KR100308444B1

KR100308444B1 - 이종 t-세포 에피토우프를 사용하여 자가 단백질에 대해항체반응을유도하는방법

Info

Publication number: KR100308444B1
Application number: KR1019960701052A
Authority: KR
Inventors: 모리트센 소렌; 엘스너 헨리크
Original assignee: 헨릭 엘스너 ; 소덴 모리트센; 모리트센 앤드 엘스너 에이/에스
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 2001-11-30
Also published as: WO1995005849A1; EP0752886A1; CA2170236A1; ATE162723T1; ES2112559T3; DK0752886T3; EP0752886B1; DE69408342T2; DE69408342D1; GR3026419T3; US20020090379A1; JPH09505031A; DK96493D0; CA2170236C; KR960704568A; AU7608094A; JP3825041B2

Abstract

본 발명은 하나 이상의 이종 T 세포 에피토우프를 분자 생물학적 수단에 의해 자가 단백질에 삽입시켜서 이러한 단백질을 면역원성으로 만드는 것으로 이루어지는, 자가 단백질을 제거 및/또는 조절하기 위한 면역 장치를 이용하기 위한 방법에 관한 것이다. 조절된 단백질은 사람 또는 동물에게서 바람직하지 않은 단백질에 대한 자가 백신으로서 사용될 수 있으며, 상기 자가 백신은 많은 질환, 예를 들어 암, 만성 염증성 질환, 류머티스 관절염, 염증성 장질환, 알레르기성 증상 또는 당뇨병에 대한 백식으로서 유용하다.

Description

[발명의 명칭]

이종 T-세포 에피토우프를 사용하여 자가 단백질에 대해 항체 반응을 유도하는 방법

[발명의 분야]

본 발명은 인체에 존재하는 것이 바람직하지 않은 자가 단백질을 제거하고/하거나 감소시키기 위한 면역 장치를 사용하는 신규의 방법에 관한 것이다. 상기 단백질은 질병 및/또는 질병의 바람직하지 않은 증상 또는 징후의 원인이 되는 단백질이다. 이러한 단백질은 백신화에 의해 특이적으로 유도되는 자가 항체를 순환시킴으로써 제거된다. 본 발명은 이러한 자가 백신을 개발하기 위한 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

약리학적으로, 척추 동물 면역계는 미생물과 같은 감염체의 인체 공격에 대해 방어 메카니즘으로서 역할을 한다. 고특이성 순환 항체에 의해 세포막내조직계를 통해 이종 단백질이 제거되고, 항체, 세포독성 T 임파구, 천연 킬러 세포, 보체 등을 포함하는 일련의 세포와 체액 메카니즘의 착체에 의해 바이러스 및 박테리아는 공격을 받는다. 이러한 공격의 리이더는 T 헬퍼(T_H) 임파구이며, 이는 항원 제공 세포(Antigen Presenting Cells: APC)와 함께 세포질의 복합망을 통해 면역 방어를 조절한다.

T_H임파구는 APC의 표면에 존재하는 단백질 항원을 인식한다. 그러나, 이들 임파구는 천연 항원 자체는 인식하지 못한다. 대신에, 2가지 성분, 즉 "처리된"(단편화된) 단백질 항원(이른바, T 세포 에피토우프) 및 주요 조직 적합성 착제 제 Ⅱ류 분자(Major Histocompatibility Complex Class Ⅱ moleculars)로 이루어진 복합 리간드를 인식하는 것으로 보인다[참조; O. Werdelin et al., lmm. Rev. 106, 181(1988)]. 이러한 인식은 궁극적으로 T_H임파구가 특이적으로 B 임파구를 도와 온전한 단백질 항원에 대한 특이적 항원을 생성시킬 수 있게 한다. 주어진 T 세포는 특정 항원 MHC 조합을 인식할 뿐이며, 또 다른 MHC 대립 유전자의 유전자 생성물에 존재하는 동일하거나 다른 항원은 인식하지 못할 것이다. 이러한 현상은 MHC 제한으로 일컬어진다.

통상적으로, 인체의 고유 단백질(이른바 자가 단백질 또는 자기 단백질)은 면역 장치에 의해 공격받지 않는다. 이러한 현상은 일반적으로 인체에는 유익하지만, 매우 드물게는 과정이 불량해지고, 면역계가 인체 고유의 구성 요소를 공격하여, 자가 면역 질병을 유도할 수 있다.

그러나, 일부 자가 단백질의 존재는 고수준에서 질병 증상을 유도하는 경우에 부적당하다. 고수준의 lgE 부류 면역 글로불린은 예를 들어, 제 1 류 알레르기 유도에 중요한 것으로 공지되어 있으며, 종양 괴사 인자 α(TNF α)는 암환자 및 다른 만성 질환에 걸린 환자에게 악태증을 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조; H. N Langstein et al., Cancer Res. 51, 2302-2306, 1991]. THFα는 또한 염증 과정에서 중요한 역할을 한다 : [참조; W. P Arend et al. Arthritis Rheum. 33, 305-315, 1990]. 성호르몬 의존성 암에서 호르몬은 특정 경우에 원하지 않는 단백질의 다른 예이다. 따라서, 이러한 자가 단백질에 대한 자가 백신을 개발하기 위한 방법이 제공될 필요가 있다.

