CN113150082B - 呈递sars-cov-2的rbm不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法 - Google Patents

呈递sars-cov-2的rbm不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种呈递SARS‑COV‑2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法，包括以下步骤：在SARS‑COV‑2的RBM中筛选不同的肽表位，将该基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78‑79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg‑P2、pHBcAg‑P3、pHBcAg‑P4、pHBcAg‑P6，将该质粒转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上，用IPTG诱导、纯化，得到呈递P2，P3，P4，P6的病毒样颗粒疫苗。只需几次免疫注射该疫苗即可诱导强的针对自身分子的、有持续作用的中和性抗体，以中和新型冠状病毒的感染，为新型冠状病毒疫苗研发提供新思路并奠定坚实基础。

Description

呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构 建方法
技术领域
本发明属于分子生物学及免疫学技术领域，具体涉及一种呈递SARS-COV- 2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法。
背景技术
SARS-CoV-2是引起肺炎病例的病原体，其引起的症状类似于严重急性呼 吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)感染，在2020年3月11日被世界卫生组织(世 卫组织)宣布为大流行之后，迫切需要了解和开发针对SARS-CoV-2的有效治疗 干预措施。
SARS-CoV-2与SARS-CoV密切相关，2002-2004年SARS爆发后，针对 SARS-Cov的疫苗在临床前被开发出来，其中两种疫苗在一期试验中进行了试 验。然而，由于该病毒已从人类中根除，并且自2004年以来没有再出现，因此 发展停止了。目前正在积极开发针对MERS-CoV的疫苗，并得到了流行病防备 创新联盟(CEPI)的支持。
通过对SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的临床前研究，冠状病毒疫苗的抗原 靶点已经明确。大多数冠状病毒只编码一种大的表面蛋白，即刺突蛋白，它负 责受体结合和膜融合。在SARS-CoV-2(和SARS-CoV)的病例中，刺突蛋白与宿 主细胞上的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，因此，阻断与ACE2的结合，或 阻断宿主蛋白酶裂解S糖蛋白释放融合肽是防止冠状病毒侵入的有效策略。基 于这一知识，以及从SARS-CoV和MERS-CoV的临床前研究中获得的信息，S 蛋白被确定为一个抗原靶点，用于在非常早期阶段开发针对SARS-CoV-2的疫苗。
SARS-CoV-2的S蛋白被水解为S1和S2两个亚基，其中S1亚基包含受 体结合区域(RBD)，RBM是存在于S1的受体结合域(RBD)上的受体结合基 序(RBM)。据了解，阻断RBD和ACE2关联部位的受体结合基序(RBM)是SA RS-CoV中和的主要机制。
明确主要的抗原靶点后，抗原呈递方式是影响疫苗效果的关键因素。现有 常规技术手段主要是与异源蛋白连接或者加强佐剂，我们在SARS-CoV-2的R BM区域中筛选出具有中和新型冠状病毒潜力的肽表位，但其免疫原性较低，产 生的抗体滴度不高。
目前提高抗原免疫原性常用的方法是用强的佐剂，例如弗氏佐剂，或者增 加抗原免疫剂量，但是这些常规的方法常常带来很大的副作用，例如弗氏佐剂 含有甘油、羊毛脂、死的结核分枝杆菌等，免疫后表现为局部溃烂，瘙痒，脓 肿等，而机体也会引起强烈的免疫应答；过多剂量的抗原会导致免疫系统产生 免疫耐受，需要寻找更理想的抗原递呈方式。因此如何克服现有技术的不足是 目前分子生物学及免疫学技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有常规手段不能增强SARS-CoV-2 天然S蛋白结构中免疫原性较低的表位，筛选RBM中9个肽表位与KLH载体 偶联后免疫动物，诱导产生的抗体进行体外中和实验，并选择其中4个肽表位， 构建了一种有效的呈递RBM肽表位的病毒样颗粒疫苗(选择了4个肽表位，构 建了4个呈递肽表位的病毒样颗粒疫苗)，只需要几次疫苗注射即可产生针对表 位的较强的中和性抗体，从而达到阻止新型冠状病毒感染的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法， 包括以下步骤：
步骤(1)，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表位基因；
步骤(2)，将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体， 再将步骤1)得到的编码P2、P3、P4、P6基因插入到乙肝病毒核心抗原HBc Ag的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBcAg -P4、pHBcAg-P6，质粒构建示意图如图1所示；
步骤(3)，将步骤(2)得到的重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBc Ag-P4、pHBcAg-P6转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上；
步骤(4)，用IPTG诱导表达步骤(3)的转化有重组质粒pHBcAg-P2、p HBcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6的大肠杆菌DH5α或BL21，蛋白诱导图 图如图2所示，纯化如图3所示，分别得到呈递P2、P3、P4、P6的四个病毒 样颗粒疫苗电镜下观察如图4，5所示。
