ES2280104T3 - Formulaciones de vacunas que contienen capsomeras del virus de papiloma humano y metodos de uso. - Google Patents
Formulaciones de vacunas que contienen capsomeras del virus de papiloma humano y metodos de uso. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2280104T3 ES2280104T3 ES98950930T ES98950930T ES2280104T3 ES 2280104 T3 ES2280104 T3 ES 2280104T3 ES 98950930 T ES98950930 T ES 98950930T ES 98950930 T ES98950930 T ES 98950930T ES 2280104 T3 ES2280104 T3 ES 2280104T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- protein
- amino acid
- hpv
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 119
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims abstract description 49
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 12
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 11
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 claims 6
- 125000004112 carboxyamino group Chemical group [H]OC(=O)N([H])[*] 0.000 claims 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 96
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 25
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 3
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 3
- 101000872083 Danio rerio Delta-like protein C Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 206010061978 Genital lesion Diseases 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 2-hydroxyethyl piperazine-N Chemical compound 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000009037 Panicum miliaceum subsp. ruderale Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- WTFOKLBMGCZCIY-UHFFFAOYSA-N acetic acid;phosphoric acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.OP(O)(O)=O WTFOKLBMGCZCIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000022185 broomcorn panic Species 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001373 regressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
- Y10S977/802—Virus-based particle
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
- Y10S977/917—Vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Una formulación antigénica que comprende una capsómera del virus de papiloma humano para uso como vacuna, dicha capsómera comprendiendo una proteína de fusión que contiene una proteína truncada L1 del virus de papiloma humano adyacente a los residuos aminoácidos de una segunda proteína dicha proteína L1 y dichos aminoácidos de dicha segunda proteína posicionados pata inhibir la formación de una partícula tipo virus, dicha formulación evocando una respuesta inmune que neutraliza a los viriones del virus de papiloma humano.
Description
Formulaciones de vacunas que contienen
capsómeras del virus de papiloma humano y métodos de uso.
La presente invención se relaciona con
formulaciones de vacunas que contienen proteínas del virus de
papiloma, ya sea como proteínas de fusión, como proteínas
truncadas, o como proteínas de fusión truncadas. La invención
abarca además métodos para producir capsómeras de las formulaciones,
así como métodos profilácticos y terapéuticos para su uso.
Las infecciones con ciertas cepas de alto riesgo
de virus de papiloma genital en humanos (HPV) - por ejemplo, HPV
16, 18 ó 45- se cree que son el principal factor de riesgo para la
formación de tumores malignos del tracto anogenital. Entre las
posibles malignidades, el carcinoma cervical es con mucho el más
frecuente: de acuerdo a un estimativo de la Organización Mundial
de la Salud (OMS), casi 500.000 nuevos casos de la enfermedad se
presentan cada año. Debido a la frecuencia con la cual se presenta
esta patología, la conexión entre la infección con HPV y el
carcinoma cervical ha sido extensamente examinada, conduciendo a
numerosas generalizaciones.
Por ejemplo, las lesiones precursoras de la
neoplasia intraepitelial cervical (CIN) se sabe que son causadas
por infecciones con el virus de papiloma [Crum. New Eng. J.
Med. 310:880-883 (1984)]. El ADN de los genomas
de ciertos tipos de HPV, incluidas por ejemplo, las cepas 16, 18,
33, 35, y 45, han sido detectadas en más del 95% de las biopsias de
tumor de pacientes con este desorden, así como en líneas de células
primarias cultivadas a partir de los tumores. Aproximadamente se ha
encontrado que 50 a 70% de las biopsias de las células tumorales de
CIN incluyen ADN derivado únicamente de HPV 16.
Los productos proteicos de los genes tempranos
E6 y E7 de HPV 16 y de HPV 18 han sido detectados en líneas
celulares de carcinoma cervical así como en queratinocitos humanos
transformados in vitro [Wettstein, y colaboradores, en
PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, Pfister (Ed.), CRC Press: Boca
Ratón, FL 1990 páginas 155-179] y un porcentaje
significativo de pacientes con carcinoma cervical tienen anticuerpos
anti-E6 o anti-E7. Se ha observado
que las proteínas E6 y E7 participan en la inducción de la síntesis
de ADN celular en células humanas, en la transformación de
queratinocitos humanos y de otros tipos de células, y en la
formación de tumores en ratones transgénicos [Arbelt, y
colaboradores, J. Virol., 68:4358-4364
(1994): Auewarakul, y colaboradores, Mol. Cell. Biol.
14:8250-8258 (1994); Barbosa y colaboradores, J.
Virol. 65:292-298 (1991): Kaur, y colaboradores,
J. Gen. Virol. 70:1261-1266 (1989): Schlegel
y colaboradores, EMBO J. 7:3181-3187 (1988)].
La expresión constitutiva de las proteínas E6/E7 parece ser
necesaria para mantener la condición transformada de los tumores
positivos del HPV.
A pesar de la capacidad de algunas cepas del HPV
para inducir fenotipos neoplásicos in vivo e in vitro,
no obstante otros tipos de HPV causan verrugas genitales benignas
tales como la condylomata acuminata y solamente se las asocia
raramente con tumores malignos [Ikenberg, En Gross. y colaboradores,
(eds.) GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS. Springer Verlag: Berlin,
páginas 87-112]. Las cepas de bajo riesgo de este
tipo incluyen, por ejemplo, HPV 6 y 11.
Más a menudo, los virus de papiloma genital se
transmiten entre humanos durante el coito que en muchos casos
conduce a una infección persistente en la membrana mucosa
anogenital. Mientras que esta observación sugiere que o bien la
infección primaria induce una respuesta inmune inadecuada o que el
virus ha desarrollado la habilidad para evitar la vigilancia
inmunológica, otras observaciones sugieren que el sistema
inmunológico es activo durante la manifestación primaria así como
durante el curso maligno de las infecciones por el virus de
papiloma [Altmann y colaboradores en VIRUSES AND CANCER, Minson y
colaboradores, (eds.) Cambridge University Press, (1994) páginas
71-80].
Por ejemplo, la manifestación clínica de la
infección primaria por parte del virus de papiloma bovino o de
conejo se puede prevenir por medio de vacunación con extractos de
verruga o de proteínas estructurales virales [Altmann, y
colaboradores, supra; Campo, Curr. Top. En Microbiol and
Immunol. 186:255-266 (1994); Yindle y Frazer,
Curr. Top. En Microbiol and Immunol.
186:217-253 (1994)]. Los roedores previamente
vacunados con vacunas recombinantes que codifican a las proteínas
tempranas E6 o E7 de HPV 16, o con péptidos sintéticos E6 o E7, se
protegen en forma similar de la formación de tumores después de la
inoculación de células autólogas transformadas con HPV 16 [Altman, y
colaboradores, supra; Campo, y colaboradores, supra;
Yindle y Frazer, y colaboradores, supra]. La regresión de las
verrugas puede ser inducida por medio de la transferencia de
linfocitos a partir de animales regresores después de la infección
por medio de virus de papiloma animal. Finalmente, en pacientes
inmunosuprimidos, tales como, por ejemplo, los receptores de
transplantes de órganos o individuos infectados con VIH, la
incidencia de verrugas genitales, CIN, y cáncer anogenital es
elevada.
Virology 234, 1997, páginas
93-111 divulga métodos para producir partículas de
tipo virus de papiloma quimérico que constan de proteínas de fusión
HPV 16L1 y E7. Li y colaboradores (1997), J. Virology 71,
2988-2995 divulga la obtención de capsómeras por
medio de la escisión con tripsina.
Hasta la fecha, no se habían descrito vacunas
del HPV que contuvieran proteína L1 tardía del virus de papiloma
humano en forma de capsómeras que sean adecuadas tanto para
propósitos profilácticos como terapéuticos. Ya que la proteína L1
no está presente en lesiones genitales malignas, la vacunación con
proteína L1 no tienen ningún potencial terapéutico para estos
pacientes. La construcción de proteínas quiméricas, que comprende
residuos aminoácidos de proteína L1 y, por ejemplo proteína E6 o E7,
que da lugar a capsómeras quiméricas, combina funciones
terapéuticas y profilácticas de una vacuna. Un método para la
producción de un alto nivel de capsómeras quiméricas sería por lo
tanto particularmente deseable, en vista de las posibles ventajas
ofrecidas por tal vacuna para intervención profiláctica y
terapéutica.
Por lo tanto, existe la necesidad en el arte de
proveer formulaciones de vacunas que puedan prevenir o tratar una
infección del HPV. Los métodos para producir formulaciones de
vacunas que superen los problemas conocidos en el estado del arte
asociados con la expresión de la proteína recombinante del HPV y la
purificación serían manifiestamente útiles para tratar a la
población de individuos ya infectada con HPV así como también sería
útil para inmunizar a la población de individuos susceptibles a la
infección por el HPV.