자가 단백질의 단편은 또한 APC에 의해 제공되지만, 정상적으로는 이러한 단편은 무시되거나 T 헬퍼 임파구에 인식되지 않는다. 그 주원인은 인체가 일반적으로 혈청에서 자가 항체를 잠복시키지 않기 때문이다.

그러나, 자가 단백질에 대한 항체를 유도하는 것은 인위적으로 가능하다. 이것은 상기 언급된 바와 같이, 예를 들어 파상풍 독소 또는 키이-홀림피트 헤모시아닌(key-hole limpet hemocyanin: KLH)으로서 적합한 큰 이종 운반 단백질에 대한 자가 단백질의 공유 콘쥬게이션에 의해 수행될 수 있다. 탈워(Talwar) 등의 문헌(G. P. Talwar et al., lnt. J lmmunopharmacol. 14, 511-514, 1992)에 의하면, 사람 융모성 성선자극호르몬(chorionic gonadotropin)과 파상풍 독소의 콘쥬게이트로 이루어진 백신을 사용하여 여성에게서의 재생을 예방할 수 있다. 또한, 이러한 자가 면역성 콘쥬게이트의 다른 예가 남성 및 동물 모델에게 치료적으로 사용된다[참조; D. R. Stanworth et al., Lancet 336, 1279-1281(1990)]. APC에서 이러한 콘쥬게이트 과정 동안, 필요한 T_H임파구 자극 에피토우프는 이종 단백질로부터 제공되어, 결국 운반 단백질에 대해서 뿐만 아니라 자가 단백질에 대해 항체의 유도를 초래한다. 그러나, 상기 원리를 사용하는 데에 있어서 하나의 단점은 자가 단백질에 대한 항체 반응이 공유 결합된 운반 단백질에 의한 에피토우프의 차폐로 인해 제한될 것이라는 점이다. 또 다른 단점은 이종 보유 단백질에 대한 바람지하지 않은 매우 강한 항체 반응의 상보적 유도로 인해 알레르기성 부작용을 유도하는 위험성이 증가한다는 점이다.

다른 연구자들은 T 세포 에피토우프인 것으로 예측되는 단일 펩티드를 헵탄으로서 작용하는 데가 펩티드인 자가-펩티드 [D-Lys⁶]에 화학적으로 콘쥬게이션시키고, 특별한 T 세포 에피토우프에 대한 MHC 제한으로 항체 반응을 유도하였다[참조; S. Sad et al., lmmunology 76, 599-603,1992]. 상기 방법은 큰 운반 단백질에 대한 콘쥬게이트와 비교하여 보다 효과적인 것으로 보인다. 그러나, 이것은 적합한 MHC 분자를 발현시키는 집단에서 항체를 유도할 뿐이다. 이는, 보다 많은 서로 다른 T 세포 에피토우프가 자가 펩티드에 콘주게이트되어 결과적으로 자가 펩티드의 표면상의 B 세포 에피토우프를 저해할 것이다. 다수의 단백질 콘쥬게이션은 면역원성에 대해 더욱 더 반대 작용을 할 수 있고(국제 특허 출원 제 WO 87/00056), 표면 노출된 펩티드 T 세포 에피토우프가 항원 처리 동안 단백질 분해 효소에 의해 파괴될 수 있어(S. Mouritsen, Scand. J. lmmunol. 30, 723, 1989), 상기 방법을 유용하지 않게 한다. 또한, 이러한 다중 콘쥬게이트된 자가 펩티드의 정확한 구조는 화학적으로나 약제학적으로 적절하게 규정되어 있지 않을 것이다.

최근에, 고분자량 덱스트란 분자에 대한 B 세포 및 임의적으로 또한 펩티드 T 세포 에피토우프의 화학적 콘쥬게이션에 의해 B 세포 자가 내성을 파괴시키기 위한 개선된 방법이 제안되었다(1933년 11월 25일에 공개된 WO 93/23076호). 그러나, 상기 언급된 단점이 또한 사실상 상기 방법에서도 여전히 남아 있다.

