JP2996526B2 - モノクローナル抗体の新用途 - Google Patents
モノクローナル抗体の新用途Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
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- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はモノクローナル抗体の
新規用途に関するものである。この発明は、小細胞肺癌
(ＳＣＬＣ)の処置における、モノクローナル抗体ＢＲ５
５−２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性
を有するそのフラグメント、またはそれらの変異体の用
途に関するものである。
新規用途に関するものである。この発明は、小細胞肺癌
(ＳＣＬＣ)の処置における、モノクローナル抗体ＢＲ５
５−２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性
を有するそのフラグメント、またはそれらの変異体の用
途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】治療適用におけるモノクローナル抗体の
用途は、ますます認められてきている。ネズミ起源の上
記モノクローナル抗体の一群は、例えばウィスターのＥ
Ｐ０２８５０５９に開示された、ＢＲ５５−２または同
じ特異性を有するそのフラグメントおよびそれらの変異
体であり、前記文献には、それらの製法並びに基本的に
は腺癌および類似腫ようの検出および治療におけるそれ
らの用途も開示されている。ＢＲ５５−２クラスの抗体
は、腺癌に通常随伴するジフコシル血液群抗原Ｙ−６お
よびＢ−７−２を認識する。小細胞肺癌の病因は明確に
は解明されていないが、上皮起源の悪性腫よう、例えば
腺癌とは無関連である。事実、腺癌悪性腫ようの発生に
対して阻害作用を発揮することが知られているモノクロ
ーナル抗体は、小細胞肺癌細胞に対しては通常何の作用
も示さず、逆もまた同じであるが、若干のモノクローナ
ル抗体は両タイプの細胞を認識すると主張されている。
用途は、ますます認められてきている。ネズミ起源の上
記モノクローナル抗体の一群は、例えばウィスターのＥ
Ｐ０２８５０５９に開示された、ＢＲ５５−２または同
じ特異性を有するそのフラグメントおよびそれらの変異
体であり、前記文献には、それらの製法並びに基本的に
は腺癌および類似腫ようの検出および治療におけるそれ
らの用途も開示されている。ＢＲ５５−２クラスの抗体
は、腺癌に通常随伴するジフコシル血液群抗原Ｙ−６お
よびＢ−７−２を認識する。小細胞肺癌の病因は明確に
は解明されていないが、上皮起源の悪性腫よう、例えば
腺癌とは無関連である。事実、腺癌悪性腫ようの発生に
対して阻害作用を発揮することが知られているモノクロ
ーナル抗体は、小細胞肺癌細胞に対しては通常何の作用
も示さず、逆もまた同じであるが、若干のモノクローナ
ル抗体は両タイプの細胞を認識すると主張されている。
【０００３】
【発明の構成】現在、驚くべきことに、上記ジフコシル
血液群抗原は同じくＳＣＬＣ細胞上にも存在し、ＢＲ５
５−２抗体は、機能的中和性抗ネズミ免疫グロブリンの
インビボ産生を誘発することなく、小細胞肺癌において
優れた阻害活性を有することが見出された。すなわち、
この発明は、小細胞肺癌の処置における、モノクローナ
ル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５
−２の特異性を有するそのフラグメント、またはそれら
の変異体（variant）の用途を包含する。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置を目的とする医薬の製造にお
ける、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクロ
ーナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメ
ントまたはそれらの変異体の用途を含む。
血液群抗原は同じくＳＣＬＣ細胞上にも存在し、ＢＲ５
５−２抗体は、機能的中和性抗ネズミ免疫グロブリンの
インビボ産生を誘発することなく、小細胞肺癌において
優れた阻害活性を有することが見出された。すなわち、
この発明は、小細胞肺癌の処置における、モノクローナ
ル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５
−２の特異性を有するそのフラグメント、またはそれら
の変異体（variant）の用途を包含する。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置を目的とする医薬の製造にお
ける、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクロ
ーナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメ
ントまたはそれらの変異体の用途を含む。
【０００４】さらに、この発明は、処置を必要とする対
象に、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクロ
ーナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメ
ント、またはそれらの変異体の治療有効量を投与するこ
とを含む、小細胞肺癌の処置方法を含む。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置で使用され、有効成分として
モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル
抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメントま
たはそれらの変異体を、医薬的に許容し得る担体または
希釈剤と共に含有する医薬組成物を含む。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置で使用される医薬の製造方法
であって、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノ
クローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラ
グメントまたはそれらの変異体を、医薬的に許容し得る
担体または希釈剤と混合することを含む方法を含む。
象に、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクロ
ーナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメ
ント、またはそれらの変異体の治療有効量を投与するこ
とを含む、小細胞肺癌の処置方法を含む。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置で使用され、有効成分として
モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル
抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメントま
たはそれらの変異体を、医薬的に許容し得る担体または
希釈剤と共に含有する医薬組成物を含む。さらに、この
発明は、小細胞肺癌の処置で使用される医薬の製造方法
であって、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノ
クローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラ
グメントまたはそれらの変異体を、医薬的に許容し得る
担体または希釈剤と混合することを含む方法を含む。
【０００５】肺ＳＣＬＣにおける新規用途は、下記発見
に基づいている。 １．結合性試験 １.１．ＳＣＬＣセルラインへのＢＲ５５−２抗体の結
合性。 驚くべきことに、抗体ＢＲ５５−２により規定されるル
イスＹ炭水化物抗原は、またＳＣＬＣセルラインにおい
ても顕著に発現される。これは、細胞−ＥＬＩＳＡにお
いてＳＣＬＣセルラインＳＷ２、ＯＨ−１およびＨ−６
９によるＢＲ５５−２抗体の結合性試験で示され得る
(図１、２および３参照、並びに実験の詳細については
実施例１参照)。また、ジョンストーンおよびソーペの
免疫蛍光検定において例えばＳＣＬＣセルラインＬＸ−
１、ＯＨ−３およびＺＴＬ２により似た結果が得られる
(「イミュノケミストリー・イン・プラクティス」(Immuno
chemistry in Practice)、ブラックウェル・サイエンテ
ィフィック・パブリケーションズ、オックスフォード、
１９８７)。セルラインＳＷ２の糖蛋白質におけるルイ
スＹ炭水化物抗原の発現は、実施例８の記載に従いさら
