는 명백할 것으로 예상된다. 첨부된 청구의 범위에 의해 청구된 바과 같은 한정만이 본 발명에 포함되는 것으로 하여야 한다.

〈서열 목록〉

(1) 일반정보:

(i) 출원인:

(ii) 발명의 명칭: 유두종 비루스 캡소미어 백신 제제 및 그 사용 방법

(iii) 서열의 수: 27

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인: 마샬, 오툴, 거스타인, 머레이 앤드 보런

(B) 거리: 6300 시어스 타워 사우스 웨커 드라이브 233

(C) 도시: 시카고

(D) 주: 일리노이

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 60606-6402

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC(호환 가능)

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.30

(vi) 현 출원 자료

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(viii) 대리인 정보:

(A) 성명: 윌리암스 쥬니어, 조셉 에이.

(B) 등록 번호: 38,659

(C) 참조 번호/서류 번호: 27013/34028

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: 312-474-6300

(B) 팩스: 312-474-0448

(2) 서열 번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 1518개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

(ix) 서열의 특징

(A) 특징을 나타내는 기호: CDS

(B) 존재 위치: 1..1518

(xi) 서열 번호 1:

[서열 1A]

[서열 1B]

(2) 서열 번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 506개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: 단백질

(xi) 서열 번호 2:

[서열 2A]

[서열 2B]

(2) 서열 번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 297개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(ix) 서열의 특징

(A) 특징을 나타내는 기호: CDS

(B) 존재 위치: 1..297

(xi) 서열 번호 3:

[서열 3]

(2) 서열 번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 98개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: 단백질

(xi) 서열 번호 4:

[서열 4]

(2) 서열 번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 34개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 5:

[서열 5]

(2) 서열 번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 6:

[서열 6]

(2) 서열 번호 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 40개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 7:

[서열 7]

(2) 서열 번호 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 44개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 8:

[서열 8]

(2) 서열 번호 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 9:

[서열 9]

(2) 서열 번호 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 34개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 10:

[서열 10]

(2) 서열 번호 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 44개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 11:

[서열 11]

(2) 서열 번호 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 12:

[서열 12]

(2) 서열 번호 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 38개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 13:

[서열 13]

(2) 서열 번호 14에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 14:

[서열 14]

(2) 서열 번호 15에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 39개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 15:

[서열 15]

(2) 서열 번호 16에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 39개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 16:

[서열 16]

(2) 서열 번호 17에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 294개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(ix) 서열의 특징

(A) 특징을 나타내는 기호: CDS

(B) 존재 위치: 1..294

(xi) 서열 번호 17:

[서열 17]

(2) 서열 번호 18에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 97개 아미노산

(B) 유형: 핵산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: 단백질

(xi) 서열 번호 18:

[서열 18]

(2) 서열 번호 19에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 40개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 19:

[서열 19]

(2) 서열 번호 20에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 20:

[서열 20]

(2) 서열 번호 21에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 24개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 21:

[서열 21]

(2) 서열 번호 22에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 22:

[서열 22]

(2) 서열 번호 23에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 29개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 23:

[서열 23]

(2) 서열 번호 24에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 36개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 24:

[서열 24]

(2) 서열 번호 25에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 38개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 25:

[서열 25]

(2) 서열 번호 26에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 54개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 26:

[서열 26]

(2) 서열 번호 27에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 69개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 27:

[서열 27]

(2) 서열 번호 28에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 47개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 종류: DNA

(xi) 서열 번호 28:

[서열 28]

Claims

인간 유두종 비루스 캡소미어를 포함하는 백신 제제로서, 여기서, 캡소미어가 제2 단백질에서 유래한 인간 유두종 비루스 L1 단백질 인접 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 것이 특징인 백신 제제.
인간 유두종 비루스 캡소미어를 포함하는 백신 제제로서, 여기서, 캡소미어가 비루스형 입자의 형성에 필수적인 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 보유하는 절단형 인간 유두종 비루스 L1 단백질을 포함하는 것이 특징인 백신 제제.
제2항에 있어서, 상기 캡소미어가 제2 단백질에서 유래한 절단형 인간 유두종 비루스 L1 단백질 인접 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 것이 특징인 백신 제제.
제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, L1 단백질이 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 및 HPV45로 구성된 군에서 선택되는 인간 유두종 비루스의 게놈에 암호화되어 있는 것이 특징인 백신 제제.
제4항에 있어서, 유두종 비루스가 HPV16인 것이 특징인 백신 제제.
제2항, 제3항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 카르복시 말단 아미노산 잔기가 L1 단백질로부터 결실된 것이 특징인 백신 제제.
제6항에 있어서, 1 내지 34개의 카르복시 말단 아미노산 잔기가 L1 단백질로부터 결실된 것이 특징인 백신 제제.
제7항에 있어서, 34개의 카르복시 말단 아미노산 잔기가 L1 단백질로부터 결실된 것이 특징인 백신 제제.
제2항, 제3항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 말단 아미노산 잔기가 L1 단백질로부터 결실된 것이 특징인 백신 제제.
제2항, 제3항 또는 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 내부 아미노산 잔기가 L1 단백질로부터 결실된 것이 특징인 백신 제제.
제10항에 있어서, L1 단백질로부터 결실된 아미노산 잔기가 핵의 위치 신호를 포함하는 것이 특징인 백신 제제.
제2항 또는 제3항에 있어서, 제2 단백질에서 유래한 아미노산 잔기가 HPV 단백질로부터 유래한 것이 특징인 백신 제제.
제12항에 있어서, HPV 단백질이 초기 HPV 단백질인 것이 특징인 백신 제제.
제12항에 있어서, 초기 HPV 단백질이 E1, E2, E3, E4, E5, E6 및 E7로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 백신 제제.
HPV 감염 레벨을 감소시키는 데 유효한 양의 제1, 2, 3, 5, 7, 8, 11, 13 또는 14항에 따른 백신 제제를 그 필요 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HPV 비루스로 감염된 개체의 치료 방법.
HPV 감염을 억제시키는 데 유효한 양의 제1, 2, 3, 5, 7, 8, 11, 13 또는 14항에 따른 백신 제제를 유두종 비루스 감염에 민감한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 유두종 비루스 감염의 예방 방법.