HU225893B1 - Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use - Google Patents

Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use Download PDF

Info

Publication number
HU225893B1
HU225893B1 HU0004360A HUP0004360A HU225893B1 HU 225893 B1 HU225893 B1 HU 225893B1 HU 0004360 A HU0004360 A HU 0004360A HU P0004360 A HUP0004360 A HU P0004360A HU 225893 B1 HU225893 B1 HU 225893B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
leu
seq
thr
pro
Prior art date
Application number
HU0004360A
Other languages
English (en)
Inventor
Lutz Gissmann
Martin Mueller
Original Assignee
Univ Loyola Chicago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Loyola Chicago filed Critical Univ Loyola Chicago
Publication of HUP0004360A2 publication Critical patent/HUP0004360A2/hu
Publication of HUP0004360A3 publication Critical patent/HUP0004360A3/hu
Publication of HU225893B1 publication Critical patent/HU225893B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/802—Virus-based particle
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
    • Y10S977/917—Vaccine

Description

A találmány tárgyát vakcinakészítmények képezik, amelyek humán papillomavírus-proteineket tartalmaznak fúziós proteinekként, csonka proteinekként vagy csonka fúziós proteinekként. A találmány tárgyát közelebbről olyan vakcinakészítmények képezik, amelyek a papillomavírus késői L1-proteinjét és egy második proteinből származó aminosavszekvenciákat magában foglaló fúziós proteineket tartalmaznak kapszomerek formájában. Ezenfelül a találmány tárgyát képezik eljárások a találmány szerinti készítményekben alkalmazott kapszomerek előállítására, valamint eljárások a találmány szerinti proteinek profilaktikus és terápiás alkalmazására.
A találmány szerinti vakcinakészítmények és eljárások alkalmazhatók papillomavírus-fertőzés megelőzésére és kezelésére.
Bizonyos magas kockázatú humán genitális papillomavírus- (HPV-) törzsekkel, például a HPV16-, 18vagy 45-típusokkal történő fertőződést tartják az anogenitális traktus malignus tumorai kialakulása szempontjából a fő rizikófaktornak. Az előforduló malignus elváltozások közül a cervikális karcinóma (méhnyakrák) messze a leggyakoribb: Az Egészségügyi Világszervezet („World Health Organization”; WHO) becslése szerint csaknem 500 000 új esetet fedeznek fel évente. A fenti kóros elváltozás gyakori előfordulása indokolta a HPV-fertőzés és a cervikális karcinóma közti összefüggés alapos tanulmányozását, ami számos általános megállapításhoz vezetett.
Például a cervikális intraepiteliális neoplázia („cervical intraepftheiiai neoplasia”, CIN) prekurzor elváltozásairól tudjuk, hogy azokat papillomavírus-fertőzések okozzák [Crum: New Eng J. Med. 310, 880 (1984)]. Bizonyos HPV-típusok genomjának DNS-ét - például a 16., 18., 33., 35. és 45. törzsek DNS-ét - ilyen rendellenességben szenvedő betegek tumorbiopsziás anyagának több mint 95%-ából, valamint a tumorokból továbbtenyésztett elsődleges sejtvonalakból ki lehet mutatni. A biopsziával nyert CIN-tumorsejtek körülbelül 50-70%ában csak HPV16-típusból származó DNS-t találtak.
A HPV16- és HPV18-eredetű korai gének proteintermékeit, az E6- és E7-proteineket kimutatták cervikális karcinóma sejtvonalakban és in vitro transzformált humán keratinocitákban [Wettstein és munkatársai: „Papilloma Viruses and Humán Cancer”, 155-179., szerk.: Pfister, CRC Press, Boca Raton, FL (1990)], és cervikális karcinómában szenvedő betegek jelentős százalékában anti-E6- vagy anti-E7-ellenanyagok mutathatók ki. Az E6- és E7-proteinekről kimutatták, hogy azok humán keratinocitákban és más sejttípusokban szerepet játszanak a celluláris DNS-szintézis indukálásában, továbbá transzgenikus egerekben részt vesznek tumorképződés kiváltásában [Arbeit és munkatársai: J. Virol. 68, 4358 (1994); Auewarakul és munkatársai: Mól. Cell Bioi. 14, 8250 (1994); Barbosa és munkatársai: J. Virol. 65, 292 (1991); Kaur és munkatársai: J. Gén. Virol. 70, 1261 (1989); Schlegel és munkatársai: EMBO J. 7, 3181 (1988)]. Az E6/E7 proteinek konstitutív expressziója szükségesnek látszik a HPV-pozitív tumorok transzformált állapotának fenntartásához.
Míg bizonyos HPV-törzsek in vivő és in vitro neoplasztikus elváltozások kiváltására képesek, más HPVtípusok benignus genitális szemölcsöket, például condyloma acuminatum (hegyes függöly) keletkezését idézik elő, és csak ritkán hozhatók kapcsolatba malignus tumorokkal [Ikenberg: „Genital Papillomavírus Infections”, 87-112., szerk.: Gross és munkatársai, Springer Verlag, Berlin]. Ilyen alacsony kockázati csoportba sorolt törzsek például a HPV6 és HPV11.
A genitális papillomavírusok leggyakrabban szexuális érintkezés során kerülnek át emberről emberre, számos esetben az anogenitális nyálkahártya tartós fertőződéséhez vezetve. Míg ez a megfigyelés azt sugallja, hogy vagy az elsődleges fertőzés vált ki elégtelen immunválaszt, vagy a vírus szerzett olyan képességet, hogy elkerülje az immunrendszer ellenőrző funkcióját, más megfigyelések szerint az immunrendszer aktív a papillomavírus-fertőzések elsődleges megnyilvánulása, valamint annak malignus átalakulása során [Altmann és munkatársai: „Viruses and Cancer”, 71-80., szerk.: Minson és munkatársai, Cambridge University Press (1994)].
Például nyúl- és szarvasmarha-patogén papillomavírusokkal történt elsődleges fertőződés klinikai megnyilvánulási formáinak kialakulása megakadályozható szemölcsextraktumokkal vagy víruseredetű strukturális proteinekkel végzett vakcinázással [Altmann és munkatársai: lásd fent; Campo: Curr. Top. In Microbiol and Immunoi. 186, 217 (1994)]. HPV16-eredetű E6 vagy E7 korai proteineket kódoló vakciniarekombinánsokkal vagy szintetikus E6- vagy E7-peptidekkel vakcinázott rágcsálók hasonlóképp védettekké válnak HPV16-vírussal transzformált autológ sejtekkel kiváltott tumorképződéssel szemben [Altman és munkatársai: (lásd fent); Campo és munkatársai: lásd fent; Yindle és Frazer és munkatársai: lásd fent]. Szemölcsök visszafejlődése váltható ki állati eredetű papillomavírusokkal történő injektálást követően, regresszor állatokból származó limfociták átvitelével. Végül immunszuppresszált betegekben - például szervtranszplantátum-recipiensekben vagy HIV-fertőzött egyénekben - a genitális szemölcsök, CIN-elváltozások és anogenitális karcinómák előfordulási aránya emelkedik.
A technika állása szerint nem ismertek olyan HPVvakcinák, amelyek humán papillomavírus késői L1-proteint tartalmaznának kapszomerek formájában, és amelyek mind profilaktikus, mind terápiás célra alkalmasak lennének. Mivel az L1-protein malignus genitális elváltozásokban nincs jelen, az L1-proteinnel végzett vakcinázás ilyen elváltozásban szenvedő betegek számára terápiás lehetőségként nem jön számításba. L1-proteinből és például E6- vagy E7-proteinből származó aminosavszekvenciákat tartalmazó, kiméra kapszomereket képező kiméra proteinek előállításával vakcinák profilaktikus és terápiás funkciói egy vakcinában egyesíthetők. Ilyen vakcinák profilaktikus és terápiás beavatkozás szempontjából kínált lehetséges előnyeinek tükrében különösen előnyös lenne, ha kiméra kapszomerek magas szintű termelésére alkalmas eljárás állna rendelkezésünkre.
HU 225 893 Β1
A technika állása szerint szükség van tehát HPVfertőzés megelőzésére vagy kezelésére alkalmas vakcinakészítményekre. Olyan, vakcinakészítmények előállítására alkalmas eljárások, amelyek áthidalnák a technika állása szerint ismert, a rekombináns HPV-proteinek expressziójával és tisztításával kapcsolatos problémákat, nyilvánvalóan alkalmazhatók lennének a HPV-vel már fertőződött egyénekből álló populáció kezelésére, valamint a HPV-fertőzésre fogékony egyénekből álló populáció immunizálására egyaránt.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét.
A találmány tárgyát terápiás és profilaktikus vakcinakészítmények képezik, amelyek kiméra, humán papillomavírus-kapszomereket tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik továbbá terápiás eljárások HPV-vel fertőzött betegek kezelésére, valamint eljárások HPV-fertőzés megelőzésére a fertőzésre fogékony egyénekben. Ezenfelül a találmány tárgyát képezik eljárások a találmány szerinti kapszomerek és proteinek előállítására és tisztítására.
Egyrészt a találmány tárgyát képezik profilaktikus vakcinázási eljárások HPV-fertőzés megelőzésére, amelyek szerint a papillomavírus L1 és L2 strukturális proteinjeit tartalmazó vakcinákat adunk be. Ilyen típusú vakcinák kifejlesztéséhez jelentős akadályokat kell leküzdenünk, mivel papillomavírusok sejttenyészetekben vagy más kísérleti rendszerekben nem szaporíthatok megfelelő titerben, és a vírusproteinek nem nyerhetők ki gazdaságos vakcina előállításához elegendő mennyiségben. Ezenfelül a proteinek expresszáltatására alkalmazható rekombináns technológiák nem mindig közvetlenek, és azokkal a protein gyakran alacsony hatásfokkal állítható elő. Újabban a víruskapszid-struktúrához hasonló felépítésű vírusszerű részecskéket („viruslike particles”; VLP-k) írtak le, amelyeket Sf-9-rovarsejtekben állítanak elő az L1- és L2-vírusproteinek (vagy csak az L1-protein) expresszáltatásával, rekombináns vakcinia- vagy baculovírus alkalmazásával. A VLP-k igen egyszerűen tisztíthatok CsCIvagy szacharózgradiensen végzett centrifugálással [Kimbauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad Sci. USA 99, 12 180 (1992), Kirnbauer és munkatársai: J. Virol. 67, 6929 (1994); Porso és munkatársai: J. Virol. 6714, 1936 (1992); Sasagawa és munkatársai: Virology 2016, 126 (1995); Volpers és munkatársai: J. Virol. 69, 3258 (1995); Zhou és munkatársai: J. Gén. Virol. 74, 762 (1993); Zhou és munkatársai: Virology 185, 251 (1991)]. A WO 93/02 184 számú nemzetközi közzétételi iratban olyan eljárást ismertetnek, amelyben papillomavírusszerű részecskéket (VLP-ket) alkalmaznak diagnosztikai célokra, vagy vakcinaként papillomavírus okozta fertőzések ellen. A WO 94/00 152 számú nemzetközi közzétételi iratban humán és állati papillomavirionokon található konformációs neutralizáló epitópot utánzó L1-protein rekombináns úton történő előállítását ismertetik.