La presente invención provee formulaciones de
vacunas terapéuticas y profilácticas que contienen capsómeras
quiméricas de papiloma humano. La invención también provee métodos
terapéuticos para tratar pacientes infectados con un HPV así como
métodos profilácticos para prevenir la infección con HPV en un
individuo susceptible. Se contemplan también métodos para la
producción y purificación de capsómeras y de proteínas de la
invención.
En un aspecto de la invención, las vacunaciones
profilácticas para la prevención de la infección por el HPV se
considera que incorporan a las proteínas estructurales L1 y L2 del
virus de papiloma. El desarrollo de una vacuna de este tipo
enfrenta obstáculos significativos debido a que el virus del
papiloma no se puede propagar en títulos adecuados en cultivos
celulares o de otros sistemas experimentales para proveer las
proteínas virales en cantidad suficiente para la producción
económica de la vacuna. Además, las metodologías recombinantes para
expresar las proteínas no son siempre directas y a menudo resultan
en un bajo rendimiento de proteína. Recientemente, las partículas
tipo virus (las VLP), en forma similar a la formación de las
estructuras de la cápside viral, se ha descrito que se forman en
células Sf-9 de insectos por expresión de las
proteínas virales L1 y L2 (o L1 por si misma) utilizando una vacuna
recombinante o baculovirus. La purificación de las VLP se puede
lograr muy simplemente por medio de centrifugación en gradientes de
CsCl o de sacarosa [Kirnbauer, y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA). 99:12180-12814 (1992):
Kirnbaurer, y colaboradores, J. Virol.
67:6929-6936 (1994); Proso, y colaboradores, J.
Virol. 6714:1936-1944 (1992): Sasagawa y
colaboradores, Virology 2016:126-195 (1995):
Volpers y colaboradores, J. Virol.
69:3258-3264 (1995); Zhou y colaboradores, J.
Gen. Virol. 74:762-769 (1993): Zhou y
colaboradores, Virology 185:251-257 (1991)].
WO 93/02184 describe un método en el cual las partículas tipo virus
de papiloma (las VLP) se utilizan para aplicaciones diagnósticas o
como una vacuna contra infecciones causadas por el virus del
papiloma. WO 94/00152 describe la producción Recombinante de
proteína L1 que imita al epítopo conformacional de neutralización
sobre viriones de papiloma humano o animal.
En otro aspecto de la invención, se proveen
vacunas terapéuticas para aliviar las complicaciones de, por
ejemplo, carcinoma cervical o lesiones precursoras resultantes de
la infección con virus de papiloma, y por lo tanto representan una
alternativa para la intervención profiláctica. Las vacunas de este
tipo pueden contener proteínas tempranas del virus de papiloma,
principalmente E6 o E7, que se expresan en las células
persistentemente infectadas. Se asume que, después de la
administración de una vacuna de este tipo, las células T citotóxicas
pueden ser activadas contra las células persistentemente infectadas
en lesiones genitales. La población objetivo para intervención
terapéutica son los pacientes con lesiones genitales malignas o
premalignas asociadas con el HPV. La solicitud PCT de patente WO
93/20844 divulga que la proteína temprana E7 y los fragmentos
antigénicos de la misma del virus de papiloma de HPV o de BPV son
terapéuticamente efectivos en la regresión, pero no en la
prevención, de tumores causados por el virus de papiloma en
mamíferos. Mientras que las proteínas tempranas del HPV han sido
producidas por medio de expresión recombinante en E. coli o
en tipos adecuados de células eucariotas, la purificación de las
proteínas recombinantes ha probado ser difícil debido a la baja
solubilidad inherente y a los procedimientos complejos de
purificación que generalmente requieren de una combinación de
etapas, incluida cromatografía de intercambio iónico, filtración por
gel y cromatografía de afinidad.
De acuerdo con la presente invención, se
suministran las formulaciones de vacunas que contienen capsómeras
del virus de papiloma que comprenden ya sea: (i) una proteína viral
truncada; (ii) una proteína viral truncada expresada como una
proteína de fusión que contiene en parte residuos aminoácidos de una
segunda proteína, o (iii) alguna combinación de los dos tipos de
proteínas. De acuerdo con la invención, las formulaciones para
vacuna se suministran con un contenido de capsómeras de virus de
papiloma bovino (BPV) y de virus de papiloma humano. Las capsómeras
preferidas de virus bovino contienen proteína del virus de papiloma
bovino tipo l. Las capsómeras preferidas de virus humano contienen
proteínas de cualquiera de las cepas del virus de papiloma humano
HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 y HPV45. Las formulaciones
más preferidas para la vacuna comprenden capsómeras que contienen
proteínas de HPV16.
En un aspecto de la invención, se proveen
formulaciones capsómeras para la vacuna que contienen proteínas
virales truncadas que contienen una supresión de uno o más residuos
aminoácidos necesarios para la formación de una partícula tipo
virus. Se prefiere que la supresión de aminoácidos no inhiba la
formación de capsómeras por medio de la proteína truncada, y se
prefiere más que la supresión favorezca la formación de capsómeras.
Las formulaciones preferidas para la vacuna de este tipo incluyen a
las capsómeras que contienen L1 truncada con o sin proteínas
virales L2. Las capsómeras particularmente preferidas contienen
proteínas L1 truncadas. Las proteínas truncadas contempladas por la
invención incluyen a aquellas que tienen uno o más residuos
aminoácidos suprimidos del carboxi terminal de la proteína, o uno o
más residuos aminoácidos suprimidos del amino terminal de la
proteína, o uno o más residuos aminoácidos suprimidos de una región
interna (esto es, no de cualquiera de los terminales) de la
proteína. Las formulaciones preferidas de capsómeras para la vacuna
contienen proteínas truncadas en el carboxi terminal. En las
formulaciones que incluyen a la proteína L1 derivada de HPV16, se
prefiere suprimir desde los residuos 1 hasta 34 de los aminoácidos
carboxi terminales. También se contemplan las supresiones
relativamente cortas que ofrecen la ventaja de una modificación
menor de las propiedades antigénicas de las proteínas L1 y de las
capsómeras formadas a partir de las mismas. Se prefiere más sin
embargo, suprimir 34 residuos aminoácidos de la secuencia L1,
correspondiente a los aminoácidos 472 a 505 en HPV16 expuestos en
la SEQ ID NO: 2, y codificados por medio de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1414 a 1516 en la
secuencia de codificación L1 de HPV16 expuesta en la SEQ ID NO:
1.
Cuando se elabora una formulación de una vacuna
de capsómera con proteínas que sufren una supresión interna, se
prefiere que la secuencia de aminoácidos suprimida comprenda la
región nuclear de localización de la proteína. En la proteína L1 de
HPV16, la señal nuclear de localización se encuentra aproximadamente
entre el residuo aminoácido 499 hasta aproximadamente el residuo
aminoácido 505. Después de la expresión de las proteínas L1 en
donde NLS ha sido suprimido, el montaje de las estructuras
capsómeras ocurre en el citoplasma de la célula huésped. Por lo
tanto, la purificación de las capsómeras se posible a partir del
citoplasma en vez de a partir del núcleo donde las proteínas
intactas L1 se ensamblan dentro de las capsómeras. Las capsómeras
que resultan del montaje de proteínas truncadas en donde las
secuencias adicionales de aminoácidos no reemplazan a las secuencias
suprimidas de proteína son necesariamente no quiméricas por
naturaleza.
En aún otro aspecto de la invención, las
formulaciones capsómeras para vacuna se suministran con un contenido
de proteína viral truncada expresada como residuos aminoácidos
adyacentes de una proteína de fusión a partir de una segunda
proteína. Las proteínas virales truncadas preferidas de la invención
son las proteínas virales estructurales de papiloma L1 y L2. Las
capsómeras que constan de fusiones de proteína viral truncada se
pueden producir utilizando juntos los componentes de la proteína L1
y L2 o solamente la proteína L1. Las capsómeras preferidas son
aquellas que constan de los residuos aminoácidos de la proteína L1.
Los componentes de la proteína viral truncada de las proteínas de
fusión incluyen a aquellos que tienen uno o más residuos aminoácidos
suprimidos del carboxi terminal de la proteína, o uno o más
residuos aminoácidos suprimidos de una región interna (esto es, no
a partir de cualquiera de los terminales) de la proteína. Las
formulaciones preferidas de la vacuna con capsómeras contienen
proteínas truncadas en el carboxi terminal. En aquellas
formulaciones que incluyen a la proteína L1 derivada de HPV 16, se
prefiere que se supriman de 1 a 34 residuos aminoácidos del carboxi
terminal. Se contemplan también supresiones relativamente más cortas
que ofrecen la ventaja de una modificación menor de las propiedades
antigénicas de la proteína L1 componente de la proteína de fusión y
de las capsómeras formadas a partir de allí. Se prefiere más, sin
embargo, que los 34 residuos aminoácidos sean suprimidos de la
secuencia de L1, correspondiente a los aminoácidos 472 a 505 en HPV
16 expuestos en la SEQ ID NO: 2, y codificados por la secuencia de
polinucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1414 a 1516 en la
secuencia de codificación de L1 del HPV 16 expuesta en la SRQ ID
NO: 1. Cuando la formulación de la vacuna consta de capsómeras
elaboradas con proteínas que sufren una supresión interna, se
prefiere que la secuencia de aminoácidos suprimida contenga a la
región nuclear de localización, o a la secuencia, de la
proteína.
