JPH04131092A - モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、モノクローナル抗体とこれを産生ずるハイ
ブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法
に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、ジアデノシンテトラホス
フェート（ＡＰ４Ａ）のモノクローナル抗体と、このモ
ノクローナル抗体を詩興的に産生ずるハイブリドーマ細
胞株、および医療分野、とくに心臓血管系の疾病等の診
断および治療に有用なこのモノクローナル抗体を用いる
生体液中のＡｐａＡの免疫学的測定法に関するものであ
る。

（従来の技術） 生体中のジアデノシンテトラホスフェート（ＡＰ４Ａ）
は、主として活性化された血小板から放出され血中に出
現し、血小板凝集阻害作用（Ｈ，Ｊ、　Ｈａｒｒｉｓｏ
ｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　５４．５７．１９
７５）　、肥満細胞からのヒスタミン放出促進作用（Ｂ
、　　Ｓ、　　Ｇｏｍｐｅｒｔｓ、　　５ｅｃｒｅｔｏ
ｒｙ　　ＰｒｏｃｅｓｓＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、　
Ｌｏｎｄｏｎ、　１８−３７．１９８４　）　Ｈ血管収
１作用　　（Ｒ，Ｂｕｓｓｅ他、／Ｉｓ、　Ｊ、　　Ｐ
ｈｙｉｏｌ、　２５４Ｈ８２８−Ｈ８３２，１９８８）
等の生理作用を有している。

従来より、生体液中のこのＡＰａＡの定量法としては２
つの方法が知られている。１つは、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、Ａ　Ｐ　４　Ａを含む検
体を逆相カラムで分離し、２６０ｎ−における吸光度を
測定することにより検体中のＡＰ４Ａ含有量を定量する
というものである（前記Ｒ，Ｂｕｓｓｅ他に記載）。

もう１つは、酵素法と呼ばれるものであり、Ａ　Ｐ　４
　Ａを酵素（ホスホジェステラーゼ）によりアデノシン
モノホスフェートとアデノシントリホスフェート（ＡＴ
Ｐ）に分割し、それをＡＴＰが必須であり、かつその量
に応じて活性が変化するルシフェラーゼを用いて発光さ
せることによりＡ　Ｐ　４　Ａを定量するというもので
ある。（Ｂ、に。

Ｋｉｌ他、Ｂｌｏｏｄ　６６　、７３５−７３７．１９
８５　）　。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、これら従来の測定法においては、たとえ
ばＨＰＬＣを用いる方法の場合、カラムが生体成分によ
り著しく劣化するのを避けるため予め検体を穴径０．４
５μｍ以下のフィルターで処理するという繁雑な操作を
必須とする。さらにこの方法の場合、ＨＰＬＣのハード
面の問題として、安定したベースライン値を得ることが
困難であり、またわずかな温度変化や溶媒変化等により
ＡＰ４Ａの溶出時間が不均等になるなどの欠点を有して
もいる。

またホスホジェステラーゼとルシフェラーゼを用いる酵
素法の場合も、最終的にはＡＴＰをルシフェラーゼで測
定するため、生体成分中に混在するＡＴＰを予めホスホ
モノエステラーゼを用いて消去する必要があり、さらに
このホスホモノエステラーゼを、次のステップで生成さ
れるＡＴＰを消去させないために熱処理（９０℃、５分
間）によって失活させるという繁雑な操作を必要とする
という問題点を有している。

このように、従来のＡｐａＡ測定法においては、検体中
のＡ　ｐ　ａ　ＡをＨＰＬＣを用い分離したり、あるい
は酵素により分割したりするため、操作が繁雑となり、
しかも測定精度も必ずしも良好なものではなかった。

一鍛に、生体中の特定の生理活性物質を定量する場合、
その物質の抗体、とくにモノクローナル抗体が同定され
るならば、たとえば標識を結合したその抗体を検体に添
加することにより、目標とする物質を直接的に定量する
免疫学的測定が可能となる。しかしながら、これまでＡ
Ｐ４ｋに対するモノクローナル抗体は存在しなかった。

この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもので
あり、これまで存在しなかったＡＰ４Ａのモノクローナ
ル抗体を提供することを目的としている。またこの発明
は、このモノクローナル抗体を特異的に産生ずるハイブ
リドーマ細胞株およびこのモノクローナル抗体を用いる
ＡＰ４Ａの免疫学的測定法を提供することを目的として
もいる。

