CN105950565A - 高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述方法包括构建所述质粒载体，然后将质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译，接着分离纯化得到假病毒颗粒。通过本发明的方法可以制备内含能用于作为检测靶标的诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒，其具有无传染性、拷贝数高、稳定性好等优点。

Description

高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内含有诺如病毒核酸片段的高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
背景技术
诺如病毒(Norovirus，NoV)发现于1972年，属于杯状病毒科、诺如病毒属，被世界卫生组织划定为B类病原体，是导致不同年龄阶段人群急性病毒性腹泻的最主要病原之一。诺如病毒在环境中稳定存在，只需要很小的感染剂量即可致病，可以通过污染的水源、食物、空气等传播，因此常常引起严重的公共卫生问题和食品安全问题。根据诺如病毒依赖于RNA的RNA聚合酶和衣壳蛋白编码基因序列的相似度，将诺如病毒分为GI、GII、GIII、GIV、GV共5个基因组。
RT-PCR方法与real-time RT-PCR方法由于具有灵敏度高、重复性好、检测过程快捷等优点，目前成为诺如病毒检测的“金标准”方法。但是，由于诺如病毒目前不能进行体外细胞培养，real-timeRT-PCR等分子生物学方法均没有统一的标准样品作为阳性对照，无法开展病毒提取过程与检测结果的评价。
综合国内外的参考文献、我国行业标准、国际标准，大多建议使用阳性腹泻样本作为阳性标准样品，但腹泻样本作为阳性标准样品有以下两个重大缺点：(1)病毒含量不均一，不同患者的腹泻样本中的病毒浓度可能相差数十倍、数百倍，不能用于检测方法灵敏度评价、不同实验室检测结果比对等重要环节；(2)存在严重的生物安全隐患，以活病毒为阳性对照，存在操作人员感染继而引发大范围传染的可能。
因此，急需研发一种稳定性好、与病毒高度相似、无生物安全隐患、适用于国际检测标准的标准品。
现有技术文献
耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达.李金明，宋如俊，王露楠，邓巍.中华检验医学杂志，2003年2月第26卷第2期，86-88页
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体的衣壳蛋白而构建获得，且其中包含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒例如GII型诺如病毒的靶标。
所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。优选地，所述核酸片段是与序列表中SEQID No.2的DNA序列相对应的RNA。
优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体中含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述整体DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
本发明还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
本发明还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。
优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
本发明所提供的假病毒颗粒，由于其中包含诺如病毒的核酸片段，该核酸片段能用作检测诺如病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能作为诺如病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。该核酸片段可以是例如国际标准ISO/T15216-22012所涉及到的GII型诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为国际标准ISO/T15216-2 2012方法的标准阳性样品，与ISO/T15216-2 2012配套使用，解决了现有技术中存在的“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约诺如病毒检测发展的瓶颈问题。
此外，与属于I型的MS2噬菌体相比，属于III型的Qbeta噬菌体的衣壳蛋白的稳定性更高，因此，基于Qbeta噬菌体衣壳蛋白构建的盔甲RNA具有更高的稳定性，更能适用于标准品的制备、运输、储存与使用。
本发明所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、KpnI、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备其它检测RNA病毒核酸时的标准阳性样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。
利用本发明所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒。
附图说明
图1是具体实施方式中QINVGII片段组成的示意图。
图2是具体实施方式中质粒载体pET-QINVGII的图谱示意图。
图3是PCR扩增的QINVGII片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是质粒载体pET-QINVGII的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QINVGII为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。
图6是质粒载体pET-QINVGII在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QINVGII、但未进行诱导表达的重组大肠杆菌BL21对照，泳道3和4是转化有质粒载体pET-QINVGII并进行了诱导表达的重组大肠杆菌BL21实验组。
图7是示出在15000倍电镜下观察到的假病毒颗粒的图。
图8是示出对实施例2的假病毒颗粒中的诺如病毒核酸片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
图9是示出37℃条件下假病毒颗粒稳定性检测结果的图。
图10是示出4℃条件下假病毒颗粒稳定性检测结果的图。
图11是示出-20℃条件下假病毒颗粒稳定性检测结果的图。
具体实施方式
以下结合实施例以及附图对本发明的一个具体实施方式进行详细的说明。
实施例1：构建质粒载体pET-QINVGII