Los aminoácidos de la segunda proteína se pueden
derivar de numerosas fuentes mientras que la adición de los
residuos aminoácidos de la segunda proteína a la primera proteína
permite la formación de capsómeras. Preferiblemente, la adición de
los residuos aminoácidos de la segunda proteína inhibe la habilidad
de la proteína viral intacta para formar estructuras de partículas
tipo virus; más preferiblemente, los residuos aminoácidos de la
segunda proteína promueven la formación de capsómeras. Los residuos
aminoácidos de la segunda proteína se pueden derivar a partir de
numerosas fuentes, incluidos los residuos aminoácidos de la primera
proteína. En una modalidad de la invención, la segunda proteína
puede ser cualquier antígeno tumoral humano, antígeno viral, hubo
antígeno bacteriano que sea importante en la estimulación de una
respuesta inmune en estados neoplásicos o infecciosos de la
enfermedad. En una modalidad preferida, la segunda proteína es
también una proteína del virus de papiloma. Se prefiere también que
la segunda proteína sea el producto de la expresión del gen temprano
del virus de papiloma. Se prefiere también, sin embargo, que la
segunda proteína sea seleccionada del grupo de E1, E2, E3, E4, E5,
E6 y E7 - productos génicos tempranos codificados en el genoma de
las cepas del virus de papiloma HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 o
HPV45. Se prefiere más que la segunda proteína sea codificada por el
gen E7 del HPV16, el marco de lectura abierta que se expone en la
SEQ ID NO: 3. Las capsómeras reunidas a partir de las subunidades
de la proteína de fusión son mencionadas aquí como capsómeras
quiméricas. En una modalidad, la formulación de la vacuna de la
invención contiene capsómeras quiméricas en donde los residuos
aminoácidos de la proteína L1 constituyen aproximadamente de 50 a
99% de los residuos totales de aminoácidos de la proteína de
fusión. En otra modalidad, los residuos aminoácidos de L1
constituyen aproximadamente de 60 a 90% de los residuos totales de
aminoácidos de la proteína de fusión; en una modalidad
particularmente preferida, los aminoácidos de L1 constituyen
aproximadamente el 80% de los residuos aminoácidos de la proteína de
fusión.
En una modalidad preferida de la invención, las
proteínas de las formulaciones de la vacuna se producen por medio
de metodologías recombinantes. En las formulaciones que contienen
proteínas virales truncadas, las proteínas se pueden aislar a
partir de las fuentes naturales como proteínas intactas y se las
hidroliza in vitro utilizando hidrólisis química o digestión
enzimática con cualquiera entre un gran número de proteasas
especificas o generales, posteriormente se modifica la proteína
truncada para incluir residuos aminoácidos adicionales como se
describió anteriormente para suministrar una proteína de fusión
truncada de la invención.
En la producción de capsómeras, se pueden
utilizar las técnicas de biología molecular recombinante para
producir ADN que codifique ya sea a la proteína truncada deseada, o
a la proteína de fusión truncada. Las metodologías recombinantes
requeridas para producir un ADN que codifique a una proteína deseada
son bien conocidas y practicadas rutinariamente en el arte. Los
manuales de laboratorio, por ejemplo Sambrook, y colaboradores
(eds), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor
Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausebel y colaboradores
(eds), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.
(1994-1997), describen en detalle las técnicas
necesarias para llevar a cabo las manipulaciones requeridas del ADN.
Para la producción a gran escala de capsómeras quiméricas, la
expresión de la proteína se puede llevar a cabo utilizando ya sea de
vectores virales o eucariotas. Los vectores preferidos incluyen a
cualquiera de los bien conocidos vectores de expresión de
procariotas, a baculovirus recombinantes, a vectores específicos de
las células COS, a vacuna recombinantes, o a construcciones de
expresión específicas para levadura. Cuando se utilizan proteínas
recombinantes para proveer capsómeras de la invención, se pueden
aislar primero las proteínas de la célula huésped de su expresión y
después incubarlas bajo condiciones que permitan que ellas mismas
se ensamblen para proveer capsómeras. Alternativamente, las
proteínas se pueden expresar bajo condiciones en donde las
capsómeras se forman en la célula huésped.
La invención también contempla procesos para
producir capsómeras de las formulaciones de la vacuna. En un
método, las proteínas L1 se expresan a partir del ADN que codifica
seis histidinas adicionales en el carboxi terminal de la secuencia
que codifica a la proteína L1. Las proteínas L1 expresadas con
histidinas adicionales (proteínas L1 His) se expresan más
preferiblemente en E. coli y las proteínas L1 His se pueden
purificar utilizando cromatografía de afinidad con níquel. Las
proteínas L1 His en lisado celular se suspenden en un amortiguador
para desnaturalización, por ejemplo, clorhidrato de guanidina 6 M
hubo un amortiguador de capacidad de desnaturalización equivalente,
y luego se las somete a cromatografía con níquel. La proteína eluida
a partir de la etapa de cromatografía con níquel se renaturaliza,
por ejemplo en NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM,
Tritón-X 100 al 0,01%, HEPES 10 mM (ácido
2-hidroxietil
piperazina-N'-2 etano sulfónico), pH
7,4. De acuerdo a un método preferido de la invención, el montaje
de capsómeras tiene lugar después de la diálisis de las proteínas
purificadas, preferiblemente después de la diálisis contra NaCl 150
mM, Ca^{2+} 25 mM, DMSO al 10% (dimetil sulfóxido),
Tritón-X 100 al 0,1%, Tris 10 mM
[tris-(hidroximetil) amino-metano] ácido acético con
un valor de pH de 5,0.
La formación de capsómeras puede ser monitoreada
por medio de un microscopio electrónico, y, en los casos en donde
las capsómeras se componen de proteínas de fusión, la presencia de
diferentes componentes de proteína en la capsómera armada se puede
confirmar por medio de análisis de transferencias de Western
utilizando antisuero específico.
De acuerdo con la presente invención, se proveen
formulaciones para vacuna para uso en tratamiento terapéutico de
individuos infectados con HPV. El uso de formulaciones para vacuna
también provee un tratamiento profiláctico para individuos
susceptibles a la intención por HPV. Mientras que los individuos
infectados pueden ser identificados fácilmente utilizando técnicas
estándar de diagnóstico, los individuos susceptibles se pueden
identificar, por ejemplo, como aquellos comprometidos en relaciones
sexuales con un individuo infectado. Sin embargo, debido a la alta
frecuencia de infección con HPV, todas las personas sexualmente
activas son susceptibles de infección por el virus de papiloma.
La administración de una formulación para vacuna
puede incluir uno o más componentes adicionales tales como
excipientes farmacéuticas aceptables, diluyentes, adyuvantes, y/o
amortiguadores. Las vacunas se pueden administrar una sola vez o en
múltiples ocasiones. La formulación para la vacuna de la invención
se puede suministrar a través de diferentes rutas de administración
incluidas, por ejemplo, oral, intravenosa, intramuscular, nasal,
rectal, transdérmica, vaginal, subcutánea, e intraperitoneal.
Las formulaciones para vacuna de la invención
ofrecen numerosas ventajas cuando se las compara con preparaciones
convencionales para vacuna. Como parte de una vacunación
terapéutica, las capsómeras puede promover la eliminación de
células persistentemente infectadas en, por ejemplo, pacientes con
CIN o carcinoma cervical. Adicionalmente, las vacunaciones
terapéuticas de este tipo pueden servir también para un propósito
profiláctico en la protección de pacientes con lesiones CIN, de
infectarse nuevamente. Como una ventaja adicional, las capsómeras
pueden evitar la neutralización por medio de anticuerpos
anticápside previamente existentes y por lo tanto poseen una vida
media en circulación más larga en comparación con partículas
quiméricas tipo virus.
Las formulaciones para vacuna que comprenden
capsómeras quiméricas pueden proveer una ventaja adicional de
antigenicidad incrementada de ambos componentes proteicos de la
proteína de fusión a partir de los cuales se forma la capsómera.
