JPS60185800A - モノクロナ−ル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背以 本発明は、勅規なハイグリドーマ（ハイブリッドイ町只
糸）、すなわち各々１９８３年１１月９日および１９８
３年１１月１６日提出されたＡ１’Ｃ（Ｊ（Ｂ８４１８
およびＡＴ、ＣＣＨＢ８４２６　に関する。さらに計細
には、本発明は、そのような新規なハイプリドーマの各
々からモノクロナール抗体たとえばフィブリノーゲン牟
らｆｒｙ３’ｈされる生体内フラグメントに対して特異
性のある抗体の製造、およびこれらの抗体を用いる診断
および治療方法および組成物に関する。

フィブリノーゲンは、３つの異なるポリペプチド鎖から
なる大きな（Ｍｒ　３４０，０００　）二量体分子であ
る。フィブリノーゲン−フィブリン遷移はフィブリノ６
ｆチドの絹ｌｉｔ的放出を伴う。この二段トロンビン媒
介プロセスでは、フィブリンＩは初期生成物であシ、Ｆ
ＰＡ［ノイズリノペプチドＡ（Ａα１−１６））の放出
に続いて形成される。

よシコンパクトな４イ４遺体であるフィブリン■はＦＰ
Ｂ　（フィブリノペプチドＢ（ＢＩ３−１４）〕が放出
された除に生成する（　Ｂｌｏｍｂ’ａｃｌｃ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｎ、ａｔｕｒｅ　、Ｌｏｎｄ、、２５７　＃　５０１−
５０５　＋１９７８）。血管統合性を同波するには、フ
ィブリン（フィブリン１であれま／こは■で必ｈ）沈着
物の溶解が必要である。これは主としてプラスミン経路
を介して達成される（　Ｋｅｒｎｏｆｆ　ａｎｄＡ（ｃ
Ｎｉｃｏｌ　、　Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ、　＋　
３３　ｔ　２３９−２４４．１９７７およびＣｏ１１ｅ
ｎ　、　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　、４３．７７−８９　＋　１９
８０　）。

フィブリノ−ダンまたはフィブリンの初期プラスミン分
解産物の１つは、Ｂβ鎖のＮａ２−末端部分から訪導さ
れる。結合Ｂβ４２　Ａｒｇ　−４３Ａｌａはプラスミ
ンに特に敏感である（　Ｍｏ５ｅｓｓｏｎ　ｅｔａｌ−
ｅ　Ｊ−Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ−ｐ２４７　Ｐ５２１０−
５２１９　、１９７２　：　Ｔａｋａｇｌ　ａｎｄ　Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ。

Ｂｌｏｃｈｅｍｌｌｔｒｙ　ｐ　１４　ｔ　９４０−９
４６　＋１９７５）。プラスミンによシ放出されるＢβ
鎖４プテドの性状は利用出来る基質に依存する。フィブ
リノーゲンｌたはフィブリンＩの分解により、ペプチド
Ｂβ１−４２を含イｊするＦＰＢが生じる。

もちろん、後者は、被プチドＢβ１５−４２ノ放出を生
じるフィブリンＨの７８ラスミンタンノ９り負加水分ト
ノγにおいて生じ得ない。

フィブリノーゲンおよびフィブリンのトロンビンおよび
プラヌミン分Ｐ＋′Ｉ産物の同定および定量は貞Ｍ’−
’！　ｕ俗１１ｒテストとして役立ち得る。］７７４１
１０年の間、この目的のために多久ンの免役検定法が開
発された。これらの免役検定法のほとんどで通常の免役
感作により調製きれる抗血イ１１１が使用されている。

そのような抗血清はイ・ＩＩ々のノ月１１１１　、Ｉｔ
和１≦［ユおよび特異性の抗体を含有しているので、多
砂の問題に、Ｉｌ’￥　遇する。／ことえＱす、フィプ
リノーケ”ンおよびフィブリンのあるフラグメントｔ（
見い出される多Ｊ’　＋’＋’ｆ−会含したネ副抗ｊ足
に対する抗１本は一般に措［、く低い力価で存１′■°
する（　Ｐｌｏｗ　ａｎｄ　Ｅｄｇｌｎｇｔｏｎ＋−３
３９２、ｌ　９７５　）。父２Ｃ反応１１．にし１して
１１人１１（の屏１１１１．　’（１’＋帽；ｉ、ｌｉ
ｌ鴎のフィブリノーゲンと反応し、したがって、血漿サ
ンプルは無偏フィプリノーケ゛ンを選択的に除去するた
めに処理工程を必要とする。調製された抗血清では、Ｆ
ＰＡおよびＦＰＢの両方に対する免役反応性に著しい赤
が見られる（　Ｃｏｎｆｌｏｌｄ　ａｔ　ａｌ、ｒ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　１５ｐ１２０３−１２０
８　＋　１９７６　；Ｗｌｌｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｒ　１５　＋　１．２０９
−１２１３　ｐｌ　９７６　”、　Ｂ１１ｅｚｉｋｌａ
ｎ　ａｔ　ａｌ、＊　Ｊ、　ＣｌＩｎ。

これらのイ九Ｊｆ１０１゛イのあるものは、遊−１ｔＦ
ＰＡまたｋＪ、ＦＰＢよシ長いごく少数のアミノｒ１．
・Ｖ基であるペプチドとの交差反応性に限界がある。

Ｋｏｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｌｎ　、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　、　２５６　＋４９５−４９７．１９７５．に
よる］・イブリ　ドーマ技術のし１１発によ如、フィブ
リノ−ダンまたケ、１フィブリン分解産物を取シ扱うほ
とんどの免役検定法の改善が可能になるかも知れない。

Ｋ’ｏｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｌｌｓｔｅｌｎによる免役
されたマウスからの肺細胞へのマウス骨髄）１つ什１胞
の融合によシ、モノクロナール抗体を産生ずる無限増久
１工性細胞系をイ゛することが出り）、ゐことが始めて
ｒｔ：ｌ：ｌ：ｌ’Ｊ式れた。

その後、４ｊｌｉ／ｙのハイブリッドＡ、ｌｌｌ　ｌｉ
包示（ハイブリドーマ）の彫ｊ】も６・よ（ｉこれらの
ハイブリドーマによりメイ・、生？す（る抗［＋の’Ｌ
ｌ：　１１４　＆（−ちシくのカカが回けられた（／こ
と工軒（、Ｆ゛。Ｍｅｌｃｈｅｔａ　、　ＩＶＬ　Ｐｏ
ｔ、１ｅｒ　。

”　Ｔ、ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｆ（ｙｂｒｌｄ＊ｍａａ
　”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ　！　１
９７８およびそ−こに引用さ第１ている文献；（゛。Ｊ
、　１３ａｒｎｓｔａｂｌｅ　、　ａｔ　ａｌ、　、　
Ｃｅ１ｌ。

１４　、９−’２（１、Ｍａｙ　ｔ１９７８　；Ｐ、　
Ｐａｒｂａｍａｎｄ　Ｗ、　Ｆ、　Ｂｏｄｍｅｒ　、　
、Ｎａｔｕｒｅ　、　２７６　。

３９７−：３！１９Ｎｏｖｅｎ＋ｂａｒ　＋　１９７８
　；Ｄ、　Ｍ。

１９７８　、　Ｃｈａｐｔｅｒ　２５　；およびＣｈｅ
ｍｉｃａｌａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ
、　ｐ　Ｊａｎ、　１　ｔ　１９７９＋１５−１７）。

これらの文市；（には、ハイブリドーマからモノクロナ
ール抗体を産生じようとする際に固有に存在する問題が
指摘されている。一般的な技ｊｌ；ｒは良く叩解されて
いるけれども、各特定の場合には多くの凶弾と変更が０
任する。

実際の７Ｊｉ、ある−穴のハイグリドーマを調製し２よ
うとする前に、所望のハイブリドーマがｑｂられること
、得られた場合にそのハイブリドーマが抗体を産生ずる
こと、またはそのようにして得られる抗体が所望の特異
性を有すること、の保８１Ｌはない。成功の度合は、主
として使用する抗原の１１．ｉ　伊および所望のハイブ
リドーマの単離に使用芒れる選択技術によって左右され
る。

従来の研究によれは、ＣＮＢｒによるフリブリノーダン
の生体内分解により主要ＮＨ２末端フラグメント、いわ
ゆるＮ−ＤＳＫが放出されることが判明している（　Ｂ
ｌｏｍｂ’ａｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　。

２１８．１３０−１３４．１９６８）。７リプリノーダ
ンのＮ−ＤＳＫ部分は酵素活性化の結果として現われか
つンイプリノーダンのフィブリンへの遷移において作用
する結合または重合ドメインを含有する（　Ｋｕｄｒｙ
ｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、旧６１．　Ｃｈｅｍ、。

色光９．３３２２−３３２５．１９７４　）。酵素トロ
ンビンｉＪ、’：’１ゾリノーケ゛ンからＦＰＡおよび
ＦＰ　Ｂ　：ｃ　ｌ　’ｉ−１ミー１メンネｌとが出来
、両ベグナトの放出はフィブリンｌの（ｌ三１．ｉｋ　
５Ｗもたらす１．トロンビンとｅま顕なって、ヘビｊ？
ｌ・１ｉ素パトロキソビンはフィブリノーゲン〃・らＦ
ＰＡＩ、か繰出させることが出牙′ず（Ｌｕｕｒｅｎｔ
　Ａ：ｓ　Ｂｌｏｍｂ’ａｃｋ　、　Ａｃｔａ　Ｃｈｅ
ｍ。

５ｃａｎｄ、、　１２　、ｌ　８７５−１８７７　、１
９５８）、これケ、１フィブリンＩと呼釦：れる棟胡の
フィブリンの′１−成ｔ〜える方法である。フィブリノ
ーゲンおよびＮ−ＤＳＫのＮｕ　２．１．、’　ｙ；ａ
：　Ｕ回−であるから、トロンビンす・よひバトロキソ
ビン１．２）ηノフィプリンケ゛ンから異ンデるＮ−（
）ε＋ｒ＜　４１１、をイＬＪることか出来る。

ネメベグプドを同定しようとして、Ｑｕｒｅｓｈｉｅｔ
　ａｌ。、　Ｔｌ＋ｒｏｍｂ、　ｌ１ｏｓ、６．　３５
７−３７４　＊］　９７５　、にふいて、人（ｉ胸−Ｄ
ＳＫに対するラビットＪ、’＋１’、　Ｉｆ旧′１′」
かｉｆ”）　４”！され／ζ。高力価佃清が１１１られ
たにもかかわらず、これらの研死者等はＮ−ＤＳＫと（
Ｔ）Ｎ−Ｄ　Ｓｆ（の免θξ化学四ｊ・だを４ｉＩＪら
証明することが出メ（なかっ／こ。

１９８２年、Ｋｕｄｒｙｌｃ　ｅｔ　ａｌ−ｉｌ、’ｘ
フィブリノーダンまたはフィブリンからメ魯されたＢｉ
１２−４２配列會含むペプチドの血県水卑の測定に使用
出来るラジオイムノアッセイを開発した（　Ｋｕｄｒｙ
ｋ＠ｔ　ａｌ、　、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅａ＊　、　
２５．２７７−２９Ｌ１９８２）。これらのペプチドは
生体内プラヌミン分解の結果として生じるので、ラジオ
イムノアッセイは血栓症が起りそうなまたははっきりし
いいる扶病状態に関する臨床研究において車装な情報を
与え得ることが提案された。しかしながら、ラジオイム
ノアッセイはＢｉ１２．−４２υＮＨ，、−またはＣ０
０Ｈ−末端に延長部を名有するペグチド間の識別を行う
ことが出来ず、したがって、全Ｂβ１５、−４２免投反
応性しか６川定出来なかった。

Ｎｏ５ａｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　
Ｉｎｖｅ＋＋ｔ、　。

６４．１３７１−１３７８．１９７９．において、臨床
血液サンプル中でＢＩ３−４２が同定され、−したがっ
て、それはいわゆるフィブリン１のプラスミンタンパク
質加水分解から生じることが示唆された。第２の独類の
フィブリンも生体内で形成される。定義によれば、フィ
ブリン■はＦＰＡもまたＦＰＢも含んでおらず、したが
って、プラスミンでそれ勿浴胴″してもＢ１０−４２は
生成し得ない（１（８１２１）ｏ　Ｎｏ５ｓｅｌ　（Ｎ
ａｕｒｅ’、　ｐ　Ｌｏｎｄ、。

２９１．１６５−１６７．１９８１）は、フィブリン１
は生体内フィプリノーグンタンノ９り負加水分解におけ
る止装な晶質であシ、そしてフィブリン■はし］表つ性
血栓舶をより生じやすいと示唆している（第８図）。閉
塞性血栓症は患者の生命を危険にさらすので、血栓症の
初期を検出しなけれはならない。生体内でのフィブリノ
ーケゝン分）ｌＩイは、フィブリノーケ８ンタンノ９り
狗加水分１′斤時にノ煕る一般的な附系反応に依存して
血栓症を引き起す生成！１勿を牛じる。フィブリノ−ダ
ンのトロンビンを８性化から生じるフィブリンｌポリマ
ーカ次いでトロンビン１だはプラスミンにより活性化さ
れるかどうかをｍ　！ｌ：ｓム出来る力θにで調らべる
ことけ困・パ１Ｆであるという間に３＋か存在する。主
としてプラスミンにより活性化されると、フィン°リン
ＩのＢβ領の７ミノ１佼残基１−４２’ｉ含有するフラ
グメントを含む分＞ｊ’ｆ　ｊ！＜ニー　’吻が外生さ
れる。仮名が主な経路であれば、閉塞性血栓症は起らな
い。その代り、フィブリンｌポリマーがトロンビンによ
シさらに活性化されると、フィブリン■が生成し、これ
はしはしば血栓症を伴う。

上記に照らして、フィブリン１分子がどのような生化学
的ルートを取るのかを決定することは非常に重重しいこ
とである。これを行う１つのアプローチは、臨床サンプ
ル中のＢβ鎖ヘプチドの分子性状を同定することである
。たとえば、Ｂβ鎖のアミノ１５ツ残基１−１４および
１５−４２をへ有するペゾチドフラグメントの一指像と
合せて、７ψ者の血漿中で無傷Ｂβ１−４２が支配的で
あることが確６３されれば、フィブリンｌのプラスミン
タンｉｊり負加水分解が強く示唆されるであろう、他方
、逆の発見であれば、フィブリンｌがさらに分解されて
フィブリン■が生じることが指摘されるであろう、前述
したように、フィブリン■のプラスミン分解はＢ１０−
４２を決して生じることがない。

１１２９−１１３２．１９８３．においてＳ　ｌ’　２
　／　０　’ｉｕ　ｉｂｉ＋月甲イ１１１１１泣糸の＋
、１１．ｌ　ｆｌ：拮と、人フィブリンのＢββ金的リ
アミノ１：、Ｍ、品のイ３欣ヘゾタ役ノナド、ヘノタペ
プチドのカルン」テ゛キシ才☆１１１１に位ｉ？ｊする
システィン５’Ｑノ、ＩＮおよ０・Ｍｌｌ−ＫＬＩＩ　
（マレイミドベンゾイル化Ａ−−ポールリン波ノトヘモ
シｒニン）からなる複合体で先代にきＪした組１３ＡＬ
Ｂ／Ｃマウスからの１ｌｌｌｊ　ｌ甑１１’ｌｉｌ胞と
のｉ；＋’ｉｉ台から調製されるハイプリドーマから人
フィブリンに結合する：うつのモノクロナール抗体を１
１４　’；ＩＫＬツアーことが運べしれている。モノク
ロナール抗１１・切）１つは、入具り１の４・・１から
のンイプリンた。！：、＞、Ｊｕｌジヒットフィブリン
と父差反Ｌ６シた。

）に、。

目）Δ　：フｆゾリノベプブドＡ（Ａα１−１６　）。

ｌＩ’ｌ’　１１　＋フィノ゛リノペノヴド１３（Ｂ１
０−１４）。

ノイグリンＩ：ンイゾリノーク゛ンをヘビ青酵素ハトロ
キソビンで凝固させることに よりＡ１１口・、りされるＦＰＡを欠除しているフィビ
リン。

フィブリン■：フィプリノーケ９ンのトロンビン分解か
ら得られる完全形成ンイビリ ン（ＦＰＡおよ０１ＰＢ−ｉ、書ない）。

ｎｐＬｃ　：高１生能叔体クロマトダラフィー。

ハイプリドーマＡＴＣＣＨＢ８４１８ ：１９８３年１１月９日に給゛託をれ たＡｍｅｒ−１ｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ　、　１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　
Ｄｒｉｖｅ　、　Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　（以下１”’ＡＴＣＣ
Ｊ）によるＨＢ８４１８の名称が与えられたマウスＩＪ
　７パ 球ハブリドーマ（寄託者記号： １−８ｃ６　）。

ハイグリ　ドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６：１９８３年１
１月１６日に寄託さ れたＡＴＴＣによシＩ（Ｂ　８４２６の名称が与えられ
たマウスリンパ球 ハイプリドーマ（寄託者記号： Ｔ２Ｇｌｓ　）。

単一特異性抗体：単一の抗原と結合する抗体。単一の抗
原法定基に対して単一特異性 である単一特異性抗体はｈＩＪ記抗原 決定糸（エビ′トープ）とのみ結合 する。

ヘテロ分子量１１　：同一抗体の多数の異なる分子形態
を含゛任する抗体。

ホモ分子（）Ｌ体　：単一分子形態のみを含有する抗体
、すなわち、各抗体分子は各他の抗 体分子と同じである。

モノクロナール抗体 二発生的には同一でホモ分子抗体を 産生ずる単−細胞系からルｊ力され る抗体。

ＭＡｂ／１−８ｃ６　：モノクロナール抗１４１−８ｃ
６、ＡＴＣＣＨＢ８４１８と称されるハイプリドーマク
ローンの犬緩培養のｂｔ培地 からのＩｇＧ画分。

ＭＡｂ／’１”２Ｇｌｓ　：％／クロナール抗体Ｔ２Ｇ
１ｇ。

ＡＴＣＣＨＢ８４２Ｇと称されるハイプリドーマクロー
ンの大量培養の廃培 地からのＩｇＧ画分。

Ｎ−ＤＳＫ　：　ＣＮＢｒ分Ｗｒによシ得られる人フィ
プリノーケゝンのＮＨ２末端部分、分 子式（Ａα１−５１、ＢＩ３−１１８、ｒｌ−７８）２
、分子間５８．０００（分子１．４：はケ゛ル電気泳動
によシ測定）。

（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ　：フィブリノ−ダンをヘビ毒酵糸ハ
トロキソビンで凝固させることに よ）調ｍされた人フィブリンから 得られるＣＮＢｒフラグメント。

（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、ＦＰＡを欠除し、したがって、そ
の分子式は （Ａα１７−５１、ＢＡＩ−ｉ　ｉｓ、γｌ−７８）２
で分子量５５，０００（分子量はグル 電気泳動によ、！ｌｌ測定）である点においてＮ−ＤＳ
Ｋと異なる。

（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ　：フィグリノーダンヲ人トロンヒン
で凝固させるかまたはＮ−ＤＳＫを 同じ酵素で活性化することにより 調製された人フィブリンから得ら れるＣＮＢｒフラグメント。（Ｔ）、Ｎ−ＤＳＫｌ、Ｔ
、　ＦＰｋも゛またＦＩＦＢも欠除しており、分子式（
＃１１７−５１、ｖｉ５−１１８．７’ｌ−７８）２お
よび分子量５２，０００（分子量 はケ゛ル電気泳動によシ測定）を有 する。

ＣＮＨｒ　：　ＩＡ化ジシアン 奥埼ニ　ドデシル（ｒｉｌ、　１１芭ナトリウム。

ＴｌｌＢ５　：　０．０５％トゥイーン２０をさらに含
イ１するすＪＩｒ」ツ坊−生理的食塩水緩他Ｊ散◇ ＥＬＩＳＡ　：エンザイムリンクドイムノソルベントア
ノセイ。

盟人二うノｊイムノ７゛ノセイ。

Ａ４９゜　：訳伺・ニー４９０　ｎｍにおりる睦う゛に
ｊ則。

５ａｃ−Ｃａｌ　ニロパ」ＪＬ７ウスヒノＩロース！＆
ｉ／Ｎ　７（３’。

＋＋４！ｌ　’１，１　；ことわりか乃い１１づり、本
発明で使用する［動物Ｊ　Ｌｌ、人間リタ１の鋺パ″”
′″’９）’−：　Ｉｂ３”ｌ：ｔｘ・す、千全臼発明
の概要 モノクロナール抗体の製造方法がυまたに見い出された
。そのようなモノクロナール抗体な＝Ｌ単一特異性でも
ある。そのようにして産生さノＬる中１肌なモノクロナ
ール抗体は、λｉＡｂ／１−８ｃ６およびＭＡ　ｂ／Ｔ
　２Ｇ　ｌ　ｓと称される。これらのモノクロナール抗
体を産生ずるハイプリドーマは各々１−８ｃ６（ＡＴＣ
ＣＨＢ８４１８　）およびＴ２ＧＩｓ（ＡＴＣＣＩＩＲ
８４２ｆｉ）と称をれる。