首先，参考Genbank数据库中的Qbeta噬菌体基因组序列(登录号为AB971354)以及ISO/T15216-2 2012所规定的GII型诺如病毒检测靶标序列，通过例如人工合成的方式制备包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、GII型诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性多克隆位点在内的DNA片段(下文称为QINVGII片段)(见图1)，该DNA片段的具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
辅助多克隆位点从5'端到3'端包括例如Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I等。将上述核酸片段亚克隆到pUC-18载体中，得到中间质粒载体，命名为pUC-QINVGII。
接下来，以中间质粒载体pUC-QINVGII为模板进行PCR扩增来获取QINVGII片段。根据QINVGII片段5'端的成熟酶编码基因上游的非编码序列及3'端的多克隆位点序列设计引物对P1与P2(见表1)，为了便于与原核表达载体pET-28a(+)进行同源克隆，在引物P1的5'端添加了pET-28a(+)载体上BamH I上游25bp的同源序列，在引物P2的5'端添加了pET-28a(+)载体上Xho I下游25bp的同源序列。
PCR反应体系如表2所示。扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应30次，循环条件为94℃1min，52℃1min，72℃3min；72℃延伸5min。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，结果显示扩增产物大小约为2500bp，与目标产物QINVGII片段的预期大小2504bp一致(见图3)。回收并纯化扩增所获取的QINVGII片段，用于后续的载体构建。
表1
引物 序列
P1 5’-gactggtggacagcaaatgggtcgcGGATCCGGGGACCCCCTTTAG-3’
P2 5’-gtggtggtggtggtggtgctcgagtGCGGCCGCTCTAGAGCATGC-3’
表2
反应体系的组成 用量
模板pUC-QINVGII 0.5μL
引物P1(10μm/L) 1.0μL
引物P2(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
线性化处理原核表达载体，本实施例以pET-28a(+)载体为例，用限制性内切酶BamH I与Xho I双酶切pET-28a(+)载体，回收并纯化酶切处理后得到的线性化pET-28a(+)载体，然后通过重组酶(例如南京诺唯赞生物科技有限公司生产的II OneStep Cloning Kit)将上述获得的QINVGII片段同源克隆至线性化的pET-28a(+)载体，反应体系如表3所示。在37℃下反应30min后，将产物在冰水浴中放置5min，随后用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。经过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒构建正确，得到用于制备假病毒颗粒的质粒载体，命名为pET-QINVGII。质粒载体pET-QINVGII的图谱示意图如图2所示，酶切鉴定结果如图4所示。
表3
由于pET-28a(+)载体中原有的多克隆位点(MCS)中含有Qbeta噬菌体克隆片段中的固有的多个酶切位点，不利于后期的基因操作。上述构建的质粒载体pET-QINVGII，切除了pET-28a(+)载体中原有的MCS，而替换成了从5'端到3'端依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点(aMCS)，从而可以十分方便地在该aMCS中插入其他核酸片段对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准阳性样品。而且，该aMCS对应的限制性内切酶市场价格十分便宜，可极大地降低质粒载体的构建成本。
实施例2：假病毒颗粒的制备
将实施例1制备得到的质粒载体pET-QINVGII转化入例如大肠杆菌BL21感受态细胞中，然后涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的营养琼脂平板上，37℃培养18h。营养琼脂平板的具体制备方法如下：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，琼脂粉1.5g，溶于90mL ddH2O中，调节pH值至7.0～7.2，然后补加ddH2O并定容至100mL，高压灭菌后备用。
然后，从上述培养后的平板上挑取菌落单斑，并接种于3mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养18h。液体LB培养基的具体制备方法为：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O并定容至100mL，高压灭菌后备用。
按1:100的比例将上述培养的菌液接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，在37℃培养至培养物的OD600达到0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度达0.2mmol/L～1.0mmol/L进行诱导表达，37℃振荡培养4h～16h之后，5000rpm离心10min，收集菌体。设置大肠杆菌BL21以及转化有质粒pET-28a(+)载体的大肠杆菌BL21作为对照，在同样的条件下进行培养和诱导表达。
在上述收集到的菌体中加入适量无菌ddH2O，涡旋混匀，按4：1的比例加入上样缓冲液(配制方法如下：SDS 0.5g，溴酚兰25mg，甘油2.5mL，用pH6.8的1.0mol/L Tris-HCl定容至5mL，分装成10管，每管500μL，室温保存，使用前每管加25μLβ-巯基乙醇)并混匀，沸水浴10min，然后在5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果如图6所示，重组菌试验孔在14.4kD附近出现明显的条带，与目的产物的预期大小14.6kD一致，对照孔相应位置未见该大小的条带，表明目的DNA片段在大肠杆菌中成功表达。。
按照前述培养和诱导表达的方法，用例如200mL液体LB培养基扩大培养转化有pET-QINVGII的重组菌，然后收集菌体并用PBS溶液洗涤菌体三次，反复冻融8次之后，加入10mL超声处理缓冲液，涡旋混匀。菌体经超声波破碎后，12000rpm离心10min，取上清，分别加入10U/μL的DNase I 5.0μL和10mg/mL的RNase 10μL并在37℃下消化12h。超声处理缓冲液的制备方法如下：8.02gNaCl，0.201g KCl，3.87g Na2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，用ddH2O 950mL溶解，加10mL Triton-X-100，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