Por ejemplo, en una VLP, los componentes de la proteína de la
capsómera subyacente se pueden insertar en la estructura total como
resultado del posicionamiento internalizado dentro de las mismas
VLP. En forma similar, los epítopos de los componentes de la
proteína se pueden obstruir estéricamente como resultado del
contacto capsómera con capsómera, y por lo tanto se hacen
inaccesibles para producir una respuesta inmune. Los resultados
preliminares utilizando proteínas de fusión L1/E7 para producir las
VLP soportan esta posición en que no se detectó respuesta al
anticuerpo contra el componente E7. Esta observación es consistente
con los resultados previos que indican que la región carboxi
terminal de L1 forma estructuras de brazo interpentaméricas que
permiten el montaje de capsómeras dentro de cápsides [García y
colaboradores, J. Virol. 71:2988-2995
(1997)]. Presumiblemente en la estructura capsómera quimérica,
ambos componentes proteicos de la subestructura de la proteína de
fusión son accesibles para evocar una respuesta inmune. Las vacunas
que contienen capsómera ofrecerían por lo tanto la ventaja
adicional de una antigenicidad mayor contra cualquier componente
proteico, incluido, por ejemplo, los epítopos de neutralización de
otras proteínas virales, expresadas como una fusión con las
secuencias de aminoácidos de L1.
La presente intención se ilustra por medio de
los siguientes ejemplos. El Ejemplo 1 describe la construcción de
vectores de expresión para producir proteínas virales, quiméricas o
de fusión. El Ejemplo 2 se relaciona con la generación de
baculovirus recombinantes para la expresión de proteínas virales. El
Ejemplo 3 se relaciona con la purificación de capsómeras. El
Ejemplo 4 describe un protocolo de inmunización para la producción
de anticuerpos monoclonales y de antisuero. El Ejemplo 5 provee un
ELISA de un péptido para cuantificar la formación de capsómeras. El
Ejemplo 6 describe un ELISA de captura de antígeno para cuantificar
la formación de capsómeras. El Ejemplo 7 provee un ensayo de
hemaglutinina para analizar la inducción de anticuerpos
neutralizantes.
Se cortó el ADN que codifica al marco de lectura
abierta de L1 de HPV 16 del plásmido
16-114/k-L1/L2-pSynxtVI^{-}
[Kirnbauer y colaboradores, J. Virol.
67:6929-6936 (1994)] utilizando BglII y al
fragmento resultante subclonado dentro de pUC19 (New England
Biolabs. Beverly, MA) previamente linealizado en el único sitio de
restricción BamHI. Se generaron primero dos construcciones
básicas de expresión para permitir la inserción posterior de ADN
para permitir la expresión de la proteína de fusión. Una
construcción codificada HPV16 L1\Delta310 que tiene una supresión
de nueve aminoácidos: se sabía que la región suprimida mostraba bajo
nivel de homología con todas las otras proteínas L1 de virus de
papiloma. La segunda construcción, HPV 16 L1 \DeltaC, codificó
una proteína que tenía una supresión de 34 aminoácidos de los
residuos del carboxi terminal de L1. Otras construcciones incluyen
un sitio de restricción EcoRV en la posición de la supresión
para una inserción más fácil de ADN que codifica otras secuencias
de proteína. La adición del sitio EcoRV codifica dos
aminoácidos de una proteína no L1, aspartato y isoleucina.
Se diseñaron dos iniciadores (las SEQ ID NO: 5 y
6) para amplificar al vector pUC19 y la secuencia de codificación
completa de HPV 16 L1, excepto los nucleótidos 916 a 942 en la SEQ
ID NO: 1. Los iniciadores se sintetizaron para introducir también
un sitio único de restricción EcoRV (subrayado en las SEQ ID
NO: 5 y 6) en los terminales del producto de amplificación.
| CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG | SEQ ID NO: 5 | |
| CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG | SEQ ID NO: 6 |
Se digirió el producto PCR resultante con
EcoRV para proveer extremos complementarios y se hizo un
círculo con el producto de digestión por medio de ligación. El ADN
ligado fue transformado dentro de E. coli utilizando
técnicas estándar y se seleccionaron los plásmidos de las colonias
resultantes por la presencia de un sitio de restricción
EcoRV. Se identificó que un clon designado como HPV 16 L1
\Delta310 tenía la supresión apropiada de veintisiete nucleótidos
y se utilizó esta construcción para insertar fragmentos de ADN que
codifican a otras proteínas HPV 16 en el sitio EcoRV como se
discute más adelante.
Se designaron dos iniciadores (las SEQ ID NO: 7
y 8) complementarios al marco de lectura abierta de HPV 16 L1 de
tal manera que los iniciadores colindaban entre si para permitir la
amplificación en direcciones inversas sobre el ADN molde que
contiene secuencias que codifican a HPV16 L1 en el pUC19
anteriormente descrito.
| AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC | SEQ ID NO: 7 | |
| AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG | SEQ ID NO: 8 |
Cada iniciador introdujo un sitio de restricción
EcoRV en el terminal del producto de amplificación. En el
iniciador secuencia abajo (SEQ ID NO: 8), el sitio EcoRV fue
seguido por un codón de detención translacional TAA posicionado de
tal manera que el producto de amplificación, por ligación de los
extremos de EcoRV para convertirlo en circular, incluirían
supresión de los 34 aminoácidos carboxi terminales de L1. La PCR
fue realizada para amplificar al marco de lectura abierta parcial
de L1 y al vector completo. El producto de amplificación fue
escindido con EcoRV, se lo hizo circular con T4 ADN ligasa, y
de lo transformó dentro de células DH5 \alpha de E. coli.
Se analizaron los plásmidos de los clones viables por la presencia
de un sitio EcoRV que linealizaría al plásmido. Se identificó una
construcción positiva designada pUCHPV16L1\DeltaC y se la utilizó
para insertar ADN de otras proteínas HPV 16 utilizando el sitio
EcoRV.
Los fragmentos de ADN de HPV 16 E7 que codifican
a los aminoácidos 1-50. 1-60.
1-98. 25-75. 40-98.
50-98 en la SEQ ID NO: 4 fueron amplificados
utilizando iniciadores que introdujeron los sitios de restricción
EcoRV en el terminal 5' con el propósito de facilitar la
inserción del fragmento ya sea dentro de la secuencia modificada de
HPV 16 L1 \Delta310 o de HPV16L1\DeltaC. En las diferentes
reacciones de amplificación, se utilizó el iniciador E7.1 (SEQ ID
NO: 9) en combinación con el iniciador E7.2 (SEQ ID NO: 10) para
generar un fragmento de ADN que codifica a los aminoácidos
1-50 de E7: con el iniciador E7.3 (SEQ ID NO: 11)
para generar un fragmento de ADN que codifica a los aminoácidos
1-60 de E7: o con el iniciador E7.4 (SEQ ID NO: 12)
para generar un fragmento de ADN que codifica a los aminoácidos
1-98 de E7. En otras reacciones de amplificación, se
utilizaron los pares de iniciadores E7.5 (SEQ ID NO: 13) y E7.6
(SEQ ID NO: 14) para amplificar un fragmento de ADN que codifica a
los aminoácidos 25-75 de E7; E7.7 (SEQ ID NO: 15) y
E7.4 (SEQ ID NO: 12) fueron utilizados para amplificar un fragmento
de ADN que codifica a los aminoácidos 40-98 de E7; y
E7.8 (SEQ ID NO: 16) y E7.4 (SEQ ID NO: 12) fueron utilizados para
amplificar un fragmento de ADN que codifica a los aminoácidos
50-98 de E7.
Iniciador E7.1 SEQ ID NO: 9
- AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
Iniciador E7.2 SEQ ID NO: 10
- TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC
Iniciador E7.3 SEQ ID NO: 11
- TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCC
Iniciador E7.4 SEQ ID NO: 12
- AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC
Iniciador E7.5 SEQ ID NO: 13
- TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG
Iniciador E7.6 SEQ ID NO: 14
- TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC
Iniciador E7.7 SEQ ID NO: 15
- TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC
Iniciador E7.8 SEQ ID NO: 16
- TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTG
En forma similar, se amplificaron los
nucleótidos del ADN que codifica a la proteína de la matriz de
influenza (SEQ ID NO: 17) utilizando el par iniciador expuesto en
las SEQ ID NO: 19 y 20. Ambos iniciadores introdujeron un sitio de
restricción EcoRV en el producto de amplificación.
| TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC | SEQ ID NO: 19 | |
| TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG SEQ | ID NO: 20 |
Se escindieron los productos PCR de cada
reacción de amplificación con EcoRV y se los insertó dentro
del sitio EcoRV de cualquiera de las secuencias HPV 16 L1
\Delta310 y HPV16L1\DeltaC previamente linealizadas con la
misma enzima. Con el propósito de determinar la orientación de los
insertos en los plásmidos que codifican a los aminoácidos
25-75 y 50-98 de E7 y al plásmido
que incluye a la proteína de la matriz de influenza, se empleó
digestión con Clal, tomando ventaja de un sitio de
restricción que se superpone al recientemente creado sitio de
restricción EcoRV (GATATCGAT) y que está incluido en
el iniciador secuencia arriba. Para las tres construcciones de
expresión que incluyen a la metionina de iniciación de HPV 16 E7, se
determinó la orientación del inserto utilizando un sitio de
restricción NslI dentro de la región de codificación de
E7.