보편적으로 인식된 강한 T 세포 에피토우프는 제조합 DMA 기술을 사용하여, B-세포 에피토우프를 나타내는 항원구조를 갖는 이종 펩티드와 관련될 수 있는 것으로 제시되어 있다(EP-A2-0 343 460호). 또한, 면역원성 조성물, 예를 들어 백신의 제조에 헬퍼 T 세포(T_H임파구 )반응성 에피토우프 및 바람직하게는 B-세포 반응성 에피토우프를 혼입시키는 면역원성 또는 항원성 펩티드를 포함하는 펩티드 수지 콘쥬게이트를 사용하는 것이 제안되었다. 이들 콘쥬게이튼는 바람직하게는 폴리 아미드 수지 상에서 고체상 합성에 의해 제조된다(WO 90/15627). 당해의 펩티드에 대한 항체 반응을 증가시키는 것은 의도된 반면, 이것이 세포 단백질에 대한 면역계의 자가 내성을 파괴하고, 자가 단백질에 대한 항체 반응을 유도할 목적으로 수행될 수 있다는 것은 제안되어 있지 않다. 자가 항체의 유도를 위해 상기 방법을 사용하므로써, 하나의 프라이어리(priori)는 반응의 MHC 제한의 상기 언급된 한계에 대해 확신시키는 동일 규칙을 예상할 수 있다. 그러나, 놀랍게도, 면역 우세 T 세포 에피토우프를 함유하는 것으로 공지된 상응하는 펩티드에 의한 하나 이상의 펩티드 단편의 치환에 의해 자가 단백질 유사체를 생성시키며, 사실상 원래 자가 단백질의 전체 3차 구조를 생성시키도록 치환이 수행되는 본 발명의 방법에 의해 자가 단백질을 변형시키므로써, 사용되는 삽입된 T 세포 에피토우프가 면역된 마우스의 MHC 분자로 제한된다는 점에도 불구하고, TNFα에 대해 동등하게 빠르고 심지어 더 강한 자가 항체 반응을 유도할 있음이 입증되었다(실시예 3). 이러한 결과의 원인은 명백한 것은 아니지만, 자가 단백질에서 돌연변이된 부분에서 새로운 MHC 결합 세그멘트의 출현으로 인한 것일 수 있다. 그러나, 하기의 실시예 5에 기재된 실험은, 우비퀴틴(ubiquitin)에서의 삽입된 오발부민 T 세포 에피토우프의 중복 영역을 나타내는 합성 펩티드가 H-2^k미우스의 MHC 제 Ⅱ류 분자 중 어느 것에도 강하게 결합하지 않으며, 상기 재조합 분자가 고면역원성이기 때문에 상기 원인이 모든 경우에 행당되는 것은 아님을 입증한다.

단백질의 가능한 MHC 제 Ⅱ류 결합 세그멘트의 대부분은 통상적으로 은폐되어 있으며, 항원 제공 세포에 의해 숙주 T 세포에 제공되지 않을 것이다[참조; S. Mouritsen et al, Scand. J. Immunol. 34, 421, 1991]. 삽입된 T 세포 에피토우프의 MHC 제한과 항체 반응의 제한 간에 관찰된 결핍 상응성은 아마도 서로 다른 자가 단백질 세그멘트에 의한 MHC 분자로의 결합에 대한분자내 경쟁의 일반적인 저지로 인한 것일 것이다. 본 발명의 방법에 따라, 비내성화된 은폐되어 있는 자가 단백질 세그멘트는 T 세포에 제공되어, 단백질에 대해 T 세포 뿐만 아니라 B 세포 자가 내성 파괴를 유도할 수 있다. 하기에 기술되는 모든 실시예에서 예시된 본 발명에 따르면, 자가 단백질의 단편은 이종 T 세포 에피토우프로 교체될 수 있다. 이러한 결실에 이은 다른 단백질 단편에 의한 교체는 자가 단백질의 3차 구조를 최소로 불명료하게 하지만, 또한 MHC 제 Ⅱ 류 결합 세그멘트의 상기 분자내 경쟁 저지에 강하게 기여할 수 있다. 따라서, 이러한 개념은 상기 언급된 종래의 메카니즘 및 방법과는 명백이 다르다. 본 발명에 따르는 방법에 의한 작용의 조작 메카니즘과는 무관하게, 서로 다른 최소량의 이종 T 세포 에피토우프의 삽입에 의해 MHC 분자의 광범위한 집단에서 항체를 유도할 수 있기 때문에, B 세포 자가 내성을 파괴시키기 위한 공지된 방법과 비교하여 기술적으로 더욱 유용하다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 펩티드 단편의 결실 및 상응하는 수의 이종 T 세포 에피토우프의 동시 삽입에 의해 적절하게 조절되어 실질적으로 보존된 3차 구조를 갖는 자가 단백질 유사체를 생성시키는 제조합 자가 단백질 주입이 비변형 자가 단백질에 대해 현저한 자가 항체 반응을 유도한다는 놀라운 사실에 근거한다. 놀랍게도, 유도된 자가 항체 반응의 MHC 제한은 반드시 삽입된 T 세포 에피토우프로 제한되는 것은 아니다. 고도로 보존된 자가 단백질 우비퀴틴 뿐만 아니라 TNF α에서 최소 3차 구조 변동을 유도하므로써, 아미노산의 길이가 12 내지 15개인 이종 T 세포 에피토우프가 유전자 공학 방법을 사용하여 삽입된다. 상기 재조합 자가단백질 유사체는 정제되고, 보조제 중에서 에멀션화되어, 마우스에 삽입된다. 단지 1주 내에, 우비퀴틴에 대한 자가 항체 반응이 상기 마우스의 혈청에서 검출될 수 있다. 동일 방식으로 처리되고 삽입된 비변형 재조합 우비퀴틴은 상기 반응을 유도할 수 없다.