接下来，先后用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上述消化后的液体。然后按1g滤液加0.6g CsCl的比例，将CsCl加入到滤液中，充分涡旋混匀，再用超高速冷冻离心机，4℃、85000rpm离心4h。通过例如注射器从离心后的液体中吸取出含有目的条带的那部分液体。
将含有上述目的条带的液体置于透析袋中，然后将透析袋浸没于PBS溶液中透析12h左右。将透析之后透析袋内的液体作为假病毒颗粒原液，分装到无RNase和DNase的EP管中，放置于-80℃保存备用。PBS溶液的配制方法为：8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87gNa2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，加ddH2O 950mL，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
将上述假病毒颗粒原液用2％磷钨酸进行负染，然后在透射电镜下观察假病毒颗粒。可以观察到大量排列紧密、大小形态一致的病毒样颗粒，如图7所示。
由于上述假病毒颗粒内含有的核酸片段是国际标准ISO/T15216-2 2012所涉及到的GII型诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为国际标准ISO/T15216-2 2012方法的标准阳性样品，与ISO/T15216-2 2012配套使用，解决了现有技术中存在的“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约诺如病毒检测发展的瓶颈问题。
实施例3：假病毒颗粒中残留质粒DNA的检测
用PCR扩增法检测实施例2制备的假病毒颗粒中是否含有残留的质粒pET-QINVGII的核酸，设计上游引物PpqinvF和下游引物PpqinvR，序列如表4所示，该对引物可扩增质粒pET-QINVGII含有的GII型诺如病毒靶标cDNA片段上下游共150bp的目标区域。以质粒载体pET-QINVGII为模板设置阳性对照，以ddH2O为模板设置阴性对照。反应体系如表5所示。
表4
引物 序列
PpqinvF 5’-GACAGCATAAGCTTTTTCC-3’
PpqinvR 5’-GCGGCCGCTCTAGAGCAC-3’
表5
反应体系的组成 用量
模板(假病毒颗粒原液) 1.0μL
PpqinvF(10μm/L) 1.0μL
PpqinvR(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应35次，条件为95℃1min，50℃40sec，72℃40sec；72℃延伸5min。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图5所示，以pET-QINVGII为模板的阳性对照孔出现大小为150bp的目的条带，以纯化的假病毒颗粒为模板的实验孔的相应位置未见该大小的条带，说明制备的假病毒颗粒原液中无质粒DNA残留，可用于实时荧光RT-PCR分析。
实施例4：假病毒的定值
提取纯化质粒载体pET-QINVGII，通过核酸测定仪确定其浓度与纯度，利用拷贝数计算公式Nc＝(6.02×1023×Cp×10-9)/(Ln×660)计算pET-QINVGII的拷贝数，其中Nc为拷贝数，单位为copies/μL；Cp为质粒pET-QINVGII的浓度，单位为ng/μL；Ln为质粒pET-QINVGII的碱基对数，单位为bp。通过计算得到此次提取pET-QINVGII的拷贝数，并连续做10倍梯度稀释，制备系列稀释液，以此作为假病毒定值的标准参考。
提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzol Reagent来进行RNA提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液置于无RNase和DNase的EP管中，加1mL Trizol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g、4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNase和DNase的EP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g、4℃离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g、4℃离心5min，弃上清；12000×g、4℃离心1min，小心除去EP管中的残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥，加20μL RNase-freeH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
以上述提取的RNA为模板，利用引物对QNIF2/COG2R以及Taqman探针QNIF3(具体序列见表6)进行实时荧光RT-PCR检测。用例如Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Takara公司，货号为RR064A)配制实时荧光RT-PCR反应体系，如表7所示；同时设置10倍梯度稀释质粒为模板来作为绝对定量参考标准。反应条件为：42℃5min；95℃10sec；循环反应40次，条件为95℃5sec，60℃20sec；在60℃20sec后收集荧光信号，结果如图8所示。
表6
引物/探针 序列
QNIF2 5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’
COG2R 5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’
QNIF3 5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA3’
表7
反应体系的组成 用量
RNA 2.0μL
2×one step RT-PCR BufferⅢ 10.0μL
Takara Ex Taq HS(5U/μL) 0.4μL
QNIF2/COG2R(10μM) 各0.3μL
QNIF3(10μM) 0.4μL
RNase-Free H2O 6.6μL
所得扩增曲线方程为：y＝-3.3443x+42.339，R2＝0.9982，扩增效率E＝99.1％；通过计算与统计分析，制备的假病毒颗粒原液定值为(4±0.2)×1011copies/μL。
一般检测用标准样品的拷贝数多在102～105copies/μL之间，因此上述假病毒颗粒仅需少量制备，通过稀释即可制备大量标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
实施例5：假病毒稳定性试验
将按照实施例2的方法制备的假病毒原液用无RNase H2O稀释成浓度为1.0×108copies/μL的储液，分装至无DNase和无RNase的EP管中，每管中分装100μL。
将装有储液的若干EP管分别在37℃、4℃、-20℃条件下保存，定时取出，按照实施例4的方法测定拷贝数，分析储液中假病毒在不同温度下的稳定性。