Una vez que las construcciones de expresión que
tienen a los insertos apropiados fueron identificadas, se cortó la
región de codificación de la proteína tanto para L1 como para los
aminoácidos insertados como una unidad que utiliza enzimas de
restricción Xbal y Smal y el ADN aislado ligado dentro
del plásmido pVL1393 (Invitrogen) para generar baculovirus
recombinantes.
La secuencia de HPV 16 L1 \DeltaC incluye ADN
del sitio EcoRV que resulta en la traducción de los
aminoácidos que no se encuentran normalmente en polipéptidos L1 de
tipo silvestre. Por lo tanto, se diseñó una serie de construcciones
para expresión en la cuales el sitio artificial EcoRv fue
eliminado. La secuencia de L1 para esta serie de construcciones de
expresión fue designada como HPV16L1\DeltaC*.
Para generar una construcción para expresión que
contenga a la secuencia HPV 16L1DC*, se llevaron a cabo dos
reacciones PCR para amplificar dos fragmentos que se superponen a
partir del pUC-HPV16 L1\DeltaC que codifica a los
aminoácidos 1-50 de E7. Los fragmentos de ADN
resultantes se superpusieron en la posición del límite entre L1/E7
pero no contenían a los dos sitios de restricción EcoRV. El
fragmento 1 se generó utilizando a los iniciadores P1 (SEQ ID NO:
21) y P2 (SEQ ID NO: 22) y al fragmento 2 utilizando los
iniciadores
P3 (SEQ ID NO: 23) y P4 (SEQ ID NO: 24).
Iniciador P1 SEQ ID NO: 21
- GTTATGACATACATACATTCTATG
Iniciador P2 SEQ ID NO: 22
- CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC
Iniciador P3 SEQ ID NO: 23
- CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC
Iniciador P4 SEQ ID NO: 24
- CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG
Después de las primeras dos reacciones de
amplificación, se utilizaron los dos productos purificados como
moldes en otra reacción PCR utilizando únicamente a los iniciadores
P1 y P4. El producto de amplificación resultante fue digerido con
las enzimas EcoNI y HindIII insertadas en la
construcción para expresión de HPV 16L1\DeltaC descrita
anteriormente después de la digestión con las mismas enzimas. La
construcción resultante para expresión difiere de la construcción
original HPV16L1\DeltaC con ADN que codifica a los aminoácidos
1-50 de L1 y de E7 por la pérdida de los dos sitios
de restricción internos de EcoRV. El primer sitio
EcoRV fue reemplazado por ADN que codifica a los aminoácidos
nativos alanina y glicina de L1 en esta posición y el segundo fue
reemplazado por una señal translacional de detención. Además, la
construcción para expresión, designada como HPV 16 L1\DeltaC* E7
1-52, contenía los primeros 52 aminoácidos de HPV 16
E7 como resultado del uso del iniciador P4 que también codifica a
los residuos aminoácidos de E7 histidina en la posición 51 y
tirosina en la posición 52. Se utilizó entonces HPV 16 L1\DeltaC*
E7 1-52 para generar construcciones adicionales
para expresión de HPV 16 L1\DeltaC que incluyen además ADN que
codifica a los aminoácidos 1-55 de E7 utilizando al
iniciador P1 (SEQ ID NO: 21) en combinación con el iniciador P5 (SEQ
ID NO: 25), a los aminoácidos 1-60 de E7 con el par
iniciador P1 y P6 (SEQ ID NO: 26), a los aminoácidos
1-65 de E7 con el par iniciador P1 y P7 (SEQ ID NO:
27). Las secuencias adicionales de ADN que codifican a los
aminoácidos en los productos de amplificación surgen del diseño de
los iniciadores para incluir nucleótidos adicionales para los
aminoácidos deseados.
Iniciador P5 SEQ ID NO: 25
- CATCTGAAGCTTAAGCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
Iniciador P6 SEQ ID NO: 26
- CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
Iniciador P7 SEQ ID NO: 27
- CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCT GTCCG
En forma similar, HPV 16 L1\DeltaC* E7
1-70 fue generado utilizando el molde de ADN que
codifica a HPV 16 L1\DeltaC* E7 1-66 y al par
iniciador P1 y P8 (SEQ ID NO: 28).
Iniciador P8 SEQ ID NO: 28
- CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
Después de cada reacción PCR, se digirieron los
productos de amplificación con EcoNI y HindIII y se
los insertó dentro de HPV16L1\DeltaC previamente digerido con las
mismas enzimas. Se determinaron las secuencias de cada una de las
construcciones utilizando un instrumento para secuenciación modelo
Prism 377 de Applied Biosystems con dideoxinucleótidos
fluorescentes en la cadena terminal [Prober y colaboradores,
Science 238:336-341 (1987)].
Las células de Spodoptera frugiperda
(Sf9) se cultivaron en suspensión o en cultivos monocapa a 27° en
medio TNMFH (Sigma) suplementado con suero fetal de ternera al 10%
y glutamina 2 mM. Para la construcción recombinante de baculovirus
con base en HPV 16 L1, se transfectaron células Sf9 con 10 \mug de
plásmido de transferencia junto con 2 \mug de
Baculo-Gold DNA (PharMingen, San Diego. CA)
linealizado. Se purificaron los virus recombinantes de acuerdo con
el protocolo sugerido por el fabricante.
Para analizar la expresión de la proteína HPV 16
L1, se infectaron 10^{5} células Sf9 con baculovirus recombinante
con una multiplicidad de infección (m.o.i) de 5 a 10. Después de
incubación durante tres a cuatro días a 28°C, se removió el medio y
se lavaron las células con PBS. Se lisaron las células en
amortiguador SDS para la muestra y se las analizó por medio de
SDS-PAGE y de transferencias de Western utilizando
anticuerpos anti-HPV16 L1 y
anti-HPV16 E7.
Con el propósito de determinar cuál de las
construcciones para la expresión de la proteína quimérica L1
produciría preferencialmente capsómeras, se sometieron los
extractos de las células transfectadas a centrifugación por
gradiente. Las fracciones obtenidas del gradiente fueron analizadas
por el contenido de proteína L1 por medio de transferencias de
Western y de la formación de VLP a través de microscopía
electrónica. Los resultados se observan en la Tabla 1.
La proteína intacta HPV L1, así como los
productos de expresión HPV 16 L1\Delta310 y HPV 16 L1\DeltaC,
se observó que cada uno de ellos produce capsómeras y partículas
tipo virus en iguales proporciones. Cuando las secuencias de
codificación E7 fueron insertadas dentro del vector HPV 16
L1\Delta310, únicamente las proteínas de fusión que incluían a
los aminoácidos producidos 1 a 50 de E7 dieron lugar a la formación
detectable de capsómeras.
Cuando el AND que codifica a E7 fue insertado
dentro del vector HPV 16 L1\DeltaC, se encontró que todas las
proteínas de fusión producían capsómeras; las proteínas quiméricas
que incluyen los residuos aminoácidos 40-98 de E7
produjeron el nivel más alto de estructuras capsómeras
exclusivamente. Las proteínas quiméricas que incluyen a los
aminoácidos 1-98 y 25-75 de E7
produjeron ambas capsómeras en forma predominante, aunque también
se observó la formación de partículas tipo virus. La proteína
quimérica que incluye a los aminoácidos 1-60 de E7
resultó en niveles casi iguales de capsómeras y en la producción de
partículas tipo virus.
Cuando se insertaron las secuencias de E7 dentro
del vector HPV 16 L1\Delta*C vector, se observó que todas las
proteínas de fusión producían capsómeras. La inserción de ADN que
codifica a los residuos 1-52. 1-55,
y 1-60 de E7 produjo el nivel más alto de
capsómeras, pero se observaron niveles iguales en la producción de
partículas tipo virus. Mientras que la inserción de ADN que codifica
a los residuos 1-65, 1-70.
25-75, 40-98, y
1-98 de E7 resultó en niveles comparativamente más
bajos o en niveles indetectables de cápside, se produjeron
capsómeras en cantidades altas.
(continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Las células High Five de Trichopulsia ni
(TN) se desarrollaron hasta una densidad aproximadamente de 2 x
10^{6} células/ml en medio libre de suero Ex-Cell
405 (JRH Biosciences). Se precipitaron aproximadamente 2 x 10^{8}
células por medio de centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos,
se las resuspendió en 20 ml de medio, y se las infectó con
baculovirus recombinantes con una m.o.i de 2 a 5 durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de la adición de 200 ml de medio, se
sembraron las células en placa y se las incubó durante 3 a 4 días a
27ºC. Después de la incubación, se recogieron las células, se las
precipitó y resuspendió en 10 ml de amortiguador de extracción.