进一步，优选的是，步骤(1)中，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、 P4、P6肽表位基因采用的引物如下：
编码P2基因的上游引物(5’端)：gatcttacctgtaccgtctgttccgtaaatctaacctgaagccgttcgaaggatccggtg；(SEQ ID NO.1)
编码P2基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccttcgaacggcttcaggttagatttacggaacagacggtacaggtaa；(SEQ ID NO.2)
编码P3基因的上游引物(5’端)：gatctcgtgatatcagcaccgaaatctaccaggccggttctaccccgtgcggatccggtg；(SEQ ID NO.3)
编码P3基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgcactatagtcgtggctttagatggtccggccaagatggggcacga；(SEQ ID NO.4)
编码P4基因的上游引物(5’端)：gatctaacggcgttgaaggcttcaactgctacttcccgctgcagagctacggcggatccggtg；(SEQ ID NO.5)
编码P4基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgccgtagctctgcagcgggaagtagcagttgaagccttcaacgccgtta；(SEQ ID NO.6)
编码P6基因的上游引物(5’端)：gatctaaagtgggcggtaactataactacctgtaccgtctgttccgtaaaggatccggtg；(SEQ ID NO.7)
编码P6基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatcctttacggaacagacggtacaggtagttatagttaccgcccacttta。(SEQ ID NO.8)
进一步，优选的是，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表 位基因的体系及程序如下：
上游引物：50微摩尔，2微升；下游引物：50微摩尔，2微升；10X PCR buffer：1微升；双蒸水：5微升；总计10微升；
进行退火：将双蒸水加热至100℃，分别放入配好的4个退火体系，自然降 温至室温，得到编码P2、P3、P4、P6的基因。
进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法如下：
编码截断的HBcAg基因5’端和3’端分别有BamHI和EcoRI的酶切位点， 用内切酶NdeI和PstI酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒pHBcAg；然后再 用BamHI和EcoRI将编码P2、P3、P4、P6基因的DNA构建到pHBcAg中， 转化大肠杆菌DH5α或BL21，得到带有目的基因的重组质粒pHBcAg-P2、pH BcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6；
其中，酶切体系为：pThioHisA：1微克/微升，2微升；NdeI：酶活性单位 为10U/微升，1微升；PstI：酶活性单位为15U/微升，1微升；10XH buffer： 1微升；双蒸水：5微升；总计10微升；经37℃反应过夜；
构建体系为：质粒pHBcAg：2微升；肽基因(P2、P3、P4或P6基因) 的DNA：0.5微升；T4连接酶：1微升；10X T4酶buffer：1微升；双蒸水： 5.5微升；总计10微升；室温连接3小时。
进一步，优选的是，步骤(4)纯化的方法为：通过Sepharose 4Fast Fl ow柱子纯化，再用含有0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液稀释碘克沙醇，最终 以质量浓度为39％、33％和27％的碘克沙醇对P2、P3、P4、P6目的蛋白进行 密度梯度离心纯化最后用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化P2、P3、P4、P6目的蛋 白。6、根据权利要求1所述的呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病 毒样颗粒疫苗构建方法，其特征在于，步骤(4)的具体方法为：
1)将30℃下IPTG诱导4小时的1升菌液离心后，收集菌体；
2)用0.02摩尔/升、pH7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤1)收集的菌体 重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清10毫升；重复此步骤1) 次，收集2次共20毫升超声上清液；再通过0.45微米滤器过滤除菌，用Seph arose 4Fast Flow柱子纯化；再用含有0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液稀 释碘克沙醇，最终以质量浓度为27％、质量浓度为33％和质量浓度为39％的碘 克沙醇进行密度梯度离心，离心后的液体经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目 的蛋白含量为50％及以上的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到分别呈递 P2、P3、P4、P6的病毒样颗粒疫苗。7、根据权利要求6所述的呈递SARS-C OV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法，其特征在于，密度 梯度离心的具体方法为：
从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升浓度为39％、33％和27％ 的碘克沙醇，加完后每个浓度的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜； 次日每个质量浓度的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升柱Se pharose 4Fast Flow纯化后的样品，在4℃，40000转/分钟条件下，离心4 小时。