に立証され得る。１.２．ひとＳＣＬＣ組織試料に対す
るＢＲ５５−２抗体の結合性。コルビン等の免疫組織化
学的方法(「ダイアグノスティック・イミュノパソロジ
ー」(Diagnostic Immunopathology)、ラーベン・プレ
ス、ニューヨーク(１９８８))を用いることにより、ひ
とＳＣＬＣから得られた冷凍薄片について抗体の結合性
を調べた。ＢＲ５５−２は、７つの調べた試料中５つに
おいて強く結合し、残り２試料において幾分弱く結合す
ることが見出された。
に基づいている。 １．結合性試験 １.１．ＳＣＬＣセルラインへのＢＲ５５−２抗体の結
合性。 驚くべきことに、抗体ＢＲ５５−２により規定されるル
イスＹ炭水化物抗原は、またＳＣＬＣセルラインにおい
ても顕著に発現される。これは、細胞−ＥＬＩＳＡにお
いてＳＣＬＣセルラインＳＷ２、ＯＨ−１およびＨ−６
９によるＢＲ５５−２抗体の結合性試験で示され得る
(図１、２および３参照、並びに実験の詳細については
実施例１参照)。また、ジョンストーンおよびソーペの
免疫蛍光検定において例えばＳＣＬＣセルラインＬＸ−
１、ＯＨ−３およびＺＴＬ２により似た結果が得られる
(「イミュノケミストリー・イン・プラクティス」(Immuno
chemistry in Practice)、ブラックウェル・サイエンテ
ィフィック・パブリケーションズ、オックスフォード、
１９８７)。セルラインＳＷ２の糖蛋白質におけるルイ
スＹ炭水化物抗原の発現は、実施例８の記載に従いさら
に立証され得る。１.２．ひとＳＣＬＣ組織試料に対す
るＢＲ５５−２抗体の結合性。コルビン等の免疫組織化
学的方法(「ダイアグノスティック・イミュノパソロジ
ー」(Diagnostic Immunopathology)、ラーベン・プレ
ス、ニューヨーク(１９８８))を用いることにより、ひ
とＳＣＬＣから得られた冷凍薄片について抗体の結合性
を調べた。ＢＲ５５−２は、７つの調べた試料中５つに
おいて強く結合し、残り２試料において幾分弱く結合す
ることが見出された。
【０００６】２．インビトロＳＣＬＣセルラインに対す
る細胞溶解および細胞毒性活性。 この作用は、ひとエフェクター機能の誘導により伝達さ
れる。原則として、抗体による腫よう細胞の破壊は、２
つの一般的機構、すなわち補体依存性細胞溶解(ＣＤＣ)
および抗体依存性細胞・細胞毒性(ＡＤＣＣ)に基づき得
る。 ２.１．ＣＤＣ よく知られている通り、ひとＳＣＬＣセルラインへの結
合後、アイソタイプにより異なるが、抗体ＢＲ５５−２
はひと補体を活性化し、さらに腫よう細胞を破壊する。
それらの試験で使用される補体の供給源は、ひと血しょ
うまたは血清であり得る。腫よう細胞の破壊は、予め組
み込まれた51Ｃrの放出により測定され得る。腫ようセ
ルラインＳＷ２およびＨ−６９を用いた上記補体介在細
胞溶解実験から得られた結果を図４および５に示す(実
験詳細については実施例２参照)。抗体ＢＲ５５−２
は、これらのセルラインに対する補体活性化により優れ
た殺腫よう活性を有することが判る。 ２.２．ＡＤＣＣ ２.２.１．末梢血液単核細胞を用いた場合。 それらのアイソタイプにより異なるが、抗体ＢＲ５５−
２は、ひとエフェクター細胞を活性化することにより、
ひとＳＣＬＣセルラインを選択的に破壊させる。次い
で、周知の通り、これらのエフェクター細胞は腫よう細
胞を破壊する。例えば、ヘパリンで凝血防止した新鮮な
ひと血液から得られた末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)は、
ひとエフェクター細胞の好都合な供給源である。腫よう
細胞破壊は、例えば予め組み込まれた51Ｃrの放出によ
り測定され得る。上記実験から得られた結果を図６に示
す(実験詳細については実施例３参照)。そこから、抗体
ＢＲ５５−２は、ＡＤＣＣにおけるひとエフェクター細
胞の強力な活性剤であると思われる。 ２.２.２．ヘパリンで凝血防止した新鮮なひと全血を用
いた場合。 上記標準実験において、ひと血しょうまたは血清を補体
供給源として使用し、新たに単離したひとＰＢＭＣをエ
フェクター細胞として使用する。２つのエフェクター要
素は分離されているため、これらの条件は生理学的では
ない。従って、ヘパリンで凝血防止したひと全血による
ひとＳＣＬＣセルラインの溶解についても調べた。この
両エフェクター機構の組み合わせにより、インビボ状況
により近い条件を作り出す。抗体ＢＲ５５−２は、それ
らのアイソタイプによっては、ひと全血によるひとＳＣ
ＬＣセルラインの破壊における、優れた介在物質である
ことが見出された。上記試験の代表的結果を図７に示す
(実験の詳細については実施例４参照)。これらの試験で
使用したヘパリンで凝血防止した全血は、もともと進行
ＳＣＬＣ患者から得られたものである。
る細胞溶解および細胞毒性活性。 この作用は、ひとエフェクター機能の誘導により伝達さ
れる。原則として、抗体による腫よう細胞の破壊は、２
つの一般的機構、すなわち補体依存性細胞溶解(ＣＤＣ)
および抗体依存性細胞・細胞毒性(ＡＤＣＣ)に基づき得
る。 ２.１．ＣＤＣ よく知られている通り、ひとＳＣＬＣセルラインへの結
合後、アイソタイプにより異なるが、抗体ＢＲ５５−２
はひと補体を活性化し、さらに腫よう細胞を破壊する。
それらの試験で使用される補体の供給源は、ひと血しょ
うまたは血清であり得る。腫よう細胞の破壊は、予め組
み込まれた51Ｃrの放出により測定され得る。腫ようセ
ルラインＳＷ２およびＨ−６９を用いた上記補体介在細
胞溶解実験から得られた結果を図４および５に示す(実
験詳細については実施例２参照)。抗体ＢＲ５５−２
は、これらのセルラインに対する補体活性化により優れ
た殺腫よう活性を有することが判る。 ２.２．ＡＤＣＣ ２.２.１．末梢血液単核細胞を用いた場合。 それらのアイソタイプにより異なるが、抗体ＢＲ５５−
２は、ひとエフェクター細胞を活性化することにより、
ひとＳＣＬＣセルラインを選択的に破壊させる。次い
で、周知の通り、これらのエフェクター細胞は腫よう細
胞を破壊する。例えば、ヘパリンで凝血防止した新鮮な
ひと血液から得られた末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)は、
ひとエフェクター細胞の好都合な供給源である。腫よう
細胞破壊は、例えば予め組み込まれた51Ｃrの放出によ
り測定され得る。上記実験から得られた結果を図６に示
す(実験詳細については実施例３参照)。そこから、抗体
ＢＲ５５−２は、ＡＤＣＣにおけるひとエフェクター細
胞の強力な活性剤であると思われる。 ２.２.２．ヘパリンで凝血防止した新鮮なひと全血を用
いた場合。 上記標準実験において、ひと血しょうまたは血清を補体
供給源として使用し、新たに単離したひとＰＢＭＣをエ
フェクター細胞として使用する。２つのエフェクター要
素は分離されているため、これらの条件は生理学的では
ない。従って、ヘパリンで凝血防止したひと全血による
ひとＳＣＬＣセルラインの溶解についても調べた。この
両エフェクター機構の組み合わせにより、インビボ状況
により近い条件を作り出す。抗体ＢＲ５５−２は、それ
らのアイソタイプによっては、ひと全血によるひとＳＣ
ＬＣセルラインの破壊における、優れた介在物質である
ことが見出された。上記試験の代表的結果を図７に示す
(実験の詳細については実施例４参照)。これらの試験で
使用したヘパリンで凝血防止した全血は、もともと進行
ＳＣＬＣ患者から得られたものである。
【０００７】３．ＳＣＬＣ患者における臨床試験から得
られた血清学的結果。 Ｉ期臨床試験の過程において、化学療法に耐性を示す進
行ＳＣＬＣ患者を、抗体ＢＲ５５−２／ＩgＧ３で処置
した。勿論、患者の病状が末期段階であることを考える
と、測定可能な治癒効果を期待できるとは考えられなか
った。２週間にわたって、第１、３、５、８、１０およ
び１２日目の各日に食塩水に溶かした５０mg(１２患者)
または１００mg(４患者)の緩慢な静脈内注入として患者
に抗体を投与した。この２週間の間に、血清試料を下記
検定に付した。 −血清中におけるＢＲ５５−２／ＩgＧ３の濃度、 −別の成分を全く加えない場合の血清のＳＣＬＣセルラ
イン破壊能力(血清中に存在する注入抗体によるＣＤ
Ｃ)、 −投与されたねずみ蛋白質に対するひと免疫応答。 ３.１．血清抗体力価。 抗体ＢＲ５５−２／ＩgＧ３は、静脈内注入後数μg／ml
の濃度で血清中に存在する。用量、半減期(平均約２４
時間)および注入後の時点により異なるが、図８で示さ
れている通り、１注入当たり５０mgによる処置の全期間
にわたって約２μg／ml〜約１３μg／mlの濃度が測定さ
れ得る(実験の詳細については実施例５参照)。血清中の
抗体濃度は、次回注入直前に明らかに最低である。上記
血清抗体力価は、一般に例えばマウス−Ｉgとして検出
され得る(実施例５)。 ３.２．セルラインＳＷ２に関するＳＣＬＣ患者血清の
エクスビボ腫よう細胞毒性(ＣＤＣ)。 処置中の様々な時点で患者から血清試料を集め、ＳＣＬ
ＣセルラインＳＷ２に対する細胞毒性について試験し
た。この腫よう細胞の細胞毒性は、血清中に存在するＢ
Ｒ５５−２抗体による補体活性化に起因する。代表的結
果を図９に示す(実験詳細については実施例６参照)。患
者の血清は、処置の全期間にわたりセルラインＳＷ２に
関する７０−９０％溶解の範囲で明白に細胞毒性を示
す。上記結果は、ひとにおける投与後の抗腫よう抗体の
生物学的効果を明白に立証している。 ３.３．ねずみ免疫グロブリンに対するひと免疫応答。 患者の処置は、通常ひと免疫系により異物として認識さ
れるねずみ免疫グロブリンにより行なわれているため、
ねずみＢＲ５５−２蛋白質に対するひと免疫応答が予想
される(ひと抗マウス抗体＝ＨＡＭＡ)。上記免疫応答
は、ねずみ抗体の排出速度を促進し得る。さらに、この
機構は、腫よう細胞に結合後ひとエフェクター機構の活
性化時に誘発された抗体の生物学的活性の中和を誘導し
得、その結果、臨床的副作用を誘発し得る。意外なこと
に、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３で処置された患者は、一般
に処置期間中および後にも明白な免疫応答を全く呈しな
いことが判明した。顕著なＨＡＭＡ応答は観察されなか
った。測定された抗マウス免疫グロブリンの力価は低
く、血清中の腫よう細胞毒性の誘導を減損または中和す
るのに充分ではない。さらに、免疫応答の誘発に起因し
得る副作用は全く観察されない。処置期間中におけるひ
と免疫応答の発生を示す代表的図表を図１０に示す(実
験の詳細については実施例７参照)。
られた血清学的結果。 Ｉ期臨床試験の過程において、化学療法に耐性を示す進
行ＳＣＬＣ患者を、抗体ＢＲ５５−２／ＩgＧ３で処置
した。勿論、患者の病状が末期段階であることを考える
と、測定可能な治癒効果を期待できるとは考えられなか
った。２週間にわたって、第１、３、５、８、１０およ
び１２日目の各日に食塩水に溶かした５０mg(１２患者)
または１００mg(４患者)の緩慢な静脈内注入として患者
に抗体を投与した。この２週間の間に、血清試料を下記
検定に付した。 −血清中におけるＢＲ５５−２／ＩgＧ３の濃度、 −別の成分を全く加えない場合の血清のＳＣＬＣセルラ
イン破壊能力(血清中に存在する注入抗体によるＣＤ
Ｃ)、 −投与されたねずみ蛋白質に対するひと免疫応答。 ３.１．血清抗体力価。 抗体ＢＲ５５−２／ＩgＧ３は、静脈内注入後数μg／ml
の濃度で血清中に存在する。用量、半減期(平均約２４
時間)および注入後の時点により異なるが、図８で示さ
れている通り、１注入当たり５０mgによる処置の全期間
にわたって約２μg／ml〜約１３μg／mlの濃度が測定さ
れ得る(実験の詳細については実施例５参照)。血清中の
抗体濃度は、次回注入直前に明らかに最低である。上記
血清抗体力価は、一般に例えばマウス−Ｉgとして検出
され得る(実施例５)。 ３.２．セルラインＳＷ２に関するＳＣＬＣ患者血清の
エクスビボ腫よう細胞毒性(ＣＤＣ)。 処置中の様々な時点で患者から血清試料を集め、ＳＣＬ
ＣセルラインＳＷ２に対する細胞毒性について試験し
た。この腫よう細胞の細胞毒性は、血清中に存在するＢ
Ｒ５５−２抗体による補体活性化に起因する。代表的結
果を図９に示す(実験詳細については実施例６参照)。患
者の血清は、処置の全期間にわたりセルラインＳＷ２に
関する７０−９０％溶解の範囲で明白に細胞毒性を示
す。上記結果は、ひとにおける投与後の抗腫よう抗体の
生物学的効果を明白に立証している。 ３.３．ねずみ免疫グロブリンに対するひと免疫応答。 患者の処置は、通常ひと免疫系により異物として認識さ
れるねずみ免疫グロブリンにより行なわれているため、
ねずみＢＲ５５−２蛋白質に対するひと免疫応答が予想
される(ひと抗マウス抗体＝ＨＡＭＡ)。上記免疫応答
は、ねずみ抗体の排出速度を促進し得る。さらに、この
機構は、腫よう細胞に結合後ひとエフェクター機構の活
性化時に誘発された抗体の生物学的活性の中和を誘導し
得、その結果、臨床的副作用を誘発し得る。意外なこと
に、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３で処置された患者は、一般
に処置期間中および後にも明白な免疫応答を全く呈しな
いことが判明した。顕著なＨＡＭＡ応答は観察されなか
った。測定された抗マウス免疫グロブリンの力価は低
く、血清中の腫よう細胞毒性の誘導を減損または中和す
るのに充分ではない。さらに、免疫応答の誘発に起因し
得る副作用は全く観察されない。処置期間中におけるひ
と免疫応答の発生を示す代表的図表を図１０に示す(実
験の詳細については実施例７参照)。
【０００８】４．ＳＣＬＣ患者を含まない異なる臨床試
験の一部として、５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３抗体
を１回投与後、患者の胸膜しん出液、腹水または骨髄に
おける腫よう細胞の実質的インビボ溶解も見出された。
すなわち、ひと細胞溶解の活性化は、腹水、胸膜しん出
液および骨髄において立証され得る。すなわち、上記実
験結果を検討すると、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２
およびＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメント
およびそれらの変異体は、ＳＣＬＣの処置における使用
に適していることが判る。勿論、上述の用途の場合、用
量は、例えば対象患者の年令、病気の段階または投与方
法により変化するため、個々の各状況で専門家により決
定され得る。また、抗体を他の化学療法剤、例えば細胞
増殖抑止剤と組み合わせて使用する場合も用量は変化す
る。投与は、例えば注射または注入により非経口的に行
なわれ、所望によりエフェクター細胞、好ましくは白血
球、例えばオートローガス末梢血単核細胞を一緒に用い
てもよい。投与用量は、例えば約０.０１mg／m2〜約２
０００mg／m2である。共同投与は通常実質的に同時性で
あり、すなわち免疫調節剤は、例えば抗体投与の約１〜
約６日前に投与される。注射は、例えば皮下、筋肉内、
腹膜内、空洞内または静脈内であり得る。ＢＲ５５−２
の変異体は、例えばキメラ抗体、ヒューマナイズド抗
体、クラス-スイッチ変異体、標識抗体および免疫コン
ジュゲートである。フラグメントは、例えばＦabおよび
Ｆ(ab')2フラグメントである。変異体およびフラグメン
トは、公知方法、例えばＥＰＯ２８５０５９記載の方法
に従い製造され得る。標識は、例えば放射性同位元素、
薬剤、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤、レクチンまた
は毒素により行なわれ得る。好ましいのは、無傷のＢＲ
５５−２、特にＩgＧ３アイソタイプのものである。内
面化されているというそれらの特性を考えると、抗体Ｂ
Ｒ５５−２は、毒素および放射性同位元素を標的とする
のに特に適している。「モノクローナル抗体ＢＲ５５−
２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有
するそのフラグメント、またはそれらの変異体」という
語は、寄託されたハイブリドーマＢＲ５５.２(ＢＲ５５
−２／ＩgＧ３)およびＢＲ５５.２Ｓ２a(ＢＲ−５５−
２／ＩgＧ２a)により産生されたモノクローナル抗体に
より認識される抗原を認識するモノクローナル抗体、抗
体フラグメントまたは抗体変異体を包含する。これらの
ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下、各々寄
託番号ＡＴＣＣ ＨＢ９３２４およびＡＴＣＣ ＨＢ９３
４７として、アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されている。抗体ＢＲ５５−２は非常に耐
容性良好である。副作用は、用量、投与持続期間および
投与される抗体のアイソタイプにより異なる。５０mg〜
１００mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を注入後、中程度の
悪心および吐き気のみが大部分の患者において観察され
る。この明細書において利用能または製法について特記
していなければ、この発明の操作で使用される試薬およ
び原材料は公知かつ入手可能であるか、またはこれらは
常法により製造され得るか、またはその均等内容物は常
法により製造され得る。
験の一部として、５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３抗体
を１回投与後、患者の胸膜しん出液、腹水または骨髄に
おける腫よう細胞の実質的インビボ溶解も見出された。
すなわち、ひと細胞溶解の活性化は、腹水、胸膜しん出
液および骨髄において立証され得る。すなわち、上記実
験結果を検討すると、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２
およびＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメント
およびそれらの変異体は、ＳＣＬＣの処置における使用
に適していることが判る。勿論、上述の用途の場合、用
量は、例えば対象患者の年令、病気の段階または投与方
法により変化するため、個々の各状況で専門家により決
定され得る。また、抗体を他の化学療法剤、例えば細胞
増殖抑止剤と組み合わせて使用する場合も用量は変化す
る。投与は、例えば注射または注入により非経口的に行
なわれ、所望によりエフェクター細胞、好ましくは白血
球、例えばオートローガス末梢血単核細胞を一緒に用い
てもよい。投与用量は、例えば約０.０１mg／m2〜約２
０００mg／m2である。共同投与は通常実質的に同時性で
あり、すなわち免疫調節剤は、例えば抗体投与の約１〜
約６日前に投与される。注射は、例えば皮下、筋肉内、
腹膜内、空洞内または静脈内であり得る。ＢＲ５５−２
の変異体は、例えばキメラ抗体、ヒューマナイズド抗
体、クラス-スイッチ変異体、標識抗体および免疫コン
ジュゲートである。フラグメントは、例えばＦabおよび
Ｆ(ab')2フラグメントである。変異体およびフラグメン
トは、公知方法、例えばＥＰＯ２８５０５９記載の方法
に従い製造され得る。標識は、例えば放射性同位元素、
薬剤、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤、レクチンまた
は毒素により行なわれ得る。好ましいのは、無傷のＢＲ
５５−２、特にＩgＧ３アイソタイプのものである。内
面化されているというそれらの特性を考えると、抗体Ｂ
Ｒ５５−２は、毒素および放射性同位元素を標的とする
のに特に適している。「モノクローナル抗体ＢＲ５５−
２またはモノクローナル抗体ＢＲ５５−２の特異性を有
するそのフラグメント、またはそれらの変異体」という
語は、寄託されたハイブリドーマＢＲ５５.２(ＢＲ５５
−２／ＩgＧ３)およびＢＲ５５.２Ｓ２a(ＢＲ−５５−
２／ＩgＧ２a)により産生されたモノクローナル抗体に
より認識される抗原を認識するモノクローナル抗体、抗
体フラグメントまたは抗体変異体を包含する。これらの
ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下、各々寄
託番号ＡＴＣＣ ＨＢ９３２４およびＡＴＣＣ ＨＢ９３
４７として、アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されている。抗体ＢＲ５５−２は非常に耐
容性良好である。副作用は、用量、投与持続期間および
投与される抗体のアイソタイプにより異なる。５０mg〜
１００mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を注入後、中程度の
悪心および吐き気のみが大部分の患者において観察され
る。この明細書において利用能または製法について特記
していなければ、この発明の操作で使用される試薬およ
び原材料は公知かつ入手可能であるか、またはこれらは
常法により製造され得るか、またはその均等内容物は常
法により製造され得る。
【０００９】図面の説明 図１:ＳＣＬＣセルラインＳＷ２に対するＢＲ５５−２
アイソタイプＩgＧ３(星印)およびＩgＧ２a(白い四角)
の結合特性(細胞ＥＬＩＳＡ)。 図２:図１と同様、ただし、セルラインＯＨ−１の場
合。 図３:図１と同様、ただし、セルラインＨ−６９の場
合。 図４:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３による補体依存性細胞溶解
(ＣＤＣ)(ＳＣＬＣセルラインＳＷ２の細胞の溶解％)。 図５:図４と同様、ただし、セルラインＨ−６９の場合
で、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３およびＢＲ５５−２／ＩgＧ
２aによる。 図６:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、エフェクター
細胞としてＰＢＭＣを用いたＳＣＬＣセルラインＳＷ２
およびＨ−６９に関するＡＤＣＣ(細胞の溶解％)。 図７:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、ヘパリンで凝
血防止した新鮮なひと全血によるＳＷ２細胞の溶解。 図８:ＳＣＬＣ患者からの血清におけるマウスＩgＧ３抗
体力価としてのＢＲ５５−２測定。第１、３、５、８、
１０および１２日目の各日に５０mgのＢＲ５５−２／Ｉ
gＧ３が投与された。断続的垂線は注入持続時間を示
す。 図９:第１、３、５、８、１０および１２日目の各日に
５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を投与した後のＳＣＬ
Ｃ患者の血清における補体依存性細胞溶解(溶解したＳ
Ｗ２細胞の％)。断続的垂線は注入持続時間を示す。 図１０:ＳＣＬＣ患者からの血清におけるＢＲ５５−２
／ＩgＧ３に対する免疫応答。第１、３、５、８、１０
および１２日目の各日に５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ
３を投与した後のＨＡＭＡ力価。
アイソタイプＩgＧ３(星印)およびＩgＧ２a(白い四角)
の結合特性(細胞ＥＬＩＳＡ)。 図２:図１と同様、ただし、セルラインＯＨ−１の場
合。 図３:図１と同様、ただし、セルラインＨ−６９の場
合。 図４:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３による補体依存性細胞溶解
(ＣＤＣ)(ＳＣＬＣセルラインＳＷ２の細胞の溶解％)。 図５:図４と同様、ただし、セルラインＨ−６９の場合
で、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３およびＢＲ５５−２／ＩgＧ
２aによる。 図６:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、エフェクター
細胞としてＰＢＭＣを用いたＳＣＬＣセルラインＳＷ２
およびＨ−６９に関するＡＤＣＣ(細胞の溶解％)。 図７:ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、ヘパリンで凝
血防止した新鮮なひと全血によるＳＷ２細胞の溶解。 図８:ＳＣＬＣ患者からの血清におけるマウスＩgＧ３抗
体力価としてのＢＲ５５−２測定。第１、３、５、８、
１０および１２日目の各日に５０mgのＢＲ５５−２／Ｉ
gＧ３が投与された。断続的垂線は注入持続時間を示
す。 図９:第１、３、５、８、１０および１２日目の各日に
５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を投与した後のＳＣＬ
Ｃ患者の血清における補体依存性細胞溶解(溶解したＳ
Ｗ２細胞の％)。断続的垂線は注入持続時間を示す。 図１０:ＳＣＬＣ患者からの血清におけるＢＲ５５−２
／ＩgＧ３に対する免疫応答。第１、３、５、８、１０
および１２日目の各日に５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ
３を投与した後のＨＡＭＡ力価。
【００１０】以下、実施例によりこの発明を説明する。
温度は全て摂氏である。略語は下記の意味を有する。 ＡＤＣＣ: 抗体依存性細胞・細胞溶解。 ＢＳＡ: 牛血清アルブミン。 ＣＤＣ: 補体依存性細胞溶解。 ＥＤＴＡ: エチレンジアミン四酢酸。 ＥＬＩＳＡ: 固相酵素免疫測定法。 ＦＣＳ: 胎児牛血清。 ＨＡＭＡ: ひと抗マウス抗体。 ＰＢＭＣ: 末梢血単核細胞。 ＰＢＳ: 燐酸緩衝食塩水。 ＲＰＭＩ: ロズウェル・パーク・メモリアル・インス
ティテュート。 ＳＤＳ: ドデシル硫酸ナトリウム。 ＳＣＬＣ: 小細胞肺癌。 実施例で示された原材料は次の通りである。セルライン
Ｈ−６９、ＯＨ−１およびＳＷ２:ひとＳＣＬＣライン
(ワイブル等、「キャンサー・リサーチ」、４８[１９８
８]４３１８−４３２３)。 培地Ａ: ＲＰＭＩ １６４０＋２g／lのＮaＨＣＯ3 １００Ｕ／mlのペニシリンＧ １００μg／mlのストレプトマイシン・スルフェート ４ミリモルのグルタミン １０％のＦＣＳ(加熱不活化、γ−グロブリン−不含有) フィコル-パーク:密度１.０７７±０.００１g／ml 完全ＰＢＳ: ８.０gのＮaＣl ０.２gのＫＨ2ＰＯ4 ０.２gのＫＣl １.１５gのＮa2ＨＰＯ4 ０.１３gのＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ０.１gのＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ 蒸留水、適量加えて１ｌとする 不完全ＰＢＳ: １３８.０ミリモルのＮaＣl １.５ミリモルのＫＯＨ ２.７ミリモルのＫＣl ６.５ミリモルのＮa2ＨＰＯ4 pＨ７.２ コーティング緩衝液: １５ミリモルのＮa2ＣＯ3 ３５ミリモルのＮaＨＣＯ3 ３ミリモルのＮaＮ3 pＨ９.６ 染色緩衝液: ２４.３ミリモルのくえん酸 ５１.４ミリモルのＮa2ＨＰＯ4 pＨ５.０ 洗浄緩衝液: ２％ＮaＣl ０.２％トリトンＸ−１００ １０x過剰の１０％不完全ＰＢＳ Ｎa2 51ＣrＯ4:１mＣi／ml。
温度は全て摂氏である。略語は下記の意味を有する。 ＡＤＣＣ: 抗体依存性細胞・細胞溶解。 ＢＳＡ: 牛血清アルブミン。 ＣＤＣ: 補体依存性細胞溶解。 ＥＤＴＡ: エチレンジアミン四酢酸。 ＥＬＩＳＡ: 固相酵素免疫測定法。 ＦＣＳ: 胎児牛血清。 ＨＡＭＡ: ひと抗マウス抗体。 ＰＢＭＣ: 末梢血単核細胞。 ＰＢＳ: 燐酸緩衝食塩水。 ＲＰＭＩ: ロズウェル・パーク・メモリアル・インス
ティテュート。 ＳＤＳ: ドデシル硫酸ナトリウム。 ＳＣＬＣ: 小細胞肺癌。 実施例で示された原材料は次の通りである。セルライン
Ｈ−６９、ＯＨ−１およびＳＷ２:ひとＳＣＬＣライン
(ワイブル等、「キャンサー・リサーチ」、４８[１９８
８]４３１８−４３２３)。 培地Ａ: ＲＰＭＩ １６４０＋２g／lのＮaＨＣＯ3 １００Ｕ／mlのペニシリンＧ １００μg／mlのストレプトマイシン・スルフェート ４ミリモルのグルタミン １０％のＦＣＳ(加熱不活化、γ−グロブリン−不含有) フィコル-パーク:密度１.０７７±０.００１g／ml 完全ＰＢＳ: ８.０gのＮaＣl ０.２gのＫＨ2ＰＯ4 ０.２gのＫＣl １.１５gのＮa2ＨＰＯ4 ０.１３gのＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ０.１gのＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ 蒸留水、適量加えて１ｌとする 不完全ＰＢＳ: １３８.０ミリモルのＮaＣl １.５ミリモルのＫＯＨ ２.７ミリモルのＫＣl ６.５ミリモルのＮa2ＨＰＯ4 pＨ７.２ コーティング緩衝液: １５ミリモルのＮa2ＣＯ3 ３５ミリモルのＮaＨＣＯ3 ３ミリモルのＮaＮ3 pＨ９.６ 染色緩衝液: ２４.３ミリモルのくえん酸 ５１.４ミリモルのＮa2ＨＰＯ4 pＨ５.０ 洗浄緩衝液: ２％ＮaＣl ０.２％トリトンＸ−１００ １０x過剰の１０％不完全ＰＢＳ Ｎa2 51ＣrＯ4:１mＣi／ml。
【００１１】
【実施例】実施例１ ＳＣＬＣセルラインへのＢＲ５５−２抗体の結合性(細
胞ＥＬＩＳＡ)。マイクロタイター・プレートをポリ−
Ｌ−リジン臭化水素酸塩で予備処理し(２０−０kＤ、不
完全ＰＢＳ中２０μg／ml、１００μl／ウェル、３０分
間、室温)、不完全ＰＢＳで２回洗浄し(２００μg／ウ
ェル)、次いで、４°で一夜４x１０6細胞／mlの濃度で
試験されるセルラインの細胞懸濁液(５０μlの細胞懸濁
液／ウェル、培地Ａ)とインキュベーションする。遠心
分離し、上清を除去した後、細胞を、室温で５分間１ウ
ェル当たり５０μlのグルタルジアルデヒド(生理食塩水
中０.１％)により固定し、遠心分離し、上清を除去し、
細胞を２００μl／ウェルの不完全ＰＢＳ／１％ＢＳＡ
／０.１％ＮaＮ3に再懸濁し、室温で１時間放置した。
上清を除去し、３７°で１時間１ウェル当たり２００μ
lのＰＢＳ／トウィーン２０(０.０５％)で２回洗浄した
後、抗体を３７°で１時間インキュベーションする(コ
ーティング緩衝液は不完全ＰＢＳである)。試験細胞へ
の抗体結合の測定に関する最高濃度として約１００μg
／mlが選択される。非結合抗体を１ウェル当たり２×１
００μlの氷冷ＰＢＳ／トウィーン２０(０.０５％)によ
り洗浄し、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗体をピ
ペットで加える。抗体検定に使用されるコンジュゲート
は、不完全ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中うさぎ抗マウスＩgＧ
−ペルオキシダーゼまたはうさぎ抗マウスＩgＧ−Ｆ(a
b')2−ペルオキシダーゼ(例えば、ディアノバ・カンパ
ニーの試薬)１:１０００である。３７°で４０〜６０分
間インキュベーション後、ウェルを上記ＰＢＳ／トウィ
ーン２０溶液で３回洗浄し、次いで、基質溶液:４０mg
のo−フェニレンジアミン・ジ塩酸塩、１００mlの染色
緩衝液、２０μlのＨ2Ｏ2(３０％)１００μlを各ウェル
に加える。約５分後、５０μlの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4／ウェル
を加えることにより、色素展開を止める。４９２nmでの
吸光度を測定することにより(較正は６２０nmで行う)、
細胞に対する抗体の結合を測定する。非付着性セルライ
ンを使用する場合、洗浄段階は全て細胞遠心分離および
再懸濁により行なわれる。
胞ＥＬＩＳＡ)。マイクロタイター・プレートをポリ−
Ｌ−リジン臭化水素酸塩で予備処理し(２０−０kＤ、不
完全ＰＢＳ中２０μg／ml、１００μl／ウェル、３０分
間、室温)、不完全ＰＢＳで２回洗浄し(２００μg／ウ
ェル)、次いで、４°で一夜４x１０6細胞／mlの濃度で
試験されるセルラインの細胞懸濁液(５０μlの細胞懸濁
液／ウェル、培地Ａ)とインキュベーションする。遠心
分離し、上清を除去した後、細胞を、室温で５分間１ウ
ェル当たり５０μlのグルタルジアルデヒド(生理食塩水
中０.１％)により固定し、遠心分離し、上清を除去し、
細胞を２００μl／ウェルの不完全ＰＢＳ／１％ＢＳＡ
／０.１％ＮaＮ3に再懸濁し、室温で１時間放置した。
上清を除去し、３７°で１時間１ウェル当たり２００μ
lのＰＢＳ／トウィーン２０(０.０５％)で２回洗浄した
後、抗体を３７°で１時間インキュベーションする(コ
ーティング緩衝液は不完全ＰＢＳである)。試験細胞へ
の抗体結合の測定に関する最高濃度として約１００μg
／mlが選択される。非結合抗体を１ウェル当たり２×１
００μlの氷冷ＰＢＳ／トウィーン２０(０.０５％)によ
り洗浄し、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗体をピ
ペットで加える。抗体検定に使用されるコンジュゲート
は、不完全ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中うさぎ抗マウスＩgＧ
−ペルオキシダーゼまたはうさぎ抗マウスＩgＧ−Ｆ(a
b')2−ペルオキシダーゼ(例えば、ディアノバ・カンパ
ニーの試薬)１:１０００である。３７°で４０〜６０分
間インキュベーション後、ウェルを上記ＰＢＳ／トウィ
ーン２０溶液で３回洗浄し、次いで、基質溶液:４０mg
のo−フェニレンジアミン・ジ塩酸塩、１００mlの染色
緩衝液、２０μlのＨ2Ｏ2(３０％)１００μlを各ウェル
に加える。約５分後、５０μlの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4／ウェル
を加えることにより、色素展開を止める。４９２nmでの
吸光度を測定することにより(較正は６２０nmで行う)、
細胞に対する抗体の結合を測定する。非付着性セルライ
ンを使用する場合、洗浄段階は全て細胞遠心分離および
再懸濁により行なわれる。
【００１２】実施例２ インビトロＳＣＬＣセルラインのひと補体依存性細胞溶
解(ＣＤＣ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。 標的細胞の51Ｃr標識:細胞を培養フラスコから集め、３
７°／５％ＣＯ2で２時間８００μlの培地Ａ中２×１０
6〜５×１０6細胞の濃度で１００μＣiのＮa2 51ＣrＯ4
とインキュベーションする。次いで、細胞を培地Ａで洗
浄することにより、過剰の51Ｃrを除去し、新鮮な培地
Ａに再懸濁し、それらの濃度を２×１０5〜３×１０5細
胞／mlに調節する。 ＣＤＣ:この標的細胞懸濁液の１００μlアリコートをピ
ペットで各ウェルに移し、不完全ＰＢＳ中所望濃度に希
釈した抗体溶液の５０μlアリコートを加える。次い
で、１ウェルに対し、ひと補体製品(補体の最終希釈率
＞１:１５)の１００μlアリコートを加え、細胞を一夜
３７°／５％ＣＯ2でインキュベーションする。上清を
スキャトロン・ハーベスティング・プレスにより採取
し、γ−計数管で計数する。この結果、実験的放出の値
が得られる。全51Ｃr放出を測定するため、上記と同様
ではあるが、補体製品を２％ＳＤＳ、５０ミリモルＮa2
ＣＯ3および１０ミリモルＥＤＴＡの溶液と置き換え
て、細胞を処理する。補体製品を培地Ａと、また抗体溶
液を５０μlの完全ＰＢＳまたはＮaＣl(０.８６％)と置
き換えることにより、自然発生的51Ｃr放出値が得られ
る。 計数後、結果を次の要領でコンピューター処理する。 溶解％＝(実験的放出−自然発生的放出)×１００／(全
放出−自然発生的放出)
解(ＣＤＣ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。 標的細胞の51Ｃr標識:細胞を培養フラスコから集め、３
７°／５％ＣＯ2で２時間８００μlの培地Ａ中２×１０
6〜５×１０6細胞の濃度で１００μＣiのＮa2 51ＣrＯ4
とインキュベーションする。次いで、細胞を培地Ａで洗
浄することにより、過剰の51Ｃrを除去し、新鮮な培地
Ａに再懸濁し、それらの濃度を２×１０5〜３×１０5細
胞／mlに調節する。 ＣＤＣ:この標的細胞懸濁液の１００μlアリコートをピ
ペットで各ウェルに移し、不完全ＰＢＳ中所望濃度に希
釈した抗体溶液の５０μlアリコートを加える。次い
で、１ウェルに対し、ひと補体製品(補体の最終希釈率
＞１:１５)の１００μlアリコートを加え、細胞を一夜
３７°／５％ＣＯ2でインキュベーションする。上清を
スキャトロン・ハーベスティング・プレスにより採取
し、γ−計数管で計数する。この結果、実験的放出の値
が得られる。全51Ｃr放出を測定するため、上記と同様
ではあるが、補体製品を２％ＳＤＳ、５０ミリモルＮa2
ＣＯ3および１０ミリモルＥＤＴＡの溶液と置き換え
て、細胞を処理する。補体製品を培地Ａと、また抗体溶
液を５０μlの完全ＰＢＳまたはＮaＣl(０.８６％)と置
き換えることにより、自然発生的51Ｃr放出値が得られ
る。 計数後、結果を次の要領でコンピューター処理する。 溶解％＝(実験的放出−自然発生的放出)×１００／(全
放出−自然発生的放出)
【００１３】実施例３ 末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を用いたひとＳＣＬＣセルラ
インに関する抗体依存性細胞細胞毒性(ＡＤＣＣ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。標的細胞
の51Ｃr標識は、上記実施例２の記載に従い行なわれ
る。 ＰＢＭＣの単離。 ヘパリンで凝血防止した新鮮なひと血液５０mlを、６０
mlの０.１％グルコース含有完全ＰＢＳにより希釈す
る。この溶液の１５mlアリコートを１５mlのフィコル-
パーク溶液の上部に載せ、管を３０〜６０分間４００g
で遠心分離する。血しょう上清を廃棄し、ＰＢＭＣ層を
集め、完全ＰＢＳ＋０.１％グルコースにより５０mlに
希釈する。約８０gで遠心分離(１０分間)し、２５−３
０mlの完全ＰＢＳ＋０.１％グルコースに沈澱物を再懸
濁し、再遠心分離(８０g、１０分間)した後、沈澱物を
集め、培地Ａに懸濁し、細胞を計数し、懸濁液を培地Ａ
により約２×１０6〜９×１０6細胞／mlに希釈する。１
００μlアリコートをピペットでマイクロタイター・プ
レートの各ウェルに移し、エフェクター細胞を一夜３７
°／５％ＣＯ2でインキュベーションする。 ＡＤＣＣ:１００μlの51Ｃr標識標的細胞を、プレイン
キュベーションしたエフェクター細胞に所望のエフェク
ター細胞対標的細胞比で加える。不完全ＰＢＳにより所
望濃度に希釈したモノクローナル抗体溶液５０μlを加
え、プレートを３７°／５％ＣＯ2で４〜２０時間イン
キュベーションする。次いで、上清をスキャトロン・ハ
ーベスティング・プレスにより採取し、γ−計数管で計
数する。この結果、実験的放出値が得られる。全51Ｃr
放出を上記と同様に測定するが、ただしＰＢＭＣを１０
０μlの２％ＳＤＳ、５０ミリモルのＮa2ＣＯ3および１
０ミリモルのＥＤＴＡと置き換え、抗体溶液を５０μl
の不完全ＰＢＳと置き換える。ＰＢＭＣを１００μlの
培地Ａと置き換え、抗体溶液を５０μlの不完全ＰＢＳ
と置き換えることにより、自然発生的51Ｃr放出が得ら
れる。結果を上記実施例２の記載と同様にコンピュータ
ー処理する。
インに関する抗体依存性細胞細胞毒性(ＡＤＣＣ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。標的細胞
の51Ｃr標識は、上記実施例２の記載に従い行なわれ
る。 ＰＢＭＣの単離。 ヘパリンで凝血防止した新鮮なひと血液５０mlを、６０
mlの０.１％グルコース含有完全ＰＢＳにより希釈す
る。この溶液の１５mlアリコートを１５mlのフィコル-
パーク溶液の上部に載せ、管を３０〜６０分間４００g
で遠心分離する。血しょう上清を廃棄し、ＰＢＭＣ層を
集め、完全ＰＢＳ＋０.１％グルコースにより５０mlに
希釈する。約８０gで遠心分離(１０分間)し、２５−３
０mlの完全ＰＢＳ＋０.１％グルコースに沈澱物を再懸
濁し、再遠心分離(８０g、１０分間)した後、沈澱物を
集め、培地Ａに懸濁し、細胞を計数し、懸濁液を培地Ａ
により約２×１０6〜９×１０6細胞／mlに希釈する。１
００μlアリコートをピペットでマイクロタイター・プ
レートの各ウェルに移し、エフェクター細胞を一夜３７
°／５％ＣＯ2でインキュベーションする。 ＡＤＣＣ:１００μlの51Ｃr標識標的細胞を、プレイン
キュベーションしたエフェクター細胞に所望のエフェク
ター細胞対標的細胞比で加える。不完全ＰＢＳにより所
望濃度に希釈したモノクローナル抗体溶液５０μlを加
え、プレートを３７°／５％ＣＯ2で４〜２０時間イン
キュベーションする。次いで、上清をスキャトロン・ハ
ーベスティング・プレスにより採取し、γ−計数管で計
数する。この結果、実験的放出値が得られる。全51Ｃr
放出を上記と同様に測定するが、ただしＰＢＭＣを１０
０μlの２％ＳＤＳ、５０ミリモルのＮa2ＣＯ3および１
０ミリモルのＥＤＴＡと置き換え、抗体溶液を５０μl
の不完全ＰＢＳと置き換える。ＰＢＭＣを１００μlの
培地Ａと置き換え、抗体溶液を５０μlの不完全ＰＢＳ
と置き換えることにより、自然発生的51Ｃr放出が得ら
れる。結果を上記実施例２の記載と同様にコンピュータ
ー処理する。
【００１４】実施例４ ヘパリンで凝血防止した新鮮なひと全血を用いたＳＣＬ
Ｃセルラインに関する抗体依存性細胞細胞毒性(ＡＤＣ
Ｃ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。標的細胞
の51Ｃr標識は、上記実施例２の記載に従い行なわれ
る。新鮮なひと全血を培地Ａで１:３に希釈し、１００
μlアリコートをマイクロタイター・プレートのウェル
にピペットで移す。不完全ＰＢＳで所望濃度に希釈した
抗体溶液５０μlおよび標識した標的細胞の１００μlア
リコートを加える。３７°／５％ＣＯ2で４〜２０時間
インキュベーション後、上清をスキャトロン・ハーベス
ティング・プレスで採取し、51Ｃrをγ−計数管で測定
する(＝実験的放出)。全51Ｃr放出を測定するため、細
胞を１００μlの２％ＳＤＳ、５０ミリモルのＮa2ＣＯ3
および１０ミリモルのＥＤＴＡで処理し、抗体溶液の代
わりに５０μlの不完全ＰＢＳを加える。１００μlの培
地Ａおよび５０μlのＰＢＳを標的細胞に加えることに
より、自然発生的51Ｃr放出が得られる。結果を上記実
施例２の記載と同様にコンピューター処理する。
Ｃセルラインに関する抗体依存性細胞細胞毒性(ＡＤＣ
Ｃ)。 検定の前日、腫よう標的細胞を新鮮な培地Ａへ移し、細
胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。標的細胞
の51Ｃr標識は、上記実施例２の記載に従い行なわれ
る。新鮮なひと全血を培地Ａで１:３に希釈し、１００
μlアリコートをマイクロタイター・プレートのウェル
にピペットで移す。不完全ＰＢＳで所望濃度に希釈した
抗体溶液５０μlおよび標識した標的細胞の１００μlア
リコートを加える。３７°／５％ＣＯ2で４〜２０時間
インキュベーション後、上清をスキャトロン・ハーベス
ティング・プレスで採取し、51Ｃrをγ−計数管で測定
する(＝実験的放出)。全51Ｃr放出を測定するため、細
胞を１００μlの２％ＳＤＳ、５０ミリモルのＮa2ＣＯ3
および１０ミリモルのＥＤＴＡで処理し、抗体溶液の代
わりに５０μlの不完全ＰＢＳを加える。１００μlの培
地Ａおよび５０μlのＰＢＳを標的細胞に加えることに
より、自然発生的51Ｃr放出が得られる。結果を上記実
施例２の記載と同様にコンピューター処理する。
【００１５】実施例５ 患者血清におけるマウス−ＩgＧ３抗体力価の測定(ＥＬ
ＩＳＡ)。 うさぎ抗マウスＩgＧ溶液の１００μlアリコートを、マ
イクロタイター・プレートのウェルに加え、コーティン
グ緩衝液を加え、３７°で３０〜６０分間インキュベー
ションを行う。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、２
００μlの不完全ＰＢＳ／５％ＦＣＳを加え、３７°で
３０分間インキュベーションを行う。プレートを洗浄
し、標準(ＢＲ５５−２／ＩgＧ３)および検定される血
清の様々な希釈率の１００μlアリコートを加え(不完全
ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で希釈)、プレートを３７°で６
０分間インキュベーションする。非結合抗体を上記と同
様に洗浄し、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗体(う
さぎ−抗マウスＩgＧ３／ペルオキシダーゼ)の１００μ
lアリコートを加える。３７°で３０分間インキュベー
ション後、プレートを上記洗浄緩衝液で４回および染色
緩衝液で２回洗浄する。基質溶液(４０mgのo−フェニレ
ンジアミン・ジ塩酸塩、１００mlの染色緩衝液、２０μ
lの３０％Ｈ2Ｏ2)の１００μlアリコートを加え、４Ｎ
Ｈ2ＳＯ4の５０μlアリコートで４〜５分後に色素展開
を止める。４９２nmでの吸光度を測定することにより光
度測定的評価を行い(レファレンス測定６２０nm)、試料
の抗体力価を標準曲線から読み取る。
ＩＳＡ)。 うさぎ抗マウスＩgＧ溶液の１００μlアリコートを、マ
イクロタイター・プレートのウェルに加え、コーティン
グ緩衝液を加え、３７°で３０〜６０分間インキュベー
ションを行う。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、２
００μlの不完全ＰＢＳ／５％ＦＣＳを加え、３７°で
３０分間インキュベーションを行う。プレートを洗浄
し、標準(ＢＲ５５−２／ＩgＧ３)および検定される血
清の様々な希釈率の１００μlアリコートを加え(不完全
ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で希釈)、プレートを３７°で６
０分間インキュベーションする。非結合抗体を上記と同
様に洗浄し、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗体(う
さぎ−抗マウスＩgＧ３／ペルオキシダーゼ)の１００μ
lアリコートを加える。３７°で３０分間インキュベー
ション後、プレートを上記洗浄緩衝液で４回および染色
緩衝液で２回洗浄する。基質溶液(４０mgのo−フェニレ
ンジアミン・ジ塩酸塩、１００mlの染色緩衝液、２０μ
lの３０％Ｈ2Ｏ2)の１００μlアリコートを加え、４Ｎ
Ｈ2ＳＯ4の５０μlアリコートで４〜５分後に色素展開
を止める。４９２nmでの吸光度を測定することにより光
度測定的評価を行い(レファレンス測定６２０nm)、試料
の抗体力価を標準曲線から読み取る。
【００１６】実施例６ 処置されたＳＣＬＣ患者からの血清のエクスビボ腫よう
細胞毒性。検定の前日、腫よう標的細胞(例えば、ひと
ＳＣＬＣセルラインＳＷ２から)を新鮮な培地Ａへ移
し、細胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。患
者血清試料を冷凍し、１回でのみ解凍する。それらは非
希釈状態で使用される。１００μlアリコートをピペッ
トでマイクロタイター・プレートのウェルに移し、４°
に保ちながら、上記実施例２の記載と同様に標的細胞を
51Ｃrで標識し、患者血清に加える。３７°／５％ＣＯ2
で一夜インキュベーション後、上清をスキャトロン・ハ
ーベスティング・プレスで採取し、51Ｃr放出をγ−計
数管で測定する(＝実験的放出)。全51Ｃr放出を測定す
るため、細胞を、血清の代わりに２％ＳＤＳ、５０ミリ
モルのＮa2ＣＯ3および１０ミリモルのＥＤＴＡで処理
する。血清の代わりに培地Ａを用いることにより、自然
発生的51Ｃr放出が得られる。結果を上記実施例２の記
載と同様にコンピューター処理する。
細胞毒性。検定の前日、腫よう標的細胞(例えば、ひと
ＳＣＬＣセルラインＳＷ２から)を新鮮な培地Ａへ移
し、細胞培養フラスコ中３７°／５％ＣＯ2に保つ。患
者血清試料を冷凍し、１回でのみ解凍する。それらは非
希釈状態で使用される。１００μlアリコートをピペッ
トでマイクロタイター・プレートのウェルに移し、４°
に保ちながら、上記実施例２の記載と同様に標的細胞を
51Ｃrで標識し、患者血清に加える。３７°／５％ＣＯ2
で一夜インキュベーション後、上清をスキャトロン・ハ
ーベスティング・プレスで採取し、51Ｃr放出をγ−計
数管で測定する(＝実験的放出)。全51Ｃr放出を測定す
るため、細胞を、血清の代わりに２％ＳＤＳ、５０ミリ
モルのＮa2ＣＯ3および１０ミリモルのＥＤＴＡで処理
する。血清の代わりに培地Ａを用いることにより、自然
発生的51Ｃr放出が得られる。結果を上記実施例２の記
載と同様にコンピューター処理する。
【００１７】実施例７ マウス免疫グロブリンに対するひと免疫応答の測定(Ｅ
ＬＩＳＡ)(ＨＡＭＡ)。１０μg／mlの濃度のＢＲ５５−
２／ＩgＧ３溶液の１００μlアリコートをマイクロタイ
ター・プレートのウェルに取り、２００μl／ウェルの
割合でコーティング緩衝液および３％ゼラチンを加えた
後、患者血清(ＰＢＳ／１％ゼラチン中で希釈)のインキ
ュベーションを３７°で３０〜６０分間行う。さらに後
の手順およびコンピューター処理は上記実施例５の要領
で行われるが、ただし、使用されるペルオキシダーゼ-
コンジュゲート抗体は、ＰＢＳ／１％ゼラチン中で希釈
した、やぎ抗ひとＩgＧ＋ＩgＭ／ペルオキシダーゼであ
る。
ＬＩＳＡ)(ＨＡＭＡ)。１０μg／mlの濃度のＢＲ５５−
２／ＩgＧ３溶液の１００μlアリコートをマイクロタイ
ター・プレートのウェルに取り、２００μl／ウェルの
割合でコーティング緩衝液および３％ゼラチンを加えた
後、患者血清(ＰＢＳ／１％ゼラチン中で希釈)のインキ
ュベーションを３７°で３０〜６０分間行う。さらに後
の手順およびコンピューター処理は上記実施例５の要領
で行われるが、ただし、使用されるペルオキシダーゼ-
コンジュゲート抗体は、ＰＢＳ／１％ゼラチン中で希釈
した、やぎ抗ひとＩgＧ＋ＩgＭ／ペルオキシダーゼであ
る。
【００１８】実施例８ ＳＣＬＣセルラインＳＷ２の糖蛋白質におけるルイスＹ
抗原の発現。ＳＷ２細胞の糖蛋白質または原形質膜を常
法(トム等、「バイオケミカル・ジャーナル」(Ｂiochem．
Ｊ.)、１６８[１９７７]１８７−１９４)により単離す
る。ＳＤＳゲル電気泳動(ラエムリ、「ネイチャー」(Ｎat
ure)２２７[１９７０]６８０−６８５)後、慣用的ウエ
スタン・ブロット分析(ワイロンおよび中根、「イミュノ
フルオレセンス・アンド・リレイテッド・ステイング・
テクニクス」(Ｉmmunofluoroscence and RelatedStaing
Techniques)、エルセビア／ノース・ホーランド・バイ
オケミカル・プレス、アムステルダム[１９７８]２１５
−２２４)により、抗体ＢＲ５５−２は、セルラインＳ
Ｗ２の糖蛋白質フラクションへ特異的に結合することが
示され得る。
抗原の発現。ＳＷ２細胞の糖蛋白質または原形質膜を常
法(トム等、「バイオケミカル・ジャーナル」(Ｂiochem．
Ｊ.)、１６８[１９７７]１８７−１９４)により単離す
る。ＳＤＳゲル電気泳動(ラエムリ、「ネイチャー」(Ｎat
ure)２２７[１９７０]６８０−６８５)後、慣用的ウエ
スタン・ブロット分析(ワイロンおよび中根、「イミュノ
フルオレセンス・アンド・リレイテッド・ステイング・
テクニクス」(Ｉmmunofluoroscence and RelatedStaing
Techniques)、エルセビア／ノース・ホーランド・バイ
オケミカル・プレス、アムステルダム[１９７８]２１５
−２２４)により、抗体ＢＲ５５−２は、セルラインＳ
Ｗ２の糖蛋白質フラクションへ特異的に結合することが
示され得る。
【図１】 ＳＣＬＣセルラインＳＷ２に対するＢＲ５５
−２アイソタイプＩgＧ３(星印)およびＩgＧ２a(白い四
角)の結合特性(細胞ＥＬＩＳＡ)を示す図である。
−２アイソタイプＩgＧ３(星印)およびＩgＧ２a(白い四
角)の結合特性(細胞ＥＬＩＳＡ)を示す図である。
【図２】 図１と同様(ただし、セルラインＯＨ−１の
場合)の図である。
場合)の図である。
【図３】 図１と同様(ただし、セルラインＨ−６９の
場合)の図である。
場合)の図である。
【図４】 ＢＲ５５−２／ＩgＧ３による補体依存性細
胞溶解(ＣＤＣ)(ＳＣＬＣセルラインＳＷ２の細胞の溶
解％で示す)を示す図である。
胞溶解(ＣＤＣ)(ＳＣＬＣセルラインＳＷ２の細胞の溶
解％で示す)を示す図である。
【図５】 図４と同様（ただし、セルラインＨ−６９の
場合で、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３およびＢＲ５５−２／
ＩgＧ２aによる）の図である。
場合で、ＢＲ５５−２／ＩgＧ３およびＢＲ５５−２／
ＩgＧ２aによる）の図である。
【図６】 ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、エフェ
クター細胞としてＰＢＭＣを用いたＳＣＬＣセルライン
ＳＷ２およびＨ−６９に関するＡＤＣＣ(細胞の溶解％)
を示す図である。
クター細胞としてＰＢＭＣを用いたＳＣＬＣセルライン
ＳＷ２およびＨ−６９に関するＡＤＣＣ(細胞の溶解％)
を示す図である。
【図７】 ＢＲ５５−２／ＩgＧ３が介在する、ヘパリ
ンで凝血防止した新鮮なひと全血によるＳＷ２細胞の溶
解を示す図である。
ンで凝血防止した新鮮なひと全血によるＳＷ２細胞の溶
解を示す図である。
【図８】 ＳＣＬＣ患者からの血清におけるマウスＩg
Ｇ３抗体力価としてのＢＲ５５−２測定を示す図であ
る。
Ｇ３抗体力価としてのＢＲ５５−２測定を示す図であ
る。
【図９】 第１、３、５、８、１０および１２日目の各
日に５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を投与した後のＳ
ＣＬＣ患者の血清における補体依存性細胞溶解(溶解し
たＳＷ２細胞の％を示す)を示す図である。
日に５０mgのＢＲ５５−２／ＩgＧ３を投与した後のＳ
ＣＬＣ患者の血清における補体依存性細胞溶解(溶解し
たＳＷ２細胞の％を示す)を示す図である。
【図１０】 ＳＣＬＣ患者からの血清におけるＢＲ５５
−２／ＩgＧ３に対する免疫応答を示す図である。
−２／ＩgＧ３に対する免疫応答を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/395 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】 小細胞肺癌の処置で使用される、医薬的
に許容し得る担体または希釈剤と一緒に有効成分として
モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル
抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメントま
たはそれらの変異体を含む医薬組成物。 - 【請求項２】 非経口投与のための請求項１に記載の医
薬組成物。 - 【請求項３】 エフェクター細胞と共に投与するための
請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項４】 前記エフェクター細胞が、自己末梢血単
核細胞である、請求項３に記載の医薬組成物。 - 【請求項５】 小細胞肺癌細胞を処置するに有効な量の
モノクローナル抗体ＢＲ５５−２またはモノクローナル
抗体ＢＲ５５−２の特異性を有するそのフラグメント、
またはその変異体を含む請求項１に記載の医薬組成物で
あって、該有効な量が、１日あたり約５０mg〜約１００
mgである、医薬組成物。 - 【請求項６】 前記モノクローナル抗体の変異体がキメ
ラ抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項７】 前記モノクローナル抗体の変異体が標識
抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項８】 前記標識抗体が薬剤で標識される、請求
項７に記載の医薬組成物。 - 【請求項９】 前記モノクローナル抗体の変異体がひと
化抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項１０】 前記投与が、皮下、筋肉内、空洞内ま
たは静脈内投与である、請求項２に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4006308A DE4006308A1 (de) | 1990-02-28 | 1990-02-28 | Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom |
| DE4006308.9 | 1990-02-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211612A JPH04211612A (ja) | 1992-08-03 |
| JP2996526B2 true JP2996526B2 (ja) | 2000-01-11 |
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ID=6401132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3058440A Expired - Lifetime JP2996526B2 (ja) | 1990-02-28 | 1991-02-27 | モノクローナル抗体の新用途 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5523085A (ja) |
| EP (1) | EP0445078B1 (ja) |
| JP (1) | JP2996526B2 (ja) |
| AT (1) | ATE130200T1 (ja) |
| DE (2) | DE4006308A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0528767B1 (en) * | 1991-08-21 | 2000-01-12 | Novartis AG | Antibody derivatives |
| ATE179214T1 (de) * | 1992-05-22 | 1999-05-15 | Novartis Erfind Verwalt Gmbh | Antiidiotypische monoklonale antikörper gegen den lewis y-spezifischen monoklonalen antikörper br55-2 und deren verwendungen |
| AT413486B (de) * | 2002-07-03 | 2006-03-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Verwendung eines antikörpers gerichtet gegen lewis-antigene |
| TWI618669B (zh) * | 2016-05-09 | 2018-03-21 | 力山工業股份有限公司 | 可收折的文具 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE468231B (sv) * | 1984-05-18 | 1992-11-23 | Kabi Pharmacia Ab | Foerfarande foer att paavisa smaacelligt lungcarcinomantigen och anvaendning av antikroppar mot fukosylsialosylgangliotetraos foer framstaellning av komposition foer behandling eller in vivo/ diagnos |
| US4971792A (en) * | 1987-03-27 | 1990-11-20 | The Wistar Institute | Monoclonal antibodies against glycolipid antigens |
| EP0323802A3 (en) * | 1987-12-24 | 1989-07-26 | Sandoz Ag | Monoclonal antibodies against, and cell surface antigen of, lung carcinoma |
-
1990
- 1990-02-28 DE DE4006308A patent/DE4006308A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-02-26 AT AT91810128T patent/ATE130200T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-26 EP EP91810128A patent/EP0445078B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-26 DE DE69114546T patent/DE69114546T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-27 JP JP3058440A patent/JP2996526B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-24 US US08/378,890 patent/US5523085A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5523085A (en) | 1996-06-04 |
| EP0445078B1 (en) | 1995-11-15 |
| DE4006308A1 (de) | 1991-08-29 |
| DE69114546T2 (de) | 1996-04-04 |
| JPH04211612A (ja) | 1992-08-03 |
| EP0445078A1 (en) | 1991-09-04 |
| DE69114546D1 (de) | 1995-12-21 |
| ATE130200T1 (de) | 1995-12-15 |
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