CN101921733A - 一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，按如下方法制备：步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；步骤3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa。使用异双功能交联剂将短肽抗原耦联至Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术药物和生物治疗学领域，涉及免疫靶向治疗疫苗载体的构建以及载体和短肽耦联的方法。
背景技术
针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点，这些疾病包括：慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔采默病等，其中一些治疗性疫苗在临床试验中有较好的效果，具有广阔的应用前景。与普通预防性疫苗不同的是：治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。
在该发明提出之前，过去常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然有效诱导机体免疫反应，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但存在其他副反应如脑动脉硬化等。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，产生抗体或自身反应T细胞，从而发挥 治疗作用。病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。
病毒样颗粒(VLP)是由病毒的衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可通过和病毒感染一样的途径诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而诱导产生针对与之结合的抗原的抗体，但不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒感染的风险。由于病毒较细菌更原始，与哺乳动物的种属差异更大，作为载体其免疫原性极强(如强于破伤风类毒素等)。此外病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，进入体内后可以将特异性B细胞表面大量B细胞受体(BCR)聚集到一起，提供足够强的第一信号活化B细胞，从而有利于突破自身免疫耐受。每个衣壳蛋白单体一般具有碱性氨基酸(如赖氨酸)，有些碱性氨基酸侧链的氨基(-NH2)朝向颗粒的外表面，短肽等大分子只要带有合适的氨基酸(如-SH)，通过异双功能交连剂(如Sulfo-SMCC)就能结合于VLP表面，刺激机体产生抗体。已有基于VLP的血管紧张素II疫苗成功进行II期临床试验，具有良好的降压效果。
制备用于治疗性疫苗载体的病毒样颗粒，选择合适的病毒十分重要。虽然病毒样颗粒本身不具有感染性，但是能感染人体的病毒可能与人体组织存在交叉反应，免疫后可能产生心肌炎等自身免疫性疾病，并且如果机体已感染过该病毒，该载体的免疫作用将减弱，从而不能发挥治疗作用。因此选择合适的源病毒是关键，噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在，包括人体排泄物，它只寄居在易感宿主菌体内，对人体无害。目 前国内外已制备出MS2噬菌体病毒样颗粒，国外也有Q β噬菌体病毒样颗粒用于降压疫苗的II a临床试验，这两种噬菌体及F2噬菌体均属单链线形RNA病毒，其外形成球形，由其衣壳蛋白组成的病毒样颗粒非常适合用作治疗性疫苗的载体。
发明内容
本发明目的是构建一种病毒样颗粒，并对其进行改建，使其成为免疫靶向治疗的短肽载体，能够诱导机体产生高滴度特异性抗体，从而为免疫靶向治疗提供平台。
为了实现本发明的目的，本发明设计人员充分考虑研究了Qβ噬菌体的生物特征，因为Q β噬菌体属于III类RNA噬菌体，表面结构和I、II类噬菌体相似，编码衣壳蛋白的C基因由两部分组成，CP蛋白基因，以及CP延伸蛋白基因，CP蛋白基因末端为第一个终止密码子TGA，噬菌体有时会错读终止密码子而继续表达，从而生成CP延伸蛋白，从而得到C基因表达产物-A1蛋白(如图1)。CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸所在位置是病毒刺突顶端免疫优势决定区，在CP蛋白辅助下，A1蛋白可以自行聚合为病毒样颗粒。这为本发明的实现奠定了良好的基础和平台。
本发明所提供的病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa，按下述方法得到：
步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子，突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；
步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白免疫优势决定区对应基因内插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸(AAGCTT)，并将CP蛋白基因终止密码子TGA(CP蛋白基因第135位密码子)突变为GGA后，克隆至原核表达载体PGEX4T-2 中，得到编码A1蛋白质粒PGEXQβ-A1；