（課題を解決するための手段） この発明は、上記の課題を解決するものとして、ジアデ
ノシンテトラホスフェート特異認識モノクローナル抗体
を提供する。

また、この発明は、ジアデノシンテトラホスフェート抗
原を免疫した哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエロ
ーマ細胞とのハイブリドーマから産生されてなることを
特徴とするジアデノシンホスフェート特異認識モノクロ
ーナル抗体と、このモノクローナル抗体産生能を有する
ハイブリドーマ細胞株およびこのモノクローナル抗体を
用いるジアデノシンホスフェートの免疫学的測定法を提
供する。

以下、この発明について詳しく説明する。

この発明のモノクローナル抗体は、上記の通り、ＡＰ４
Ａ抗原を免疫した哺乳動物より調製したリンパ球と、ミ
エローマ細胞とのハイブリドーマを選択、培養すること
により得ることができるが、生産効率の点からは、上記
ハイブリドーマのうち、ＡＰ４Ａに対するモノクローナ
ル抗体を特異的に産生ずる細胞を選別し、これをクロー
ン化して細胞株とした上で、この細胞株の培養によりＡ
Ｐ４Ａのモノクローナル抗体を得るのが好ましい。

このような細胞株の作成とモノクローナル抗体の採取法
、およびそのモノクローナル抗体を用いるＡｐ４Ａの免
疫学的測定法は以下の通り行うことができる。

（１）　　Ａｐ、Ａのモノクローナル抗体を特異的に産
生ずるハイブリドーマ細胞株の作成：まず、ハイブリド
ーマを作成するため、ＡＰ４Ａ抗原に免疫した哺乳動物
のリンパ球と、これと融合させるミエローマ（骨髄腫細
胞）を用意する。このうち、上記リンパ球を採取するに
は、まず、Ａ　ｐ　＜　Ａと担体タンパク質を共有結合
させた複合体（以下、Ａ　Ｐ　４　Ａ−キャリアと記載
する）からなるＡＰ４Ａ抗原を作成し、これを哺乳動物
、好ましくはマウスまたはラットに免疫する。

抗原の使用量、投与部位、アジュバントの使用等、免疫
の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい０例え
ば、マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につき
０．００１〜１０■、好ましくは０．０１〜１■のＡ　
ｐ　４　Ａ−キャリアを、初回はアジュバント（例えば
、フロイントの完全アジュバント）とよく混合して、皮
下、腹腟内等に投与し、２週間以上経過後、再びアジュ
バント（例えば、フロイントの不完全アジュバント）を
よく混合して、皮下、腹腟内等に投与する。さらに、２
週間以上経過後、Ａ　Ｐ　４　Ａ　　’ｒヤリアのみを
静脈内、皮下、腹腟内等に投与して、十分免疫する。こ
のようにして免疫された動物を、好ましくは最終免疫か
ら２〜４日後に殺し、リンパ球を採取する。

リンパ球調製には、膵臓、リンパ節、末梢血等が用いら
れる。このリンパ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく
。

一方、ミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを
使用することが好ましい、さらに、そのミエローマは薬
剤抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエ
ローマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好
ましい、最も一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ラ
インが用いられる。これは、ヒボキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨｙｐＯＸａｎ
ｔ　ｉｎｇｕａｎ＋ｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠損しており、選択培
地の一種ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミジン（
ＨＡＴ）培地に生育できない、また、使用するミエロー
マ自身が抗体を分泌しないものが望ましい６以上の点か
ら、例えば、市販のマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・Ａ
ｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）；Ｐ３・Ｘ６
３・Ａｇ８・Ｕｌ　（Ｐ３ｔＪ１）、ラットミエローマ
　２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３等を用いるのが好
ましい。

このミニ−ローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有
するイーグル最少培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭ１１６４０培
地（ＲＰＭ１１６４０）等の培地中で培養する。

次に、ＭＥＭ、ＲＰＭｉ１６４０等の培地に上記で得た
リンパ球およびミエローマを各々懸濁し、混合する。こ
のときの混合比は任意に選択できるが、好ましくはリン
パ球：ミエローマが細胞数で１：１〜２０：１、好まし
くは５：１〜１０：１の比率を用いればよい、混合した
細胞は、融合促進剤を用いて融合を行う、融合方法とし
ては、例えば、イムノロジカルメソツブ２巻、２８５頁
（１＋ｇｇ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　　Ｖｏｌ、ＩＩ　　、　　１９８１゜Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　　Ｐｒｅｓｓ）に従って行えばよい、融合促進剤と
しては、種々の高分子物質やウィルス等を用いることが
できるが、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）　、センダイウィルスを用いればよい、ＰＥＧは、平
均分子量４００〜２０．０００のものが使用できるが、
好ましくは１　、０００〜７．５００のものを用いれば
よい、その使用濃度は、４０〜６０ｖｏ１．％が好まし
い。

融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し、５〜１
５ｖｏ１．％の血清を含むＭＥＭまたはＲＰ　Ｍ　Ｉ　
１６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に０．５〜５ｘ
ｔｏ’／穴の割合で分注する。さらに、各人に選択培地
（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交換す
れば、１０〜１４日後には未融合のミエローマは死滅し
、ハイブリドーマのみ生育する。因に、リンパ球は長時
間生体外（ｉｎＶ＋ｔｒｏ　）では育成できず、やはり
１０〜１４日後には死滅する。

次に、Ａ　ｐ　４Ａに対する抗体を産生ずるハイブリド
ーマを検索、選別する。そのための方法としてはＥＬＩ
ＳＡ法を用いることができる。ただし、その場合に上記
ハイブリドーマは、Ａ　ｐ　４　Ａ−キャリアを抗原と
するため、ＡＰ４Ａに対する抗体を産生ずるもののほか
、担体タンパク質に対する抗体を産生ずるものも存在す
るので、ＡＰ４Ａに対する抗体を産生ずるハイブリドー
マのみを選択する必要がある。そのためには、たとえば
担体タンパク質以外のタンパク質にＡ　Ｐ　４　Ａを共
有結合させた複合体（以下、ＡＰ４Ａ−キャリア２と記
載する）を作成し、これをＥＬＩＳＡプレートに吸着さ
せ、これにハイブリドーマ上清を加え、洗浄後、市販の
免疫動物免疫グロブリンに対する標識抗＃、（例えば、
ホースラディシュバーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体
あるいは＋２Ｓｌｉｌ識抗体）を添加する。その結果、
ハイブリドーマ上清中にＡ　Ｐ４　Ａに対する抗体が存
在する場合には、それが固相のＡ　ｐ　４　Ａ−キャリ
ア２に結合し、さらに免疫グロブリンに対する標識抗体
がこれに結合して、標識によるシグナルが得られる。一
方、上清中にＡ　ｐ　４　Ａに対する抗体が存在しない
場合には、固相のＡ　ｐ４　Ａ−キャリア２には何も結
合せず、従ってシグナルも得られない、このように、標
識によるシグナルの有無を手がかりとしてハイブリドー
マの選択を行なうことができる。

次いで、このようにして得たＡ　Ｐ　４　Ａに対するモ
ノクローナル抗体を特異的に産生ずるＡイブリドーマを
選択的に培養することにより、ノ飄イブリドーマ細胞株
を創製することができる。

なお、この方法に従って予めＡ　ｐ　４　Ａ　　”ｒヤ
リアで免疫したマウスの牌臓リンパ球とマウスのミエロ
ーマ細胞を融合して創製したノ１イブリドーマ細胞株の
１種を、ハイブリドーマＩＪＮＨ３Ｈ１０と命名した。

この株を、平成　２年　７月１１日に通商産業省微生物
工業研究所に寄託の手続を行い、菌寄第１１６００号（
ＦＥＢＮ　Ｐ−１１６００）として受は入れられた。こ
のＵＮＨ３Ｈ１０は、−１２０℃以下でほぼ永久的に凍
結保存か可能であって、たえず頒布可能な状態に１かれ
ている。

このハイブリドーマＵＮＨ３Ｈ１０は、通常用いられる
培地で増殖可能である０例えば、牛胎児血清を５〜２０
％含有するＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０又はＭＥＭを培地
として用い、３７℃、炭酸ガス濃度５ｖｏ１．％含有空
気下でよく増殖する。また、ミエローマの造腫瘍性をも
有しているので、生体内（例えば、同系の動物、ヌード
マウスなど）で増殖し、Ａ　ｐ　４　Ａに対するモノク
ローナル抗体を産生することができる。

（２）　　ＡＰ４Ａのモノクローナル抗体の多量採取： 上記の通り作成したハイブリドーマ細胞株を培養するこ
とにより、ＡＰ４Ａに対するモノクローナル抗体を大量
に採取することができる。このモノクローナル抗体の採
取方法には、大きく分けて２通りの方法がある。１つは
、培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、その上
澄液から抗体を採取する方法である０例えば、５〜１Ｑ
ｖｏ１．％の血清を含むＭＥＭまたはＲＰＭ１１６４０
培地に０．５〜５Ｘ１０’個のハイブリドーマ細胞株を
植えると、２〜４日で１０〜２０倍に成育し、その培養
後の上澄液から抗体を採取する方法である。

もう１つの方法は、このようにして培養容器で培養した
ハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種する方法で
ある。すなわち、ハイブリドーマ細胞株１０５〜１０７
個を同系の動物の皮下または腹腔内等に投与し、７〜２
０日後ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大きくな
ったときに、血清および腹水を採取する方法である。腹
腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６
゜１０．１４−テトラメチルペンタデカン等の鉱物油を
投与すると、より多量の腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じ精製して使
用することができる。たとえば硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、プロティンＡを固定したアフィニテ
ィークロマトグラフィー等、通常タンパク質に適用され
うる手段を用いて精製することができる。

このようにして、Ａ　Ｐ　４　Ａに対するモノクローナ
ル抗体を容易に、かつ多量に得ることができる。

（３）　モノクローナル抗体を用いるＡ　ｐ　＜　Ａの
免疫学的測定： まず、Ａ　ｐ　４　Ａ−キャリアを固相に固定化する。

固相としては、プラスチック試験官、マイクロタイター
プレート、ガラスピーズ、プラスチックビーズ、メンブ
レン等を用いることができる。

Ａ　ｐ　４　Ａ　　’ｒヤリアを固定化するには、−船
釣な物理的吸着法を用いることができるが、官能基をも
つ固相に固定化する場合には共有結合法を用いることも
できる。このとき、Ａ　ｐ　４　Ａ−キャリアの濃度は
、ｏ、　ｏｏｉ■／ｍ１以上、好ましくは０．０５〜０
．２．７ｍｌとし、これを固相と接触させればよい。

次に、このようにＡ　ｐ　ａ　Ａ−キャリアを固定した
固相に、数種のＡＰ４Ａ濃度既知の液体またはＡ　Ｐ　
Ａ　ＡｉＪ度未知の検体を加える。さらに、これに酵素
、ＲＩ、蛍光物質等を標識したＡ　ｐ　４　Ａに対する
抗体を加えるか、またはＡ　Ｐ　４　Ａに対する抗体を
加えた後、酵素、ＲＩ、蛍光物質等をｌ！識した二次抗
体を加える。なお、酵素としては、ＨＲＰ、ウシ小腸ア
ルカリホスファターゼ等を用いることができる。また、
Ｒ１として　１２Ｊを、蛍光物質としては、フルオレセ
インイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート等を用いることができる。

次いで、数種のＡ　ｐ　ａ　Ａ濃度既知の液体の標識抗
体に対するシグナルを各々測定して検量線を作成し、Ａ
Ｐ４Ａ濃度未知の検体から得られるシグナルをこの検量
線に当てはめ、その検体のＡ　ｐ　４　Ａ濃度を定量す
る。

以下、実施例を示し、この発明について具体的に説明す
る。

実施例１ （免疫原およびハイブリドーマ細胞株のスクリーニング
） 担体タンパク質として、にｅｙｈｏｌｅ　Ｌｙｎｐｅｔ
Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　（Ｋ　Ｌ　Ｈ）およびウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ＞を用い、免疫原およびハイブリド
ーマ細胞株のスクリーニングを行なった。

Ａ　Ｒ４Ａ　１０１１（ｌを０．　ＩＮＮ　ａ　Ｉ　Ｏ
４０、２ａ＋ｌに溶解し、２５℃の温度で２０分間酸化
した。これにエチレングリコールを加え、過剰のＮａｌ
０．を分解した０次いで２８■ＫＬＨまたはＢＳＡを加
え、度敢ナトリウム水溶液でｐＨ９、０〜９．５に調整
し、Ａｐ４Ａ　　ＫＬＨまたはＡ　Ｐ　４　Ａ　　Ｂ　
Ｓ　Ａを作成しな、これらの２６０ｎｅにおける吸光度
およびタンパク質量からＫＬＨＩ分子あたり結合したＡ
　ｐ　４　Ａは約１０００分子、またＢ５Ａｌ分子あた
り結合したＡＰ、Ａは約０．５分子と求められた。

実施例２ （ハイブリドーマの作成） ８退会のマウスＢａ１ｂ／ｃ（オリエンタルバイオサー
ビスより入手）に、実施例１で作成したＡｐ４Ａ−ＫＬ
Ｈを完全フロインドアジュバント（半回化学より入手）
と１＝１に混合乳化し、腹腔内に投与し、２′Ａ間後に
５０μｇのＡ　ｐ　４　ＡＫＬＨを静注して追加免疫し
、３日後に肺臓を取り出し、ＭＥＭ培地（半回化学より
入手）にほぐして懸濁洗浄した。一方、マウスのミエロ
ーマＸ６３・６・５・３（京都大学より入手）を２日前
から培養し、対数増殖期にある細胞を遠心分離で集めた
。肺細胞１０”ｍをミエローマＸ６３・６・５・３１０
７と混合し、遠心によりベレットしたのち、３７℃の水
浴中で５０％のＰ　Ｅ　Ｇ　４０００−ＲＰＭ１１６４
０（ギブコ社より入手）１ｍｌを徐々に１分間で加え、
さらに、１分間緩やかに攪拌後、９　ｍｌのＲＰＭ１１
６４０培地を徐々に加えて、ＰＥ０４０００を希釈した
。遠心分離によりＰＥＧ溶液を除去し、ペレットに１０
％牛脂児血清を含むＨＡＴ培地２０ｍ１を加えて、２皿
の９６穴培養皿（コーニング社製ンの各人に０．１ａ＋
１ずつ分注した。４゜８．１１日目の計３回にわたり半
分量の培養基を捨て、新しいＨＡＴ培地を加えた。

その結果、１０日後には３８４穴中２４穴でハイブリド
ーマの成育が観察された。

実施例３ （ハイブリドーマ細胞株の作成） 実施例２で得たハイブリドーマのうちＡ　Ｐ　４　Ａに
対する抗体を産生ずる株を、ＥＬＩＳＡ法を用い検索し
た。

まず、ＥＬＩＳＡズレート〈コーニング社製）に５０ｉ
Ｈ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９、６に溶解したＡ　Ｐ
　４　Ａ　　Ｂ　Ｓ　Ａを各式につき５０μｌずつ分注
し、２５℃の温度で２時間放置した。この液を除去した
後、各人に１．０％ＢＳＡ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含む２０１１１４リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
２）を充満させ、２５℃の温度で１時間放置した。さら
にこの液を除去し、０．２％トウイーン２０．０．２％
Ｂ　Ｓ　Ａ　、　０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）からなる洗
浄液で各ウェルをよく洗浄し、Ａ　Ｐ　４　Ａ−ＢＳＡ
固定化プレートを作成した。

次いで、このプレートに実施例２で得たハイブリドーマ
の上清５０μｍを添加し、２５℃の温度で２時間放置し
た後、洗浄液で充分に洗浄し、ＨＲＰＩｍヤギ抗マウス
抗マウス１ナＧシより購入）１μ「／ｍｌを各人に５０
μｌ加え２５℃の温度で２時間放置した。さらに、洗浄
後、パーオキシダーゼ測定試薬（バイオラット社製）５
０μｌを加え、２５℃の温度で２０分間反応させ、１０
％５ＤＳ５０μＩの添加によりバーオキシンダーゼ活性
を停止させ、４１５ｎｉにおける吸光度（Ａ４１５）を
測定した。また対照にはハイブリドーマ上清のかわりに
ＨＡＴ培地のみを反応させたものを用いた。

その結果、対照として用いた上清無添加時のシグナルに
比べ、高いシグナルを示した上清が得られた。この上清
の穴の株を選択し、限界希釈法にてクローニングを行い
、モノクローンのハイブリドーマ細胞株ＵＮＨ３Ｈ１０
を得た。

実施例４ （Ａｐ４Ａに対するモノクローナル抗体の採取）実施例
３で得たハイブリドーマ細胞株 ＵＮＨ３Ｈ１０を培養し、Ａ　Ｐ　４　Ａに対するモノ
クローナル抗体の採取を行った。

まず、ＵＮＨ３Ｈ１０を１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ１
１６４０培地で培養し、細胞濃度が２Ｘ１０’細胞／　
ｍｌに達した培養物３００ｍ１を遠心分離し、その上清
を５０％飽和硫安分画により粗抗体画分を分離し、透析
した後、プロティンＡ−セファロース（ｐＨ９，０）に
吸着させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ３，０）で溶出してＡ
　Ｐ　４　Ａに対する抗体（以下、ｔＪＮＡ３Ｈ１０と
記載する）を得た。

次に、このＵＮＡ３Ｈ１０のＡＰ４Ａに対する特異性を
検討した。

まず、Ａ　Ｐ　４　Ａ　　Ｂ　Ｓ　Ａを固定したＥＬＩ
ＳＡプレートに、各式１０−’、　１０−’、　１０−
’１０−’ｍｏ　ｌ／　１となるよう５０μｌのＡＰ４
Ａまたはアデノシン（Ａ）、アデノシンモノホスフェー
ト（ＡＭＰ）、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ＞、
アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、アデノシンテ
トラホスフェート（ＡＰ４）の各々をプレートの各式に
注入し、次いで、各人に４．０μｔ　／　ｍｌ濃度のＵ
ＮＡ３Ｈ１０・５０μｌを添加した。このプレートを２
５℃の温度で２時間インキュベートした後、０．２％ト
ウィーン２０．０．２％ＢＳＡ、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム含有２０１１Ｈリン酸ナトリウム緩衝液で充分に洗
浄し、ＨＲＰＩＩｍヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を各式に添
加した９次いでこれを洗浄し、パーオキシダーゼ測定試
薬（バイオラット社製）５０μｌを加え、２５℃の温度
で２０分間反応させた後、１０％５ＤＳ５０μｌを添加
して反応を停止させ、４１５ｎｍにおける吸光度を測定
した。その結果は第１表および第１図に示した通りであ
る。

これら第１表および第１図からも明らかなように、モノ
クローナル抗体ｔＪＮＡ３Ｈ１０は、Ａ。

Ａ　Ｍ　、Ｐ　、およびＡＤＰを全く認識せず、またＡ
ＴＰおよびＡ　Ｐ　４をわずかに認識はするがそれもＡ
Ｐ４Ａに対する認識力の１００分の１程度である。

これらのことから、ｔＪＮＡ３Ｈ１０は、ＡＰ４Ａに対
する特異的なモノクローナル抗体であると考えられる。

第 表 実施例５ （モノクローナル抗体を用いるＡ　ｐ　ａ　Ａの免疫学
的測定） 実施例４で得たモノクローナル抗体 ＬＪＮＡ３Ｈ１０を用い、検体中のＡ　Ｐ　４　Ａ濃度
を免疫学的に測定した。

まず、１）８３．５の条件下で、ＵＮＡ３Ｈ１０とペプ
シンを重量比２００：　１で混合し、３７℃の温度で６
時間消化し、Ｕ　Ｎ　Ａ　３　Ｈ１０Ｆ　（ａ　ｂ　′
）　ｘを得　さらにこれを還元して ＵＮＡ３Ｈ１０Ｆａｂ′を得た。

一方、ＨＲＰにＮ−スクシニミジル・マレイミドカルボ
キシレートを反応させ、マレイミド基を導入した。

このマレイミド基を導入したＨＲＰと ＵＮＡ３Ｈ１０を混合し、ＨＲＰ標識 ＵＮＡ３Ｈ１０Ｆａｂ′を作成した。

次に、実施例１で作成したＡｐａ　Ａ−ＢＳＡを固定化
したＥ　Ｌ　Ｉ　ＳＡ７レー　）４：、Ａ　ｐ　ａ　Ａ
　：ａ度既知（０，１０−７，３ｘｌＯ−，１０３Ｘ　
１０−’、　１０−’讃ｏｆ／１）の各標準液およびＡ
　ｐ　４Ａ濃度未知の血清サンプルを各々５０μｍ注入
し、これらに１μｓｒ　／　ｍｌ濃度のＨＲＰＩｊ識Ｕ
ＮＡ３Ｈ１０Ｆａｂ’　５０μｌを添加して、２５℃の
温度で１時間反応させた後、よく洗浄し、ＨＲＰ発色試
薬５０μｍを加え、２０分間反応させた後、１０％５Ｄ
Ｓ５０μｍを添加して反応を停止させＡ４１５を測定し
た。

この測定結果を第２表に示した。また、Ａ　ｐ　４Ａ濃
度既知の各標準液のＡ４１５から得られる検量線を第２
図に示した。

この第２表および第２図から検体として用いた血清サン
プルに含まれるＡ　Ｐ　４　Ａ濃度は　５．６×１０−
７■０１／１である。

比較例 （従来法によるＡ　ｐ　４　Ａの測定）実施例５におい
て検体として用いた血清サンプルのＡ　Ｐ　４　Ａ　４
度を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。

すなわち、実施例４と同様のＡＰ４Ａ濃度既知の各標準
液および血清サンプルを、逆相Ｃ１１ｌカラム＜　Ｗａ
ｔｅｒＳ社製）に、０，１％テトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウム含有リンＩ［衝液（ｐＨ７，０）を溶媒として、
各々５００μｌ注入し、２６０ｎ簡における吸光度（Ａ
２．。）を測定した。なお、Ａ　Ｐ　４　Ａの濃度はｉ
６ｏのピーク面積で表わした。その結果は第３表および
第３図に示した通りであり、血清サンプル中のＡ　Ｐ　
４　Ａ濃度は５．６　Ｘ　１０−’ｓｏ　ｌ／　］とな
る。

このように、同一の血清サンプルに対し、従来法である
ＨＰＬＣ法により測定したＡＰ４Ａ濃度と、実施例５に
示したこの発明のモノクローナル抗体を用いる酵素免疫
学的測定によるＡ　Ｐ　４　Ａ濃度は、全く同一値を示
したことから、この発明のＡｐ４Ａ測定法は充分に信頼
性の高い測定法であると言える。

もちろんこの発明は以上の例によって限定されるもので
はなく、その手続きの細部や適用範囲等については、様
々な態様が可能であることは言うまでもない。

第 表 第 表 （発明の効果） 以上詳しく説明した通り、この発明によりモノクローナ
ル抗体を用いたＡＰ４Ａの免疫学的測定が可能となり、
生体液中のＡＰ４Ａを簡易かつ迅速に、しかも高精度に
定量化することができる。

しかも、このＡ　Ｐ　４　Ａに対するモノクローナル抗
体を特異的に産生ずるハイブリドーマ細胞株の樹立によ
り、診断および測定に有用なＡ　Ｐ　４　Ａのモノクロ
ーナル抗体を多量に、かつ容易に得ることが可能となる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体 ＵＮＡ３Ｈ１０と、ＡＰ４Ａおよびその競合物質の結合
の程度を、各検体の濃度と吸光度の相関図として示した
ものである。 第２図は、この発明の免疫学的測定法に使用するＡＰ４
Ａの検量線の一例を示したＡ　Ｐ　４　Ａ濃度と吸光度
の相関図である。 第３図は、従来法であるＨＰＬＣ法によるＡ　ｐ４　Ａ
の検量線の一例を示した相関図である。 濃 度（Ｍ　） ・：　Ａｐ４Ａ 口：ＡＭＰ ◇：ＡＤＰ ム：ＡＴＰ Δ：Ａｐ４ 第 図 Ａｐ４Ａ濃 度（μＮｉ　） 第 図 ＡＩ）４Ａ 濃 度　（μへ１　）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジアデノシンテトラホスフェート特異認識モノク
   ローナル抗体。
2. （２）ジアデノシンテトラホスフェート抗原を免疫した
   哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエローマ細胞とを
   融合したハイブリドーマから産生されてなることを特徴
   とする請求項（１）記載のジアデノシンテトラホスフェ
   ート特異認識モノクローナル抗体。
3. （３）請求項（２）記載のモノクローナル抗体産生能を
   有するハイブリドーマ細胞株。
4. （４）請求項（１）または（２）記載のモノクローナル
   抗体を用いるジアデノシンテトラホスフェートの免疫学
   的測定法。