JP4520034B2 - パピローマウイルスカプソメアワクチン製剤及び使用方法 - Google Patents
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Description
本発明はパピローマウイルスタンパク質、またはその融合タンパク質、欠切された（truncated）タンパク質、または欠切された融合タンパク質を含んでなるワクチン製剤に関する。さらに本発明は前記製剤を用いた予防及び治療方法に加え、前記製剤のキャプソメアを製造する方法を包含する。
【０００１】
ヒトにおける性器のパピローマウイルスのある高い発症率の株（例えば、ＨＰＶ １６、１８、または４５など）は、肛門性器路（anogenital tract）の悪性腫瘍の形成の主要な危険因子であると考えられている。可能性のある悪性のものとしては、子宮頸部癌が非常に最も頻繁に起きている：世界保健機構（ＷＨＯ）の評価によれば、ほぼ５００，０００の新しい症例が毎年出てきている。この病理の生じる頻度ゆえに、ＨＰＶ感染と子宮頸部癌の関連が広く研究され、多数の一般論に結びついている。
【０００２】
例えば、子宮頸部上皮内の腫瘍形成（ＣＩＮ）の前駆病変はパピローマウイルス感染によって生じることが知られている［クラム(Crum), New Eng. J. Med. 310:880-883(1984)］。例えば、株１６、１８、３３、３５、及び４５を含む、あるＨＰＶタイプのゲノム由来のＤＮＡは、この病態の患者由来の腫瘍から培養されたプライマリーの細胞系に加えて、前記腫瘍のバイオプシーでも９５％を超えて検出されている。バイオプシーを行ったＣＩＮ腫瘍細胞のおよそ５０乃至７０％がＨＰＶ１６からのみ由来しているＤＮＡを含むことがわかった。
【０００３】
ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の初期遺伝子Ｅ６及びＥ７のタンパク質産物は、イン・ビトロで形質転換されたヒトケラチノサイトにおけるのと同様に、子宮頸部癌の細胞系においても検出されており［ウエッツステイン(Wettstein),ら，PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, ピスター(Pfister)（編）, CRC Press:ボカ ラトン(Boca Raton), ＦＬ 1990 pp155-179］、さらにかなりのパーセンテージの子宮頸部癌患者が抗Ｅ６抗体または抗Ｅ７抗体を有している。前記Ｅ６及びＥ７タンパク質は、ヒト細胞において細胞ＤＮＡ合成の誘導、ヒトケラチノサイト及び他の細胞タイプの形質転換、及びトランスジェニックマウスにおける腫瘍形成に関与していることが示されている［アルベルト(Arbelt),ら, J. Virol. 68:4358-4364(1994); アウエワラクル(Auewarakul),ら, Mol. Cell. Biol. 14:8250-8258(1994); バーボサ(Barbosa),ら, J. Virol. 65:292-298(1991); カゥアー(Kaur),ら, J. Gen. Virol.70:1261-1266(1989);シェレゲル(Schlegel),ら, EMBO J. 7:3181-3187(1988)］。前記Ｅ６／Ｅ７タンパク質の本質的な発現にはＨＰＶ陽性腫瘍の形質転換された状態を維持することが必要であるらしい。
【０００４】
イン・ビボ及びイン・ビトロでの腫瘍形成性表現型を誘導する幾種類かのＨＰＶ株の能力にもかかわらず、いまだ他のＨＰＶタイプは尖形コンジロームなどの良性の性器疣を生じるだけで、ただまれに悪性腫瘍と関係している［イケンベルグ(Ikenberg), イン グロス(In Gross), ら,（編）GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS, スプリンガー バーラグ(Springer Verlag):ベルリン, 87-112頁］。このタイプの低い発症率の株には例えば、ＨＰＶ ６及び１１が含まれる。
【０００５】
性器のパピローマウイルスは、性交中にヒトとヒトの間で最も頻繁に伝染し、多くの場合肛門性器の粘液分泌膜におけるしつこい感染をもたらす。この知見は一次感染が不適当な免疫応答を誘導するか前記ウイルスが免疫監督を避ける能力を発達させたことを示唆しているが、別の知見ではパピローマウイルス感染の悪性進行のあいだと同様に初期徴候のあいだに免疫システムが活性であることが示唆される［アルトマン(Altmann)ら, in VIRUSES AND CANCER, ミンソン(Minson)ら,(編) Cambridge University Press ,(1994) pp. 71-80］。
【０００６】
例えば、ウサギ及びウシパピローマウイルスによる一次感染の臨床徴候は疣抽出物またはウイルスの構造タンパク質を用いてワクチン接種を行うことによって防ぐことができる［アルトマンら, 前出;キャンポ(Campo), Curr. Top. In Microbiol and Immunol. 186:255-266(1994); インドル(Yindle)及びフラザー(Frazer), Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186;217-253(1994)］。ＨＰＶ １６初期タンパク質Ｅ６またはＥ７をコードするワクシニア組換え体で、または合成Ｅ６またはＥ７ペプチド類で事前にワクチン接種を行った齧歯類動物は、同様にＨＰＶ１６で形質転換したオーソローガスな細胞の接種後の腫瘍形成から防御される［アルトマンら, 前出;キャンポ,ら,前出;インドル及びフラザー,ら,前出］。動物パピローマウイルスによる感染後の退行動物からのリンパ球の移送により疣の退行が誘導されうる。最後に、例えば臓器移植のレシピエントまたはＨＩＶに感染している個体などの、免疫が抑制された患者において、性器疣、ＣＩＮ、及び肛門性器癌の発生率は高い。
【０００７】
今日まで、予防と治療の両方の意図に適したカプソメアの形態のヒトパピローマウイルス後期Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶワクチン接種については報告されていない。前記Ｌ１タンパク質は悪性の性器病変においては存在しないので、Ｌ１タンパク質を用いたワクチン接種はこれらの患者には治療効果がない。キメラカプソメアを生じる、Ｌ１タンパク質由来のアミノ酸残基と、例えばＥ６またはＥ７タンパク質を含むキメラタンパク質の構築によりワクチンの予防機能と治療機能とが組み合わされる。よって、キメラカプソメアを高レベルに製造する方法は、予防及び治療の介入のためのこのようなワクチンによって提供される可能な利点の観点から特に望ましいであろう。
【０００８】
したがって、当該技術分野においてＨＰＶ感染を予防または処置することができるワクチン製剤を提供する必要がある。組換えＨＰＶタンパク質の発現と精製に付随する当該技術分野における既知の問題を克服するワクチン製剤を製造する方法は、ＨＰＶ感染に感受性のある個体の集団を免疫するために有用であることに加え、ＨＰＶに既に感染している個体の集団を処置するためにも明白に有用であろう。
【０００９】
本発明は、キメラヒトパピローマカプソメアを含む治療及び予防用ワクチン製剤を提供する。本発明はまた、ＨＰＶに対して感受性の個体をＨＰＶ感染から守るための予防方法とともに、ＨＰＶに感染した患者を処置するための治療方法をも提供する。また、本発明のカプソメア及びタンパク質の製造と精製のための方法も意図される。
【００１０】
本発明の一側面において、パピローマウイルスの構造タンパク質Ｌ１及びＬ２を含むＨＰＶ感染を防ぐための予防ワクチン接種が考慮される。経済的にワクチンを製造するための充分な量のウイルスタンパク質を提供するために細胞培養または他の実験システムにおいて適当な力価までパピローマウイルスを増やすことができないので、このタイプのワクチンの開発は重大な障害に直面している。さらに、前記タンパク質を発現するための組換え方法は必ずしも容易ではなく、しばしば低いタンパク収量に終わっている。最近、ウイルスのカプシド構造を構成する点で類似している、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が記載されており、組換え体ワクチンまたはバキュロウイルスを用いたウイルスＬ１及びＬ２（またはそれ自身におけるＬ１）の発現において前記粒子はＳｆ−９昆虫細胞において形成される。ＶＬＰの精製はショ糖勾配またはＣｓＣｌにおける遠心分離によって非常に簡単に達成できる［キンバウアー(Kimbauer),ら, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 99:12180-12814(1992);キンバウアー,ら, J. Virol. 67:6929-6936(1994);プロソ(Proso),ら, J. Virol. 6714:1936-1944(1992);ササガワ(Sasagawa),ら, Virology 2016:126-195(1995);ボルパース(Volpers),ら, J. Virol. 69:3258-3264(1995);ゾウ(Zhou),ら, J. Gen. Virol. 74:762-769(1993);ゾウ,ら, Virology 185:251-257(1991)］。ＷＯ ９３／０２１８４には、診断に応用するため、またはパピローマウイルスによって引き起こされた感染に対してのワクチンとしてパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いる方法が記載されている。ＷＯ ９４／００１５２には、ヒト及び動物パピローマウイルス粒子のコンフォメーション中和エピトープによく似たＬ１タンパク質の組換え体の製造が記載されている。
【００１１】
本発明の別の側面において、治療用ワクチン接種を例えば子宮頸部癌またはパピローマウイルス感染に起因する前駆病変の複雑化を緩和するために提供し、よって予防的介入に対する選択肢を表す。このタイプのワクチン接種は持続的に感染している細胞において発現する、初期パピローマウイルスタンパク質、本質的にはＥ６またはＥ７を含むものでもよい。このタイプのワクチン接種の投与に続き、細胞傷害性Ｔ細胞が性器の病変において持続的に感染している細胞に対して活性化されるかもしれないと想定される。治療介入のターゲット集団はＨＰＶに関連した前悪性または悪性の性器病変をもつ患者である。ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９３／２０８４４には、ＨＰＶまたはＢＰＶ由来のパピローマウイルスの初期タンパク質Ｅ７及びその抗原断片が退行に治療的に有効であることが開示されているが、それは哺乳動物におけるパピローマウイルス腫瘍の、予防においてではない。初期ＨＰＶタンパク質は大腸菌または適当な真核細胞タイプにおける組換え体発現によって製造されているが、本質的な低溶解性と、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過及びアフィニティー・クロマトグラフィーを含む工程の組み合わせを一般的に必要とする複雑な精製手順ゆえに、前記組換え体の精製が困難であることが証明されている。
【００１２】
本発明によれば、パピローマウイルスカプソメアを含むワクチン製剤を提供し、前記製剤は（ｉ）第１のタンパク質であって、第２のタンパク質由来のアミノ酸残基の一部を含む融合タンパク質として発現する完全なウイルスタンパク質である第１タンパク質；（ｉｉ）欠切されたウイルスタンパク質；（ｉｉｉ）第２タンパク質由来のアミノ酸残基の一部を含む融合タンパク質として発現する欠切されたウイルスタンパク質、または（ｉｖ）前記３タイプのタンパク質のいくつかの組み合わせのいずれかを含んでなる。本発明によれば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）及びヒトパピローマウイルスのカプソメアを含むワクチン製剤が提供される。好ましいウシウイルスカプソメアは、ウシパピローマウイルスタイプＩ由来のタンパク質を含んでいる。好ましいヒトウイルスカプソメアは、ヒトパピローマウイルス株ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ４５のいずれかひとつの株由来のタンパク質を含むものである。最も好ましいワクチン製剤は、ＨＰＶ１６由来のタンパク質を含むカプソメアを含んでなる。
【００１３】
一側面において、本発明のカプソメアワクチン製剤は第２タンパク質由来の付加的なアミノ酸残基をともなった融合タンパク質として発現する第１の完全なウイルスタンパク質を含む。好ましい完全ウイルスタンパク質は構造パピローマウイルスタンパク質Ｌ１及びＬ２である。完全ウイルスタンパク質融合体を含むカプソメアは、前記Ｌ１及びＬ２タンパク質をともに用いてもまたはＬ１タンパク質単独を用いて製造してもよい。好ましいカプソメアは完全にＬ１融合タンパク質から成り立っており、そのアミノ酸配列は配列番号：２に記載され、配列番号：１のポリヌクレオチド配列によってコードされている。第２タンパク質のアミノ酸は第２タンパク質のアミノ酸残基の第１タンパク質への添加がカプソメアの形成を許容する限り多数の 供給源（第１タンパク質由来のアミノ酸残基を含む）から誘導できる。好ましくは、第２タンパク質のアミノ酸残基の添加が完全なウイルスタンパク質の能力を阻害しウイルス様粒子構造を形成する；最も好ましくは第２タンパク質のアミノ酸残基がカプソメア形成をプロモートする。本発明の１態様において、第２タンパク質は新生物のまたは感染の疾患状態における免疫応答を刺激するのに重要ないかなるヒト腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原であってもよい。好ましい実施態様において第２タンパク質はまたパピローマウイルスタンパク質である。また第２タンパク質がパピローマウイルスの初期遺伝子の発現産物であることが好ましい。しかしながら、また第２タンパク質がＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７--パピローマウイルス株ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、またはＨＰＶ４５のゲノムにコードされた初期遺伝子産物の群から選択されることが好ましい。第２タンパク質がＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子でコードされていることが最も好ましく、その読み取り枠は配列番号：３に記載されている。融合タンパク質サブユニットから組み立てられたカプソメアは本明細書ではキメラカプソメアという。１実施態様では、本発明のワクチン製剤はＬ１タンパク質アミノ酸残基が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ５０乃至９９％から成り立っているキメラカプソメアを含んでなる。別の実施態様において、Ｌ１アミノ酸残基が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ６０乃至９０％から成り立っており、特に好ましい実施態様においてはＬ１アミノ酸が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ８０％を含む。
【００１４】