바람직하지 않은 단백질에 대한 백신을 개발하는데 상기 원리를 사용하므로써, 알레르기성 부작용을 유도하는 위험을 감소시키고, TNFα와 같은 독성 자가 단백질을 생물학적 활성 단백질 세그멘트의 제거 또는 돌연변이에 의해 동시에 해독할 수 있다. 상기 기술된 에프토우프 차폐 효과는 문제가 되지 않으며, 우비퀴틴에 대한 자가 항체는 자가 단백질을 운반 단백질 또는 펩티드와 콘쥬게이트시키는 공지 기술과 비교하여 훨씬 더 빠르게 유도된다. 중요하게는, 상기 방법에 의해, 인체의 T 세포의 자가 내성 뿐만 아니라 B 세포의 자가 내성을 일시적으로 파괴할 수 있는 것으로 보이며, 이러한 재조합 단백질은 많은 서로 다른 MHC 제 Ⅱ류 분자를 발현시키는 큰집단에서 자가 면역원성일 것이다.

본 발명에 따르는 백신은 상기 기술된 바와 같이 변형되고, 인산 칼슘, 사포닌, 퀴일(quil) A 또는 생분해성 중합체와 같은 적합한 보조제로 제형화된 하나 이상의 자가 단백질 유사체로 구성된다. 변형된 자가 단백질은 GM-CSF 또는 인터류킨 2와 같은 적합한 면역 활성 시토킨과의 융합 단백질로서 제조될 수 있다.

자가 백신은 악액질이 있는 환자, 예를 들어 암 환자의 치료를 위한 TNFα 또는 γ- 인터페론에 대한 백신, 또는 알레르기가 있는 환자의 치료를 위한 lgE에 대한 백신이 될 수 잇다. 더욱더, 상기 백신은 만성 염증 질환에 걸린 환자의 치료를 위한 TNFα, TNFβ 또는 인터류킨 1에 대한 백신이 될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에서 예시된다.

[실시예 1] 우비퀴틴으로의 이종 T 세포 에피토우프의 치환

예로서 T 세포 에피토우프 MP7을 사용하는 본 과정의 개요가 제 1도에 도시되어 있다. MP7을 나타내는 유전자 서열(MP7. 1-C 및 MP7.1-NC)을 적합한 제한 효소 클로닝 자리로 계획된 2개의 상보적 올리고누클레오티드로서 합성하였다. MP7의 아미노산 서열은 PELFEALQKLFKHAY이다[참조; Mouritsen et al., Scand. J. Immunol. 30, 723-730, 1989]. 올리고누클레오티드를 통상적인 자동 고체상 올리고누클레오티드 합성법을 사용하여 합성하고, 아가로오스 겔 전기 영동 및 저융점 아가로오스를 사용하여 정제하였다. 겔로부터 목적하는 밴드를 절단시켜 내고, 공지량의 올리고누클레오티드를 혼합하고, 1 내지 2 시간 동안 이의 이론적 융점보다 5℃ 낮은 온도(일반적으로 약 65℃)로 가열하고, 37℃로 서서히 냉각시켰다. 이 온도에서, 혼성된 올리고누클레오티드를 우비퀴틴 유전자 부분을 함유하는 벡터 단편에 결찰시켰다. 이후, 제한 단편 분석 및 DNA 서열화를 사용하여 포지티브 클론의 분석을 통상적인 방법으로 수행하였다[참조; "Molecular Cloning", Eds. : T. Maniatis et al., 2ed. CSH Laboratory Press, 1989].

[실시예 2] 변형된 우비퀴틴 유사체에 의한 백신화로 우비퀴틴에 대한 자가 항체 유도

이종 T 세포 에피토우프를 코딩하는 서열을 함유하는 유전자, 오발부민(OVA)으로부터의 OVA(325-336) 및 암탉 달걀 흰자위 리소자임(HEL)으로 부터의 HEL(50-61)을 각각 열민감성 λ억제제 조절 촉진제의 조절하에 대장균 균주, AR58에서 발현시켰다. 다클론성 항우비퀴틴 항체 및 웨스턴-블롯팅을 사용하여 재조합 우비퀴틴 단백질의 발현을 확인하였다[참조; "Antibodies", Eds.: D. Harlow et al., CSH Laboratory Press, 1988]. 제조합 단백질을 통상적인 방법에 의해 정제하였다[Maniatis et al., 상기 문헌 참조].