Másrészt a találmány tárgyát képezik terápiás vakcinázási eljárások, komplikációk - például papillomavírus-fertőzés okozta cervikális karcinóma vagy prekurzor elváltozások - megszüntetésére, amelyek alternatívát kínálnak a megelőző célú beavatkozásokhoz képest. Ilyen típusú vakcinák tartalmazhatnak korai papillomavírus-proteineket, elsősorban a tartósan fertőzött sejtekben expresszálódó E6- vagy E7-proteineket. Feltételezzük, hogy ilyen típusú vakcinák beadását követően citotoxikus T-sejtek aktiválódnak a genitális elváltozásokban található tartósan fertőzött sejtek ellen. A terápiás beavatkozás célpopulációját HPV-asszociált premalignus vagy malignus elváltozásokban szenvedő betegek képezik. A WO 93/20 844 számú nemzetközi PCT közzétételi iratban azt az állítást találjuk, hogy a HPV- vagy BPV-papillomavírusok E7 korai proteinje vagy annak antigénhatású fragmentumai terápiás hatásúak emlősökben papillomavírus okozta tumorok visszafejlesztésére, de nincs ilyen hatásuk a megelőzésben. Míg a korai HPV-proteineket rekombináns expresszióval előállították E. coliban vagy megfelelő eukarióta sejttípusokban, a rekombináns proteinek tisztítása bonyolultnak bizonyult a proteinek eredendően alacsony szolubilitása és az összetett tisztítási eljárások következtében, amelyek általában több lépés kombinációjának - ezen belül ioncserélő kromatográfia, gélszűrés és affinitásos kromatográfia - alkalmazását teszik szükségessé.
A találmány tárgyát papillomavírus-kapszomereket tartalmazó vakcinakészítmények képezik, amelyek a felsoroltak valamelyikét tartalmazzák: (i) egy első proteint, amely részben egy második proteinből származó aminosavszekvenciákat tartalmazó fúziós proteinként expresszáltatott intakt vírusprotein; (ii) csonkított vírusproteint; (iii) csonkított vírusproteint, amely részben egy második proteinből származó aminosavszekvenciákat tartalmazó fúziós proteinként expresszáltatott csonkított vírusprotein; vagy (iv) az említett három proteintípus valamilyen kombinációját. A találmány szerinti megoldással összhangban a találmány tárgyát képezik szarvasmarha-papillomavírusból (BPV) és humán papillomavírusból (HPV) származó kapszomereket tartalmazó vakcinakészítmények. Szarvasmarhapapillomavírus-kapszomerek előnyösen I. típusú szarvasmarhapapillomavírusból származó proteint tartalmaznak. Humán papillomavírus-kapszomerek előnyösen HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 vagy HPV45 papillomavírus-törzsekből származó proteineket tartalmaznak. A vakcinakészítmények legelőnyösebben HPV16 típusú törzsből származó proteineket magában foglaló kapszomereket tartalmaznak.
Egyrészt a találmány szerinti kapszomer vakcinakészítmények egy első, intakt vírusproteint tartalmaznak, amely egy második proteinből származó további aminosavszekvenciákkal alkotott fúziós proteinként van expresszáltatva. A vakcinák intakt vírusproteinekként előnyösen az L1 és L2 strukturális papillomavírusproteineket tartalmazzák. Intakt vírusproteint magában foglaló fúziós proteint tartalmazó kapszomerek előállíthatok az L1- és L2-proteinek kombinációjának, vagy csak az L1-proteinnek az alkalmazásával. Kapszomerek előnyösen csak L1 fúziós proteinekből épülnek fel, amelynek aminosavszekvenciáját a 2. azonosító szá3
HU 225 893 Β1 mú szekvencián, az azt kódoló nukleotidszekvenciát az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. A második protein aminosavszekvenciája számos forrásból származhat (ezen belül az első protein aminosavszekvenciájából), amennyiben a második protein aminosavszekvenciáinak hozzáadása az első proteinéhez megengedi kapszomerek képződését. A második protein aminosavszekvencájának hozzáadása előnyösen gátolja az első vírusproteint abban, hogy vírusszerű részecskestruktúrákat alakítson ki; és legelőnyösebben a második protein aminosavszekvenciái elősegítik a kapszomerképződést. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a második protein bármely humán tumorantigén, virális antigén vagy bakteriális antigén lehet, amely lényeges szerepet játszik immunválasz kiváltásának stimulálásában, neoplasztikus vagy fertőző betegségekben. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a második protein szintén papillomavírus-protein. Az említetteken felül a második protein előnyösen papillomavírus korai gén expressziós terméke. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a második protein HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 vagy HPV45 papillomavírus-törzsek genomja által kódolt E1, E2, E3, E4, E5, E6 vagy E7 korai géntermék. A második protein legelőnyösebben a HPV16 E7-génje által kódolt protein, amelynek nyitott olvasási keretét a 3. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. A fúziósprotein-alegységekből felépülő kapszomereket a leírásban kiméra kapszomereknek nevezzük. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vakcinakészítmények olyan kiméra kapszomereket tartalmaznak, amelyekben az L1-proteinből származó aminosavszekvenciák a teljes fúziós protein aminosavszekvenciájának mintegy 50-99%-át teszik ki. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint az L1-protein-eredetű aminosavszekvenciák a teljes fúziós protein aminosavszekvenciájának mintegy 60-90%-át teszik ki; és a találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az L1-protein-eredetű aminosavszekvenciák a fúziós protein aminosavszekvenciájának mintegy 80%-át teszik ki.
Ezenfelül a találmány tárgyát képezik olyan, csonkított vírusproteineket tartalmazó kapszomer vakcinakészítmények, amelyekben a vírusszerű részecskék kialakításához szükséges egy vagy több aminosav deletált. Az aminosavdeléció előnyösen nem gátolja, hogy a csonkított proteinből kapszomerek képződjenek, és legelőnyösebben a deléció kedvez a kapszomerképződésnek. Ilyen típusú vakcinakészítmények előnyösen csonkított L1-vírusproteinből felépülő kapszomert tartalmaznak L2-vírusproteinnel együtt vagy anélkül. Különösen előnyösen a kapszomerek csonkított L1-proteineket tartalmaznak. A leírás szerinti értelemben csonkított proteineknek olyan proteineket nevezünk, amelyekben egy vagy több aminosav deletált a protein karboxiterminális végéről, vagy egy vagy több aminosav deletált a protein aminoterminális végéről; vagy egy vagy több aminosav deletált a protein egy belső régiójából (azaz nem valamelyik végről). Kapszomer vakcinakészítmények előnyösen a karboxiterminális végen csonkított proteineket tartalmaznak. HPV16-eredetű L1-proteineket tartalmazó kapszomer vakcinakészítményekben előnyösen a karboxiterminális 1-34. aminosav deletált. Viszonylag rövid deléciók is lehetségesek, amelyek azzal az előnnyel járnak, hogy csak kismértékben változtatják meg az L1-proteinek és az általuk képzett kapszomerek antigéntulajdonságait. Legelőnyösebben azonban 34 aminosav deletált az L1-szekvenciából, közelebbről a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV16 L1-proteinszekvencia 472-505. pozícióinak megfelelő, azaz az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott humán HPV16 L1-kódolószekvencia 1414-1516. nukleotidjainak megfelelő polinukleotidszekvencia által kódolt szekvencia van deletálva.
Amennyiben a kapszomer vakcinakészítmény belső deléciót hordozó proteineket tartalmaz, a deletált aminosavszekvencia előnyösen a protein nukleáris lokalizációs régióját foglalja magában. A HPV16 L1-proteinjében a nukleáris lokalizációs szignál körülbelül a 449. aminosavtól körülbelül az 505. aminosavig terjedő régióban található. Amennyiben az L1-proteint az NSL delécióját követően expresszáltatjuk, a kapszomer struktúrák a gazdasejt citoplazmájában állnak össze. Következésképp a kapszomerek a citoplazmából tisztíthatok a mag helyett, ahol az intakt L1-proteinek kapszomerekké történő összeépülése megy végbe. Csonkított proteinek összeépülésével keletkező kapszomereket, amennyiben a deletált proteinszekvenciát további aminosavakkal nem helyettesítettük, természetesen nem tekintjük kiméráknak.
A találmány tárgyát képezik továbbá kapszomer vakcinakészítmények, amelyek csonkított vírusproteint tartalmaznak egy második proteinből származó aminosavszekvenciákkal alkotott fúziós proteinként. A találmány szerinti csonkított vírusproteinek előnyösen a papillomavírus L1 és L2 strukturális proteinjeiből származnak. Csonkított vírusprotein-fúziókat tartalmazó kapszomerek előállíthatok L1- és L2-proteinkomponensek, vagy csak L1-protein alkalmazásával. A kapszomerek előnyösen csak L1-proteinből származó aminosavszekvenciákat tartalmaznak. A fúziós proteinek csonkított vírusprotein-komponenseiben egy vagy több aminosav deletált a protein karboxiterminális végéről; vagy egy vagy több aminosav deletált a protein aminoterminális végéről; vagy egy vagy több aminosav deletált a protein egy belső régiójából (azaz nem valamelyik végről). Kapszomer vakcinakészítmények előnyösen a karboxiterminális végen csonkított proteineket tartalmaznak. HPV16-eredetű L1-proteineket tartalmazó kapszomer vakcinakészítményekben előnyösen a karboxiterminális 1-34. aminosav deletált. Viszonylag rövid deléciókat is létrehozhatunk, amelyek azzal az előnnyel járnak, hogy csak kismértékben változtatják meg az L1-proteinek és az általuk képzett kapszomerek antigénsajátságait. Előnyösebben azonban 34 aminosav deletált az L1-szekvenciából, közelebbről a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV16 L1-proteinszekvencía 472-505. pozícióinak megfelelő, azaz
HU 225 893 Β1 az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott humán HPV16 L1-kódolószekvencia 1414-1516. nukleotidjainak megfelelő polinukleotidszekvencia által kódolt szekvencia van deletálva. Amennyiben a kapszomer vakcinakészítmény belső deléciót hordozó proteineket tartalmaz, a deletált aminosavszekvencia előnyösen a protein nukleáris lokalizációs régióját vagy annak szekvenciáját foglalja magában.