本発明の別の側面において、カプソメアワクチン製剤が提供され、前記製剤はウイルス様粒子の形成に必要な１以上のアミノ酸残基の欠失を有する欠切されたウイルスタンパク質を含んでいる。アミノ酸の欠失が欠切されたタンパク質によるカプソメアの形成を阻害しないことが好ましく、前記欠失がカプソメア形成に有利に働くことが最も好ましい。このタイプの好ましいワクチン製剤はＬ２ウイルスタンパク質とともにまたはなしに欠切されたＬ１を含むカプソメアを含んでなる。特に好ましいカプソメアは欠切されたＬ１タンパク質を含むものである。本発明によって意図される欠切されたタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質のアミノ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質の内部領域から（すなわち、いずれの末端からでもない）欠失された１以上のアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。好ましいカプソメアワクチン製剤は、カルボキシ末端で欠切されたタンパク質を含んでなる。ＨＰＶ１６から由来したＬ１タンパク質を含む製剤においては、１乃至３４のカルボキシ末端アミノ酸残基が欠失されていることが好ましい。Ｌ１タンパク質及びそれによって形成されたカプソメアの抗原性質のマイナー修飾について利点をもたらす比較的短い欠失もまた意図される。しかしながら、３４アミノ酸残基がＬ１配列から欠失されていることが最も好ましく、そのアミノ酸配列は配列番号：２に記載されているＨＰＶ１６におけるアミノ酸４７２から５０５であり、かつ配列番号：１に記載された配列をヒトＨＰＶ１６Ｌ１をコードする配列におけるヌクレオチド１４１４から１５１６に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。カプソメアワクチン製剤が内部欠失のあるタンパク質から成り立っている場合、欠失されたアミノ酸配列がタンパク質の核局在化領域を含むことが好ましい。ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質において、核局在化シグナルが約アミノ酸残基４９９から約アミノ酸残基５０５で見出されている。ＮＬＳが欠失しているＬ１タンパク質の発現に続き、カプソメア構造の組立てが宿主細胞の細胞質で起こる。その結果、カプソメア内に完全なＬ１タンパク質が組み立てられている核からに代え、細胞質からカプソメアの精製が可能である。付加的なアミノ酸配列が欠失されたタンパク質配列に置き換わっていない、欠切されたタンパク質の組立てから結果として得られたカプソメアは必ずしも天然においてキメラではない。
【００１５】
本発明のさらなる別の側面において、第２タンパク質由来のアミノ酸残基に近接する融合タンパク質として発現された欠切されたウイルスタンパク質を含むカプソメアワクチン製剤を提供する。本発明の好ましい欠切されたウイルスタンパク質は構造パピローマウイルスタンパク質Ｌ１及びＬ２である。欠切されたウイルスタンパク質融合物を含むカプソメアは、Ｌ１及びＬ２タンパク質成分をともにまたはＬ１タンパク質単独で用いて製造してもよい。好ましいカプソメアは、Ｌ１タンパク質アミノ酸残基を含むタンパク質である。融合タンパク質の欠切されたウイルスタンパク質成分は、タンパク質のカルボキシ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質のアミノ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質の内部領域から（すなわち、いずれの末端からでもない）欠失された１以上のアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。好ましいカプソメアワクチン製剤はカルボキシ末端で欠切されたタンパク質を含む。ＨＰＶ１６に由来するＬ１タンパク質を含むそれらの製剤においては、１乃至３４カルボキシ末端アミノ酸残基が欠失していることが好ましい。融合タンパク質と、形成されるそのカプソメアのＬ１タンパク質成分の抗原特性の若干の修飾の利点を与える、比較的短い欠失体も企図される。しかしながら、最も好ましいのは、配列番号：２に示すＨＰＶ１６のアミノ酸４７２から５０５までに対応する、Ｌ１配列から３４アミノ酸残基が欠失されたものであって、配列番号：１に示すヒトＨＰＶ１６ Ｌ１をコードする配列の１４１４から１５１６までのヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド配列によってコードされるものである。ワクチン製剤が内部欠失を有するタンパク質で構成されるカプソメアを含む場合、欠失されるアミノ酸配列はタンパク質の核局在化領域、すなわちその配列を含むことが好ましい。
【００１６】
第２タンパク質のアミノ酸は、第１タンパク質への当該第２タンパク質アミノ酸残基の添加がカプソメアの形成を可能とする限りにおいて数多くの供給源に由来するものとすることができる。好ましくは、第２タンパク質アミノ酸残基の添加によって、カプソメア形成が促進または推進される。第２タンパク質のアミノ酸残基は、第１タンパク質のアミノ酸残基を含めた数多くの供給源に由来するものとすることができる。好ましい実施態様において、第２タンパク質もまたパピローマウイルスタンパク質である。さらに、第２タンパク質がパピローマウイルス初期遺伝子の発現産物であっても好ましい。しかしながら最も好ましくは、パピローマウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７遺伝子によってコードされる初期遺伝子産物よりなる群から第２タンパク質が選択される。一実施態様において、本発明のワクチン製剤は、キメラカプソメアを含んでなり、ここでＬ１タンパク質アミノ酸残基が、融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ５０乃至９９％を構成している。他の実施態様において、Ｌ１アミノ酸残基は、融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ６０乃至９０％を構成しており、特に好ましい実施態様にあっては、Ｌ１アミノ酸残基が融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ８０％を構成している。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチン製剤のタンパク質は組換え法によって生産されるが、完全体のウイルスタンパク質を含む製剤の場合には、タンパク質が天然の供給源から単離されたものであってもよい。天然の供給源から単離された完全体のタンパク質は、よく知られており当該技術分野で日常的に実施されている共有結合修飾の技術を使用して、本発明の融合タンパク質を提供すべくさらに付加的なアミノ酸残基を含めるよう、イン・ビトロで修飾してもよい。同様に、欠切されたウイルスタンパク質を含む製剤で、タンパク質が天然の供給源から単離されたものでもよく、そしてイン・ビトロにて、化学的加水分解、または数多くの部位特異的または一般的プロテアーゼのいずれかを用いた酵素消化を使用して加水分解を行ってもよく、そして欠切したタンパク質は引き続き、本発明の欠切した融合タンパク質を提供すべく前記のごとくにさらに付加的なアミノ酸残基を含むよう修飾を施されてもよい。
【００１８】
カプソメアを製造するに際して、所望の完全体タンパク質、欠切体タンパク質、つまり欠切された融合タンパク質の何れかをコードするＤＮＡを製造するのに、組換え分子生物学的技術を利用することができる。所望のタンパク質をコードするＤＮＡを製造するために必要な組換え法はよく知られており、当該技術分野で日常的に実施されている。実験マニュアル、例えば、Sambrookら（編）、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989)及びAusebelら（編）、PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons. Inc.、(1994-1997)に、ＤＮＡ操作を行うために必要な技術の詳細が記載されている。キメラカプソメアの大量生産のためには、ウイルスまたは真核細胞性ベクターの何れかを用いたタンパク質発現を行うことができる。好ましいベクターには、あらゆる既知原核細胞性発現ベクター、組換えバキュロウイルス、ＣＯＳ細胞特異的ベクター、ワクシニア組換え体、あるいは酵母特異的発現構築体が包含される。本発明のカプソメアを提供するために組換えタンパク質が用いられる場合、タンパク質を先ず、その発現の宿主細胞から単離し、そしてその後、カプソメアを提供すべく自己会合を許容する条件下にインキュベーションを行うとよい。あるいは、宿主細胞中でカプソメアが形成される条件下に、タンパク質を発現させてもよい。
【００１９】
本発明はさらに、ワクチン製剤のカプソメアを生産するための方法も企図するものである。一つの方法においては、Ｌ１タンパク質をコードする配列のカルボキシ末端でさらに付加的な６つのヒスチジンをコードするＤＮＡから、Ｌ１タンパク質が発現される。付加的なヒスチジンと共に発現されるＬ１タンパク質（His Ｌ１タンパク質）は、最も好ましくは大腸菌で発現され、そしてこのHis Ｌ１タンパク質は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。細胞溶解液中のHis Ｌ１タンパク質を変性用緩衝液（例えば６Ｍグアニジン塩酸塩または同等の変性能を有する緩衝液）に懸濁し、次いでニッケルクロマトグラフィーに付す。ニッケルクロマトグラフィーの工程から溶出されたタンパク質は、例えば１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１％Triton-Ｘ１００、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸）、ｐＨ７．４にて再生される。本発明の好ましい方法によれば、精製タンパク質の透析後に、好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｃａ2+、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、０．１％Triton-Ｘ１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ［トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン］酢酸（ｐＨ値５．０のもの）に対する透析後に、カプソメアの会合が起こる。
【００２０】
カプソメアの形成は、電子顕微鏡によってモニターすることができ、そしてカプソメアが融合タンパク質を含む場合にあっては、会合したカプソメア中の様々なタンパク質成分の存在を特異抗血清を用いたウェスタンブロット分析によって確認することができる。
【００２１】
本発明によれば、ＨＰＶウイルスに感染した個体を治療処置するための方法が提供され、この方法は、ＨＰＶ感染のレベルを低減するに有効な量の本発明のワクチン製剤を、それを必要としている患者個体に投与する工程を含むものである。本発明はさらにまた、ＨＰＶ感染に対して感受性の個体の予防処置のための方法を提供し、ＨＰＶ感染を防ぐのに有効な量の本発明のワクチン製剤を、ＨＰＶ感染に対して感受性の個体に投与する工程を含む。感染した個体は標準的な診断技術を使用して容易に同定することができるが、感受性の個体については、例えば感染した個体との性交渉をもったことなどに基づいて同定してもよい。しかしながら、ＨＰＶ感染が高頻度であることに起因して、性的に活動性を有するヒトはすべて、パピローマウイルス感染に対して感受性であるといえよう。
【００２２】
ワクチン製剤の投与には、医薬上容認しうる担体、希釈剤、アジュバント、及び／または緩衝液などの、１以上の付加成分を包含することができる。ワクチンは、単回投与しても、または複数回投与してもよい。本発明のワクチン製剤は、例えば経口、静脈内、筋肉内、経鼻、直腸内、経皮、腟内、皮下、及び腹腔内投与などを包含する様々な経路によって送達させることができる。
【００２３】
本発明のワクチン製剤は、従来のワクチン調製剤に比較すると多大な利点をもたらすものである。治療用のワクチン接種の一部として、ＣＩＮまたは子宮頸部癌の患者における、持続的に感染した細胞の除去を、カプソメアが促進することができる。加えて、このタイプの治療用ワクチン接種は、再感染によるＣＩＮ病変を有する患者を保護する予防的な目的にも役立てることができる。さらなる利点として、カプソメアは既存の抗カプシド抗体による中和を回避することができ、それによってキメラウイルス様粒子に比較して、より長い循環半減期を有している。
【００２４】
キメラカプソメアを含むワクチン製剤は、カプソメアが形成される融合タンパク質の両タンパク質成分の抗原性上昇という、さらなる利点を提供することができる。例えば、ＶＬＰでは潜在しているカプソメアのタンパク質成分が、ＶＬＰ自体の内部への内部配置の結果、構造全体として埋没してしまうかもしれない。同様に、タンパク質成分のエピトープがカプソメア−カプソメアの接触の結果、立体的に遮蔽され、従って免疫応答性を惹起するように接近することができなくなることがある。Ｌ１／Ｅ７融合タンパク質を用いてＶＬＰを生産する予備実験の結果、Ｅ７成分に対して抗体の応答が検出できず、このような配置が裏付けられた。この観察は、Ｌ１のカルボキシ末端領域が、カプシドへのカプソメアの会合を許容する五量体間腕構造を形成することを示唆する、以前観察された結果［ガルシア(Garcia)ら、J.Viol.,71: 2988-2955(1997)］に合致するものである。おそらくキメラカプソメア構造では、融合タンパク質下位構造の両タンパク質成分が免疫応答を惹起するよう、接近可能となっているのであろう。カプソメアワクチンは従って、例えばＬ１アミノ酸配列として発現される、他のウイルスタンパク質由来の中和エピトープを含めて種々のタンパク質成分の抗原性を増大させるというさらなる利点をもたらすはずである。
【００２５】
本発明は、以下の実施例によって例証されるものである。
【００２６】
これらの実施例に示される本発明に種々の修飾や改変を施すことが当業者に想起されるものと考えられる。本発明が特許請求の範囲によってしか限定されないことはもちろんである。
【００２７】
実施例１には、融合、あるいはキメラウイルスタンパク質を製造するための発現ベクターの構築を記載する。実施例２は、ウイルスタンパク質の発現のための組換えバキュロウイルスの作製に関するものである。実施例３には、カプソメアの精製を述べる。実施例４では、抗血清及びモノクローナル抗体の製造のための免疫付与プロトコルを記載する。実施例５には、カプソメア形成を定量するためのペプチドＥＬＩＳＡを示す。実施例６には、カプソメア形成を定量するための抗原捕獲ＥＬＩＳＡを記載する。実施例７には、中和抗体の誘導について分析するための赤血球凝集アッセイを示す。
【００２８】
［実施例１：キメラＬ１遺伝子の構築］
ＨＰＶ１６ Ｌ１の転写解読枠をコードするＤＮＡを、プラスミド16-114/k-L1/L2-pSynxtVI-［Kirnbauerら、Virol. 67巻、6929〜6939頁(1994)］からBglIIを用いて切り出し、得られた断片を、予め固有のBamHI制限部位にて直鎖にしておいたpUC19へとサブクローニングした。先ず、２つの塩基性発現構築体を作製して、融合タンパク質発現を許容すべく引き続いてのＤＮＡの挿入を可能とした。１つの構築体は、９つのアミノ酸の欠失を有する、ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310をコードしており、欠失された領域は他のパピローマウイルスＬ１タンパク質すべてと低い相同性を示すことが知られていた。第２の構築体であるＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣは、カルボキシ末端のＬ１残基の３４アミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードしていた。他の構築体には、他のタンパク質の配列をコードするＤＮＡの挿入を容易ならしめるために、欠失位置にEcoRV制限部位を含んでいる。EcoRV制限部位の付加によって、非Ｌ１タンパク質のアミノ酸２つ、すなわち、アスパラギン酸及びイソロイシンがコードされることとなっている。
【００２９】
Ａ．ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310発現構築体の作製
２つのプライマー（配列番号：５及び６）を、pUC19ベクターと、配列番号：１のヌクレオチド第９１６位から９４２位までを除いた完全なＨＰＶ１６Ｌ１コード配列とを増幅させるように設計した。プライマーはまた、増幅産物の末端で固有のEcoRV制限部位（配列番号：５及び６の下線部）も導入するように合成されていた。
【００３０】
CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG
（配列番号：５）
CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG
（配列番号：６）
こうして得られたＰＣＲ産物をEcoRVで消化して相補性端部を与え、その消化産物を連結反応により環状とした。連結したＤＮＡを標準技術を用いて大腸菌に形質転換し、その結果得られたコロニーからのプラスミドをEcoRV制限部位の存非についてスクリーニングした。ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310と命名した１つのクローンは、適切な２７ヌクレオチドの欠失を有しているものとして同定され、この構築体を下記のとおりEcoRV部位にて他のＨＰＶ１６タンパク質をコードしているＤＮＡ断片を挿入するために使用した。
【００３１】
Ｂ．ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体の作製
２つのプライマー（配列番号：７及び８）を、プライマーが相互に近接して、前記のとおりpUC19にＨＰＶ１６Ｌ１をコードする配列を含む鋳型ＤＮＡ上で逆方向の増幅を可能とするように、ＨＰＶ１６Ｌ１の転写解読枠に対して相補的に設計した。
【００３２】
AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC
（配列番号：７）
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG
（配列番号：８）
各プライマーは、増幅産物の末端にEcoRV制限部位を導入するものであった。下流のプライマー（配列番号：８）では、EcoRV端部を連結して環状とした場合に増幅産物が３４カルボキシ末端Ｌ１アミノ酸の欠失を含むように、EcoRV部位の後にTAA翻訳終止コドンが配置されていた。ＰＣＲを実施して部分的なＬ１転写解読枠と完全なベクターを増幅させた。増幅産物をEcoRVで切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状として大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換した。生存能力のあるクローン由来のプラスミドを、プラスミドを直鎖状にさせるEcoRV部位の存在について分析した。pUCHPV16L1ΔCと命名した１つの陽性の構築体を同定し、EcoRV部位を利用して他のＨＰＶ１６タンパク質からＤＮＡを挿入するために使用した。
【００３３】
Ｃ．ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310及びＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣへのＤＮＡ断片の挿入
配列番号：４のアミノ酸１〜５０、１〜６０、１〜９８、２５〜７５、４０〜９８、５０〜９８をコードするＨＰＶ６ Ｅ７のＤＮＡ断片を、ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310とＨＰＶ１６Ｌ１Δの修飾配列のいずれかへの断片の挿入を容易ならしめるために、端部５’EcoRV制限部位が導入されたプライマーを用いて増幅させた。様々な増幅反応で、プライマーＥ７．１（配列番号：９）をプライマーＥ７．２（配列番号：１０）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜５０をコードするＤＮＡ断片を作製し、プライマーＥ７．３（配列番号：１１）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜６０をコードするＤＮＡ断片を作製し、あるいはプライマーＥ７．４（配列番号：１２）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜９８をコードするＤＮＡ断片を作製した。他の増幅反応において、Ｅ７．５（配列番号：１３）とＥ７．６（配列番号：１４）のプライマー対を用いてＥ７アミノ酸２５〜７５をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、Ｅ７．７（配列番号：１５）とＥ７．４（配列番号：１２）を用いてＥ７アミノ酸４０〜９８をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、そしてＥ７．８（配列番号：１６）とＥ７．４（配列番号：１２）を用いてＥ７アミノ酸５０〜９８をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。
【００３４】
プライマーＥ７．１（配列番号：９）
AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
プライマーＥ７．２（配列番号：１０）
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC
プライマーＥ７．３（配列番号：１１）
TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATG GGCC
プライマーＥ７．４（配列番号：１２）
AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC
プライマーＥ７．５（配列番号：１３）
TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG
プライマーＥ７．６（配列番号：１４）
TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC
プライマーＥ７．７（配列番号：１５）
TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC
プライマーＥ７．８（配列番号：１６）
TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTG
同様に、インフルエンザマトリックスタンパク質（配列番号：１７）をコードするＤＮＡ由来のヌクレオチドを、配列番号：１９及び２０に示すプライマー対を使用して増幅させた。両プライマーはいずれも増幅産物中にEcoRV制限部位を導入するものであった。
【００３５】
TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC
（配列番号：１９）
TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG
（配列番号：２０）
各増幅反応から得られたＰＣＲ産物は、EcoRVで切断し、同酵素を用いて予め直鎖状にしておいたＨＰＶ１６Ｌ１Δ310とＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ配列のいずれかのEcoRV部位へと挿入した。Ｅ７アミノ酸２５〜７５及び５０〜９８をコードするプラスミド、そしてインフルエンザマトリックスタンパク質を含むプラスミドでのインサートの方向を調べるために、新しく作られたEcoRV制限部位（GATATCGAT）に重複する制限部位の利点を有し、上流プライマーに含められたClaI消化を採用した。ＨＰＶ１６ Ｅ７の開始のメチオニンを含む３つの発現構築体について、Ｅ７コード領域内のNslI制限部位を利用して挿入方向を調べた。
【００３６】
適切なインサートを有する発現構築体が同定されると、Ｌ１と挿入されたアミノ酸の双方に対するタンパク質コード領域を制限酵素XbaI及びSmaIを用いてユニットとして切り出し、そして単離したＤＮＡをプラスミドpVL1393（Invitrogen社）へと連結して組換えバキュロウイルスを作製した。
【００３７】
Ｄ．発現構築体中のEcoRV制限部位の除去
ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ配列は、野生型Ｌ１ポリペプチドには通常認められないアミノ酸の翻訳を結果的に引き起こすEcoRV部位由来のＤＮＡを含んでいる。しかして、人工的なEcoRV部位が除去された一連の発現構築体を設計した。発現構築体のこのシリーズに対するＬ１配列は、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*と命名した。
【００３８】
ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*配列を含む発現構築体を作製するために、２つのＰＣＲ反応を実施して、Ｅ７アミノ酸１〜５０をコードするpUC−ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣからの２つの重複断片を増幅させた。こうして得られたＤＮＡ断片は、Ｌ１／Ｅ７境界の位置で重複していたが、２つのEcoRV制限部位は含んでいなかった。断片１はプライマーＰ１（配列番号：２１）及びＰ２（配列番号：２２）を用いて作製され、断片２はプライマーＰ３（配列番号：２３）及びＰ４（配列番号：２４）を用いて作製された。
【００３９】
プライマーＰ１（配列番号：２１）
GTTATGACATACATACATTCTATG
プライマーＰ２（配列番号：２２）
CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC
プライマーＰ３（配列番号：２３）
CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC
プライマーＰ４（配列番号：２４）
CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG
第１の２つの増幅反応の後、２つの精製産物を、プライマーＰ１及びＰ４のみを使用したさらなるＰＣＲ反応における鋳型として用いた。こうして得られた増幅産物を、酵素EcoNI及びHindIIIで消化して前記のＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体へと挿入し、続いて同酵素で消化した。得られた発現構築体は、２つの内部EcoRV制限部位を喪失しているという点でＬ１及びＥ７アミノ酸１〜５０をコードするＤＮＡを含む元のＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ構築体と相違していた。第１のEcoRV部位は、本来のこの位置にあるＬ１のアラニン及びグリシンアミノ酸をコードするＤＮＡに置換されており、第２の部位は翻訳終止シグナルに置換されていた。加うるに、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-52と命名された発現構築体は、第５１位のヒスチジンと第５２位のチロシンのＥ７アミノ酸残基もコードするプライマーＰ４を用いた結果、ＨＰＶ１６ Ｅ７の最初の５２アミノ酸を含んでいた。次いで、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-52を使用し、プライマーＰ１（配列番号：２１）をプライマーＰ５（配列番号：２５）と組み合わせて用いて、Ｅ７アミノ酸の１〜５５をコードするＤＮＡをさらに包含する、さらなるＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体を作製した。また、プライマー対Ｐ１及びＰ６（配列番号：２６）を用いてＥ７アミノ酸の１〜６０を、そしてプライマー対Ｐ１及びＰ７（配列番号：２７）を用いてＥ７アミノ酸の１〜６５をコードするＤＮＡをさらに包含するものを作製した。増幅産物中のさらに付加したアミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、所望のアミノ酸に対する付加的なヌクレオチドを含むようなプライマーの設計から生じるものであった。
【００４０】
プライマーＰ５（配列番号：２５）
CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
プライマーＰ６（配列番号：２６）
CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
プライマーＰ７（配列番号：２７）
CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAAC-
AAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
同様に、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-70を、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-66をコードする鋳型ＤＮＡとプライマー対Ｐ１及びＰ８（配列番号：２８）を用いて作製した。
【００４１】
プライマーＰ８（配列番号：２８）
CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
各ＰＣＲ反応の後、増幅産物をEcoNI及びHindIIIで消化して、予め同酵素で消化しておいたＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣに挿入した。各構築体の配列は、蛍光鎖終止ジデオキシヌクレオチドを用い、Applied Biosystems Prism 377配列決定装置を使用して決定した［Proberら、Science、238巻、336〜341頁(1987)］。
【００４２】
［実施例２：組換えバキュロウイルスの作製］
Spodoptera frugiperda（Ｓｆ９）細胞を、１０％胎児仔ウシ血清及び２ｍＭグルタミンを追加したＴＮＭＦＨ培地（Sigma社）中で２７℃で懸濁または単層培養にて生育した。ＨＰＶ１６Ｌ１に基づく組換えバキュロウイルス構築体に対し、２μｇのBaculo-Gold ＤＮＡ（PharMingen、サンディエゴ、カリホルニア州）と共に１０μｇの伝達プラスミドを用いて、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトした。製造業者が提示したプロトコルに従うことにより組換えウイルスを精製した。
【００４３】
ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質の発現について調べるために、１０5個のＳｆ９細胞を５〜１０の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ）でバキュロウイルス組換え体で感染させた。２８℃にて３乃至４時間インキュベートした後、培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＳＤＳ試料用緩衝液に溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ＨＰＶ１６Ｌ１及び抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。
【００４４】
いずれのキメラＬ１タンパク質発現構築体が優先的にカプソメアを生産するかを調べるために、トランスフェクトした細胞からの抽出物を密度勾配遠心分離に付した。密度勾配から得られた画分をウェスタンブロッティングによりＬ１タンパク質含量について、そして電子顕微鏡によりＶＬＰ形成について分析した。その結果を表１に示す。
【００４５】
完全なＨＰＶ Ｌ１タンパク質そして、発現産物ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310及びＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣはそれぞれ、同等の比率でカプソメア及びウイルス様粒子を生産することが示された。Ｅ７をコードする配列をＨＰＶ１６Ｌ１Δ310ベクターへ挿入すると、生産されるＥ７アミノ酸１〜５０を含む融合タンパク質だけが検出可能な程度にカプソメア形成を上昇させた。
【００４６】
Ｅ７をコードするＤＮＡをＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣベクターへ挿入すると、すべての融合タンパク質がカプソメアを生産することが見出され、Ｅ７アミノ酸４０〜９８を含むキメラタンパク質は、専一的にカプソメア構造を最高レベルで生産した。Ｅ７アミノ酸１〜９８及び２５〜７５を含むキメラタンパク質は双方とも、主にカプソメアを生産したが、それでもウイルス様粒子の形成も観察された。Ｅ７アミノ酸１〜６０を含むキメラタンパク質では、ほぼ同レベルのカプソメアとウイルス様粒子の生産が認められた。
【００４７】
Ｅ７配列がＨＰＶ１６Ｌ１*ΔＣベクターに挿入されると、すべての融合タンパク質がカプソメアを形成することが示された。Ｅ７残基の１〜５２、１〜５５、及び１〜６０をコードするＤＮＡの挿入で、最高レベルのカプソメアが生産されたが、ウイルス様粒子の生産は同レベルで観察された。１〜６５、１〜７０、２５〜７５、４０〜９８及び１〜９８の残基に対するＥ７ ＤＮＡをコードするＤＮＡの挿入の結果、比較的低レベルの、または検出不能なレベルのカプシドが生じたものの、カプソメアは多量に生産された。
【００４８】
【表１】
【００４９】
［実施例３：カプソメアの精製］
トリコプルシアニ（Trichopulsia ni、ＴＮ）High Five細胞を、Ex-Cell４０５無血清培地（ＪＲＨ Biosciences）中でおよそ２×１０6細胞／ｍｌの密度で生育した。およそ２×１０8の細胞を、１０００×ｇで１５分間遠心分離することによりペレット化し、２０ｍｌの培地に再懸濁し、そして２乃至５のｍ．ｏ．ｉで１時間室温にて組換えバキュロウイルスで感染させた。２００ｍｌの培地を添加した後、細胞を播種し、２７℃にて３乃至４日間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を回収してペレット化し、そして１０ｍｌの抽出用緩衝液に再懸濁させた。
【００５０】
以下の工程は４℃にて実施した。細胞を６０ワットで４５秒間超音波処理し、そうして得られた細胞溶解液をSorvalＳＳ３４ローターにて１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り出して生じたペレットを６ｍｌの抽出用緩衝液に再懸濁してさらに６０ワットで３秒間超音波処理し、再度遠心分離する間保存しておいた。２回分の上清を併せて１４ｍｌの４０％スクロースを８ｍｌのＣｓＣｌ溶液（抽出用緩衝液８ｍｌ当たり４．６ｇのＣｓＣｌ）上方に含む２段階密度勾配の上に積層し、そして１０℃にて２７，０００ｒｐｍで２時間、SorvalＡＨ６２９スイングバケットローターで遠心分離した。ＣｓＣｌとスクロースとの間の界面領域を、ＣｓＣｌ完全層に沿って１３．４ｍｌのQuicksealチューブ（Beckman）に集め、そして抽出用緩衝液を添加して容量を１３．４ｍｌに調整した。試料をBeckman ７０ ＴＩローターで２０℃にて５０，０００ｒｐｍで終夜遠心分離した。密度勾配は、２１ゲージの針でチューブの上部と底部を穿孔することにより分画（１画分につき１ｍｌ）した。画分を各チューブから集めて、各画分の２．５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗−ＨＰＶ１６Ｌ１抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【００５１】
ウイルス様粒子とカプソメアとを、１０乃至５０％スクロース勾配に沈降する、前記同定画分から分離した。ＣｓＣｌ密度勾配からのピーク画分を集めて、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に対して２時間透析した。透析液の半分を用いて、ＥＤＴＡ（最終濃度５０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５０ｍＭ）、ＤＴＴ（３０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、及びＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０（１０ｍＭ）を添加することによる完全体のＶＬＰの離合によってカプソメアを生産した。対照として、残り半分にＮａＣｌ及びＴｒｉｓ／ＨＣｌのみを添加した。
【００５２】
離合させたＶＬＰを分析するために、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＴ（各々５ｍＭ）をスクロースクッションに添加して、これを２５０，０００×ｇで４℃にて２乃至４時間遠心分離した。底部からチューブを穿孔することにより画分を集めた。各画分の１：１０希釈液を、次いで抗原捕獲ＥＬＩＳＡによって分析した。
【００５３】
［実施例４：ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体の製造のための免疫付与プロトコル］
６０μｇのＨＰＶキメラカプソメアを、完全または不完全フロインドアジュバントと１：１で混合して総容量１００μｌとしたものを用いて、４週間おきに３回、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し皮下に免疫付与する。第３回目の免疫付与から６週間後にマウスを屠殺し、心臓穿刺により血液を集める。
【００５４】
［実施例５：カプソメア形成を定量するためのペプチドＥＬＩＳＡ］
ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＥ７０１［Mullarら、1982］５０μで、微量定量プレート（Dynatech）を終夜被覆する。ＰＢＳ中に５％ＢＳＡ及び０．０５％Tween ２０を含有する緩衝液１００μｌで、３７℃にて２時間ブロッキングを行い、そして０．０５％Tween ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。第３回目の洗浄の後、ＢＳＡ／Tween ２０／ＰＢＳで１：５０００に希釈した５０μｌの血清を各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを１時間実施する。プレートを前回と同様に再度洗浄し、そして１：５０００希釈にて、ヤギ−抗マウスペルオキシダーゼ接合物５０μｌを添加する。１時間後にプレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質（０．１Ｍナトリウム−酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．２）中に、０．２ｍｇ／ｍｌ、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズヒアゾリン−β−スルホン酸を、１０ｍｌに対し４μｌの３０％Ｈ2Ｏ2と共に含むもの）を用いて染色する。Dynatech自動式プレートリーダーにて、４９０ｎｍで１時間後に吸光度を測定する。
【００５５】
［実施例６：カプソメア形成を定量するための抗原捕獲ＥＬＩＳＡ］
ＣｓＣｌ密度勾配でのウイルス様粒子及びカプソメアの相対的な定量を許容するために、抗原捕獲ＥＬＩＳＡを利用した。微量定量プレートを、ＨＰＶ１６Ｌ１に対して免疫特異性を有する、プロテインＡで精製されたマウスモノクローナル抗体（抗体２５／Ｃ、ＭＭ０７及びRitti１は、ＨＰＶ１６ ＶＬＰを用いて免疫付与したマウスから得たもの）の１：５００希釈液（ＰＢＳ中、最終濃度は１ｍｌ当たり２μｇ）５０μｌ／ウェルで終夜被覆した。プレートを５％ミルク／ＰＢＳで１時間ブロッキングし、そしてＣｓＣｌ密度勾配の画分５０μｌを１：３００の希釈液（５％ミルク／ＰＢＳ溶液）にて３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ／０．０５％Tween ２０で３回洗浄した後、ＨＰＶ１６ ＶＬＰに対して作製したポリクローナルウサギ抗血清（ミルク／ＰＢＳを用いた１：３０００希釈液）５０μｌを添加し、このプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、さらに５％のミルクを含有するＰＢＳで１：５０００に希釈したヤギ−抗ウサギペルオキシダーゼ接合物（Sigma社）５０μｌとさらに１時間インキュベートした。最後に洗浄してから、プレートをＡＢＴＳ基質で３０分間染色し、Dynatech自動化プレートリーダーで４９０ｎｍにて吸光度を測定した。負の対照として、アッセイにはＰＢＳのみを被覆したウェルも含めておいた。
【００５６】
カプソメアへの特異性についてモノクローナル抗体を試験するために、粒子を離合させるべくＥＤＴＡ／ＤＴＴと共にＶＬＰを用いた。処理した粒子調製物は、抗原捕獲ＥＬＩＳＡでアッセイし、その読取り値を未処置の対照と比較した。離合のため、３０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＥＧＴＡ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含有する５００μｌの破壊用緩衝液中で４℃にて終夜、４０μｌのＶＬＰをインキュベートした。処置及び未処置粒子のアリコートを、上記の捕獲ＥＬＩＳＡで、１：２０〜１：４０の希釈倍率にて使用した。
【００５７】
［実施例７：赤血球凝集阻害アッセイ］
キメラカプソメアワクチンが中和抗体の生産を惹起する程度を調べるために、赤血球凝集阻害アッセイを、下記に概略説明するとおりに行う。このアッセイは、ウイルス様粒子が赤血球を凝集させることができるとの過去の観察に基づいたものである。
【００５８】
マウスをキメラカプソメアワクチンのいずれかのもので免疫し、実施例４に記載したと同様に血清を集める。陽性の対照として、ＨＰＶ１６Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）とウシＰＶ１（ＢＰＶ）Ｌ１ ＶＬＰをキメラカプソメア調製物と平行してアッセイする。陽性のベースラインを樹立するために、ＨＰＶ１６またはＢＰＶ１ ＶＬＰを、先ず、免疫したマウスから集めた血清の存在下または非存在下にインキュベートし、その後赤血球を加える。マウス血清とのプレインキュベーションが赤血球凝集を阻害する程度が、マウス血清の中和能力の指標となる。次いで、ワクチンへのマウス血清の中和効果を調べるために、キメラカプソメアを用いて実験を繰り返す。赤血球凝集阻害アッセイのための概略のプロトコルを以下に記載する。
【００５９】
１００μｌのヘパリン（１０００ｕｓｐ単位／ｍｌ）を、１ｍｌのマウス新鮮血に添加する。赤血球は、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで遠心分離して１０ｍｌの容量となるように再懸濁する。次に、赤血球を０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁して３日を上限として４℃に保存する。赤血球凝集アッセイのために、９６ウェルプレートでウェル当たり７０μｌの懸濁液を用いる。
【００６０】
ＣｓＣｌ密度勾配より得られたキメラカプソメアのアリコートを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）に対して１時間透析し、そしてＰＢＳで連続的に２倍希釈した溶液１００μｌを、９６ウェル微量定量プレートの丸底に入れたマウス赤血球に添加し、それをさらに４℃にて３〜１６時間インキュベートする。赤血球凝集阻害のためには、カプソメアを抗体のＰＢＳ希釈液と室温にて６０分間インキュベートし、次いで赤血球に添加する。赤血球凝集のレベルと、それにより中和抗体の存在が、標準技術によって決定される。
【００６１】
予備的な実験結果で、Ｅ７アミノ酸残基１〜９８と会合させたＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣタンパク質を含むキメラカプソメアに対して作製されマウス血清は、ＨＰＶ１６ ＶＬＰによる赤血球凝集を阻害するが、ＢＰＶ ＶＬＰによるものは阻害しないことが観察された。従ってかかるマウス血清は、ヒトＶＬＰに対する中和抗体に対して陽性であり、この差示的な中和は、抗体を作製したもののエピトープに対する抗体の特異性の結果に最も依存するものであると推定された。
【０００１】
ヒトにおける性器のパピローマウイルスのある高い発症率の株（例えば、ＨＰＶ １６、１８、または４５など）は、肛門性器路（anogenital tract）の悪性腫瘍の形成の主要な危険因子であると考えられている。可能性のある悪性のものとしては、子宮頸部癌が非常に最も頻繁に起きている：世界保健機構（ＷＨＯ）の評価によれば、ほぼ５００，０００の新しい症例が毎年出てきている。この病理の生じる頻度ゆえに、ＨＰＶ感染と子宮頸部癌の関連が広く研究され、多数の一般論に結びついている。
【０００２】
例えば、子宮頸部上皮内の腫瘍形成（ＣＩＮ）の前駆病変はパピローマウイルス感染によって生じることが知られている［クラム(Crum), New Eng. J. Med. 310:880-883(1984)］。例えば、株１６、１８、３３、３５、及び４５を含む、あるＨＰＶタイプのゲノム由来のＤＮＡは、この病態の患者由来の腫瘍から培養されたプライマリーの細胞系に加えて、前記腫瘍のバイオプシーでも９５％を超えて検出されている。バイオプシーを行ったＣＩＮ腫瘍細胞のおよそ５０乃至７０％がＨＰＶ１６からのみ由来しているＤＮＡを含むことがわかった。
【０００３】
ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の初期遺伝子Ｅ６及びＥ７のタンパク質産物は、イン・ビトロで形質転換されたヒトケラチノサイトにおけるのと同様に、子宮頸部癌の細胞系においても検出されており［ウエッツステイン(Wettstein),ら，PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, ピスター(Pfister)（編）, CRC Press:ボカ ラトン(Boca Raton), ＦＬ 1990 pp155-179］、さらにかなりのパーセンテージの子宮頸部癌患者が抗Ｅ６抗体または抗Ｅ７抗体を有している。前記Ｅ６及びＥ７タンパク質は、ヒト細胞において細胞ＤＮＡ合成の誘導、ヒトケラチノサイト及び他の細胞タイプの形質転換、及びトランスジェニックマウスにおける腫瘍形成に関与していることが示されている［アルベルト(Arbelt),ら, J. Virol. 68:4358-4364(1994); アウエワラクル(Auewarakul),ら, Mol. Cell. Biol. 14:8250-8258(1994); バーボサ(Barbosa),ら, J. Virol. 65:292-298(1991); カゥアー(Kaur),ら, J. Gen. Virol.70:1261-1266(1989);シェレゲル(Schlegel),ら, EMBO J. 7:3181-3187(1988)］。前記Ｅ６／Ｅ７タンパク質の本質的な発現にはＨＰＶ陽性腫瘍の形質転換された状態を維持することが必要であるらしい。
【０００４】
イン・ビボ及びイン・ビトロでの腫瘍形成性表現型を誘導する幾種類かのＨＰＶ株の能力にもかかわらず、いまだ他のＨＰＶタイプは尖形コンジロームなどの良性の性器疣を生じるだけで、ただまれに悪性腫瘍と関係している［イケンベルグ(Ikenberg), イン グロス(In Gross), ら,（編）GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS, スプリンガー バーラグ(Springer Verlag):ベルリン, 87-112頁］。このタイプの低い発症率の株には例えば、ＨＰＶ ６及び１１が含まれる。
【０００５】
性器のパピローマウイルスは、性交中にヒトとヒトの間で最も頻繁に伝染し、多くの場合肛門性器の粘液分泌膜におけるしつこい感染をもたらす。この知見は一次感染が不適当な免疫応答を誘導するか前記ウイルスが免疫監督を避ける能力を発達させたことを示唆しているが、別の知見ではパピローマウイルス感染の悪性進行のあいだと同様に初期徴候のあいだに免疫システムが活性であることが示唆される［アルトマン(Altmann)ら, in VIRUSES AND CANCER, ミンソン(Minson)ら,(編) Cambridge University Press ,(1994) pp. 71-80］。
【０００６】
例えば、ウサギ及びウシパピローマウイルスによる一次感染の臨床徴候は疣抽出物またはウイルスの構造タンパク質を用いてワクチン接種を行うことによって防ぐことができる［アルトマンら, 前出;キャンポ(Campo), Curr. Top. In Microbiol and Immunol. 186:255-266(1994); インドル(Yindle)及びフラザー(Frazer), Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186;217-253(1994)］。ＨＰＶ １６初期タンパク質Ｅ６またはＥ７をコードするワクシニア組換え体で、または合成Ｅ６またはＥ７ペプチド類で事前にワクチン接種を行った齧歯類動物は、同様にＨＰＶ１６で形質転換したオーソローガスな細胞の接種後の腫瘍形成から防御される［アルトマンら, 前出;キャンポ,ら,前出;インドル及びフラザー,ら,前出］。動物パピローマウイルスによる感染後の退行動物からのリンパ球の移送により疣の退行が誘導されうる。最後に、例えば臓器移植のレシピエントまたはＨＩＶに感染している個体などの、免疫が抑制された患者において、性器疣、ＣＩＮ、及び肛門性器癌の発生率は高い。
【０００７】
今日まで、予防と治療の両方の意図に適したカプソメアの形態のヒトパピローマウイルス後期Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶワクチン接種については報告されていない。前記Ｌ１タンパク質は悪性の性器病変においては存在しないので、Ｌ１タンパク質を用いたワクチン接種はこれらの患者には治療効果がない。キメラカプソメアを生じる、Ｌ１タンパク質由来のアミノ酸残基と、例えばＥ６またはＥ７タンパク質を含むキメラタンパク質の構築によりワクチンの予防機能と治療機能とが組み合わされる。よって、キメラカプソメアを高レベルに製造する方法は、予防及び治療の介入のためのこのようなワクチンによって提供される可能な利点の観点から特に望ましいであろう。
【０００８】
したがって、当該技術分野においてＨＰＶ感染を予防または処置することができるワクチン製剤を提供する必要がある。組換えＨＰＶタンパク質の発現と精製に付随する当該技術分野における既知の問題を克服するワクチン製剤を製造する方法は、ＨＰＶ感染に感受性のある個体の集団を免疫するために有用であることに加え、ＨＰＶに既に感染している個体の集団を処置するためにも明白に有用であろう。
【０００９】
本発明は、キメラヒトパピローマカプソメアを含む治療及び予防用ワクチン製剤を提供する。本発明はまた、ＨＰＶに対して感受性の個体をＨＰＶ感染から守るための予防方法とともに、ＨＰＶに感染した患者を処置するための治療方法をも提供する。また、本発明のカプソメア及びタンパク質の製造と精製のための方法も意図される。
【００１０】
本発明の一側面において、パピローマウイルスの構造タンパク質Ｌ１及びＬ２を含むＨＰＶ感染を防ぐための予防ワクチン接種が考慮される。経済的にワクチンを製造するための充分な量のウイルスタンパク質を提供するために細胞培養または他の実験システムにおいて適当な力価までパピローマウイルスを増やすことができないので、このタイプのワクチンの開発は重大な障害に直面している。さらに、前記タンパク質を発現するための組換え方法は必ずしも容易ではなく、しばしば低いタンパク収量に終わっている。最近、ウイルスのカプシド構造を構成する点で類似している、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が記載されており、組換え体ワクチンまたはバキュロウイルスを用いたウイルスＬ１及びＬ２（またはそれ自身におけるＬ１）の発現において前記粒子はＳｆ−９昆虫細胞において形成される。ＶＬＰの精製はショ糖勾配またはＣｓＣｌにおける遠心分離によって非常に簡単に達成できる［キンバウアー(Kimbauer),ら, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 99:12180-12814(1992);キンバウアー,ら, J. Virol. 67:6929-6936(1994);プロソ(Proso),ら, J. Virol. 6714:1936-1944(1992);ササガワ(Sasagawa),ら, Virology 2016:126-195(1995);ボルパース(Volpers),ら, J. Virol. 69:3258-3264(1995);ゾウ(Zhou),ら, J. Gen. Virol. 74:762-769(1993);ゾウ,ら, Virology 185:251-257(1991)］。ＷＯ ９３／０２１８４には、診断に応用するため、またはパピローマウイルスによって引き起こされた感染に対してのワクチンとしてパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いる方法が記載されている。ＷＯ ９４／００１５２には、ヒト及び動物パピローマウイルス粒子のコンフォメーション中和エピトープによく似たＬ１タンパク質の組換え体の製造が記載されている。
【００１１】
本発明の別の側面において、治療用ワクチン接種を例えば子宮頸部癌またはパピローマウイルス感染に起因する前駆病変の複雑化を緩和するために提供し、よって予防的介入に対する選択肢を表す。このタイプのワクチン接種は持続的に感染している細胞において発現する、初期パピローマウイルスタンパク質、本質的にはＥ６またはＥ７を含むものでもよい。このタイプのワクチン接種の投与に続き、細胞傷害性Ｔ細胞が性器の病変において持続的に感染している細胞に対して活性化されるかもしれないと想定される。治療介入のターゲット集団はＨＰＶに関連した前悪性または悪性の性器病変をもつ患者である。ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９３／２０８４４には、ＨＰＶまたはＢＰＶ由来のパピローマウイルスの初期タンパク質Ｅ７及びその抗原断片が退行に治療的に有効であることが開示されているが、それは哺乳動物におけるパピローマウイルス腫瘍の、予防においてではない。初期ＨＰＶタンパク質は大腸菌または適当な真核細胞タイプにおける組換え体発現によって製造されているが、本質的な低溶解性と、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過及びアフィニティー・クロマトグラフィーを含む工程の組み合わせを一般的に必要とする複雑な精製手順ゆえに、前記組換え体の精製が困難であることが証明されている。
【００１２】
本発明によれば、パピローマウイルスカプソメアを含むワクチン製剤を提供し、前記製剤は（ｉ）第１のタンパク質であって、第２のタンパク質由来のアミノ酸残基の一部を含む融合タンパク質として発現する完全なウイルスタンパク質である第１タンパク質；（ｉｉ）欠切されたウイルスタンパク質；（ｉｉｉ）第２タンパク質由来のアミノ酸残基の一部を含む融合タンパク質として発現する欠切されたウイルスタンパク質、または（ｉｖ）前記３タイプのタンパク質のいくつかの組み合わせのいずれかを含んでなる。本発明によれば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）及びヒトパピローマウイルスのカプソメアを含むワクチン製剤が提供される。好ましいウシウイルスカプソメアは、ウシパピローマウイルスタイプＩ由来のタンパク質を含んでいる。好ましいヒトウイルスカプソメアは、ヒトパピローマウイルス株ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ４５のいずれかひとつの株由来のタンパク質を含むものである。最も好ましいワクチン製剤は、ＨＰＶ１６由来のタンパク質を含むカプソメアを含んでなる。
【００１３】
一側面において、本発明のカプソメアワクチン製剤は第２タンパク質由来の付加的なアミノ酸残基をともなった融合タンパク質として発現する第１の完全なウイルスタンパク質を含む。好ましい完全ウイルスタンパク質は構造パピローマウイルスタンパク質Ｌ１及びＬ２である。完全ウイルスタンパク質融合体を含むカプソメアは、前記Ｌ１及びＬ２タンパク質をともに用いてもまたはＬ１タンパク質単独を用いて製造してもよい。好ましいカプソメアは完全にＬ１融合タンパク質から成り立っており、そのアミノ酸配列は配列番号：２に記載され、配列番号：１のポリヌクレオチド配列によってコードされている。第２タンパク質のアミノ酸は第２タンパク質のアミノ酸残基の第１タンパク質への添加がカプソメアの形成を許容する限り多数の 供給源（第１タンパク質由来のアミノ酸残基を含む）から誘導できる。好ましくは、第２タンパク質のアミノ酸残基の添加が完全なウイルスタンパク質の能力を阻害しウイルス様粒子構造を形成する；最も好ましくは第２タンパク質のアミノ酸残基がカプソメア形成をプロモートする。本発明の１態様において、第２タンパク質は新生物のまたは感染の疾患状態における免疫応答を刺激するのに重要ないかなるヒト腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原であってもよい。好ましい実施態様において第２タンパク質はまたパピローマウイルスタンパク質である。また第２タンパク質がパピローマウイルスの初期遺伝子の発現産物であることが好ましい。しかしながら、また第２タンパク質がＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７--パピローマウイルス株ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、またはＨＰＶ４５のゲノムにコードされた初期遺伝子産物の群から選択されることが好ましい。第２タンパク質がＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子でコードされていることが最も好ましく、その読み取り枠は配列番号：３に記載されている。融合タンパク質サブユニットから組み立てられたカプソメアは本明細書ではキメラカプソメアという。１実施態様では、本発明のワクチン製剤はＬ１タンパク質アミノ酸残基が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ５０乃至９９％から成り立っているキメラカプソメアを含んでなる。別の実施態様において、Ｌ１アミノ酸残基が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ６０乃至９０％から成り立っており、特に好ましい実施態様においてはＬ１アミノ酸が全融合タンパク質アミノ酸残基のおよそ８０％を含む。
【００１４】
本発明の別の側面において、カプソメアワクチン製剤が提供され、前記製剤はウイルス様粒子の形成に必要な１以上のアミノ酸残基の欠失を有する欠切されたウイルスタンパク質を含んでいる。アミノ酸の欠失が欠切されたタンパク質によるカプソメアの形成を阻害しないことが好ましく、前記欠失がカプソメア形成に有利に働くことが最も好ましい。このタイプの好ましいワクチン製剤はＬ２ウイルスタンパク質とともにまたはなしに欠切されたＬ１を含むカプソメアを含んでなる。特に好ましいカプソメアは欠切されたＬ１タンパク質を含むものである。本発明によって意図される欠切されたタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質のアミノ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質の内部領域から（すなわち、いずれの末端からでもない）欠失された１以上のアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。好ましいカプソメアワクチン製剤は、カルボキシ末端で欠切されたタンパク質を含んでなる。ＨＰＶ１６から由来したＬ１タンパク質を含む製剤においては、１乃至３４のカルボキシ末端アミノ酸残基が欠失されていることが好ましい。Ｌ１タンパク質及びそれによって形成されたカプソメアの抗原性質のマイナー修飾について利点をもたらす比較的短い欠失もまた意図される。しかしながら、３４アミノ酸残基がＬ１配列から欠失されていることが最も好ましく、そのアミノ酸配列は配列番号：２に記載されているＨＰＶ１６におけるアミノ酸４７２から５０５であり、かつ配列番号：１に記載された配列をヒトＨＰＶ１６Ｌ１をコードする配列におけるヌクレオチド１４１４から１５１６に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。カプソメアワクチン製剤が内部欠失のあるタンパク質から成り立っている場合、欠失されたアミノ酸配列がタンパク質の核局在化領域を含むことが好ましい。ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質において、核局在化シグナルが約アミノ酸残基４９９から約アミノ酸残基５０５で見出されている。ＮＬＳが欠失しているＬ１タンパク質の発現に続き、カプソメア構造の組立てが宿主細胞の細胞質で起こる。その結果、カプソメア内に完全なＬ１タンパク質が組み立てられている核からに代え、細胞質からカプソメアの精製が可能である。付加的なアミノ酸配列が欠失されたタンパク質配列に置き換わっていない、欠切されたタンパク質の組立てから結果として得られたカプソメアは必ずしも天然においてキメラではない。