鉴于现有技术中已公开了基于I型的MS2噬菌体衣壳蛋白构建假病毒颗粒，本实施例同时参照现有技术的方法，制备了基于MS2噬菌体衣壳蛋白且包含与实施例2相同的诺如病毒核酸片段的假病毒颗粒作为对照。将制备的基于MS2噬菌体衣壳蛋白的假病毒定值并稀释成浓度为1.0×108copies/μL的储液。
比较Qbeta与MS2两种假病毒颗粒的稳定性。两种假病毒颗粒储液在37℃、4℃、-20℃条件下的拷贝数变化分别如图9、10、11所示，在-20℃保存条件下，Qbeta假病毒颗粒放置360天的拷贝数下降约为8.3％，MS2假病毒颗粒拷贝数的下降程度高达17％(见图11)；在4℃保存条件下，Qbeta假病毒颗粒放置60天的拷贝数下降约为6.7％，而MS2假病毒颗粒拷贝数的下降程度达到17.7％(见图10)；在37℃高温挑战实验中，Qbeta假病毒颗粒放置30天的拷贝数下降约为3％，MS2假病毒颗粒拷贝数的下降程度为10.4％(见图9)。
因此，无论是在低温还是高温环境下，基于Qbeta噬菌体衣壳蛋白而制备的假病毒颗粒的稳定性都要优于基于MS2噬菌体衣壳蛋白而制备的假病毒颗粒，使得可以满足批量制备、运输、保存的要求。
以上通过实施例对本发明一个具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。例如，除了上述具体实施方式中提到的国际标准ISO/T15216-2 2012中规定的诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段，本发明的假病毒颗粒中含有的核酸片段还可以是其他的可用作诺如病毒检测靶标的核酸片段。此外，除了上述提到的人工合成方式，QINVGII片段还可以通过聚合酶链式扩增反应等方式来获得。另外，除了pET-28a(+)，其他的原核表达载体也可以用来进行本发明所述QINVGII片段的转录和/或翻译表达。

Claims (15)

1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有诺如病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测诺如病毒的靶标。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.2的DNA序列相对应的RNA。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，
其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
5.根据权利要求4所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
6.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
8.根据权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
9.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
10.一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(1)制备包括Qbet a噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；
(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；
(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；
(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；
(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。
12.根据权利要求10或11所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
13.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。
14.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
15.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921733A (zh) * 2010-01-05 2010-12-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途
CN102559616A (zh) * 2012-02-24 2012-07-11 河南科技大学 一种含诺如病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN102559731A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国检验检疫科学研究院 一种假病毒载体及其制备方法和应用
CN103789277A (zh) * 2014-01-16 2014-05-14 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104560896A (zh) * 2013-11-15 2015-04-29 闽南师范大学 一种在大肠杆菌中表达ms2假病毒颗粒的方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921733A (zh) * 2010-01-05 2010-12-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途
CN102559731A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国检验检疫科学研究院 一种假病毒载体及其制备方法和应用
CN102559616A (zh) * 2012-02-24 2012-07-11 河南科技大学 一种含诺如病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104560896A (zh) * 2013-11-15 2015-04-29 闽南师范大学 一种在大肠杆菌中表达ms2假病毒颗粒的方法
CN103789277A (zh) * 2014-01-16 2014-05-14 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INDULIS CIELENS ET AL.,: "Mutilation of RNA phage Qbeta virus-like particles from icosahedrons to rods", 《FEBS LETTERS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法

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