Se llevaron a cabo las siguientes etapas a 4ºC.
Se sonicaron las células durante 45 segundos a 60 watts y el lisado
celular resultante fue centrifugado a 10.000 rpm en un rotor Sorval
SS34. Se removió el sobrenadante y se lo guardó mientras se
resuspendía el precipitado resultante en 6 ml de amortiguador para
extracción, sonicado durante 3 segundos adicionales a 60 watts, y
se lo centrifugó nuevamente. Se combinaron los dos sobrenadantes,
se los colocó en capas sobre un gradiente en dos etapas que contenía
14 ml de sacarosa al 40% en la parte suprior de 8 ml de una
solución CsCl (4,6 g de CsCl por 8 ml en amortiguador para
extracción), y se centrifugó en un rotor de contenedores
basculantes Sorval AH629 durante 2 horas a 27.000 rpm y a 10ºC. La
región de interfase entre el CsCl y la sacarosa, junto con la capa
completa de CsCl fueron recolectadas en tubos Quickseal de 13,4 ml
(Beckman) y se añadió amortiguador para extracción para ajustar el
volumen a 13,4 ml. Se centrifugaron las muestras durante la noche a
50.000 rpm y a 20ºC en un rotor Beckman 70 TI. Se fraccionaron los
gradientes (1 ml por fracción) haciéndole punción a los tubos en la
parte superior y en la parte inferior con una aguja calibre 21. Se
recolectaron las fracciones de cada tubo y se analizaron 2,5 \mul
de cada fracción por medio de un gel de
poliacrilamida-SDS al 10% y transferencias de
Western utilizando un anticuerpo anti-HPV16L1.
Se separaron las partículas tipo virus y las
capsómeras de las fracciones identificadas anteriormente por medio
de sedimentación sobre gradientes de sacarosa entre el 10 y el 50%.
Se recolectaron las fracciones poco de los gradientes de CsCl y se
las dializó durante 2 horas contra HEPES 5 mM (pH 7,5). Se utilizó
la mitad del dializado para producir capsómeras desarmando las VLP
intactas durante noche por medio de la adición de EDTA
(concentración final 50 mM), EGTA (50 mM), DTT (30 mM), NaCl (100
mM), y Tris/HCl, pH 8,0 (10 mM). Como control, se añadieron
únicamente NaCl y Tris/HCl a la otra mitad.
Para el análisis de las capsómeras producidas a
partir de las VLP desarmadas, se añadieron EDTA, EGTA, y DTT
(concentración final 5 mM cada una) a los cojines de sacarosa que
fueron centrifugados a 250.000 x g durante 2 a 4 horas a 4ºC. Se
recolectaron las fracciones por medio de la punción de los tubos por
la parte inferior. Se analizó entonces una dilución 1:10 de cada
fracción por medio de la captura de antígeno por ELISA.
Los ratones Balb/c se inmunizan en forma
subcutánea tres veces, cada cuatro semanas aproximadamente con 60
\mug de capsómeras quiméricas de HPV mezcladas 1:1 con Adyuvantes
incompletos de Freund en un volumen total de 100 \mul. Seis
semanas después de la tercera inmunización, se sacrifican los
ratones y se recolecta la sangre por medio de punción cardiaca.
Las placas de microtitulación (Dynatech) se
recubren durante la noche con 50 \mul de péptido E701 [Muller y
colaboradores, 1982] a una concentración de 10 \mug/ml en PBS. Los
pozos se bloquean durante dos horas a 37ºC con 100 \mul de
amortiguador que contiene BSA al 5% y Tween 20 en PBS al 0,05% y se
los lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. Después
del tercer lavado, se añaden 50 \mul de suero diluido 1:5000 en
BSA/Tween 20/PBS a cada pozo y se lleva acabo una incubación durante
1 hora. Se lavan nuevamente las placas como anteriormente y se
añaden 50 \mul de conjugado de peroxidasa antirratón de cabra a
una dilución 1:5000. Después de 1 hora, se lavan las placas y se
las colorea utilizando sustrato ABTS (0,2 mg/ml, ácido
2,2'-Azino-bis(3-etilbenzhiazolina-\beta-sulfónico
en amortiguador de fosfato-acetato de Na 0,1 M (pH
4,2) con 4 \mul de H_{2}O_{2} al 30% por 10 ml). La extinción
se midió después de 1 hora a 490 nm en un lector de placas
automatizado de Dynatech.
Para permitir la cuantificación relativa de
partículas tipo virus y de capsómeras en fracciones de gradientes
de CsCl, se utilizó un ELISA de captura de antígeno. Las placas de
microtitulación se recubrieron durante la noche con 50 \mul/pozo
de una dilución 1:500 (concentración final de 2 \mug por ml, en
PBS) con una proteína A purificada de anticuerpo monoclonal de
ratón inmunoespecífico para HPV 16 L1 (anticuerpos 25/C. MM07 y
Ritti 1 se obtuvieron a partir de ratones inmunizados con las VLP
del HPV 16). Las placas se bloquearon con leche al 5%/PBS durante 1
hora y se añadieron 50 \mul de fracciones de gradientes en CsCl
durante 1 hora a 37ºC utilizando una dilución 1:300 (en leche al
5%/PBS). Después de tres lavados con PBS/Tween 20 al 0,05%, se
añadieron 50 \mul de un antisuero policlonal de conejo (dilución
1:3000 en leche/PBS), creado contra las VLP del HPV 16 y se
incubaron las placas a 37ºC durante 1 hora. Se lavaron las placas
nuevamente y se incubaron adicionalmente con 50 \mul de un
conjugado de peroxidasa anticonejo de cabra (Sigma) diluido 1:5000
en PBS que contenía leche al 5% durante 1 hora. Después del lavado
final, se colorearon las placas con sustrato ABTS durante 30 minutos
y se midió la extinción a 490 nm en un lector de placas
automatizado de Dynatech. Como control negativo, el ensayo incluyó
también pozos recubiertos únicamente con PBS.
Para analizar los anticuerpos monoclonales por
la especificidad capsómera, las VLP con EDTA/DTT para desarmar
partículas. Las preparaciones de partículas tratadas fueron
analizadas en el ELISA para captura de antígeno y se compararon las
lecturas con controles no tratados. Para el desarmado, se incubaron
40 \mul de las VLP durante la noche a 4ºC en 500 \mul de
amortiguador de rotura que contiene DTT 30 mM, EGTA 50 mM, EDTA 60
mM, NaCl 100 mM, y Tris/HCl 100 mM, pH 8,0. Las alícuotas de
partículas tratadas y no tratadas fueron utilizadas en el ELISA de
captura anterior en una dilución 1:20-1:40.
Con el propósito de determinar el grado en el
cual las vacunas quiméricas que contienen capsómera evocan la
producción de anticuerpos neutralizantes, se lleva acabo un ensayo
de inhibición de hemoaglutinación como se describe brevemente más
adelante. Este ensayo se basa en observaciones previas de que las
partículas tipo virus son capaces de hemoaglutinar los glóbulos
rojos.
Los ratones se inmunizan con cualquier vacuna
quimérica capsómera y se recolecta el suero como se describió
anteriormente en el Ejemplo 4. Como controles positivos, se
analizaron las partículas tipo virus HPV 16 L1 (las VLP) y las VLP
de PV1 bovino (BPV) L1 en paralelo con una preparación capsómera
quimérica. Para establecer una línea base positiva, las VLP de
HPV16 o de BPV1 son incubadas primero con o sin suero recolectado a
partir de ratones inmunizados después de lo cual se añaden glóbulos
rojos. El grado en el cual la incubación previa con sueros de ratón
inhibe la hemoaglutinación de glóbulos rojos es una indicación de la
capacidad de neutralización de los sueros de ratón. Se repitieron
entonces los experimentos utilizando capsómeras quiméricas con el
propósito de determinar el efecto neutralizador de los sueros de
ratón sobre la vacuna. Más adelante se describe un breve protocolo
para el ensayo de inhibición de hemoaglutinación.
Se añadieron cien microlitros de heparina (1000
usp unidades/ml) a 1 ml de sangre fresca de ratón. Se lavaron tres
veces los glóbulos rojos con PBS seguido por centrifugación y
resuspensión en un volumen de 10 ml. Luego, se resuspendieron los
eritrocitos en 0,5 ml de PBS y se los almacenó a 4ºC hasta por tres
días. Para el ensayo de hemaglutinina, se utilizaron 70 \mul de
la suspensión por pozo sobre una placa de 96 pozos.