密度梯度离心优选为，将1400微升质量浓度为27％、1400微升质量浓度 为33％和1400微升质量浓度为39％的碘克沙醇、Sepharose 4Fast Flow柱 子纯化后样品700微升依次加入到离心管中，进行密度梯度离心，离心后用移 液枪从上到下每200微升取一次样品，样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，将目 的蛋白含量为50％及以上的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到分别呈递 P2、P3、P4、P6的病毒样颗粒疫苗。
进一步，优选的是，密度梯度离心的具体方法为：
从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升浓度为39％、33％和27％ 的碘克沙醇，加完后每个浓度的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜； 次日每个质量浓度的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升柱Se pharose 4Fast Flow纯化后的样品，在4℃，40000转/分钟条件下，离心4 小时。
本发明同时提供上述呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样 颗粒疫苗构建方法构建得到呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒 样颗粒疫苗。
本发明还提供上述呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗 粒疫苗在制备SARS-COV-2病毒疫苗中的应用。
本发明所述的呈递肽表位的病毒样颗粒疫苗，以不同的肽表位作为组成之 一(以下简称HBcAg-P2、HBcAg-P3、HBcAg-P4、HBcAg-P6)，选择具有强 免疫原性的乙肝病毒核心抗原作为载体(简称载体)，通过基因工程的方法，将 编码的肽表位与乙肝病毒核心抗原连接并在大肠杆菌中高效表达。
本发明步骤(1)中的编码RBM基因的基因库收录号为：6YZ5_E。
本发明步骤(2)中编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg(1-149个氨基酸) 的基因库收录号为：GQ377581。所述编码截断的乙肝病毒核心抗原基因的核苷 酸序列如SEQ IDNO.9所示。
本发明一种将经过筛选的SARS-COV-2蛋白的RMB肽表位呈递在乙肝核 心抗原病毒样颗粒表面作为中和新型冠状病毒的应用，本发明得到的呈递P2、 P3、P4、P6的病毒样颗粒疫苗能够用于免疫动物产生中和性抗体，如图6至图 12所示。
现有常规技术手段主要是与异源蛋白连接或者加强佐剂，而乙肝病毒核心 抗原(简称HBcAg或载体)在大肠杆菌里能够有效的组装成病毒样颗粒，具有 极强的免疫原性并且已经广泛的应用于插入目的抗原的疫苗载体。本发明在SA RS-CoV-2的RBM区域中筛选出具有中和新型冠状病毒潜力的肽表位，但其免 疫原性较低，产生的抗体滴度不高，如图9所示，与KLH偶联的P2-KLH，P3- KLH，P4-KLH，P6-KLH以160微克免疫小鼠产生的抗体应答水平低于以50微 克病毒样颗粒呈递的HBcAg-P2，HBcAg-P3，HBcAg-P4，HBcAg-P6，尤其是HBcAg-P3，HBcAg-P6产生的抗体水平在统计意义上具有显著差异，而HBcAg -P2，HBcAg-P4也产生了相当水平的抗体。病毒样颗粒疫苗以50微克的剂量 就能产生相当水平甚至更高水平的抗体，超过KLH偶联的160微克剂量，因此， 更进一步说明病毒样颗粒疫苗作为疫苗呈递载体具有显著优势。
发明人发现以病毒样颗粒呈递RBM不同区域的肽表位，能有效的增强原本 在SARS-CoV-2的S蛋白天然结构中低免疫原性的肽表位的免疫原性，免疫动 物后诱导产生的高强度抗体。发明人的发现突出了RBM结构域在SARS-CoV-2 疫苗设计中的重要性，并通过诱导针对RBM结构域的抗体为保护性疫苗的开发 提供了理论依据。
病毒样颗粒模拟天然病毒的结构，但没有病毒核酸，因此安全性有保障。 并且由于其高度有序的重复结构，可以将抗原高度有序的重复呈递在病毒样颗 粒表面，低剂量就能产生有效的免疫应答。病毒样颗粒作为一种崭新的疫苗呈 递方式，在疫苗研究领域具有广阔的应用前景。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1)在SARS-COV-2的S蛋白中，RBM是新型冠状病毒与受体结合的主要 靶点，但有些具有中和潜力的表位可能隐藏在天然蛋白内部，而肽疫苗的优势 在于可以将原本隐藏的表位暴露出来。
2)制备简单：利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的重组表达及 易获得有效纯化；
3)免疫原性强：一个颗粒由180或240个亚基组成，因此允许插入的表位 高拷贝的、高度有序的暴露在颗粒表面，这样的结构可破坏机体识别异与己的 能力，有利打破耐受。
4)安全：乙肝核心抗原作为疫苗载体的安全性已在FDA批准的一项疟疾 疫苗的I/II期临床试验中获得考察，无明显的不良反应发现。
5)只需要有限的免疫次数和较低剂量的疫苗蛋白注射，即可以诱导强的可 持续存在并作用的中和抗体。
6)本发明采用主动免疫的方法，通过基因重组的呈递P2、P3、P4、P6肽 表位的病毒样颗粒疫苗，与常规肽表位与KLH载体蛋白偶联后免疫产生的抗体 相比，在小鼠中诱导强的中和性抗体如图6至图10所示，凸显了以病毒样颗粒 呈递肽疫苗的优势，也为新型冠状病毒肽疫苗的开发提供了新思路并奠定坚实 基础。
附图说明
图1是质粒构建示意图：为重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBcAg- P4、pHBcAg-P6的构建示意图；
图2是编码HBcAg-P3的诱导表达前后和Sepharose 4Fast Flow柱子纯 化后样品电泳图；其中，M代表蛋白marker，泳道1为HBcAg-P3诱导前，泳 道2为HBcAg-P3诱导后，泳道3为HBcAg-P3经Sepharose 4Fast Flow柱 子纯化后，图中箭头显示目的蛋白表达；