ハイブリドーマ、したがってモノクロナール抗体の産生
方法は、！１ｌＩＩ物ｉ’ｆｌＮ胞たとえばマウス・（
１岩「ｌ＋　ＩＩＪｊ細胞たとえばマウスＰ３Ｘ６３Ａ
ｇ　８．６５３を、！［１１）物たとえばマウスたとえ
ばＢＡＩ、１１／ｃＪマウスからりＢ’：’１繊細胞と
Ｈ（Ｉ合さぜることを含んでなる。

ＭＡｂ／１−８０６の場合、　マウスは人フィ／リノー
ダンまたはフィブリンＩのＮＨ２；１．！’ｌ°１：プ
ラグメントにより免役され、新規なハイプリ１゛−マず
なわち１−８ｃ６；６に形成される。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　
Ｉ　ｎの」場合、マウスは人フィブリンＩＩのＮＨ２末
端フラグメントにより免役され、新規なハイブリドーマ
すなわちＴ２ＧＩ１１が形成てれる。得られるノ・イブ
リドーマ（よ分離され、ＭＡ、ｂ／８ｃ６の鳴合にυ人
ノイズリノーダンまたはフィブリノＩのＮｌ２末−ン；
ｔフラグメントに附して、捷グこΔ（Ａ　ｂ／Ｔ　２Ｇ
　ｌ　ｓの７鴨合、人フィブリン１１のＮ１（２末で・
１′ＩＡフラグメントに対してｔｌ’（）、行４注抗体
を産生するハイブリドーマが】■はれる。

人フィブリ、ノーダン寸た一フィブリンＩのフラグメン
ト番−１１、人ノイプリノーケゝン神たはフィブリンｌ
のＣＮＢｒによる分弁了により形１反することか出来る
。そのようなＣＮＢｒ分ｗｒＯ人フィブリノ−ダンの７
ラグメン）　ｒ、ｉ　Ｎ−１）ＳＫでめる。１更用出来
る人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの他のフラグ
メントはＢβＩ　−，１１８およびＢＩ３−４２である
。本冗明において使用出来るフィブリン■の７ラグメン
ト）：ｆ、　（Ｊ３）　Ｎ　−Ｄ　Ｓｌぐである。

人フィプリンロの７ラグメント（ハ）、フィブリンＵの
ＣＮＩ（ｒによる分）１γに［υ形成することが出来る
。人フィブリン１１０フラグメントは（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
である。使用出来る人フィブリンｎの他の７ラグメント
はＢＩ１５−１１８およびＢＩ１５−４２である。

バイブリド−Ｖ　ｉ＋ｕ胞系ＡＴＣＣＨＢ８４１８　ｉ
ｄ、単一！ケ異性抗体ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生する。

このＭＡｂ／ｌ−８ｃ（３は、人フィブリノーケ゛ン葦
１ζはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２に
含有するペプチドフラグメントと反）、６するが、しか
し人フィグリノーダンまたはフィブリノｌのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１−１４または１５−４２を含有する々プナ
ドフラグメントとは反応しない。したがっ０１ＭＡｂ／
１−８　ｃ６はＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙｈｉ台内の
Ｊ：たはその周りのエピトープ（抗原決定基）と１．Ａ
１められ、したがって人フィプリノーク゛ン、まメこは
フィブリンＩおよびフィブリン■のＢβ鎖からｎ５街さ
れるＮＨ２末端ペグチド間の識別を行う。

ハイグリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８４２６は、Ｊｌｊ
　ｉ持具性抗体ＭＡｂ／７２Ｇ１ｍ　’（ｃ産生する。

このＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　１　ｇは人フィブリン■のＢβ鎮
のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメ
ントと反応するが、しかし人フィブリノーダンまたはフ
ィブリンＩ（ＤＢ／鎖のアミノｒｔ残基１−４２寸たｌ
：Ｆ、１−１４′ｆ′：含有するペプチドフラグメント
と反応しない。し７たがって、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｇはフ
ィブリン１１のＢβ−６Ｊ−にのエピトープとＫＭめら
れるカｓ１しかしフィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＩ３βｆＪ４−Ｊ−のエピドーグでない。

ＭＡｂ／１−８　ｃ　６は、人フィブリノーゲン、フィ
ブリン１寸たけこのいずれががら誘導されたペプチド（
アミノｆ’ｉ＆残基１−４２を含有する）のＢββ上上
単一決定基に対して単一特異性である。

ＭＡｂ／Ｉ　−８ｃ６　は他の抗人フィブリノーケリ抗
体を庁有しない。このことは、本来的に汚染されている
従来技術の抗血ＦｒＶおよびＢＩ３４Ａｒｇ−１５Ｇ１
ｙ結合中才たＶｌ、その周囲のエピドーグに対して特異
性でないイ・）附旧力ｉすのモノクロナール抗体と対照
をなす。

ＭＡｂ／１２Ｇ１ｇは、人フィブリン■のＢＩ４１４の
アミノ［′ｊψ残基１．５−４２を含有する４ノチドフ
ラグメントにの単一決定基に対して単一特異性である。

ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ　ｉｒｊ、本来的に汚染される従来
技術）抗１１’１１７＋”？とはぜとってま／こフィブ
リン…のＢβ鎖上のエピトープに対して特異性でない従
来技術のモノクロナール抗体とは違って、他の抗人免役
グロブリンを実質的に含有しない。

ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　１　ｇは、フィブリン■のアミノら？
残基１５−４２を含有する人波プチドフラグメントに対
しても特異性である。すなわち、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｓは
人フイグリノーグンのトロンビン分解にょシ生じる産物
と反応するが、しかしある動物フィブリノーゲンたとえ
ばラビットフィブリノ−ダンのトロンビン分解から得ら
れる産物とは反応しない。

本発明の新規なハイプリドーマは、培養して抗体を産生
させることが出来るが、この際動物に免疫し、殺すこと
、およびついで従来技術の不純な抗血清を得るためにさ
え必要な冗長な吸着・精製工程を必要としない。

免役グロブリン分子はすべて２つの同じＬ鎖（Ｎｌ２５
，０００　）と２つの同じＨ鎖（ＭＷｓｏ、ｏｏｏ）が
ジスルンイド結合により四散体として結合されたものか
らなる。各鎖は概念上稈１造的および機能的意味を有す
る特異性ドメインまたは領域に分けることが出来る。カ
ル？キシ末端側のＬ　６１の半分は不変部と呼ばれ、ア
ミン末端の半分はＬ釦の可変部である。アミノ末端に位
置するＨ鎖の多まは１／４は可変部と呼はれ、Ｈｇの他
の３／４はＨ鎖の不変部と呼はれる。

４クラスのＨ鎖がマウスに見い出されておシ、これらの
クラスは化学的差異によシ識別することが出来る。Ｈ卸
の柚類は免疫グロブリンのクラスを、したがって、その
エフェクター作用を決定する。５つの免疫グロブリンク
ラスＩｇＧ、ＩｇＡ。

ＩｇＭＸＩｇＤおよびＩｇＥが存在する。マウスＩｇＧ
の４クラスはＩｇＧ、、ＩｇＧ２ａ１１ｇＧ２．および
ＩｇＧ３と叶はれる。

ＭＡｂ／１−８　ｃ６はクラスＩｇＧおよびサブクラス
Ｉ　ｇＧ２＆に属している。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　１　ｓは
クラスＩｇＧおよσサブクラスＩｇＧ、に属している。

したがっ１、前述の利点を達成するに当って、本発明ｅ
；ｌ′、２つのハイプリドーマ、すなわち人フィブリノ
ーダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２金含イ■するペプチドフラグメントに対して抗体を
産生ずるノ・イブリドーマおよび人フィブリン■のＢβ
順のアミノば残基１５−４２を含有するペプチドフラグ
メントに対して抗体を産生ずるハイブリドーマを提供す
る。

さらに、本発明は、生体内でのフィブリノーゲンタンパ
ク質加水分解経路の性質を決定する方法を提供する。

また、本発明は、本発明のモノクロナール抗体を用いる
疾病の診断方法を提供する。

また、本発明は、閉塞性血栓症になる恐れのあるまたは
現にかかっている患者の血流からフィブリン■を治療に
よシ除去する方法を提供する。

一般に、本発明によるモノクロナール抗体を産生ずるハ
イプリドーマは、Ｋｏｂｌｏｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ
ｌｎの方法によシ調製される。ＭＡｂ／１−８ｃ６の産
生の場合はＮ−ＤＳＫの溶液をまたはＭＡｂΔ２Ｇ１ｇ
の産生の場合は（’ｒ）Ｎ−ＤＳＫの溶液によシマウス
を免疫した後、免疫したマウスの１１♀）ｌλ細胞を、
マウス骨髄原糸からの細胞と融合させる。得られたハイ
ブリドーマからのクローン培メζ液をスクリーニングし
、人フィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のア
ミ７に’Ａ基１−４２を名′有する被グテドフラグメン
トに（ＭＡｂ／１−８　ｃ６の産生の場合）、または人
フィブリン■のＢβ鎖のアミノ威残基１５−４２を含有
するｄノチドフラダメントに（ＭＡＬＩ／Ｔ２Ｇ　１　
ｓの産生の」６１合）ノヘ釈的に結合する抗体をＪイＪ
する上？ｉｆ”／Ｉブを名む培養液を得る。

強調すべきことは、ノ・イブリッド、Ｘｔ、ｇ　ｉ４物
の性状は予知出来ないために、１つの抗原または細胞糸
からの他の４５’Ｌ原−またはＡ：；１胞系への外挿が
不用能なことである。

本う１“、明の方法により製造されるノ・イブリドーマ
から肋佑・芒れるモノクロナール抗体は、血栓症にかか
るｆｆ’：ｔ＋のあるまたはかかっている患者のｎ＋＋
液に２尾生ずるフィブリン分子の性状全決定するために
臨床イＶ＋丸において診断系として有用である。血栓Ｊ
Ｍ　ｔ：ｊ：多数の病状と関連があるが、また手術前、
中ま／こｔ」、抜力、らびに他の外傷状）／ＪＱでも起
り得る。

皿液坊セＩＭ、’、渚に対するヘノンリン治療の効果を
、本発明のト１１９＋払−を介してフィブリノ−ダンま
たはフィブリン分解産物の血漿（る“ジ度をｄｌ）１定
することにょ）検査することも出来る。ストレグトキナ
ーゼまたは組織屋プラスミノーダンアクチペータを用い
る血栓」を治療の効果を、本発り」の抗体を用いて検査
す６眞も出来６・　以下余白 発明の共体的；尻明 本発明による、ハイプリドーマおよびそのハイプリドー
マによって産生される抗体の製造方法は、形′ｔす転換
された動物細胞たとえば骨髄腫細胞を動物のＩ＋’！臓
ｊｆｆｌｌ　ｌ１ｉｕとｌＡＩ＋！合させることにより
行うことが出来る。しかしながら、マウス４髄肺細胞お
よびマウス牌；リシ卸１胞を使用することが好寸しく、
シたがって、以下、本発明はマウス骨髄腫細胞およびマ
ウスＩＩ”！−ｒ臓ｉｌｌ胞を用いて記載される。

本発明によれば、ＭＡｂ／１−８ｃ６　（人フィブリノ
ーダン址たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントと反応するがしか
じ人フィプリノーケ９ンまたはフィシリンＩのＢβ鎖の
アミノＩ及残基１−１４または１５−４２を含有する一
８ｆチドフラグメントと反応しない）またはＭＡｂ／’
ｒ２Ｇ１．ｓ　（人フィブリｙｌｌのＢβ鎖のアミノ酸
残基１５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応
するがしかじ人フィブリノーダンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有す
るペプチドフラグメントと反応しない）を産生ずるハイ
プリドーマの調製方法は、一般に下記工程からなる：Ａ
、ＭＡｂ／ｌ−８ｃ６の産生の場合にはＮ−ＤＳＫ１Ｂ
β１−１１８、ＢＩ３−４２または（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを
、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　ｌ　ｇの産生の場合には（Ｔ
）　Ｎ−ＤＳＫ　。

Ｂｉ１２−１１８またはＢｉ１２−４２によりマウスを
免疫する工程。Ｎ　−Ｄ　Ｓ　Ｋはフィプリノーケ゛ン
から調製され、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫのトロン
ビン分解により調製される。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスが好
ましいが、他のマウス系統が使用出来る。免疫感作スケ
ジュールおよび免疫原濃度は、適当に感作された牌細胞
の有効楚を生じるものとする。ＭＡｂ／１−８ｃ６を産
生するためには、Ｎ−ＤＳＫ溶液（４ｍ９／ｍｔ）のエ
マルジョンｏ、ｉｙおよび等客月の完全７０インドアジ
−パントを腹腔内（ｉ、ｐ、）に注射し、次いで一週間
おきに不完全フロイントアジ−パントを用いて同じ投与
量の二次免疫注射を４回行い、次いで１０週間後に０．
　Ｉ　ＩｎｆｉＩＮ−ＤＳＫをトリス−生理的食塩水に
溶解したものを静脈（１、ｖ　、　）注射してマウスを
免疫する。ＭＡ　ｂ／４ｒ２ＣＩ　Ｉ＋を産生するには
、１００μＩの（’ｒ）　Ｎ−ＤＳＫを完全７０インド
アノ−パントと混合したものを腹腔内に注射し、次いで
不冗全フロインドアジュバントを用いて同じ投り晶ｉの
二次免疫静脈注射を４回行い、次いで１００　ｔｌｇの
（Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫをトリス−生理的食塩水にＭＭした
ものを静脈注射して、マウスを免疫する。

Ｂ、各免疫されたマウスから牌繊を摘出し、各肝臓から
の細胞を適当な媒体たとえばＲＰＭ１１６４０に分ＨＨ
ｙさせた懸濁液を調製する工程。

Ｃ１懸濁牌職細胞を適当な細胞系からのマウス骨ｆｌＪ
ｉ　１ｌＩｉｔ細胞とたとえば適当な−に１ｙ合促進剤
たとえばＭ：Ｇ１０００を用いて融合させる工程。好ま
しい割合は、ＭＡｂ／ｌ−８ｃ　６産生の場合、骨髄肺
細胞当り１ｙで４個の牌ｌ繊細胞であり、ＭＡｂ／’ｒ
　２Ｇ　ｌ　ｇの場合、骨髄肺細胞当り７個の肺臓細胞
である。約１０８個の牌細胞に対して全］１１で約Ｑ、
５−１．０ｍ／の融合媒体が適当である。多くのマウス
骨髄１匝細胞系は公知であり、−＋１υに学痒のメンバ
ーまたは神々の訂６ｔバンクたとえば５ａｌｋ　ＩｎＩ
Ｉｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅ１１１）Ｉｓｔｒｌｂ＋＋ｔｌｏ
ｎ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ＋ＣＡから入手出
来る。使用する細胞系は、融合しない骨髄腫細胞が選択
培地で生き残らず、ノ・イゾリッドが生き残るように、
いわゆる「薬物耐性」型であるのが好ましい。最も普通
のクラスは８−アザグアニン耐性細胞系であるが、この
ものは酵素ヒポキサンチングアニンホスホリがジルトラ
ンスフェラーゼを欠除しており、したがって、ＨＡＴ　
（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培
地によって育成されない。また、使用する骨髄腫細胞系
は、それ自身では抗体を全く産生じないのでいわゆる「
非分泌ｊ型であるのが好ましい（分泌型も使用出来るけ
れども）。しかしながら、ある場合には、分泌型骨髄腫
系が好ましい。

好ましい融合促進剤は平均分子幇が約１０００〜約４０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００等とし
て市販されている）であるが、当業界で公知の他の融合
促進剤も使用することが出来る。

Ｄ、別個の容器、たとえばミクロタイタープレートの別
個のウェルで、未融合牌細胞、未融合骨髄肝細胞および
融合細胞の混合物を、未）、４゛ｊｊ合骨髄腫細胞が生
育しない選択培地で未融合細胞を死滅させるのに十分な
時間（約１４−１６日）の間希釈して培養する工程。希
釈は、希釈剤の容量が各別々ノ容器（たとえばミクロタ
イタープレートの各ウェル）である数の細胞（たとえば
１−４）を単離させるようにＫｄｊ　ｉｆｆ的にＨ目−
１された限界希釈でよい。培地は・・１１≦物ｌ１ＩＩ
ｌ′Ｉ−（たとえば８−アザグアニン１性）未１．１１
１！合・ｔ’７１ｉｉ’ｉ　Ｉｔ↓鴫１１１胞糸が生育
し／Ｉいもの（たとえばＨＡＴ培地）である。したがっ
て、これらの・ｉ’ｉ’　！’ｉイ１＋１１１情＋１１
＋ｉシは化戚才る。未融合胛に１１１胞はＮ４“、注で
ないから、イ］１１（の世代数しか有しない。したかつ
で、ある”’＋１１ｉ１　（約１４−１６日）＠、これ
らの未融自牌細胞は牛桐することが出来ない。他方、融
合細馴は・ｉ、ｊ、　ｉｊ、ｔ、肺イ（ｌの悪性１１ｊ
性およびＪ藁択培地でｑ；き残る１１Ｌ力を；１１シて
いるので生殖し続ける。

Ｅ、　ハイプリドーマを含イ］する谷′？ｆ器（ウェル
）の十／ｐｉみｈｌｒについて、（すＭＡｂ／１−８ｃ
６産生の場合は、Ｎ−ｒ）ＳＫオよヒ１５．１連（ｌ”
１′／造体〔フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳＫ１’ｆたは
−すれらのフラグメント、たとえば（Ｂ）　Ｎ−ＤＳＫ
　（Ｎ−ＤＳＫのバトロキソビン分解産物）およびＢＩ
３−１１８］に対する抗体の存在およびＮ−ＤＳＫのＡ
Ｃ３−５１またはα１−７８鎖、トロンビン分解Ｂβ１
−１１８、（Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫ、遊１ｉｉ（４）Ｂβｌ
　−１４（ＦＰＢ　）またはＢＩ１５−４２に対する抗
体の不存在についておよび（２）　ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　ｌ
　ｇ産生の場合は、（Ｔ’）Ｎ−ＤＳＫおよび関連４１
１造体（フィブリンＩＩ　、（１”）　Ｎ−ＤＳＫ、ト
ロンビン分解Ｂβ１−４２およびＢＩ１５−４２）に対
する抗体の存在および無傷フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳ
Ｋ捷たは（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫまたはＢＩ３−４２に対する
抗体の不存在について評価する工程。

Ｆ、所望の抗体、たとえばｋｉＡｂ／１−８ｃ６の場合
、人フィブリノーダンまたはフィブリンｉのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１−４２を含有す−るペゾチドフラグメント
と反応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１
４または１５−４２のみしか含有しないペゾチドフラグ
メントと反応しない抗体を、またはＭＡｂ／’ｒ　２Ｇ
　ｌ　ｇの場合、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有するペゾナドフラグメントと反応す
るが、しかじ人フイブリノーケ゛ン捷たはフィブリンＩ
のＢβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有
するペゾチドフラグメントと反応しない抗体を産生ずる
ノ・イブリドーマを選択（たとえば限Ｗ箱釈によシ）・
クローン化する工程。

７９［望の）・イブリドーマを選択し、クローン化した
ら、生成抗体を２つの方法のうち１つの方法で産生ずる
ことが１１１来る。最も純粋なモノクロナール抗体は、
））１望のノ・イブリドーマを適当な培地で適当な時間
の門生体外培養し、次いでクローンの上澄み故から所望
の抗体を取得することにより産生される。適当な培地お
よび適当な培養時間は公知でありまたは容易に決定され
る。この生体外技術により曲の抗人免疫グロブリンを含
まないモノクロナール抗体が産生される。培地は異種血
清（たとえば、ウシ胎児血清）す含有するので少鼠の他
の免疫グロブリンが存在する。しかしながら、この生体
外方法では、ある目的に対して十分な量または濃度の抗
体を産生ずることが出来な“い。これは、モノクロナー
ル抗体のｌｊｒ度が約５０μｆｌａｍｅに過ぎないから
である。

さらに高濃度の純度がわずかに劣るモノクロナール抗体
を産生ずるには、所望のノ・イブリド−マクローンをマ
ウス、好ましくは同系または半回系マウスに転移、すな
わち腹腔内注射することが出来る。ハイブリｒ−マは適
当な培蝉時間後、抗体産生腫瘍を形成し、この腫瘍は、
宿主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）中に高濃度
（約５−５−２Ｏ／ｅ３）の所望の抗体を生じる。これ
らの宿主マウスも血液および腹水中に正常抗体を有する
けれども、これらの正常抗体の濃度はモノクロナール抗
体の濃度の約５チに過ぎない。さらに、これらの正常抗
体は特異性が抗人性でないので、産生された悪性腹水か
らまたは血清から得られたモノクロナール抗体は汚染性
抗人免疫グロブリンを実質的に含んでいない。このモノ
クロナール抗体は高力価を有し、非特異性免疫グロブリ
ンに対する特異性の割合が大きい。

専門技術者が血漿サンプルをテストして本発明のモノク
ロナール抗体が単一特異性を示す対象である抗原の存在
用（たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、人ブイプリノ
ーダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントのｈｌ、またはＭ
Ａｂ／Ｔ２Ｇ　１．の場合、人フィブリン■のＢβ鎖の
アミノミｎ残基１５−’４２を含イｊするペプチドフラ
グメントの七）を徂１定出来る方法は次のようである。

、ｗ者からある間隔で血液を集め、その血液から血漿を
取り出す。血漿サンプルを迅速に「処理」（ｐｒｏｃｅ
ｓｓｅｄ　）　Ｊ　Ｌ、ずなわち氷冷エタノールで処理
し〔５０％最終濃度〕、Ｂβ釦から銹導されるフィブリ
ノ−ダン／フィブリンペプチドを単離する。エタノール
上澄液は一般に凍結乾燥して溶剤を除去すると共に抽出
ｆ夜をｄ３縮する。「処理」血漿サンゾルを２つの部分
すなわち、ＢＩ３−４２の存在を検出するために使用さ
れる部分と、Ｂｉ１２−４２の存在を検出するために使
用される部分に分割することが出来る。エタノール抽出
液中に存在するベグチド水準は、ラジオイムノアッセイ
（’ＲＩＡ）かまたはエンディムリンクドイムノソルペ
ントアッセイ（Ｆ、ＬＩＳＡ　）によりｄ用字すること
が出来る。たとえば、エタノール抽出液の植種の希釈液
を、一定量の動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／
１−８ｃ６およびたとえば人フィブリノーダンまたはフ
ィブリン！のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する
放射能標識ペプチドフラグメントからなる競合的放射能
標識抗原、たとえば動物モノクロナール抗体たとえばＭ
Ａｂ／１−８ｃ６と結合することが出来る　ＩＢβ１−
４２りがンドと混合する。また、エタノール抽出液の種
々の希釈液を、一定置の動物モノクロナール抗体たとえ
ばＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　ｌ　ｇ　および人フィブリン■のＢ
β鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する放射能標識ペ
プチドフラグメントからなる競合的放射能標識抗原と混
合する（この競合的放射能標識抗原たとえば　ＩＢβ１
５−４２リガンドは動物モノクロナール抗体たとえばＭ
Ａ　ｂ／１ｒ２Ｇ　ｌ　ｓと結合することが出来る。両
方の場合共、適当なインキュベーション期間後、場合に
より、動物モノクロナール抗体たとえばＦ１’ｌＡ　ｂ
／ｌ　’−８ｃ　５またはＭＡｔ＋／’ｒｚｃ　ｔ　８
に特異的である第二の抗体（たとえばラビット抗マウス
全抗体または５ａｃ−Ｃｅｌ）ヲ添加する。第二のイン
キュベーションＪｔＪＪ　間（＆、抗体が結合した放射
能標識抗原（リガンド）を分離して定ｈ；−する、すな
わち結合放射能標識抗原の放射能を計数する。サンプル
中に存在するＢＩ３−４２（または１５−４２）ｈ丁コ
ールド」であるほど、そのサンプルでは結合リガンドが
少ない。

未知サンプル中の正確な’（ｙｔ、　（すなわちＢＩ３
−４２甘たは１５−４２ベノテドのイｔ１度）は、未知
サンプルの阻止征１を各々Ｂβ１−４２または１５−４
２代′・準を用いで丙られる１ｓ１１止ｔ、１１４と比
較することにより、ずなわち、Ｉｔ’ｌｌ漿サンプルを
用いるＲＩＡテストの結果を、（ご１１〜ヘ−１の既知
抗原たとえばへフィブリノーダンまたはフィブリンｌの
Ｂβ鎖の酸残基１−４２を含イ１するペプチドフラグメ
ントまたはフィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−
４２を＠４−Ｉするペプチドフラグメントを用いて得ら
れるＲＩＡテスト結果と比較することにより、測定する
ことが出来る。

別法として、前記抗原（すなわち、ＢＩ３−４２または
１５−４２）の存在はｇＬＩｓＡにより検出することが
出来る。この方法では、固体担体たトエハミクロタイタ
ーグレートに、たとえばＢＩ３−４２、Ｎ−ＤＳＫまた
は無傷フィブリノ−ダンを含有する人フィブリノーダン
またはフィブリンｌのＢβ鎖のペプチドフラグメントか
らなる競合的抗原を一晩被瀉する。洗浄「遮断」（非特
異性結合な最小限にする）工程後、ＭＡｂ／ｌ−８Ｃ６
および血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢ
Ｉ３−４２標準）を適当に希釈したものをミクロタイタ
ープレートの適当なウェルに添加する。

そのようなサンプル中に大過剰のＢβ■−４２ベグテド
が存在する場合、ＭＡｂ／ｌ−８ｃ６はペプチドと反応
し、ミクロタイタープレートの表面に最初に被葎された
前記抗原または関連抗原との結合にこの抗体のほとんど
は利用出来ない（前管己参照）。

抗原被包プレートに結合することがある場合この抗体た
とえばＭＡｂ／１−８ｃ６の量は、プレートに結合した
酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫グロブリンたとえ
はＭＡ　＋＞／１−８　ｃ　６に結合する、すなわち’
Ｃｒｗ的である）のｉｄをすでに述べた方法（Ｅｎｇａ
ｌ　ｌ　＋Ｅ−＋　Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７ｏ、　ＰａｒｔＡ、４１９−４
３９、．１９８０差こより測定することによって検出す
る。未知サンプル中のたとえばＢＩ３−４２の：１：は
、未知サンプルの阻止１１１！ｒをたとえばＢβ］　−
，４２ｔ；、’！’Ｉいを用いてイ１１られる阻止値と
比Ｉ咬することにより（すなわち血漿サンプルを用いる
ＥＬＩＳＡテストの結呆を既知抗原すなわち、人フィプ
リノーケ゛ンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残
基１−４２を含有するペプチドフラグメントの標準＋ｊ
）を用いてイ！ｔられるＥＬＩＳＡテスト結果と比較す
ることにより）　？１１１定する。前記ＥＬＩＳＡ法は
血漿サンフ０ル中の１３β１５−４２の存在の検出に使
用される。たとえば、ミクロタイタープレートに、人フ
ィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を金山す
るペプチドフラグメントからなる競合的抗原たとえばＢ
ｉ１２−４２を被覆する。ＭＡｂ／ｌＴ’２Ｇ　ｌ　ｇ
および血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢ
ｉ１２−４２４？ｉ準）をグレートのウェルに添加する
。抗原被ｊ夏プレートに結合したＭＡｂ／’ｒ２Ｇ　ｌ
　８の４ｉは、プレートにＩｔｌＬｉばｌ−た酵素結合
抗体（この抗体はマウス免疫グロブリンたとえばｂＡＡ
　ｂ７’ｒ　２Ｇ　ｌ　ａに結合する、すなわち稍異的
である）の桁を測定することにより（う１出する。

未知サンプル中のＢｉ１２−４２のｈ；ば、未知サンプ
ルの阻止値をＢｉ１２−４２標準を用いて得られる阻止
値と比較することにより（すなわち、血漿サンプルを用
いるＥＬＩＳＡテストの結果を、人フィブリ／■のＢβ
鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する標準ペプチドフ
ラグメントを用いてイ（）られるＥＬＩＳＡテスト結果
と比較することにより）測定する。

専門技術者が患者に閉塞性血栓症が発病するＦｉＪ能性
を検出出来る方法は、血漿サンプルを２つの部分に分割
し、そして（１）１つの部分で人フィブリノーダンまた
はフィゾリンロのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有
するペプチドフラグメントの飯を、および（２）もう１
つの部分で人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５
−４２を含有するペプチドフラグメントの絹をけ用足す
ることからなる。

技術者は、［）（１述１．たようにｇＬＩｓＡ　’また
はＩ’ｔＩＡテストのいずれかを用いることが出来る。

次に、患名の血漿中の（プチドフラグメントの相対拓を
比Ｉ咬−することが出来る。ＢＩ３−４２がＢｉ１２−
４２より徨勢である場合、フィブリノーケ゛ンまたはフ
ィブリンｌ　；１？　＋７マーのプラスミンタンノぐり
負加水分解が行われでいることが指摘される。Ｂｉ１２
−４２がＢＩ３−４２より優勢である場合、フィブリン
■が形成されている。すなわち、！、−１ｉに閉塞性血
栓症の発病の■」能性があることが指摘される。

土た、本イ０明は、フィブリノーケ９ンおよび（または
）フィブリノの生体内弁接ペプチドの性状をｌｉｌ、′
、ｊらべるためのテストキットに１３′」する。１つの
そのようなテストキット、すｌよりち単一ペプチドキッ
トでは、たとえばへフィブリノーダンまたはフィブリン
１のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含イうするペプチ
ドフラグメントの存在が検出される。

凍結乾燥した動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／
１−８ｃ６のアリコート（たとえばｏ、　５　ｍｅ　）
を用意する。また、フィゾリノーダンのアリコート（た
とえば２−４ｍ９）も用意する。技術者はこのアリコー
トを用いてＥＬＩＳＡテストで使用するミクロリットル
プレートを被保する。さらに、人フィブリノーダンまた
はフィブリンＩのＢβ釦のアミノ酸残基１−４２を含有
するペプチドフラグメントのアリコート（たとえば２０
μＩ）を用意する。

これは、技術者により、フィブリノ−ダンａｌ？０１Ｅ
ＬｆＳＡプレートに結合するＭＡｂ／ｌ−８ｃ６の量が
色強度（下記で説明）により示されるように、テストザ
ンゾル溶液中の競合性抗原（Ｂβｌ−４２）の清が増加
するにつれて減少する椋準曲線をつくるために使用され
る。技術者は、競合性ＥＬＩＳＡテストで溶液として使
用する既知ｈ１の抗原を得るために用意されたＢＩ３−
４２の希釈液を調製、する。

この技術は良く知られている。また、動物たとえばマウ
ス免疫グロブリンに対する酵素結合（たとえばペルオキ
シダーゼ結合）免疫グロブリン（たとえばラビット）を
用意して、動物免疫グロブリンたとえはＭＡｂ／１−ｓ
ｃ６のフィブリノ−ダン被堕プレートへの結合を検出す
る。酵素結合ＩｇＧ結合はＨ２Ｏ２−０−ジアニシジン
溶液を用いて検出する。色強ｊｍ、はたとえばＭ　Ｒ５
８０・マイクロエリザオートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ＋Ａ１ｅｘａｎｄｒｉａ＋ＶＡ　）を用いて自動的に
批１定することが出来る。

標準曲線をつくったら、フィブリノ−ダンを除去すべく
処理された血漿サンプル（たとえば例７にｎ市１２）（
この血漿サンプルは未知ＭａｌのＢ１０−４２をきイｊ
しイ！Ｉる）を用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが出
来る。邑・ｊ＾鳴を測定し、血し、！：サンプル中のＢ
βｌ　−，４２−１ｉを４Ｈ，’；（＄曲ｉｌｌ　カラ
ｉｉ；ｅ、ミ取ルコとが出来る。

本発明による曲のテストキットすなわち単一にノテド検
出キットは、前述の如＜　１１’ｙ’・作されるが、し
かし血漿サンプル中に存在するＢｉ１２−４２０ｈｌを
泪１１定する。イ東押ｊ　’Ｘｉ、魁へしたり１力（１
勿モノクロナ一ル抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ　ｇの
アリコート（たとえば０．５　ｍり）を用、も（する。

寸だ、ミクロタイタープレートの＋Ａｉ（ｊに用いるフ
ィブリンのアリコート（たとえば２−４ｍ９）を用意す
る。また、動物たとえばマウス免疫グロブリンに対する
酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビット）と同様に
人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基を含有するペプ
チドフラグメントのアリコート（たとえば２０μｇ）を
用意する。

本発明による本発明の好ましいテストキットである。第
三のテストキットすなわち２つの異なるにゾチド検出用
のペプチド検出キットを用いて血漿サンプル中のＢ１０
−４２およびＢ１０５−４２の両方を測定することが出
来る。血漿サンプルを２つの部分すなわちＢ１０−４２
の存在のテストに用いる部分と、Ｂｉ１２−４２の存在
のテストに用いる部分に分割する。動物モノクロナール
抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６、ＭＡｂ／’ｒ２Ｇｌ
ｓ　、　７　イブリノーダンおよびフィブリン（プレー
ト被捗用）、Ｂ１０−４２およびＢβ１５’−４２（標
準曲線作製用）および動物たとえばマウス免疫グロブリ
ンに対する酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビ≦ッ
ト）をすべて用意する。技術者は、各単一ペプチド検出
キットについて前述した手１ｔ１４に従う。このように
して、各血漿サンフ０ルにおいてＢ１０−４２およびＢ
βｌ　５−．１２の１．１を測定し、比較することが出
来る。

１）１１述したように、ｇＬＩｓＡの１・１４用が好廿
しい。しかしながら、］々術渚は、キットの構成部分を
用いて［ｉ’：ＬＩＳＡの代りにＲＩＡを行ってペプチ
ドフラグメントのｈ；をｌ１１１１５１することが出来
る。

０１１述したように、本発明は、牛体内で産生されつつ
あるフィブリン分子の１′−１状の迅速な分り１手段を
提供する。面力↓テストサンゾル中でＢ１０−４２抗原
がＢ１０５−４２の抗原より優勢である場合、フィブリ
ノ−ダンまたはフィブリンＩポリマーのゾラスミンタン
パク質加水分解が起りつつあることが指摘される。他方
、Ｂｉ１２−４２抗原がＢ１０−４２抗原より置部であ
る場合、フィブリン■がＩＭｊ　ＵＮしているかまたは
血管壁に付着しつつある可能性がある（この過程は閉塞
性血栓症に至る）ことが臨床医に指摘される。

木つ１を明では、免疫マウスからの肺細胞および骨髄腫
細胞を使用することが好せしいけれども、他の動物たと
えばラット、モルモットおよびラビットからの細胞を使
用することも出来る。

本発明の方法を用いて人間以外の種からのフィブリノ−
ダンまたはフィブリン１フラグメントに対して抗体を生
じさせることも出来る。たとえばラビットまたはドッグ
フィブリノ−ダン、フィブリン■またはフィブリンｎか
らのフラグメントを用いて、獣医学用に、フィプリノー
ケ９ンまたはフィブリン■に対して抗体を生じさせるこ
とが出来る。このような抗体は、実験的血栓症または血
栓崩壊治療を取シ扱５研究で使用することも出来る。

しかしながら、注目すべきことは、特定の柿の動物を治
療する場合、抗体は異なるわ９の動物から誘導しなけれ
ばならないことである。

本発明の検定法を用いて、多数の外傷患者群たとえば火
傷患者、頭部および他の身体部位のＪＭ傷を受けている
患者、関心および冠状バイパス手術を含む手術中の患者
（検定法は手術前、中および後に行うことが出来る）、
血液透析患者、癌、＠者および深部静脈血栓症患者にお
いてフィブリノ−ダンまたはフィブリノ分解産物を測定
することが出来る。たとえば、股の手術を受けヤいる初
老の患者は、急性深部静脈血栓症を引き起すことがある
。この状態を軽減するために、２つの治療方法すなわち
トロンビン（凝固）を除去する手術かまたはフィブリン
溶解剤たとえばストレプトキナーゼまたは組織型プラス
ミノーダンアクチベータ−（ｔ−ｐＡ　）によるトロン
ビンの汗ｆ解を使用することが出来る。本発明の方法を
用いて前述した血栓崩壊剤により指摘されるように、血
餅ｍ　ＩＱ’（のごく初期の段階を検出することが出来
る。本発明の方法を用いて閉基性血栓症にかかり得るま
たは潜在的にかかり得る。患者においてフィプリノーケ
゛ンまたはフィブリン分１９’ｌ産物を検出することが
出来る。

本発明のＭＡｂ／’ｒ　２Ｇ　ｌ　ｓを治療に用いて、
閉塞性血俺にかかりつつあるかも知れないＷ；にの血流
からフィブリン■を除去することが出来る。たとえば、
血液透析を用いてそのような除去を行うことが出来る。

血ｌａ析を用いる場合、ＭＡｂ／’ｒ２Ｇ１ｓは固体担
体たとえばガラスピーズ上で固定化される。次いで、固
定化ＭＡ　ｂ／’ｒ２　Ｇ　ｌ　ｓ−固体担体複合体は
、血液透析室のある位置に置かれ、次いで血液が患者に
戻される。したがって１．血液透析中、血液は血液透析
室を血液が固定化モノクロナール抗体と接触するように
流れてフィシリン■が血液から実質的に除去され、その
後血液はｗ者の楯″環系に戻される。

本発明をさらに下記の非限定的例により説明する。

因 例１　：　Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび関連フ
ラグメントの調製 ｌＭＣ０ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ、（ストック
ホルム。

スエーデン）から人フィブリノーダンを得た。このフィ
ブリノ−ダンから、実質的に旧ｏｍａｃｋ　ｅｔａｌ、
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４８．５８０６−５８
２０　。

１９７３．０技術に従ってＮ−ＤＳＫを調製した。しか
しながら、向流分配を用いる代りに、セファデックスＤ
ＥＡＥ　Ａ　５０　（Ｐｈａｒｍａｃｌａ、　Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ＋Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　）によるイオン
交換クロマトグラフィーを使用した。

部分的に純粋なＮ−ＤＳＫを０．１Ｍトリス中、Ｈ７，
５でイオン交換樹脂に適用した。Ｎ−ＤＳＫ　７．０．
１　Ｍトリス、１．ＩＩ　７．５　（出発緩衝液）およ
び０１Ｍトリス、ＰＩＩ　７．５でつくりかつさらに０
．３　Ｍ　ＮａＣ１（限界緩衝液）を含有する線状塩勾
配でカラムから溶離した。精製工程の任君の段階からの
Ｎ−ＤＳＫまたはＮ−ＤＳＫ菖−有画分は、凍結乾燥に
より決して濃縮しなかった。

フィブリンダルのトロンビン〔人トロンビン、３００Ｏ
ＮＩＨη１位／タンパククｊｌｌ　ｍｑ　（Ｓ　ｉｇｍ
ａ　＊Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＬ）　）　］およびバトロ
キソビン〔ツ乙工２０バトロ＝ｖ’ソビン単位／　ｉ’
ＩＪ’、　ｆｉＪ　７夜１　ｍｌ（Ｐｅｎｔａｐｈａｎ
ｎＬｔｄ、＊　Ｂａ１ｓｅ＋５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）
　〕分解から（ＴＡＮ−ＤＳＫ粋よび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
を各々Ｗ、、１製した。フイプリノーケゝン１ｒｉ　’
（ｉ’ｊ、を、Ｋｏｅｈｎ　ａｎｄ　Ｃａｎｆｌｅｌｄ
＋１９８−１．に記載の如くしてつった。５単位／ｍｌ
（トロンビンまたはバトロキソビン）を添加して凝固を
開始し、３７℃で約６時間分解を続けた。

ＣＮＢ　ｒ分解および続くすべての単離手１１ｈ’ｉは
、Ｎ−ＤＳＫの場合と同じであった。また、（１’）Ｎ
−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから直接調製した。Ｎ−ＤＳＫの
溶液（０，５−１，０ｍ９／ｍｌ　）を０．１５　Ｍ　
ＮａＣ４を含有する０、１Ｍトリス（ｐｉ（７，５）で
つくり、これらの溶液を２つの等しい部分に分割した。

トロンビン（ｌ　Ｑ　ＮＩＨ単位１　ｍｌ　）を１つの
アリコートに添加し、勿容量の生理的食塩水をもう一方
のアリコートに添加した。両サンプル共３７℃で４時間
項ｍｌし、その後、高特異性トロンビン阻害剤１）−Ｐ
ｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａ１ｉ
ｆｏｎｉａ　）のアリコート（１０ｔｔｅの０．９　Ｘ
　１０−’　Ｍ原液／分解液１ｍ／りを両サンプルに添
加した。フイプリノペプテドＡ　（ＦＰＡ）およびフィ
グリノベゾチドＢ　（Ｆ’ＰＢ）ラジオイムノアッセイ
を用いてトロンビン分解産物を測定する。

ｌＭＣ０Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ、　（ストッ
クホルム、スエーデン）から供化されるキットおよび方
法を用いてＢ′ＰＡ４１１Ｉ一定を行った。Ｆ”ＰＢ検
定は、Ｂ１１ｅｚｉｋｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、　＋　Ｊ、
ＣｌＩｎ、Ｉｎｖｅｓｔ＋　５６　＋４３８−４４５．
１９７５．の方法により行った。

Ｎ−１）ＳＫの、１１１お、Ｌびフィブリノーケ゛ンの
！ラスミン分１９’（産物を前述の如くして１ｉｌｊＪ
　製した（ＩｌｌｏｍｂＭｃｋ５８０６−５８２０　＋
　１９７３　：Ｇａｒｄｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ。

Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、　１．３７１−３８８　、１
９７２）。

４中々の技術を用いてＮ−ＤＳＫおよびその関連フラグ
メントσヰ１＋ｔ　ｒｗゲ（１川定した。！０８４Ｂヒ
ユーレットー・やッカード（楔体クロマトグラフィーを
用いて分析および分１１１！クロマトグラフィーを行っ
た。

カラムお、Ｌびクロマトグラフィー条件は、Ｋｏｅｈｎ
ａｎｄ　Ｃａｎ口ｅｌｄ＋Ａｎａｌｙｔ、旧ｏｃｈｅｍ
−１１６，３４９−３５６，１９８１、に記載されてい
るものと同じであった。Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体の
エレクトロイムノアッセイは前述と同様であった（Ｋｕ
ｄｒｙｋｅ　ｔ　ａ　ｌ　、＋　’１）ａｌ出、１９８
２　）　。、Ｎ−ＤＳＫ抗血清（２４１６）を熱グル溶
液と混合して約０．４チの抗血７Ｎδ度とすることによ
りグルをつくった。グル電気泳動およびアミノ酸分析は
、６己載された通りであった（　ＢｌｏｍｂＭｃｋ　ａ
ｔ　ａｌ、＋Ｊ、ＢＩｏ１．Ｃｈｅｍ。

２４８．５８０６−５８２０．１９７３　；Ｈｅ５ｓｅ
ｌ　ｅｔａｌ、＋　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　
９８　＋　５２１−５３４　＋１９７９）。

ジスルフィド結合Ｎ−ＤＳＫ　、　（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫお
よびψ）　Ｎ−ＤＳＫは、第１図に示すように、ＳＤＳ
の存在下７％アクリルアミドグル中でわずかであるが検
出用能な移動度差を示した。還元後、ＳＤＳの存在下１
０％アクリルアミドグル中で各フラグメントの鎖につい
て特性帯・ぐターンを得た（図示せず）。

すなわち、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはＡα鎖
の移動度のみが異なっていた。Ｎ−ＤＳＫと比較すると
、還元（Ｔ’）Ｎ−ＤＳＫはＡαおよびＢβ鎖の両方に
ついて異なる移動度を示した。これらの観察は他の人々
によって報告されているものと一致した（Ｈｅｓｓｅｌ
＋Ｄｏｃｔｏｒａｌ　ｔｈｅｓｉｓ、　Ｃｈｅｍ、Ｄｅ
ｐｔ、ＫａｒｏｌｌｎｓｋａＩｎｓｔｌ　ｔｕｔ＠＋　
Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ　ｒ　Ｓｗｅｄｅｎ＋１９７５　；
Ｈｅ５ｓｅｌ　ｅｌ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ−＋９８　＋　５２１−５３４．１９７９）。各々
の成分フィブリノ４プチド含扇を測定するために、３つ
のＮ−ＤＳＫ種をトロンビンで処理した。この後、各分
解液を９チドリクロル酢酸に６周節し、もしあればトロ
ンビン分解ペプチドを、前述したように５ｅｐ−Ｐａｋ
　Ｃ１Ｂカートリツジに吸着させて上澄み液から単離し
た（Ｋｏｅｈｎ　ａｎｄ　Ｃａｎｆｌｅｌｄ、前出、１
９８１）、その後、第２図に示すように、ペプチドを高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によシ同定し
た。

ＦＰＡおよびＦＰＢ共Ｎ−ＤＳＫから放出された（第２
ａ図）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫのトロンビン分解物から取得
された主要ペプチドはＦＰＢであった（第２ｂ図）。

グルｒ　Ｊ（Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫをトロンビンで２回分解
した場合、ペプチドは放出されなかった。

Ｎ’−ＤＳＫの成分鎖は１０％アクリルアミドグルで単
−帯を示し、すでに記載されたものと一致するアミノ酸
組成を示した（　ＢｌｏｍｂＭｃｋ　ｅｔ　ａｌ、ｒ前
ｔｊ己　＋　１　９７２　；　１９７３　；Ｈｅ５ｓｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、＋前ｄ己　、１９７９）。

次のようにしてプラスミノ−ダン含有フィブリノ−ダン
溶液を活性化することによりペプチドＢβ１−４２を調
製した。ｌＭＣ０フィブリノ−ダン（Ｌｏｔ　Ｆ−１７
１）を０．０５Ｍトリス（ｐ”７．４）中で約４．０１
１９１ｍ１１１１度に希釈した。１００Ｕ／ｍ／のスト
レプトキナーゼ（Ｌｏｔ　１１２Ｆ−０３７３）、４５
００Ｕ／固体１ｍ９、　Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉａ
＋ＭＯ〕を添加後、３７℃／６０分で分解を進行させた
。

この後、６０℃／３０分で加熱することにより非分解フ
ィブリノ−ダンのほとんどを沈殿させた。

遠心分離後、上澄み液を５ｅｐ−Ｐａｃ　ＣＡＢカート
リッジ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｌａｔｅｓ＋Ｍｉｌ
ｆｏｒｄ＋ＭＡ　）に通した。ＢＩ３−４２を含む吸７
！＃ペプチドを５０チアセトニトリルを用いて溶離した
。その後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いてＢＩ３−４２ペプチドを精製した。カラムおよ
び手順は、Ｋｏｅｈｍ　＆　Ｃａｎｆｉｅｌｄ、Ａｎａ
ｌｙｔ、ＢＩｏｃｈｅｍ。

１１６．３４９−３５６．１９８１．に記載のものと実
質的罠同じであった。

ストレプトキナーゼ活性化の結果としてフイブリノーダ
ンから放出されたペプチドは、非常に複雑なＨＰＬＣ、
、ｐターン（図示せず）を示した。ＨＰＬＣ画分の免疫
反応性を前述のように（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔａｌ、前出
、１９８２）Ｂ１０５−−４２ラジオイムノアツセイで
遺留することにより、幾つかの反応性ピークをイ（）だ
。これらの両分の１つを分取ＨＰＬＣ操作で単離した。

第９ａ図に示すように、両分１６またはその近くで的−
４［するピークはＢｉ１２−４２に対するラビット抗血
清と反応した。この机面ｍはＢ１０５−．４２とＢ１０
−４２を区別しないのでこれらの結果は予期された（　
Ｋｕｄｒｙｋ　ａｔ　ａｌ、。

１）ｆＪＩＨ、１９８２）。この同じ′吻Ｊ１１ｉｌ　
Ｂ１０−４２のアリコートな人トロンビンで分解し、同
じ条件下でｉｔ＜びクロマトグラフィーにかけると、８
４’ｚ　９１）図に７Ｊ・す・（゛ターンがｌ′己４都
された。トロンビンづ）角′ｒの結ｊｌｊとして、第９
ａ図にノＪ（すピークは哨失し、２つの′１ｊ１シいピ
ークが月−７わＪした。これらのピークの１つは画分６
−８また（４、その近くでｉ７仝離し、Ｂ１０５−．４
２イムノアツセイで反応した。この物質はＢ１０５−．
４２として同定され、ｌ　４　Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合
でＢ１０−４２のトロンビン分解から生じた。ｆｌＰＬ
Ｃにより同じ条件下で分離した場合、ｌＭＣ０標準Ｂβ
１５−４２もこの位置で溶離した（図示せず）。画分２
１またはそのイτ」近で溶離する第２のピークはＦＰＢ
と同定された。これは、ＨＬＰＣ系におけるＦＰＢ標準
の公知溶離位置から確認された。さらに、画分２１ピー
クはＦＰＢラジオイムノアッセイで反応した（図示せず
）。

ペプチドＢβ１５’−４２はｌＭＣ０から得または前述
したように人トロンビン〔３００ＯＮＩＨ単位／タンパ
クＪ　ｌ　ｍ’ｉ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋Ｍ
Ｏ］で分ｌＩノ・「することによりＢ１０−４２から直
接調製した。

後者の方法では、Ｂ１０−４２を０．２　Ｍ　ＮＨ４Ｈ
ＣＯ。

ｃｐｒｓ　ｓ、　ｏ　）　ＶＣ７ｕ解し、３７℃／９０
分で分ｉＷを行った。この後、高特異性トロンビンｌ〕
ｌＩ害剤Ｄ−Ｐｈ’ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＩＩ２ＣＩ
　（Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ−Ｂｅｈｒｉｎｇ＋Ｓａｎ
Ｄｌｅｇｏ、　ＣＡ　）のアリコート（ｌ　ＯｔｉＢの
０．９　Ｘ　１０−’ＭＩｌｉＸ液／分屓欣１ｍｇ）を
添加して分解を停止した。

例２＝モノクロナール抗体の産生 ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生ずるために、ＢＡ’ＬＢ／ｃ
Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ目ｅｓ、
Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ＋ＭＥ、）の各々に、Ｎ−ＤＳＫ
　Ｉｒｉ　液（４ｍｑ　／　ＩＩ＋／　）のエマルシコ
ンＱ、　ｌ　ｍ／および’ｙ’５”ｆｉ、４１；の完全
フロインドアジユバントへ′１１（とＩＦｉ；内（、Ｌ
ｐ−）注射して免疫した。ハｑＡｂ／Ｔ’２Ｇ＋を産生
−Ｊ−るために、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの名々に、１０
０１ｔ＆　（’ｌ”）　Ｎ−ＤＩを完全フロインドアジ
ュバントと混合したものをｉ、ｐ、注射して免疫した。

両方の吠１合共、マウスに１悶問おきに同じ投与用゛（
不完４フロイン［・アジ−パントを用いて）を４回追加
注射した。ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合、１０＋’ｄ
ｌｉ１体止抜、トリス−生Ｊ１．ｊ的食塩水中１００μ
ＩのＮ−１）Ｓｌ（Ｑ用いて！＋ｉｌｌ物の１１Ｍ腔内
（ｉ、ｖ、）に追加ｆ１：射した。ＭＡ　ｂ／ｒ　２　
Ｇ　ｌ産生の場合、最初の注射ｉ　ｓ　、（ｉｚ　５　
Ｊ’Ａ間してトリス−生理的食塩水中１００μｇの（’
Ｉ）　Ｎ−１３ＳＫを１１）加圧射した。両方の場合共
、３日１表にマウスから１１卑）１蔵を４１：（出し、
組織をステンレス汁１１金網から押し出してη’　ｉＭ
ＩＩ　ｉｈ懸ン蜀液をつくった０ 両方の場合共、ｎ用胞融合は、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎ’ｄ
Ｍ目５ｔｅｌｎ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、＋　６　
＋　５１１−！５１９　。

１９７６、に記載の方法によりイ］った。１１豊′４ｉ
１　＋Ｉ：礼を、ｐｐＭ’ｔ　ｌ　６４０培地（ＧＩＢ
ＣＯＬａｂｓ＋Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄＮ、Ｙ、　）
で３５％ポリエチレングリコールｌ　０００（Ｋｏｃｈ
−Ｌｉｇｂｔ　Ｌａｂ＋ｚＣｏ１ｍｂｒｏｏｋ、Ｕ、Ｋ
。）中で骨髄１ｈｌｊ細胞［：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３〕と４　：　１　（ＭＡｂ／１−８ｃ６）　ｔたは７
　：　１　（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｇ　）の割合で室温で１
分間融合させた。細胞を小球形にし、洗浄し、そして１
０％ＮＣＴＣ１０９（ＭＡバイオゾロダクツ、Ｎａ１ｋ
ｅｒａｖｉｌｌｅ＋　ＭＯ）および２０係ウシ胎児血清
（ステリルシステムズ、Ｌｏｇａｎ、　ＶＴ）を金石す
る２１５ｍ／ＲＰＭ１１６４０に再温りふｊさせた。正
常牌細胞（ｌＯ）を支持細胞層として添加した。湿温し
た５％Ｃ０２雰囲気中、３７℃で一晩培養後、ヒポキサ
ンチンーアミノプテリンーチミジン（ＨＡＴ　）培地（
Ｌｌｔｔｌｅ’ｆｉｅｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ、　１４５
　ｒ７０９−７１０．１９６４）を添加してＨＡＴ選択
を開始した。５　％　ＣＯ２中、３７℃で一晩培養後、
９６−ウェル培地プレート［コースタ−３５９６（Ｃａ
ｍｂｒｌｄｇｅ　、ＭＡ）　］で限界希釈を行って前記
ＨＡＴ培地中の細胞をクローン化した。ノ・イブリドー
マクロ−７を１６１」間培仔し、次いで培地の抗体を検
定した。

ハイブリドーマ培地のノ（１）初のテストは、Ｅｎｇａ
ｖａｌｌ、Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　Ｉｎ　ｇｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　＋　７０（ＰａｒｔＡ）　＋　４１９−４３９　
＋　１９８０　＋Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ＋Ｎ、Ｙ、のＥ
ＬＩＳＡ方法により行った。クローン培地液をポリビニ
ルミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ＋Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ、ＭＡ、）上でスクリーニングした。各つｘ　
ルハ６　個の抗体：フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳＫ。

（ｒ）　Ｎ−ｒ）ＳＫ　、　Ｎ−ＤＳＫ　（７）　Ａ　
（１１−５’１、ＢＩ３−１１８またはｒ　１−７８　
釦の１つを、Ｎａ　２　Ｃ０３Ａａ　ｆＩＣＯ５（ｐＨ
９，６）巾約５−１５　ｔＪ／ｎｅの飽度で含有した。

未希釈クローン培地液のアリコートを６個の「抗原」ウ
ェルの各々に添加した。培養・洗浄サイクル後、マウス
免疫グロブリン（ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ
＋Ｗｅｓｔｂｕｒｙ＋Ｎ、Ｙ、　〕試薬に対する被ルオ
ギシダーゼ結合ラビット免疫グロブリンを適当に希釈し
たものを添加した。Ｈ２０２−ｏ−／７＝シ六溶液を用
いて酵素結合ＩｇＧ結合を検出した。ＭＲ５８０マイク
ロエリサオートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ＋ＶＡ、　）を用いて色強度を自
動的に測定した。

検定可能な抗Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストした１８２
のハイブリドーマクローンの中で、１つ（ＡＴ’ＣＣＨ
３８４１ｓ　）は、抗原（Ｎ−ＤＳＫ　）とはかりでな
く、無傷フィブリノ−ダン、（Ｂ）　Ｎ−ＤＳＫ　。

ＢＩ３−１１８およびＢＩ３−４２とも反応する抗体を
きわめて高濃度で産生じた。１０％ＮＣ’ｌ’Ｃ１０９
および２０チウシ胎児血清を含有するＲＰＭｌｌ　６４
０でハイシリドーマを培養することによシ、各社のＭＡ
ｂ／１−８ｃ６を得た。

その後、半飽和硫酸アンモニウムで沈殿させてＭＡｂ／
１−８ｃ６を精製し、第２沈殿から得られたＩｇＧを０
．０２％ＮａＮ５を含有する０、１Ｍトリス（ＰＦ量７
．５）に溶解した。最終溶液は培地の最初の容量の１／
１０であった。ＩｇＧクラスの測定を、ラビット抗マウ
ス免疫グロブリンクラス−特異性抗血清（Ｌｉｔｔｏｎ
　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏ
ｎ＋ＳＣ）を用いでオフテルロニー法によりテストした
。第３し１に示Ｉ−ように、ＭＡｂ／１−８ｃ６はＩｇ
Ｇ、抗血清とのみ反応した。抗体のＬ　ｌｆｊクラスは
測定されなかった。

抗（Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストンた１６３２
のハイブリドーマクローンの中で、２４７のクローンは
そのような抗体を非常に高？ｂ度産生じた。また、これ
らのクローン１１′？地色のほとんどはＮ−１）ＳＫお
よびフィブリノ−ダン被１”ｔｔプレートと反応した。

しかじなメンζら、クローン’ｌ”２にｌは、ｎ：Ｉ　
３Ｉｌｉの３４中・ｊ、白のものをｔｔ！Ｆ扮した７°
レートすべてと結合するイ１１１に、帛ｊリイした　Ｉ
ＩＩβ１５−４２リガンドとも結合する抗体を産生じた
。（・ｐ々のり差反尾、性を有するために、’ｒ２ＧＩ
は？（１′、合クローンと３−１なさ！１、したがって
、サブクローン化した。クローンｆ１″：　Ｊ、Ｌ　４
’？イノいテストした９６の中で単−蘭クローン（Ｔ２
Ｇｌｓ）は、ＥＬＩＳＡＩＣｕ：す、（１’）　Ｎ−１
）ＳＫ　（Ｂ（４’ｉ）デＬ／　−）　ト反応するばか
りでなく、溶九了した　１１３β１５−４２と結合−ず
イ】ことも出来る抗体を分ｌビ・することが判明した。

サブクローン化後、１０チＮＣＴＣ１０９および２０％
ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０中でクロー
ンＴ２Ｇｌｓの大１ｉ培養物を調製した。このハイプリ
ドーマの廃培地に蓄積した抗体［ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ＋＋
）を半飽和硫酸アンモニウムで沈殿させることにより精
製し、第二沈殿から得られたＩｇＧを０．０２％Ｎａ　
Ｈ５を含有する０、１Ｍｌリス（ｐＨ７，５）に溶Ｍし
た。最終溶液は培地の最Ｗの容ｉｉｔのｌ／１０であっ
た。前述したようにオフテルロニーテストにより測定し
た際、ＭＡｂ／ｈｒ２Ｇ　Ｉ　ｓはＩｇＧ１抗血７ｒｆ
とのみ反応した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ　ｓ　Ｏ）　Ｌ鎖り
ラスは６１す定されなかった。

対する４’ケ異性 前述したようにハイブリドーマクローン１−８ｃ６（Ａ
ＴＣＣＨＢ　８４１８　）からの最初の培１ぐ液を、Ｎ
−ＤＳＫまたは前述した関連構造体のいずれかをａ＋＊
したプレート上でＥＬＩＳＡによりテストした。Ｎ−Ｄ
ＳＫ　。

フィブリノ−ダンまたはＢＩ３−１１８をイ］するプレ
ートで強いプラス反応がイ４ｊられた。ＥＬＩＳＡおよ
びラジオイムノアッセイの両方を用いて競合免疫検定法
によりＭＡｂ／１−８　ｃ　６の特異性をさらに検討し
た。ＥＬＩＳＡは二段法であった。ミクロタイタープレ
ートに、ＢＩ３−１１８（５μｆｌ／ｍ１Ｊ）を＋４℃
／１６ｈｒで被ｉ’！ｊ　Ｌ、た。ＭＡｂ／１−ｓ　ｃ
６をＴＰＢＳ　（洗剤トウィーンを含有する・燐酸塩緩
ｔｉ＋Ｕ生理的食小水）中で希釈し、Ａ４９０／’　０
分値を１，５−２０とした。この抗体希釈液を標ｉ、Ｇ
’ｊ　（ＢＩ３−１１８）または他の所望の競合抗原と
混合し、プレートに添力１比だ０洗浄後、同相に結合し
たＭＡｂ／ｌ−８ｃ６の…を、前述した酵素抗免疫グロ
ブリン結合基質および色原体浴液（例３）を用いて検出
した。これらの検定法で、ＢＩ３−１１８、Ｎ−ＤＳＫ
　オヨび無傷フィプリノーケゝンはＭＡｂ／ｌ−８ｃ５
と反比、することが判明した。ぐｉ”）Ｎ−ＤＳＫ、　
Ａα１−５１およびγ１−７８は、検出に用いた各々の
溶液が■３β１−１１８、Ｎ−１）ＳＫまタハ無１易フ
イブ！Ｊ／−ケ°ンと比較して約１００Ｘモル過剰であ
ったＫもかかわらず反応しなかった。Ｎ−ＤＳＫ　ｔた
は無傷フィブリノ−ダンを波峰したプレートを用いたＥ
ＬＩＳＡで同じ結果が得られた。

ラジオイムノアッセイでは、リガンドは１２５Ｉ−ＢＩ
３−１１８であった。　Ｉ−ＢＩ３−１１８は人フィブ
リノーダンからのＢＩ１５−４２の沃素化について述べ
た方法を用いて調製した（１（ｕｄｒｙｋｅｔａｌ、ｒ
ＪｉＪυ３，１ｃ＋８２）。１２造業者（Ｗｅｌｌｃｏ
ｍｅＤｉａｇｎｏｓｔ１ｃｍ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｔｒ
ｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ＋ＮＣ）により略述された示唆
に従って５ａｃ−Ｃａｌ　（Ｏバ抗マウスセルロース懸
濁液）を用いて結合リガンドを分離した。ラジオイムノ
アッセイは、４つの区分からなり、２つの別々の培養時
間を含むものであった。検定手順は、前述したリガンド
および第二抗体を除いて、最近記載（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅ
ｔ　１１１．１前出、１９＆２）のものとほぼ同じであ
った。

ＭＡｂ／１−８　ｃ６および５Ｂｃ−Ｃｅｌの適当な希
釈液は１２５１−ＢＩ３−１１８リガンドのほぼ９０チ
結合することが出来た。ラジオイムノアッセイでは、こ
れらの試薬の希釈液はコールド競合抗原の不在下でりが
ンドの約４０％結合をもたらすように選ばれた。これら
の実験で、ＭＡｂ／１−８ｃ６の代りに緩１１１ｊ液呼
たは対１１ベクローン培Ｊｔ　ｒ［Ｊ、から単ｒ＋：ｆ
　シたＩｇＧを用いた」ぢ合、りがンドの非４’４＋異
性結合は５チを超えなかった。りがンドのｔ詩興性結合
は、ソＶ冷Ｂβｌ−１１８の：１；を増大さぜることに
より徐々に阻１１−された。１１〜４１５４＋に示すよ
うに、約５　Ｘ　１０　Ｍ＜（、’、”、度でリガンド
結合の５０係阻止率が得られた。フィブリノ−ダン、Ｎ
−ＤＳＫおよび（Ｂ）　Ｎ−１）ＳＫはすべて強い競合
を示した。第４図において、Ｎ−ＤＳＫは無１易フイブ
リノーダンおよび（［３）Ｎ−ＤＳＫに比較して幾らか
弱い競合抗原と思われる。しかしながら、その後の実験
で、異なるロットのＮ−ＤＳＫを用いた場合、フィブリ
ノ−ダンおよび（Ｂ）Ｎ−１）ＳＫと一致する１ｊ［１
止曲線が得られた（図示せず）。比較すると、（′ｌ１
ｌＮ−ＤＳＫは第４図に示す濃用帆囲では競合せず、し
たがってＭＡｂ／ｌ−８ｃ６により結合されなかった。

このことは、テストしたあらゆるロットの（Ｔ）Ｎ−Ｄ
ＳＫで見られた。（ｒ）　Ｎ−ＤＳＫとのわずかの競合
が検出されたが、しかし１０　Ｍより大きいｇ！！度に
おいてのみであった。

トロンビンの公知のｌ特異性およびＢＩ３−１１８と（
Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ間のＭＡｂ／１−８ｃ６との反応性の差
から、ＢＩ３−１１８をラジオイムノアッセイで競合抗
原として使用するためにトロンビンで分解した。

第５図に示すように、トロンビン分解後Ｂβｔ−１ｉｓ
では移動度に明確な変化が認められた。これは、ＳＤＳ
の存在下７％およびｌＯ％アクリルアミドケ９ルの両方
で認められた。この移動度変化は、Ｈｅ５ｓｅｌ　ｅｔ
　ａｌ−＋前出、　１９７９　、により報告されている
発見と一致し、したがって ＢＩ３４Ａｒｇ　−１５Ｇｌｙ結合のトロンビンによる
分解を反映している。第６図は、トロンビン分解前後に
ＢＩ３−１１８で得られた競合曲線を示す。

明らかなように、非分解Ｂβｌ−１１８で得られる同じ
阻止率を達成するには、約２０００モル過剰の分解鎖が
必要であった。純ＦＰＢ、Ｂβ１５−４２またはこれら
２つのペプチドの混合物は、ラジオイムノアッセイにお
いて第６図に示す濃度範囲では競合しなかった。

ＢＩ３−１１８に対する反応性の差およびＢＩ３−１１
８が多重鎖構造の一部である場合の前記差は、ＭＡｂ／
１−８ｃ６が対象メするエピトープがフィブリノ−ダン
および関連ジスルフィド結合フラグメント上で表１ｎ１
配向されている場合のみ十分反応性であるという事によ
ると思われる。

第６図に示すように、ＢＩ３−１１８鎖がトロンビンで
分解された場合、ＢＩ３−１１８反応性のほとんどは失
われた。この結果は、（Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫ　。

遊離Ｂβ１−１．４　（ＦＰＢ　）ならびにＢｉ１２−
４２がＭＡｂ／１−８ｃ６と反応４ることが出来なかっ
たという事実と相俟って、この抗体がトロンビン感受性
Ｂβ１４　Ａｒｇ　−１５Ｇｌｙ結合中寸たはその周囲
のエピトープに向うということを明示するものである。

ＢＩ３４　Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合がトロンビンにより
完全に分＋１１＋１；された場合、ＢＩ３−１１８およ
び関連構造体によるすべての免疫反応性は完全に失われ
る。

Ｎ　５　：　ＭＡｂ／Ｔ２ＧＩ　Ｓの１１与異性ＭＡｂ
／’ｒ　２Ｇ　Ｉ　ｓ　ノ’ｆ５５’４性をｇＬＩｓＡ
法によりテストした。ミクロタイタープロレートに、（
Ｔ）　Ｎ−１）ＳＫ（０８μｇ／　ｍｐ　）な＋４℃／
１６時間で′＄覆した。

ＭＡｂ／’ｒ　２　Ｇ　ｌ　ｓをＴＰＢＳ中で希釈して
Ａ４９０／　５分値を約１６とした。この抗体希釈液を
所望の競合抗原の希釈液と混合し、プレートに添カｌ比
だ。洗浄後、固相に結合した抗体を前記と同様にして（
例３）検定した。

ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ／”ｒ　２Ｇ　ｌ　ｓは（
Ｔ）　Ｎ−ＤＳＫ　ａｌ覆プレートと強く反応した。こ
の抗体は溶解したＩＢβ１５−４２すがンドとも結合す
るので、グレート上にベゾチドを被栓ンし、ＭＡｂ／Ｔ
２Ｇ１ｓがそのようなグレートに結合することを証明す
る試みを行った。これらの実験で、前述のカップリング
緩衝液でＢｉ１２−４２ペプチドの原液（０，０５−０
，１μｍ７ｍ１　〕をつくった。これらの溶液を被ゎｌ
したプレートは、ＭＡｂ、／’ｒ　２Ｇ　ｌ　ｓと特）
４的に結合することが分った。トロンビン分１’ｌ’ｒ
Ｂβ１−４２を破覆したグレートで同様の結果が得られ
た。

ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　ｌ　ａは、ＢＩ３−４２を被覆したプ
レートと結合しなかった。第１０図は、（Ｔ）　Ｎ−Ｄ
ＳＫ　Ｉ！覆プレートおよびＭＡｂ／ｌＮ″２Ｇ１ｇを
用いた競合的ｇＬＩｓＡ実験の結果を示す。用いた競合
抗原はトロンビン分解前区のＢＩ３−４２であった。

Ｂｉ１２−４２−”；’チドはトロンビン分）ノｆｒＢ
β１−４２で見られるものと同じ競合曲線を与えた。

捷た、ＭＡｂ／／′ｒ２Ｇｌ　ｇの特′１り件を検Ｊ目
−るためにラジオイトノアソセイを用いた。用いたりガ
ントは＋２５１，３β１５〜４２であった。１２５１Ｂ
β１５−４２は′す−Ｃに述べた方′Ｌ）−、（Ｋｔ＋
ｄｒｙｌｃ　ｅｔ　ａｌ　、ｒ　ｆｉｉＪＬｌ−１＋１
９１（２）を用いて調＋ｐ’：　１．た。ｊｐＪ箔業者
（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｉ）ｉａｇｎｏｓｔｌｃｓ＋　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ’ｒｒｌａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ、ＮＣ）
により略述されている示Ｉ（旬に【）ｒい５ａｃ−Ｃｅ
ｌ　（ロバー抗マウス免疫グロブリンセルロース）間開
７１％、　）を用いて結合リガンドを分１′１′１１シ
た１、ラノオイｌ、ノア、セイは４つの区分から／「す
、２．冗）別々のインキュベーション時間を會み、＋用
、？ｌ：しΔソ［１４’？（性［ＭＡｂ／［’２Ｇｌ　
ｓ　］および第二抗体を除い−Ｃ、＋’ｌ＞　；ｌ−の
記載（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ−＋煎−串−１１９８
２　）のものとｔ；Ｌとんど回じであった。

抗体１．・よび・；１、−二Ｉ：Ｉ’ｌ’、体（５ａｃ
−Ｃｅｌ）の適当な希釈（’Ｈ’ｔ　ｆ　ｔ、、ｙ’、
！ｒＮ’、”＋：Ｊ！ｉｊ）不ｒｌ：　Ｆ’−ｒ１２”
ｒ　＋３βｌ　５−４２　＋）ノｆンドの４．’）　、
ｉ　ｏ％結合を！うえるように選んだ。第１１１％ｌに
示すように、このりがンドの結合ｉｆコールド」Ｂｉ１
２−４２０．′−；べらの鼠に増大させることにより阻
害された。約２　Ｘ　ｌ　ＯＭ　ｒｍＪＩＢ＝で５０係
置換水ｆ■が得られた。トロンビン分７將Ｂβ１−４２
および（’Ｉ’）　Ｎ　−Ｄ　Ｓ　Ｋで同じ阻止４Ｓが
見られた（図示せず）。無傷Ｂβ１−４２、Ｎ−ｒ）Ｓ
Ｋおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはもしあってもほとんどｌ５
１１止率をメＪテさなかった。異なるロットのＩ　ＭＣ
Ｏフィブリノ−ダンはわずかの阻止率を示した。しかし
ながら、Ｂｉ１２−４２のリガンド最大置換対無傷フィ
ブリノーケ゛ンのそれとを比較するモル比は１　：２５
０程度であった。

第１Ｏ図および第１１図に示すデータに基いて、前記結
果をり丁に説明する。ＦＰＢは１３β１−４２の一部で
ありかつ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよびＢＩ３．５−４２の両
方から欠除しているので、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｇとフィブ
リノ−ダンまたはそのフラグメント間の免疫反応性には
、すべての抗原において結合Ｂβ１４−Ａｒｇ　１５　
Ｇｌｙの前分解が必要であると７１１！ｊわれる。

第１１図に示すように、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　ｌ　ｓと力１
［傷）ィプリノーグンでわずかであるが測定可能な交差
反応が４、υ出された４、すでにス７トベたように、こ
れは幾つかの′１１ｙなるロットのｌＭＣ０フイシリフ
ノーダンの」易イ１にｊ！３７　ｔ＋４された。これに
対する１つのｉ）１．明は、そのようなフィブリノーケ
゛ン調製物が溶解して残るある少１．１０フイブリノ一
ケ°ンーフイプリン複合体としてｉ、ｓ　イｊ　Ｉ−Ｃ
いるということで・ちる［　５ｈａｌｎｏｆｆ　＆　Ｐ
ａｇｅ　＋　１９６２　〕ｏそのような調製物のＮＨ２
未☆：に分析で少ト、４のグリシンがほとんど常に検出
されるという１１実がこれを支持している。

このアミノ酸は、トロンビン作用の結果としてＦＰＡも
土たＦＰＢも放出された場合、新規なＮＨ２末９＃、ｉ
残基である［　ＢｌｏｍｂＭｃｋ　＆　Ｙａｍａｒｈｌ
ｎａ　ｒ１９５８］。

１夕１］４で亦べたように、ＭＡｂ／ｌ−８ｃ６は無傷
フィブリノーダンと冗全に交差反応した。ＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌ＋ａはイ中々のフィブリノ−ダン？ＩＱ　’ＪＪ物
とごくわずかしか反応しなかったので、そのような反応
は恐らくフィブリンの機敏汚染によるものと思われた。

これら２つの抗体のフィブリノ−ダンに対する反応性の
差を比較するために、フィブリノ−ダン被覆ＥＬＩＳＡ
プレートを用いて非常に簡単な実験を試みた。フィブリ
ノ−ダンおよびフイズリンー被覆ＥＬＩＳＡプレートの
調製に際して、■ＭＣＯフィブリノーダン（Ｌｏｔ　Ｆ
　−１５５、４，３ｍ９７　ｍ／）をＮａ２ＣＯ，／Ｎ
ａＨＣ０３（Ｐ）（９，６）中で１７５００に希釈し、
ポリビニルミクロタイタープレート上に＋４℃／１６時
間で被覆した。洗浄、５４　ＢＳＡ　［：　ＲＩＡ級Ｂ
ＳＡ、ＳＩｇｍａ＋Ｓｔ、Ｌｏｕｌｓ＋　ＭＯ：］によ
る１！目止および続く洗浄後、人トロンビン（ＳＩｇｍ
ａ＋Ｓｔ、ＬｏｕｉｓＭＯ〕原液（ｌ　ＮＩＨ単位／ｎ
−生理的食塩水１ｍυ１００μ呑を各ウェルに添加した
。選定した間隔で、前述のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−ＣＨ２Ｃ１原液を等容ｈ１添加してトロンビンを阻止
した。その後の洗浄、反応および結合抗体の検出は、す
でに述べたものと同じであった。

第１２図に示すように、トロンビン溶液で９０秒以下処
理したフィブリノ−ダン被接ウェルにＭＡｂ／１−８ｃ
６を両力［比た場合、かなりのＡ　４９　ｏ１５分値が
得られた。この抗体をトロンビンで９０秒より長い時間
処理されたウェルに添加した場合、色の急激な減少が見
られたが、これは抗体結合の低下を意味した。ＭＡｂ／
Ｔ　２Ｇ　ｌ　ｓで、完全に予知出来る逆の結果が得ら
れた。この抗体を非処理ウェルに両力［比た場合、バッ
クグランドの色のみが観察された。しかしながら、トロ
ンビンに対する暴露時間が増大すると、非常に有意のＡ
４９゜１５分値が記録された。これらの結果は、トロン
ビン分解によりＥＬＩＳＡ　プレートの表１百１にネオ
エピトープが漸次用われることおよびＭＡｂ／’ｒ　２
Ｇ　ｌ　ｓがこのネオエピトープと反応・結合すること
が出来ることを示％ｖしている。

例６　：　ＭＡｂ／１−８ｃ６の臨床的応用ＭＡｂ／ｌ
−８ｃ６の慣異性が確認されたら、臨床研究におけるそ
の有用性を研究することが興味あることであった。この
目的のために、Ｉ根ｌｉｊ症史者から血液透析中選定さ
れた間隔で血液を集めた。捕集および処理はすでに述べ
たものと同じであった（　Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、　２５　＋　２７７−２
９１．１９８２）。フィブリノーケ９ンを１１表後の微
量まで除去するために、患者血漿の凍結乾燥したエタノ
ール抽出液を使い捨て５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ，８カートリ
ツジ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、ＭＩｌｆ
ｏｒｃＬＭＡ）でＫｏｅｈｎ　ａｎｄ　Ｃａｎｆ１ｅｌ
ｄ＋Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ＋１１６．３４９−
４５６．１９８１．の方法によりさらに精製した。

従来の実験で、そのような、書名は、正常の被検者に見
い出される０、　４１　ｐｍｏ　１　ｅ　ｓ／ｍｅの４
０倍以上の非常に高い水準のＢｉ１２−４２免疫反応性
物質を有することが確定された（　Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ
　ａｌ、＋前出、１９８２）。本発明の研究では、この
、壱者群に普通見い出されるＢｉ１２−４２免疫反応性
物質の何チがＭＡｂ／ｌ−８ｃ６と交差反応するかを測
定することが興味あることであった。

フィブリノ−ダンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反応するので
（第４図）、前述した方法（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ
、。

前出、１９８２　）により１ｌ−ｊ製した。＠者の血漿
抽出液を５ｅｐ−Ｐａｋ　ＣＨＩカートリッジでさらに
精製した。

その後、サンプルを２つの部分に分割し、その１１つの
部分をトロンビンで分解した（　９０　ＮＩＨ単位／ｍ
ｇ１３７℃／６０分）。最後に、各サンプルの適当な希
釈液をつくり、例４と同じラノオイムノ゛アッセイで用
いた。

表１は、３人の前者のフィブリノ−ダン、ＦＰＡおよび
Ｂｉ１２−４２免疫反応物ｌＪ１の血”Ａｔ　ｉｆ″１
１度を示す。サンプ０ルは、透析前および１ツタ析プロ
グラム中の２つのＩＩｉシなる時点で敗った。後渚の２
つのサンプルは静脈（出口１ｉ１１　）而・ぽからもの
であった。

各轡者からの１フンυ肖ＪｉＩサンプル中のＦＰＡ　（
、Ｈ１度は、ｌＭＣ０肯定キット（Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓ
ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋旦月１１ジ旦り工ｏ１．，１５，
２５２−２５８．１９８１）を用いた」場合、止′濱の
被検名に見い出される１４±０．６　ｐｍｏ　Ｉ　ｅ　
８／　ｍｌ、水準よりわずかに大きい値であった。３人
の＋Ｊ４　名のうち２人にサンプル２においてＦＰＡの
ＩＩｉ、１；が見られた。３人の、＠ｊ者全部カラのＪ
″＋？＋：、’ｚザンプルはサンプル２に比較して大き
いイ直をンｊ＜した。

これらの結果は、ヘパリン水準が０．５ＩＵ／−より大
きい場合透析の初期段階時ではＦＰＡは正常かまたは正
常に近いことを犀す従来の発見と一致する。へ・母リン
がこの値以下になると、一般にＦＰＡ濃度の増大が兄ら
れた（　Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌＩＡｆｌ
ｔ８．１９８１）。へ・リン治療の効果はこの様にして
検査することが出来る。たとえば、ＦＩ）Ａの血漿水準
の増大は、脈管内のフィブリン沈着をもたらし得る高ト
ロンビン活性の指ｊ、ｌｉとして考えることが出来る。

Ｂｉ１２−４２免疫反応性に関しては、ラビット抗血清
で検出された水準は、正常の血漿で見い出される０、４
１　ｐｍｏｌｅｓ／　ｍｌよりかなり大きかった（　Ｋ
ｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ、＋前出、１９８２）。、轡者
１７２は３つのサンプルすべてにおいてきわめて似た濃
度を示した。これは、特に透析前の水準およびサンプル
３の水準を比較した場合、他の２人の書名ではそうでな
かった。ＭＡｂ／１−８ｃ６で検出されたＢｉ１２−４
２免疫反応物質の濃度は、ラビット抗血清を用いた場合
に見い出されるものと類似していたが、しかし同じでは
なかった。前述したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性から、
これらの結果は、全部ではないがほとんどのＢｉ１２−
４２免疫物質は薪１陽Ｂβ１４　Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結
合を貧有するペプチド上にイイ在することを示唆した。

これは、各サンプルをトロンビンで分Ｍ’＃Ｌ、２つの
糸を用いて再（りｇシ［ニジた史、自、１；１（公的に
Ｓ′１Ｍ＋Ｈされた。ラビット１〕１．血ｔ１１１の場
ｒヤに検出される＋３β１５−４２免疫反応性物質の６
１月αはトロンビン分Ｍ’（＋３ｉｌ後において同じで
・しった。他方、トロンビン分解サンプルにおいてＭＡ
ｂ／ｌ−８ｃ６で非常の少しの免疫反応性物質を１１１
１１　％：’、することがｔ１４来た（データは示され
ていない）。

生体内分解産物のゼト状をさらに特徴づけるため、プー
ルされた。寄渚の血漿から抽出液を調製した。

用いた血漿はｉ４　ｌに示す、１３者を除く数人の書名
からのものであり、透析や釉々の時点で集めた。抽出数
、を、Ｋｏｅｈｎ　ａｎｄ　Ｃａｎｆｉｅｌｄ＋Ａｎａ
ｌｙｔ。

焦りＲＩＰ、す、６，３４９−３５６．１９８１　、に
記載されているような高性能液体クロマトグラフィーで
分別した。その後、画分のＦＰＡおよびＢｉ１２−４２
Ｑ疫反応性について検定した。高１３β１５−４２活性
を示す両分をトロンビンで分解し、その後Ｂβ１５−４
：Ｉｎ定法ならびにＦＰＢ免疫検定法を用いて再分析し
た。第７図に示すように、ＦＰＡは画分１１−１４にお
いて■し得された。

画分５−８ではラビット抗血清およびＭＡｂ／１−８　
ｅ６の両方を用いてＢｉ１２−４２免疫反応性を検出し
た。各画分をトロンビンで分解し、再検定した場合、ラ
ビット抗体では免疫反応性の変化はもしあっても非常に
小さかった。これに対し、他の２つの検定法を用いた場
合、トロンビン分解画分で大きな差が得られた。ＭＡｂ
／１−８ｃ６との免疫反応性が実質的にすべて失われた
。画分５−８ではトロンビン分解後だけかなりの水準の
ＦＰＢ免疫反応性が得られた。画分５−８および１７−
１９ではトロンビン分解前に若干のＦＰＢ免疫反応性が
検出されたことも指摘すべきことである。

すでに説明したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性から、これ
らの結果は、Ｂｉ１２−４２免疫反応性物質のほとんど
がＦＰＢを含有するペプチド上に存在することを示唆し
ている。第７図に示すデータもこの結論を支持している
。すなわち、遊離ＦＰＢより非常に早＜　溶ｊ’ｉｌｔ
するペプチドはＦＰＢ抗血清と特異的に反応した。した
がって、そのようなペプチドはフィブリノ−ダンまたは
フィブリンＩからのみ生じることが出来、フィブリン■
から生じ得なかった。表１および第７図に示すデータに
関してはさらに幾つかの意見を加える必要がある。ラビ
ット抗血７ｆｔおよびＭＡｂ／１−８ｃ６で検出される
免疫反応性物質の水準に関しては、書名５８９からのサ
ンプル２が、モノクロナール抗体でかなり大きい部カ測
定されたことを示す。この１つの説明として、ラビット
抗血清により普通検出出来るあるＢｉ１２−４２免疫反
応性物質はサンプルｎ、■製時に失われたということが
挙げられる。Ｂｉ１２−４２標準は正常または由者の血
清に添加した場合急速な崩壊を受けることはすでに示さ
れている（Ｋｕｄｒｙｋｅｔａｌｌ、Ｆｉｆｌｌｌｊ、
１９８２）。この研究で述べた３つのＢβ鎖関連検定法
の場合、高性能液体クロマトグラフィー画分について多
級の・免疫反応性輪郭が得られた。第７図に示すものは
、プールされた９ノ者血漿からの抽出液を用いた実験結
果であった。他のサンプルのクロマトグラフィーでは全
く異なる結果が得られた。あるサンプルでは、Ｂβ鎖免
疫反応性は、遊離ＦＰＡの近くで溶離する画分にも見ら
れた。これらの結果から、そのような患者はこの報告に
記載の抗体と交差反応し得る多数のペプチドを有するこ
とが明らかである。これら生体内ペプチドの正確な分子
性状の同定は現在研究１ｔている。最後に、これら磨者
の高水準のＢｉ１２−４２免疫反応性物質に関しである
論１ｒを行わなければならない。サンプルｌおよび２で
はＦＰＡ　９度は正常または正常に近かったので、用い
たへ・ヤリン法により３人の、＠者すべてにおいてフィ
ブリン形成が効果的に抑制されたことは明らかであると
思われる。このことならびにＢｉ１２−４２免疫反応性
物質の透析剤水準さえ著しく向上したという事実を念頭
に入れて、これら分解産物のＩｆｌわれだ異化作用の問
題を考慮しなければならない。この点において、ジャー
マンおよび共同者は、幾つかの動物モデルにおいて非常
に多くのフィブリノ−ダン分解産物の回転について研究
した。彼等の結果は、尿２１症それ自体よりは機能性腎
組織の不全はフィブリノ−シン分解産物のクリアランス
の低下に原因があることを示唆した（　Ｈａｙｎｅ　ａ
ｎｄ　Ｓｈｅｒｍａｎ、Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈ１７　Ｌ２
１９−２３６．１９７３　；Ｉｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ
、Ｌａｂ。

ＣｌＩｎ、八１ｅｄ−８７，９３４−９４６，１９７６
）。

表１から分るように、ある史、者は透析時これらの投プ
チドが一様に増加する。これは、初期段階ではＦＰＡ　
（７３度の増加を伴わないフィブリン溶解（ｆｌｂｒｌ
ｎｏｇｅｎｏｌｙｓｌｓ）から生じ得る（　Ｂ１１ｅｚ
ｌｋｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓ
ｔ、　＋５６．４３８−．４４５．１９７５）。

以下余白 １）血液サンプルは透析前（１）、透析に入って２時間
臼（ＩＩ）および各患者を透析器から外す直前、約３時
間後（ｌｕｌｌに採集した。サンプルＩは動脈痕針によ
り取シ出した。他の２つのサンプルは静脈（出口側）血
管の穿刺によシ採集した。

２）前述した（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ　、１９８２
）エレクトロイムノアッセイによシ測定した。

３）、４）　ｌＭＣ０，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｔ
ｄ、＋Ｓｔｏｃｋｈｏ１ｍ＋Ｓｗｅｄｅｎから購入され
るＦＰＡおよびＢｉ１２−４２ラジオイムノアツセイキ
ツトによシ測定した。各アッセイの方法は製造業者によ
シ推奨されたものであった。

５）ラジオイムノアッセイは、Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｋ記載されたものであった。人Ｂ
βｌ−１１８をリガンドとしてもまた標準としても用い
、抗体はＭＡｂ／１−８Ｃ６であった。

前記データに基づいて、ＭＡｂ／１−８Ｃ６は、フィブ
リン溶解（ｆ　ｉｂｒｉｎｏ（ｇｅｎｏ）ｌｙｓｉｓ）
に関連する疾病状態の臨床（ｌＩｆ究において有用な試
薬として役立つと結論される。生体内発生フィブリンの
性状およびその溶解動力学に関する重要な情報は、Ｂβ
鎖標識を測定する免疫検定法を用いることによシ得るこ
とが出来る。

１、４　ｗｍ針をつけたきすのない静脈穿刺によｐ患者
から血液を集めた。最初の２−３ｍ１を捨てた後、続い
て９ｒｎｌの血液を％　１００ＯＩＵへＡリンおよび１
０００ＫＩＵ　）ラシロールを含有するｌＩｎ１の０．
．１５ＭＮａＣｊを含む１２ｄポリスチレン管に直接流
し込んだ。管をただちにプラスチックフィルムに対して
３回逆さにし、３０００−３５００＆、４℃で２０分間
遠心分離した。各血漿サンプルを直接処理するかまたは
一７０℃で保存した。凍結血漿サンプルを３７℃で迅速
に溶かし、次いで直ちに前述の如くして処理した。血漿
処理は次のようにして行った。

３ｍｌプラスチック管中ノ１．０　ｒｎｌの血漿に、１
．Ｑｍｌの冷却（水浴）エタノールを添加した。水浴で
３０分間混合・培養した後、サンプルを前記と同様にし
て遠心分離した。上澄み液を新しい遠心分雌管に移し、
水浴でさらに３０分間保持し、そして再び遠心分離した
。第二の上澄み液を「処理血漿サンプル」とする。

「処理血漿サンプル」からフィブリノ−ダンを最後の微
量まで除去するために、サンプルを、使い捨て５ｅｐ−
ＰａｌｃＣＨ３カートリッジ（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ　５Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ　、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）でＫｏ
ｅｈｎ　ａｎｄＣａｎｆ　１ｅｌｄ　、Ａｎａｌｙｔ−
Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋１１６，３４９−３５６（１９８１
）、の方法によシさらに精製した。

各「処理血漿サンプル」を、競合的免疫検定法：エンザ
イムリンクドイムノアソセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジ
オイムノアッセイによりテストした。「処理血漿サンプ
ル」は、２つの部分−３なわち、ｎβ１−４２の存在の
検出に使用する部分およびｎβ１５−４２の存在の検出
に使用する部分に分割することが出来る。ＥＬＩＳＡを
用いてｎβ１−４２抗原の存在についてテストするため
に、ミクロリットルプレートにたとえばｎβ１−４２ま
たはｎβ１−１１８（５ｔｔ　１１７ａｃ　）を＋４℃
７１６時間で被栓した。ＭＡｂ／１−８Ｃ６をＴＰＢＳ
　（洗剤トウイーン−２０を含有する燐酸塩緩衝生理的
食塩水）で希釈して１．５−２．０のＡ４９゜７１０分
値とした。この希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液
と混合し、プレートに添加した。培養・洗浄後、固相に
結合した抗体を前述（例３）と同様にして検出した。

ＥＬＩ　ＳＡを用いてｎβ１５−４２抗原の存在につい
てテストするために、ミクロリットルプレートにＢハ５
−４２を４℃７１６ｈｒて被覆した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　
ｌ　ｓをＴＰＢＳで希釈して約１．６０Ａ４９０１５分
値とした。

この抗体希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合
し、プレートに添加した。培養・洗浄後、固相に結合し
た抗体を前述（例３）と同様にして検出した。

ＲＩＡを用いてｎβ１−４２抗原の存在について「処理
血漿サンプル」をテストするために、前述した方法（例
４）を行った。リガンドは　Ｉ−ｎβ１−４２゛または
１２５　Ｉ−ｎβ１−１１８であシ、抗体はＭＡｂ／１
−８Ｃ６であシ、第二抗体はロバの抗マウス抗体をセル
ロースに懸濁させたもの、すなわち５ａｃ−ｅｅｌであ
った。（例４）。

ＲＩＡを用いてｎβ１５−４２抗原の存在についてテス
トするために、前記と同じ手順に従った。リガンドは１
２５　ニーｎβ１５−４２テあシ、抗体はＭＡｂ／Ｔ　
２Ｇ　１　ｓであシ、第二抗体は５ａｃＣｅｌであった
。

本発明は、その精神または本質的な属性から逸脱するこ
となく他の特定の形態で具体化１−ることか出来、した
がって、本発明の範囲を指摘するものとして前記明細書
の記載でなく、添付の特許請求の範囲を参照することが
必要である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＤＳの存在下７％ｙＩ？リアクリルアミド
グル中のＮ−ＤＳＫ（１）、（Ｂ）Ｎ　−ＤＳＫ（２）
　、および（’ｌ’）Ｎ−ＤＳＫ（３）の電気泳動パタ
ーンを示す。各Ｎ−ＤＳＫ種の、移動度が示される１、
（ＢＩＮ−ＤＳＫはパトロキソビン誘導フィブリンから
単離し、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから人トロンビ
ン分解により調製した。 第２ａ図、および第２ｂ図は、Ｎ−ＤＳＫ　（第２ａ図
）および（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（第２ｂ図）からのトロンビ
ン分解Ｏプチドの高性能液体クロマトグラフィーによる
分別を示すグラフである。溶離パターンは２０６ｎｍで
の吸光度を測定することにより層た。カラムおよびクロ
マトグラフィー条件は、Ｋｏｅｈｎ　ａｎｄＣａｎｆｉ
ｅｌｄ＋Ａｎａｌｙｔ、Ｂ１ｏｃｈｅｍ１１１６＋３４
９−３５６＋１９８１、に記載のものと同じであった。 第３図は、クラス特異性抗血清を用いるＭＡｂ／１−８
０６のオフテルロニー分析を示す。抗原は正常マウス血
漿（Ａ）およびＭＡｂ／ｌ−８Ｃ６（Ｂ）であシ、クラ
ス特異性抗血清は：抗ＩｇＧ　Ｔ（１）　：抗ＩｇＧ２
ａ（２）：抗ＩｇＧ２ｂ（３）　：抗ＩｇＧ５（４）で
あった。 第４図は、種々の「コールド」競合抗原による１２５　
Ｉ−ｎβ１−１１８リガンドの結合阻止を示すグラフで
ある。ＭＡｂ／１−８Ｃ６の１／４０希釈液を使用した
。 ＭＡｂ／１−８Ｃ６は競合抗原の不在下でリガンドの約
４０チと結合した。非特異性結合は５チ未満であった。 少なくとも５つの異なる実験の平均値を示す。Ｎ−ＤＳ
Ｋの他の２つの鎖（すなわち、Ａα−ト５１およびｒｌ
−７８）でここに示す濃度範囲では阻止が見られなかっ
た。フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫは、２モルのＢβ鎖（フィブリノ−ダンの場合）ま
たはｎβ１−１１８　（両Ｎ−ＤＳＫ種の場合）を有す
る二社体である。したかって、計算に用いた演算分子量
（ｍｏｌ−Ｗｔ−）は各々の実際の分子量の捧第５図は
、トロンビン分解前（ダル１および３）および後（ダル
２および４）のＢＩ３−１１８の電気泳動ノンターンを
示ず。クー゛ル１および２はＳＤＳ　中１０チアクリル
アミドであシ、ダル３および４はＳＤＳ中７中子チアク
リルアミドった。各ダルのＢβ鎖の移動度を示す。 第６図は、トロンビン分解前後における標準量の「コー
ルド」ＢＩ３−１１８による　Ｉ−ＢＩ３−１１８の結
合阻止を示すグラフである。抗体希釈、特異的および非
特異的結合は第４図に示す通シであった０８つの連続実
験の平均を示し、標準偏差を垂直バーで示す。 第７ａ図、第７ｂ図および第７ｃ図は、プールされた（
５．７ｍＡり患者血漿からつくった抽出液を用いて高性
能クロマトグラフィー操作から得られた画分についての
免疫反応性輪郭を示すグラフである。カラムおよび茶件
は第２図に示すものと同じであった。クロマトグラフィ
ー後、アセトニトリルを留去し、各両分を１．Ｏｍｌの
０．２Ｍ　ＮＨ４Ｉ（Ｃｏ５に溶解し、免疫検定法で用
いた。トロンビン分解前後に―分５−８のみを分析した
。ザンプルのＦＰＡをトロンビン分解前のみ測定した。 トノゾ・やネル：商用Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッ
セイキット（ＩＭＣＯＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋Ｌｔｄ
−＋Ｓｔｏｃｋｈｏ１ｍ＋Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる免疫
反応性；中間・臂ネル：ＭＡｂ／１−８Ｃ６で測定した
免疫反応性；底部ノ！ネル：トロンビン後のみの画分５
−８０ＰＰＢ免疫反応性。画分５−８および１　’７−
１９にＦＰＢが見い出された。 第８図は、Ｎｏ５ｓｅｌおよび共同者によシ仮定さ１れ
たトロンビンおよびグラスミンによる生体内フィブリノ
−ダンタンパク質加水分解の図解を示す（Ｎｏｓｓｅｌ
　ｅｔ　ａｌｌＪ−ＣＩｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ−＋６Ｃ１
３７１−１３７８，１９７９、からの修正図）。 第９図は、人トロンビンによる分解前（、）および２後
（ｂ）のＢＩ３−４２ペゾチドのＨＰＬＣ溶離ノ溶離ノ
ンターングラフである。両分の免疫反応性輪郭（陰影領
域）は、　Ｉ−Ｂｉ１２−４２リガンドおよびＢｉ１２
−４２に対するラビット抗血清を用いてラジオイムノア
ッセイによシ得た（Ｋｕｄｒｙｋ　ｅｔ　ａｌ、、前出
、１９８２）。（ｂ）でカラムに適用されたトロンビン
分解ペプチドの量は（、）の場合の約３倍であった。 研究によれば、指摘された両分で抗原の７０チ超を取得
出来ることが分った。 第１Ｏ図は、（ＴＡＮ−ＤＳＫ被俊プレート（０，８ｔ
ｔｇ／ｍｅ）　−およびＭＡｂ／Ｔ　２Ｇ　ｌ　ｇを用
いる競合ＥＬＩ８Ａを示すグラフである。阻害剤はトロ
ンビンによる分解前後のＢＩ３−４２であった。緩衝液
対照ウェル（阻害剤添加せず）のＡ４９０１５分値は約
０．８であった。 第１１図は、Ｉ−Ｂｉ１２−４２リガンドのＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓへの結合の指摘された「コールド」競合抗原に
よる阻止を示すグラフである。（ＴＡＮ　−Ｄ　ＳＫは
Ｂｉ１２−４２４たはトロンビン分解Ｂβ１−４２で示
されるものと同じ阻止曲線を与えた。無傷Ｂβ１−４２
　。 ＢＩ３−１１８　、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
は、図示の濃度範囲で交差反応しなかった。正常の人血
漿を用いた場合わずかの競合が見られたが、非常に低〜
・希釈率で添加した場合だけであった。 第１２図は、トロンビン分解後のフィブリノ−ダン被覆
ＥＬＩ　ＳＡ　ｆレート上における２つの異なるモノク
ロナール抗体の反応性を示すグラフである。 実験ハ、トロンビンを添加した単一プレート（９６ウエ
ル）上で行った。指摘された時点における分解は、トロ
ンビン阻害剤Ｄ−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｐ　ｒ　ｏ　−Ａｎ　
ｇ　−ＣＨ２Ｃ１を添加して停止させた。対照（非分解
）フィブリノ−ダン被覆プレート上のＭＡｂ／１−８Ｃ
６に対するＡ４９０１５分値は約１．７であった。同じ
プレート上で、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｓのみがパックグラウ
ンドの色を与えた。 特許出願人 ニューテークブラッドセンター、インコーポレイテｒド
特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 １　２　３ ＦＩＯ，Ｉ ＦＩＧ、　’５ 、ｉ廁オＳｔ（ｍｌ） ＦＩＧ、　２ａ ３ｓ＊＃ぶ量（ｍｌ） ＦＩＧ、　２ｂ ＦＩＧ、　４ ノ ー０−； ｉｔ、合航原湾庄ｆｌｖｌｌ ＦＩＧ、　６ １　２　３　４ ＦＩＧン５ フィ７ソノーデノ ；匝可仲：：質Ｌ・辱ゲル鞠 ＦＩＧ、　８ ７ｕｌ劃シ側度ＦＭＩ ミ 乙 ニ督ｊ−自１５４量（ｍ（） ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、１Ｉ ＦＩＧ、Ｉ２ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ　、’　識別記号　庁内整理番号優先権
主張　［相］１９８杯１月３日［相］米国（ＵＳ）［有
］５６７４６２手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願　第２３７・６９１号２、発明の名称 モノクロナール抗体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ニューヨーク　ブラッドセンター。 インコーホレイティド ４、代理人 氏名弁理士（６５７９）青水　朗 ６、ｉ内圧の対象 （１）願１の「出願人の代表者」の伐 （２）明細１の「図面のＩ＋１１単な説明」の＜ｔＳ＋
（３）委任状 ７、補正の内存 （１）（３）　別紙の通り　。 （２）（イ）明細書第１２７負第１３行目「・くターン
を示す。」を「パターンを示す図面に代る写真である。 」に補正する。 （ｏ）同第１２８貞第６行目「分伯を示す。−１・　を
「分析を示す図１１１１に代る写Ｊ′ｆである。」に？
山王する。 Ｃ→　同第１２９貞第１１行目「を示す。」をＵ″を示
す図１川に代る写真で４ちる。ｊ＆′（補止する。 ８、添付汀力゛ｊの目録 正願昏　ｌｉｔ拝 、−７〜、任状及び訳文　各１通 （３）上申６　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物骨髄腫系からの細胞と、人フィブリノーケ゛ン
   またはフィブリンＩのＮＨ２末端フラグメントで前場っ
   て免疫された動物からの牌細胞とを融合させ、その後ハ
   イブリドーマを分離し、そして人フィグリノーケゞンま
   たはフィブリンｌのフラグメントに対して単一特異性抗
   体を産生ずるノ・イブリドーマを選択することにより形
   成されたノ・イブリドーマによってｒｉｆｅ生されるこ
   とを特徴とするモノクロナール抗体。 ２０１１記動物がマウスである特許請求の範囲第１ＩＬ
   １に記・１、（のモノクロナール抗体。 ３　人フィブリノーケ゛ンの前記フラグメントがｆ’ｌ
   ｆＪ　ｉｄ人フィブリノーケ゛／またはフィフ゛リンＩ
   をＣＮＨｒで分解することにより形成される特ｉｔ’Ｆ
   　請求の範囲第１項に記載のモノクロナール抗体。 ４、　人フィグリノーケ９ンの前記フラグメントがＮ−
   ＤＳＫである特許請求の範１１項に記載のモノクロナー
   ル抗体。 ５、へフィブリノーダンまたはフィブリンＩの前記フラ
   グメントがＢＩ３−１１８およびＢＩ３−４２からなる
   群より選ばれる特許請求の範囲第１項に記載のモノクロ
   ナール抗体。 ６、　フィブリン■の前記フラグメントが（Ｂ）Ｎ−Ｄ
   ＳＫである特許請求の範囲第１項に記載のモノクロナー
   ル抗体。 ７、　前記骨髄腫系がＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫
   細胞からなる特許請求の範囲第２項に記載のモノクロナ
   ール抗体。 ８、前記牌細胞がＢＡＬＢ／ｃＪマウスから得られる特
   許請求の範囲第２項に記載のモノクロナール抗体。 ９、前記抗体がクラスＩｇＧに属する特許請求の範囲第
   ２項に記載のモノクロナール抗体。 ｌＯ９前記抗体がサブクラスＩｇＧ２．に属する特許請
   求の範囲第２項に記載のモノクロナール抗体。 １１、前記抗体が： ａ）　人フィブリノーデン１だはフィブリンＩのＢβ鎖
   のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメン
   トと反応し： ｂ）人フィブリノーク９ンまたはフィブリン■のＢβ鎖
   のアミノ漬残ＪＩｉ、’ｌ　−１４をＪ有するにゾテド
   フラグメントと反応すず；そして ｃ）　人フィブリノーケ゛ンまたはフィブリン■のＢβ
   鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する一２ｆチドフラ
   グメントと反応し々い； モノクロナール抗体。 １２　前記抗体が、下記工程からなる方法により調製さ
   れる特許請求の範囲第１１項に記載のモノクロナール抗
   体： ａ）Ｎ−ＤＳＫを含む溶液を用いて動物を免疫する工程
   ； ｂ）工程ａ）の各動物から肝臓を摘出し、各肝臓からそ
   の細胞の懸濁液をつくる工程； Ｃ）工程ｂ）の各肝臓の前記細胞を動物の骨髄腫細胞と
   融合促進剤の存在下で融合させる工程；ｄ）工程Ｃ）か
   らの融合細胞を、別々のウェルで未融合骨髄肝細胞を生
   育しない培地で希釈・培養する工程； ｅ）ハイブリドーマを含有する各ウェルの上ｔ「み液を
   、フィプリノーケゞン、Ｎ　−ＤＳＫ　、またはそれら
   の関連フラグメントに対する抗体の存在について評価す
   る工程； ｆ）　人フィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖
   のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメン
   トと反応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−
   １４または１５−４２を含有する４ゾチドフラグメント
   と反応しない抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、
   クローン化する工程；および ｇ）前記クローンの上へＬみ液から抗体を取得する工程
   。 １３８　前記動物がマウスである特許請求の範囲第１２
   項に記載のモノクロナール抗体。 １４、前記抗体が下記工程からなる方法により調製され
   る特許請求の範囲第１１項に記載のモノクロナール抗体
   ： ａ）　Ｎ　−ＤＳＫを含む溶液を用いて動物を免疫する
   工１．ｊ； ｈ）工十′、Ｈａ）の各動物から牌＋１ｉ’Ｊ、を）１
   ４出し、各ｎ′４４臓からその細胞の懸濁液をつくる工
   程； Ｃ）■４−４ｂ）の各１１乍臓の前記細胞を動物の情髄
   腫イ１０胞と融合促進剤の存在下で融合させる工程；ｄ
   ）工程Ｃ）からの融合細胞を別々のウェルで未融合骨髄
   腫細胞が生育しない培地で希釈・培養する工程； Ｔり　ハイブリ１゛−マを含有する各ウェルの上澄み液
   な、フィブリノーケ゛ン、Ｎ−ＤＳＫ、“またはそれら
   の関連フラグメントに対する抗体の存在について評価す
   る二［ｉξ↓； ｆ）人フィブリノーケ゛ンのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
   ４２を含イＪするペプチドフラグメントと反応するが、
   しかし１）ｉＪ　ｉｐ　Ｂβ鎖のアミノ１貸残基１−１
   ４−ま／ζは１５−４２を自治する波グチドフラグメン
   トと反応しない抗体を産生ずるハイブリドーマを】：ｊ
   り択し７、クローン化する工程；ｇ）　ｉｉ＋＋ｒｉ己
   クローン全クローンＩ！ｌ◇）の１復腔内に転移する工
   程；および ｈ）前記動物から、所望の抗体を含有する悪性腹水−ま
   たは血清を取得する工程。 １５、前記動物がマ′ウスである特許請求の範囲第１４
   項に記載のモノクロナール抗体。 １６、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４１８により産生
   されるモノクロナール抗体。 １７、動物の骨髄腫系からの細胞と、へフィブリノーダ
   ンまたはフィブリンＩのＮＨ２末端フラグメントで前取
   って免疫された動物からの牌細胞との融合により形成さ
   れたハイブリドーマ。 １８、前記動物がマウスである特許請求の範囲第１７項
   に記載のハイブリドーマ。 １９、六フィブリノーダンの前記フラグメントが前記フ
   ィブリノ−ダンまたはフィブリンＩをＣＮＢｒで分解す
   ることにより形成される特許請求の範囲第１７項に記載
   のハイブリドーマ。 ２０、六フィブリノーダンの前記フラグメントがＮ　−
   ＤＳＫである特許請求の範囲第１７項に記載のハイブリ
   ドーマ。 ２１、六フィブリノーダンまたはフィブリンＩの前記フ
   ラグメントが、ＢＩ３−１１８およびＢＩ３−４２から
   なる群より選ばれる特許請求の範囲第１７項に記載のハ
   イブリドーマ。 ２２、フィブリンｌの前記フラグメントが（Ｂ）Ｎ−Ｄ
   ＳＫである特許請求の範囲第１７項に記載のノ・イブリ
   ドーマ。 ２３　骨髄１厘細胞がＩ）３Ｘ６３ＡｇＨ，６５３骨ｎ
   Ｉｘ　ｌｌ’Ｍ細胞からなるＩｔ＋許請求の範囲第１８
   項に記載のノ・イブリ　ドーマ。 ２４　牌細胞がＢａ１ｂ／ｃＪマウスから得られる特許
   請求の範囲第１８項に記載のノ・イブリドーマ。 ２５　前記Ｎ■Ｉ２末端フラグメントがＮ　−ＤＳＫを
   含む溶液であり、そして前記融合が融合促進剤の存在下
   で行われる特ａ′「請求の範囲第１７項に記載のハイブ
   リドーマ。 ２６、ＡＴＣＣｉｌＢ　８４１８と称されるハイブリド
   ーマ。 ２７　動物の骨髄純系からの細胞と、人フイブリノーケ
   ９ンまたはフィブリンＩのＮＨ２末端フラグメントで前
   取って免疫された動物からの牌細胞との融合によりハイ
   ブリドーマを形成し、その後生成ハイシリｌ°−マを分
   離し、人フィゾリノークーゞンまだはフィブリンＩのＮ
   Ｈ２末端フラグメントに対して単一特異性抗体を産生ず
   るハイブリドーマを選択することからなることを１１）
   　「シ＋（とするモノクロナール抗体の調製方法。 ２８８　前記動物がマウスである特許請求の範囲第２７
   項に記載の方法。 ２９　人フィプリノーケゞンまたはフィブリン１の前記
   フラグメントが前記人フィブリノーケ゛ンまたはフィブ
   リン■をＣＮＢｒで分解することにより形成される特許
   請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３０、人フィブリノーダンの前記フラグメントがＮ　−
   ＤＳＫである特許請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３１、へフィブリノーダンの前記フラグメントがＢＩ３
   −１１８およびＢＩ３−４２からなる１４１．より選ば
   れる特許請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３２、フィブリンＩの前記フラグメントが（Ｂ）Ｎ−Ｄ
   ＳＫである特許請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３３　前記′目−１１・１を系かＰ３Ｘ６３Ａｇ＋う６
   ５３骨１ＩＡＩ庫細胞からなる！１．Ｊ許誼求の範囲２
   Ａ’１．２８項に記載の方法。 ”　４１＋Ｄ　ｉｔ己１ｆ”＋’　１ｌｌｌ　１ｌｉＪ
   ＩがＴＩＡＬ＋３／ｃＪ　７ウスから得られる特「１′
   Ｉ請求のＩＩ旧ｎＪ　−ＪＯ２８項に記載の方法。 ３５　モノクロナール抗体の調ｌ方法において、１涌１
   １己１元ｒ本が： （１）人フィブリノーケ゛ンまたはフィブリン■の１３
   β鎖のアミノ酸残ノ、！：１−４２を含有する４ノチド
   フラグメントと反応し： （ＩＩ）　人フィブリノーク゛ンーまたはフィブリンＩ
   のＢβ鎖のアミノ酸残基１−１４を含有する″″２７°
   ２７°チ１゛フラグメントず；そして ６１１）人フィズリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ
   ｔ１１のアミ、ノ酸残基１５−４２を含有するペゾチド
   フラグメントと反応せず、 前記方法が： （ａ）　Ｎ　−１）ＳＫを■む溶液により動物を免疫す
   る工程； （ｂ）　工１京ａ＞の各動物から肝臓を摘出し、各肝臓
   からそのｉ′、（ｌ胞の懸濁液をつくる工程；（ｃ）工
   程（ｂ）の各肝臓の前記細胞を動物の細胞と融合促進剤
   の存在下で融合する工程； （ｄ）　工ｆｊ、（（＝）からの融合細胞を別々のウェ
   ルで未融合骨髄肺組胞を生育しない培地で希釈・培養す
   る工程； （ｅ）　ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄み液
   を、フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳＫ、またはそれらの関
   連フラグメントに対する抗体の存在について計測する工
   程； （ｆ）　へフィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ
   鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する一２ｆチドフラグ
   メントと反応するがしかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１
   −１４または１５−４２Ｌか含有しない４プチドフラグ
   メントと反応しない抗体を産生ずるハイブリドーマを選
   択し、クローン化する工程； （ｇ）　前記クローンを動物の腹腔内に転移する工程；
   および （ｈ）　前記動物から所望の抗体を含有する悪性腹水ま
   たは血清を取得する工程； を含んで成ることを特へとするモノクロナール抗体の調
   製方法。 ３６、＋”＋η記動物がマウスである特許請求の範囲第
   ３５頃に記載の方法。 ３７　モノクロナール抗体の調製方法において、ｒｉｊ
   ｌ記抗体が： 中　人フィブリノーケ８ンまだはフィブリンＩのＢβ釦
   のアミハ゛ｊβ残基１−４２を含有するシフ０チドフラ
   グメントと反応し； （１１）人フィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ
   鎖のアミノ酸残基１−１４を含有するペプチドフラグメ
   ントと反応せず；そして （面　人フィブリ／−１’ン“またはフィブリン■のＢ
   β鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラ
   グメントと反応せず；そして 前記方法が： ａ）　Ｎ　−１）ＳＫを含むＩｉｉ液を用いて動Ｉ吻を
   免役する工程； ｂ）工程ａ）の各動物から牌１蝕を摘出し、６眉り臓か
   らその糸ｉ１１側の懸？蜀液をっくる工４呈；Ｃ）工程
   ｂ）の各膵臓の前記細胞を動物の骨髄腫細胞と融合促進
   剤の存在下で融合する工程；ｄ）工程ｂ）からの融合細
   胞を別々のウェルで未融合骨髄腫細胞を生育しない培地
   で希釈・培養する工程； ｅ）ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄み液を、
   フィブリノ−ダン、Ｎ−ＤＳＫまたはそれらの関連フラ
   グメントに対する抗体の存在について評価する工程； ｆ）人フィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
   アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
   と反応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１
   ４または１５−４２を含有するペプチドフラグメントと
   反応しない抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、ク
   ローン化する工程；および ｇ）前記クローンの上澄み液から抗体を取得する工程； を含んで成ることを特徴とするモノクロナール抗体の調
   製方法。 ３８　前記動物がマウスである特許請求の範囲第３７項
   に記載の方法。 ３９、動物の骨髄腫系と、人フィブリノーダンまたはフ
   ィブリンＩのＮＨ２末端フラグメントで前取って免疫さ
   れた動物からの牌細胞とを融合させることを含むハイブ
   リドーマの調製方法。 ４０、前記動物がマウスである特許請求の範囲第３９項
   に記載の方法。 ４１、人フィブリノーダンまたはフィシリンＩの前記フ
   ラグメントが前フィプリノーケ８ンまたはフィブリンＩ
   のＣＮＢｒによる分１’ｒ’ｌにより形成される特ｉｔ
   ′目Ｉ”Ｊ求の範囲第３９項に記載の方法。 ４２　六フィブリノーダンの前記フラグメントがＮ−Ｉ
   ）ＳＫであるＩＱｊ許請求の範囲第３９項に記載の方７
   人。 ４：（人フィブリノーダンのｆｆ１ｉＮ＋己フラグメン
   トが１３β１−１１８およびＢＩ３−４２からなるイ１
   ￥よりＪｊ４げれる・１＆Ｉ作請求の範１！Ｈ第３９頃
   に記載の方法。 ４４　フィシリンＩのｒｉｉＪ　Ｈ己フラグメントが（
   Ｂ）Ｎ−１）ＳＫである時ボｌ−請求の５ｉｉ４囲第３
   ９項に記載の方法。 ４５、前記骨髄腫系がＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄肝
   細胞からなる特許請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４６、前記肺細胞がＢＡＬＢ／ｃＪマウスから得られる
   特許請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４７、前記ＮＩ（２末端フラグメントがＮ　−ＤＳＫを
   含む溶液であり、そして前記融合が融合促進剤の存在下
   で行われる特許請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４８、　血漿サンプルを、人フィブリノ−ｒ７またはフ
   ィシリンｌのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する
   フラグメントに対する抗体と接触させることにより、エ
   ンザイムリンクドイムノア、セイまたはラジオイムノア
   、セイによって前記血漿サンプル中の六フィブリノーダ
   ンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の前記フラグメントの存
   在を検出する方法において、前記抗体が特許請求の範囲
   第１項に記載の抗体であることを特徴とする前記検出方
   法。 ４９、前記抗体が前記サンプルと、人フィブリノーダン
   またはフィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を
   含有する放射能侍識フラグメントの存在下で混合され、
   前記抗体に結合した放射能標識フラグメントが前記抗体
   に特異性のある抗体を用いて分ｈｔ＃される特許請求の
   範囲第４８項に記載の方法。 ５０、前記抗体が１３ｆＪ記サンプルと混合され、この
   ＞１４合物が人フィプリノーケ゛ンまたはフィブリンＩ
   のＢβ句のアミノ酸残基１−４２を含有するポリ深ノチ
   ドフラグメントと接触せしめられ、そして前記抗体に特
   異性のある抗体が酵素結合される特１杵ｉ１ｉ’Ｊ求の
   ・１ｉｉｊ囲ｅｉ’＞４８頃に記載の方法。 ５１　エンザイムリンクドイムノンルペントアνセイが
   行われる特許請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５２　ラジオイムノアッセイが行われる特許請求の範囲
   第４９項に記載の方法。 ５３、前記エンディムリンクドイムノソルペントアッセ
   イまだは前記ラジオイムノアッセイの結果が、既知標準
   と比較され、標準サンプルと比較してテストサンプル中
   の相対抗原濃度が測定される特許請求の範囲第４８項に
   記載の方法。 ５４、下記工程からなることを特徴とする血漿サンプル
   中に存在する、入フィグリノーダンまたはフィブリンＩ
   のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する一！ゾチド
   フラグメントの量を測定する方法： ａ）前記サンプルを、ＭＡｂ／１−８　ｃ６　、固体担
   体上の、へフィブリノーダンまたはフィブリン■のＢβ
   鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する４プチドフラグメ
   ントからなる競合抗原およびマウス免疫グロブリンと結
   合する酵素結合抗体の既知量と接触させる工程； ｂ）結合した酵素結合抗体の量を測定することによシ固
   体担体上の競合抗原に結合したＭＡｂ／］　−８ｃ６の
   量を検出する工程；および Ｃ）工程ａ）およびｂ）の結果を、へフィブリノーダン
   まだはフィブリンＩ（７）Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４
   ２を含有するペプチドフラグメントからなる既知抗原の
   標準量を用いて得られた結果と比較する工程。 ５５　ト−Ｅ２　ＬＬ　４ｍからなることを４寺Ｃａと
   する、皿漿サンダル中に存在する、人フィブリノーダン
   またはフィシリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を
   キ南するペプチドフラグメントの量を測定する方法： ａ）前記サンプルを、ＭＡｂ／１−８ｃ６および人フィ
   ブリノーケ゛ン寸たけフィブリ／■のＢβ鎖のアミノ酸
   残基１−４２を含有するペプチドフラグメントからなる
   競合放射能標識抗原各々の既知量と、競合放射能標識抗
   原がＭＡｂ／１−８ｃ６と結合出来るように接触させる
   工程； ｂ）工４ｆｆｌａ）の前記サングル、ＭＡｂ／１−８ｃ
   ６およびθ合放射能標識抗原をマウス免疫グロブリンに
   対して特異性のある抗体と接触させる工程；Ｃ）工程ｂ
   ）の抗体を用いて工程ｂ）の抗体結合放射能標識抗原を
   分離する工程； ｄ）工４°ノＣ）の結合放射能標識抗原の放射能を計数
   する二［程；および ｅ）工程ａ）、ｂ）、Ｃ）およびｄ）の結果を、人フィ
   プリノーケ゛ンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸
   残基１−４２を含有するペプチドフラグメントからなる
   既知抗原の標準量を用いて得られた結果と比較する工程
   。 ５６、動物の骨髄腫系からの細胞と、人フィブリン■の
   ＮＨ２末端フラグメントで前取って免疫された動物から
   の牌細胞とを融合し、その後ハイプリドーマを分離し、
   人フィブリン■のフラグメントに対する単一特異性抗体
   を産生ずるハイブリドーマを選択することによって形成
   されたハイブリドーマにより産生されることを％ｔａと
   するモノクロナール抗体。 ５７、　前記動物がマウスである、特許請求の範囲第５
   ６項に記載のモノクロナール抗体。 ５８、人フィブリン■の前記フラグメントが、前記人フ
   ィブリンＨのＣＮＢｒによる分解によって形成される特
   許請求の範囲第５６項に記載のモノクロナール抗体。 ５９、人フィブリン■の前記フラグメントが（Ｔ）　Ｎ
   −ＤＳＫである特許請求の範囲第５６項に記載のモノク
   ロナール抗体。 ６０、人フィブリン■の前記フラグメントがＢｉ１２−
   １１８およびＢｉ１２−４２からなる群より選ばれる特
   許請求の範囲第５６項に記載のモノクロナール抗体。 ６１、前記骨髄腫系がＰ３Ｘ３Ａｇ８．６５３骨髄＋＋
   ：）ｊ細胞からなる特許請求の範囲第５７項に記載のモ
   ノクロナール抗体。 ６２、前記牌細１１ｆｊｌがＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ　マウス
   から得られる特許請求の範囲第５７頃にｉ己載のモノク
   ロナール抗体。 ６３　前記抗体がクラスＩｇＧに（謁する特許請求の範
   囲第５７項にＡＵ　Ｈ成のモノクロナール抗体。 ６４、前記抗体がサブクラス■ｇＧ１に属する特Ｉｆ　
   請求の範囲第５７すｊに記載のモノクロナール抗体。 ６５ａ）人フィブリン■のＢβ（＋ｊ１のアミノ酸残基
   １５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応し； ｂ）　人フィブリノーケ゛ンまたはフィブリンＩのＢβ
   鎖のアミノ酸残基１−１４を含治するペプチドフラグメ
   ントと反応せず；そして Ｃ）人フィプリノーケゞンまたはフィブリン■のＢβ鎖
   のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメン
   トと反応しない； モノクロナール抗体。 ６６　前記抗体が下記工程からなる方法によって調製さ
   れる特許請求の範囲第６５項に記載のモノクロナール抗
   体： ａ）　（Ｔ）　Ｎ　−ＤＳＫを含む溶液により動物を免
   疫する工程； ｂ）　Ｉ程ａ）の各動物から肝臓を摘出し、各肝臓の細
   胞の懸濁液をつくる工程； Ｃ）工程ｂ）の各肝臓の前記細胞を動物の骨髄腫細胞と
   融合促進剤の存在下で融合する工程；ｄ）工＆ｊｅ）か
   らの融合細胞を別々のウェルで未融合骨髄肺細胞を生育
   しない培地にて希釈・培養する工４呈； ｅ）ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄み液をフ
   ィブリンＴＩ　、（Ｔ）Ｎ　−ＤＳＫ、またはそれらの
   関連フラグメントに対する抗体の存在について評価する
   工程； ｆ）入フィブリン１１のＢβ鎖のアミノ酸゛残基１５−
   ４２を含有する４ゾチドフラグメントと反応するが、し
   ７かしフィブリノ−ダンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
   アミノ酸残基１−１４または１−４２のみを含有するペ
   プチドフラグメントと反［Ｔｈ；　Ｌない抗体を産生ず
   るハイプリドーマを選択し、クローン化する工程；およ
   び ｇ）　ｆ）ｌ記りローンのドア（ｆみ液から抗体を取得
   する工程。 ６７．前記動物がマウスである特許請求の範囲第６６　
   Ｊｌ：Ｊに記載のモノクロナール抗体。 ６８　前記抗体が下記工程からなる方法によって調）Ｉ
   恕される特許請求の範囲第６５項に記載のモノクロナー
   ル抗体： ａ）　（ｒ）　Ｎ　−ＤＳＫから本領的になる均質溶液
   によりｄｉｂ物を免疫する工程： ｂ）工程ａ）の各動物から肝臓を摘出し、各肝臓からそ
   の沼１１１１Ｎの１・吐油ｉ′ｅ、をつくる工程；Ｃ）
   工程ｂ）の各肝臓の前記細胞を動物の骨髄腫細胞とｆ７
   ｔｌ１合促進剤の存在下で融合する工程；ｄ）工程Ｃ）
   からの融合細胞を別々のウェルで未融合骨髄腫細胞を成
   育しない培地において希釈・培養する工程； ｅ）ハイプリドーマを含有する各ウェルの上澄み７夜を
   フィブリン■、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、　ｔたはそれらの関
   連フラグメントに対する抗体の存在について評価する工
   程； ｆ）人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
   を含有するペプチドフラグメントと反応するが、しかし
   フイブリノーゲンまたはフィブリン■のＢβ鎖のアミノ
   酸残基１−１４または１−４２を含有するペプチドフラ
   グメントと反応しない抗体を産生ずるハイブリドーマを
   選択し、クローン化する工程； ｇ）前記クローンをマウスの腹腔内に転移する工程；お
   よび ｈ）前記マウスから所望の抗体を含有する悪性腹水また
   は血清を取得する工程。 ６９、前記動物がマウスである特許請求の範囲第６８項
   に記載のモノクロナール抗体。 ７０ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６によって産生
   されるモノクロナール抗体。 ７１、前記モノクロナール抗体が、へフィブリノーダン
   のトロンビン分解によって産生される産物と反応するが
   、しかしラビットフィブリノ−ダンのトロンビン分解か
   ら生じる産物とは反応しない特許請求の範囲第５６項に
   記載のモノクロナール抗体。 ７２、　＠ｂ物骨髄腫系からの細胞と、人フィブリン■
   のＮＨ２末端フラグメントで前以って免疫された動物か
   らの牌細胞との融合により形成されたハイブリドーマ。 ７３、前記動物がマウスである特許請求の範囲第７２項
   に記載のハイブリドーマ。 ７４、人フィブリン■の前記フラグメントが前記フィブ
   リン■をＣＮＢ　ｒで分解することにより形成される特
   許請求の範囲第７２項に記載のハイブリドーマ。 ７５　人フィブリン■の前記フラグメントが（Ｔ）　Ｎ
   −ＤＳＫである特許請求の範囲第７２項に記載のハイブ
   リドーマ。 ７６、人フィブリン■の前記フラグメントがＢｉ１２−
   １１８およびＢＩ３５、−４２からなる群よυ選ばれる
   、特許請求の範囲第７２項に記載のノ・イブリドーマ。 ７７、骨髄腫細胞がＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細
   胞からなる特許請求の範囲第７３項に記載のノ・イブリ
   　ドーマ。 ７８、牌細胞がＢＡＬＢ／ｃＪマウスから得られる特許
   請求の範囲第７３項に記載のノ・イブリドーマ。 ７９、前記ＮＨ２末端フラグメントが（Ｔ）　Ｎ　−Ｄ
   ＳＫを含む溶液であり、そして前記融合が融合促進剤の
   存在下で行われる特許請求の範囲第７２項に記載のハイ
   ブリドーマ。 ８０、ＨＢ８４２６と称されるハイシリドーマ。 ８１、動物の骨髄腫系からの細胞と、人フィブリン■の
   ＮＨ２末端フ２グメントで前以って免疫状態にされた動
   物からの牌細胞とを融合させ、その後・・イブｊノドー
   マを分離し、所望の単一特異性抗体を産生ずるハイブリ
   ドーマを選択することによりハイブリドーマを形成する
   ことを含んでなる、モノクロナール抗体の調製方法。 ８２、前記動物がマウスである特許請求の範囲第８１項
   に記載の方法。 ８３、人フィブリン■の前記フラグメントが前記人フィ
   ブリン■をＣＮＢｒで分解することにより形成される特
   許請求の範囲第８１項に記載の方法。 ８４　人フィブリン■の前記フラグメントが（’ｒ’）
   　Ｎ−ＤＳＫである％前ｆＪ求の範囲第８１項に記載の
   方法。 ８５　人フィブリンＨの前記フラグメントがＢｉ１２−
   １１８およびＢｉ１２−４２からなる群より選ばれる特
   許請求の範囲第８１項に記載の方法。 ８６　前記骨ｖ１１１ｉｔｉ系カＰ　３　Ｘ６３　Ａｇ
   　８．６５３　骨髄＋１ｔｌｊｍ胞からなる特許請求の
   範囲第８２項に記載の方法。 ８７、Ｍ記ハ’Ｖ　１ｒｊｌ＋胞がＢＡＬＢ／ｃＪ　マ
   ウスから得らレル特許請求の範囲第８２項に記載の方法
   。 ８８、モノクロナール抗体のＡ製において、前記抗体が
   ： （１）人フィブリン１１０）　Ｂβ鎖のアミノ酸残基１
   ５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応し； （ｉｉ）　人フィブリノーケ゛ンまたはフィブリンＩの
   Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４を含有するペプチドフラ
   グメントと反応せず；そして Ｇ１１）　人フィプリノーケ゛ンまだはフィブリンＩの
   Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラ
   グメントと反応せず、前記方法が：そして（ａ）　（Ｔ
   ）　Ｎ　−ＤＳＫを含む溶液により動物を免疫する工程
   ； （ｂ）　工程（ａ）の各動物から肺臓を摘出し、６牌１
   （佐　゛からその細胞の懸濁液をつくる工程； （ｃ）　工程（ｂ）の各牌１１蔵のｌｌ１Ｊ記細胞を動
   ｌ吻の骨髄肝細胞と融合促進剤の存在下で融合する工程
   ；（ｄ）　工程（Ｃ）からの融合細胞を別々のウェルで
   未融合骨髄腫細胞を成育しない培地において希釈・培堡
   する工程； （、）　ハイブリドーマを含有する各ウェルの上■み液
   をフィブリンＩＩ　、（Ｔ）Ｎ　−ＤＳＫ　、またはそ
   れらの関連フラグメントに対する抗体の存在について評
   価する工程； （ｆ）人フィブリン■のＢβ釦のアミノ酸残基１５−４
   ２を含有するベゾチ１゛フラグメントと灰石するが、し
   かしフィプリノーク゛ンまたはフィブリン１のＢβぞ・
   １１のアミノｊ゛・皮りけ１古１−１４４たけ１−４２
   を１有する−・？プチドフングメントと反応し々い抗ｆ
   ト’（Ｌ’　ｒ’ｒ生ずるハイブリドーマを選択し、ク
   ローン化する工程； （ｇ）　ｉ’ｔｆｌ記クローンを動物の腹腔内に転移す
   る工Ｊ’ｌ、ｊ　； （ｈ）　＋）ｉｌ記動ｉり劫・ら、Ｈ１望の抗体をぎｔ
   冶するｊｌＱ性１１ｊｊ　／ｌｃ片たはＩＩ：Ｌ　ｉｉ
   ’ｉ金取ｉ１する工程、からなることを′１．胃改とす
   るモノクロナール抗体のｉｊ！ｌ’ｉ１号゛ｌ方θ−〇 ８！ｌ　１）ｔＪ記動物がマウスである特許請求の範囲
   第８８１↓゛１に１１己・１氏の方ンム。 ９（）、モノクロナール抗体の調製方法において、前記
   抗体が： （１）人フィシリン■のＢβ鎖のアミノ酸ＩＡ茫１、５
   −４２を３有する（グチドフラグメントと反応し： （１１）　人フィブリノーケ゛ンまたはフィブリンｌの
   Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４を含有するペプチドフラ
   グメントと反応せず；そして Ｇ１１）　へフィブリノーダンまたはフィブリンＩのＢ
   β鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグ
   メントと反応せず；そして 前記方法が： ａ）　（Ｔ）　Ｎ　−ＤＳＫから本質的になる均質溶液
   により動物を免疫する工程； ｂ）工程ａ）の各動物から牌ｊ凧を摘出し、各肝臓から
   その細胞の懸濁液をつくる工程； Ｃ）工程ｂ）の各肝臓の前記細胞を動物の肯髄腫細胞と
   融合促進剤の存在下で融合する工程；ｄ）工程Ｃ）から
   の融合細胞を別々のウェルで未融合骨髄腫細胞を成育し
   ない培地において希釈・培養する工程； ｅ）ハイブリドーマを含有する各ウェルの上澄み液をフ
   ィブリン■またはその関連フラグメントに対する抗体の
   存在について評価する工程；ｆ）人フィブリンＩＩのＢ
   β釦のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラ
   グメントと反応するが、しかしフィグリノーケ゛ン捷た
   けフィブリンｌのＢβ鎖のアミノ酸残基１−１４′また
   は１−４２を含有するペプチドフラグメントと反応しな
   い抗体を１ｙｒｅ生ずるハイブリドーマを選択し、クロ
   ーン化する工程；および ｇ）　ｎｉ＋記クコクローン澄み液から抗体を取得する
   工）、ｊ、ｊｌ からなることを特［改とするモノクロナール抗体のｒｉ
   ｌ′Ｊ製方法。 りＬ　１）ｉＪｉ４ｊ！！肋物がマウスである特許請求
   の範囲第９０　」ｆｉに記載の方法。 ９２１１・ｂ物の・ｉｔ’　Ｉｉイ１１１１０系と、人
   フィブリン■のＮＨ２末ＶｉｉΔフラグメントで前身っ
   て免疫状態にされた動物からの１１１￥細胞とを融合す
   ることを含んでなることを′１徴とするハイブリドーマ
   の調製方法。 ９：ウ　前記動物がマウスである特許請求の範囲第９２
   項に記載の方法。 ９４　人フィブリン１１の前記フラグメントが前記人フ
   ィブリン■のＣＮＢｒによる分解により形成される特許
   請求の範囲第９２項に記載の方法。 ９５　人フィブリン■の前記フラグメントが（Ｔ）　Ｎ
   −ＤＳＫである特許請求の範囲第９２項に記載の方法。 ９６　人フィブリン■の前記フラグメントがＢβ１５−
   １１８およびＢβ１５−４２からなる群より選ばれる特
   許請求の範囲第９２項に記載の方法。 ９７、前記骨髄腫系がＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫
   細胞からなる特許請求の範囲第９３項に記載の方法。 ９８、前記肝臓細胞がＢＡＬＢ／ｃＪマウスから得られ
   る特許請求の範囲第９３項に記載の方法。 ９９、前記ＮＨ２末端フラグメントが（Ｔ）　Ｎ　−Ｄ
   ＳＫを含む溶液であシ、そして前記融合が融合促進剤の
   存在下で行われる特許請求の範囲第９２項に記載の方法
   。 １００、血漿サンプルを人フィブリン■のＢβ鎖のアミ
   ノ酸残基１５−４２を含有するフラグメントに対する抗
   体と接触させることによるエンザイムリンクドイムノン
   ルペントアッセイまたはラジオイムノアッセイによって
   前記血漿中の人フィグリン■のＢβ鎖の前記フラグメン
   トリ存在を検出する方法において、前記抗体が特許請求
   の範囲第５６項に記載の抗体であることを％徴とする、
   血漿中の前記フラグメントの検出方法。 １０１　前記抗体が前記サンプルと、人フィブリン■の
   Ｂβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する放射能標＋
   ａ　７ラグメントの存在下で接触せしめられ、前記抗体
   に結合した放射能標識フラグメントが前記抗体に！（杓
   “４件のある抗体を用いて分離される稲許請求の範囲第
   １００項に記載の方法。 １０２、前記抗体が前記サンノルと混合され、得られた
   ７１４合物が人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１
   ５−４２を含有するポｌＪ゛ｅプチドフラグメントと接
   触せしめられ、そして前ｉ、ピ抗体に特異性のある抗体
   が酵素結合される特許請求の範囲第１００項に記載の方
   法。 １０３、エンヂイムリンクｉ’イムノソルベントアッセ
   イが行われる特許請求の範囲第１００項に記載の方γ）
   日。 １０４、ラジオイムノアッセイが行われる特許請求の範
   囲第１００項に記載の方法。 １０５、前記エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
   セイまたは前記ラジオイムノアッセイの結果が、既知の
   標準と比較されて、標準サンプルと比較してテストサン
   プル中の相対抗原濃度が測定される特許請求の範囲第１
   ００項に記載の方法。 １０６、下記工程からなることを特徴とする、血漿サン
   プル中に存在する、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸
   残基１５−４２を含有するペプチドフラグメンドリ量を
   測定する方法； ａ）前記サンダルを、ＭＡ　ｂ／Ｉ”２　Ｇ　１　ｇ、
   固体担体上の、人フィブＩＪ　７１のＢβ鎖のアミノ酸
   残基１５−４２を含有するパフ０チドフラグメントから
   なる競合抗原お・よびマウス免疫グロブリンと結合する
   酵素結合抗体の各々の既知址と接触させる工程；ｂ）結
   合した酵素結合抗体の量を測定することにより、固体担
   体上の競合抗原と結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１８の量を検
   出する工（呈；およびＣ）工程ａ）およびｂ）の結果を
   、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を
   含有するにグチ１°フラグメントからなる既知抗原のｆ
   ｉｊｑ準量を用いてイ（ｊられる結果と比較する工程。 １（１７，下奇シニｌ二程からなることを牛５゛徴とす
   る、Ｉ′ＩＩＩｔ　Ｍ：サンプル中に存在する、人フィ
   ブリンＩｔ　（７）　Ｂβ碩のアミノ１ｊ句残ノー：１
   ５−４２を含有する波ゾヂドフラグメンｌの１１゛を１
   １川定する方法：”）　ｎ’ｆ　ｉｉ己→ノンノルを、
   ＭＡｂ　／　’ｒ２Ｇ　１　ｓおよび人フィブリン１１
   のＢβ、（、、ｌｊのアミノ酸残基１’５−４２’ｉ含
   −ｈする波プチドフラグメントからなる競合放射能１・
   １″識１ｆ１□片の名々σｌ　ｌｊＸ、知ｆ＋ｔど、β
   ４Ｂ、合放射能椋識抗１Ｂ、ＵＮ情ｂ　／　ｉ’２Ｇ　
   ｌ　８と、１．．１１合出来るように接触させるエイ呈
   ； ｂ’）　−ｆ’、　ｆ’ｊ　ａ、）のｒｉｆｔ記リーン
   す’　／１．、へ４Ａｂ　／　’ｒ：２Ｇ　ｌ　ｓおよ
   び・現今ｂｋ　’ＪＪ　ｆｉｌニド１．：ｊｉ　ｉ’ｊ
   表抗原を、マウス免疫グロブリンに！１．１，１．５１
   ．Ｓ性のある抗体と接触させる工程；Ｃ）土Ｉ′Ｉ！ｌ
   Ｊ）の抗体結合放射能標識抗原を工程ｂ）の抗体を用い
   “０分１’ｉｌ）する工：ｊ：・ｉｌ、　：ｄ）　ｆ：
   セ１゛ｃ）の結合した放射１１旧票識抗原の放射能をｒ
   ｌ）１とｙする二］二４呈；およびｅ）■程ａ）、ｂ）
   、Ｃ）およびｄ）の結果を、入フィブリン■のＢβ鎖の
   アミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメン
   トからなる１１℃知抗原の標準鼠を用いて得られる結果
   と比較する工程。 １０８、患者からの血漿サンダルを第一部分と第二部分
   に分割することをきむ、患者に閉寒性血栓症が発生する
   可能性を検出する方法において、ａ）第一部分を、 １）前記部分を、ＭＡｂ　／　１−８　ｃ６、固体担体
   上の人フィブリノーケ９ンまだはフィブリンＩのＢβ鎖
   のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメン
   トからなる競合抗原、およびマウス免疫グロブリンと結
   合する酵素結合抗体の各々の既知鼠と接触させる工程； １１）結合した酵素結合抗体の量を測定することにより
   、固体担体上の競合抗原に結合したＭＡｂ／１−８ｃ６
   の量を検出する工程；および１１１）工程１）および１
   １）の結果を、人フィブリノーダンまたはフィブリン■
   のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフ
   ラグメントからなる）ｐ（、知抗原の４・；”ｊ　鵡４
   ｊ４を用いて１１↓られる結果と比較し、第一部分にお
   （＝−Ｊる、人フィフニリノーケ９ン捷たはフィブリン
   ｌ　Ｏ）　Ｂβ（、′１のアミノ（’＋１．残基１−４
   ２を含イ１するペプチドフラグメントの；１１：を測定
   する］二４１１！　、 によって処理する工程； ｂ）第二Ｈｑ１ｓ分を：、 ｉ　）　１）ｉＪ記線部分、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ、固体
   担体上の、人フィブリン■のＢβ・鎖のアミノ酸残基１
   ５−４２を含有するペプチドフラグメントから々る競合
   抗原、赴よびマウス免疫グロブリンに特異性のある酵素
   結合抗体の各々の既知量と接触させる工程；１１）結合
   した酵素結合抗体の量を測定することにより、固体担体
   上の競合抗原に結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇ　１　ｇの［ト
   を検出する工、１；および１１１）工程ｉ）および１１
   ）の結果を、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１
   ５−４２を含有するペプチドフラグメントからなる既知
   抗原の標準量を用いて得られる結果と比較して、第二部
   分における、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１
   ５−４２を含有するペプチドフラグメントの１１を測定
   する工程、 によって処理する工程； Ｃ）工程ａ）　１ｉｉ）からの人フィブリ／−ケ゛ンま
   たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含
   有するペプチドフラグメントの量を、工程ｂ）船カラの
   人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含
   有するペプチドフラグメントの歇と比較し、Ｂｉ１２−
   ４２がＢβ１−４２より優勢であるかどうかを確定する
   工ｆ！！（Ｂｉ１２−４２の優勢は前記患者において閉
   塞性血栓症の発生の可能性を指摘する）、 を含むことを特徴とする閉塞性血栓症の検出方法。 １０９、患者からの血漿サンプルを２４＜一部分と第二
   部分に分割することを含む、患者に閉塞性血栓症が発生
   する可能性を検出する方法において、ａ）第一部分を、 １）前記部分を、ＭＡｂ／１−８ｃ６および人フィブリ
   ノーダンまだはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ醸成１ｌ
   −４２を含有するペプチドフラグメントからなるｊ・築
   合放射能家識抗原の各々の既知量と、競合Ｕ’ｌ射能停
   識抗原がＭＡｂ／１−８ｃ６と結合出来るように接触さ
   せる工程； ＩＩ）工＋ａｉ）の：ＪｊＪ　ｉｉ己部分、ＭＡｂ／１
   −８ｃ６および競合放射１１Ｌ標識抗原をマウス免疫グ
   ロブリンに特異性のある抗体と接触させる工程； １１１）工程１１）の抗体結合放射能標識抗原を工程１
   １）の抗体を用いて分離する工程； ｉＶ）　工（’＝ｆｌｌ：りの抗体結合放射能標識抗原
   の放射能を１：１゛数する工・ＩＡ；および ■）工（呈ｉ）　、　ｉｉ’）　＋−１ｉｉ）およびｉ
   ｖ）の結果を、人フィブリノーク゛ンまノこはフィブリ
   ンＩのＢβ鎖のアミノ醸成）、；１−４２を含有するイ
   ノ０テドフラグメントからなる既知抗原の１票塾はを用
   いで１１らｉする結果と比較し、第一部分における、人
   フィブリノーケ゛ン捷／こはフィブリノＩのＢβ鎖のア
   ミノ酸残基：Ｎ−４２を’Ｎ偵するベノチドフラグメン
   トσ月ｊｔを６１１１　’＋ｉ４する工１′］！、に、
   Ｌっ−（処ＩＩＩ！　する工程； ｂ）　・１５−二ｆ；ｌ！句を、 １）前記部分を、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｇおよび人フィブリ
   ン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプ
   チドフラグメントからなる競合放射能標識抗原の各々の
   既知量と、競合放射能標識抗原がＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｓと
   結合出来るように接触させる工程；ｊｉ）工程ｉ）の前
   記部分、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１ｓおよび競合放射能標識抗原
   をマウス免疫グロブリンに対して特異性のある抗体と接
   触させる工程；１１１）工程１１）の抗体を用いて、工
   程１１）の抗体結合放射能標識抗原を分離する工程； １■）工１ｍ　ｌ！ｌ）の抗体結合放射能標ｎｒＪｌ抗
   原の放射能を計数する工程；および ■）工程１）、１１）、１１１）およびｉｖ）の結果を
   、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を
   含有するペプチドフラグメントからなる既知抗原の標準
   量を用いてイ（Ｉられた結果と比較して、ａ工二部分に
   おける、人フィブリン■のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−
   ４２を含有するペプチドフラグメントのｉＪｌ：を測定
   する工程、 ２０によって処理する工程；および Ｃ）工程ａ））からの人フィブリノーダンまたはフィブ
   リンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するベン
   ０チドフラグメントの叶を、工程ｂ）　ｖ）からの人フ
   ィブリン■のＢｉ１２のアミノ１１′ｌ残基１５−４２
   を含有するペゾチドフラグメントの量と比較して、Ｂｉ
   １２−４２がＢＩ３−４２より優勢であるかどうかを確
   定する工程（Ｂｉ１２−４２の優勢は前記患者において
   閉塞性血栓症の発生の可能性を指摘する） を＾むことを−Ｗ　＋改とする閉塞性血栓症の検出方法
   。 １１０、−’Ｆ記−［程からなることを７１ｈ′贋とす
   る、患＆の血流からフィブリン１１を除去する方法：ａ
   ）特許１ｊｉ’５・１＜の範囲第５６項に記・ｉ′（の
   モノクロナール抗体を固体用体上に固定化する工程；ｂ
   ）前１．旧４定化モノクロナール抗体を血液透析室内に
   巨く工程；および Ｃ）前記患者の血流を前記血液透析室に、前記血液がｎ
   ｉＪ記固足固定化モノクロナール抗体触するようにυＩ
   Ｃすことにより前記患者の血液透析を行う工程。 １１１　テストサンプルに含まれる血漿が特定のアミノ
   酸配列を含有するか否かを決定するだめのキットであっ
   て、 （１）特許請求の範囲第１項に記載のモノクロナール抗
   体、 （ｉｉ）　へフィフ゛リノーダン捷だはフィブリン■の
   Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペフ０チドフ
   ラグメント、 （ｉｉｉＪ　八）、イプリノーケ゛ン、およびＩｌψ　
   励動免疫グロブリンに対して特異性のある酵素結合免疫
   グロブリン、 を含んで成るキット。 １１２　前記モノクロナール抗体が特許請求の範囲第２
   項に記載のモノクロナール抗体であり、そして動物の免
   疫グロブリンがマウス免疫グロブリンである特許請求の
   範囲第１１１項に記載のキット。 １１３、テストサンノル中に含まれる血漿が特定のアミ
   ノ酸配列を含有するか否かを決定するだめのキットであ
   って、 （＋）　特許請求の範囲第５６項に記載のモノクロナー
   ル抗体、 （１１）　人フィブリンＩＩ　Ｏ，）　Ｂβ鎖のアミノ
   酸残基１、５−４２を含有する一２ｆチドフラグメント
   、（ｌ巾　人フィブリン■、および ０ψ　動物免役グロブリンに対してｌｊ異性のある＋□
   １１デ素結合免疫グロブリン、 を含んで成るキット。 １１４　前記モノクロナール抗体が特許請求の範囲ｔｉ
   Ｒ５７項に記載のモノクロナール抗体であり、そし−Ｃ
   ９１１・ＩＩ物の免疫グロブリンがマウス免役グロブリ
   ンである、特ｉｉ’ｌ’　請求の範囲第１１３　、ＩＡ
   に記載のキット。 １１５　テストサンプル中に含まれる血漿が特定のアミ
   ノ酸配列を含有するか否かを決定するだめのキットであ
   って、 （１）特Ｊ′［請求の範囲第１項に記載の第一モノクロ
   ナール抗体、 （１１）特許請求の範囲第５６項に記載の第二モノクロ
   ナール抗体、 ０Ｉｌ）　人フィブリノーダン、 （ｌψ　人フィブリン■および ０　動物の免疫グロブリンに対して特異性のある酵素結
   合免疫グロブリン を含んで成るキット。 １１６　前記第一モノクロナール抗体が特許請求の範囲
   第２項に記載のモノクロナール抗体であり、前記第二モ
   ノクロナール抗体が特許請求の範囲第５７項に記載のモ
   ノクロナール抗体であり、そして動物の免疫グロブリン
   がマウス免疫グロブリンである特許請求の範囲第１１５
   項に記載のキット。 以下系〔１