마우스에 프로인트 완전 보조제(Freund's Complete adjuvant)중에서 에멀션화된 인산염 완충 염수(PBS) 중의 100㎍의 우비퀴틴 또는 이의 유사체를 복강내 주입하였다. 프로인트 불완전 보조제 중에서 1 : 1로 에멀션화된 동일량의 항원을 14일 및 28일째에 복강내에 부스터 주입하였다. 5개의 Balb/c 마우스를 각각의 군에서 조사하고, 통상적인 ELISA 방법을 사용하여 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일 째에 항우비퀴틴 항체의 존재에 대해 혈액 샘플을 조사하였다.

T 세포 에피토우프 OVA(325-336) 및 HEL(50-61)을 각각 함유하는 2개의 서로다른 우비퀴틴 유사체에 대한 항체 반응에 의해 예증된 결과가 제 2 도에 도시되어 있다. 삽입된 OVA(325-336) 에피토우프의 아미노산 서열은 QAVHAAHAEINE이고, HEL(50-61) 에피토우프의 아미노산 서열은 STDYGILQINSR이다.

항원의 첫 번째 주입으로부터 단지 1주 내에 천연 우비퀴틴에 대한 명백한 항체 반응을 검출할 수 있었고, 반응은 2주 내에 최대에 도달하였다. 소 면역 글로불린에 우비퀴틴을 공유 콘쥬게이트시킴으로써 토끼에게서 형성된 항우비퀴틴 항체는 훨씬 더 오랜 면역 기간 후에 최대치에 도달하였다(미도시됨).

[실시예 3] 적합하게 변형된 TNF 유사체에 의한 백신화로 종양 괴사인자(TNF)에 대한 자가 항체 유도

천연 쥐과 동물 TNFα 단백질(MR101)의 구조 부분에 대해 코드화시킨 유전자를 DNA의 폴리머라이제 연쇄 반응(PCR) 클로닝에 의해 얻었다. MR103 TNFα 유사체에서, 오발부민(OVA) H-2^d제한 T 세포 에피토우프 서열 325-334(QAVHAAHAET)가 암피패틱(amphiphatic) α-헬릭스의 치환인 클로닝된 TNHα 서열에서 아미노산 서열 26-35를 치환시켰다. TNFα의 상기 영역에서의 치환은 재조합 단백질을 해독하게 하였다[참조; X. Van Ostade et al., Nature 361, 266-269, 1993]. MR105 TNFα유사체에서, 암탉 달걀 흰자위 리소자임(HEL)으로부터의 H-2^k제한 T 에피토우프, 즉 아미노산 서열 81-96(SALLSSDITASVNCAK)은 클로닝된 TNFα 서열에서 아미노산 5-20를 치환시켰다. MR106 TNFα돌연변이체에서, 동일한 에피토우프, 즉 아미노산 서열 81-95(SALLSSDITASVNCA)는 클로닝된 TNFα서열에서 아미노산 126-140를 치환시켰다. 유전자 구성은 제 3 도에 도시되어 있다. 실시예 1 에 기술된 기술과 비교하여 서로 다른 기술을 사용하여, TNFα유전자 부분을 T 세포 에피토우프에 대해 코딩한 DNA로 치환시켰다. MR105 및 106 구성은 T 세포 에피토우프를 도입시키기 위한 의도된 자리 옆에 위치하는 TNFα유전자의 일부를 재클로닝시키는 PCR에 의해 돌연변이 서열을 도입시킴으로써 이루어졌다. 돌연변이 올리고누클레오티드 프라이머는 TNFα DNA 서열과 유사한 DNA 서열 뿐만 아니라 T 세포 에피토우프를 코드딩하는 DNA 서열을 함유하였다. TNFα 유전자의 PCR 재클로닝 부분을 계속해서 적절한 제한 효소에 의해 절단시키고, MR103 유전자로 클로닝시켰다. MR103 구성은 "중복 연장에 의한 스플라이싱" PCR 기술의 변형에 의해 이루어진다.[참조; R. M. Horton et al., Gene 77, 61, 1989]. 여기에서 2개의 PCR 생성물이 생성되며, 각각 TNFα 유전자의 일부를 포함하며, 또한 각각의 PCR 유전자는 T 세포 에피토우프 서열의 절반을 함유하였다. 완전한 돌연변이 TNFα유전자를 계속해서 제 2 PCR 로 두개의 PCR 생성물을 결합시키므로써 형성하였다. 최종적으로, 완전한 유전적 구성물을 단백질 발현 벡터에 삽입시켰다. 이후, 모든 유전적 구성물을 제한 단편 분석 및 통상적인 방법을 사용하는 DNA 서열화에 의해 분석하였다[참조; "Molecular Cloning", Eds, ; T. Maniatis et al., 2. ed. CSH Laboratory Press, 1989]. 재조합 단백질을 대장균에서 발현시키고, 통상적인 단백질 정제법에 의해 정제하였다.