【００１５】
本発明のさらなる別の側面において、第２タンパク質由来のアミノ酸残基に近接する融合タンパク質として発現された欠切されたウイルスタンパク質を含むカプソメアワクチン製剤を提供する。本発明の好ましい欠切されたウイルスタンパク質は構造パピローマウイルスタンパク質Ｌ１及びＬ２である。欠切されたウイルスタンパク質融合物を含むカプソメアは、Ｌ１及びＬ２タンパク質成分をともにまたはＬ１タンパク質単独で用いて製造してもよい。好ましいカプソメアは、Ｌ１タンパク質アミノ酸残基を含むタンパク質である。融合タンパク質の欠切されたウイルスタンパク質成分は、タンパク質のカルボキシ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質のアミノ末端から欠失された１以上のアミノ酸残基、またはタンパク質の内部領域から（すなわち、いずれの末端からでもない）欠失された１以上のアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。好ましいカプソメアワクチン製剤はカルボキシ末端で欠切されたタンパク質を含む。ＨＰＶ１６に由来するＬ１タンパク質を含むそれらの製剤においては、１乃至３４カルボキシ末端アミノ酸残基が欠失していることが好ましい。融合タンパク質と、形成されるそのカプソメアのＬ１タンパク質成分の抗原特性の若干の修飾の利点を与える、比較的短い欠失体も企図される。しかしながら、最も好ましいのは、配列番号：２に示すＨＰＶ１６のアミノ酸４７２から５０５までに対応する、Ｌ１配列から３４アミノ酸残基が欠失されたものであって、配列番号：１に示すヒトＨＰＶ１６ Ｌ１をコードする配列の１４１４から１５１６までのヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド配列によってコードされるものである。ワクチン製剤が内部欠失を有するタンパク質で構成されるカプソメアを含む場合、欠失されるアミノ酸配列はタンパク質の核局在化領域、すなわちその配列を含むことが好ましい。
【００１６】
第２タンパク質のアミノ酸は、第１タンパク質への当該第２タンパク質アミノ酸残基の添加がカプソメアの形成を可能とする限りにおいて数多くの供給源に由来するものとすることができる。好ましくは、第２タンパク質アミノ酸残基の添加によって、カプソメア形成が促進または推進される。第２タンパク質のアミノ酸残基は、第１タンパク質のアミノ酸残基を含めた数多くの供給源に由来するものとすることができる。好ましい実施態様において、第２タンパク質もまたパピローマウイルスタンパク質である。さらに、第２タンパク質がパピローマウイルス初期遺伝子の発現産物であっても好ましい。しかしながら最も好ましくは、パピローマウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７遺伝子によってコードされる初期遺伝子産物よりなる群から第２タンパク質が選択される。一実施態様において、本発明のワクチン製剤は、キメラカプソメアを含んでなり、ここでＬ１タンパク質アミノ酸残基が、融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ５０乃至９９％を構成している。他の実施態様において、Ｌ１アミノ酸残基は、融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ６０乃至９０％を構成しており、特に好ましい実施態様にあっては、Ｌ１アミノ酸残基が融合タンパク質アミノ酸残基全体のおよそ８０％を構成している。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、ワクチン製剤のタンパク質は組換え法によって生産されるが、完全体のウイルスタンパク質を含む製剤の場合には、タンパク質が天然の供給源から単離されたものであってもよい。天然の供給源から単離された完全体のタンパク質は、よく知られており当該技術分野で日常的に実施されている共有結合修飾の技術を使用して、本発明の融合タンパク質を提供すべくさらに付加的なアミノ酸残基を含めるよう、イン・ビトロで修飾してもよい。同様に、欠切されたウイルスタンパク質を含む製剤で、タンパク質が天然の供給源から単離されたものでもよく、そしてイン・ビトロにて、化学的加水分解、または数多くの部位特異的または一般的プロテアーゼのいずれかを用いた酵素消化を使用して加水分解を行ってもよく、そして欠切したタンパク質は引き続き、本発明の欠切した融合タンパク質を提供すべく前記のごとくにさらに付加的なアミノ酸残基を含むよう修飾を施されてもよい。
【００１８】
カプソメアを製造するに際して、所望の完全体タンパク質、欠切体タンパク質、つまり欠切された融合タンパク質の何れかをコードするＤＮＡを製造するのに、組換え分子生物学的技術を利用することができる。所望のタンパク質をコードするＤＮＡを製造するために必要な組換え法はよく知られており、当該技術分野で日常的に実施されている。実験マニュアル、例えば、Sambrookら（編）、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989)及びAusebelら（編）、PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons. Inc.、(1994-1997)に、ＤＮＡ操作を行うために必要な技術の詳細が記載されている。キメラカプソメアの大量生産のためには、ウイルスまたは真核細胞性ベクターの何れかを用いたタンパク質発現を行うことができる。好ましいベクターには、あらゆる既知原核細胞性発現ベクター、組換えバキュロウイルス、ＣＯＳ細胞特異的ベクター、ワクシニア組換え体、あるいは酵母特異的発現構築体が包含される。本発明のカプソメアを提供するために組換えタンパク質が用いられる場合、タンパク質を先ず、その発現の宿主細胞から単離し、そしてその後、カプソメアを提供すべく自己会合を許容する条件下にインキュベーションを行うとよい。あるいは、宿主細胞中でカプソメアが形成される条件下に、タンパク質を発現させてもよい。
【００１９】
本発明はさらに、ワクチン製剤のカプソメアを生産するための方法も企図するものである。一つの方法においては、Ｌ１タンパク質をコードする配列のカルボキシ末端でさらに付加的な６つのヒスチジンをコードするＤＮＡから、Ｌ１タンパク質が発現される。付加的なヒスチジンと共に発現されるＬ１タンパク質（His Ｌ１タンパク質）は、最も好ましくは大腸菌で発現され、そしてこのHis Ｌ１タンパク質は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。細胞溶解液中のHis Ｌ１タンパク質を変性用緩衝液（例えば６Ｍグアニジン塩酸塩または同等の変性能を有する緩衝液）に懸濁し、次いでニッケルクロマトグラフィーに付す。ニッケルクロマトグラフィーの工程から溶出されたタンパク質は、例えば１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１％Triton-Ｘ１００、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸）、ｐＨ７．４にて再生される。本発明の好ましい方法によれば、精製タンパク質の透析後に、好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｃａ2+、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、０．１％Triton-Ｘ１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ［トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン］酢酸（ｐＨ値５．０のもの）に対する透析後に、カプソメアの会合が起こる。
【００２０】
カプソメアの形成は、電子顕微鏡によってモニターすることができ、そしてカプソメアが融合タンパク質を含む場合にあっては、会合したカプソメア中の様々なタンパク質成分の存在を特異抗血清を用いたウェスタンブロット分析によって確認することができる。
【００２１】
本発明によれば、ＨＰＶウイルスに感染した個体を治療処置するための方法が提供され、この方法は、ＨＰＶ感染のレベルを低減するに有効な量の本発明のワクチン製剤を、それを必要としている患者個体に投与する工程を含むものである。本発明はさらにまた、ＨＰＶ感染に対して感受性の個体の予防処置のための方法を提供し、ＨＰＶ感染を防ぐのに有効な量の本発明のワクチン製剤を、ＨＰＶ感染に対して感受性の個体に投与する工程を含む。感染した個体は標準的な診断技術を使用して容易に同定することができるが、感受性の個体については、例えば感染した個体との性交渉をもったことなどに基づいて同定してもよい。しかしながら、ＨＰＶ感染が高頻度であることに起因して、性的に活動性を有するヒトはすべて、パピローマウイルス感染に対して感受性であるといえよう。
【００２２】
ワクチン製剤の投与には、医薬上容認しうる担体、希釈剤、アジュバント、及び／または緩衝液などの、１以上の付加成分を包含することができる。ワクチンは、単回投与しても、または複数回投与してもよい。本発明のワクチン製剤は、例えば経口、静脈内、筋肉内、経鼻、直腸内、経皮、腟内、皮下、及び腹腔内投与などを包含する様々な経路によって送達させることができる。
【００２３】
本発明のワクチン製剤は、従来のワクチン調製剤に比較すると多大な利点をもたらすものである。治療用のワクチン接種の一部として、ＣＩＮまたは子宮頸部癌の患者における、持続的に感染した細胞の除去を、カプソメアが促進することができる。加えて、このタイプの治療用ワクチン接種は、再感染によるＣＩＮ病変を有する患者を保護する予防的な目的にも役立てることができる。さらなる利点として、カプソメアは既存の抗カプシド抗体による中和を回避することができ、それによってキメラウイルス様粒子に比較して、より長い循環半減期を有している。
【００２４】
キメラカプソメアを含むワクチン製剤は、カプソメアが形成される融合タンパク質の両タンパク質成分の抗原性上昇という、さらなる利点を提供することができる。例えば、ＶＬＰでは潜在しているカプソメアのタンパク質成分が、ＶＬＰ自体の内部への内部配置の結果、構造全体として埋没してしまうかもしれない。同様に、タンパク質成分のエピトープがカプソメア−カプソメアの接触の結果、立体的に遮蔽され、従って免疫応答性を惹起するように接近することができなくなることがある。Ｌ１／Ｅ７融合タンパク質を用いてＶＬＰを生産する予備実験の結果、Ｅ７成分に対して抗体の応答が検出できず、このような配置が裏付けられた。この観察は、Ｌ１のカルボキシ末端領域が、カプシドへのカプソメアの会合を許容する五量体間腕構造を形成することを示唆する、以前観察された結果［ガルシア(Garcia)ら、J.Viol.,71: 2988-2955(1997)］に合致するものである。おそらくキメラカプソメア構造では、融合タンパク質下位構造の両タンパク質成分が免疫応答を惹起するよう、接近可能となっているのであろう。カプソメアワクチンは従って、例えばＬ１アミノ酸配列として発現される、他のウイルスタンパク質由来の中和エピトープを含めて種々のタンパク質成分の抗原性を増大させるというさらなる利点をもたらすはずである。
【００２５】
本発明は、以下の実施例によって例証されるものである。
【００２６】
これらの実施例に示される本発明に種々の修飾や改変を施すことが当業者に想起されるものと考えられる。本発明が特許請求の範囲によってしか限定されないことはもちろんである。
【００２７】
実施例１には、融合、あるいはキメラウイルスタンパク質を製造するための発現ベクターの構築を記載する。実施例２は、ウイルスタンパク質の発現のための組換えバキュロウイルスの作製に関するものである。実施例３には、カプソメアの精製を述べる。実施例４では、抗血清及びモノクローナル抗体の製造のための免疫付与プロトコルを記載する。実施例５には、カプソメア形成を定量するためのペプチドＥＬＩＳＡを示す。実施例６には、カプソメア形成を定量するための抗原捕獲ＥＬＩＳＡを記載する。実施例７には、中和抗体の誘導について分析するための赤血球凝集アッセイを示す。
【００２８】
［実施例１：キメラＬ１遺伝子の構築］
ＨＰＶ１６ Ｌ１の転写解読枠をコードするＤＮＡを、プラスミド16-114/k-L1/L2-pSynxtVI-［Kirnbauerら、Virol. 67巻、6929〜6939頁(1994)］からBglIIを用いて切り出し、得られた断片を、予め固有のBamHI制限部位にて直鎖にしておいたpUC19へとサブクローニングした。先ず、２つの塩基性発現構築体を作製して、融合タンパク質発現を許容すべく引き続いてのＤＮＡの挿入を可能とした。１つの構築体は、９つのアミノ酸の欠失を有する、ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310をコードしており、欠失された領域は他のパピローマウイルスＬ１タンパク質すべてと低い相同性を示すことが知られていた。第２の構築体であるＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣは、カルボキシ末端のＬ１残基の３４アミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードしていた。他の構築体には、他のタンパク質の配列をコードするＤＮＡの挿入を容易ならしめるために、欠失位置にEcoRV制限部位を含んでいる。EcoRV制限部位の付加によって、非Ｌ１タンパク質のアミノ酸２つ、すなわち、アスパラギン酸及びイソロイシンがコードされることとなっている。
【００２９】
Ａ．ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310発現構築体の作製
２つのプライマー（配列番号：５及び６）を、pUC19ベクターと、配列番号：１のヌクレオチド第９１６位から９４２位までを除いた完全なＨＰＶ１６Ｌ１コード配列とを増幅させるように設計した。プライマーはまた、増幅産物の末端で固有のEcoRV制限部位（配列番号：５及び６の下線部）も導入するように合成されていた。
【００３０】
CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG
（配列番号：５）
CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG
（配列番号：６）
こうして得られたＰＣＲ産物をEcoRVで消化して相補性端部を与え、その消化産物を連結反応により環状とした。連結したＤＮＡを標準技術を用いて大腸菌に形質転換し、その結果得られたコロニーからのプラスミドをEcoRV制限部位の存非についてスクリーニングした。ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310と命名した１つのクローンは、適切な２７ヌクレオチドの欠失を有しているものとして同定され、この構築体を下記のとおりEcoRV部位にて他のＨＰＶ１６タンパク質をコードしているＤＮＡ断片を挿入するために使用した。
【００３１】
Ｂ．ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体の作製