Las alícuotas de capsómera quimérica de los
gradientes en CsCl se dializaron durante una hora contra Hepes 10
mM (pH 7,5) y se añadieron 100 \mul de diluciones seriales a la
mitad en PBS a eritrocitos de ratón en placas de microtitulación de
fondo redondo de 96 pozos que son incubadas además durante
3-16 horas a 4ºC. Para la inhibición de la
hemoaglutinación, las capsómeras se incubaron con diluciones de
anticuerpos en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente y
añadidos luego a los eritrocitos. El nivel de hemoaglutinación de
eritrocitos, y por lo tanto la presencia de anticuerpos
neutralizantes, se determina por medio de métodos estándar.
En los resultados preliminares, se observó que
los sueros de ratón generados contra capsómeras quiméricas que
contienen proteína HPV16L1\DeltaC en asociación con los residuos
aminoácidos 1-98 de E7 inhiben la hemoaglutinación
por las VLP de HPV16, pero no por las VLP de BPV. Los sueros de
ratón fueron por lo tanto positivos para los anticuerpos
neutralizantes contra las VPL humanas y esta neutralización
diferencial fue muy probablemente el resultado de la especificidad
del anticuerpo por los epítopos contra los cuales se erigieron los
anticuerpos.
Se espera que ocurran numerosas modificaciones y
variaciones en la invención como se la expone en los ejemplos
ilustrativos anteriores para aquellos capacitados en el arte.
Consecuentemente, únicamente aquellas limitaciones que aparecen en
las reivindicaciones anexas deberían afectar a la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Formulaciones de Vacunas que Contienen Capsómeras del Virus de Papiloma Humano y Métodos de Uso
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murria & Borun
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 60606-6402
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA EN QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Williams Jr., Joseph A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.659
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: 27013/34028
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE LAS TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 312-474-6300
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 312-474-0448
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1518 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..1518
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 505 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 297 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..297
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG
\hfill35
\vskip0.800000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC ATTGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC CTTGCAACAA AAGGTTACAA TATTGTAATG GGCC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGATATC TGGTTTCTGA GAACAGATGG GGCAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GATTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCAG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGACAAGCA GAACCGGAC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 294 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..294
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AAGACCAATC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTATGACAT ACATACATTC TATG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACAAGCAG GAATGCATGG AGATACACC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTGAAGC TTATCAATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTGAAGC TTACTTGCAA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG
\hfill47
Claims (16)
1. Una formulación antigénica que
comprende una capsómera del virus de papiloma humano para uso como
vacuna, dicha capsómera comprendiendo una proteína de fusión que
contiene una proteína truncada L1 del virus de papiloma humano
adyacente a los residuos aminoácidos de una segunda proteína dicha
proteína L1 y dichos aminoácidos de dicha segunda proteína
posicionados pata inhibir la formación de una partícula tipo virus,
dicha formulación evocando una respuesta inmune que neutraliza a los
viriones del virus de papiloma humano.
2. Una formulación antigénica que
comprende una capsómera del virus de papiloma humano para uso como
una vacuna, dicha capsómera comprendiendo una proteína truncada L1
del virus de papiloma humano que tiene una supresión de uno o más
residuos aminoácidos necesarios para la formación de una partícula
tipo virus, dicha formulación evocando una respuesta inmune que
neutraliza a los viriones del virus de papiloma humano.
3. La formulación antigénica de acuerdo a
la reivindicación 2 en donde dicha capsómera comprende una
proteína de fusión que contiene una proteína truncada L1 del virus
de papiloma humano adyacente a residuos aminoácidos de una segunda
proteína.
4. La formulación antigénica de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde la proteína
está codificada en el genoma de un virus de papiloma humano
seleccionado del grupo que consiste de HPV6, HPV11, HPV16, HPV18,
HPV33, HPV35, y HPV45.
5. La formulación antigénica de acuerdo a
la reivindicación 4 en donde el virus de papiloma humano es
HPV16.
6. La formulación antigénica de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 5 en donde los
residuos aminoácidos carboxi terminales son suprimidos de la
proteína L1.
7. La formulación antigénica de acuerdo a
la reivindicación 6 en donde de 1 a 34 residuos aminoácidos carboxi
terminales son suprimidos de la proteína L1.
8. La formulación antigénica de acuerdo a
la reivindicación 7 en donde 34 residuos aminoácidos carboxi
terminales son suprimidos de la proteína L1.
9. La formulación antigénica de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 5 en donde los
residuos aminoácidos amino terminales son suprimidos de la proteína
L1.
10. La formulación antigénica de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 5 en donde los
residuos aminoácidos internos son suprimidos de la proteína L1.
11. La formulación antigénica de acuerdo a la
reivindicación 10 en donde los residuos aminoácidos suprimidos de
la proteína L1 comprenden una señal nuclear de localización.
12. La formulación antigénica de acuerdo a
las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde los residuos aminoácidos de
la segunda proteína se derivan de una proteína del HPV.
13. La formulación antigénica de acuerdo a la
reivindicación 12, en donde la proteína del HPV es una proteína
temprana del HPV.
14. La formulación antigénica de acuerdo a la
reivindicación 12, en donde la proteína temprana del HPV se
selecciona del grupo que consiste de E1, E2, E3, E4, E5, E6, y
E7.
15. El uso de la formulación de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la producción de una
composición farmacéutica para el tratamiento de una infección
causada por el HPV y por los desordenes relacionados con el
mismo.
16. El uso de la formulación de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la producción de una
composición farmacéutica para la prevención de una infección causada
por el HPV y por los desordenes relacionados con el mismo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US944368 | 1997-10-06 | ||
| US08/944,368 US6228368B1 (en) | 1997-10-06 | 1997-10-06 | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2280104T3 true ES2280104T3 (es) | 2007-09-01 |
Family
ID=25481268
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06270010T Expired - Lifetime ES2337492T3 (es) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Formulaciones y formas de uso de la vacuna capsomero de virus de papiloma. |
| ES98950930T Expired - Lifetime ES2280104T3 (es) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Formulaciones de vacunas que contienen capsomeras del virus de papiloma humano y metodos de uso. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06270010T Expired - Lifetime ES2337492T3 (es) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Formulaciones y formas de uso de la vacuna capsomero de virus de papiloma. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6228368B1 (es) |
| EP (2) | EP1690941B1 (es) |
| JP (3) | JP4520034B2 (es) |
| KR (1) | KR20010030969A (es) |
| AT (2) | ATE349536T1 (es) |
| AU (1) | AU9684698A (es) |
| BR (1) | BR9814606A (es) |
| CA (1) | CA2305382A1 (es) |
| CY (1) | CY1105963T1 (es) |
| CZ (1) | CZ302351B6 (es) |
| DE (2) | DE69841342D1 (es) |
| DK (1) | DK1021547T3 (es) |
| ES (2) | ES2337492T3 (es) |
| HU (1) | HU225893B1 (es) |
| IL (3) | IL135528A0 (es) |
| NO (2) | NO328128B1 (es) |
| NZ (1) | NZ503830A (es) |
| PL (1) | PL195332B1 (es) |
| PT (1) | PT1021547E (es) |
| TR (1) | TR200001842T2 (es) |
| WO (1) | WO1999018220A1 (es) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2264563T3 (es) * | 1994-10-07 | 2007-01-01 | Loyola University Of Chicago | Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion. |
| WO1998054325A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | The Government Of The United States Of America,Re Presented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human frp and fragments thereof including methods for using them |
| US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
| US7494658B2 (en) * | 1998-02-20 | 2009-02-24 | Medigene Ag | Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| US7182947B2 (en) * | 1998-02-20 | 2007-02-27 | Medigene Ag | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs |
| CA2229955C (en) * | 1998-02-20 | 2003-12-09 | Medigene Gmbh | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| US20020039584A1 (en) * | 1998-02-20 | 2002-04-04 | Medigene Ag | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
| GB9806666D0 (en) * | 1998-03-27 | 1998-05-27 | Stanley Margaret | Antigen preparation and use |
| AUPP765398A0 (en) | 1998-12-11 | 1999-01-14 | University Of Queensland, The | Treatment of papillomavirus infections |
| DE19905883C2 (de) * | 1999-02-11 | 2001-05-23 | Deutsches Krebsforsch | Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV |
| FI107932B (fi) * | 1999-02-16 | 2001-10-31 | Mikael Paronen | Polymeerikalvo ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| US6551597B1 (en) * | 1999-03-18 | 2003-04-22 | President & Fellows Of Harvard College | Vaccine compositions for human papillomavirus |
| DE19925234A1 (de) * | 1999-06-01 | 2000-12-14 | Medigene Ag | Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE19925199A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Medigene Ag | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE19925235A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Medigene Ag | Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| ATE284898T1 (de) * | 1999-08-25 | 2005-01-15 | Merck & Co Inc | Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind |
| DE60041889D1 (de) * | 1999-12-09 | 2009-05-07 | Medimmune Inc | In-vitro-methode zur zerlegung und zum wiederzusammenfügen von papillomavirusartigen partikeln |
| US6600018B1 (en) * | 2000-04-10 | 2003-07-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Secreted frizzled related protein, sFRP, fragments and methods of use thereof |
| US6908613B2 (en) * | 2000-06-21 | 2005-06-21 | Medimmune, Inc. | Chimeric human papillomavirus (HPV) L1 molecules and uses therefor |
| DE10055545A1 (de) * | 2000-11-09 | 2002-07-25 | Deutsches Krebsforsch | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen |
| DE10059630A1 (de) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Medigene Ag | Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor |
| AU2002367977B2 (en) | 2001-08-13 | 2008-06-19 | University Of Rochester | Transcutaneous immunization against papillomavirus with papillomavirus virus-like particles |
| CN100424094C (zh) * | 2001-08-31 | 2008-10-08 | 开普敦大学 | 药物组合物,制备和分离其的方法,及其在制备预防性治疗损害和癌的药物中的应用 |
| US20040063188A1 (en) * | 2002-02-14 | 2004-04-01 | Novavax, Inc. | Kit for treating gastrointestinal tract |
| PT1506222E (pt) † | 2002-05-17 | 2009-06-12 | Univ Cape Town | Proteínas l1 quiméricas do papilomavírus humano 16 incluindo um péptido l2, partículas semelhantes a vírus preparadas a partir daquelas e um método de preparação das partículas |
| US8101189B2 (en) | 2002-07-05 | 2012-01-24 | Folia Biotech Inc. | Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them |
| ES2431963T3 (es) | 2002-07-05 | 2013-11-28 | Folia Biotech Inc. | Partícula viral adyuvante |
| SE0202897D0 (sv) * | 2002-10-01 | 2002-10-01 | Quantovir Ab | Method and kit for quantitative and qualitative determination of human papillomavirus |
| SE0202896D0 (sv) * | 2002-10-01 | 2002-10-01 | Quantovir Ab | Method for estimating the risk of carcinoma development |
| WO2004062584A2 (en) * | 2003-01-10 | 2004-07-29 | Regents Of The University Of Colorado | Therapeutic and prophylactic vaccine for the treatment and prevention of papillomavirus infection |
| US7172773B2 (en) * | 2004-04-26 | 2007-02-06 | Renew Life Inc. | Food supplement formulation |
| KR101187625B1 (ko) * | 2004-09-10 | 2012-10-05 | 도쿠리츠다이가쿠호징 가나자와다이가쿠 | 경구 투여 백신 |
| US7354719B2 (en) | 2004-12-08 | 2008-04-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US7314630B2 (en) * | 2005-01-07 | 2008-01-01 | Yao-Xiong Hu | Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified |
| CN101570571B (zh) | 2007-04-29 | 2012-07-11 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 截短的人乳头瘤病毒18型l1蛋白 |
| BRPI0811016B1 (pt) * | 2007-04-29 | 2021-09-21 | Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. | Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 16 |
| DK2154149T3 (da) * | 2007-05-29 | 2019-10-14 | Univ Xiamen | En trunkeret l1-protein af human papillomavirus 6 |
| US8507811B2 (en) * | 2009-02-02 | 2013-08-13 | Apple Inc. | Touch sensor panels with reduced static capacitance |
| EP2377879A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-19 | Deutsches Krebsforschungszentrum | N-terminal HPV E7 fusion proteins |
| US10413603B2 (en) * | 2014-06-19 | 2019-09-17 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for improved human papilloma virus constructs |
| WO2016026919A1 (en) * | 2014-08-20 | 2016-02-25 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Vaccines and manufacturing methods for treatment and prevention of disease |
| CN114127099B (zh) * | 2019-07-19 | 2024-04-19 | 神州细胞工程有限公司 | 嵌合的人乳头瘤病毒6型l1蛋白 |
| US11382700B2 (en) | 2020-05-08 | 2022-07-12 | Globus Medical Inc. | Extended reality headset tool tracking and control |
| US11510750B2 (en) | 2020-05-08 | 2022-11-29 | Globus Medical, Inc. | Leveraging two-dimensional digital imaging and communication in medicine imagery in three-dimensional extended reality applications |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE332973T1 (de) | 1991-07-19 | 2006-08-15 | Univ Queensland | Polynukleotidabschnitt des hpv16-genoms |
| GB9207701D0 (en) | 1992-04-08 | 1992-05-27 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus e7 protein |
| PT647140E (pt) | 1992-06-25 | 2007-12-27 | Univ Georgetown | Vacinas de papilomavírus |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| US5618536A (en) * | 1992-09-03 | 1997-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric papillomavirus-like particles |
| CA2157932C (en) * | 1993-03-09 | 2011-10-11 | Robert C. Rose | Production of human papillomavirus capsid protein and virus-like particles |
| AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
| DE4447664C2 (de) | 1994-10-07 | 1999-04-15 | Lutz Prof Dr Gissmann | Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung |
| ES2264563T3 (es) * | 1994-10-07 | 2007-01-01 | Loyola University Of Chicago | Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion. |
| JP3413020B2 (ja) * | 1996-07-17 | 2003-06-03 | 株式会社東芝 | 半導体装置の製造方法 |
| DE19712541C1 (de) | 1997-03-25 | 1998-11-05 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| CA2295316C (en) * | 1997-07-03 | 2007-06-26 | University Of Colorado, University Technology Corporation | Homogeneous human papilloma virus capsomere containing compositions, methods for manufacture, and the use thereof as diagnostic, prophylactic or therapy |
| JP3559048B2 (ja) | 1997-08-26 | 2004-08-25 | 日本精工株式会社 | 転がり軸受の製造方法 |
| US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
-
1997
- 1997-10-06 US US08/944,368 patent/US6228368B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-06 BR BR9814606-8A patent/BR9814606A/pt active Search and Examination
- 1998-10-06 CZ CZ20001244A patent/CZ302351B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-06 JP JP2000515014A patent/JP4520034B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-06 EP EP06270010A patent/EP1690941B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 AT AT98950930T patent/ATE349536T1/de active
- 1998-10-06 EP EP98950930A patent/EP1021547B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 DE DE69841342T patent/DE69841342D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 KR KR1020007003721A patent/KR20010030969A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-10-06 PT PT98950930T patent/PT1021547E/pt unknown
- 1998-10-06 DE DE69836753T patent/DE69836753T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 TR TR2000/01842T patent/TR200001842T2/xx unknown
- 1998-10-06 WO PCT/US1998/020965 patent/WO1999018220A1/en active Search and Examination
- 1998-10-06 ES ES06270010T patent/ES2337492T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 AT AT06270010T patent/ATE449852T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-06 PL PL98339735A patent/PL195332B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-10-06 DK DK98950930T patent/DK1021547T3/da active
- 1998-10-06 NZ NZ503830A patent/NZ503830A/xx unknown
- 1998-10-06 ES ES98950930T patent/ES2280104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-06 CA CA002305382A patent/CA2305382A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-06 HU HU0004360A patent/HU225893B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-10-06 IL IL13552898A patent/IL135528A0/xx active IP Right Grant
- 1998-10-06 AU AU96846/98A patent/AU9684698A/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-04-06 NO NO20001768A patent/NO328128B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-04-06 IL IL135528A patent/IL135528A/en not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-04-29 US US10/042,526 patent/US20050031636A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-02-21 US US11/358,285 patent/US7371391B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-29 CY CY20071100114T patent/CY1105963T1/el unknown
-
2008
- 2008-04-01 IL IL190554A patent/IL190554A0/en unknown
- 2008-04-17 US US12/105,013 patent/US7754430B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-05-04 NO NO20091761A patent/NO20091761L/no not_active Application Discontinuation
- 2009-12-24 JP JP2009292021A patent/JP5296665B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-04-16 JP JP2013085666A patent/JP2013147507A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2280104T3 (es) | Formulaciones de vacunas que contienen capsomeras del virus de papiloma humano y metodos de uso. | |
| ES2213754T3 (es) | Particulas quimericas de tipo papilomavirus. | |
| US6352696B1 (en) | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs | |
| US6649167B2 (en) | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs | |
| US7182947B2 (en) | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs | |
| ES2323634T3 (es) | Proteinas quimericas l1 del virus del paliloma humano 16 que contienen un peptido l2, particulas tipo virus preparadas a partir de estas proteinas y un metodo para preparar las particulas. | |
| US7494658B2 (en) | Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs | |
| ES2237913T3 (es) | Medicamento para prevenir o tratar tumores especificos del virus del papiloma. | |
| AU2003200653B2 (en) | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use | |
| MXPA00003358A (es) | Formulaciones de vacuna del capsomero del virus de papiloma y metodo de uso.?? | |
| AU2007201791A1 (en) | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |