CN106011078A - 内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。所述方法包括构建含有编码Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA的质粒载体，然后将所述质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达，接着分离纯化得到所述假病毒颗粒。所述假病毒颗粒能作为轮状病毒检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。通过本发明的方法可以制备具有无传染性、浓度高、稳定性好的假病毒颗粒。

Description

内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
背景技术
人轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科，1973年由澳大利亚学者发现，按照内层衣壳蛋白VP6的组特异性抗原表位不同，可将RV分为A～G共7个群，仅有A、B、C三个群感染人，其中A群RV是引起全世界婴幼儿严重胃肠炎的主要病原。
RV广泛存在于自然界，传染性强，病人和隐性携带者均为传染源。病毒随粪便排出体外，一般经粪-口途径传播，也可通过飞沫经由呼吸道传播，常常引起严重的公共卫生问题与食品安全问题。
RV的检测是临床诊断、口岸检疫、食品卫生检验等领域的关键技术。近年来随着分子生物学的快速发展，实时荧光RT-PCR技术由于其高灵敏性、高时效性、高通量性等优点而成为RV检测的重要方法，尤其是对于污染病毒含量低但潜在传播重要性大的食品检测领域应用更为广泛。
标准阳性样品是检测技术的重要基石，是评价检测结果的重要依据。RV的实时荧光RT-PCR方法没有统一的标准阳性样品作为对照，无法对病毒提取过程与检测结果进行评价。
综合国内外的参考文献，大多建议使用阳性腹泻样本作为阳性标准样品，但腹泻样本作为阳性标准样品有以下两个重大缺点：(1)病毒含量不均一，不同患者的腹泻样本中的病毒浓度可能相差数十倍、数百倍，不能用于检测方法灵敏度评价、不同实验室检测结果比对等重要环节；(2)存在严重的生物安全隐患，以活病毒为阳性对照，存在操作人员感染继而引发大范围传染的可能。
因此，急需研发一种稳定性好、与病毒高度相似、无生物安全隐患、适用于国际检测标准的标准阳性样品。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体构建而得，并包含轮状病毒的核酸片段，该核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。
所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。优选地，所述核酸片段是与序列表中SEQID No.1的DNA序列相对应的RNA。
优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体中含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述整体DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。所述大肠杆菌优选是大肠杆菌BL21。
本发明还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
本发明还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。
优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
本发明所提供的假病毒颗粒，由于其中包含轮状病毒的核酸片段，该核酸片段能用作检测轮状病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能作为轮状病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。该核酸片段可以是例如我国出入境检验检疫行业标准《SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为该标准的配套标准阳性样品使用，解决了现有技术中存在的“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约轮状病毒检测发展的瓶颈问题。
本发明所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、KpnI、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。
利用本发明所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒。
附图说明
图1是具体实施方式中QSNRV片段组成的示意图。
图2是具体实施方式中质粒载体pET-QSNRV的图谱示意图。
图3是PCR扩增的QSNRV片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是质粒载体pET-QSNRV的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QSNRV为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。
图6是质粒载体pET-QSNRV在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QSNRV、但未进行诱导表达的重组大肠杆菌BL21对照，泳道3和4是转化有质粒载体pET-QSNRV并进行了诱导表达的重组大肠杆菌BL21实验组。
图7是示出在15000倍电镜下观察到的假病毒颗粒的图。
图8是示出对假病毒颗粒中的轮状病毒核酸片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例以及附图对本发明的一个具体实施方式进行详细的说明。
实施例1：构建质粒载体pET-QSNRV
首先，参考Genbank数据库中的Qbeta噬菌体基因组序列(登录号为AB971354)以及我国出入境检验检疫行业标准《SNT2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列，通过例如人工合成的方式制备包括Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、RV核酸片段对应的cDNA序列及辅助多克隆位点在内的DNA片段(下文称为QSNRV片段)(见图1)，该DNA片段具有序列表中SEQ ID No.Y所示的序列。辅助多克隆位点从5'端到3'端包括例如Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I等。将上述DNA片段亚克隆到pUC-18载体中，得到中间质粒载体，命名为pUC-QSNRV。
接下来，以中间质粒载体pUC-QSNRV为模板进行PCR扩增来获取QSNRV片段。根据QSNRV片段5'端的成熟酶编码基因上游非编码序列及3'端的多克隆位点序列设计引物对PRVPF与PRVPR(见表1)，为了便于与原核表达载体pET-28a(+)进行同源克隆，在引物PRVPF5'端添加了pET-28a(+)载体BamH I酶切位点上游同源序列，在引物PRVPR 5'端添加了pET-28a(+)载体Xho I酶切位点下游同源序列。
表1
引物 序列
PRVPF 5’-ctggtggacagcaaatgggtcgcGGATCCGGGGACCCCCTTT-3’
PRVPR 5’-ggtggtggtggtggtgctcgagtGCGGCCGCTCTAGAGC-3’
反应体系如表2所示。扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应30次，循环条件为94℃1min，52℃1min，72℃3min；72℃延伸5min。
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，结果显示扩增产物大小约为2500bp，与目标产物QSNRV片段的预期大小2504bp一致(见图3)。回收并纯化扩增所获取的QSNRV片段，用于后续的载体构建。
表2
反应体系的组成 用量
模板pUC-QSNRV 0.5μL
PRVPF(10μm/L) 1.0μL
PRVPR(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
线性化处理原核表达载体，本实施例以pET-28a(+)载体为例。用限制性内切酶BamH I与Xho I双酶切pET-28a(+)载体，回收并纯化酶切处理后得到的线性化pET-28a(+)载体，然后通过重组酶(例如南京诺唯赞生物科技有限公司生产的II OneStep Cloning Kit)将上述获得的QSNRV片段同源克隆至线性化的pET-28a(+)载体，反应体系如表3所示。在37℃下反应30min后，将产物放置于冰水浴5min，随后用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。经过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒构建正确，从而得到用于制备假病毒颗粒的质粒载体，命名为pET-QSNRV。
pET-QSNRV的图谱示意图见图2，酶切鉴定结果如图4所示。
表3
由于pET-28a(+)载体中原有的多克隆位点(MCS)中含有Qbeta噬菌体克隆片段中的固有的多个酶切位点，不利于后期的基因操作。上述构建的质粒载体pET-QSNRV，切除了pET-28a(+)载体中原有的MCS，而替换成了从5'端到3'端依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点(aMCS)，从而可以十分方便地在aMCS中插入其他RNA片段对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，该aMCS对应的限制性内切酶市场价格十分便宜，可极大地降低质粒载体的构建成本。
实施例2：假病毒颗粒的制备
将实施例1制备得到的质粒载体pET-QSNRV转化入例如大肠杆菌BL21感受态细胞中，然后涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的营养琼脂平板上，37℃培养18h。营养琼脂平板的具体制备方法如下：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，琼脂粉1.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O定容至100mL，高压灭菌后备用。
然后，从上述培养后的平板上挑取菌落单斑，并接种于3mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养18h。液体LB培养基的具体制备方法为：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O定容至100mL，高压灭菌后备用。
按1:100的比例将上述培养的菌液接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，在37℃培养至培养物的OD600达到0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度达0.2mmol/L～1.0mmol/L进行诱导表达，37℃振荡培养4h～16h之后，5000rpm离心10min，收集菌体。设置大肠杆菌BL21以及转化有pET-28a(+)载体的大肠杆菌BL21作为对照，同样的条件下进行培养和诱导表达。
在上述收集到的菌体中加入适量无菌ddH2O，涡旋混匀，按4：1的比例加入上样缓冲液(制备方法如下：SDS 0.5g，溴酚兰25mg，甘油2.5mL，用pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl定容至5mL，分装成10管，每管500μL，室温保存，使用前每管加25μLβ-巯基乙醇)并混匀，沸水浴10min，在5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明，重组菌试验孔在14.4kD附近出现明显的条带，与目的产物的预期大小14.6kD一致，对照孔相应位置未见该大小的条带，表明目的基因在大肠杆菌中成功表达，如图6所示。
按照前述培养和诱导表达的方法，用例如200mL液体LB培养基扩大培养转化有pET-QSNRV的重组菌，然后收集菌体并用PBS洗涤菌体三次，反复冻融8次之后，加入10mL超声处理缓冲液，涡旋混匀。菌体经超声波破碎后，12000rpm离心10min，取上清，分别加入10U/μL的DNase I 5.0μL和10mg/mL的RNase 10μL在37℃下消化12h。超声处理缓冲液的具体制备方法如下：8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87g Na2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，用ddH2O950mL溶解，加10mL Triton-X-100，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
接下来，先后用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上述消化后的液体。然后按1g滤液加0.6g CsCl的比例，将CsCl加入到滤液中，充分涡旋混匀，再用超高速冷冻离心机，4℃、85000rpm离心4h。通过例如注射器从离心后的液体中吸取出含有目的条带的那部分液体。
将含有上述目的条带的液体置于透析袋中，浸没于PBS溶液中透析12h左右。将透析之后透析袋内的液体作为假病毒颗粒原液，分装到无RNase和DNase的EP管中，放置于-80℃保存备用。PBS溶液的配制方法为:8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87g Na2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，加ddH2O 950mL，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
将上述假病毒颗粒原液用2％磷钨酸进行负染，然后在透射电镜下观察假病毒颗粒，可以观察到大量排列紧密、大小形态一致的病毒样颗粒，如图7所示。
由于上述假病毒颗粒内含有的核酸片段是我国出入境检验检疫行业标准《SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够作为该检测方法的标准阳性样品，与上述标准配套使用。从而，改变了“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约轮状病毒检测发展的瓶颈。
实施例3：假病毒颗粒中残留质粒DNA的检测
用PCR扩增法检测实施例2制备的假病毒颗粒是否含有残留的质粒pET-QSNRV的核酸，设计上游引物PpqRVF和下游引物PpqRVR，序列如表4所示，该对引物可扩增质粒pET-QSNRV含有的RV核酸片段对应的cDNA片段上下游共132bp的目标区域。以质粒载体pET-QSNRV为模板设置阳性对照，以ddH2O为模板设置阴性对照。反应体系如表5所示。
表4
引物 序列
PpqRVF 5’-CATAAGCTTACCATCTACACAT-3’
PpqRVR 5’-GCGGCCGCTCTAGAGCAC-3’
表5
反应体系的组成 用量
模板(假病毒颗粒原液) 1.0μL
引物PpqRVF(10μm/L) 1.0μL
引物PpqRVFR(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应35次，条件为95℃1min，50℃40sec，72℃40sec；72℃延伸5min。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图5所示，以pET-QSNRV为模板的阳性对照孔出现大小为132bp的目的条带，以纯化的假病毒颗粒为模板的实验孔的相应位置未见该大小的条带，说明制备的假病毒颗粒原液中无质粒DNA残留，可用于实时荧光RT-PCR分析。
实施例4：假病毒颗粒中RV核酸片段的鉴定
首先，提取假病毒颗粒中的RNA。例如利用Invitrogen公司生产的TRIzol Reagent来进行提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mL TRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNase EP管中，加入0.5mL异丙醇，4℃静置10min之后在12000×g、4℃下离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，用枪头小心吸除EP管中残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；加20μL RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
参照《SN/T 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中的实时荧光RT-PCR方法及其反应体系与条件并做适当优化，利用其提供的引物与探针(见表6)，来确认实施例2制备的假病毒颗粒中含有轮状病毒的RNA片段。
表6
以上述提取的RNA为模板，利用引物对NVP3-F/NVP3-R以及Taqman探针NVP3-P(具体序列见表6)进行实时荧光RT-PCR检测。利用实时荧光试剂盒(如Takara公司生产的One stepPrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒，货号为RR064A)在无RNase/DNase PCR管中配制反应体系(见表7)。同时以RNase FreeddH2O为模板设置阴性对照。
表7
反应体系的组成 用量
2×One Step RT-PCR Buffer III 10.0μL
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL) 0.40μL
PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.40μL
NVP3-F(10μm/L) 0.40μL
NVP3-R(10μm/L) 0.40μL
NVP3-P(10μm/L) 0.80μL
RNA 2.0μL
RNase Free ddH2O 5.60μL
反转录反应条件为42℃5min，95℃10sec。PCR反应条件为：循环反应40次，95℃5sec，60℃20sec；在60℃20sec后收集荧光信号，结果如图8所示。
图8的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-6)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含轮状病毒的RNA片段。此外，该结果还表明所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此，仅需少量制备，通过稀释即可获得大量的标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
以上通过实施例对本发明一个具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。例如，除了上述实施例中提到的我国出入境检验检疫行业标准《SNT2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，本发明的假病毒颗粒中含有的核酸片段还可以是可用作轮状病毒检测靶标的其他核酸片段。此外，除了上述提到的人工合成方式，QSNRV片段还可以通过聚合酶链式扩增反应等方式来获得。另外，除了pET-28a(+)，其他的原核表达载体也可以用来进行本发明所述QSNRV片段的转录和/或翻译表达。

Claims (15)

1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，
其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。
5.根据权利要求4所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
6.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
8.根据权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。
9.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
10.一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；
(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得质粒载体；
(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；
(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；
(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。
12.根据权利要求10或11所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
13.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载。
14.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
15.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
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