步骤3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa。
由于Qβ噬菌体编码衣壳蛋白的基因C由两部分组成，CP蛋白基因，以及CP延伸蛋白基因，CP蛋白基因末端为第一个终止密码子TGA，即CP蛋白基因第135位密码子，自然界中的噬菌体有一定几率错读终止密码子而继续表达，从而生成CP延伸蛋白(如图1)。Qβ噬菌体C基因表达产物-A1蛋白必须在CP蛋白的辅助下才能自行聚合为病毒样颗粒。本发明设计人通过步骤1)获得单纯Qβ噬菌体CP蛋白，用于辅助A1蛋白组装；
步骤2)所述免疫优势决定区为Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间部分，其表达产物位于病毒衣壳蛋白刺突顶端，是机体免疫系统主要识别区域，在其间插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸(AAGCTT)，使得A1蛋白免疫优势决定区新增一个赖氨酸和一个亮氨酸，由赖氨酸提供侧链氨基，成为耦联短肽的位点；
步骤3)获得Qβ噬菌体病毒样颗粒蛋白，由于在A1蛋白免疫优势区添加了赖氨酸和亮氨酸两个氨基酸，将新获得Qβ噬菌体病毒样颗粒命名为Qβ-2aa病毒样颗粒蛋白。
带有Qβ-2aa基因的表达载体有多种选择，可以是原核表达载体，真核表达载体或昆虫表达载体，表达生物可以为大肠杆菌、真核细胞或昆虫细胞。
本发明的第二个目的是提供以本发明获得的病毒样颗粒为载体的短肽-病毒样颗粒疫苗。
本发明耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的方法，按如下方法制备：步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；步骤3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa。步骤4)使用异双功能交联剂将短肽抗原耦联至Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒。
本发明步骤1)Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA；步骤2)所述免疫优势决定区为Qβ噬菌体CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸间部分，位于病毒衣壳蛋白刺突顶端，是机体免疫系统主要识别区域。将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后，使得大肠杆菌可以越过CP蛋白终止密码子，继续表达突变后CP延伸蛋白，最终得到突变后A1蛋白。
本发明在Qβ噬菌体CP蛋白辅助下，突变后A1蛋白自行聚合为病毒样颗粒Qβ-2aa。
本发明步骤2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间为编码赖氨酸和亮氨酸基因AAGCTT；步骤3)中表达得到病毒样颗粒A1蛋白免疫优势决定区中有赖氨酸和亮氨酸。
本发明耦联短肽抗原为大鼠AT1受体胞外第二环肽RNVFFIE，在其N端添加一个半胱氨酸(C)，使得异双功能交联剂Sulfo-SMCC可以将短肽抗原N端半胱氨酸，和病毒样颗粒A1蛋白免疫优势决定区赖氨酸耦联，得到耦联短肽抗原病毒样颗粒Qβ-2aa。
本发明耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，是将短肽抗原耦联到Qβ-2aa病毒样颗粒而得到的疫苗。
本发明靶抗原可以是T细胞表位，也可以是B细胞表位，或者是多种表位的组合。
本发明的优越性在于：应用本发明的载体可以将短肽展示在病毒样颗粒免疫优势决定区，从而更好的为机体免疫系统识别，通过与传统半抗原载体如KLH比较，Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒可以大大增强短肽抗原的免疫原性，有效诱导高滴度特异性抗体的生成。
通过化学耦联剂还可以将各种多肽抗原表位展示在病毒颗粒表面，便于免疫细胞和免疫分子识别，在不使用佐剂条件下，诱导高效免疫反应，达到治疗病原体感染、肿瘤和多种慢性疾病的目的，本发明为免疫靶向治疗提供理想载体。
本发明所述的编码CP蛋白质粒其培养物名称命名为，大肠杆菌DH5α/pETQβ-CP Escherichia coli DH5α/pETQβ-CP，并且在2009年11月25日以保藏号CCTCCNO：M209281保藏于国际保藏授权单位，中国典型培养物保藏中心。
本发明所述的编码A1蛋白质粒其培养物名称命名为，大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1 Escherichia coli DH5α/pGEXQβ-A1，并且在2009年11月25日以保藏号CCTCCNO：M209282保藏于国 际保藏授权单位，中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
附图说明
图1：本发明质粒构建步骤，将CP蛋白基因终止密码子TGA突变为强终止密码子TAA后，亚克隆至pET28a(+)表达质粒；将CP蛋白基因终止密码子TGA突变为GGA，在CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间插入核苷酸AAGCTT，亚克隆至PGEX4T-2表达质粒，两个质粒共同转化BL21(DE3)细胞。
图2：其中，M1和M2分别为TaKaRa公司DL2000和DL15000DNA Marker；1)是pETQβ-CP质粒；2)是pGEXQβ-A1质粒；3)是使用EcoR I/Xho I酶切pETQβ-CP质粒得到约400bp片断；4)使用EcoR I/Xho I酶切pGEXQβ-A1质粒得到约900bp片断；5)是用Hind III酶切pGEXQβ-A1质粒得到线性化质粒。
图3：其中，图3(a)SDS-PAGE结果，M为Marke(Fermen tas，CAT#SM0671)，1泳道为共转化pETQβ-CP和PGEXQβ-A1质粒，未诱导时大肠杆菌表达蛋白；2泳道为使用IPTG诱导后大肠杆菌表达蛋白；3泳道为裂解后细菌上清所含蛋白；4泳道为裂解后细菌沉淀所含蛋白；5泳道为纯化后CP蛋白；6泳道为纯化后A1蛋白，图3(b)Western Blot鉴定的His tag CP蛋白，图3(c)Western Blot鉴定的GST tag A1蛋白。
图4(a)、(b)、(c)透射电镜所示大肠杆菌中病毒样颗粒的聚合，箭头所指为大肠杆菌细胞质内组装成功的病毒样颗粒，图4(d)为纯化后得到的病毒样颗粒。
图5为各免疫组抗体按1∶1000稀释后，240nm吸光度，Qβ耦联免疫 组(P1-Qβ)和KLH耦联免疫组(P 1-KLH)相比较，两组间240nm吸光度有显著性差异(P＜0.05)。
具体实施方法
1.Qβ噬菌体的培养和提取
Qβ噬菌体菌株购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，复苏和培养噬菌体方法参考《分子克隆指南》，具体方法是：使用TYG培养基(1％酪蛋白胰酶解物，0.1％酵母提取物，0.1％葡萄糖，0.8％氯化钠，0.03％CaCl2·2H2O)溶解噬菌体菌株，取0.1ml按比例稀释数个浓度。使用LB培养基(1％酪蛋白胰酶解物，0.5％酵母提取物，0.1％氯化钠)扩增宿主菌DH5α，使之达到饱和。在TYG培养基中加入1.5％琼脂粉，高压后制备琼脂平板，另外制备含0.5％琼脂粉的TYG培养基，高压后待温度降至约30℃后加入500ul饱和宿主菌DH5α，将其倒至已凝固1.5％琼脂板，待凝固后将不同稀释浓度Qβ噬菌体滴至平板上，37℃过夜，次日可见噬菌斑形成，根据噬菌斑形成情况确定噬菌体浓度，使用相同方法扩增培养噬菌体。
噬菌体培养完成后，刮取表层0.5％琼脂培养基，12000rpm离心10分钟，收集上清，此即为噬菌体悬液，-80℃保存。
2.CP蛋白基因亚克隆至pET28a(+)质粒
使用Trizol(Invitrogen，USA)、氯仿、异丙醇抽提噬菌体总RNA，逆转录生成cDNA。设计引物如表1，下划线分别为EcoR I和Xho I酶切位点，PCR扩增CP蛋白基因，电泳切胶回收PCR产物。使用DNA A-Tailing Kit(TaKaRa，大连)在PCR产物3’端加多聚A尾，使用T4连接酶(TaKaRa)将 其和pMD-19T中间质粒(TaKaRa)连接，命名为pMD-CP，转化DH5α感受态细胞，挑取菌落扩增后提取质粒测序，结果表明目的基因未发生突变。
| 名称 | 序列(5’-3’) | 长度(mers) |
| QβF | GAATTCATGGCAAAATTAGAGACTGT | 26 |
| QβR | CTCGAGTTAATACGCTGGGTTCAG | 24 |
表1引物序列
使用EcoR I/Xho I分别酶切pET28a质粒和pMD-CP，电泳切胶回收CP蛋白基因和酶切后pET28a，使用T4连接酶(TaKaRa)连接回收产物，命名为pETQβ-CP。PCR鉴定该质粒带有目的基因，酶切鉴定(见图2)和测序结果均表明目的基因插入正确酶切位点。
3.CP蛋白基因终止子的突变，核苷酸AAGCTT的插入及亚克隆至PGEX4T-2质粒
设计引物如表2，下划线分别是EcoR I和Xho I酶切位点。以Qβ噬菌体总RNA为模板，RT-PCR扩增C基因，切胶回收目的基因。使用DNAA-Tailing Kit(TaKaRa，大连)在PCR产物3’端加多聚A尾，使用T4连接酶(TaKaRa)将其和pMD-19T中间质粒(TaKaRa)连接，命名为pMD-A1，转化DH5α感受态细胞，挑取菌落扩增后提取质粒测序，测序结果表明目的基因序列正确。
| 名称 | 序列(5’-3’) | 长度(mers) |
| F0 | GAATTCCCATGGCAAAATTAGAGACTGTTAC | 31 |
| R0 | CTCGAGCTAAGCACGAGGAACGACTAT | 27 |
表2引物序列
设计引物如表3，以pMD-A1模板，F1/R1、F2/R2、F3/R3为引物PCR 扩增目的基因，产物分别命名为PCR1、PCR2、PCR3，电泳切胶回收PCR产物，使用DNA Polymerase(TaKaRa)，以上述PCR产物为模板，F1/R3为引物，经PCR扩增产物命名为PCR4，电泳切胶回收PCR产物，使用EcoRI/Xho I酶切，经乙醇沉淀后命名为1nsert DNA。
| 名称 | 序列(5’-3’) | 长度(mers) |
| F1 | GAGCGGATAACAAATTTCACACAGG | 25 |
| F2 | CCCAGCGTATGGAACACTGCTCATTG | 26 |
| F3 | GCCCTCAAAAAGCTTGATCTTTTGGGCAATAC | 32 |
| R1 | GCAGTGTTCCATACGCTGGGTTCAG | 25 |
| R2 | AAGATCAAGCTTTTTGAGGGCAACATCAAATTC | 33 |
| R3 | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC | 24 |
表3引物序列
将质粒PGEX4T-2用EcoR I/Xho I酶切，电泳回收酶切后质粒，使用使用T4连接酶(TaKaRa)将其和Insert DNA连接，命名为pGEXQβ-A1，转化至DH5α感受态细胞，挑选菌落扩增后提取质粒，PCR鉴定该质粒带有目的基因，酶切鉴定和测序结果表明目的基因插入正确酶切位点，并且在CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间插入序列AAGCTT，见图2。
4.病毒样颗粒的表达和纯化
将质粒pETQβ-CP和pGEXQβ-A1同时热转化至BL21(DE3)大肠杆菌，在含卡那霉素50ug/ml、氨苄青霉素100ug/ml的LB琼脂平板挑选菌落，摇菌过夜。取饱和菌液，加入含卡那霉素50ug/ml、氨苄青霉素100ug/ml的LB培养基中，37℃扩增至OD600＝0.6，加入IPTG(Sigma)至终浓度为1mM，28℃摇菌培养8小时诱导蛋白表达。收集菌液，使用超声裂解细菌，全过程在冰浴中进行，裂解结束后，4℃，13000g离心20分钟，分别收集上清和沉淀， 用SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况，结果表明：质粒pET-CP和pGEX-A1同时热转化至BL21(DE3)大肠杆菌后，经IPTG诱导可以有效表达，获得一个分子量约为60kDa融合蛋白，此即为突变后A1蛋白；另外，还可以获得一分子量约为17kDa的融合蛋白CP，SDS-PAGE分析细菌裂解后上清和沉淀发现融合蛋白可溶，见图3a。
对融合蛋白形成的多聚体，使用Sepharose CL-4B(Pharmacia Biotech)层析柱分离获得病毒样颗粒Qβ-2aa，BCA蛋白浓度测试试剂盒(PIERCE，USA)测定透析产物浓度后，-80℃分装保存。SDS-PAGE分析表明：经过纯化后，目的蛋白纯度在90％以上，见图2a。Western Blot分析表明：GST单克隆抗体和His tag单克隆抗体可以分别和诱导的融合蛋白特异性结合，表明获得的融合蛋白是由被诱导后pETQβ-CP和PGEXQβ-A1质粒表达，见图3b。
5.病毒样颗粒的鉴定
电镜鉴定病毒样颗粒，以确定突变后病毒颗粒在大肠杆菌内正确聚合，将IPTG诱导12小时后菌液1ml，13000g离心1mi n后使用2.5％戊二醛固定2小时，0.1M PBS洗3次，每次20分钟，1％锇酸后固定60分钟后0.1M PBS洗3次，依次经过50％，70％，90％，90％乙醇丙酮，90％丙酮，100％丙酮各5分钟脱水，丙酮和环氧树酯1∶1浸透2小时后，纯环氧树酯包埋浸润2小时，超薄切片，经醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色各10分钟后，透射电镜(荷兰FEI Tecna G212)鉴定病毒样颗粒在细菌内的聚合，纯化后的病毒样颗粒于电镜下行磷钨酸负染色以观察病毒颗粒纯化情况，结果表明：可以在大肠杆菌胞质中看到表达的病毒样颗粒，直径 约30nm；纯化后电镜鉴定表明直径约30nm球形蛋白颗粒大小均一，形态一致，见图4
6.肽段合成
采用固相合成法应用多肽合成仪(PSSM-8型多肽合成仪ShimadzuCompany，JAlan)自动合成大鼠AT1受体胞外第二环肽CRNVFFIE(P1)，采用Fmoc化学合成法，在合成过程中，脱阻滞试剂被加到固相载体上，钠阻滞集团被脱阻滞，活化的氨基酸进而与脱阻滞试剂连接，肽段逐渐延长，每合成一步，剩余的氨基酸被清洗干净，以免干扰下一氨基酸的合成，合成的肽段由自动运行的氮气吹干，具体合成过程按多肽合成仪说明书进行操作。
7.肽段P1分别和Qβ噬菌体病毒样颗粒，以及KLH的耦联
分别取5mg Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒和匙孔血蓝蛋白(KLH)，和1ml 5mg/ml Sulfo-SMCC混合，室温反应2小时，其间间歇振荡，使用0.1MPBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后用于耦联。
取10mg肽段P1，溶于500ul耦联缓冲液(83mM磷酸钠缓冲液，0.1M EDTA，0.9M氯化钠，0.02％叠氮钠，pH7.2)，后将其分别与结合Sulfo-SMCC的Qβ-2aa噬菌体和KLH混合，室温反应2小时后，PBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后-80℃保存，此即为制备的P1-Qβ-2aa蛋白和P1-KLH蛋白。
8.P1-Qβ蛋白免疫SD大鼠
8周龄SD大鼠30只随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组，Qβ-2aa耦联免疫组(P1-Qβ-2aa)和KLH耦联免疫组(P1-KLH)， 免疫剂量为100ug/只，皮下多点注射，每2周加强免疫一次，免疫6次，每次留取血清，-20℃保存。
9.ELISA测定抗体滴度