图3是HBcAg-P3的蛋白碘克沙醇密度梯度离心取样电泳图；其中，M代 表蛋白marker，泳道1为HBcAg-P3诱导前，泳道2为HBcAg-P3诱导后，泳 道3-14代表碘克沙醇密度梯度离心后每200微升一层取一次样，第3层～第14 层取样的样品；
图4是观察到HBcAg乙肝病毒核心抗原形成病毒样颗粒的电镜图；
图5是以HBcAg-P3为代表电镜观察到形成病毒样颗粒的电镜图；
图6是ELISA检测抗体反应图：为使用高剂量160微克的肽与KLH偶联诱 导的抗体反应；
图7是ELISA检测抗体反应图：为使用高剂量160微克的肽与KLH偶联产 生的中和抗体滴度；
图8是ELISA检测抗体反应图：为使用50微克低剂量的病毒样颗粒疫苗 免疫诱导产生强的抗体应答；
图9是ELISA检测抗体反应图：为低剂量50微克呈递肽的病毒样颗粒疫 苗产生的抗体高于与高剂量160微克肽与KLH载体偶联产生的抗体；
图10是ELISA检测抗体反应图：为代表性的病毒样颗粒形式的HBcAg-P6 产生的中和抗体滴度高于肽偶联到KLH即P6-KLH产生的中和抗体。
图11是显微镜拍照细胞的图：为新型冠状病毒感染细胞，产生细胞病变；
图12是显微镜拍照细胞的图：为中和性抗体阻止新型冠状病毒感染，细胞 不病变。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所 描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商 者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法， 包括以下步骤：
步骤(1)，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表位基因；
步骤(2)，将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体， 再将步骤1)得到的编码P2、P3、P4、P6基因插入到乙肝病毒核心抗原HBc Ag的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBcAg -P4、pHBcAg-P6；
步骤(3)，将步骤(2)得到的重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBc Ag-P4、pHBcAg-P6转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上；
步骤(4)，用IPTG诱导表达步骤(3)的转化有重组质粒pHBcAg-P2、p HBcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6的大肠杆菌DH5α或BL21，纯化，分别 得到呈递P2、P3、P4、P6的四个病毒样颗粒疫苗。
实施例2
呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法， 包括以下步骤：
步骤(1)，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表位基因；
步骤(2)，将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体， 再将步骤1)得到的编码P2、P3、P4、P6基因插入到乙肝病毒核心抗原HBc Ag的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBcAg -P4、pHBcAg-P6；
步骤(3)，将步骤(2)得到的重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBc Ag-P4、pHBcAg-P6转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上；
步骤(4)，用IPTG诱导表达步骤(3)的转化有重组质粒pHBcAg-P2、p HBcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6的大肠杆菌DH5α或BL21，纯化，分别 得到呈递P2、P3、P4、P6的四个病毒样颗粒疫苗。
步骤(1)中，合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表位基因 采用的引物如下：
编码P2基因的上游引物(5’端)：gatcttacctgtaccgtctgttccgtaaatctaacctgaagccgttcgaaggatccggtg；
编码P2基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccttcgaacggcttcaggttagatttacggaacagacggtacaggtaa；
编码P3基因的上游引物(5’端)：gatctcgtgatatcagcaccgaaatctaccaggccggttctaccccgtgcggatccggtg；
编码P3基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgcactatagtcgtggctttagatggtccggccaagatggggcacga；
编码P4基因的上游引物(5’端)：gatctaacggcgttgaaggcttcaactgctacttcccgctgcagagctacggcggatccggtg；
编码P4基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgccgtagctctgcagcgggaagtagcagttgaagccttcaacgccgtta；
编码P6基因的上游引物(5’端)：gatctaaagtgggcggtaactataactacctgtaccgtctgttccgtaaaggatccggtg；
编码P6基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatcctttacggaacagacggtacaggtagttatagttaccgcccacttta。
合成SARS-COV-2的RBM中P2、P3、P4、P6肽表位基因的体系及程序 如下：
