CN102618501A

CN102618501A - Nnmt蛋白单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Info

Publication number: CN102618501A
Application number: CN2011104415965A
Authority: CN
Inventors: 张钧; 谢鑫友; 杨肃文; 王燕忠
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明提供了一种尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，以及该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。本发明的单克隆抗体对NNMT蛋白均具有较高的抗体效价，亲和力和纯化后较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用于对NNMT蛋白的科研研究领域，也可应用于临床检测，对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况，有助于NNMT相关肿瘤的诊断、治疗和预后判断。

Description

NNMT蛋白单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

(一)技术领域

本发明涉及尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体，以及单克隆抗体在制备检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的试剂盒中的应用。

(二)背景技术

恶性肿瘤严重危害人类健康，据世界卫生组织最新数据显示，到2020年前，每年将新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅速上升，2007年全球共有760万人死于癌症，2030年这个数字可能会增至1320万。

肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡率或提高治疗的效果，许多研究致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤早期诊断、分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志物一直是肿瘤学的研究热点。

尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)正是今年用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现的癌组织中异常表达的蛋白质酶。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌和胰腺等肿瘤组织有过表达，并在多种肿瘤患者的血清中升高。这些研究提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响华、放疗效果。

NNMT正常表达于人肝脏组织中，其他组织如肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活性差异较大，活性的高低取决于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关，与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后调控异常所致，可能受肝细胞核因子-1(HNF-1)、TGF-β1、STAT3等激活。

NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)为供体，催化尼克酰胺和吡啶类物质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生物转化，是催化药物、异型生物质代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼克酰胺参与细胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产NAD，而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗，细胞的寿命等。帕金森综合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通过两条途径导致帕金森综合症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激活导致线粒体复合体1受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼克酰胺还能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、坏死、凋亡等多细胞调节来保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT在肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步明确NNMT作为在肿瘤防治中的价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能稳定高效分泌抗NNMT蛋白的抗体的杂交瘤细胞株，以及该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。

本发明采用的技术方案是：

一种尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株1E7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2011年8月31日，保藏编号：CCTCC NO：C 201167。该细胞株由尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠后，筛选获得。

本发明还涉及一种由所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体(1E7)。

经检测，所述单克隆抗体为IgG亚类、2aκ轻链型。

本发明还涉及所述的单克隆抗体在制备检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的试剂盒中的应用。

由于本发明的单克隆抗体对于NNMT蛋白均有高水平的抗体效价，因此本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性变异体，或其任意组合可用于制备用于检测NNMT蛋白的试剂、药剂或试剂盒。所述试剂、药剂或试剂盒可用于检测NNMT蛋白，从而可以进一步用于诊断、治疗和预后判断NNMT相关肿瘤。

本发明的试剂、药剂或试剂盒优选包括标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。所述标记指生物标记或化学标记，例如酶标记的或荧光标记的(例如荧光素标记)或化学发光标记的。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。

检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白时具体可采用双抗夹心法进行检查NNMT蛋白抗原，具体为：先将一抗(特异性单克隆抗体)与相应的(临床样本中的)组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标记的抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

本申请发明人采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能稳定分泌抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接ELISA法筛选并进行，获得了能分泌的细胞系及由所属细胞系产生的单克隆抗体。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的1E7单克隆抗体对NNMT蛋白均具有较高的抗体效价，亲和力和纯化后较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用于对NNMT蛋白的科研研究领域，也可应用于临床检测，对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况，有助于NNMT相关肿瘤的诊断、治疗和预后判断。

(四)附图说明

图1为2F8、1E7腹水及纯品抗体SDS-PAGE电泳图；M：Marker 1：2F8腹水2：2F8纯品抗体3：1E7腹水4：1E7纯品抗体；

图2为2F8细胞株分泌抗体的亚类、轻链型鉴定结果；

图3为1E7细胞株分泌抗体的亚类、轻链型鉴定结果；

图4为2F8纯品抗体凝胶扫描图；

图5为1E7纯品抗体凝胶扫描图；

图6为2F8、1E7细胞株纯品抗体的亲和力反应曲线图；

图7为2F8细胞株单抗的免疫印迹；M：Marker 1：NNMT-GST融合蛋白 2：NNMT蛋白 3：GST蛋白；

图8为1E7细胞株单抗的免疫印迹；M：Marker 1：NNMT-GST融合蛋白 2：NNMT蛋白 3：GST蛋白；

图9为肝脏正常组织的免疫组化(×100)；

图10为透明细胞型肾癌(a)及正常肾组织(b)的免疫组化(×100)；

图11为乳头状甲状腺癌(a)及正常甲状腺组织(b)的免疫组化(×100)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选及制备

1、单克隆抗体的制备

1.1、免疫原的制备

免疫原为GST-NNMT融合蛋白及NNMT蛋白，利用基因工程技术制备NNMT蛋白：构建pGEX-4T-2/NNMT质粒，转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3)中以表达GST-NNMT融合蛋白。然后将融合蛋白纯化后，通过加入凝血酶使其融合蛋白充分酶切，再次纯化后获得NNMT蛋白(geneBank登录号：ACA06031.1)。

1.2、动物免疫：

免疫程序为：初次免疫取6～8周龄BALB/C雌性小鼠，将NNMT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只小鼠120μg。30天后，再次用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量同前。之后每隔10天再免疫一次，共三次作为加强免疫。最后进行细胞融合前三天NNMT蛋白与生理盐水等体积混匀后腹腔注射，剂量为每只小鼠80μg。

1.3、细胞融合：

取免疫鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按比例融合，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第七天采用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性细胞。间接法采用，筛选同时呈阳性的细胞孔。间接ELISA法如下：将NNMT蛋白用包被液稀释成0.025μg/ml，每孔100μl包被酶标板，GST蛋白用包被液稀释成1∶5000，每孔100μl包被酶标板，4℃放置过夜。次日，洗涤3次，加封闭液10％小牛血清约350μl/孔，37℃ 1小时，洗涤后拍干。每孔加入杂交瘤上清100μl，设阳性血清对照(免疫后小鼠的血清，多抗)、阴性血清对照(未免疫小鼠的血清)，同时设置空白对照孔(HT培养液和/或1×PBS)，37℃反应2小时后洗涤酶标板，加入100μl兔抗小鼠IG-HRP(1∶4000)，37℃反应1小时后洗涤酶标板，加入TMB显色液37℃显色15分钟，加终止液终止反应，仪器上读取OD450的吸光度。BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0完成细胞融合，细胞融合率为96.7％。融合细胞的初筛阳性率为62.4％。选择抗-NNMT滴度高且抗-GST滴度很低的几株杂交瘤细胞进一步克隆化，直至阳性率达到100％。

结果，阳性血清对照的OD值为2.494，阴性血清对照的OD值为0.112，空白孔OD值为0.098，经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的OD值如表1所示。

表1：单克隆抗体细胞株筛选细胞上清OD值

由此筛选出的4株杂交瘤细胞株均能分泌抗NNMT蛋白的抗体且OD值大于1.4。而且抗GST的OD值均很低，几乎与空白孔的OD值一致。

1.4、克隆：

采用有线稀释法对上述初筛细胞进行克隆。最终筛选出4株稳定分泌抗-NNMT抗体的杂交瘤细胞，分别为2F8、1E7、1F8、2C10。选择2F8、1E7(即CCTCC NO：C 201167)进行抗体的制备和进一步的鉴定。

1.5、腹水制备：

将上述4株单克隆抗体细胞株扩大培养，收集后腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠，每只注射1ml，杂交瘤细胞浓度为0.5×10⁶/ml。接种后10天收获腹水，1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上层单克隆抗体腹水。

1.6、抗体纯化：

1份预处理后的腹水中加入2份醋酸钠缓冲液(0.06mol/L，PH 4.0)，在室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸，每毫升稀释后样品中加辛酸40μl。搅拌30分钟后，将悬浊液于10000rpm离心30分钟，去沉淀。上清装入透析袋，1×PBS中透析过夜。透析后蛋白溶液10000rpm离心10分钟，取上清，缓慢滴加饱和硫酸铵至终浓度为50％，边加边搅拌，搅拌30分钟后置于4℃静置至第二天。悬浊液10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用适量1×PBS溶解，置于1×PBS中4℃透析，直至用1％BaCL₂检测无SO₄离子。透析后蛋白溶液10000rpm离心10分钟。取上清，测定蛋白浓度。加入0.02％NaN₃分装保存。腹水粗品经4％辛酸提取与50％硫酸铵盐析，主要的杂蛋白，如白蛋白等几乎全部被去除。SDS-PAGE电泳显示(图1)纯化后除抗体的重链(50KD)及轻链(25KD)条带之外的杂带较少，表明纯化效果较好。

1.7、抗体的鉴定

1.7.1、杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类及轻链型检测：

杂交瘤细胞株2F8分泌的抗体进行亚类、轻链型检测后为IgG2bκ类(图2)。1E7分泌的抗体为IgG2aκ类(图3)。

1.7.2、纯品抗体的纯度及分子量：

2F8、1E7纯品抗体经SDS-PAGE电泳和凝胶扫描分析后，抗体纯度分别为85.6％和90.2％(图4，图5)。轻链分子量约为25KD，重链分子量约为50KD，与抗体分子的特性相符。

1.7.3、纯品抗体效价与亲和力分析：

2F8、1E7细胞株纯品抗体经间接法ELISA分析后，抗体效价均在100000以上(如表2)。具体方法如下：将NNMT蛋白稀释至0.025μg/ml后包板，4℃过夜。酶标板中加封闭液37℃封闭1小时后洗涤。洗涤拍干后加单抗按1∶100～1∶8192000稀释量入孔，37℃ 2小时后洗涤，加二抗兔抗鼠HR-IgG 1小时后洗涤。最后显色15分钟，终止反应，测定波长450nm的OD值。表明经纯化后，抗体的效价有所增高，并保持了抗体的免疫活性。

表2：1E7和2F8单克隆抗体对NNMT蛋白间接法抗体效价结果

结果以抗体浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制单抗亲和力的测定曲线，结果如图6。2F8、1E7细胞株达到最大结合50％时的抗体浓度(单位μg/ml)分别为5.7×10^-5μg/ml和8.4×10^-4μg/ml，表明2F8细胞株所分泌抗体的相对亲和力比1E7株要高。

1.8、抗体特异性鉴定(采用Western-blot)

1.8.1、方法

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

表3：分离胶及浓缩胶组成

(1)按表3配制聚丙烯酰胺15％分离胶。

(2)最后一步加入TEMED，混匀后，小心地将分离胶注入准备好的玻璃凝胶模中，上面要为浓缩胶留1.5～2cm的空隙。在顶层加水覆盖，使界面平整，并防止空气中的氧气对凝胶聚合起抑制作用，室温下放置约30分钟，使之聚合。

(3)聚合完成后，倾去分离胶上的水，尽量用吸水纸吸干凝胶顶端的残存液体。

(4)按表配制5％浓缩胶，混匀后加入玻璃凝胶模，插上梳子，室温下放置30分钟。将凝胶电泳板放入电泳槽，浸没于1×Tris甘氨酸电泳缓冲液中，小心移去梳子。

(5)准备样品：取上样缓冲液8μl，1M DTT 2μl，样品10μl，置于0.5ml的离心管中，沸水浴10分钟后立刻置于冰上。

(6)上样：每个泳道分别用微量加样器加样10μl。

(7)接通电源，35mA电泳10～15分钟，使蛋白质快速泳动至分离胶上层并浓缩成一条窄带；电压改为25mA，继续电泳约1.5小时，直至示踪染料接近凝胶的底端。

b.转膜及显影

(1)取4张与电泳凝胶大小一致的滤纸和一张氟化聚偏二乙烯滤膜(PVDF，Polyvinylidene-Fluoride)，用甲醇浸泡15分钟至滤膜呈透明。

(2)将两层滤纸放在固定的转移装置上，将己电泳好的聚丙烯酰胺凝胶放在滤纸上，然后将PVDF滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，PVDF滤膜上再覆盖两层滤纸，每一步都要用玻璃棒赶去气泡，然后固定装置。

(3)将整个装置置于电泳槽中，注意使凝胶层位于负极，滤膜层位于正极.在转移电泳槽中加入预冷的转移缓冲液。

(4)接通电源，250mA转移2小时。

(5)封闭：在封闭液中室温转动60分钟。

(6)加一抗：一抗(抗NNMT单抗)用封闭液稀释，配稀释后一抗2ml(2F8 1∶6000；1E7 1∶1000)，将膜放入其中，4℃转动过夜。

(7)用浸洗液室温浸洗膜3次，每次10分钟。

(8)加二抗：将二抗(IgG-HR)用封闭液1∶5000稀释，配稀释后二抗2ml，将膜放入其中，室温转动2小时。

(9)用浸洗液室温浸洗条带3次，每次10分钟。

(10)加ECL显影液后显影。

结果经Western-blot鉴定单克隆抗体，在PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜上，只有NNMT-GST融合蛋白(55KD)及NNMT蛋白(29KD)泳道相应分子量区域出现一条明显的特异性条带，而在GST蛋白(26KD)泳道未出现相应条带。(如图7和图8。)

实施例2：单克隆抗体应用于免疫组化检测临床标本(采用二步间接法)

本实验生产的抗NNMT单克隆抗体可以应用于临床病理标本的免疫组化实验。选用1E7单克隆抗体对不同组织进行免疫组化实验。先将一抗(特异性抗体)与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，1∶5000稀释)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：

(1)临床病理标本石蜡切片脱腊至水。

(2)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(3)3％过氧化氢甲醇溶液作用20分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。

(4)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(5)封闭液封闭10分钟。

(6)用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复。

(7)每张切片滴加一抗(1∶1600)，37℃ 60分钟或4℃冰箱过夜。

(8)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(9)滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5000)，37℃ 40分钟。

(10)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(11)新鲜配制的3，3-二氨基联苯胺(DAB)溶液，3～10分钟。

(12)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。

以正常肝组织、透明细胞型肾癌及正常肾脏组织、乳头状甲状腺癌及正常甲状腺组织分别按上述方法进行检测，结果判断：由两个病理医生判断，5％为界，即≤5％的细胞阳性染色为阴性；＞6％细胞阳性染色为阳性。

结果如下：

(1)正常肝脏组织的免疫组化

肝组织中，肝细胞核及浆均显示NNMT阳性(图9)。

(2)透明细胞型肾癌及正常肾脏组织的免疫组化

透明细胞型肾癌组织的癌细胞核、浆均显阳性(图10a)，正常肾脏组织显阴性(图10b)。

(3)乳头状甲状腺癌及正常甲状腺组织的免疫组化

乳头状甲状腺癌组织的癌细胞核、浆均显阳性(图11a)，正常甲状腺组织显阴性(图11b)。

Claims

1.一种尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2011年8月31日，保藏编号：CCTCC NO：C 201167。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体为IgG亚类、2aκ轻链型。

4.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的试剂盒中的应用。