BALB/c(MHC 단순형(haplotype), H-2^d) 및 C3H(MHC 단순형, H-2^d)의 군을 각각, 프로인트 완전 보조제 중에서 에멀션화된 100㎍의 반정제 MR103 및 MR106으로 피하적으로 면역시켰다. 매 2주 마다 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 면역화를 반복하였다. 모든 마우스에게서 생물학적 활성 MR101에 대한 초기의 강한 항체 반응이 전개되었다. 이것은 피동적으로 흡착된 100% 순수 MR101을 사용하는 직접적 ELISA 법에 의해 측정 되었다. MR101 및 PBS로 면역시킨 대조군 마우스에서는 각각 MR101에 대한 항체 반응이 나타나지 않았다.

두드러지게는, MR101에 대한 항체 반응은 상이한 MHC 단순형의 두마리의 마우스 균주가 서로 다르게 제한된 T 세포 에피토우프를 함유하는 MR103 및 MR106에 잘 반응하므로, 삽입된 T 세포 에피토우프에 상응하여 MHC 제한되지 않았다(제 4 도). 함께 취한 상기 결과에서는, (a) 분비된 자가 단백질에 대한 자가 항체를 유도하기 위한 본 발명에 따르는 방법에 의해 생성된 자가 단백질 유사체의 능력 및 (b) 삽입된 T 세포 에피토우프의 MHC 결합 능력에 의해 예측되는 것보다 광범위한 MHC 집단에서 반응을 유도하는 것에 있어서 본원에 기술된 방법의 개선된 효율을 입증하고 있다. 재조합 자가 단백질 유사체 MR103 및 MR106에 의해 유도된 MR101에 대한 면역 반응은 알데히드 콘쥬게이트 MR101에 유도된 면역 반응 비교하여 훨씬 더 강하고, 역가가 더 높았다(실시예 4 참조).

[실시예 4] 대장균 단백질에 대해 콘쥬게이트된 비변형된 자가 단백질과 비교한 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 자가 단백질 유사체에 의한 TNFα에 대한 자가 항체의 유도

본 발명의 방법에 의한 TNFα에 대한 항체의 유도를 더 큰 이종 운반 단백질 뿐만 아니라 작은 단일 T 세포 에피토우프 펩티드를 함유해야 하는 TNFα 및 대장균 단백질의 콘쥬게이트를 사용하는 경우에 유도되는 자가 항체 반응과 직접 비교하였다.

반정제된 재조합 쥐과 동물 TNFα(MR101)을 0.5% 포름알데히드를 사용하여, PBS(pH 7.4) 중의 대장균에 콘쥬게이트시켰다. 단백질의 콘쥬게이션은 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 이 콘쥬게이트를 이후 C3H 마우스의 면역화에 사용하였다. C3H 마우스의 또 다른 군을 반정제된 비콘쥬게이트 자가 단백질 유사체 MR105로 백신화시켰다. 약 100㎍의 재조합 TNFα유사체 및 콘쥬게이트를 프로인트 완전 보조제 중에서 1 : 1로 에멀션화시키고, 각각의 마우스의 군에 피하적으로 주입하였다. MR105는 TNFα에 대한 L929 생물 검정에 의해 판단하여 생물학적으로 비활성이었다. 후속 면역화를 위해, 매 2주 마다 불완전 프로인트 보조제를 사용하였다. 2개의 군은 모두 ELISA에 의해 측정됨에 따라 결국에는 고정제된 생물학적 활성 MR101에 대한 자가 항체가 발생되지만, 본 발명의 방법에 의해 생성된 비콘쥬게이트 유사체 MR105에 대한 면역 반응이 더 먼저 유도되었고, 역가도 더 높았다(제 5 도).

[실시예 5] 자가 단백질, 및 우비퀴틴에 삽입된 오발부민 T 세포 에피토우프의 중복 서열을 나타내는 펩티드의 가능한 MHC 제 Ⅱ류 결합

¹²⁵I-표지 펩티드 (10-100 nM)를 실온에서 3시간 동안 친화성 정제된 MHC 제 Ⅱ류 분자 (2-10 μM)로 인큐베이팅시키므로써 펩티드-MHC 착체를 얻었다[참조; S. Mouritsen, J. Immunol. 148, 1438-1444, 1992]. E^k분자에 강하게 결합하는 Hb(64-76), 및 A^k분자에 강하게 결합하는 HEL(46-61)의 펩티드를 결합의 방사선 표지 마아커로서 사용하였다. 이들 착물을, 면역적으로 관련된 모든 MHC 제 Ⅱ 류 결합을 전적으로 억제시키기에 충분한 다량의 냉각된 (비방사성표지) 펩티드(> 550㎛)로 동시 인큐베이션시켰다. 동일한 펩티드를 사용하거나 3개의 서로 다른 중복 펩티드를 사용하였으며, 이들 펩티드는 측부 영역 뿐만 아니라 우비퀴틴으로 치환된 전체 OVA(325-336) T 세포 에피토우프를 나타내었다. 3개의 펩티드는 TITLEVEPSQAVHAA(U(12-26)), PSQAVHAAHAEINEKE (U(19-34)) 및 HAEINEKEGIPPDQQ(U(27-41)) 였다. 8 mM 시트레이트, 17 mM 포스페이트 및 0.05% NP-40을 함유하는 반응 완충액 (ph 5) 및 펩티드-MHC 제 Ⅱ류 착체를 G25 실칼럼(spun columns)을 사용하는 겔 여과에 의해 펩티드 없이 분리시켰다(중복하여). 배제된 "공극" 부피의 방사능 및 포함된 부피의 방사능 모두를 감마 분광법으로 측정하였다. 냉각된 펩티드를 첨가하므로써 결합의 최대 경쟁적 억제율(%)을 계산하였다. 결과가 표 1에 기재된다.

E^k및 A^k각각에 대한 방사선 표지 펩티드 Hb(64-76)Y 및 HEL(46-61)Y의 전체 결합 억제는 냉각 상태의 동일 펩티드를 사용하여서만 달성될 수 있음을 알 수 있다. 결합의 일부 억제가 상기 한계량의 냉각된 펩티드를 사용하여 U(12-26) 및 U(19-34)에 의해 나타난다고 하더라도, H-2^kMHC 제 Ⅱ류 분자에 대한 이들 펩티드의 친화성은 매우 낮은 것으로 여겨진다. 따라서, 이는 오발부민 T 세포 에피토우프를 함유하는 우비퀴틴의 H-2^k마우스 균주에서의 강한 면역성을 설명하기에는 충분하지 않은 것으로 보인다. 더욱이, 다른 자가 에피토우프 및 미리 비내성화된 자가 에피토우프가 상기 동물의 T 세포에 제공된다.

[실시예 6] 적합하게 변형된 TNFα유사체에 의한 백신화로 당뇨병 또는 염증성 질환 치료

TNFα에 대해 코딩하는 유전자를, 예를 들어 파상풍 독소 또는 인플루엔자 헤마글루티닌으로부터 유도된 T 세포 에피토우프에 대해 코딩하는데 적합한 유전자 세그멘트를 삽입하여 변형시켰다. 이러한 유전자를 예를 들어 대장균 또는 곤충 세포에 적합한 발현 벡터로 발현시켰다. 제조합 TNFα 단백질을 통상적인 방법을 사용하여 정제하였다[참조; "Molecular Cloning", Eds. : Maniatis et al. 2 ed. CHS Laboratory Press, 1989].

임의적으로, 이러한 재조합 단백질을 GMCSF 또는 인터류킨 2와 같은 면역 활성 시토킨에 커플링시킬 수 있다.

재조합 단백질을 적합한 보조제를 사용하여 제형화시켜, 항TNFα 백신으로서 병인에 있어서 TNFα 가 중요한 질환에 걸린 환자에게 투여할 수 있다. 따라서, 유도된 항TNFα 항체는 질환에 영향을 미칠 수 있다.

상기 질환의 일례로는 예를 들어 TNFα 가 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 류머티스 관절염과 같은 만성 염증 질환이 있다[참조; F. M. Brennan et al., Br. J. Rheumatol. 31, 293-298, 1992]. TNFα는 또한 암, 및 AIDS와 같은 만성 감염 질환에서 보여지는 악액질 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다[참조; M. Odeh. J. Intern. Med. 228, 549-556, 1990]. 또한, 패혈증성 쇼크에 TNF가 관여하는 것으로 공지되어 있다[참조; B. P. Giroir, Crit Care. Med., 21, 780-789, 1993]. 더욱더, TNFα 가 제 Ⅱ형 당뇨병의 발병에서 병인적 역할을 할 수 있는 것으로 나타났다[참조; CHLang et al., Endocrinology 130, 43-52, 1992].

[도면에 대한 설명]

제1도는 이식된 이종 T 세포 에피토우프 (MP7)를 사용하는 우비퀴틴 유전자의 구성에 사용된 클로닝 방법의 개략도이다. 제한 효소 분해, 혼성화 및 결찰 과정이 화살표로 표시된다. 단편 크기는 괄호에 표시되어 있다.

제2도는 우비퀴틴와 이식된 T 세포 에피토우프 OVA(325-336) 및 HEL(50-61)를 각각 함유하는 유사체로 면역시킨 마우스로부터의 혈청에서의 부동화된 소과 동물 우비퀴틴에 대한 반응성을 나타내는 도면이다. 제 2a도는 OVA(323-339)를 함유하는 재조합 오비퀴틴으로 면역시킨 Balb/c 마우스로부터의 혈청을 나타내는 도면이다. 제 2b도는 HEL(50-61)을 함유하는 재조합 우비퀴틴으로 면역시킨 Balb/c 마우스로부터의 혈청을 나타내는 도면이다. 제2c도는 재조합 비변형 우비퀴틴으로 면역시킨 Balb/c 마우스로부터의 혈청을 나타내는 도면이다. 혈청 (1 : 100으로 희석됨)을 고체상으로 부동화된 비변형 소 우비퀴틴을 사용하여 표준 ELISA 검정하여 시험하였다.

제3도는 재조합 TNFα 돌연변이의 구성에 사용되는 클로닝 방법의 개략도이다. PCR 생성물 및 제한 효소 분해가 제시된다.

제4도는 반정제된 MR103 및 MR106에 의한 Balb/c 또는 C3H 마우스의 백신화에 의한 TNFα 자가 항체의 유도에 대한 도면이다. 항체 역가는 ELISA에 의해 측정되며, 한 마리의 마우스로부터의 강한 표준 항혈청에 관한 임의의 단위(AU)로서 표현된다. 플롯팅된 값는 5 마리의 동물에 대한 평균값을 나타낸다. 프로인트 완전 보조제를 제 1 면역화에 대한 보조제로서 사용하였다. 모두 프로인트의 불완전한 보조제를 사용하여 14일 간격의 연속적으로 면역화를 수행하였다. PBS 중에서 천연 MR101과 병행하여 면역된 마우스에 검출가능한 TNFα 자가 항체가 형성되지 않았다(미도시됨). 비검출성 항체 역가는 역가 1로 지정된다.

제5도는 비콘쥬게이트된 MR105 및 대장균 단백질에 콘쥬게이트된 MR101 각각에 의한 백신화에 의해 유도된 항TNFα 가자 항체에 대한 도면이다. CHS 마우스 및 Balb/c 마우스를 2개의 제제에 의해 면역시켰다. 면역화, 평균 항체 역가의 측정 및 계산은 실시예 4에서 기술한 바와 같이 수행하였다.

Claims

숙주에 대해 변형된 자가 단백질을 투여하므로써 비변형 자가 단백질에 대한 항체 반응을 유도하기 위해 시험관내 자가 단백질을 변형시키는 방법에 있어서, 면역 우세 T 세포 에피토우프를 함유하는 것으로 알려져 있는 상응하는 수의 펩티드로 자가 단백질의 하나 이상의 펩티드 단편을 치환시키므로써 분자 생물학적 수단에 의해 자가 단백질 유사체를 제공하고, 필수적으로 원래 자가 단백질의 전체 3차 구조가 보존되도록 치환이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 면역 우세 이종 T 세포 에피토우프가 삽입되어 T 세포 에피토우프의 양 측부 모두에서 원래 자가 단백질로부터의 측부 영역을 보존함을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 2항에 있어서, 면역 우세 T 세포 에피토우프가 파상풍 독소 및 디프테리아 독소로부터 기원함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 따른 변형된 자가 단백질 유사체로 구성되고, 인산 칼슘, 사포닌, 퀴일 A 및 생분해성 중합체와 같은 약제학적으로 허용되는 보조제에 의해 제형화됨을 특징으로 하는, 사람 또는 동물의 바람직하지 않은 자가 단백질에 대한 자가 백신.
제4항에 있어서, 자가 단백질 유사체가 GM-CSF 또는 인터류킨 2와 같은 적합한 면역 활성 시토킨과의 융합 단백질의 형태로 존재함을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항에 있어서, 암 환자와 같은 악액질에 걸린 환자를 치료하기 위한, TNFα또는 γ-인터페론에 대한 백신임을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항에 있어서, 알레르기성 질환에 걸린 환자를 치료하기 위한, lgE에 대한 백신임을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항에 있어서, 만성 염증성 질환에 걸린 환자를 치료하기 위한, TNFα, TNFβ및 인터류킨 1에 대한 백신임을 특징으로 하는 자가 백신.
제8항에 있어서, 류머티스성 관절염 또는 염증성 장질환에 걸린 환자를 치료하기 위한 백신임을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항 또는 5항에 있어서, 당뇨병을 치료하기 위한, TNFα에 대한 백신임을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항에 있어서, 삽입된 면역 우세 T 세포 에피토우프가 원래 자가 단백질로부터의 보존된 측부 영역에 의해 폐쇄됨을 특징으로 하는 자가 백신.
제4항 또는 제11항에 있어서, 면역 우세 T 세포 에피토우프가 파상풍 독소 및 디프테리아 독소로부터 기원함을 특징으로 하는 자가 백신.