A második protein aminosavszekvenciája számos forrásból származhat, amennyiben a második protein aminosavszekvencájának hozzáadása az első proteinéhez megengedi kapszomerek képződését. A második protein aminosavszekvenciájának hozzáadása előnyösen elősegíti a kapszomerképződést, vagy kedvez annak. A második protein aminosavszekvenciája számos forrásból származhat, ezen belül az első protein aminosavszekvenciájából. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a második protein ugyancsak papillomavírus-protein. Szintén előnyösen a második protein papillomavírus korai gén expressziós terméke. Legelőnyösebben azonban a második protein papillomavírus E1, E2, E3, E4, E5, E6 vagy E7 korai gének génterméke. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vakcinakészítmények olyan kiméra kapszomereket tartalmaznak, amelyekben az L1-proteinből származó aminosavszekvenciák a teljes fúziós protein aminosavszekvenciájának mintegy 50-99%-át teszik ki. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint az L1-protein-eredetű aminosavszekvenciák a teljes fúziós protein aminosavszekvenciájának mintegy 60-90%-át teszik ki; és a találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az L1-protein-eredetű aminosavszekvenciák a fúziós protein aminosavszekvenciájának 80%-át teszik ki.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vakcinakészítmény proteinjeit rekombináns úton állítjuk elő, de intakt vírusproteineket tartalmazó készítmények esetében a proteinek természetes forrásból is izolálhatok. Természetes forrásból izolált intakt proteinek in vitro, a technika állása szerint ismert kovalens módosító technológiákkal úgy módosíthatók, hogy azokhoz további aminosavakat adunk, ezáltal a találmány szerinti fúziós proteineket megkapjuk. Hasonlóképp, csonkított vírusproteineket tartalmazó készítmények esetében, a proteinek természetes forrásból intakt proteinként izolálhatok, és in vitro kémiai hidrolízissel vagy enzimatikus emésztéssel hidrolizálhatók, helyspecifikus vagy általános proteázok bármelyikének alkalmazásával. Ezután a csonkított proteineket úgy módosíthatjuk, hogy a fent leírtak szerint további aminosavakat tartalmazzanak, ezáltal megkaphatjuk a találmány szerinti csonkított fúziós proteineket.
A kapszomerek előállítása során rekombináns molekuláris biológiai eljárásokat alkalmazhatunk a kívánt intakt proteint, csonkított proteint vagy csonkított fúziós proteint kódoló DNS előállítására. A kívánt proteint kódoló DNS előállítására alkalmazható rekombináns eljárások a technika állása szerint jól ismertek, és azokat a gyakorlatban rutinszerűen alkalmazzák. A kívánt DNStechnológiai eljárások részletes leírása megtalálható laboratóriumi kézikönyvekben, lásd például: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); valamint Ausubel és munkatársai (szerk.): „Protocols In Molecular Biology”, John Wiley & Sons. Inc., (1994-1997). Kiméra kapszomerek üzemi mértékben történő előállítására a protein virális vagy eukarióta vektorok alkalmazásával expresszáltatható. Vektorokként előnyösen bármely ismert prokarióta expressziós vektort, rekombináns baculovírust, COS-sejtspecifikus vektort, vakciniarekombinánst vagy élesztőspecifikus expressziós konstrukciót alkalmazhatjuk. Amennyiben rekombináns proteineket alkalmazunk a találmány szerinti kapszomerek előállítására, eljárhatunk úgy, hogy a proteineket először izoláljuk a gazdasejtből, amelyben azt expresszáltattuk, majd olyan körülmények mellett inkubáljuk, amelyek lehetővé teszik azok összeépülését, ezáltal kapszomerek létrejöttét. Eljárhatunk továbbá úgy, hogy a proteineket olyan körülmények mellett expresszáltatjuk, amelyek lehetővé teszik, hogy kapszomerek képződjenek a gazdasejtben.
A találmány tárgyköréhez tartoznak továbbá eljárások a vakcinakészítményekben található kapszomerek előállítására. Egy eljárás szerint L1-proteineket expresszáltatunk az L1-protein kódolószekvenciájának karboxiterminális végén hat további hisztidint kódoló DNSről. Járulékos hisztídineket hordozó (His-L1-proteinként) expresszáltatott L1-proteineket legelőnyösebben E. coliban expresszáltatunk, és a His-L1-proteineket nikkel affinitásos kromatográfiával tisztíthatjuk. A sejtlizátumban található His-L1-proteineket denaturálópufferben, például 6 mol/l guanidin-hidrokloridban vagy azzal egyenértékű denaturálóképességű pufferben szuszpendáljuk, és nikkel affinitásos kromatográfiának vetjük alá. A nikkel kromatográfiás lépésben eluált proteineket renaturáljuk, például a következő összetételű pufferben: 150 mmol/l NaCI; 1 mmol/l CaCI2; 0,01% TritonX-100; 10 mmol/l HEPES (N-2-hidroxi-etil-piperazin-N’2-etánszulfonsav) (pH=7,4). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kapszomerek összeáll ítódása azután megy végbe, hogy a proteineket dializáltuk, például az alábbi összetételű pufferrel szemben: 150 mmol/l NaCI; 25 mmol/l Ca2+; 10% DMSO (dimetilszulfoxid); 0,1% Triton-X-100; 10 mmol/l Tris [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán]-ecetsav (pH=5,0).
A kapszomerek képződése elektronmikroszkópos vizsgálattal követhető, és - amennyiben a kapszomerek fúziós proteinekből állnak - a különböző proteinkomponensek jelenlétét az összeépült kapszomerekben Western-blot-analízissel igazolhatjuk, specifikus antiszérumok alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldással összhangban a találmány tárgyát képezik eljárások HPV-vel fertőzött egyének terápiás célú kezelésére, amely szerint a találmány szerinti vakcinakészítmény olyan mennyiségét adjuk be kezelésre szoruló betegnek, amely hatásos a HPV-fertőzés szintjének csökkentésére. A már említet5
HU 225 893 Β1 teken felül a találmány tárgyát képezik eljárások HPVfertőzésre hajlamos egyének megelőző célú (profilaktikus) kezelésére, amelyek szerint a találmány szerinti vakcinakészítmény olyan mennyiségét adjuk be HPVfertőzésre fogékony egyénnek, amely hatásos HPV-fertőzés megelőzésére. Míg a fertőzött egyének könnyen azonosíthatók ismert diagnosztikai eljárásokkal, fogékony egyéneket azonosíthatunk például annak alapján, hogy szexuális kapcsolatuk volt fertőzött egyénnel. A HPV-fertőzés magas előfordulási gyakorisága miatt azonban valamennyi szexuálisan aktív egyént fogékonynak tekintjük papillomavírus-fertőzésre.
A beadott vakcinakészítmény egy vagy több további komponenst is tartalmazhat, például gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat, hígítóanyagokat, adjuvánsokat és/vagy puffereket. A vakcinákat beadhatjuk egyetlen vagy több alkalommal. A találmány szerinti vakcinakészítmények különböző utakon adhatók be, például szájon át (orálisan), intravénásán, intramuszkulárisan, orron át (nazálisán), rektálisan, transzdermálisan, vaginálisan, szubkután vagy intraperitoneálisan.
A találmány szerinti vakcinakészítmények számos előnnyel bírnak a hagyományos vakcinakészítményekhez képest. Terápiás vakcinázás részeként a kapszomerek elősegíthetik tartósan fertőzött sejtek eliminációját, például CIN-elváltozásban vagy cervikális karcinómában szenvedő betegben. Az ilyen típusú terápiás vakcinázás profilaktikus célt is szolgálhat, mivel védelmet nyújt a betegnek ismételt fertőzés okozta CIN-elváltozásokkal szemben. További előnyt jelent, hogy a kapszomerek elkerülhetik a neutralizációt a már jelen lévő, antikapszid ellenanyagok által, ezáltal felezési idejük a keringésben hosszabb, mint a kiméra vírusszerű részecskéké.
Kiméra kapszomereket tartalmazó vakcinakészítmények további előnye lehet, hogy azokban a kapszomereket alkotó fúziós protein mindkét proteinkomponense nagyobb mértékű antigenitást mutathat. VLP-k esetében például az alsó kapszomer proteinkomponenseit az összességében vett struktúra elfedheti, mivel az a VLP-ben belül helyezkedik el. Hasonlóképp, a proteinkomponensek epitópjai kapszomer-kapszomer kontaktusok eredményeképp szférikusán gátoltak lehetnek, ezért hozzáférhetetlenek ahhoz, hogy immunválaszt váltsanak ki. L1/E7 fúziós proteinek alkalmazásával végzett, VLP-k előállítását célzó előzetes kísérletek alátámasztják ezt a feltételezést, amennyiben nem volt ellenanyagválasz kimutatható az E7-komponens ellen. Ez a megfigyelés összhangban van korábbi eredményekkel, melyek szerint az L1-protein karboxiterminális régiója pentamerek közti „kar”-struktúrákat képez, amelyek lehetővé teszik kapszomerek kapsziddá történő összeépülését [Garcia és munkatársai: J. Virol. 71, 2988 (1997)]. A kiméra kapszomer struktúrában feltehetően a fúziósprotein-alegység mindkét proteinkomponense hozzáférhető immunválasz kiváltásához. Kapszomer vakcinák alkalmazása tehát azzal a további előnnyel jár, hogy a proteinkomponensek, például az L1-aminosavszekvenciákkal fuzionáltatva expresszált egyéb vírusproteinek neutralizáló epitópjainak antigenitása megnövekszik.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
Miután a találmány szerinti megoldást az alábbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni. Az 1. példában fúziós protein vagy kiméra vírusproteinek előállítására alkalmazott expressziós vektorok előállításának menetét ismertetjük. A 2. példában vírusproteinek expresszáitatására alkalmazott rekombináns baculovírus előállítását írjuk le. A 3. példában kapszomerek tisztítását ismertetjük. A 4. példában immunizációs eljárást ismertetünk, amellyel antiszérum és monoklonális ellenanyagok állíthatók elő. Az 5. példában kapszomerképződés kvantitatív meghatározására alkalmas peptid-ELISA-eljárást írunk le. A 6. példában kapszomerképződés kvantitatív meghatározására alkalmas „capture” ELISA eljárást ismertetünk. A 7. példában neutralizáló ellenanyagok termelődésének meghatározására alkalmas hemagglutinin vizsgálati eljárást ismertetünk.
1. példa
Kiméra L1-gének előállítása
HPV16-törzs-eredetű L1 nyitott olvasási keretet kódoló DNS-t a 16-114/k-L1/L2-pSynxtVI- plazmidból vágtunk ki [Kimbauer és munkatársai: J. Virol. 67, 6929 (1994)] Bglll-enzim alkalmazásával, és a kapott fragmentumot előzőleg linearizált pUC19-plazmid (New England Biolabs, Beverly, MA) egyedi BamHI hasítási helyére szubklónoztuk. Először két expressziós konstrukciót hoztunk létre, amelyek lehetővé tették a fúziós proteint kódoló DNS inszertálását és a fúziós protein expresszáltatását. Az egyik, HPV16 L1A310-nek elnevezett konstrukció kilenc aminosavdeléciót hordozó proteint kódolt: a deletált régióról ismert, hogy alacsony fokú homológját mutat egyéb papillomavírus L1-proteinekkel. A második, HPV16 L1AC-nek elnevezett konstrukció olyan proteint kódolt, amely 34 aminosavdeléciót hordozott az L1-szekvencia karboxiterminális végén. További konstrukciók EcoRV restrikciós helyet tartalmaztak a deléció pozíciójában, ami lehetővé tette más proteinszekvenciákat kódoló DNS-ek inszertálását. Az EcoRV-hely létrehozása két nem L1-proteineredetű aminosav - aszparagin és izoleucin - hozzáadásával járt.
