JP2009529334A - B型肝炎ワクチンの免疫応答を促進するタンパク質およびその遺伝子 - Google Patents
B型肝炎ワクチンの免疫応答を促進するタンパク質およびその遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ヒト肝臓cDNAライブラリーから、このタンパク質のcDNAをスクリーニングし、配列決定し、およびそれをこのcDNAでコードされるタンパク質の発現のために原核細胞あるいは真核(動物あるいは植物)細胞にクローン化し、得られたタンパク質を精製する。得られたタンパク質は、HBワクチンと共に用いる場合、ワクチンの効果を顕著に増強し、HBVキャリアの免疫力を高め、そして、抗体の力価を高める。このタンパク質はまた、HBワクチンのアジュバントとして用いられ得る。
【選択図】なし
Description
B型肝炎表面抗原結合タンパク質をコードするcDNAクローンは、ヒト肝臓cDNAファージ発現ライブラリーを、イムノブロッティングにより、ヒトプラズマから精製した完全B型肝炎表面抗原(プレS1、プレS2、およびSゾーンを含む)でスクリーニングすることによって得られた。遺伝子配列決定の結果により、1035bpの独立したオープンリーディングフレーム(ORF)が解明された(配列表の配列番号1)。このcDNAでは、344個のアミノ酸残基がコードされ、理論上の分子量は、38kuであった。等電点(PI)は、8.0であった。推定配列により、典型的な膜貫通領域が示唆され、およびイムノグロブリンスーパーファミリーへの分類が示唆された。ORFによりコードされるタンパク質の配列は、配列表の配列番号2に示される通りである。
タンパク質の発現および精製は、上述の遺伝子が、原核または真核発現ベクター中でクローン化された後になされた。全遺伝子は、pBV220原核発現ベクター中にクローン化された。大腸菌に組換えベクターをトランスフェクトした。ポジティブモノクローンを、液体培養培地中で培養した。タンパク質発現は、最初に37℃にて、次に42℃にて、5時間誘導した。タンパク質を、Ni−NTAアガロースアフィニティーカラムで精製された。精製されたタンパク質は、透析によって、リネイチャーされた。タンパク質とターゲットとの相互作用は、ELISAおよびウエスタンブロッティングにて確認された。
血液を最初の免疫の20日後に尾静脈から得た。血清中のB型肝炎表面抗原に対する抗体のレベルは、ELISAによって決定した。SPSSソフトウエアをグループの相違を分析する為に用いた。
Claims (5)
- 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、B型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質。
- 配列表の配列番号1に記載の配列である、B型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列。
- 請求項1記載のタンパク質をスクリーニングする方法であって、ヒト肝臓cDNA発現ライブラリーを、ウエスタンブロットにてHBsAgをプローブ分子として使用してスクリーニングすること、ポジティブcDNAクローンを得て、塩基配列を決定すること、その結果1035bpの独立したオープンリーディングフレームを有するcDNAを得ることを含む、方法。
- 請求項1記載のB型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質を発現する方法であって、該タンパク質のN末端上にある6×ヒスタグ領域およびエンテロキナーゼ開裂部位をクローンし、pBV220発現システム中にサブクローンし、大腸菌中でタンパク質を発現させ、大腸菌を集菌し、溶菌し、混合体を単離し、粗精製を行い、標的タンパク質を、最終的に、Ni−NTAアガロースゲルおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて集中的に精製し、最終的に透析を行ってタンパク質を得る工程を含む、方法。
- 請求項1記載の配列表の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質のHBワクチンのアジュバントとしての使用。
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