PT1021547E - Formulações da vacinas com capsomeros do vírus papiloma e métodos de utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"FORMULAÇÕES DE VACINAS COM CAPSÓMEROS DO VÍRUS PAPILOMA E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a formulações de vacinas compreendendo proteínas do vírus papiloma, na forma de proteínas de fusão, proteínas truncadas ou proteínas de fusão truncadas. A invenção abrange suplementarmente métodos para produzir capsómeros das formulações, bem como métodos profilácticos e terapêuticos para a sua utilização.

CONTEXTO

Crê-se que infecções com certas estirpes de alto risco de vírus papiloma genitais em humanos (HPV) - por exemplo, HPV 16, 18 ou 45 - são o principal factor de risco para a formação de tumores malignos do tracto anogenital. Das malignidades possíveis, o carcinoma cervical é, de longe, o mais frequente: de acordo com uma estimativa da Organização Mundial de Saúde (OMS), ocorrem anualmente quase 500 000 novos casos da doença. Devido à frequência da ocorrência desta patologia, a relação entre infecção pelo HPV e carcinoma cervical tem sido extensamente examinada, conduzindo a numerosas generalizações.

Por exemplo, é conhecido que lesões precursoras de neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) são causadas por infecções com o vírus papiloma [Crum, New Eng. J. Med. 310: 880-883 (1984)]. DNA dos genomas de certos tipos do HPV, incluindo, por exemplo, as estirpes 16, 18, 33, 35 e 45, foi detectado em mais de 95% das biopsias tumorais de pacientes com esta perturbação, bem como em linhas de 2 células primárias cultivadas a partir dos tumores. Verificou-se que aproximadamente 50 até 70% das células de tumores CIN submetidas a biopsia incluem DNA derivado apenas do HPV 16.

Os produtos proteicos dos genes iniciais E6 e E7 do HPV 16 e HPV 18 foram detectados em linhas de células de carcinoma cervical, bem como em queratinócitos humanos transformados in vitro [Wettstein et al., em "PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CÂNCER" Pfister (Editor), CRC Press: Boca Raton, FL 1990, páginas 155-179], e uma percentagem significativa de pacientes com carcinoma cervical tem anticorpos anti-E6 ou anti-E7. Verificou-se que as proteínas E6 e E7 participam na indução da síntese de DNA celular em células humanas, transformação de queratinócitos humanos e outros tipos de células, e formação de tumores em ratinhos transgénicos [Arbelt et al., J. Virol. 6_8: 4358-4364 (1994); Auewarakul et al., Mol. Cell. Biol. 1_4: 8250-8258 (1994); Barbosa et al., J. Virol. 6_5: 292-298 (1991); Kaur et al., J. Gen. Virol. 7_0: 1261-1266 (1989); Schlegel et al., EMBO J. T_: 3181-3187 (1988)]. A expressão constitutiva das proteínas E6/E7 parece ser necessária para manter o estado transformado de tumores positivos para o HPV.

Apesar da capacidade de algumas estirpes do HPV para induzir fenótipos neoplásticos in vivo e in vitro, outros tipos do HPV causam verrugas genitais benignas, como condylomata acuminata, e só raramente são associados a tumores malignos [Ikenberg, em Gross. et al. (editores) "GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS" Springer Verlag: Berlim, páginas 87-112]. Estirpes de baixo risco deste tipo incluem, por exemplo, HPV 6 e 11. 3

Muito frequentemente, os vírus papiloma genitais são transmitidos entre humanos durante as relações sexuais, o que, em muitos casos, conduz a infecção persistente na membrana mucosa anogenital. Se bem que esta observação sugira que a infecção primária induz uma resposta imunológica inadequada ou que o vírus desenvolveu a capacidade para evitar a vigilância imunológica, outras observações sugerem que o sistema imunológico está activo durante a manifestação primária, bem como durante a progressão maligna de infecções pelos vírus papiloma [Altmann et al., em "VIRUSES AND CÂNCER", Minson et al. (editores) Cambridge University Press (1994) páginas 71-80] .

Por exemplo, a manifestação clínica de infecção primária pelo vírus papiloma de coelho e bovino pode ser prevenida por vacinação com extractos de verrugas ou proteínas estruturais virais [Altmann et al., supra; Campo, Curr. Top. In Microbiol. and Iwmunol. 186: 255-266 (1994); Yindle e Frazer, Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186: 217-253 (1994)]. Roedores previamente vacinados com recombinantes de vacínia que codificam as proteínas iniciais E6 ou E7 do HPV 16, ou com péptidos E6 ou E7 sintéticos, são igualmente protegidos da formação de tumores após inoculação de células autólogas transformadas pelo HPV 16 [Altmann et al., supra; Campo et al., supra; Yindle e Frazer et al., supra]. A regressão de verrugas pode ser induzida pela transferência de linfócitos de animais regressores após infecção por vírus papiloma de animais. Por fim, em pacientes com imunossupressão, tais como, por exemplo, receptores de transplantes de órgãos ou indivíduos infectados com o HIV, a incidência de verrugas genitais, CIN e cancro anogenital é elevada. 4 0 artigo Virology 234, 1997, páginas 93-111, revela métodos para produzir partículas quiméricas do tipo vírus papiloma que consistem em proteínas de fusão de LI e E7 do HPV 16. Li et ai. (1997) J. Virology 71, 2988-2995, revelam a obtenção de capsómeros por clivagem com tripsina. Não foram descritas, até à data, vacinações para HPV compreendendo a proteína LI tardia do vírus papiloma humano na forma de capsómeros que são adequadas para fins profilácticos e terapêuticos. Uma vez que a proteína LI não está presente em lesões genitais malignas, a vacinação com a proteína LI não tem nenhum potencial terapêutico para estes pacientes. A construção de proteínas quiméricas compreendendo resíduos de aminoácidos da proteína LI e, por exemplo, da proteína E6 ou E7, que dão origem a capsómeros quiméricos, combina as funções profiláctica e terapêutica de uma vacina. Em consequência, seria particularmente desejável um método para a produção de alto nível de capsómeros quiméricos, tendo em vista as possíveis vantagens oferecidas por essa vacina para intervenção profiláctica e terapêutica.

Assim, é necessário na área fornecer formulações de vacinas que possam prevenir ou tratar infecções causadas pelo HPV. Métodos para produzir formulações de vacinas que ultrapassem problemas que se sabe, na área, estarem associados à expressão e purificação de proteínas do HPV recombinantes seriam manifestamente úteis para tratar a população de indivíduos já infectados com o HPV, bem como úteis para imunizar a população de indivíduos susceptíveis a infecção pelo HPV.

RESUMO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção fornece formulações de vacinas terapêuticas e profilácticas compreendendo capsómeros quiméricos de papiloma humano. A invenção também proporciona métodos terapêuticos para tratar pacientes infectados com um HPV, bem como métodos profilácticos para prevenir infecção pelo HPV num indivíduo susceptível. Também são contemplados métodos de produção e purificação de capsómeros e proteínas da invenção.

Num aspecto da invenção são consideradas vacinações profilácticas para a prevenção de infecção pelo HPV que incorporam as proteínas estruturais LI e L2 do vírus papiloma. 0 desenvolvimento de uma vacina deste tipo depara-se com obstáculos importantes porque os vírus papiloma não podem ser propagados, em títulos adequados, em culturas de células ou outros sistemas experimentais de modo a fornecerem as proteínas virais em quantidade suficiente para uma produção económica de vacinas. Além disso, as metodologias recombinantes para expressar as proteínas nem sempre são directas e resultam muitas vezes em baixo rendimento proteico. Recentemente foram descritas partículas do tipo vírus (VLPs), de constituição semelhante a estruturas capsídicas virais, que são formadas em células de insecto Sf-9 por expressão das proteínas virais LI e L2 (ou LI isoladamente) utilizando vírus vacínia ou baculovírus recombinantes. As VLPs podem ser purificadas muito simplesmente por centrifugação em gradientes de CsCl ou sucrose [Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 99 : 12180-12814 (1992); Kirnbaurer et al., J. Virol. 6 7: 6929-6936 (1994); Proso et al., J. Virol. 6714: 1936-1944 (1992); Sasagawa et al., Virology 2016: 126-195 (1995);

Volpers et al., J. Virol. 6_9: 3258-3264 (1995); Zhou et al., J. Gen. Virol. 74: 762-769 (1993); Zhou et al., 6

Virology 185: 251-257 (1991)]. A patente WO 93/02184 descreve um método em que partículas do tipo vírus papiloma (VLPs) são utilizadas para aplicações de diagnóstico ou como vacina contra infecções causadas pelo vírus papiloma. A patente WO 94/00152 descreve a produção recombinante da proteína LI que imita o epítopo neutralizador conformacional em viriões de papiloma humano e de animais.