96孔板每孔的包被量约在10μg。根据大鼠AT1受体胞外第二环肽P1序列，采用固相合成法应用多肽合成仪自动合成。将合成的两个多肽片断分别溶解于0.1mmol/L的碳酸缓冲液中(pH＝9.6)，配成100g/ml的抗原包被液，以每100μl的量包被反应，4℃过夜；弃去孔中液体。5％小牛血清于37℃封闭40min。封闭时注意加满各反应孔，封闭结束后用PBS洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。将倍比稀释(1∶1，000-1∶50，000)免疫血清加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃环境，40-60分钟。PBST洗涤液洗涤3遍，每遍3min。加入1∶2000辣根过氧化物酶酶标抗体，于37℃下作用30min。加入底物，每孔100μl，置37℃避光显色。当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。OD值测定及结果判断：在ELX-800型酶标仪(Bio-tek公司，美国)以450nm波长测定光密度(OD)值。实验中设置空白对照和阳性、阴性对照，测OD值时以空白对照调零，以保证检测结果可靠性。研究抗体溶液与阴性抗体溶液的吸光度之比([标本OD值-空白对照OD值]/[阴性对照OD值-空白对照OD值])超过2.1倍者判为抗体检测阳性。
抗体滴度取对数后以均数±标准差表示，用SPSS10.0软件进行统计处理，统计作图采用Origin7.5软件，组间差异性比较采用方差分析(ANOVA)，以P＜0.05具有显著性差异。结果表明：第二次免疫后大鼠体内针对P1蛋 白的抗体滴度开始升高(如图2)，Qβ-2aa耦联免疫组(P1-Qβ-2aa)和KLH耦联免疫组(P1-KLH)特异性抗体滴度在第4次免疫后达到稳定，Qβ-2aa耦联免疫组(P1-Qβ-2aa)抗体滴度约为1∶30,000，KLH耦联免疫组(P1-KLH)约为1∶6,000两组间抗体按1∶1000稀释后，240nm吸光度有显著性差异(P＜0.05)，见图5。
序列表
<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科
<120>一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途
<160>3
<210>1
<211>402
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ATGGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAACATCGGGAAAGATGGAAAACAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGGTAA
ATCCCACTAACGGCGTTGCCTCGCTTTCACAAGCGGGTGCAGTTCCTGCGCTGGAGAAGCGTGTTACCGTTTCGGTATCTCA
GCCTTCTCGCAATCGTAAGAACTACAAGGTCCAGGTTAAGATCCAGAACCCGACCGCTTGCACTGCAAACGGTTCTTGTGAC
CCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTTTTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTC
GTACAGAGCTTGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTCTGCTGATCGATGCTATTGATCAGCTGAACCCAGCGTATTAA
<210>2
<211>996
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ATGGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAACATCGGGAAAGATGGAAAACAAACTCTGGTTCTCAATCCGCGTGGGGTAA
ATCCCACTAACGGCGTTGCCTCGCTTTCACAAGCGGGTGCAGTTCCTGCGCTGGAGAAGCGTGTTACCGTTTCGGTATCTCA
GCCTTCTCGCAATCGTAAGAACTACAAGGTCCAGGTTAAGATCCAGAACCCGACCGCTTGCACTGCAAACGGTTCTTGTGAC
CCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTTTTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTC
GTACAGAGCTTGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTCTGCTGATCGATGCTATTGATCAGCTGAACCCAGCGTATGGAACACTGCT
CATTGCCGGTGGTGGCTCAGGGTCAAAACCCGATCCGGTTATTCCGGATCCACCGATTGATCCGCCGCCGGGGACAGGTAAG
TATACCTGTCCCTTCGCAATTTGGTCCCTAGAGGAGGTTTACGAGCCTCCTACTAAGAACCGACCGTGGCCTATCTATAATG
CTGTTGAACTCCAGCCTCGCGAATTTGATGTTGCCCTCAAAAAGCTTGATCTTTTGGGCAATACAAAGTGGCGTGATTGGGA
TTCTCGGCTTAGTTATACCACGTTCCGCGGTTGCCGTGGCAATGGTTATATTGACCTTGATGCGACTTATCTTGCTACTGAT
CAGGCTATGCGTGATCAGAAGTATGATATTCGCGAGGGCAAGAAACCTGGTGCTTTCGGTAACATTGAGCGATTCATTTATC
TTAAGTCGATAAATGCTTATTGCTCTCTTAGCGATATTGCGGCCTATCACGCCGATGGCGTGATAGTTGGCTTTTGGCGCGA
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Claims (10)
1.一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，按如下方法制备：
步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；
步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；
步骤3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa。
2.根据权利要求1所述的Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：在步骤2)中将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后，使得大肠杆菌可以越过CP蛋白终止密码子，继续表达突变后CP延伸蛋白，最终得到突变后A1蛋白。
3.根据权利要求1所述Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：在Qβ噬菌体CP蛋白辅助下，突变后A1蛋白自行聚合为病毒样颗粒Qβ-2aa。
4.根据权利要求1所述Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：所述CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸间为Qβ噬菌体衣壳蛋白刺突顶端，是机体免疫系统识别的主要部位，即病毒样颗粒的免疫优势决定区；步骤2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间为编码赖氨酸和亮氨酸基因AAGCTT；步骤3)中表达得到病毒样颗粒A1蛋白免疫优势决定区中有赖氨酸和亮氨酸。
5.一种制备权利要求1耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的方法，按如下方法制备：
步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；
步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；
步骤3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa；
步骤4)使用异双功能交联剂将短肽抗原耦联至Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒。
6.根据权利要求5所述的耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：步骤1)Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA；步骤2)所述免疫优势决定区为Qβ噬菌体CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸间部分，位于病毒衣壳蛋白刺突顶端，是机体免疫系统主要识别区域，将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后，使得大肠杆菌可以越过CP蛋白终止密码子，继续表达突变后CP延伸蛋白，最终得到突变后A1蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：在Qβ噬菌体CP蛋白辅助下，突变后A1蛋白自行聚合为病毒样颗粒Qβ-2aa。
8.根据权利要求5所述耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：在步骤2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间为编码赖氨酸和亮氨酸基因AAGCTT；在步骤3)中表达得到病毒样颗粒A1蛋白免疫优势决定区中有赖氨酸和亮氨酸。
9.根据权利要求5或6所述耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：所述耦联短肽抗原为大鼠AT1受体胞外第二环肽RNVFFIE，在其N端添加一个半胱氨酸(C)，使得异双功能交联剂Sulfo-SMCC可以将短肽抗原N端半胱氨酸，和病毒样颗粒A1蛋白免疫优势决定区赖氨酸耦联，得到耦联短肽抗原病毒样颗粒Qβ-2aa。
10.应用权利要求5或9所述耦联短肽抗原Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，其特征在于：是将短肽抗原耦联到Qβ-2aa病毒样颗粒而得到的疫苗。
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