上游引物：50微摩尔，2微升；下游引物：50微摩尔，2微升；10X PCR buffer：1微升；双蒸水：5微升；总计10微升；
进行退火：将双蒸水加热至100℃，分别放入配好的4个退火体系，自然降 温至室温，得到编码P2、P3、P4、P6的基因。
步骤(2)的具体方法如下：
编码截断的HBcAg基因5’端和3’端分别有BamHI和EcoRI的酶切位点， 用内切酶NdeI和PstI酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒pHBcAg；然后再 用BamHI和EcoRI将编码P2、P3、P4、P6基因的DNA构建到pHBcAg中， 转化大肠杆菌DH5α或BL21，得到带有目的基因的重组质粒pHBcAg-P2、pH BcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6；
其中，酶切体系为：pThioHisA：1微克/微升，2微升；NdeI：酶活性单位 为10U/微升，1微升；PstI：酶活性单位为15U/微升，1微升；10XH buffer： 1微升；双蒸水：5微升；总计10微升；经37℃反应过夜；
构建体系为：质粒pHBcAg：2微升；肽基因的DNA：0.5微升；T4连接 酶：1微升；10XT4酶buffer：1微升；双蒸水：5.5微升；总计10微升；室 温连接3小时。
步骤(4)纯化的方法为：通过Sepharose 4Fast Flow柱子纯化，再用 含有0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液稀释碘克沙醇，最终以质量浓度为39％、 33％和27％的碘克沙醇对P2、P3、P4、P6目的蛋白进行密度梯度离心纯化最 后用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化P2、P3、P4、P6目的蛋白。6、根据权利要 求1所述的呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建 方法，其特征在于，步骤(4)的具体方法为：
1)将30℃下IPTG诱导4小时的1升菌液离心后，收集菌体；
2)用0.02摩尔/升、pH7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤1)收集的菌体 重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清10毫升；重复此步骤1) 次，收集2次共20毫升超声上清液；再通过0.45微米滤器过滤除菌，用Seph arose 4Fast Flow柱子纯化；再用含有0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液稀 释碘克沙醇，最终以质量浓度为27％、质量浓度为33％和质量浓度为39％的碘 克沙醇进行密度梯度离心，离心后的液体经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目 的蛋白含量为50％及以上的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到分别呈递 P2、P3、P4、P6的病毒样颗粒疫苗。7、根据权利要求6所述的呈递SARS-C OV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法，其特征在于，密度 梯度离心的具体方法为：
从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升浓度为39％、33％和27％ 的碘克沙醇，加完后每个浓度的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜； 次日每个质量浓度的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升柱Se pharose 4Fast Flow纯化后的样品，在4℃，40000转/分钟条件下，离心4 小时。
实施例3
1)在S蛋白RBM区域筛选目的肽表位P2、P3、P4、P6；合成编码肽表 位经生工生物公司优化后的基因。所述基因由生工生物工程(上海)股份有限 公司合成，具体如下：
编码P2基因的上游引物(5’端)：gatcttacctgtaccgtctgttccgtaaatctaacctgaagccgttcgaaggatccggtg
编码P2基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccttcgaacggcttcaggttagatttacggaacagacggtacaggtaa
编码P3基因的上游引物(5’端)：gatctcgtgatatcagcaccgaaatctaccaggccggttctaccccgtgcggatccggtg
编码P3基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgcactatagtcgtggctttagatggtccggccaagatggggcacga
编码P4基因的上游引物(5’端)：gatctaacggcgttgaaggcttcaactgctacttcccgctgcagagctacggcggatccggtg
编码P4基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatccgccgtagctctgcagcgggaagtagcagttgaagccttcaacgccgtta
编码P6基因的上游引物(5’端)：gatctaaagtgggcggtaactataactacctgtaccgtctgttccgtaaaggatccggtg
编码P6基因的下游引物(3’端)：aattcaccggatcctttacggaacagacggtacaggtagttatagttaccgcccacttta
配如下体系(10微升)，进行退火操作：
肽表位基因的5’端引物(浓度为50微摩尔)：2微升，3’端引物(浓度为5 0微摩尔)：2微升，10X PCR buffer：1微升，双蒸水：5微升。进行退火： 将双蒸水加热至100℃，分别放入配好的4个退火体系，自然降温至室温，得到 编码P2、P3、P4、P6的基因。