Noutro aspecto da invenção, são fornecidas vacinações terapêuticas para atenuar complicações, por exemplo, de carcinoma cervical ou lesões precursoras resultantes de infecção pelo vírus papiloma e, assim, representam uma alternativa à intervenção profiláctica. Vacinações deste tipo podem compreender proteínas iniciais do vírus papiloma, principalmente E6 ou E7, que são expressas nas células infectadas de modo persistente. Presume-se que, após a administração de uma vacinação deste tipo, células T citotóxicas possam ser activadas contra células infectadas de modo persistente em lesões genitais. A população-alvo para a intervenção terapêutica consiste em pacientes com lesões genitais pré-malignas ou malignas associadas ao HPV. A candidatura de patente PCT WO 93/20844 revela que a proteína inicial E7, e respectivos fragmentos antigénicos, do vírus papiloma de HPV ou BPV é terapeuticamente eficaz na regressão, mas não na prevenção, de tumores causados pelo vírus papiloma em mamíferos. Se bem que proteínas iniciais do HPV tenham sido produzidas por expressão recombinante em E. coli ou tipos adequados de células eucarióticas, a purificação das proteínas recombinantes é difícil devido à baixa solubilidade inerente e procedimentos complexos de purificação que geralmente requerem uma combinação de passos, incluindo cromatografia 7 de permuta iónica, filtraçao em gel e cromatografia de afinidade.

De acordo com a presente invenção são fornecidas formulações de vacinas compreendendo capsómeros do vírus papiloma que compreendem qualquer uma das seguintes: (i) uma proteína virai truncada; (ii) uma proteína virai truncada expressa como uma proteína de fusão que é constituída, em parte, por resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína, ou (iii) alguma combinação dos dois tipos de proteínas. De acordo com a invenção, são fornecidas formulações de vacinas compreendendo capsómeros do vírus papiloma bovino (BPV) e do virus papiloma humano. Capsómeros preferidos do vírus bovino compreendem proteínas do vírus papiloma bovino de tipo I. Capsómeros preferidos do vírus humano compreendem proteínas de qualquer uma das estirpes do vírus papiloma humano HPV6, HPVll, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 e HPV45. As formulações de vacinas mais preferidas compreendem capsómeros contendo proteínas do HPV16.

Num aspecto da invenção, são fornecidas formulações de vacinas com capsómeros que são compreendidas por proteínas virais truncadas com uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos necessários para a formação de uma partícula do tipo vírus. É preferido que a deleção de aminoácidos não iniba a formação de capsómeros pela proteína truncada, e é muito preferido que a deleção favoreça a formação de capsómeros. Formulações de vacinas preferidas deste tipo incluem capsómeros compreendidos por proteínas virais LI truncadas com ou sem L2. Capsómeros particularmente preferidos são compreendidos por proteínas LI truncadas. Proteínas truncadas contempladas pela invenção incluem as 8 que têm um ou mais resíduos de aminoácidos detetados do terminal carboxi da proteína, ou um ou mais resíduos de aminoácidos detetados do terminal amino da proteína, ou um ou mais resíduos de aminoácidos deletados de uma região interna (isto é, de nenhum dos terminais) da proteína. Formulações preferidas de vacinas com capsómeros são compreendidas por proteínas truncadas no terminal carboxi. Em formulações que incluem a proteína LI derivada do HPV16, é preferido que estejam deletados desde 1 até 34 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi. Também são contempladas deleções relativamente mais pequenas, que oferecem a vantagem de modificação muito pequena das propriedades antigénicas das proteínas LI e dos respectivos capsómeros formados. No entanto, é muito preferido que sejam deletados 34 resíduos de aminoácidos da sequência Ll, correspondentes aos aminoácidos 472 até 505 do HPV16 apresentada na ID SEQ NO: 2 e codificados pela sequência polinucleotídica correspondente aos nucleótidos 1414 até 1516 da sequência que codifica a Ll do HPV 16 humano apresentada na ID SEQ NO: 1 .

Quando uma formulação de vacina com capsómeros é constituída por proteínas com uma deleção interna, é preferido que a sequência de aminoácidos deletada compreenda a região de localização nuclear da proteína. Na proteína Ll do HPV 16, o sinal de localização nuclear situa-se desde cerca do resíduo de aminoácido 499 até cerca do resíduo de aminoácido 505. Após a expressão de proteínas Ll nas quais foi deletado o NLS, a reunião de estruturas de capsómeros ocorre no citoplasma da célula-hospedeiro. Consequentemente, é possível purificar os capsómeros a partir do citoplasma em vez do núcleo, onde proteínas Ll intactas se reúnem em capsómeros. Os capsómeros que 9 resultam da reunião de proteínas truncadas nas quais sequências de aminoácidos adicionais não substituem as sequências da proteína deletada têm natureza necessariamente não quimérica.

Ainda noutro aspecto da invenção são fornecidas formulações de vacinas com capsómeros compreendendo uma proteína virai truncada expressa como uma proteína de fusão adjacente a resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína. Proteínas virais truncadas preferidas da invenção são as proteínas virais estruturais de papiloma L1 e L2. Os capsómeros constituídos por fusões de proteínas virais truncadas podem ser produzidos utilizando componentes das proteínas LI e L2 em conjunto ou a proteína LI isoladamente. Capsómeros preferidos são os compostos por resíduos de aminoácidos da proteína Ll. Componentes de proteínas virais truncadas das proteínas de fusão incluem os que têm um ou mais resíduos de aminoácidos deletados do terminal carboxi da proteína, ou um ou mais resíduos de aminoácidos deletados do terminal amino da proteína, ou um ou mais resíduos de aminoácidos deletados de uma região interna (isto é, de nenhum dos terminais) da proteína. Formulações preferidas de vacinas com capsómeros são compreendidas por proteínas truncadas no terminal carboxi. Naquelas formulações que incluem a proteína Ll derivada do HPV16, é preferido que estejam deletados desde 1 até 34 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi. Também são contempladas deleções relativamente mais pequenas, que oferecem a vantagem de modificação muito pequena das propriedades antigénicas do componente da proteína Ll da proteína de fusão e dos respectivos capsómeros formados. No entanto, é muito preferido que sejam deletados 34 resíduos de aminoácidos da sequência Ll, correspondentes aos aminoácidos 472 até 505 10 do HPV16 apresentada na ID SEQ NO: 2 e codificados pela sequência polinucleotidica correspondente aos nucleótidos 1414 até 1516 da sequência que codifica a LI do HPV16 humano apresentada na ID SEQ NO: 1. Quando a formulação de vacina for compreendida por capsómeros constituídos por proteínas com uma deleção interna, é preferido que a sequência de aminoácidos deletada compreenda a região, ou sequência, de localização nuclear da proteína.

Os aminoácidos da segunda proteína podem derivar de numerosas fontes, desde que a adição dos resíduos de aminoácidos da segunda proteína à primeira proteína permita a formação de capsómeros. Preferivelmente, a adição dos resíduos de aminoácidos da segunda proteína inibe a capacidade da proteína virai intacta para formar estruturas de partículas do tipo vírus; muito preferivelmente, os resíduos de aminoácidos da segunda proteína promovem a formação de capsómeros. Os resíduos de aminoácidos da segunda proteína podem derivar de numerosas fontes, incluindo resíduos de aminoácidos da primeira proteína. Numa especificação da invenção, a segunda proteína pode ser qualquer antigene de tumor humano, antigene virai ou antigene bacteriano, que é importante na estimulação de uma resposta imunológica em estados de doença neoplástica ou infecciosa. Numa especificação preferida, a segunda proteína também é uma proteína do vírus papiloma. Também é preferido que a segunda proteína seja o produto de expressão de um gene inicial do vírus papiloma. No entanto, também é preferido que a segunda proteína seja seleccionada do grupo que consiste em produtos dos genes iniciais El, E2, E3, E4, E5, E6 e E7 codificados no genoma das estirpes do vírus papiloma HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 ou HPV45. É muito preferido que a segunda proteína seja 11 codificada pelo gene E7 do HPV16, cuja fase de leitura aberta está apresentada na ID SEQ NO: 3. Os capsómeros reunidos a partir de subunidades de proteínas de fusão são aqui referidos como capsómeros quiméricos. Numa especificação, a formulação de vacina da invenção é compreendida por capsómeros quiméricos em que os resíduos de aminoácidos da proteína LI perfazem aproximadamente 50 até 99% do total dos resíduos de aminoácidos da proteína de fusão. Noutra especificação, os resíduos de aminoácidos de LI perfazem aproximadamente 60 até 90% do total dos resíduos de aminoácidos da proteína de fusão; numa especificação particularmente preferida, os aminoácidos de LI constituem aproximadamente 80% dos resíduos de aminoácidos da proteína de fusão.