２つのプライマー（配列番号：７及び８）を、プライマーが相互に近接して、前記のとおりpUC19にＨＰＶ１６Ｌ１をコードする配列を含む鋳型ＤＮＡ上で逆方向の増幅を可能とするように、ＨＰＶ１６Ｌ１の転写解読枠に対して相補的に設計した。
【００３２】
AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC
（配列番号：７）
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG
（配列番号：８）
各プライマーは、増幅産物の末端にEcoRV制限部位を導入するものであった。下流のプライマー（配列番号：８）では、EcoRV端部を連結して環状とした場合に増幅産物が３４カルボキシ末端Ｌ１アミノ酸の欠失を含むように、EcoRV部位の後にTAA翻訳終止コドンが配置されていた。ＰＣＲを実施して部分的なＬ１転写解読枠と完全なベクターを増幅させた。増幅産物をEcoRVで切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状として大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換した。生存能力のあるクローン由来のプラスミドを、プラスミドを直鎖状にさせるEcoRV部位の存在について分析した。pUCHPV16L1ΔCと命名した１つの陽性の構築体を同定し、EcoRV部位を利用して他のＨＰＶ１６タンパク質からＤＮＡを挿入するために使用した。
【００３３】
Ｃ．ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310及びＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣへのＤＮＡ断片の挿入
配列番号：４のアミノ酸１〜５０、１〜６０、１〜９８、２５〜７５、４０〜９８、５０〜９８をコードするＨＰＶ６ Ｅ７のＤＮＡ断片を、ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310とＨＰＶ１６Ｌ１Δの修飾配列のいずれかへの断片の挿入を容易ならしめるために、端部５’EcoRV制限部位が導入されたプライマーを用いて増幅させた。様々な増幅反応で、プライマーＥ７．１（配列番号：９）をプライマーＥ７．２（配列番号：１０）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜５０をコードするＤＮＡ断片を作製し、プライマーＥ７．３（配列番号：１１）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜６０をコードするＤＮＡ断片を作製し、あるいはプライマーＥ７．４（配列番号：１２）と組み合わせて用いてＥ７アミノ酸１〜９８をコードするＤＮＡ断片を作製した。他の増幅反応において、Ｅ７．５（配列番号：１３）とＥ７．６（配列番号：１４）のプライマー対を用いてＥ７アミノ酸２５〜７５をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、Ｅ７．７（配列番号：１５）とＥ７．４（配列番号：１２）を用いてＥ７アミノ酸４０〜９８をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、そしてＥ７．８（配列番号：１６）とＥ７．４（配列番号：１２）を用いてＥ７アミノ酸５０〜９８をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。
【００３４】
プライマーＥ７．１（配列番号：９）
AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
プライマーＥ７．２（配列番号：１０）
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC
プライマーＥ７．３（配列番号：１１）
TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATG GGCC
プライマーＥ７．４（配列番号：１２）
AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC
プライマーＥ７．５（配列番号：１３）
TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG
プライマーＥ７．６（配列番号：１４）
TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC
プライマーＥ７．７（配列番号：１５）
TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC
プライマーＥ７．８（配列番号：１６）
TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTG
同様に、インフルエンザマトリックスタンパク質（配列番号：１７）をコードするＤＮＡ由来のヌクレオチドを、配列番号：１９及び２０に示すプライマー対を使用して増幅させた。両プライマーはいずれも増幅産物中にEcoRV制限部位を導入するものであった。
【００３５】
TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC
（配列番号：１９）
TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG
（配列番号：２０）
各増幅反応から得られたＰＣＲ産物は、EcoRVで切断し、同酵素を用いて予め直鎖状にしておいたＨＰＶ１６Ｌ１Δ310とＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ配列のいずれかのEcoRV部位へと挿入した。Ｅ７アミノ酸２５〜７５及び５０〜９８をコードするプラスミド、そしてインフルエンザマトリックスタンパク質を含むプラスミドでのインサートの方向を調べるために、新しく作られたEcoRV制限部位（GATATCGAT）に重複する制限部位の利点を有し、上流プライマーに含められたClaI消化を採用した。ＨＰＶ１６ Ｅ７の開始のメチオニンを含む３つの発現構築体について、Ｅ７コード領域内のNslI制限部位を利用して挿入方向を調べた。
【００３６】
適切なインサートを有する発現構築体が同定されると、Ｌ１と挿入されたアミノ酸の双方に対するタンパク質コード領域を制限酵素XbaI及びSmaIを用いてユニットとして切り出し、そして単離したＤＮＡをプラスミドpVL1393（Invitrogen社）へと連結して組換えバキュロウイルスを作製した。
【００３７】
Ｄ．発現構築体中のEcoRV制限部位の除去
ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ配列は、野生型Ｌ１ポリペプチドには通常認められないアミノ酸の翻訳を結果的に引き起こすEcoRV部位由来のＤＮＡを含んでいる。しかして、人工的なEcoRV部位が除去された一連の発現構築体を設計した。発現構築体のこのシリーズに対するＬ１配列は、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*と命名した。
【００３８】
ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*配列を含む発現構築体を作製するために、２つのＰＣＲ反応を実施して、Ｅ７アミノ酸１〜５０をコードするpUC−ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣからの２つの重複断片を増幅させた。こうして得られたＤＮＡ断片は、Ｌ１／Ｅ７境界の位置で重複していたが、２つのEcoRV制限部位は含んでいなかった。断片１はプライマーＰ１（配列番号：２１）及びＰ２（配列番号：２２）を用いて作製され、断片２はプライマーＰ３（配列番号：２３）及びＰ４（配列番号：２４）を用いて作製された。
【００３９】
プライマーＰ１（配列番号：２１）
GTTATGACATACATACATTCTATG
プライマーＰ２（配列番号：２２）
CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC
プライマーＰ３（配列番号：２３）
CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC
プライマーＰ４（配列番号：２４）
CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG
第１の２つの増幅反応の後、２つの精製産物を、プライマーＰ１及びＰ４のみを使用したさらなるＰＣＲ反応における鋳型として用いた。こうして得られた増幅産物を、酵素EcoNI及びHindIIIで消化して前記のＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体へと挿入し、続いて同酵素で消化した。得られた発現構築体は、２つの内部EcoRV制限部位を喪失しているという点でＬ１及びＥ７アミノ酸１〜５０をコードするＤＮＡを含む元のＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ構築体と相違していた。第１のEcoRV部位は、本来のこの位置にあるＬ１のアラニン及びグリシンアミノ酸をコードするＤＮＡに置換されており、第２の部位は翻訳終止シグナルに置換されていた。加うるに、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-52と命名された発現構築体は、第５１位のヒスチジンと第５２位のチロシンのＥ７アミノ酸残基もコードするプライマーＰ４を用いた結果、ＨＰＶ１６ Ｅ７の最初の５２アミノ酸を含んでいた。次いで、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-52を使用し、プライマーＰ１（配列番号：２１）をプライマーＰ５（配列番号：２５）と組み合わせて用いて、Ｅ７アミノ酸の１〜５５をコードするＤＮＡをさらに包含する、さらなるＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ発現構築体を作製した。また、プライマー対Ｐ１及びＰ６（配列番号：２６）を用いてＥ７アミノ酸の１〜６０を、そしてプライマー対Ｐ１及びＰ７（配列番号：２７）を用いてＥ７アミノ酸の１〜６５をコードするＤＮＡをさらに包含するものを作製した。増幅産物中のさらに付加したアミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、所望のアミノ酸に対する付加的なヌクレオチドを含むようなプライマーの設計から生じるものであった。
【００４０】
プライマーＰ５（配列番号：２５）
CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
プライマーＰ６（配列番号：２６）
CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
プライマーＰ７（配列番号：２７）
CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAAC-
AAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG
同様に、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-70を、ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ*Ｅ７ 1-66をコードする鋳型ＤＮＡとプライマー対Ｐ１及びＰ８（配列番号：２８）を用いて作製した。
【００４１】
プライマーＰ８（配列番号：２８）
CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACTTG
各ＰＣＲ反応の後、増幅産物をEcoNI及びHindIIIで消化して、予め同酵素で消化しておいたＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣに挿入した。各構築体の配列は、蛍光鎖終止ジデオキシヌクレオチドを用い、Applied Biosystems Prism 377配列決定装置を使用して決定した［Proberら、Science、238巻、336〜341頁(1987)］。
【００４２】
［実施例２：組換えバキュロウイルスの作製］
Spodoptera frugiperda（Ｓｆ９）細胞を、１０％胎児仔ウシ血清及び２ｍＭグルタミンを追加したＴＮＭＦＨ培地（Sigma社）中で２７℃で懸濁または単層培養にて生育した。ＨＰＶ１６Ｌ１に基づく組換えバキュロウイルス構築体に対し、２μｇのBaculo-Gold ＤＮＡ（PharMingen、サンディエゴ、カリホルニア州）と共に１０μｇの伝達プラスミドを用いて、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトした。製造業者が提示したプロトコルに従うことにより組換えウイルスを精製した。
【００４３】
ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質の発現について調べるために、１０5個のＳｆ９細胞を５〜１０の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ）でバキュロウイルス組換え体で感染させた。２８℃にて３乃至４時間インキュベートした後、培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＳＤＳ試料用緩衝液に溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ＨＰＶ１６Ｌ１及び抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。
【００４４】
いずれのキメラＬ１タンパク質発現構築体が優先的にカプソメアを生産するかを調べるために、トランスフェクトした細胞からの抽出物を密度勾配遠心分離に付した。密度勾配から得られた画分をウェスタンブロッティングによりＬ１タンパク質含量について、そして電子顕微鏡によりＶＬＰ形成について分析した。その結果を表１に示す。
【００４５】
完全なＨＰＶ Ｌ１タンパク質そして、発現産物ＨＰＶ１６Ｌ１Δ310及びＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣはそれぞれ、同等の比率でカプソメア及びウイルス様粒子を生産することが示された。Ｅ７をコードする配列をＨＰＶ１６Ｌ１Δ310ベクターへ挿入すると、生産されるＥ７アミノ酸１〜５０を含む融合タンパク質だけが検出可能な程度にカプソメア形成を上昇させた。
【００４６】
Ｅ７をコードするＤＮＡをＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣベクターへ挿入すると、すべての融合タンパク質がカプソメアを生産することが見出され、Ｅ７アミノ酸４０〜９８を含むキメラタンパク質は、専一的にカプソメア構造を最高レベルで生産した。Ｅ７アミノ酸１〜９８及び２５〜７５を含むキメラタンパク質は双方とも、主にカプソメアを生産したが、それでもウイルス様粒子の形成も観察された。Ｅ７アミノ酸１〜６０を含むキメラタンパク質では、ほぼ同レベルのカプソメアとウイルス様粒子の生産が認められた。
【００４７】