将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg基因由生工生物工程(上海)股份 有限公司合成(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，其中5’端和3’端分别有B amHI和EcoRI的酶切位点，并用内切酶NdeI和PstI酶切后克隆到pThioHisA 中，酶切体系为：pThioHisA：2微升(浓度为1微克/微升)，NdeI：1微升(酶 活性单位为10U/微升)，PstI：1微升(酶活性单位为15U/微升),10XH buffer: 1微升,双蒸水：5微升，总计10微升，经37℃反应过夜，得到质粒pHBcAg； 然后再用BamHI和EcoR I将步骤1)得到的编码P2、P3、P4、P6基因的D NA(如SEQ IDNO.10-SEQ ID NO.13所示)分别构建到乙肝病毒核心抗原 HBcAg的78-79位氨基酸之间，分别得到带有目的基因的重组质粒pHBcAg-P2、 pHBcAg-P3、pHBcAg-P4、pHBcAg-P6，经过生工生物工程(上海)股份有限公 司测序，该目的基因与基因库中的序列一致，为阳性克隆；其中连接体系(10 微升)如下：pHBcAg载体：2微升，编码肽表位P2、P3、P4、P6基因的DN A：0.5微升，T4连接酶：1微升，10X T4酶buffer：1微升，双蒸水：5.5微 升，室温连接3小时；如图1所示：病毒样颗粒疫苗HBcAg-P2，HBcAg-P3， HBcAg-P4，HBcAg-P6质粒构建示意图(核苷酸序列如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.17所示)，选取的RBM肽，即P2、P3、P4、P6的基因构建到HBcAg 的第78位和79位氨基酸之间。
2)分别将步骤2)所得连接产物10微升转化到100微升大肠杆菌DH5α 或BL21感受态细胞上，得到包含重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、pHBcA g-P4、pHBcAg-P6的细菌；
4)用IPTG诱导步骤3)的转化有重组质粒pHBcAg-P2、pHBcAg-P3、p HBcAg-P4、pHBcAg-P6的大肠杆菌DH5α或BL21，高效表达P2、P3、P4、 P6目的蛋白，先用Sepharose4Fast Flow柱子纯化，再用质量浓度为39％、 33％和27％的碘克沙醇，对P2、P3、P4、P6目的蛋白进行下列密度梯度离心 纯化：
4.1)将30℃下IPTG诱导4小时的1升菌液离心后，收集菌体；
4.2)用0.02摩尔/升、pH7.4的磷酸缓冲液10毫升，将步骤4.1)收集的 菌体重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，重复此步骤两次，收集两次 的上清共20毫升；用0.45微米的滤器过滤，用Sepharose 4Fast Flow柱子 纯化，然后再通过质量浓度为27％、33％和39％的碘克沙醇进行下列密度梯度 离心，质量浓度为27％、33％和39％的碘克沙醇的配制方法如下：
购买的商业化碘克沙醇浓度为60％，将商业化的碘克沙醇用磷酸盐缓冲液 稀释为46％的碘克沙醇；取8.48毫升46％的碘克沙醇加1.52毫升含0.8摩尔/ 升氯化钠的磷酸盐缓冲液，即为39％的碘克沙醇；取7.17毫升46％的碘克沙醇 加2.83毫升含0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液，即为33％的碘克沙醇；取5. 87毫升46％的碘克沙醇加4.13毫升含0.8摩尔/升氯化钠的磷酸盐缓冲液，即 为27％的碘克沙醇。从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升质量浓度 为39％、33％和27％的碘克沙醇，加完后每个质量浓度的碘克沙醇之间形成明 显界限，室温放置过夜后，每个质量浓度的碘克沙醇之间的界限消失，向离心 管中加入700微升柱Sepharose 4Fast Flow纯化后的样品，在4℃、40000 转/分钟条件下，离心4小时；之后每200微升取一次样品，经聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定后，将目的蛋白较多的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到呈递 P2、P3、P4、P6的病毒样颗粒疫苗，-70℃保存备用。
其中，编码HBcAg-P3的诱导表达前后和Sepharose 4Fast Flow柱子纯 化后样品电泳图如图2，HBcAg-P3的蛋白碘克沙醇密度梯度离心取样电泳图如 图3。
本发明实施例3得到的疫苗经下列动物实验和细胞实验：
一、检测实施例3所得疫苗的免疫原性
1)免疫原：单独的实施例3的160微克P2-KLH+铝佐剂，160微克P3-K LH+铝佐剂，160微克P4-KLH+铝佐剂，160微克P6-KLH+铝佐剂、实施例3 的50微克HBcAg-P2病毒样颗粒疫苗+铝佐剂、50微克HBcAg-P3病毒样颗粒 疫苗+铝佐剂、50微克HBcAg-P4病毒样颗粒疫苗+铝佐剂、50微克HBcAg-P6 病毒样颗粒疫苗+铝佐剂。注：P2-KLH表述将合成的P2肽与KLH蛋白偶联， 其它同理。
2)动物：6-8周C57BL/6雌鼠，随机分3组，4只/组。
3)方法：分别在对应组的小鼠背部皮下三点免疫1)的八种免疫原，每隔 一周免疫一次，共三次；每一次免疫后一周大腿静脉采血检测抗体水平(血清 稀释度为1:1000)。
4)检测结果显示：与肽与KLH偶联的组相比，使用更低剂量的肽病毒样 颗粒疫苗能诱导强的甚至更高的针对自身分子的中和性抗体。第二次激发后(第 五周)，P6特异的抗体滴度达到2048000。
二、实施例3的HBcAg-P2病毒样颗粒疫苗、HBcAg-P3病毒样颗粒疫苗、 HBcAg-P4病毒样颗粒疫苗、HBcAg-P6病毒样颗粒疫苗诱导产生中和性抗体分 析。
将新型冠状病毒敏感细胞Vero E6铺在96孔细胞培养板中，以8倍、16 倍、32倍，64倍、128倍、256倍用PBS分别稀释HBcAg-P2病毒样颗粒疫 苗、HBcAg-P3病毒样颗粒疫苗、HBcAg-P4病毒样颗粒疫苗、HBcAg-P6病毒 样颗粒疫苗免疫小鼠后采集的血清(注：原始倍数为免疫小鼠后采集的血清)， 将稀释好的抗体与新型冠状病毒孵育，然后依次将孵育后的血清病毒混合物加 入细胞培养板中，3-5天观察细胞病变情况，见图10。
如图4所示：显示疫苗载体HBcAg经电镜观察形成病毒样颗粒。
如图5所示：以HBcAg-P3为代表性图，显示疫苗HBcAg-P3经电镜观察 形成病毒样颗粒。
如图6所示：在SARS-COV-2的RBM区域选取了9个肽，不同的肽合成 后与KLH偶联，分别命名为P1-KLH，P2-KLH，P3-KLH，P4-KLH，P5-KLH, P6-KLH，P7-KLH，P8-KLH，P9-KLH。与KLH偶联后的不同肽免疫小鼠后产 生的抗体应答水平。其中P1-KLH，P3-KLH，P5-KLH，P7-KLH产生的抗体水 平较高，而P6-KLH，P8-KLH，P9-KLH产生的抗体水平较低。
如图7所示：将P1-KLH，P2-KLH，P3-KLH，P4-KLH，P5-KLH,P6-KLH， P7-KLH，P8-KLH，P9-KLH免疫小鼠后产生的抗体做中和实验，检测中和抗体 滴度。不同的肽均能诱导不同的中和抗体水平，但由于P6-KLH虽然在图6中 其抗体水平低不如别的肽(P8-KLH，P9-KLH除外)，但其中和抗体滴度水平与 别的肽没有显著差异。
如图8所示，将P2，P3，P4，P6肽经基因工程构建到HBcAg载体上形成 病毒样颗粒，免疫小鼠后，检测第二针免疫和第三针免疫后一周抗体滴度。
如图9所示：与KLH偶联的P2-KLH，P3-KLH，P4-KLH，P6-KLH与形成 病毒样颗粒的HBcAg-P2，HBcAg-P3，HBcAg-P4，HBcAg-P6疫苗免疫小鼠后 抗体水平相比，结果显示，病毒样颗粒疫苗产生的抗体高于与KLH偶联的肽， 说明病毒样颗粒疫苗免疫原性更强。
如图10所示：本文重点在于病毒样颗粒形式的疫苗能增强原本在SARS-C OV-2的RBM中免疫原性较低的肽，P6作为典型代表，将P6呈递在病毒样颗 粒表面后，产生的中和抗体高于与KLH偶联的P6-KLH。
如图11所示：新冠病毒感染敏感细胞Vero E6后，细胞病变。
如图12所示：中和抗体能阻止新冠病毒感染敏感细胞Vero E6，细胞没有 病变。
本发明提供的疫苗，只需要有限的免疫次数和较低剂量的疫苗蛋白注射， 即可以诱导强的具有作用的中和抗体。常规手段是把自身蛋白与异源性蛋白或 表位化学偶联或基因重组，这样的疫苗能诱导自身抗体，但免疫原性常较弱， 需使用强的剂量或免疫佐剂。
本发明所述的呈递肽表位的病毒样颗粒疫苗是疫苗研究的一个热点，尤其 对于隐藏在天然蛋白内部的抗原表位，病毒样颗粒具有独特的优势。其特点为： 1)制备简单：利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的重组表达及易获 得有效纯化；2)免疫原性强：一个颗粒由180或240个亚基组成，因此允许插 入的表位高拷贝的、高度有序的暴露在颗粒表面，这样的结构可破坏机体识别 异与己的能力，有利打破耐受。此外，乙肝核心抗原的特异序列可直接激活B 细胞的抗原呈递功能，其能力是常规抗原呈递细胞的105倍。这样的病毒样颗粒 疫苗可诱导高强度的、持续的自身抗体应答，而不需要强的免疫佐剂；3)安全： 乙肝核心抗原作为疫苗载体的安全性已在FDA批准的一项疟疾疫苗的I/II期临 床试验中获得考察，无明显的不良反应发现；此外，利用乙肝核心抗原的大量 动物实验也未发现小鼠出现明显不良病征。
本发明将SARS-COV-2的S蛋白中免疫原性较低的肽表位呈递在病毒样颗 粒表面，在小鼠中诱导了强的抗体反应；通过体外中和实验，能有效阻止新型 冠状病毒的感染。本发明对新型冠状病毒抗原靶点的选择具有重要意义，同时 为新型冠状病毒基因工程疫苗的研发提供新的思路。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明 还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本 发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗构建方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gatcttacct gtaccgtctg ttccgtaaat ctaacctgaa gccgttcgaa ggatccggtg 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aattcaccgg atccttcgaa cggcttcagg ttagatttac ggaacagacg gtacaggtaa 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gatctaacgg cgttgaaggc ttcaactgct acttcccgct gcagagctac ggcggatccg 60
gtg 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
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tta 63
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gatctaaagt gggcggtaac tataactacc tgtaccgtct gttccgtaaa ggatccggtg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aattcaccgg atcctttacg gaacagacgg tacaggtagt tatagttacc gcccacttta 60
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
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ccttctgact tctttccttc tattcgagat ctcctcgaca ccgcctcagc tctgtatcgg 120
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ctgtgttggg gtgagttgat gaatttggcc acctgggtgg gaagtaattt ggaagacgga 240
ttcggtggcg gtggcggacc agcatccagg gaattagtag tcagctatgt taatgttaat 300
atgggcctaa aaatcagaca actactgtgg tttcacattt cctgtcttac ttttggaaga 360
gaaactgttc ttgaatattt ggtgtctttt ggagtgtgga ttcgcactcc tcctgcttac 420
agaccaccaa atgcccctat cttatcaaca cttccggaaa ctactgttgt ttaa 474
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tacctgtacc gtctgttccg taaatctaac ctgaagccgt tcgaa 45
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cgtgatatca gcaccgaaat ctaccaggcc ggttctaccc cgtgc 45
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<212> DNA
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aacggcgttg aaggcttcaa ctgctacttc ccgctgcaga gctacggc 48
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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aaagtgggcg gtaactataa ctacctgtac cgtctgttcc gtaaa 45
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tcttacctgt accgtctgtt ccgtaaatct aacctgaagc cgttcgaagg atccggtgaa 300
ttcggtggcg gtggcggacc agcatccagg gaattagtag tcagctatgt caatgttaat 360
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<212> DNA
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atgggcctaa aaatcagaca actattgtgg tttcacattt cctgtcttac ttttggaaga 420
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<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
catatggaca ttgacccgta taaagaattt ggagcttctg tggagttact ctcttttttg 60
ccttctgact tctttccttc tattcgagat ctcctcgaca ccgcctctgc tctgtatcgg 120
gaggccttag agtctccgga acattgttca cctcaccata cagcactcag gcaagctatt 180
ctgtgttggg gtgagttgat gaatctggcc acctgggtgg gaagtaattt ggaagacgga 240
tctaacggcg ttgaaggctt caactgctac ttcccgctgc agagctacgg cggatccggt 300
gaattcggtg gcggtggcgg accagcatcc agggaattag tagtcagcta tgtcaatgtt 360
aatatgggcc taaaaatcag acaactattg tggtttcaca tttcctgtct tacttttgga 420
agagaaactg ttcttgagta tttggtgtct tttggagtgt ggattcgcac tcctcccgct 480
tacagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgt tgtttaa 537
<210> 17
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
catatggaca ttgacccgta taaagaattt ggagcttctg tggagttact ctcttttttg 60
ccttctgact tctttccttc tattcgagat ctcctcgaca ccgcctctgc tctgtatcgg 120
gaggccttag agtctccgga acattgttca cctcaccata cagcactcag gcaagctatt 180
ctgtgttggg gtgagttgat gaatctggcc acctgggtgg gaagtaattt ggaagacgga 240
tctaaagtgg gcggtaacta taactacctg taccgtctgt tccgtaaagg atccggtgaa 300
ttcggtggcg gtggcggacc agcatccagg gaattagtag tcagctatgt caatgttaat 360
atgggcctaa aaatcagaca actattgtgg tttcacattt cctgtcttac ttttggaaga 420
gaaactgttc ttgagtattt ggtgtctttt ggagtgtgga ttcgcactcc tcccgcttac 480
agaccaccaa atgcccctat cttatcaaca cttccggaaa ctactgttgt ttaa 534

Claims (2)

1.呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.17所示。
2.权利要求1所述的呈递SARS-COV-2的RBM不同区域肽表位的病毒样颗粒疫苗在制备SARS-COV-2病毒疫苗中的应用。
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