Numa especificação preferida da invenção, as proteínas das formulações de vacinas são produzidas por metodologias recombinantes. Em formulações compreendendo proteínas virais truncadas, as proteínas podem ser isoladas de fontes naturais na forma de proteínas intactas e serem hidrolisadas in vitro utilizando hidrólise química ou digestão enzimática com qualquer uma de algumas proteases específicas para sítios ou gerais, sendo a proteína truncada subsequentemente modificada de modo a incluir resíduos de aminoácidos adicionais como descrito acima para dar origem a uma proteína de fusão truncada da invenção.

Na produção de capsómeros podem utilizar-se técnicas de biologia molecular recombinante para produzir DNA que codifica a proteína truncada desejada ou a proteína de fusão truncada. Metodologias recombinantes necessárias para produzir um DNA que codifica uma proteína desejada são bem conhecidas e habitualmente praticadas na área. Manuais 12 laboratoriais, por exemplo, Sambrook et al. (editores) "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL" Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, N.I. (1989), e Ausebel et al. (editores) "PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" John Wiley & Sons, Inc. (1994-1997), descrevem em pormenor técnicas necessárias para efectuar as manipulações de DNA requeridas. Para a produção em larga escala de capsómeros quiméricos, a expressão de proteínas pode ser efectuada utilizando vectores virais ou eucarióticos. Vectores preferíveis incluem qualquer um dos bem conhecidos vectores de expressão procarióticos, baculovírus recombinantes, vectores específicos para células COS, recombinantes de vacínia ou construções de expressão específicas para levedura. Quando se utilizam proteínas recombinantes para dar origem a capsómeros da invenção, as proteínas podem ser primeiramente isoladas da célula-hospedeiro da sua expressão e, em seguida, incubadas em condições que permitam a auto-reunião para formarem capsómeros. Alternativamente, as proteínas podem ser expressas em condições nas quais se formam capsómeros na célula-hospedeiro . A invenção também contempla processos de produção de capsómeros das formulações de vacinas. Num método, proteínas LI são expressas a partir de DNA que codifica seis histidinas adicionais no terminal carboxi da sequência codificadora da proteína Ll. As proteínas LI expressas com histidinas adicionais (proteínas His Ll) são muito preferivelmente expressas em E. coli e as proteínas His Ll podem ser purificadas utilizando cromatografia de afinidade com níquel. As proteínas His Ll presentes no lisato celular são suspensas num tampão de desnaturação, por exemplo, cloridrato de guanidina 6 M ou num tampão com capacidade de 13 desnaturação equivalente, e depois são sujeitas a cromatografia com níquel. A proteína que eluiu do passo de cromatografia com níquel é renaturada, por exemplo, em NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, Triton-X 100 0, 01%, HEPES (ácido 2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico) 10 mM, pH 7,4. De acordo com um método preferido da invenção, a reunião de capsómeros ocorre após diálise das proteínas purificadas, preferivelmente após diálise contra NaCl 150 mM, Ca2+ 25 mM, DMSO (dimetilsulf óxido) 10%, Triton-X 100 0, 1%, Tris [tris-(hidroximetil)aminometano] ácido acético 10 mM com um valor de pH de 5,0. A formação de capsómeros pode ser monitorizada por microscopia electrónica e, nos casos em que os capsómeros são constituídos por proteínas de fusão, a presença dos vários componentes proteicos no capsómero reunido pode ser confirmada por análise de coloração "Western" utilizando anti-soros específicos.

De acordo com a presente invenção são fornecidas formulações de vacinas para utilização no tratamento terapêutico de indivíduos infectados com o HPV. A utilização das formulações de vacinas também proporciona o tratamento profiláctico de indivíduos susceptíveis a infecção pelo HPV. Enquanto os indivíduos infectados podem ser facilmente identificados utilizando técnicas comuns de diagnóstico, os indivíduos susceptíveis podem ser identificados, por exemplo, como os que estão envolvidos em relações sexuais com um indivíduo infectado. No entanto, devido à elevada frequência da infecção pelo HPV, todas as pessoas sexualmente activas são susceptíveis de contraírem infecção causada pelo vírus papiloma. 14 A administração de uma formulação de vacina pode incluir um ou mais componentes adicionais, como transportadores, diluentes, adjuvantes e/ou tampões farmaceuticamente aceitáveis. As vacinas podem ser administradas uma única vez ou múltiplas vezes. A formulação de vacina da invenção pode ser administrada por várias vias, incluindo, por exemplo, a administração oral, intravenosa, intramuscular, nasal, rectal, transdérmica, vaginal, subcutânea e intraperitoneal.

As formulações de vacinas da invenção oferecem numerosas vantagens em comparação com preparações de vacinas convencionais. Como parte de uma vacinação terapêutica, os capsómeros podem promover a eliminação de células persistentemente infectadas, por exemplo, em pacientes com CIN ou carcinoma cervical. Adicionalmente, as vacinações terapêuticas deste tipo também podem servir uma finalidade profiláctica, protegendo pacientes com lesões CIN de reinfecção. Como vantagem adicional, os capsómeros podem escapar à neutralização por anticorpos anti-capsídeos pré-existentes e, desse modo, exibir um tempo de semi-vida em circulação mais longo em comparação com partículas quiméricas do tipo vírus.

Formulações de vacinas compreendendo capsómeros quiméricos podem proporcionar a vantagem adicional de antigenicidade acrescida de ambos os componentes proteicos da proteína de fusão a partir da qual se forma o capsómero. Por exemplo, numa VLP, os componentes proteicos do capsómero subjacente podem ser enterrados na estrutura global em resultado do posicionamento interiorizado na própria VLP. De modo semelhante, epítopos dos componentes proteicos podem ser obstruídos de forma estérica em resultado do contacto 15 capsómero-com-capsómero e, em consequência, podem ficar inacessíveis para induzirem uma resposta imunológica. Resultados preliminares utilizando proteínas de fusão L1/E7 para produzir VLPs suportam esta posição, pois não foi detectada nenhuma resposta de anticorpos contra o componente E7. Esta observação é consistente com resultados anteriores, que indicam que a reqião carboxi-terminal da LI forma estruturas em braço inter-pentaméricas que permitem a reunião de capsómeros em capsídeos [Garcia et al., J. Virol. 7_1: 2988-2995 (1997)]. Presumivelmente, numa estrutura de capsómero quimérico, ambos os componentes proteicos da sub-estrutura da proteína de fusão estão acessíveis para induzir uma resposta imunológica. Em consequência, as vacinas com capsómeros oferecem a vantagem adicional de antigenicidade acrescida contra qualquer componente proteico, incluindo, por exemplo, epítopos neutralizadores de outras proteínas de vírus, expresso como uma fusão com sequências de aminoácidos da Ll.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes. 0 Exemplo 1 descreve a construção de vectores de expressão para produzir proteínas virais de fusão ou quiméricas. 0 Exemplo 2 refere-se à geração de baculovírus recombinantes para a expressão de proteínas virais. 0 Exemplo 3 aborda a purificação de capsómeros. 0 Exemplo 4 descreve um protocolo de imunização para a produção de anti-soros e anticorpos monoclonais. 0 Exemplo 5 proporciona um ensaio ELISA de péptidos para quantificar a formação de capsómeros. 0 Exemplo 6 descreve um ensaio ELISA de captura de antigenes para quantificar a formação de capsómeros. 0 Exemplo 7 proporciona um ensaio de hemaglutinina para avaliar a indução de anticorpos neutralizadores. 16

Exemplo 1

Construção de Genes de Ll Quiméricos 0 DNA que codifica a fase de leitura aberta da Ll do HPV 16 foi excisado do plasmídeo 16-114/k-Ll/L2-pSynxtVI“ [Kirnbauer et al., J. Virol. 6_7: 6929-6936 (1994)] utilizando BglII e o fragmento resultante foi subclonado em pUC19 (New England Biolabs. Beverly, MA) previamente linearizado no sitio de restrição BamHI único. Em primeiro lugar geraram-se duas construções de expressão básicas para permitir a inserção subsequente de DNA, com a finalidade de permitir a expressão de proteínas de fusão. Uma construção codificou HPV 16 Ll 310 com uma deleção de nove aminoácidos: sabe-se que a região deletada exibe baixo nível de homologia com todas as outras proteínas Ll do vírus papiloma. A segunda construção, HPV 16 Ll C, codificou uma proteína com uma deleção de 34 aminoácidos dos resíduos carboxi-terminais da Ll. Outras construções incluem um sítio de restrição EcoRV na posição da deleção para inserção facilitada de DNA que codifica outras sequências proteicas. A adição do sítio EcoRV codifica dois aminoácidos que não fazem parte da proteína Ll, aspartato e isoleucina. A. Geração de uma construção de expressão HPV 16 Ll 310

Conceberam-se dois "primers" (ID SEQ NOs: 5 e 6) para amplificar o vector pUC19 e a sequência codificadora da Ll do HPV 16 completa exceptuando os nucleótidos 916 até 942 da ID SEQ NO: 1. Sintetizaram-se "primers" para introduzir também um sítio de restrição EcoRV único (sublinhado nas ID SEQ NOs: 5 e 6) nos terminais do produto de amplificação. CCCCGATATCGC-CTTTAATGTATAAATCGTCTGG SEQ ÍD NO: 5 CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG SEQ ID NO: 6 17 0 produto de PCR resultante foi digerido com EcoRV, para fornecer extremidades complementares, e o produto da digestão foi circularizado por ligação. 0 DNA ligado foi transformado em E. coli utilizando técnicas comuns e os plasmideos das colónias resultantes foram rastreados quanto à presença de um sitio de restrição EcoRV. Foi identificado um clone, designado HPV 16 LI δ310, que tinha a deleção apropriada de vinte e sete nucleótidos, tendo-se utilizado esta construção para inserir fragmentos de DNA que codificam outras proteínas do HPV 16 no sítio EcoRV, como discutido abaixo.

B. Geração de uma construção de expressão HPV 16 Ll aC

Conceberam-se dois "primers" (ID SEQ NOs: 7 e 8) complementares à fase de leitura aberta da Ll do HPV 16 de modo que os "primers" confinavam entre si, para permitir a amplificação em direcções reversas no DNA modelo compreendendo sequências codificadoras da Ll do HPV 16 em pUC19 descrito acima. AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC SEQ ID NO: 7 AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG SEQ ID NO: 8

Cada "primer" introduziu um sítio de restrição EcoRV no terminal do produto de amplificação. No "primer" a jusante (ID SEQ NO: 8), o sítio EcoRV foi seguido de um codão de terminação da tradução TAA posicionado de modo que o produto de amplificação, por ligação das extremidades EcoRV para a circularização, incluísse a deleção dos 34 aminoácidos da Ll carboxi-terminais. Efectuou-se PCR para amplificar a fase de leitura aberta da Ll parcial e o vector completo. 0 produto de amplificação foi clivado com EcoRV, circularizado com DNA ligase de T4 e transformado em células DH5 α de E. coli. Analisaram-se os plasmideos de 18 clones viáveis quanto à presença de um sitio EcoRV que linearizasse o plasmídeo. Identificou-se uma construção positiva, designada pUCHPVl6LlAC, tendo sido utilizada para inserir DNA de outras proteínas do HPV 16 utilizando o sítio EcoRV.

C. Inserção de fragmentos de DNA em HPV 16 Ll δ310 e HPV16L1aC

Amplificaram-se fragmentos de DNA dos aminoácidos que codificam a E7 do HPV 16 1-50, 1-60, 1-98, 25-75, 40-98, 50-98 da ID SEQ NO: 4 utilizando "primers" que introduziram sítios de restrição 5' EcoRV terminais de modo a facilitar a inserção do fragmento na sequência modificada HPV 16 Ll δ310 e HPV16L1aC. Nas várias reacções de amplificação utilizou-se o "primer" E7.1 (ID SEQ NO: 9) em combinação com o "primer" E7.2 (ID SEQ NO: 10) para gerar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 1-50; com o "primer" E7.3 (ID SEQ NO: 11) para gerar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 1-60, ou com o "primer" E7.4 (ID SEQ NO: 12) para gerar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 1-98. Noutras reacções de amplificação, utilizaram-se os pares de "primers" E7.5 (ID SEQ NO: 13) e E7.6 (ID SEQ NO: 14) para amplificar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 25-75; utilizaram-se E7.7 (ID SEQ NO: 15) e E7.4 (ID SEQ NO: 12) para amplificar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 40-98, e utilizaram-se E7.8 (ID SEQ NO: 16) e E7.4 (ID SEQ NO: 12) para amplificar um fragmento de DNA que codifica os aminoácidos de E7 50-98. "Primer" E7.1 ID SEQ NO: 9

AAAAG ΑΤΆΤ CAT GCATGGAGATACACCTACATT GG 19 "Primer" E7.2 ID SEQ NO: 10

TTTTGATAT CGGCTCTGTCCGGIICT GCTTGTCC "Primer" E7.3 ID SEQ NO: 11

TTTTGATATCCTT GCAACAAAAGGIT ACAATATT GTAATGGGCC "Primer" E7.4 ID SEQ NO: 12

AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC "Primer" E7.5 ID SEQ NO: 13

TTTTGATAT CGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG "Primer" E7.6 ID SEQ NO: 14

TTTTGATATCGTCTACGT GT GT GCTTTGTACGCAC "Primer" E7.7 "Primer" E7. ID SEQ NO: 15

^GCAGAACCGGAC ID SEQ NO: 16

‘CTTTTG

De modo semelhante, amplificaram-se nucleótidos do DNA que codifica a proteína de matriz de influenza (ID SEQ NO: 17) utilizando o par de "primers" apresentado nas ID SEQ NOs: 19 e 20. Ambos os "primers" introduziram um sítio de restrição EcoRV no produto de amplificação.

TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC ID SEQ NO: 19

TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG ID SEQ NO: 20 20

Os produtos de PCR de cada reacçao de amplificação foram clivados com EcoRV e inseridos no sitio EcoRV das sequências HPV 16 Ll δ310 e HPV16L1aC previamente linearizadas com a mesma enzima. Para determinar a orientação das inserções em plasmideos que codificam os aminoácidos de E7 25-75 e 50-98 e plasmídeo incluindo a proteína de matriz de influenza, empregou-se digestão com Ciai tirando partido de um sítio de restrição sobrepondo-se ao sítio de restrição EcoRV criado de novo (GATATCGAT) e incluído no "primer" a montante. Para as três construções de expressão incluindo a metionina de iniciação da E7 do HPV 16, determinou-se a orientação da inserção utilizando um sítio de restrição NslI na região codificadora de E7.

Depois de identificadas construções de expressão com inserções apropriadas, a região codificadora de proteína para Ll e aminoácidos inseridos foi excisada, como uma unidade, utilizando as enzimas de restrição Xfoal e SmaI e o DNA isolado foi ligado no plasmídeo pVL1393 (Invitrogen), para gerar baculovírus recombinantes. D. Eliminação de Sítios de Restrição EcoRV em Construções de Expressão A sequência HPV 16 Ll AC inclui DNA do sítio EcoRV que resulta na tradução de aminoácidos que não estão normalmente presentes em polipéptidos Ll de tipo selvagem. Assim, concebeu-se uma série de construções de expressão nas quais foi eliminado o sítio EcoRV artificial. A sequência da Ll para esta série de construções de expressão foi designada HPV 16L1aC*. 21

Para gerar uma construção de expressão contendo a sequência HPV 16L1aC* ef ectuaram-se duas reacções de PCR para amplificar dois fragmentos com sobreposição do pUC- HPV16 LIaC que codifica os aminoácidos de E7 1-50. Os fragmentos de DNA resultantes sobrepunham-se na posição da fronteira L1/E7, mas não continham os dois sítios de restrição EcoRV. O fragmento 1 foi gerado utilizando os "primers" Pl (ID SEQ NO: 21) e P2 (ID SEQ NO: 22) e o fragmento 2 utilizando os "primers" P3 (ID SEQ NO: 23) e P4 (ID SEQ NO: 24). "Primer" Pl ID SEQ NO: 21

GTTATGACATACATACATTCTATG "Primer" P2 ID SEQ NO: 22

CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC "Primer" P3 ID SEQ NO: 23

CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC "Primer" P4 ID SEQ NO: 24

CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG

Após as primeiras duas reacções de amplificação, os dois produtos purificados foram utilizados como modelos noutra reacção de PCR utilizando apenas os "primers" Pl e P4. O produto de amplificação resultante foi digerido com as enzimas EcoNI e HindiII inseridas na construção de expressão HPV 16L1aC descrita acima após digestão com as mesmas enzimas. A construção de expressão resultante diferiu da construção HPV16L1aC original com DNA que codifica a LI e os aminoácidos de E7 1-50 por perda dos dois sítios de restrição EcoRV internos. O primeiro sítio EcoRV foi substituído por DNA que codifica os aminoácidos alanina e glicina da Ll nativa nesta posição, e o segundo 22 foi substituído por um sinal de terminação da tradução. Adicionalmente, a construção de expressão, designada HPV 16 LIaC* E7 1-52, continha os primeiros 52 aminoácidos da E7 do HPV 16 em resultado da utilização do "primer" P4, que também codifica os resíduos de aminoácidos de E7 histidina na posição 51 e tirosina na posição 52. Em seguida, utilizou-se HPV 16 LIaC* E7 1-52 para gerar construções de expressão HPV 16 LIaC adicionais incluindo suplementarmente DNA que codifica os aminoácidos de E7 1-55 utilizando o "primer" PI (ID SEQ NO: 21) em combinação com o "primer" P5 (ID SEQ NO: 25), os aminoácidos de E7 1-60 com o par de "primers" PI e P6 (ID SEQ NO: 26) e os aminoácidos de E7 1-65 com o par de "primers" PI e P7 (ID SEQ NO: 27) . As sequências de DNA que codificam aminoácidos adicionais nos produtos de amplificação surgiram da concepção dos "primers" de modo a incluírem nucleótidos adicionais para os aminoácidos desejados. "Primer" P5 ID SEQ NO: 25

CATCTGAAGCTTAAGCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG "Primer" P6 ID SEQ NO: 26

CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTA-CAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG "Primer" P7 ID SEQ NO: 27 CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAAC-

AAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG

De modo semelhante, gerou-se HPV 16 LIaC* E7 1-70 utilizando DNA modelo que codifica HPV 16 LIaC* E7 1-66 e o par de "primers" PI e P8 (ID SEQ NO: 28). "Primer" P8 ID SEQ NO: 28 23

CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAAC-CGAAGCGTAGAGTCACACTTG

Após cada reacção de PCR, os produtos de amplificação foram digeridos com EcoNI e HindiII e foram inseridos em HPVIôLIaC previamente digerida com as mesmas enzimas. Determinaram-se as sequências de cada construção utilizando um instrumento de sequenciação da Applied Biosystems Prism 377 com didesoxinucleótidos de terminação de cadeias fluorescentes [Prober et ai., Science 238: 336-341 (1987)].

Exemplo 2

Geração de Baculovírus Recombinantes Células de Spodoptera frugiperda (Sf9) cresceram em suspensão ou culturas de monocamadas a 21° em meio TNMFH (Sigma) suplementado com soro fetal de vitelo 10% e glutamina 2 mM. Para a construção de baculovírus recombinantes à base da LI do HPV 16, células Sf9 foram transfectadas com 10 μg de plasmídeo de transferência juntamente com 2 μρ de DNA Baculo-Gold linearizado (PharMingen, San Diego, CA) . Os vírus recombinantes foram purificados de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Para testar a expressão da proteína LI do HPV 16, infectaram-se 105 células Sf9 com baculovírus recombinante a uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 5 até 10. Após incubação durante três até quatro dias a 28 °C, removeram-se os meios e lavaram-se as células com PBS. As células foram submetidas a lise em tampão de amostra de SDS e foram analisadas por SDS-PAGE e coloração "Western" utilizando anticorpos anti-Ll do HPV16 e anti-E7 do HPV16. 24

Para determinar quais das construções de expressão da proteína LI quiméricas produziam preferencialmente capsómeros, extractos de células transfectadas foram sujeitos a centrifugação com gradiente. As fracções obtidas do gradiente foram analisadas quanto ao teor de proteína LI por coloração "Western" e quanto à formação de VLP por microscopia electrónica. Os resultados estão apresentados na Tabela 1.

Verificou-se que a proteína LI do HPV intacta, bem como cada um dos produtos de expressão HPV 16 LI 310 e HPV 16 LI C, produz capsómeros e partículas do tipo vírus em proporções iguais. Quando as sequências codificadoras de E7 foram inseridas no vector HPV 16 L1a310, apenas proteínas de fusão incluindo os aminoácidos de E7 l até 50 produzidas deram origem a formação detectável de capsómeros.

Quando DNA codificador de E7 foi inserido no vector HPV 16 LIaC, verificou-se que todas as proteínas de fusão produziram capsómeros; proteínas quiméricas incluindo os resíduos de aminoácidos de E7 40-98 produziram o nível mais elevado de estruturas exclusivamente de capsómeros. Ambas as proteínas quiméricas incluindo os resíduos de aminoácidos de E7 1-98 e 25-75 produziram predominantemente capsómeros, mesmo tendo-se observado também formação de partículas do tipo vírus. A proteína quimérica incluindo os aminoácidos de E7 1-60 resultou em níveis quase iguais de produção de capsómeros e de partículas do tipo vírus.

Quando sequências de E7 foram inseridas no vector HPV 16 L1a*C, verificou-se que todas as proteínas de fusão produziram capsómeros. A inserção de DNA que codifica os 25 resíduos de E7 1-52, 1-55 e 1-60 produziu o nível mais elevado de capsómeros, mas observaram-se níveis iguais de produção de partículas do tipo vírus. Não obstante a inserção de DNA que codifica o DNA de E7 para os resíduos 1-65, 1-70, 25-75, 40-98 e 1-98 ter resultado em níveis comparativamente inferiores ou níveis indetectáveis de capsídeos, os capsómeros foram produzidos em grandes quantidades. TABELA 1

Capacidade de Formação de Capsómeros e Capsídeos de Proteínas onstrução de Expressão de LI LI do HPV Inserção Quiméricas Rendimento de Capsómeros rendimento Capsídeos H VP 16 LI Hehhuma ++++ + + + + + + HPV 18 L1A31Q Henhuma ++ + + + HPV 16 LI AC Henhuma ++++ + +++ HPV 16 L1A31G E7 1-98 - - HPV 16 L1A31Q E7 1-50 ++ - HPV 16 L1A310 E7 25 75 - - HPV 16 L1A31Ô E7 50-98 - - HPV 18 LI AC E7 1-98 +++ + HPV 16 LI AC E7 25-75 + ++ + HPV 18 LI AC E7 50-98 + + HPV 18 LI AC E7 1-60 +++++ + ++++ HPV 18 LI AC E7 40-98 4-++-6- - HPV 16 LI AC infiuenza +++ + HPV 16 L1A*C E7 1-52 +++++ +++++ HPV 18 L1Á*C E7 1-55 +-5-+-5-+ +++++ HPV 16 L1A*C E7 1-60 +++ ++ + + HPV 16 L1A*C E7 1-65 + + - HPV 16L1A*C E7 1-70 ++ -

Exemplo 3

Purificação de Capsómeros Células de Trichopulsia ni (TN) High Five cresceram, para uma densidade, aproximadamente, de 2 x 106 células/ml, em 26 meio sem soro Ex-Cell 405 (JRH Biosciences) . Aproximadamente 2 x 108 células foram transformadas em grânulos por centrifugação a 1000 x g durante 15 minutos, foram novamente suspensas em 20 ml de meio e infectadas com baculovirus recombinantes, à m.o.i. de 2 até 5, durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a adição de 200 ml de meio, as células foram plaqueadas e incubadas durante 3 até 4 dias a 27°C. Depois da incubação, as células foram recolhidas, transformadas em grânulos e novamente suspensas em 10 ml de tampão de extracção.

Os passos seguintes foram realizados a 4°C. As células foram sonicadas durante 45 segundos a 60 Watts e o lisato celular resultante foi centrifugado a 10 000 rpm num rotor Sorvai SS34. O sobrenadante foi removido e retido, enquanto o grânulo resultante foi novamente suspenso em 6 ml de tampão de extracção, foi sonicado durante 3 segundos adicionais a 60 Watts e novamente centrifugado. Os dois sobrenadantes foram combinados, foram dispostos em camadas num gradiente em dois passos, contendo 14 ml de sucrose 40% sobre 8 ml de solução de CsCl (4,6 g de CsCl por 8 ml em tampão de extracção) e centrifugados num rotor de recipiente oscilante Sorvai AH629 durante 2 horas a 27 000 rpm a 10°C. A região de interface entre o CsCl e a sucrose juntamente com a camada completa de CsCl foram recolhidas em tubos Quickseal de 13,4 ml (Beckman) e adicionou-se tampão de extracção para ajustar o volume para 13,4 ml. As amostras foram centrifugadas durante a noite a 50 000 rpm a 20 °C num rotor Beckman 70 TI. Os gradientes foram fraccionados (1 ml por fracção) fazendo punções no topo e na base dos tubos com uma agulha de calibre 21. Recolheram-se fracções de cada tubo, tendo-se analisado 2,5 μΐ de cada 27 fracção com um gel de SDS-poliacrilamida 10% e coloraçao "Western" utilizando um anticorpo anti-Ll do HPV 16.

Partículas do tipo vírus e capsómeros foram separados das fracções identificadas acima por sedimentação em gradientes de sucrose 10 até 50%. As fracções de pico dos gradientes de CsCl foram reunidas e dialisadas durante 2 horas contra HEPES 5 mM (pH 7,5). Metade do dialisado foi utilizada para produzir capsómeros através de desmantelamento de VLPs intactas durante a noite por adição de EDTA (concentração final 50 mM) , EGTA (50 mM) , DTT (30 mM) , NaCl (100 mM) e Tris/HCl, pH 8,0 (10 mM). Como controlo, adicionaram-se à outra metade apenas NaCl e Tris/HCl.

Para a análise de capsómeros produzidos a partir das VLPs desmanteladas, adicionaram-se às almofadas de sucrose EDTA, EGTA e DTT (concentração final de cada 5 mM) , que foram centrifugadas a 250 000 x g durante 2 até 4 horas a 4°C. Recolheram-se fracções através de punções feitas nas bases dos tubos. Em seguida, analisou-se uma diluição 1:10 de cada fracção por ELISA de captura de antigenes.

Exemplo 4

Protocolo de Imunização para a Produção de Anti-Soros Policlonais e Anticorpos Monoclonais

Ratinhos Balb/c são imunizados subcutaneamente três vezes, de quatro em quatro semanas, com aproximadamente 60 μg de capsómeros quiméricos de HPV misturados 1:1 com Adjuvante de Freund completo ou incompleto num volume total de 100 μΐ. Seis semanas depois da terceira imunização, sacrificam-se os ratinhos e recolhe-se sangue por punção cardíaca. 28

Exemplo 5 ELISA de Péptidos para Quantificar a Formação de Capsómeros

Placas de microtítulo (Dynatech) são revestidas durante a noite com 50 μΐ de péptido E701 [Muller et al., 1982] a uma concentração de 10 μρ/ιηΐ em PBS. As cavidades são bloqueadas, durante 2 horas a 37°C, com 100 μΐ de tampão contendo BSA 5% e Tween 20 0,05% em PBS e são lavadas três vezes com PBS contendo Tween 20 0,05%. Após a terceira lavagem, adicionam-se a cada cavidade 50 μΐ de soros diluídos 1:5000 em BSA/Tween 20/PBS e continua-se a incubação durante 1 hora. As placas são novamente lavadas com anteriormente e adicionam-se 50 μΐ de conjugado de cabra anti-ratinho peroxidase a uma diluição de 1:5000. Passada 1 hora, as placas são lavadas e coradas utilizando substrato ABTS (0,2 mg/ml, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-p-sulfónico em tampão Na-Acetato-Fosfato 0, 1 M (pH 4,2) com 4 μΐ de H202 30% por 10 ml). Mede-se a extinção após 1 hora a 490 nm num leitor de placas automático da Dynatech.

Exemplo 6 ELISA de Captura de Antigenes para Quantificar a Formação de Capsómeros

Para permitir a quantificação relativa de partículas do tipo vírus e capsómeros em fracções de gradientes de CsCl utilizou-se um ensaio ELISA de captura de antigenes. Placas de microtítulo foram revestidas durante a noite com 50 μΐ/cavidade de uma diluição 1:500 (concentração final de 2 μρ por ml, em PBS) com um anticorpo monoclonal de ratinho purificado para a proteína A imunoespecífico para a LI do 29 HPV 16 (os anticorpos 25/C, MM07 e Ritti 1 foram obtidos de ratinhos imunizados com VLPs do HPV 16) . As placas foram bloqueadas com leite 5%/PBS durante 1 hora e adicionaram-se 50 μΐ de fracções de gradientes de CsCl durante 1 hora a 37°C utilizando uma diluição 1:300 (em leite 5%/PBS). Após três lavagens com PBS/Tween 20 0,05%, adicionaram-se 50 μΐ de um anti-soro policlonal de coelho (diluição 1:3000 em leite/PBS), dirigido contra VLPs do HPV 16, e incubaram-se as placas a 37° durante 1 hora. As placas foram novamente lavadas e suplementarmente incubadas com 50 μΐ de um conjugado de cabra anti-coelho peroxidase (Sigma) diluido 1:5000 em PBS contendo leite 5% durante 1 hora. Após uma lavagem final, as placas foram coradas com substrato ABTS durante 30 minutos e mediu-se a extinção a 490 nm num leitor de placas automático Dynatech. Como controlo negativo, o ensaio também incluiu cavidades revestidas apenas com PBS.

Para testar anticorpos monoclonais quanto à especificidade para capsómeros, VLPs com EDTA/DTT para desmantelar as partículas. Avaliaram-se preparações de partículas tratadas no ensaio ELISA de captura de antigenes e compararam-se as leituras com controlos não tratados. Para o desmantelamento, 40 μΐ de VLPs foram incubados durante a noite a 4°C em 500 μΐ de tampão de desagregação contendo DTT 30 mM, EGTA 50 mM, EDTA 60 mM, NaCl 100 mM e Tris/HCl 100 mM, pH 8,0. Utilizaram-se alíquotas de partículas tratadas e não tratadas no ensaio ELISA de captura acima, numa diluição 1:20 - 1:40.

Exemplo 7

Ensaio de Inibição de Hemaglutinina 30

Para determinar a extensão em que as vacinas com capsómeros quiméricos induzem a produção de anticorpos neutralizadores, realiza-se um ensaio de inibição de hemaglutinação como resumidamente descrito abaixo. Este ensaio baseia-se em observações prévias de que partículas do tipo vírus são capazes de proceder à hemaglutinação de glóbulos vermelhos.

Imunizam-se ratinhos com qualquer vacina de capsómeros quiméricos e recolhem-se soros como descrito acima no Exemplo 4. Como controlos positivos, partículas do tipo vírus (VLPs) de LI do HPV 16 e VLPs de LI do PV1 bovino (BPV) são avaliadas em paralelo com uma preparação de capsómeros quiméricos. Para estabelecer uma referência positiva, as VLPs do HPV16 ou BPV1 são primeiramente incubadas com ou sem soros recolhidos de ratinhos imunizados, após o que se adicionam glóbulos vermelhos. A extensão em que a pré-incubação com soros de ratinho inibe a hemaglutinação de glóbulos vermelhos é uma indicação da capacidade neutralizadora dos soros de ratinho. Depois repetem-se as experiências utilizando capsómeros quiméricos para determinar o efeito neutralizador dos soros de ratinho na vacina. Descreve-se abaixo um protocolo breve para o ensaio de inibição de hemaglutinação.

Adicionam-se cem microlitros de heparina (1000 unidades usp/ml) a 1 ml de sangue fresco de ratinho. Os glóbulos vermelhos são lavados três vezes com PBS, seguido de centrifugação e nova suspensão num volume de 10 ml. Em seguida, os eritrócitos são novamente suspensos em 0,5 ml de PBS e são armazenados a 4°C durante um período até três dias. Para o ensaio de hemaglutinina, utilizam-se 70 μΐ da suspensão por cavidade numa placa de 96 cavidades. 31

Alíquotas de capsómeros quiméricos de gradientes de CsCl são dialisadas durante uma hora contra Hepes 10 mM (pH 7,5) e 100 μΐ de diluições em série duas vezes em PBS são adicionados a eritrócitos de ratinho em placas de microtitulo de 96 cavidades de fundo redondo, que são suplementarmente incubadas durante 3-16 horas a 4°C. Para a inibição da hemaglutinação, os capsómeros são incubados com diluições de anticorpos em PBS durante 60 minutos à temperatura ambiente e depois são adicionados aos eritrócitos. Determina-se por métodos comuns o nível de hemaglutinação dos eritrócitos e, em consequência, a presença de anticorpos neutralizadores.

Em resultados preliminares, observou-se que soros de ratinho gerados contra capsómeros quiméricos compreendendo a proteína HPV16L1aC em associação com os resíduos de aminoácidos de E7 1-98 inibem a hemaglutinação pelas VLPs do HPV16, mas não pelas VLPs do BPV. Em consequência, os soros de ratinho foram positivos para anticorpos neutralizadores contra as VLPs humanas, e esta neutralização diferencial resultou muito provavelmente da especificidade dos anticorpos para epítopos contra os quais foram dirigidos os anticorpos.

Espera-se que numerosas modificações e variações da invenção como apresentada nos exemplos ilustrativos acima ocorram aos experimentados na área. Em consequência, só devem ser impostas à invenção as limitações que aparecem nas reivindicações adjuntas. 32

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES DE CFNFRAI: (i) CANDIDATO: (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Formulações de Vacinas com Capsómeros do Vírus Papiloma e Métodos de Utilização (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 28 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Marshall, 0'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) RUA: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) CIDADE: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) ZIP: 60606-6402 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) "SOFTWARE": Patentln Tiragem #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DA PRESENTE CANDIDATURA: (A) NÚMERO DA CANDIDATURA: (B) DATA DO REGISTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÕES DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Williams Jr., Joseph A. (B) NÚMERO DO REGISTO: 38 659 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/EXTRACTO: 27013/34028 (ix) INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1518 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1518 33 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:1: AT 6 TCT crr TGG CTG CCT AGT GAG GCC ACT GTC TAC TTG CCT CCT GTC 48 Met ser teu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro ΡΓΟ val 1 5 10 15 CCA GTA TCT AAG GTT GTA AGC ACG GAT GAA TAT GTT GCA CGC ACA AAC 96 ΡΓΟ vai ser Lys Val Val Ser Thr ASP Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 ATA TAT TAT CAT GCA GGA ACA TCC AGA CTA CTT GCA GTT GGA CAT CCC 14·! ile Tyr Tvr HÍS Ala Gly Thr ser Arg Leu Leu Ala va! Gly HÍS Pro 35 40 45 TAT TTT CCT ATT AAA AAA CCT AAC AAT AAC AAA ATA TTA GTT CCT AAA 19: Typ Phe Pro Πδ lys Lys Pro A5n ASn ASn Lys Ile teu Val Pro Lys 50 55 60 GTA tca ggâ TTA CAA TAC AGG GTA TTT AGA ATA CAT TTA CCT GAC CCC 24C val Ser Gly léu Gl n Tyr Arg Val Phe Arg xle Hi$ teu pro ASp pro 65 70 75 80 AAT AAG TTT GGT TTT CCT GAC ACC TCA TTT TAT AAT CCA GAT ACA CAG 288 Asn tys phe Gly Phe pro ASp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin 85 90 95 cm CTG GTT TGG GCC TGT GTA GGT GTT GAG GTA GGT CGT ÇGT CAG CCA 336 Arg Leu val Trp Ala cys val Gly val Glu val Gly Arg Gly Gin pro 1QQ 105 110 TTA GGT GTG GGC ATT AGT GGC CAT CCT TTA TTA AAT AAA TTG GAT GAC 384 Leu Gly val Gly Xle Ser Gly Mis Pro Leu Leu Asn Lys Leu ASp Asp 115 120 125 ACA GAA AAT GCT AGT GCT TAT GCA GCA AAT GCA GGT GTG GAT AAT AGA 432 Thr Glu ASrt Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly val ASP Asn Arg 130 135 140 GAA TGT ATA TCT ATG GAT TAC AAA CAA ACA CAA TTG TGT TTA ATT GGT 480 Glu Cys ile ser Met ASp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys Leu He Gly 145 150 155 160 TGC AAA CCA CCT ATA GGG GAA CAC TGG GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC 528 cys Lys Pro pro ile Gly Glu HÍS Trp Gly Lys Gly Ser Pro cys Thr 165 170 175 AAT GTT GCA GTA AAT CCA GGT GAT TGT CCA CCA TTA GAG TTA ATA AAC 575 Asrt val Ala val Asn pro Gly ASp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 ACA GTT ATT CAG GAT GGT GAT ATG GTT GAT ACT GGC TTT GGT GCT ATG 624 Thr val lie Gin Asp Gly ASp Met val ASp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 GAC TTT act ACA TTA CAG GCT AAC AAA AGT GAA GTT CCA CTG GAT ATT 672 ASp Phe Thr Thr Leu Gin Ala Asn cys ser Glu val pro Leu Asp He 210 215 220 TGT ACA TCT ATT TGC AAA TAT CCA GAT TAT ATT AAA ATG GTG TCA GAA 720 CVS Thr Ser He Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr 11 e Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 CCA TAT GGC GAC AGC TTA TTT ttt TAT TTA CGA AGG GAA CAA ATG TTT 768 Pro Tyr Gly ASp Ser Leu phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe 245 250 255 GTT AGA CAT TTA TTT AAT AGG GCT GGT GCT GTT GGT GAA AAT GTA CCA 816 vai Arg HiS teu Phe Asn Arg Ala Gly Ala val Gly Glu A$n val Pro 260 265 270 GAC GAT TTA TAC ATT AAA GGC TCT GGG TCT ACT GCA AAT TTA GCC AGT 864 ASP Asp teu Tyr He Lys Gly ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala ser 34 34 275 230 2S5 TCA AAT TAT TTT CCT ACA ccr AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GAT GCC Ser Asn Tyr Phe pro Thr Pro Ser Gly Ser Met vai Thr Ser ASp Ala 290 295 300 CAA ATA TTC AAT AAA CCT TAT TGG TTA CAA CGA GCA CAG GGC CAC AAT 61 π He Phe Asn Lys pro Tyr Trp Leu Gin Arg Ala Gin Gly HÍS Α5Γ» 305 310 315 320 AAT GGC ATT TGT TGG GGT AAC CAA CTA TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT Asn Gly lie cys Trp Gly A 50 Gin leu Phe vai Thr Vai Vai Asp Thr 325 330 335 ACA CGC AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT Gcr GCC ATA TCT ACT TCA GAA Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser teu cys Ala Ala ile Ser Thr ser Glu 340 345 350 ACT ACA TAT AAA AAT ACT AAC TTT AAG GAG TAC CTA CGA CAT GGG GAG Thr Thr Tyr cys ASP Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg HÍS Gly Glu 355 360 365 GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CAA CTG TGC AAA ATA ACC TTA ACT Glu Tyr ASp Leu Glfl phe lie Phe cln ueu cys Lys He Thr Leu Thr 370 375 380 GCA GAC GTT ATG ACA TAC ATA CAT TCT ATG AAT TCC ACT ATT TTG GAG Ala ASp vai Met Thr Tyr He HÍS Ser Met ASft ser Thr ile Leu Glu 3SS 390 395 400 GAC TGG AAT TTT GGT CTA CAA CCT CCC CCA GGA G6C ACA CTA GAA GAT ASp Trp Asn Phe Gly Leu Gin Pro pro Pro Gly Gly Thr Leu GlU ASp 405 410 415 ACT TAT ACG TTT GTA ACC ICC CAG GCA ATT GCT TGT CAA AAA CAT ACA Thr Tyr Arg Phe vai Thr ser Gin Ala lie Ala cys Gin LyS HÍS Thr 420 425 430 CCT CCA GCA CCT AAA GAA GAT CCC CTT AAA AAA TAC ACT TTT TGG GAA ΡΓΟ pro Ala Pro Lys Gl u Asp pro Leu Lys Lys Tyr Thr phe Trp Gl U 435 440 445 GTA AAT TTA AAG GAA AAG TTT TCT GCA GAC CTA GAT CAG TTT CCT TTA vai A$n Leu tys Glu Lys Phe ser Ala ASp Leu ASp Gin Phe Pro ceu 450 45S 460 6GA CGC AAA TTT TTA CTA CAA GCA GGA TTG AAG GCC AAA CCA AAA TTT Gly Arg Lys Phe Leu teu Gin Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 ACA TTA GGA AAA CGA AAA GCT ACA CCC ACC ACC TCA tct ACC TCT ACA Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 ACT GCT AAA CGC AAA AAA CGT AAG CTG TAA Thr Ala tys ΑΓΟ 500 Lys Lys Arg Lys teu 505

912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392 1440 1488 151B (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 505 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 35 ID SEQ NO:2: Ala Thr val Tyr Leu pro pro val 10 15 ASP Gl u Tyr val Al a Arg Thr Asn 25 30 Arg teu Leu Ala Val Gly His Pro 45 aso Asn Lys lie teu Val Pro lys 60 Phe Arg Ile His Leu Pro ASp Pro 75 80 ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin 90 95 val Glu val Gly Arg Gly Gin Pro 105 110 pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 125 Ala Asn Al a Gly val Asp Asn Arg 140 Gin Thr Gin teu Cys Leu Ile Gly 155 160 Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 170 175 Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 185 190 val ASp Thr Gly Phe Gly A.1 a Met 205 tys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 220 ASP Tyr He Lys Met val Ser Glu 235 240 Tyr Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe 250 255 Gly Ala val Gly Glu Asn val Pro 265 270 Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala ser 285 Gly ser Met val Thr Ser ASp Ala 300 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: Met 1 Ser Leu Trp teu S Pro ser Glu > O ser Lys 20 val val Ser Thr Ile Tyr Tyr 35 Mis Ala Gl y Thr Ser 40 Tyr Ptie 50 pro lie Lys Lys Pro 55 ASR Val 65 ser Gly teu Gin Tyr 70 Arg val Asn lys Phe Gly Phe 85 Pro ASp Thr Arg Leu val Trp 100 Ai a cys val Gly Leu Gly val 115 Gly Ile Ser Gly ΗΪ 5 120 Thr Glu 130 Asn Ala Ser Ala Tyr 135 Ala Glu 145 cys Ile Ser Met Asp 150 Tyr lys Cys Lys pro Pro Ile 165 Gly Glu His ASH val Ala val ISO aso Pro Gly ASp Thr val ile 195 Gin Asp Gly Asp Met 200 Asp Phe 210 Thr Thr Leu Gl O Al a 215 Asn Cys Thr 225 ser ile cys Lys 2:30 Tyr pro Pro Tyr Gly ASp Ser 245 Leu Phe Phe val Arg HiS Leu 260 Phe Asn Arg Ala Asp ASp Leu 275 Tyr ile Lys Gly Ser 280 Ser Asn Tyr 290 Phe Pro Thr Pro 295 ser 36

Gin lie phe Asn tys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg Ala Gin Gly HÍS Asn 30 S 310 31S 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gin Leu phe vai Thr Vâl vai ASp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn phe Lys Glu Tyr Leu Arg HÍS Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr ASP Leu Gin Phe Ile phe Gin Leu Cys Lys ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ai a ASp vai «et Thr Tyr He HÍS Ser Met Asn Ser Thr ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp ASn Phe Gly Leu Gin pro Pro ΡΓΟ Gly Gly Thr Leu Glu ASp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe vai Thr Ser Gin Ala ile Al a Cys Gin Lys HÍS Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 vai ASn Leu tys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu ÃSp Gin Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys phe Leu Leu Gin Ala Gly Leu tys Ala tys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Al S Lys Arg Lys Lys Arg Lys teu 500 505 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 297 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..297 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:3: 37

ATG Met 1 CAT HÍS GGA Gly GAT ASP ACA Thr 5 CCT Pro ACA TTG CAT GAA Thr Leu Nis Glu 10 TAT Tyr ATG Met TTA GAT Leu Asp TTG Leu 15 CAA Gin CCA GAG ACA ACT GAT crc TAC TGT TAT GAG CAA TTA AAT GAC AGC TCA

Pro Glu Thr rhr ASP Leu Tyr cys Tyr Glu Gin Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC 144 Gl u Glu Glu ASp Glu 11 e ASp Gly Pro Ala Gly Gin Ala Glu Pro ASP 35 40 45 AGA GCC CAT TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAG TGT GAC TCT AC6 192 Arg Ala HÍS Tyr Asn ile val Thr phe Cys cys Lys Cys ASp Ser Thr so 55 60 CTT CGG TTG TGC GTA CAA AGC ACA CAC GTA GAC ATT CGT ACT TTG GAA 240 Leu Arg Leu cys vai Gin ser Thr HÍS val ASp lis Arg Thr teu Glu 65 70 75 80 GAC CTG TTA ATG GGC ACA CTA GGA ATT GTG TGC ccc ATC TGT tct CAG 28S ASp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro ile cys ser Gin 85 90 95 AAA CCA TAA 29? tys pro (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 98 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:4:

Met 1 HÍS Gly Asp Thr S Pro Thr Leu His Glu Tyr Met 10 Leu Asp Leu 15 Gin Pro Glu Thr Thr 20 ASp leu Tyr Cys Tyr 25 Glu Gin Leu Asn ASp 30 Ser Ser Glu Glu Glu 35 ASp Glu Ile Asp Gly 40 pro Ala Gly Gin Ala 45 Glu Pro Asp Arg Ala SO HlS Tyr Asn Ile val 55 Thr phe Cys Cys Lys Cys 60 ASP Ser Thr Leu 65 Arg Leu Cys val Gin 70 Ser Thr His val Asp 75 Π Ê Arg Thr Leu Glu 80 Asp Leu Leu Met Gly 8$ Thr Leu Gly ile val Cys 90 Pro Ile cys Ser 95 Gin tys pro (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:5: CCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG 34 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:6: CCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG 35 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:7:

AAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:8:

AAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:9: AAAA.GATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC ATTGC 35 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:10: TTTTGATÂTC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC 34 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:11:

TTTTGATATC CITGCAACAA AAGGTTÂCAA TAUGTAATG GGCC (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:12: AAAAGATATC TGGTTTCTGA GAACAGATGG GGCAC 35 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:13:

TTTTGATATC GATTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCAG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:14: TTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC 35 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:15:

TTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGAGAAGCA GAACCGGAC (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:16:

TTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 294 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 41 (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: ..294 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:17: ATG AGI CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CTT ACC AGA AAC GGA TGG GAG 48 «et Ser teu teu Thr Glu val Glu Thr teu Thr Arg ASA Gly Trp 15 Glu 1 S 10 TGC AAA TGC AGC GAT TCA AGT GAT CCT CTC ATT ATC GCA GCG AGT ATC 96 cys Lys Cys Ser ASp ser Ser ASp Pro Leu Ile Ile Ala Ala ser Ile 20 25 30 ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT rrr TAT CGT CTT TTC TFC 144 ile Gly Ile teu HÍS Leu Ile teu Trp ile Phe Tyr Arg Leu Phe Phe 3$ 40 45 AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTG AAA AGA GGG CCT TCT 192 Lys cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 ACG GAA GGA GCG CCT GAG TCT ATG AGG GAA GAA TAT CGG CAG GAA CAG 240 Thr Glu Gly Ala pro Glu ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gin Glu Gin 55 70 ?$ SO CAG AGT GCT GTG GAT GTf GAC GAT GTT CAT rrr GTC AAC ATA GAG CTG 288 Gin ser Ala val ASp val ASP ASp val HÍS Phe val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 GAG TAA 294

Glu (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 97 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:18: 42 42 Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu 10 15 Leu Ile Ile Ala Ala Ser Ile 30

Met ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr 1 5

Cys Lys cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro 20 25

Ile Pbe Tyr Arg Leu Phe PHe 45 Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 60 Glu Glu Tyr Arg Gin Glu Gin 75 80 hís Phe val Asn Ile Glu teu 90 95 lie Gly ile Leu Kis Leu Ile Leu Trp 35 40

Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr 50 55

Thr 61 u Gly Ala Pro Glu ser Met Arg 65 70

Gin ser Ala vai Asp vai Asp Asp Vai 85

Glu (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:19: TTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AA6ÂCCAATC 40 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:20: TTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG 35 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:21: GTTATGACAT AGATACATTC TATG 24 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:22:

CCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:23: CTACAAGGAG GAATGCATGG ÂGATACACC 29 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:24:

CATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:25:

CATCTGAAGC TTATCÂATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:26:

CATCTGAAGC TTACTTGCAA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:27:

CATCTGAAGC TTAAAGCGTA GAGTCACACT TGCAACAAAA GGTTACAATA TTGTAATGGG CTCTGTCCG (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:28:

CATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG

Lisboa, 14 de Fevereiro de 2007

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação antigénica compreendendo um capsómero do vírus papiloma humano para utilização como vacina, em que o referido capsómero compreende uma proteína de fusão que compreende uma proteína LI truncada do vírus papiloma humano adjacente a resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína, em que a referida proteína LI e os referidos aminoácidos da referida segunda proteína estão posicionados de modo a inibir a formação de partículas do tipo vírus, cuja formulação induz uma resposta imunológica que neutraliza viriões do vírus papiloma humano.

2. Formulação antigénica compreendendo um capsómero do vírus papiloma humano para utilização como vacina, em que o referido capsómero compreende uma proteína LI truncada do vírus papiloma humano com uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos necessários à formação de uma partícula do tipo vírus, cuja formulação induz uma resposta imunológica que neutraliza viriões do vírus papiloma humano.

3. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 2, em que o referido capsómero compreende uma proteína de fusão que compreende uma proteína LI truncada do vírus papiloma humano adjacente a resíduos de aminoácidos de uma segunda proteína.

4. Formulação antigénica de acordo com qualquer uma das Reivindicações Ϊ, 2 ou 3, em que a proteína é codificada no genoma de um vírus papiloma humano seleccionado do grupo que consiste em HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 e HPV45. 2

5. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 4, em que o vírus papiloma é HPV16.

6. Formulação antigénica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3 ou 5, em que são deletados da proteína Li resíduos de aminoácidos do terminal carboxi.

7. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 6, em que são deletados da proteína LI 1 até 34 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi.

8. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 7, em que são deletados da proteína LI 34 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi.

9. Formulação antigénica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3 ou 5, em que são deletados da proteína LI resíduos de aminoácidos do terminal amino.

10. Formulação antigénica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3 ou 5, em que são deletados da proteína LI resíduos de aminoácidos internos.

11. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 10, em que os resíduos de aminoácidos deletados da proteína LI compreendem um sinal de localização nuclear.

12. Formulação antigénica de acordo com as Reivindicações 1, 2 ou 3, em que os resíduos de aminoácidos da segunda proteína derivam de uma proteína do HPV.

13. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 12, em que a proteína do HPV é uma proteína inicial do HPV. 3

14. Formulação antigénica de acordo com a Reivindicação 12, em que a proteina inicial do HPV é seleccionada do grupo que consiste em El, E2, E3, E4, E5, E6 e E7.

15. Utilização da formulação de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 14 na produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de infecção causada pelo HPV e perturbações relacionadas.

16. Utilização da formulação de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 14 na produção de uma composição farmacêutica para a prevenção de infecção causada pelo HPV e perturbações relacionadas. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2007