Ｅ７配列がＨＰＶ１６Ｌ１*ΔＣベクターに挿入されると、すべての融合タンパク質がカプソメアを形成することが示された。Ｅ７残基の１〜５２、１〜５５、及び１〜６０をコードするＤＮＡの挿入で、最高レベルのカプソメアが生産されたが、ウイルス様粒子の生産は同レベルで観察された。１〜６５、１〜７０、２５〜７５、４０〜９８及び１〜９８の残基に対するＥ７ ＤＮＡをコードするＤＮＡの挿入の結果、比較的低レベルの、または検出不能なレベルのカプシドが生じたものの、カプソメアは多量に生産された。
【００４８】
【表１】
［実施例３：カプソメアの精製］
トリコプルシアニ（Trichopulsia ni、ＴＮ）High Five細胞を、Ex-Cell４０５無血清培地（ＪＲＨ Biosciences）中でおよそ２×１０6細胞／ｍｌの密度で生育した。およそ２×１０8の細胞を、１０００×ｇで１５分間遠心分離することによりペレット化し、２０ｍｌの培地に再懸濁し、そして２乃至５のｍ．ｏ．ｉで１時間室温にて組換えバキュロウイルスで感染させた。２００ｍｌの培地を添加した後、細胞を播種し、２７℃にて３乃至４日間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を回収してペレット化し、そして１０ｍｌの抽出用緩衝液に再懸濁させた。
【００５０】
以下の工程は４℃にて実施した。細胞を６０ワットで４５秒間超音波処理し、そうして得られた細胞溶解液をSorvalＳＳ３４ローターにて１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を取り出して生じたペレットを６ｍｌの抽出用緩衝液に再懸濁してさらに６０ワットで３秒間超音波処理し、再度遠心分離する間保存しておいた。２回分の上清を併せて１４ｍｌの４０％スクロースを８ｍｌのＣｓＣｌ溶液（抽出用緩衝液８ｍｌ当たり４．６ｇのＣｓＣｌ）上方に含む２段階密度勾配の上に積層し、そして１０℃にて２７，０００ｒｐｍで２時間、SorvalＡＨ６２９スイングバケットローターで遠心分離した。ＣｓＣｌとスクロースとの間の界面領域を、ＣｓＣｌ完全層に沿って１３．４ｍｌのQuicksealチューブ（Beckman）に集め、そして抽出用緩衝液を添加して容量を１３．４ｍｌに調整した。試料をBeckman ７０ ＴＩローターで２０℃にて５０，０００ｒｐｍで終夜遠心分離した。密度勾配は、２１ゲージの針でチューブの上部と底部を穿孔することにより分画（１画分につき１ｍｌ）した。画分を各チューブから集めて、各画分の２．５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗−ＨＰＶ１６Ｌ１抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【００５１】
ウイルス様粒子とカプソメアとを、１０乃至５０％スクロース勾配に沈降する、前記同定画分から分離した。ＣｓＣｌ密度勾配からのピーク画分を集めて、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に対して２時間透析した。透析液の半分を用いて、ＥＤＴＡ（最終濃度５０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５０ｍＭ）、ＤＴＴ（３０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、及びＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０（１０ｍＭ）を添加することによる完全体のＶＬＰの離合によってカプソメアを生産した。対照として、残り半分にＮａＣｌ及びＴｒｉｓ／ＨＣｌのみを添加した。
【００５２】
離合させたＶＬＰを分析するために、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＴ（各々５ｍＭ）をスクロースクッションに添加して、これを２５０，０００×ｇで４℃にて２乃至４時間遠心分離した。底部からチューブを穿孔することにより画分を集めた。各画分の１：１０希釈液を、次いで抗原捕獲ＥＬＩＳＡによって分析した。
【００５３】
［実施例４：ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体の製造のための免疫付与プロトコル］
６０μｇのＨＰＶキメラカプソメアを、完全または不完全フロインドアジュバントと１：１で混合して総容量１００μｌとしたものを用いて、４週間おきに３回、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し皮下に免疫付与する。第３回目の免疫付与から６週間後にマウスを屠殺し、心臓穿刺により血液を集める。
【００５４】
［実施例５：カプソメア形成を定量するためのペプチドＥＬＩＳＡ］
ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＥ７０１［Mullarら、1982］５０μで、微量定量プレート（Dynatech）を終夜被覆する。ＰＢＳ中に５％ＢＳＡ及び０．０５％Tween ２０を含有する緩衝液１００μｌで、３７℃にて２時間ブロッキングを行い、そして０．０５％Tween ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。第３回目の洗浄の後、ＢＳＡ／Tween ２０／ＰＢＳで１：５０００に希釈した５０μｌの血清を各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを１時間実施する。プレートを前回と同様に再度洗浄し、そして１：５０００希釈にて、ヤギ−抗マウスペルオキシダーゼ接合物５０μｌを添加する。１時間後にプレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質（０．１Ｍナトリウム−酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．２）中に、０．２ｍｇ／ｍｌ、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズヒアゾリン−β−スルホン酸を、１０ｍｌに対し４μｌの３０％Ｈ2Ｏ2と共に含むもの）を用いて染色する。Dynatech自動式プレートリーダーにて、４９０ｎｍで１時間後に吸光度を測定する。
【００５５】
［実施例６：カプソメア形成を定量するための抗原捕獲ＥＬＩＳＡ］
ＣｓＣｌ密度勾配でのウイルス様粒子及びカプソメアの相対的な定量を許容するために、抗原捕獲ＥＬＩＳＡを利用した。微量定量プレートを、ＨＰＶ１６Ｌ１に対して免疫特異性を有する、プロテインＡで精製されたマウスモノクローナル抗体（抗体２５／Ｃ、ＭＭ０７及びRitti１は、ＨＰＶ１６ ＶＬＰを用いて免疫付与したマウスから得たもの）の１：５００希釈液（ＰＢＳ中、最終濃度は１ｍｌ当たり２μｇ）５０μｌ／ウェルで終夜被覆した。プレートを５％ミルク／ＰＢＳで１時間ブロッキングし、そしてＣｓＣｌ密度勾配の画分５０μｌを１：３００の希釈液（５％ミルク／ＰＢＳ溶液）にて３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ／０．０５％Tween ２０で３回洗浄した後、ＨＰＶ１６ ＶＬＰに対して作製したポリクローナルウサギ抗血清（ミルク／ＰＢＳを用いた１：３０００希釈液）５０μｌを添加し、このプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、さらに５％のミルクを含有するＰＢＳで１：５０００に希釈したヤギ−抗ウサギペルオキシダーゼ接合物（Sigma社）５０μｌとさらに１時間インキュベートした。最後に洗浄してから、プレートをＡＢＴＳ基質で３０分間染色し、Dynatech自動化プレートリーダーで４９０ｎｍにて吸光度を測定した。負の対照として、アッセイにはＰＢＳのみを被覆したウェルも含めておいた。
【００５６】
カプソメアへの特異性についてモノクローナル抗体を試験するために、粒子を離合させるべくＥＤＴＡ／ＤＴＴと共にＶＬＰを用いた。処理した粒子調製物は、抗原捕獲ＥＬＩＳＡでアッセイし、その読取り値を未処置の対照と比較した。離合のため、３０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＥＧＴＡ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含有する５００μｌの破壊用緩衝液中で４℃にて終夜、４０μｌのＶＬＰをインキュベートした。処置及び未処置粒子のアリコートを、上記の捕獲ＥＬＩＳＡで、１：２０〜１：４０の希釈倍率にて使用した。
【００５７】
［実施例７：赤血球凝集阻害アッセイ］
キメラカプソメアワクチンが中和抗体の生産を惹起する程度を調べるために、赤血球凝集阻害アッセイを、下記に概略説明するとおりに行う。このアッセイは、ウイルス様粒子が赤血球を凝集させることができるとの過去の観察に基づいたものである。
【００５８】
マウスをキメラカプソメアワクチンのいずれかのもので免疫し、実施例４に記載したと同様に血清を集める。陽性の対照として、ＨＰＶ１６Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）とウシＰＶ１（ＢＰＶ）Ｌ１ ＶＬＰをキメラカプソメア調製物と平行してアッセイする。陽性のベースラインを樹立するために、ＨＰＶ１６またはＢＰＶ１ ＶＬＰを、先ず、免疫したマウスから集めた血清の存在下または非存在下にインキュベートし、その後赤血球を加える。マウス血清とのプレインキュベーションが赤血球凝集を阻害する程度が、マウス血清の中和能力の指標となる。次いで、ワクチンへのマウス血清の中和効果を調べるために、キメラカプソメアを用いて実験を繰り返す。赤血球凝集阻害アッセイのための概略のプロトコルを以下に記載する。
【００５９】
１００μｌのヘパリン（１０００ｕｓｐ単位／ｍｌ）を、１ｍｌのマウス新鮮血に添加する。赤血球は、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで遠心分離して１０ｍｌの容量となるように再懸濁する。次に、赤血球を０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁して３日を上限として４℃に保存する。赤血球凝集アッセイのために、９６ウェルプレートでウェル当たり７０μｌの懸濁液を用いる。
【００６０】
ＣｓＣｌ密度勾配より得られたキメラカプソメアのアリコートを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）に対して１時間透析し、そしてＰＢＳで連続的に２倍希釈した溶液１００μｌを、９６ウェル微量定量プレートの丸底に入れたマウス赤血球に添加し、それをさらに４℃にて３〜１６時間インキュベートする。赤血球凝集阻害のためには、カプソメアを抗体のＰＢＳ希釈液と室温にて６０分間インキュベートし、次いで赤血球に添加する。赤血球凝集のレベルと、それにより中和抗体の存在が、標準技術によって決定される。
【００６１】
予備的な実験結果で、Ｅ７アミノ酸残基１〜９８と会合させたＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣタンパク質を含むキメラカプソメアに対して作製されマウス血清は、ＨＰＶ１６ ＶＬＰによる赤血球凝集を阻害するが、ＢＰＶ ＶＬＰによるものは阻害しないことが観察された。従ってかかるマウス血清は、ヒトＶＬＰに対する中和抗体に対して陽性であり、この差示的な中和は、抗体を作製したもののエピトープに対する抗体の特異性の結果に最も依存するものであると推定された。
Claims (16)
- ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)カプソメアを含むワクチン製剤であって、当該カプソメアが、第２タンパク質由来のアミノ酸残基に近接するヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質を含む融合タンパク質を含み、当該Ｌ１タンパク質および当該第２タンパク質由来の当該アミノ酸が、ウィルス様粒子の形成を阻害する位置に存在し、および、当該製剤が、ヒトパピローマウイルスビリオンを中和する免疫応答を惹起する、ことを特徴とするワクチン製剤。
- ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)カプソメアを含むワクチン製剤であって、当該カプソメアが、ウイルス様粒子の形成のために必要な一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠切されているヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質を含み、および、当該製剤が、ヒトパピローマウイルスビリオンを中和する免疫応答を惹起する、ことを特徴とするワクチン製剤。
- 前記カプソメアが、第２タンパク質由来のアミノ酸残基に近接する欠切されたヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質を含む融合タンパク質を含む請求項２に記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、および、ＨＰＶ４５よりなる群から選択されるヒトパピローマウイルスのゲノムによってコードされる請求項１乃至３のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記パピローマウイルスが、ＨＰＶ１６である請求項４に記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、そのカルボキシ末端アミノ酸残基を欠失している請求項２、３または５のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、そのカルボキシ末端の第１位〜第３４位のアミノ酸残基を欠失している請求項６に記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、そのカルボキシ末端アミノ酸残基から３４個のアミノ酸を欠失している請求項７に記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、そのアミノ末端アミノ酸残基を欠失している請求項２、３または５のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記Ｌ１タンパク質が、その内部アミノ酸残基を欠失している請求項２、３または５のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記内部アミノ酸残基が、核局在化シグナルを含む請求項１０に記載のワクチン製剤。
- 前記第２タンパク質由来のアミノ酸残基が、ＨＰＶタンパク質に由来する請求項２または３に記載のワクチン製剤。
- 前記ＨＰＶタンパク質が、初期ＨＰＶタンパク質である請求項１２に記載のワクチン製剤。
- 前記初期ＨＰＶタンパク質が、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、および、Ｅ７よりなる群から選択される請求項１３に記載のワクチン製剤。
- ＨＰＶ感染およびその関連疾患を処置するための薬学的組成物を製造するための請求項１乃至１４のいずれかに記載のワクチン製剤の使用。
- ＨＰＶ感染およびその関連疾患を予防するための薬学的組成物を製造するための請求項１乃至１４のいずれかに記載のワクチン製剤の使用。
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