A) A HPV16 L1A310-nek elnevezett expressziós konstrukció előállítása
Két láncindítót (5. és 6. azonosító számú szekvencia) terveztünk a pUC19-vektor és az 1. azonosító számú szekvencia szerinti 916-942. nukleotidok kivételével a teljes HPV16 L1-kódolószekvencia amplifikálására. A láncindítókat úgy terveztük, hogy azokkal egyúttal EcoRV restrikciós helyet hozzunk létre az amplifikációs termékek végén (az 5. és 6. azonosító számú szekvenciákban aláhúzással jelölve).
CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG (5. azonosító számú szekvencia); és
CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG (6. azonosító számú szekvencia).
HU 225 893 Β1
A kapott PCR-terméket EcoRV-enzimmel emésztettük, miáltal komplementer végeket kaptunk, és az emésztett terméket ligálással linearizáltuk. A ligáit DNS-sel ismert eljárások szerint E. coli sejteket transzformáltunk, és a kapott telepekből izolált plazmidokat EcoRV restrikciós hely jelenlétére szűrtük. Egy, a megfelelő, huszonhét nukleotidot átfedő deléciót hordozó, HPV16 L1Á310-nek elnevezett kiónt azonosítottunk; ennek a konstrukciónak az EcoRV-helyére inszertáltunk egyéb HPV16-proteineket kódoló DNS-fragmentumokat, az alább ismertetettek szerint eljárva.
B) HPV16 L1AC expresszíós konstrukciók előállítása
Két, a HPV16 L1 nyitott olvasási keretével komplementer, egymással határosán hibridizálódó láncindítót (7. és 8. azonosító számú szekvencia) terveztünk, amelyek lehetővé tették, hogy amplifikációt végezzünk reverz irányban a fent leírt, pUC19-vektorba inszertált HPV16 L1-proteint kódoló szekvenciákat tartalmazó templát-DNS mentén:
AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC (7. azonosító számú szekvencia); és
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG (8. azonosító számú szekvencia).
Minkét láncindító EcoRV restrikciós helyet hozott létre az amplifikációs termék végén. A „lefele” („downstream”) láncindítóban (8. azonosító számú szekvencia) az EcoRV-helyet TAA transzlációs stopkodon követte, amelyet úgy helyeztünk el, hogy az amplifikációs termék - az EcoRV-helyek ligálásával történő cirkularizációt követően - az L1-protein karboxiterminális 34 aminosavát átfedő deléciót hordozzon. PCR reakciót végeztünk, miáltal amplifikáltuk a részleges L1 nyitott olvasási keretet és a teljes vektort. Az amplifikációs terméket EcoRV-enzimmel hasítottuk, T4-DNSligázzal cirkularizáltuk, és transzformációval E. coli DH5a-sejtekbe juttattuk. Életképes kiónokból plazmidokat izoláltunk, és azokat EcoRV-hely jelenlétére analizáltuk, amelynek hasítása a plazmidok linearizálódását eredményezi. Egy pozitív konstrukciót azonosítottunk, amelyet pUC-HPV16LlAC-nek neveztünk, és amelybe egyéb HPV16-proteineket kódoló DNS-fragmentumokat inszertáltunk, az EcoRV-helyre.
C) DNS-fragmentumok inszertálása a
HPV16 L1P310 és HPV16 L1AC konstrukciókba
A 4. azonosító számú szekvencia 1-50., 1-60., 1-98., 25-75., 40-98. és 50-98. aminosavait kódoló, HPV16 E7-proteinszekvenciáknak megfelelő DNSfragmentumokat 5’-végi EcoRV restrikciós hely létrehozását eredményező láncindítók alkalmazásával amplifikáltuk, amelyek megkönnyítették a fragmentumok inszertálását HPV16L1A310- vagy HPV16LlAC1-módosított szekvenciákba. A különböző amplifikációs reakciókban az E7.1 jelzésű láncindítót (9. azonosító számú szekvencia) az E7.2 jelzésű láncindítóval (10. azonosító számú szekvencia) kombinálva alkalmaztuk az E7-protein 1-50. aminosavait kódoló DNS-fragmentum amplifikálására; az E7.3 jelzésű láncindítóval (11. azonosító számú szekvencia) kombinálva az E7-protein
1-60. aminosavait kódoló DNS-fragmentum előállítására; vagy az E7.4 jelzésű láncindítóval (12. azonosító számú szekvencia) kombinálva az E7-protein 1-98. aminosavait kódoló DNS-fragmentum előállítására. További amplifikációs reakciókban az E7.5 (13. azonosító számú szekvencia) és E7.6 (14. azonosító számú szekvencia) láncindítópárt alkalmaztuk az E7-protein 25-75. aminosavait kódoló DNS-fragmentum amplifikálására; az E7.7 (15. azonosító számú szekvencia) és E7.4 (12. azonosító számú szekvencia) láncindítópárt alkalmaztuk az E7-protein 40-98. aminosavait kódoló DNS-fragmentum amplifikálására; és az E7.8 (16. azonosító számú szekvencia) és E7.4 (12. azonosító számú szekvencia) láncindítópárt alkalmaztuk az E7-protein 50-98, aminosavait kódoló DNS-fragmentum amplifikálására.
Az E7.4-láncindító a következő szekvenciájú volt: AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC (9. azonosító számú szekvencia).
Az E7.2-láncindító az alábbi szekvenciájú volt: TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC (10. azonosító számú szekvencia).
Az E7.3-láncindító a következő szekvenciával rendelkezett:
TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCC (11. azonosító számú szekvencia).
E7.4-láncindítóként a következő szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC (12. azonosító számú szekvencia).
E7.5-láncindítóként az alábbi szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG (13. azonosító számú szekvencia).
Az E7.6-láncindító az alábbi szekvenciájú volt: TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC (14. azonosító számú szekvencia).
E7.7-láncindítóként a következő szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC (15. azonosító számú szekvencia).
Az E7.8-láncindító az alábbi szekvenciájú volt: TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACC l l I l G (16. azonosító számú szekvencia). Hasonlóképp, az influenza-mátrixproteint kódoló
DNS (17. azonosító számú szekvencia) alapján nukleotidszekvenciát amplifikáltunk a 19. és 20. azonosító számú szekvencia szerinti láncindítópár alkalmazásával. Mindkét láncindító EcoRV restrikciós helyet hozott létre az amplifikációs termékben:
TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC (19. azonosító számú szekvencia);
TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG (20. azonosító számú szekvencia).
Mindegyik amplifikációs reakció PCR-termékét
EcoRV-enzimmel hasítottuk, és előzőleg ugyanezzel az enzimmel linearizált HPV16L1Á310- vagy HPV16LlAC-szekvenciákba inszertáltuk. Az E7-protein 25-75. és 50-98. aminosavait kódoló plazmidok7
HU 225 893 Β1 bán és az influenza-mátrixproteint kódoló plazmidban az inszertek orientációját úgy határoztuk meg, hogy Clal-emésztést végeztünk, kihasználva az újonnan létrehozott, az 5’ láncindítóban található EcoRV restrikciós helyet átfedő restrikciós helyet (GATATCGAT). A HPV16 E7-protein kezdő metioninját tartalmazó három expressziós konstrukció esetében az inszert orientációját az E7-kódolórégióban található Nsll restrikciós hely alkalmazásával határoztuk meg.
Miután megfelelő inszerteket hordozó expressziós konstrukciókat azonosítottunk, azokból az L1-proteinnek és az inszertált aminosavaknak megfelelő proteinkódoló régiót Xbal és Smal restrikciós enzimek alkalmazásával egy egységként kivágtuk, és az izolált DNS-t pVL1393-plazmidba (Invitrogen) ligáltuk, majd a kapott konstrukciókat rekombináns baculovírusok előállítására alkalmaztuk.
D) EcoRV restrikciós helyek megszüntetése az expressziős konstrukciókban A HPV16L1AC-szekvencia az EcoRV-hely jelenlétéből eredően vad típusú L1-polipeptidekben természetesen nem található aminosavak transzlációját eredményező DNS-t tartalmaz. Olyan expressziós konstrukciókból álló sorozatot terveztünk tehát, amelyekben a mesterségesen létrehozott EcoRV-helyet megszüntettük. Ezen expressziós konstrukciókban található L1-szekvenciát HPV16LlAC*-szekvenciának neveztük.
A HPV16L1AC*-szekvenciát tartalmazó expressziós konstrukciót úgy állítottunk elő, hogy két PCR reakciót végeztünk, amellyel két átfedő fragmentumot amplifikáltunk az E7-protein 1-50. aminosavait kódoló pUC-HPV16L1AC konstrukció alapján. A kapott DNS átfedő szekvenciákat tartalmazott az L1/E7 határmezsgyének megfelelő pozícióban, de nem tartalmazta a két EcoRV restrikciós helyet. Az 1. fragmentumot a P1(21. azonosító számú szekvencia) és P2-láncindító (22. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával, a 2. fragmentumot a P3- (23. azonosító számú szekvencia) és P4-láncindító (24. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával állítottuk elő.
A P1-láncindító a következő szekvenciájú volt:
GTTATGACATACATACATTCTATG (21. azonosító számú szekvencia);
P2-láncind (tóként a következő szekvenciájú láncindítót alkalmaztuk:
CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (22. azonosító számú szekvencia);
Az alábbi szekvenciájú P3-láncindítót terveztük:
CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (23. azonosító számú szekvencia);
P4-láncind (tóként az alábbi szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (24. azonosító számú szekvencia).
Az első amplifikációs reakciót követően a két tisztított termék szolgált templátként egy további PCR reakcióban, amelyben csak a P1- és P4-láncindítókat alkalmaztuk. A kapott amplifikációs terméket EcoNI- és Hindlll-enzimekkel emésztettük, és a fent ismertetett
HPV16L1AC expressziós konstrukcióba inszertáltuk, miután azt a fentivel megegyező enzimekkel emésztettük. A kapott expressziós konstrukció annyiban különbözött az eredeti HPV16LlAC-konstrukciótól, hogy L1-szekvenciát és az E7-protein 1-50. aminosavait kódoló DNS-t tartalmazott, azonban a két belső EcoRV restrikciós hely nélkül. Az első EcoRV-helyet a natív L1-proteinben a megfelelő pozícióban található alanin és glicin aminosavakat kódoló DNS-szekvenciával, a másodikat pedig transzlációs stopkodonnal helyettesítettük. Ezenfelül a HPV16L1AC*-E7 1-52 elnevezésű expressziós konstrukció a HPV16 E7-protein 1-52. aminosavait tartalmazta a P4-láncindító alkalmazásának eredményeképp, amely az E7-protein 51. pozíciójában található hisztidin és 52. pozíciójában található tirozin aminosavakat kódoló szekvenciát is tartalmazott. Ezután a HPV16L1AC*-E7 1-52 konstrukciót alkalmaztuk további HPV16L1AC expressziós konstrukciók előállítására, az alábbiak szerint eljárva: a P1- (21. azonosító számú szekvencia) és P5- (25. azonosító számú szekvencia) láncindítók kombinációjának alkalmazásával állítottuk elő az E7-protein 1-55. aminosavait kódoló DNS-fragmentumot magában foglaló konstrukciót; a P1- és P6- (26. azonosító számú szekvencia) láncindítópár kombinációjának alkalmazásával állítottuk elő az E7-protein 1-60. aminosavait kódoló DNSfragmentumot magában foglaló konstrukciót; és a P1és P7- (27. azonosító számú szekvencia) láncindítópár kombinációjának alkalmazásával állítottuk elő az E7-protein 1-65. aminosavait kódoló DNS-fragmentumot magában foglaló konstrukciót.
Az amplifikációs termékekben található, további aminosavakat kódoló DNS-szekvenciák onnan származtak, hogy a kívánt aminosavakat kódoló további nukleotidokat tartalmazó láncindítókat terveztünk.
A P5-láncindító az alábbi szekvenciájú volt:
CATCTGAAGCTTAACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (25. azonosító számú szekvencia);
P6-láncindítóként az alábbi szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk:
CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGC-TCTGTCCG (26. azonosító számú szekvencia).
Az alábbi szekvenciájú P7-láncindítót terveztük:
CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTG CAAC-AAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (27. azonosító számú szekvencia).
Hasonlóképp, a HPV16L1AC*-E7 1-70 konstrukciót a HPV16L1AC*-E7 1-66 konstrukciót kódoló templát-DNS és a P1-, valamint P8-láncindító (28. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával állítottuk elő:
P8-láncindító:
CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAAC-CGAAGCGTAGAGTCACACTTG (28. azonosító számú szekvencia).
Valamennyi PCR reakciót követően az amplifikációs terméket EcoNI- és Hindlll-enzimekkel emésztettük, és előzőleg ugyanezekkel az enzimekkel emész8
HU 225 893 Β1 tett HPV16L1AC-konstrukcióba inszertáltuk. Mindegyik konstrukció szekvenciáját „Applied Biosystems Prism 377 szekvenálókészülékkel határoztuk meg, fluoreszcensen jelölt, láncterminációt eredményező didezoxinukleotidok alkalmazásával [Prober és munkatársai: Science 238, 336 (1987)].
2. példa
Rekombináns baculovírusok előállítása
Spodoptera frugiperda (Sf9)-sejteket szaporítottunk szuszpenzióban vagy egyrétegű tenyészetben 27 °C-on, 10% borjúszérummal és 2 mmol/l glutaminnal kiegészített TNMHF-tápközegben (Sigma). HPV16 L1-alapú rekombináns baculovíruskonstrukciók előállításához Sf9-sejteket 10 μg transzferplazmiddal és 2 μg linearizált „Baculo-Gold DNS-sel (PharMingen, San Diego, CA) transzfektáltunk. Rekombináns vírusokat a gyártó ajánlásai szerint eljárva tisztítottunk.
A HPV16 L1-protein expressziójának vizsgálatához 105 Sf9-sejtet fertőztünk baculovírusrekombinánsokkal 5-10 fertőzési többszörös („multiplicity of infection”; m.o.i.) mellett. Miután a sejteket négy napig 28 °C-on inkubáltuk, a tápközeget eltávol itattuk, és a sejteket PBS-sel mostuk. A sejteket SDS-mintapufferben (ízáltattuk, majd SDS-PAGE-eljárással és Westem-blottal analizáltuk anti-HPV16 L1- és anti-HPV16 E7-ellenanyagok alkalmazásával.
Annak meghatározására, hogy mely kiméra L1-protein expressziós konstrukciók képesek előnyösen kapszomereket képezni, transzfektált sejtek extraktumait gradíenscentrifugálásnak vetettük alá. A gradiensekről nyert frakciókat L1-protein-tartalomra analizáltuk Western-blot-eljárással, és VLP-képződésre elektronmikroszkóppal. Eredményeinket az 1. táblázatban összegeztük.
Az intakt HPV16 L1-protein, valamint a HPV16L1A310 és HPV16L1ÁC expressziós termékek azonos arányban bizonyultak képesnek kapszomerek és vírusszerű részecskék képzésére. Amikor E7-kódolószekvenciákat inszertáltunk a HPV16L1A310-vektorba, csak az E7 1-50. aminosavait tartalmazó fúziós protein eredményezte kapszomerek képződését kimutatható mennyiségben.
Amennyiben a HPV16L1AC-vektorba inszertáltunk E7-kódoló DNS-szekvenciákat, valamennyi fúziós protein képesnek bizonyult kapszomerek képzésére; az E7-protein 40-98. aminosavait tartalmazó kiméra proteinek eredményezték a legmagasabb szinten kizárólag kapszomer struktúrák képződését. Az E7-protein 1-98. aminosavait és 25-75. aminosavait tartalmazó kiméra proteinek elsősorban kapszomereket képeztek, bár vírusszerű részecskék képződése megfigyelhető volt. Az E7-protein 1-60. aminosavait tartalmazó kiméra protein közel azonos mennyiségben vezetett kapszomerek és vírusszerű részecskék képződéséhez.
Amennyiben E7-szekvenciákat a HPV16L1AC*vektorba inszertáltunk, valamennyi fúziós protein képesnek bizonyult kapszomerek képzésére. Az E7-protein 1-52., 1-55. és 1-60. aminosavait kódoló DNS inszertálása vezetett a legmagasabb szintű kapszomerképzéshez, de azonos szinten vírusszerű részecskék termelődése is megfigyelhető volt. Míg az E7-protein 1-65., 1-70., 25-75. és 1-98. aminosavait kódoló DNS inszertálása ennél alacsonyabb szintű vagy a kimutathatóság szintjét el nem érő kapszidképződést eredményezett, kapszomerek nagy mennyiségben termelődtek.
1. táblázat
Kiméra HPV16 L1-proteinek kapszomer- és kapszidképző képessége
L1 expressziós konstrukció Inszert Kapszo- merkép- ződés Kapszid- képződés
HPV1611 nem +++++ +++++
HPV16 L1A310 nem +++ ++
HPV16 L1AC nem ++++ ++++
HPV16L1A310 E7 1-95 - -
HPV16 L1A310 E7 1-50 ++ -
HPV16L1A310 E7 25-75 - -
HPV16 L1A310 E7 50-98 - -
HPV16 L1AC E7 1-98 +++ +
HPV16L1AC E7 25-75 +++ +
HPV16 L1AC E7 50-98 + +
HPV16L1AC E7 1-60 +++++ +++++
HPV16 L1AC E7 40-98 ++++ -
HPV16L1ÁC influenza +++ +
HPV16L1A*C E7 1-52 +++++ +++++
HPV16L1A*C E7 1-55 ++++ +++++
HPV16 L1A*C E7 1-60 +++ ++++
HPV16 L1A*C E7 1-65 ++ -
HPV16L1A*C E7 1-70 ++ -
3. példa
Kapszomerek tisztítása
Trichoplusia ni (Ti) „High Five sejteket tenyésztettünk mintegy 2*106 sejt/ml denzitásig „Ex-Cell 405” szérummentes tápközegben (JRH Biosciences). Körülbelül 2*108 sejtet ülepítettünk 1000xg-vel, 15 percig végzett centrifugálással, majd a sejteket 20 ml tápközegben szuszpendáltuk, és rekombináns baculovírusokkal fertőztük 1 órán át, szobahőmérsékleten,
2- 5 m.o.i. alkalmazásával. Miután a szuszpenzióhoz 200 ml tápközeget adtunk, a sejteket kioltottuk, és
3- 4 napig 27 °C-on inkubáltuk. Az inkubációt követően a sejteket összegyűjtöttük, ülepítettük, és 10 ml extrakciós pufferben szuszpendáltuk.
Az ezután következő lépéseket 4 °C-on végeztük. A sejteket 45 másodpercig, 60 watt mellett ultrahanggal kezeltük, és a kapott sejtlizátumot 10 000 fordulat/perccel, Sorval SS34-rotorban centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottak és félretettük, míg az üledéket 6 ml extrakciós pufferben szuszpendáltuk, további 3 másodpercig 60 watt mellett ultrahangoztuk, és ismét
HU 225 893 Β1 centrifugáltuk. A két felülúszót elegyítettük, majd kétfázisú gradiensre rétegeztük, amely 14 ml 40% szacharózt tartalmazott 8 ml CsCI-oldatra rétegezve (8 ml térfogatra számítva 4,6 g CsCI, extrakciós pufferben szuszpendálva). A gradienst „Sorval AH629” lengőkosaras rotorban centrifugáltuk 2 órán át, 27 000 fordulat/perccel, 10 °C-on. A CsCI és szacharóz közti határréteget, valamint a teljes CsCI-réteget 13,4 ml „Quickseal” csövekbe (Beckman) gyűjtöttük, és a térfogatot extrakciós pufferrel 13,4 ml-re egészítettük ki. A mintákat egy éjszakán át, 50 000 fordulat/perccel centrifugáltuk 20 °C-on, „Beckman 70 ΤΓ rotorban. A gradienseket oly módon frakcionáltuk (1 ml térfogatú frakciókra), hogy a csövek tetejét és alját 21 gauge méretű tűvel kilyukasztottuk. Mindegyik csőből frakciókat gyűjtöttünk, azokból 2,5 μΙ térfogatú mintát vettünk, majd a mintákat anti-HPV16 L1-ellenanyag alkalmazásával, 10%-os SDS-poliakrilamid-gélen végzett gélelektroforézissel és Western-blot-eljárással analizáltuk.
A fenti módon azonosított frakciókból a vírusszerű részecskéket és kapszomereket 10-50% szacharózgradiensen történő szedimentációval választottuk szét. A CsCI-gradienseken csúcsot adó frakciókat elegyítettük, és 2 óráig, 5 mmol/l HEPES-pufferrel (pH=7,5) szemben dializáltuk. A dializátum felét alkalmaztuk kapszomerek előállítására oly módon, hogy intakt VLPket egy éjszakán át, a következő összetételű elegy hozzáadásával szétbontottunk: EDTA (50 mmol/l végkoncentrációban); EGTA (50 mmol/l végkoncentrációban); DTT (30 mmol/l); NaCI (100 mmol/l); és Tris/HCI (10 mmol/l) (pH=8,0). Kontrollként az elegy másik feléhez csak NaCI- és Tris/HCI-tartalmú oldatot adtunk.
A szétbontott VLP-kből képződő kapszomerek analíziséhez a szacharózpámákhoz EDTA-t, EGTA-t és DTT-t adtunk (mindegyiket 5 mmol/l végkoncentrációban), és azokat 250 000*g-vel, 2-4 órán át, 4 °C-on centrifugáltuk. Frakciókat gyűjtöttünk a csövek aljának kilyukasztásával. Ezután valamennyi frakció 1:10 arányú hígítását antigén-capfure ELISA eljárással analizáltuk.
4. példa
Immunizációs eljárás poliklonális antiszérum és monoklonális ellenanyagok előállítására Balb/c-egereket immunizáltunk szubkután, három alkalommal, négyhetente, körülbelül 60 pg, 1:1 arányban Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuvánssal elegyített HPV kiméra kapszomerrel, összesen 100 μί térfogatban. Hat héttel a harmadik immunizálást követően az egereket leöltük, és azoktól szívpunkcióval vért vettünk.
5. példa
Peptid-ELISA-eljárás a kapszomerképződés kvantitatív meghatározására Mikrotitrálólemezeket (Dynatech) vontunk be egy éjszakán át 50 μΙ, 10 pg/ml koncentrációjú E701-peptiddel [Mullerés munkatársai: (1982)] PBS-ben. A lyukakat 2 órán át, 37 °C-on, 100 μΙ térfogatú, 5% BSA-t és 0,05% Tween-20-detergenst tartalmazó PBS-pufferrel blokkoltuk, majd 0,05% Tween-20-detergenst tartalmazó PBS-pufferrel háromszor mostuk. A harmadik mosást követően mindegyik lyukhoz 50 μΙ térfogatú szérumot adtunk, amelyet előzőleg BSA/Tween-20/PBS pufferben 1:5000 arányban hígítottunk, és az inkubálást további 1 órán át folytattuk. A lemezeket a fentiek szerint ismét mostuk, és a lyukakhoz 50 μΙ, kecskében termelt, peroxidázzal jelölt antiegér konjugátumot adtunk 1:5000 hígításban. Egy óra múlva a lemezeket mostuk, és ABTS-szubsztráttal [0,2 mg/ml; 2,2’-azino-bisz(3-etilbenzhialozin-p-szulfonsav) 0,1 mol/l Na-acetát-foszfátpufferben (pH=4,2), 10 milliliterenként 4 μΙ 30% H2O2dal kiegészítve] a színreakciót előhívtuk. Egy óra elteltével, 490 nm hullámhosszon, automatizált Dynatech lemezolvasóban mértük a fényelnyelést.
6. példa
Antigén-capture ELISA eljárás a kapszomerképződés kvantitatív meghatározására Ahhoz, hogy a CsCI-gradiensről nyert frakciókban a vírusszerű részecskék és kapszomerek egymáshoz viszonyított arányát meg tudjuk állapítani, antigén-capfure ELISA eljárást fejlesztettünk ki. Mikrotitrálólemezeket vontunk be egy éjszakán át 50 μΙ térfogatú, 1:500 arányban hígított, protein-A-oszlopon tisztított, egéreredetű, HPV16 L1-re immunspecifikus monoklonális ellenanyaggal (25/C-, MM07- és Ritti-1-ellenanyagokat HPV16 VLP-kkel immunizált egerekből nyertünk). A lemezeket 1 órán át 5% tejport tartalmazó PBS-pufferrel blokkoltuk, és a lyukakhoz a CsCI-gradiens frakcióinak 50 μΙ térfogatú mintáit adtuk 1:300 hígításban (5% tejport tartalmazó PBS-pufferben). Miután a lemezeket 0,05% Tween-20-detergenst tartalmazó PBS-pufferrel háromszor mostuk, azokhoz 50 μΙ, HPV16 VLP-k ellen termelt nyúleredetű poliklonális antiszérumot adtunk (1:3000 hígításban; tejport tartalmazó PBS-ben), és a lemezeket 1 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. A lemezeket ismét mostuk, és 1 órán át, 50 μΙ térfogatú, kecskében termelt, peroxidázzal jelölt antinyúl konjugátummal (Sigma) inkubáltuk, amelyet 1:5000 arányban hígítottunk 5% tejport tartalmazó PBS-pufferben. Egy végső mosást követően a színreakciót ABTS-szubsztrát hozzáadásával 30 perc alatt előhívtuk, és 490 nm hullámhosszon, automatizált Dynatech lemezolvasóban mértük a fényelnyelést. Negatív kontrollként csak PBS-sel bevont lyukakat alkalmaztunk.
Ahhoz, hogy a monoklonális ellenanyagok kapszomer iránti spedfitását vizsgálhassuk, VLP-ket EDTA/DTT eleggyel kezeltünk, ezáltal a részecskéket szétbontottuk. A kezelt részecskekészítményeket az antigén-capfure ELISA eljárással teszteltük, és az eredményeket kezeletlen kontrollokéval hasonlítottuk össze. A részecskéket az alább ismertetettek szerint bontottuk szét: 40 μΙ VLP-t inkubáltunk egy éjszakán át, 4 °C-on, 500 μΙ térfogatú, alábbi összetételű részecskebomlasztó pufferben: 30 mmol/l DTT; 50 mmol/l EGTA; 60 mmol/l EDTA; 100 mmol/l NaCI; és 100 mmol/l Tris/HCI (pH=8,0). Kezelt és kezeletlen részecskemintákat alkalmaztunk a fenti capture ELISA eljárásban, 1:20-1:40 hígításban.
HU 225 893 Β1
7. példa
Hemagglutinációgátlási vizsgálati eljárás
Azt, hogy a kiméra kapszomer vakcinák milyen mértékben váltják ki neutralizáló ellenanyagok termelődését, hemagglutinációgátlási vizsgálattal határoztuk meg, az alábbiakban röviden ismertetettek szerint eljárva. Ez a vizsgálati eljárás azon a korábbi megfigyelésen alapult, hogy vírusszerű részecskék képesek vörösvérsejtek hemagglutinálására.
Egereket immunizáltunk a kiméra kapszomer vakcinák valamelyikével, és szérumokat gyűjtöttünk a 4. példában ismertetettek szerint. Pozitív kontrollokként HPV16 L1-eredetű vírusszerű részecskéket (VLP-ket) és szarvasmarha PVI(BPV-) L1-eredetű VLP-ket vizsgáltunk a kiméra kapszomer készítményekkel párhuzamosan. Pozitív alapvonalat úgy állapítottunk meg, hogy a HPV16 vagy BPV1 VLP-ket először immunizált egerekből származó szérummal vagy anélkül inkubáltuk, majd azokhoz vörösvérsejteket adtunk. Az egérszérummal történő előinkubálás vörösvérsejtek hemagglutinációját gátló képessége az egérszérumok neutralizálóképességének mutatója. Ezután a kísérleteket kiméra kapszomerek alkalmazásával megismételtük, hogy az egérszérumok neutralizálóképességét meghatározhassuk a vakcinák vonatkozásában. Az alábbiakban röviden ismertetjük a hemagglutinációgátlási vizsgálat menetét.
Száz mikroliter heparint (1000 usp egység/ml) adtunk 1 ml friss egérvérhez. A vörösvérsejteket PBS-sel háromszor mostuk, majd centrifugáltuk, és 10 ml térfogatban szuszpendáltuk. Ezután a vörösvérsejteket 0,5 ml PBS-ben szuszpendáltuk, és 4 °C-on tároltuk legfeljebb három napig. A hemagglutinációs vizsgálathoz lyukanként 70 μΙ szuszpenziót mértünk 96 lyukú lemez mélyületeibe.
A CsCI-gradiensről nyert kiméra kapszomer mintákat egy órán át 10 mmol/l HEPES- (pH=7,5) pufferrel szemben dializáltuk, és 100 μΙ térfogatú, kettes alapú tovafutó hígításokat adtunk gömbölyű aljú 96 lyukú mikrotitrálólemezeken egérvörösvérsejtekhez. A lemezeket 3-16 órán át, 4 °C-on tovább inkubáltuk. Hemagglutináciőgátlási vizsgálatokhoz a kapszomereket az ellenanyagok hígításaival inkubáltuk PBS-ben, 60 percig, szobahőmérsékleten, majd hozzáadtuk a vörösvérsejtekhez. A vörösvérsejt-hemagglutináció szintjét - ezáltal a neutralizáló ellenanyagok jelenlétét - ismert eljárásokkal határoztuk meg.
Előzetes vizsgálatok eredményei szerint a HPV16LlAC-proteint E7-protein 1-98. aminosavaival kapcsoltan tartalmazó kiméra kapszomerek ellen termelt egérszérumok gátolják a HPV16 VLP-k okozta hemagglutinációt, de nem gátolják a BPV VLP-k alkalmazásával kiváltott hemagglutinációt. Az egérszérumok pozitívnak bizonyultak tehát a humán VLP-k elleni neutralizáló ellenanyagok jelenlétére, és a megkülönböztetett neutralizáció legvalószínűbb oka az ellenanyagok specifitása a termelődésüket kiváltó epitópokkal szemben.
Szakember számára a példákban ismertetetteken felül a találmány szerinti megoldás számos módosítása és variációja nyilvánvaló. Következésképp ezek a módosítások és variációk is az igényelt oltalmi körön belül maradnak, az oltalmi kör terjedelmét kizárólag a szabadalmi igénypontok határozzák meg.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1518 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATiPUS: genomi DNS
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: cds
ELHELYEZKEDÉS: 1...1518
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GTC Val TAC Tyr TTG Leu CCT Pro CCT Pro 15 GTC Val
ATG Met 1 TCT Ser CTT Leu TGG Trp CTG Leu 5 CCT Pro AGT Ser GAG Glu GCC Alá ACT Thr 10
CCA GTA TCT AAG GTT GTA AGC ACG GAT GAA TAT GTT GCA CGC ACA AAC
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Alá Arg Thr Asn
20 25 30
ATA TAT TAT CAT GCA GGA ACA TCC AGA CTA CTT GCA GTT GGA CAT CCC
Ile Tyr Tyr His Alá Gly Thr Ser Arg Leu Leu Alá Val Gly His Pro
35 40 45
TAT TTT CCT ATT AAA AAA CCT AAC AAT AAC AAA ATA TTA GTT CCT AAA
Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys
50 55 60
HU 225 893 Β1
GTA Val 65 TCA Ser GGA Gly TTA Leu CAA Gin TAC Tyr 70 AGG GTA Arg Val TTT AGA ATA CAT TTA Leu CCT Pro GAC Asp CCC Pro 80
Phe Arg Ile 75 His
AAT AAG TTT GGT TTT CCT GAC ACC TCA TTT TAT AAT CCA GAT ACA CAG
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin
85 90 95
CGG CTG GTT TGG GCC TGT GTA GGT GTT GAG GTA GGT GGT GGT CAG CCA
Arg Leu Val Trp Alá Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gin Pro
100 105 110
TTA GGT CTG GCC ATT AGT GGC CAT CCT TTA TTA AAT AAA TTG GAT GAC
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp
115 120 125
ACA GAA AAT GCT AGT GCT TAT GCA GCA AAT GCA GGT GTG GAT AAT AGA
Thr Glu Asn Alá Ser Alá Tyr Alá Alá Asn Alá Gly Val Asp Asn Arg
130 135 140
GAA TGT ATA TCT ATG GAT TAC AAA CAA ACA CAA TTG TGT TTA ATT GGT
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys Leu Ile Gly
145 150 155 160
TGC AAA CCA CCT ATA GGG GAA CAC TGG GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC
Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr
165 170 175
AAT GTT GCA GTA AAT CCA GGT GAT TGT CCA CCA TTA GAG TTA ATA AAC
Asn Val Alá Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn
180 185 190
ACA GTT ATT CAG GAT GGT GAT ATG GTT GAT ACT GGC TTT GGT GCT ATG
Thr Val Ile Gin Asp Gly Asp Met Val Asp Thr dy Phe Gly Alá Met
195 200 205
GAC TTT ACT ACA TTA CAG GCT AAC AAA AGT GAA GTT CCA CTG GAT ATT
Asp Phe Thr Thr Leu Gin Alá Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile
210 215 220
TGT ACA TCT ATT TGC AAA TAT CCA GAT TAT ATT AAA ATG GTG TCA GAA
Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
CCA TAT GGC GAC AGC TTA TTT TTT TAT TTA CGA AGG GAA CAA ATG TTT
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe
245 250 255
GTT AGA CAT TTA TTT AAT AGG GCT GGT GCT GTT GGT GAA AAT GTA CCA
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Alá Gly Alá Val Gly Glu Asn Val Pro
260 265 270
GAC GAT TTA TAC ATT AAA GGC TCT GGG TCT ACT GCA AAT TTA GCC AGT
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Alá Asn Leu Alá Ser
275 280 285
TCA AAT TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GAT GCC
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Alá
290 295 300
HU 225 893 Β1
CAA Gin 305 ATA Ile TTC Phe AAT AAA CCT TAT Tyr TGG Trp TTA Leu CAA Gin CGA Arg 315 GCA CAG GGC Gly CAC His AAT Asn 320
Asn Lys Pro 310 Alá Gin
AAT GGC ATT TGT TGG GGT AAC CAA CTA TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gin Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr
325 330 335
ACA CGC AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GCT GCC ATA TCT ACT TCA GAA
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Alá Alá Ile Ser Thr Ser Glu
340 345 350
ACT ACA TAT AAA AAT ACT AAC TTT AAG GAG TAC CTA CGA CAT GGG GAG
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CAA CTG TGC AAA ATA ACC TTA ACT
Glu Tyr Asp Leu Gin Phe Ile Phe Gin Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
GCA GAC GTT ATG ACA TAC ATA CAT TCT ATG AAT TCC ACT ATT TTG GAG
Alá Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
GAC TGG AAT TTT GGT CTA CAA CCT CCC CCA GGA GGC ACA CTA GAA GAT
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
ACT TAT AGG TTT GTA ACC TCC CAG GCA ATT GCT TGT CAA AAA CAT ACA
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gin Alá He Alá Cys Gin Lys His Thr
420 425 430
CCT CCA GCA CCT AAA GAA GAT CCC CTT AAA AAA TAC ACT TTT TGG GAA
Pro Pro Alá Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
GTA AAT TTA AAG GAA AAG TTT TCT GCA GAC CTA GAT CAG TTT CCT TTA
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Alá Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu
450 455 460
GGA CGC AAA TTT TTA CTA CAA GCA GGA TTG AAG GCC AAA CCA AAA TTT
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Alá Gly Leu Lys Alá Lys Pro Lys Phe
465 470 475 480
ACA TTA GGA AAA CGA AAA GCT ACA CCC ACC ACC TCA TCT ACC TCT ACA
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Alá Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr
485 490 495
ACT GCT AAA CGC AAA AAA CGT AAG CTG TAA
Thr Alá Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu ★
500 505
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 506 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein
HU 225 893 Β1
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Alá Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 15 10 15
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Alá Asn Thr Asn 20 25 30
Ile Tyr Tyr His Alá Gly Thr Ser Arg Leu Leu Alá Val Gly His Pro 35 40 45
Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60
Val Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin 85 90 95
Arg Leu Val Trp Alá Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gin Pro 100 105 110
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125
Thr Glu Asn Alá Ser Alá Tyr Alá Alá Asn Alá Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys Leu Ile Gly
145 150 155 160
Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr
165 170 175
Asn Val Alá Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190
Thr Val Ile Gin Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Alá Met 195 200 205
Asp Phe Thr Thr Leu Gin Alá Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220
Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe
245 250 255
Val Arg Mis Leu Phe Asn Arg Alá Gly Alá Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Alá Asn Leu Alá Ser 275 280 285
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Alá 290 295 300
Gin Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg Alá Gin Gly His Asn 305 310 315 320
HU 225 893 Β1
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn 325 Gin Leu Phe 330 Val Thr Val Val Asp 335 Thr
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Alá Alá Ile Ser Thr Ser Glu
340 345 350
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
Glu Tyr Asp Leu Gin Phe Ile Phe Gin Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
Alá Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gin Alá Ile Alá Cys Gin Lys His Thr
420 425 430
Pro Pro Alá Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Alá Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu
450 455 460
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Alá Gly Leu Lys Alá Lys Pro Lys Phe
465 470 475 480
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Alá Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr
485 490 495
Thr Alá Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu ★
500 505
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 297 bázispár TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATlPUS: DNS SAJÁTSÁG: NÉV/MEGJELÖLÉS: eds ELHELYEZKEDÉS: 1...297
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATG CAT GGA GAT ACA CCT ACA TTG CAT GAA TAT ATG TTA GAT TTG CAA
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gin
1 5 10 15
CCA GAG ACA ACT GAT CTC TAC TGT TAT GAG CAA TTA AAT GAC AGC TCA
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gin Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Alá Gly Gin Alá Glu Pro Asp
35 40 45
HU 225 893 Β1
AGA GCC CAT TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAG TGT GAC TCT ACG
Arg Alá 50 His Tyr Asn Ile Val 55 Thr Phe Cys Cys Lys 60 Cys Asp Ser Thr
CTT CGG TTG TGC GTA GAA AGC AGA CAC GTA GAC ATT CGT ACT TTG GAA
Leu 65 Arg Leu Cys Val Gin 70 Ser Thr His Val Asp 75 Ile Arg Thr Leu Glu 80
GAC CTG TTA ATG GGC ACA CTA GGA ATT GTG TGC CCC ATC TGT TCT CAG
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gin
90 95
AAA CCA TAA
Lys Pro *
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 98 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gin 15 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gin Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Alá Gly Gin Alá Glu Pro Asp 35 40 45
Arg Alá His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gin Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gin
90 95
Lys Pro *
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
HU 225 893 Β1
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG 35
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 40 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC 40
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 44 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG 44
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAAGATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC ATTGC 35
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC 34
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 44 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC CTTGCAACAA AAGGTTACAA TATTGTAATG GGCC 44
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
HU 225 893 Β1
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAAGATATC TGGTTTCTGA GAACAGATGG GGCAC
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 38 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GATTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCAG
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATlPUS: DNS
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGACAAGCA GAACCGGAC
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 294 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: cds
ELHELYEZKEDÉS: 1...294
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CTT ACC AGA AAC GGA TGG GAG Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu
10 15
HU 225 893 Β1
TGC AAA TGC AGC GAT TCA AGT GAT CCT CTC ATT ATC GCA GCG AGT ATC
Cys Lys Cys Ser 20 Asp Ser ser Asp Pro 25 Leu Ile Ile Alá Alá 30 Ser Ile
ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT TTT TAT CGT CTT TTC TTC
Ile Gly Ile 35 Leu His Leu Ile Leu 40 Trp Ile Phe Tyr Arg 45 Leu Phe Phe
AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTG AAA AGA GGG CCT TCT
Lys Cys 50 Ile Tyr Arg Arg Leu 55 Lys Tyr Gly Leu Lys 60 Arg Gly Pro Ser
ACG GAA GGA GCG CCT GAG TCT ATG AGG GAA GAA TAT CGG CAG GAA CAG
Thr 65 Glu Gly Alá Pro Glu 70 Ser Met Arg Glu Glu 75 Tyr Arg Gin Glu Gin 80
CAG AGT GCT GTG GAT GTT GAC GAT GTT CAT TTT GTC AAC ATA GAG CTG
Gin Ser Alá Val Asp Val Asp Asp Val His Phe Val Asn Ile Glu Leu
90 95
GAG TAA Glu *
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 97 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATiPUS: protein
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu
Met 1 Ser Leu Leu Thr Glu 5 Val Glu Thr
10 15
Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Ile Ile Alá Alá Ser Ile
20 25 30
Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Phe Tyr Arg Leu Phe Phe
35 40 45
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Glu Gly Alá Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gin Glu Gin
65 70 75 80
Gin Ser Alá Val Asp Val Asp Asp Val His Phe Val Asn Ile Glu Leu
85 90 95
Glu *
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 40 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATiPUS: DNS
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AAGACCAATC
HU 225 893 Β1
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG 35
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTTATGACAT ACATACATTC TATG 24
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC 35
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 29 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTACAAGCAG GAATGCATGG AGATACACC 29
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG 36
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 38 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAAGC TTATCAATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG 38
HU 225 893 Β1
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 54 bázispár
TlPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAAGC TTACTTGCCA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG 54
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 69 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATlPUS: DNS
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAAGC TTAAAGCGTA GAGTCACACT TGCAACAAAA GGTTACAATA TTGTAATGGG
CTCTGTCCG 69
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 47 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG 47

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Vakcinakészítmény, amely humán papillomavíruskapszomert tartalmaz, amely kapszomer humán papillomavírus L1-proteint és - ahhoz csatlakoztatva - egy második proteinből származó aminosavakat magában foglaló fúziós proteint tartalmaz, amely L1-protein és amely második proteinből származó aminosavak vírusszerű részecskék képződését gátló módon vannak pozícionálva.
  2. 2. Vakcinakészítmény, amely humán papillomavírus-kapszomert tartalmaz, amely kapszomer csonkított humán papillomavírus L1-proteint tartalmaz, amelyben a vírusszerű részecskék képződéséhez szükséges egy vagy több aminosav deletált.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a kapszomer csonkított humán papillomavírus L1-proteint és - ahhoz csatlakoztatva - egy második proteinből származó aminosavakat magában foglaló fúziós proteint tartalmaz.
  4. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-protein a HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 vagy a HPV45 típusú humán papillomavírus genomja által kódolt.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a kapszomer HPV16 típusú papillomavírus által kódolt.
  6. 6. A 2., 3. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből karboxiterminális aminosavak vannak deletálva.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből 1-34 darab karboxiterminális aminosav van deletálva.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből 34 darab karboxiterminális aminosav van deletálva.
  9. 9. A 2., 3. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből aminoterminális aminosavak vannak deletálva.
  10. 10. A 2., 3. vagy 5. igénypont bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből belső aminosavak vannak deletálva.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-proteinből deletált aminosavak nukleáris lokalizációs szignált foglalnak magukban.
  12. 12. A 2. vagy 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a második protein aminosavai HPVproteinből származnak.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a HPV-protein egy korai HPV-protein.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a korai HPV-protein az E1-, E2-, E3-, E4-, E5-, E6- vagy E7-protein.
    HU 225 893 Β1
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti készítmény alkalmazása HPV-fertőzés és azzal összefüggő rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  16. 16. A 2-14. igénypontok bármelyike szerinti készít- 5 mény alkalmazása HPV-fertőzés és azzal összefüggő rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti készítmény alkalmazása HPV-fertőzés és azzal összefüggő rendellenessé- 10 gek megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  18. 18. A 2-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása HPV-fertőzés és azzal összefüggő rendellenességek megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  19. 19. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az L1-protein a HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 vagy a HPV45 típusú humán papillomavírus genomja által kódolt.
HU0004360A 1997-10-06 1998-10-06 Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use HU225893B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/944,368 US6228368B1 (en) 1997-10-06 1997-10-06 Papilloma virus capsomere formulations and method of use
PCT/US1998/020965 WO1999018220A1 (en) 1997-10-06 1998-10-06 Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0004360A2 HUP0004360A2 (en) 2001-03-28
HUP0004360A3 HUP0004360A3 (en) 2003-03-28
HU225893B1 true HU225893B1 (en) 2007-12-28

Family

ID=25481268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0004360A HU225893B1 (en) 1997-10-06 1998-10-06 Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use

Country Status (21)

Country Link
US (4) US6228368B1 (hu)
EP (2) EP1690941B1 (hu)
JP (3) JP4520034B2 (hu)
KR (1) KR20010030969A (hu)
AT (2) ATE349536T1 (hu)
AU (1) AU9684698A (hu)
BR (1) BR9814606A (hu)
CA (1) CA2305382A1 (hu)
CY (1) CY1105963T1 (hu)
CZ (1) CZ302351B6 (hu)
DE (2) DE69841342D1 (hu)
DK (1) DK1021547T3 (hu)
ES (2) ES2337492T3 (hu)
HU (1) HU225893B1 (hu)
IL (3) IL135528A0 (hu)
NO (2) NO328128B1 (hu)
NZ (1) NZ503830A (hu)
PL (1) PL195332B1 (hu)
PT (1) PT1021547E (hu)
TR (1) TR200001842T2 (hu)
WO (1) WO1999018220A1 (hu)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2264563T3 (es) * 1994-10-07 2007-01-01 Loyola University Of Chicago Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion.
WO1998054325A1 (en) * 1997-05-29 1998-12-03 The Government Of The United States Of America,Re Presented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human frp and fragments thereof including methods for using them
US6228368B1 (en) * 1997-10-06 2001-05-08 Loyola University Of Chicago Papilloma virus capsomere formulations and method of use
US7494658B2 (en) * 1998-02-20 2009-02-24 Medigene Ag Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US7182947B2 (en) * 1998-02-20 2007-02-27 Medigene Ag Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
CA2229955C (en) * 1998-02-20 2003-12-09 Medigene Gmbh Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
US20020039584A1 (en) * 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
GB9806666D0 (en) * 1998-03-27 1998-05-27 Stanley Margaret Antigen preparation and use
AUPP765398A0 (en) 1998-12-11 1999-01-14 University Of Queensland, The Treatment of papillomavirus infections
DE19905883C2 (de) * 1999-02-11 2001-05-23 Deutsches Krebsforsch Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV
FI107932B (fi) * 1999-02-16 2001-10-31 Mikael Paronen Polymeerikalvo ja menetelmä sen valmistamiseksi
US6551597B1 (en) * 1999-03-18 2003-04-22 President & Fellows Of Harvard College Vaccine compositions for human papillomavirus
DE19925234A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-14 Medigene Ag Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925199A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925235A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
ATE284898T1 (de) * 1999-08-25 2005-01-15 Merck & Co Inc Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind
DE60041889D1 (de) * 1999-12-09 2009-05-07 Medimmune Inc In-vitro-methode zur zerlegung und zum wiederzusammenfügen von papillomavirusartigen partikeln
US6600018B1 (en) * 2000-04-10 2003-07-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Secreted frizzled related protein, sFRP, fragments and methods of use thereof
US6908613B2 (en) * 2000-06-21 2005-06-21 Medimmune, Inc. Chimeric human papillomavirus (HPV) L1 molecules and uses therefor
DE10055545A1 (de) * 2000-11-09 2002-07-25 Deutsches Krebsforsch Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen
DE10059630A1 (de) * 2000-12-01 2002-06-06 Medigene Ag Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor
AU2002367977B2 (en) 2001-08-13 2008-06-19 University Of Rochester Transcutaneous immunization against papillomavirus with papillomavirus virus-like particles
CN100424094C (zh) * 2001-08-31 2008-10-08 开普敦大学 药物组合物,制备和分离其的方法,及其在制备预防性治疗损害和癌的药物中的应用
US20040063188A1 (en) * 2002-02-14 2004-04-01 Novavax, Inc. Kit for treating gastrointestinal tract
PT1506222E (pt) † 2002-05-17 2009-06-12 Univ Cape Town Proteínas l1 quiméricas do papilomavírus humano 16 incluindo um péptido l2, partículas semelhantes a vírus preparadas a partir daquelas e um método de preparação das partículas
US8101189B2 (en) 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
ES2431963T3 (es) 2002-07-05 2013-11-28 Folia Biotech Inc. Partícula viral adyuvante
SE0202897D0 (sv) * 2002-10-01 2002-10-01 Quantovir Ab Method and kit for quantitative and qualitative determination of human papillomavirus
SE0202896D0 (sv) * 2002-10-01 2002-10-01 Quantovir Ab Method for estimating the risk of carcinoma development
WO2004062584A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Regents Of The University Of Colorado Therapeutic and prophylactic vaccine for the treatment and prevention of papillomavirus infection
US7172773B2 (en) * 2004-04-26 2007-02-06 Renew Life Inc. Food supplement formulation
KR101187625B1 (ko) * 2004-09-10 2012-10-05 도쿠리츠다이가쿠호징 가나자와다이가쿠 경구 투여 백신
US7354719B2 (en) 2004-12-08 2008-04-08 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
US7314630B2 (en) * 2005-01-07 2008-01-01 Yao-Xiong Hu Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified
CN101570571B (zh) 2007-04-29 2012-07-11 北京万泰生物药业股份有限公司 截短的人乳头瘤病毒18型l1蛋白
BRPI0811016B1 (pt) * 2007-04-29 2021-09-21 Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 16
DK2154149T3 (da) * 2007-05-29 2019-10-14 Univ Xiamen En trunkeret l1-protein af human papillomavirus 6
US8507811B2 (en) * 2009-02-02 2013-08-13 Apple Inc. Touch sensor panels with reduced static capacitance
EP2377879A1 (en) * 2010-04-14 2011-10-19 Deutsches Krebsforschungszentrum N-terminal HPV E7 fusion proteins
US10413603B2 (en) * 2014-06-19 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for improved human papilloma virus constructs
WO2016026919A1 (en) * 2014-08-20 2016-02-25 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Vaccines and manufacturing methods for treatment and prevention of disease
CN114127099B (zh) * 2019-07-19 2024-04-19 神州细胞工程有限公司 嵌合的人乳头瘤病毒6型l1蛋白
US11382700B2 (en) 2020-05-08 2022-07-12 Globus Medical Inc. Extended reality headset tool tracking and control
US11510750B2 (en) 2020-05-08 2022-11-29 Globus Medical, Inc. Leveraging two-dimensional digital imaging and communication in medicine imagery in three-dimensional extended reality applications

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE332973T1 (de) 1991-07-19 2006-08-15 Univ Queensland Polynukleotidabschnitt des hpv16-genoms
GB9207701D0 (en) 1992-04-08 1992-05-27 Cancer Res Campaign Tech Papillomavirus e7 protein
PT647140E (pt) 1992-06-25 2007-12-27 Univ Georgetown Vacinas de papilomavírus
US5437951A (en) * 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5618536A (en) * 1992-09-03 1997-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric papillomavirus-like particles
CA2157932C (en) * 1993-03-09 2011-10-11 Robert C. Rose Production of human papillomavirus capsid protein and virus-like particles
AUPM566794A0 (en) * 1994-05-17 1994-06-09 University Of Queensland, The Process and product
DE4447664C2 (de) 1994-10-07 1999-04-15 Lutz Prof Dr Gissmann Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung
ES2264563T3 (es) * 1994-10-07 2007-01-01 Loyola University Of Chicago Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion.
JP3413020B2 (ja) * 1996-07-17 2003-06-03 株式会社東芝 半導体装置の製造方法
DE19712541C1 (de) 1997-03-25 1998-11-05 Deutsches Krebsforsch Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
CA2295316C (en) * 1997-07-03 2007-06-26 University Of Colorado, University Technology Corporation Homogeneous human papilloma virus capsomere containing compositions, methods for manufacture, and the use thereof as diagnostic, prophylactic or therapy
JP3559048B2 (ja) 1997-08-26 2004-08-25 日本精工株式会社 転がり軸受の製造方法
US6228368B1 (en) * 1997-10-06 2001-05-08 Loyola University Of Chicago Papilloma virus capsomere formulations and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
NZ503830A (en) 2002-09-27
EP1021547B1 (en) 2006-12-27
US20090028894A1 (en) 2009-01-29
CZ302351B6 (cs) 2011-03-30
DE69836753T2 (de) 2007-10-25
JP4520034B2 (ja) 2010-08-04
US6228368B1 (en) 2001-05-08
JP2010095530A (ja) 2010-04-30
PT1021547E (pt) 2007-02-28
JP2013147507A (ja) 2013-08-01
US20050031636A1 (en) 2005-02-10
CA2305382A1 (en) 1999-04-15
US7371391B2 (en) 2008-05-13
IL190554A0 (en) 2008-11-03
ES2280104T3 (es) 2007-09-01
PL195332B1 (pl) 2007-09-28
EP1021547A1 (en) 2000-07-26
NO20001768D0 (no) 2000-04-06
EP1690941B1 (en) 2009-11-25
JP2001519161A (ja) 2001-10-23
IL135528A0 (en) 2001-05-20
DE69841342D1 (de) 2010-01-07
BR9814606A (pt) 2002-01-02
PL339735A1 (en) 2001-01-02
ATE449852T1 (de) 2009-12-15
EP1690941A1 (en) 2006-08-16
US20060198853A1 (en) 2006-09-07
DE69836753D1 (de) 2007-02-08
HUP0004360A2 (en) 2001-03-28
NO328128B1 (no) 2009-12-14
DK1021547T3 (da) 2007-04-23
ES2337492T3 (es) 2010-04-26
CY1105963T1 (el) 2011-04-06
NO20091761L (no) 2000-06-02
AU9684698A (en) 1999-04-27
NO20001768L (no) 2000-06-02
ATE349536T1 (de) 2007-01-15
IL135528A (en) 2008-06-05
CZ20001244A3 (en) 2001-05-16
HUP0004360A3 (en) 2003-03-28
TR200001842T2 (tr) 2000-12-21
WO1999018220A1 (en) 1999-04-15
JP5296665B2 (ja) 2013-09-25
US7754430B2 (en) 2010-07-13
KR20010030969A (ko) 2001-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7754430B2 (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
US5618536A (en) Chimeric papillomavirus-like particles
US6352696B1 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US7279306B2 (en) Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, and viral capsid protein fusions, preferably papillomavirus L1 proteins, and uses thereof
US6649167B2 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US7182947B2 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US20050100556A1 (en) Chimeric papillomavirus-like particles
US7494658B2 (en) Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs
AU2003200653B2 (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
AU717932B2 (en) Chimeric papillomavirus-like particles
MXPA00003358A (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
AU2007201791A1 (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
MXPA98001583A (es) Formulaciones para vacunas de capsomero del papiloma virus.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees