CN102782500A - 胃癌检测用的标志物和胃癌检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供对被测人的侵袭性低、且检测灵敏度和准确度高的胃癌检测方法。本发明提供体外测定来源于被测人的体液样品中的COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段，并基于其量来检测胃癌罹患的有无的检测方法，并且提供包含能够与该蛋白质特异性结合的抗体的胃癌诊断用试剂盒。

Description

胃癌检测用的标志物和胃癌检测方法
技术领域
本发明涉及将COTL1蛋白质作为胃癌检测用标志物，通过测定其在体液中的浓度来检测胃癌的胃癌检测方法。
本发明还涉及包含能够与用于检测胃癌的上述蛋白质结合的物质的胃癌的检测用试剂盒。
背景技术
胃是具有将饮食物贮藏几个小时，通过期间分泌的胃酸使饮食物变为酸性而防止腐败，并且通过消化酶将饮食物消化的功能的重要的消化系统器官。
胃癌的发生频率，在日本每10万人口大致为50～60人左右，男女比为1～2:1，呈现男性发病较高的倾向。另外，其死亡数每年约5万人，占所有癌的17%，从第二次世界大战之后到1990年初，胃癌曾占各部位癌死亡率的第一位。虽然现在随着患者数逐年减少而紧随肺癌列第二位，但依然是患者数较多的疾病。此外从全世界范围来看，胃癌在日本、韩国、中国等亚洲地区以及南美的患者较多。作为胃癌的危险因子，一般可列举吸烟、食盐摄取过多的饮食习惯、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染等。
胃癌的治疗已知有内窥镜治疗、外科手术、化学疗法、放射线疗法等。综合考虑病期、肿瘤的大小和/或侵入深度、转移的程度等来施用。治疗方针依照2004年日本胃癌学会制成的“胃癌治疗方针”来确定。在早期胃癌的情况下，可以通过内窥镜切除或者外科手术完全切除，复发率也非常低。另一方面，在进展期胃癌的情况下，即使摘除病变也存在手术时未能发现的微小的转移病灶，复发的情况不少。胃癌在早期发现的情况下预后较好，通常90%以上可以完全治愈。但较大的肿瘤和/或转移后的治疗成绩较差，为5年生存率约70%。因此其早期发现具有重要性。
然而，大多数的胃癌在早期阶段是无症状的，很多情况下如果不是癌进展之后则不会出现明确的自觉症状。因此通过自觉症状来早期发现胃癌是困难的。作为自觉症状，随着胃癌的进展，可见软便化、黑色便、恶心、胃部不适等，另外作为全身性症状，可见易疲劳感、发烧、体重减轻、贫血等。随着病情进一步进展，肿瘤增大，才会感觉到腹部有疙瘩。并且即使出现这样的自觉症状之后，患者也常有放置病情的倾向，通过体检时的X射线照相才初次发现已经是进展的状态的情况也不少。因此，开发出在早期阶段高灵敏度且准确地检查胃癌的检测方法变得重要。
作为胃癌的检查法，有利用超声波检查、CT检查、血管造影检查、X射线照相等的图像诊断法。图像诊断法虽然对于发现早期较小胃癌是有用的方法，但在例如健康诊断等以大量被测人为对象时不能说是有效的方法，并且还存在诊断所需的费用比较高的问题。
随着近年的基因组分析或蛋白质组分析的技术进步，作为癌领域的研究成果各种新的肿瘤标志物候选逐渐被发现(例如：专利文献1、专利文献2)。由于对特定癌为特异性且灵敏度高的血中标志物被认为能够进行比较廉价且高通量的检查和/或诊断，因而其开发被寄予厚望。作为探索标志物的方法，可列举比较癌细胞与非癌细胞在基因表达和/或蛋白质或细胞的代谢产物等的量的方法，和/或测定癌患者和非癌患者的体液中所含的mRNA、蛋白质或代谢产物等的量的方法。现在，作为被临床使用的胃癌肿瘤标志物，已知CEA、BFP、NCC-ST-439、CA72-4、CA19-9等。此外在组织中发现了胃蛋白酶原C(非专利文献1)、hnRNP A2/B1(非专利文献2)、NSP3、转胶蛋白、抗增殖蛋白、HSP27、蛋白质二硫键异构酶A3、GRP58(非专利文献3)等标志物候选。然而，这些标志物和标志物候选特异性和/或检测灵敏度的不足，还未能确立利用来自活体样品的这些标志物和标志物候选的有效的检测方法。因此，其利用仅限于治疗后的跟踪观察这样的有限目的，所以期盼特异性和检测灵敏度更高的胃癌标志物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2005/001126
专利文献2：国际公开WO2003/060121
非专利文献
非专利文献1：Melle,C.等、Journal of proteome research、2005、第5卷、p.1799-1804
非专利文献2：Lee,C.等、Proteomics、2005、第5卷、p.1160-1166
非专利文献3：Ryu,J.W.等、Journal Korean Medical Science、2003、第18卷、p.505-509
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是提供对胃癌检测有用的肿瘤标志物以及使用了该肿瘤标志物的胃癌检测方法。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明者们对胃癌患者的血液和健常体的血液中存在的蛋白质群进行了比较，从而作为在胃癌患者的血液中被检测出的新的肿瘤标志物，发现了COTL1蛋白质，从而完成了本发明。
“COTL1”(肌动蛋白辅助蛋白样1，coactosin-like1)蛋白质是肌动蛋白细胞骨架结合性蛋白质，已报告在细胞内与5-脂氧合酶结合，被认为参与白三烯的生物合成(Provost P.等、2001年、Journal of BiologicalChemistry、第276卷、p.16520-16527)。另外，已报告该蛋白质伴随风湿的发病而其血中浓度升高(Eun-Heui J.等、2009年、Experimental andMolecular Medicine、第41卷、p.354-361)。并且，已知在胰腺癌组织中表达高(Nakatsura T.等、2001年、Biochemical and Biophysical ResearchCommunication、第256卷、p.75-80)。然而，至今为止尚未知关于COTL1蛋白质与胃癌的相关性的报告。
因此，本发明包含以下发明。
(1)一种胃癌检测方法，其中，体外测定来源于被测体的体液中存在的胃癌检测用标志物的量，并基于该量来确定胃癌的罹患，所述胃癌检测用标志物包含COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段。
(2)根据(1)所述的方法，其中，上述COTL1蛋白质为序列号1所示的多肽。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，在被测体的上述胃癌检测用标志物的量和健常体的该量相比统计学上有意义的多时，确定为罹患胃癌。
(4)根据(3)所述的方法，其中，上述统计学上有意义的多的量是健常体的2倍以上。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的方法，其中，上述测定使用能和上述胃癌检测用标志物特异性结合的物质。
(6)根据(5)所述的方法，其中，上述能和胃癌检测用标志物特异性结合的物质为抗COTL1抗体、抗COTL1突变体抗体和/或它们的片段。
(7)根据(1)～(6)的任一项所述的方法，其中，上述胃癌为早期胃癌。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的方法，其中，上述体液样品为血液或尿。
(9)一种胃癌检测用试剂盒，包含抗COTL1抗体、抗COTL1突变体抗体、它们的片段和/或它们的化学修饰衍生物。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-046613号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
通过本发明，能够容易且高可靠性地检测胃癌。例如，仅通过测定胃癌患者的血液等体液样品中所含的COTL1蛋白质的浓度，就可以容易地判定是否是胃癌。根据本发明的胃癌检测方法，在早期癌的情况下也能够检出这方面是有效的。
附图说明
图1是通过蛋白质印迹法检测胃癌患者和健常人的血浆中的COTL1蛋白质而得的图。
图2是通过夹心ELISA法检测胃癌患者和健常人的血浆中的CEA(图2A)和CA19-9(图2B)而得的图。
具体实施方式
1.胃癌检测用标志物
(概要)
本发明的第一方式涉及用于检测胃癌的胃癌检测用标志物。本发明是基于COTL1蛋白质在胃癌患者血液中的比健常人更多地存在的见解而做出的。如后述的本发明的第二方式中所说明的那样，根据被测体的血液中存在的该蛋白质的量的多少，可以检测出该被测体的胃癌的罹患。
(发明的构成)
在本发明中，“胃癌检测标志物”是用于检测胃癌的生物学标志物，是指成为显示被测体罹患胃癌的指标的物质。本发明的胃癌检测用标志物包含COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段(以下在本说明书中将它们归纳起来，有时称为“COTL1蛋白质等”)。
本发明的“COTL1蛋白质”如上所述是肌动蛋白细胞骨架结合性蛋白质。在本发明中，对应于由142个氨基酸组成的约17KDa的各生物种COTL1蛋白质，优选为来源于人的COTL1蛋白质(GenBank登录号NP_066972.1)，具体为序列号1所示的多肽。另外，COTL1蛋白质还可以是COTL1蛋白质、特别是来源于人的COTL1蛋白质的突变体或野生型和/或突变型的COTL1蛋白质的片段。本发明者们搞清楚了，COTL1蛋白质等由胃癌细胞产生，在胃癌患者中，多于健常体的量漏出到体液中。
在本说明书中，上述COTL1蛋白质“突变体”，是指在构成COTL1蛋白质、优选为序列号1所示的来源于人的野生型COTL1蛋白质的氨基酸序列或其部分序列中，包含1个以上、优选为1个～几个氨基酸的缺失、置换、添加或插入的突变体，或者是指与该氨基酸序列或其部分序列显示约80%以上、约85%以上、优选为约90%以上、更优选为约95%以上、约97%以上、约98%以上、约99%以上的同一性百分数的突变体。在这里，“几个”是指约10、9、8、7、6、5、4、3或2个以下的整数。此外，“同一性百分数”可以使用利用BLAST和/或FASTA的蛋白质检索系统，在导入间隙或者不导入间隙的条件下确定。(Karlin,S.等、1993年、Proceedingsof the National Academic Sciences U.S.A.、第90卷、p.5873-5877;Altschul,S.F.等、1990年、Journal of Molecular Biology、第215卷、p.403-410;Pearson,W.R.等、1988年、Proceedings of the NationalAcademic Sciences U.S.A.、第85卷、p.2444-24488)。作为COTL1蛋白质的突变体的具体例，可列举基于被测体的种类(例如，在被测人的情况下为种族)和/或个体的多态性(含SNIPs)、剪接突变等。
在本说明书中，“片段”是指下述多肽片段，所述多肽片段包含构成野生型COTL1蛋白质、优选为序列号1所示的来源于人的野生型COTL1蛋白质或其突变体的氨基酸的至少7个以上且少于总数、至少10个以上且少于总数、至少15个以上且少于总数、优选至少20个以上且少于总数、至少25个以上且少于总数、更优选至少35个以上且少于总数、至少40个以上且少于总数、至少50个以上且少于总数的连续氨基酸残基，且保持1个或几个表位。这样的片段可以与后述的本发明所涉及的抗体或其片段免疫特异性地结合。这样的肽片段也包含在COTL1蛋白质中的原因是，即使被片段化，只要能定量血液中的COTL1蛋白质，就能实现本发明的目的，而且，血液中的上述野生型COTL1蛋白质(优选为序列号1所示的来源于人的野生型COTL1蛋白质)或其突变体的全长多肽，也可能被例如血液中存在的蛋白酶和/或肽酶等片段化而存在。
2.胃癌检测方法
(概述)
本发明的第二方式涉及检测胃癌的方法。本发明是基于COTL1蛋白质在胃癌患者的血液中比健常人更多地存在的见解，测定来源于被测体的体液中存在的本发明的胃癌检测用标志物的量，由其结果来检测胃癌的方法。
(发明的构成)
本发明的方法包括(1)胃癌检测用标志物测定工序，和(2)罹患确定工序。以下对于各个工序进行详细说明。
2-1.胃癌检测用标志物测定工序
“胃癌检测用标志物测定工序”，是体外测定来源于被测体的体液中存在的本发明的胃癌检测用标志物即COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段的量的工序。
在本说明书中，“被测体”是成为胃癌罹患的检测对象的样本，对应于脊椎动物，优选为哺乳动物，特别优选为人。在本说明书中，在被测体是人的情况下，以后特别称为“被测人”。
在本说明书中，“体液”是被提供用于胃癌检测的样品，是指生物学上的流体。体液只要是可能含有本发明的胃癌检测用标志物的生物学上的流体即可，不特别限定。包含例如，血液、尿、淋巴细胞培养上清、脑脊液、消化液(包含胃液、唾液)、汗、腹水、鼻粘液、泪、阴道分泌液、精液等。优选为血液或者尿。这里所说的“血液”包含全血、血浆和血清。全血不分静脉血、动脉血或脐带血。体液也可以是由同一个体获得的两种以上不同体液的组合。由于本发明的胃癌检测方法通过侵袭性低的血液和/或尿也能够检测，所以作为简便的检测方法非常有用。
“来源于被测体的体液”是指已经从被测体采取的体液，本发明的方式并不包含采取体液的行为本身。关于来源于被测体的体液，可以在从被测体采取之后直接用于本发明的方法，也可以在采取后直接或实施适当的处理之后进行冷藏或冷冻，并在供给至本发明的方法之前恢复到室温再使用。作为冷藏或冷冻前的适当的处理，包括例如向全血中添加肝素等进行抗凝固处理后，再作为血浆或血清分离等。这些处理基于本领域公知的技术来进行即可。
在本说明书中，“本发明的胃癌检测用标志物的量”是指来源于被测体的体液中存在的COTL1蛋白质等的量。该量可以是绝对量或相对量的任一种。在绝对量的情况下，对应于在规定的体液量中所含的胃癌检测用标志物的质量或者容量。在相对量的情况下，是指通过相对于特定的测定值的来源于被测体的胃癌检测用标志物的测定值来表示的相对的值。可列举例如，浓度、荧光强度、吸光度等。
胃癌检测用标志物的量可以在体外使用公知的方法测定。可列举例如，使用与上述蛋白质等能够特异性地结合的物质进行测定的方法。
在本说明书中，“能够特异性地结合”是指，某物质仅能够与本发明的目标胃癌检测用标志物即COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段实质地形成复合体。这里的“实质地”是指除了非特异性结合以外的结合。
作为“能够特异性地结合的物质”，可列举例如COTL1结合蛋白质等。更具体地说，例如，以COTL1蛋白质作为抗原，识别并结合该抗原的“抗COTL1抗体”；优选为识别并结合具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽的抗体；或者以COTL1蛋白质的突变体作为抗原，识别并结合该抗原的“抗COTL1突变体抗体”；优选为识别并结合具有序列号1的突变体的氨基酸序列的多肽的抗体；和/或这些抗体的抗体片段。或者也可以是这些抗体的化学修饰衍生物。这里“化学修饰衍生物”包括以下任一者：在获得或保持上述抗COTL1抗体、抗COTL1突变体抗体和/或它们的片段的与COTL1蛋白质等特异性结合的活性方面所需的功能上的修饰；或者在检测上述抗COTL1抗体，抗COTL1突变体抗体和/或它们的片段方面所需的用于标记的修饰。
功能上的修饰可列举例如糖基化、去糖基化、PEG化。
标记上的修饰可列举利用例如荧光色素(FITC、罗丹明、德克萨斯红(Texas Red)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如PE、APC、GFP)、酶类(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素或(链霉)亲和素等进行的标记。
抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体的任一者。为了能够特异性地检测，优选为单克隆抗体。与COTL1蛋白质等特异性地结合的抗COTL1多克隆抗体等(包含抗COTL1多克隆抗体、抗COTL1突变体多克隆抗体和/或对这些抗体的片段的多克隆抗体)或抗COTL1单克隆抗体等(包含抗COTL1单克隆抗体、抗COTL1突变体单克隆抗体和/或对这些抗体的片段的单克隆抗体)可以通过后述的方法制作。此外，抗人COTL1多克隆抗体已经由Protein Group公司等市售，也可利用该市售品。本发明的抗体的球蛋白类型只要具有上述特征即可，不特别限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中任一种，优选为IgG和IgM。抗体片段包含例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv等，但不限于这些。还包含能够通过遗传工程学技术产生的抗体片段和衍生物。这样的抗体包含例如合成抗体、重组抗体、多重特异性抗体(含双重特异性抗体)、单链抗体等。本发明的抗COTL1蛋白质抗体等是针对包含上述蛋白质的至少5个、优选为至少8个氨基酸的1个或几个表位的抗体。特异性的多克隆抗体例如可以通过以下方法制作，所述方法包括在琼脂糖等载体上结合了COTL1蛋白质等的柱中通入免疫了该蛋白质的兔等的抗血清，再回收结合于柱载体上的IgG抗体的工序。
(1)抗COTL1抗体的制作
以下具体说明本发明中使用的抗COTL1多克隆抗体等和抗COTL1单克隆抗体等的制作方法。
(1-1)免疫原的调制
在本发明中制作抗体时，调制作为免疫原(抗原)的COTL1蛋白质等。能够在本发明中作为免疫原使用的COTL1蛋白质，例如具有序列号1所示的氨基酸序列的人COTL1蛋白质或者其突变体或者其多肽片段，或者它们与其他肽(例如，信号肽、标记肽等)的融合多肽。作为免疫原的COTL1蛋白质，例如可以利用序列号1的氨基酸序列信息，通过本技术领域公知的方法、例如固相肽合成法等，来合成用作免疫原的COTL1蛋白质片段。在使用COTL1蛋白质片段作为免疫原的情况下，优选将其与KLH、BSA等载体蛋白质连接而使用。
此外，作为免疫原的COTL1蛋白质等也可以利用公知的DNA重组技术获得。编码COTL1蛋白质等的cDNA可以通过cDNA克隆化法制作。从表达免疫原COTL1基因等的胃上皮细胞等生物体组织中提取总RNA，将其使用寡聚dT纤维素柱处理，从所得的多聚A(+)RNA通过RT-PCR法制作cDNA文库，由该文库通过杂交筛选、表达筛选、抗体筛选等筛选来获得目标cDNA克隆。根据需要还可以通过PCR法将cDNA进一步扩增。这样就可以得到与目标基因对应的cDNA。cDNA克隆化技术记载于例如Sambrook,J.和Russel,D.著、Molecular Cloning,A LABORATORYMANUAL(分子克隆实验指南)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001年1月15日发行、第1卷7.42～7.45、第2卷8.9～8.17。
接下来，将通过上述方法等获得的cDNA克隆整合到表达载体中，再通过培养用该载体进行了转化或转染的原核或真核宿主细胞，从而可以从该细胞获得目标的COTL1蛋白质等。此时，在从培养上清中获取目标的蛋白质等的情况下，可以通过在编码该多肽的DNA的5’末端侧翼化编码分泌信号序列的核苷酸序列，从而使成熟多肽分泌到细胞外。
作为表达载体，可列举来源于大肠菌的质粒(例如pET21a、pGEX4T、pC118、pC119、pC18、pC19等)、来源于枯草菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)、来源于酵母的质粒(例如YEp13、YEp24、YCp50等)，作为噬菌体DNA可列举λ-噬菌体(λgt11、λZAP等)。并且，也可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。载体和表达系统可以从Novagen公司、宝酒造、第一化学药品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、Roche Diagnositics公司、Invitrogen公司、Genetics Institute公司、GE Healthcare公司等购得。
为了向表达载体插入COTL1蛋白质等的cDNA，可采用：首先，将纯化后的DNA用适当的限制性酶切断，再插入到合适的限制性酶位点或者多克隆位点而与载体连接的方法等。载体除了含有编码该蛋白质的DNA之外，还可以含有调节元件，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、核糖体结合位点、复制起始位点、终止子、选择标志物等。此外为容易地纯化多肽可以在多肽的C末端或者N末端连接标记肽而制成融合多肽。代表性的标记肽可列举6～10个残基的组氨酸重复、FLAG、myc肽、GFP蛋白质等，但标记肽不限于这些，此外，关于DNA重组技术在Sambrook,J.和Russel,D.(上述)中记载。为了将DNA片段与载体片段连接，使用公知的DNA连接酶。
作为宿主细胞，可以使用细菌等原核细胞(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)等大肠菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等枯草菌)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫细胞(例如，Sf细胞)、哺乳动物细胞(例如，COS、CHO、BHK)等。向宿主细胞中导入重组载体的导入方法只要是向各个宿主导入DNA的方法即可，没有特别限定。向细菌导入该载体的方法，可列举例如，热激法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。这些技术都是本领域公知的，在各种文献中记载。例如可参照Sambrook,J.et.al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Ed.(分子克隆实验指南第二版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York。此外，向动物细胞导入该载体的方法，优选使用例如脂质体转染法(PNAS(1989)Vol.86,6077)、(PNAS(1987)Vol.84,7413)、电穿孔转染法、磷酸钙法(Virology(1973)Vol.52,456-467)、使用脂质体的方法、DEAE-Dextran(DEAE-葡聚糖)法等。
作为用于培养以大肠菌、酵母菌等微生物作为宿主获得的转化体的培养基，含有微生物能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，只要是能有效地进行转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基的任一者。培养通常在震荡培养或者通风搅拌培养等有氧条件下、在37℃进行6～24小时。培养过程中pH值保持在中性附近。pH值的调整使用无机或有机酸、碱溶液等进行。培养中可根据需要在培养基中添加氨苄青霉素和/或四环素等抗生素。在培养哺乳动物细胞等的转化体的情况下，也在适合各种细胞的培养基中培养后，回收培养上清或者细胞内所生产的蛋白质。此时培养基可以含有血清，也可以不含有血清，但更优选在无血清培养基中培养。在COTL1蛋白质等在菌体内或者细胞内的情况下，通过破碎菌体或细胞来提取蛋白质。此外在COTL1蛋白质等在菌体外或者细胞外生产的情况下，直接使用培养液，或者通过离心分离等除去菌体或者细胞。
在不附加标记肽的情况下生产本发明的蛋白质的情况下，作为其纯化法可列举例如利用离子交换层析的方法。此外也可以是组合凝胶过滤层析和/或疏水性层析、等电点层析等的方法。此外，在该蛋白质上带有组氨酸重复、FLAG、myc、GFP等标记肽的情况下，可以列举利用一般使用的适合各种标记肽的亲和层析的方法。优选构建分离和/或纯化容易的表达载体。特别是如果以多肽与标记肽的融合蛋白质的形态表达的方式构建表达载体，用遗传工程学的方法调制该蛋白质，则分离和/或纯化也容易。是否真正获得了COTL1蛋白质等，可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等来确认。
(1-2)抗体的制作
以这样获得的COTL1蛋白质等作为抗原，可以获得特异性地识别COTL1蛋白质等的抗体。
更具体地说，蛋白质、蛋白质片段、蛋白质突变体、融合蛋白质等，包含用于引起抗体形成的抗原决定簇或者表位，这些抗原决定簇或表位既可以是直链，也可以是更高级结构(断续的)。此外，该抗原决定簇或表位可以通过在本技术领域已知的所有方法来鉴定。
通过本发明的蛋白质可以诱导所有形态的抗体。只要分离出该蛋白质的全部或者一部分或者表位，就可以用常用的技术制造多克隆抗体和单克隆抗体的任一者。方法例如有Kennet等(主编),Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,New York,1980中所列举的方法。
(1-2-1)多克隆抗体的制作
为了制作多克隆抗体，首先将所得的COTL1蛋白质等在缓冲液中溶解调制免疫原。此外，根据需要，为了有效地进行免疫可以添加佐剂。作为佐剂的例子，可列举市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，可以将它们单独或者混合使用。
接下来，将上述调制的免疫原对哺乳动物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔等施与、免疫。免疫原的一次的施与量根据免疫动物的种类、施与途径等适宜确定，每1只动物约50～200μg。作为免疫原的施与方法，可列举例如，使用FIA或FCA进行的皮下注射、使用FIA进行的腹腔内注射、以及使用0.15mol/L的氯化钠进行的静脉注射等，但不限于此。此外，对免疫的间隔不特别限定，初次免疫之后，以几天到几周间隔、优选以1～4周间隔进行2～10次、优选为3～4次追加免疫。初次免疫后，通过ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酶联免疫吸附测定)法等来反复测定免疫动物血清中的抗体效价，当抗体效价达到平高线(Plateau)时，向静脉内或者腹腔内注射免疫原，作为最终免疫。免疫之后，可以从血液中回收针对COTL1蛋白质等的多克隆抗体。在需要单克隆抗体的情况下，制作后述的产生抗COTL1抗体的杂交瘤。
(1-2-2)单克隆抗体的制作
从免疫动物回收产生抗体的细胞
根据本发明，可以制作生产特异性地识别COTL1蛋白质等的抗COTL1单克隆抗体的杂交瘤。这种杂交瘤能够通过常用的技术产生并且鉴定。用于产生这种杂交瘤的方法之一，将动物用本发明的蛋白质免疫，从免疫后的动物采取产生抗体的细胞，并使该产生抗体的细胞与骨髓瘤(myeloma)细胞株融合，由此生产杂交瘤细胞，并且鉴定产生与COTL1蛋白质等结合的单克隆抗体的杂交瘤即可。作为产生抗体的细胞，可列举脾细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或局部淋巴结细胞。这些细胞使用从用COTL1蛋白质等免疫过的动物中摘出或者采取的即可。对动物免疫的方法依据上述多克隆抗体制作的项。作为与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞株，可以使用小鼠等动物的一般可以购得的株化细胞。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性，并具有在未融合的状态下在HAT选择性培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中无法生存、只有在与产生抗体的细胞融合了的状态下才能生存的性质。此外株化细胞优选来源于与免疫动物同种系的动物。作为骨髓瘤细胞株的具体例，有来源于BALB/c小鼠的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷细胞株P3X63-Ag.8株(ATCC TIB9)、P3X63-Ag.8.U1株(JCRB9085)、P3/NSI/1-Ag4-1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)或Sp2/0-Ag14株(JCRB0029)等。
细胞融合
细胞融合，在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞用培养基中，将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞株以约1:1～20:1的比例混合，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以以约10～80％浓度使用平均分子量为1500～4000道尔顿的聚乙二醇等。另外根据情况不同，为提高融合效率也可以并用二甲基亚砜等辅助剂。还可以进一步使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置来使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞株融合(Nature,1977,Vol.266,550-552)。
杂交瘤的分选和克隆化
从细胞融合处理后的细胞中分选出作为目标的产生抗COTL1抗体等的杂交瘤。作为其方法，将细胞悬浮液用例如含胎牛血清的RPMI-1640培养基等进行适当的稀释后，在微量滴定板上以200万个/孔左右接种。向各孔内加入选择培养基，之后适当地更换选择培养基进行培养。培养温度为20～40℃，优选为约37℃。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷株或者胸苷激酶缺陷株的情况下，可以通过使用含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的选择性培养基(HAT培养基)仅选择性地培养具有产生抗体的能力的细胞与骨髓瘤细胞株的杂交瘤，使其增殖。其结果是，可以获得从使用选择培养基开始培养后约14天前后生长的细胞作为杂交瘤。
接下来，筛选在增殖的杂交瘤的培养上清中是否存在目标抗体。杂交瘤的筛选按照通常的方法即可，不特别限定。例如，采取作为杂交瘤生长的孔中所含的培养上清的一部分，通过酶免疫测定法(EIA：EnzymeImmuno Assay、和ELISA)、放射线免疫测定法(RIA：Radio Immuno Assay)等来进行。融合细胞的筛选通过有限稀释法等来进行，最终树立作为产生单克隆抗体的细胞的杂交瘤。本发明的杂交瘤如下所述，在利用RPMI-1640、DMEM等基本培养基的培养中是稳定的，并产生、分泌与来源于胃癌的COTL1蛋白质特异性地反应的单克隆抗体。
抗体的回收
单克隆抗体可以使用常用的技术回收。即，作为从树立好的杂交瘤中采取单克隆抗体的方法，采用通常的细胞培养法或者腹水形成法等。在细胞培养中，将杂交瘤在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或者无血清培养基等动物细胞培养基中，在常用的培养条件(例如37℃、5％CO2浓度)下培养2～10天，从其培养上清中获得抗体。在腹水形成法的情况下，可以将杂交瘤以约1000万个施与至与骨髓瘤细胞所来源的哺乳动物同种系的动物的腹腔内，使杂交瘤大量增殖。然后在1～2周之后采取腹水或者血清。
在上述抗体的采取方法中，如果需要纯化抗体，则可以适宜选择硫酸铵盐析法、离子交换层析法、亲和层析法、凝胶层析法等公知的方法，或者通过上述方法的组合，从而获得被纯化的本发明的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体包含嵌合抗体，例如鼠科单克隆抗体的人化型。此外，根据本发明，还可提供上述抗体的抗原结合片段。作为可以使用常用的技术产生的抗原结合片段的例子，包含Fab及F(ab’)2片段，但不限于这些。此外也可提供可以通过遗传工程学技术产生的抗体片段和衍生物。本发明的抗体在体外和体内的任一种情况都可以在用于检测本发明的多肽或其(多)肽片段的存在的分析中使用。此外本发明的抗体也可以用于通过免疫亲和层析法来纯化蛋白质或者蛋白质片段。
为了实现分析中的特异性检测，优选使用单克隆抗体，但即使是多克隆抗体，也可以通过所谓吸收法获得特异抗体，所述吸收法包含使抗体与结合有纯化多肽的亲和柱结合。
(2)使用抗COTL1抗体等的本发明的胃癌检测用标志物的体外测定
作为使用上述(1)所制作的抗COTL1抗体等，来体外测定来源于被测人的体液中所存在的本发明的胃癌检测用标志物、即COTL1蛋白质等的量的方法(用免疫学方法)，可列举例如，酶免疫测定法(ELISA、EIA)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红血球凝集反应、颗粒凝集反应或者蛋白质印迹法。
在将本发明的胃癌检测用标志物测定方法通过酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或者发光免疫测定法等使用标记的免疫测定法来实施的情况下，优选将上述抗COTL1抗体等进行固定化，或者将样品中的成分固定化，从而进行这些免疫学反应。作为固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、Sepharose(琼脂糖凝胶)、玻璃、金属、陶瓷或者磁性体等材质制成的珠、微板、试管、棒或者试验片等形状的不溶性载体。固定化可以如下进行：按照物理吸附法、化学结合法或它们的并用等公知的方法，使固相载体与上述抗COTL1抗体等或样品成分结合。
在本发明中，为了更容易地检测上述抗COTL1抗体等与体液中的来源于胃癌细胞的本发明的胃癌检测用标志物的反应，可以通过标记上述抗COTL1抗体等来直接检测该反应，或者通过使用标记二抗来间接检测该反应。在本发明的胃癌检测方法中，从灵敏度的方面考虑，优选利用后者的间接检测(例如夹心法等)。
作为标记物质，在酶免疫测定法的情况下，可以使用过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或者生物素-亲和素复合体等；在荧光免疫测定法的情况下，可以使用异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、取代异硫氰酸罗丹明、二氯三嗪基异硫氰酸酯、Alexa或AlexaFluoro等；而且在放射免疫测定法的情况下，可以使用氚、碘125或碘131等。此外发光免疫测定法可以使用NADH-、FMNH2-、萤光素酶系、鲁米诺-过氧化氢-POD系、吖啶酯系或者二氧杂环丁烷化合物系等。
关于标记物质与抗体的结合方法，在酶免疫测定法的情况下，可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫化吡啶法或者高碘酸法等公知的方法；在放射免疫测定法的情况下，可以使用氯胺T法、鲍尔通-亨特(Bolton-Hunter)法等公知的方法。测定的操作法可以通过公知的方法(Current protocols in Protein Sciences、1995年、John Wiley&Sons Inc.、Current protocols in Immunology、2001年、John Wiley&Sons Inc.)进行。
例如，在将上述抗COTL1抗体等直接标记的情况下，可以将体液中的成分固定化，使其与标记后的上述抗COTL1抗体等接触，形成本发明的胃癌检测用标志物(COTL1蛋白质等)-抗COTL1抗体等的复合体。然后清洗分离未结合的标记抗体，通过结合标记抗体量或未结合标记抗体量，可以测定体液中的胃癌检测用标志物(COTL1蛋白质等)的量。
此外，例如，在使用标记二抗的情况下，使本发明的抗体与样品反应(一次反应)，再与标记二抗反应(二次反应)。一次反应和二次反应可以以相反的顺序进行，也可以同时进行，或延迟时间进行。通过一次反应和二次反应，形成固定化了的本发明的胃癌检测用标志物-抗COTL1抗体等-标记二抗的复合体、或者固定化了的抗COTL1抗体等-本发明的胃癌检测用标志物-标记二抗的复合体。然后清洗分离未结合的标记二抗，通过结合标记二抗量或未结合标记二抗量，可以测定样品中的胃癌检测用标志物的质量。
具体地，在酶免疫测定法的情况下，使标记酶在其最适条件下与底物反应，通过光学方法等测定其反应生成物的量。在荧光免疫测定法的情况下，测定标记荧光物质产生的荧光强度；在放射免疫测定法的情况下，测定放射性物质标记产生的放射能量。在发光免疫测定法的情况下，测定发光反应系统产生的发光量。
在本发明的方法中，在对于将免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红血球凝集反应或颗粒凝集反应等的免疫复合体凝集物的生成，通过利用光学方法测定其透射光或散射光、或目测测定的测定法来实施的情况下，作为溶剂可以使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或者Good缓冲液等，还可以在反应系中进一步含有聚乙二醇等反应促进剂和/或非特异性的反应抑制剂。
显示本发明的检测法的优选实施方式的一例。首先将本发明的抗体作为一抗固定于不溶性载体。并优选将未吸附抗原的固相表面用与抗原无关的蛋白质(小牛血清、牛血清白蛋白、明胶等)进行封闭。接下来使固定化的一抗与被测样品接触。接着，使在与上述一抗不同的部位与本发明的胃癌检测用标志物反应的标记二抗接触，检测来自该标记的信号。这里使用的“在与一抗不同的部位与胃癌检测用标志物反应的二抗”只要是识别一抗与胃癌检测用标志物(COTL1蛋白质等)的结合部位以外的部位的抗体即可，不特别限制，无论免疫原的种类，可以是多克隆抗体、抗血清、单克隆抗体的任一种，还可以使用这些抗体的片段(如Fab、F(ab’)2、Fab、Fv、ScFv等)。此外作为二抗还可以使用多种单克隆抗体。
此外，还可以与此相反，将本发明的抗体附加标记作为二抗，将在与本发明的抗体不同的部位与胃癌检测用标志物反应的抗体作为一抗固定于不溶性载体，使该固定化的一抗与被测样品接触，接着与作为二抗的带标记的本发明的抗体接触，检测来自上述标记的信号。
此外因为本发明的抗体如上所述与来源于胃癌细胞的胃癌检测用标志物特异性地反应，所以可以作为癌的检测药使用。本发明的检测药含有本发明的抗体，因此可以使用本发明的检测药，通过检测从可能罹患胃癌的个体中采取的样品中所含的来源于胃癌细胞的胃癌检测用标志物，来检测该个体的胃癌罹患。
另外，本发明的检测药，虽然只要是用于进行免疫学测定的方法就在任一方法中都可以利用，但通过与本技术领域公知的免疫层析用试纸条等简便的方法组合使用，可以进一步简便且迅速地检测癌。免疫层析用试纸条例如由包含容易吸收样品的材料的样品接受部、含有本发明的检测药的试剂部、进行样品与检测药的反应生成物的移动的展开部、使展开的反应生产物显色的标记部、进行显色的反应生产物的展开的提示部等构成，可以制成与妊娠诊断药相同的形态。首先，在样品接收部加入样品后，样品接收部吸收样品而使样品到达试剂部。接着，在试剂部，样品中的来源于胃癌细胞的胃癌检测用标志物与抗COTL1抗体等的反应发生，反应生成的复合体移动通过展开部而到达标记部。在标记部，上述的反应复合体与标记二抗的反应发生，与该标记二抗的反应生成物展开抵达提示部，则显色被确认。上述免疫层析用试纸条因为完全不会带给使用者痛苦和/或试剂使用产生的危险性，所以可以在家庭中的监测中使用，将其结果在各医疗机构水平上精查和/或治疗(外科手术切除等)，从而可以预防转移和/或复发。而且现在该试纸条可以通过例如日本特开平10-54830号公报所记载的那样的制造方法来廉价地大量生产。此外通过将本发明的检测药与已知的对胃癌的肿瘤标志物的检测药组合使用，可以实现可靠性高的诊断。
2-2.罹患确定工序
“罹患确定工序”是基于上述胃癌检测用标志物测定工序中测定的蛋白质的质量来确定胃癌的罹患的工序。基于测定的胃癌检测用标志物、即COTL1蛋白质等的质量来确定胃癌的罹患。作为确定方法的一例，可列举例如，在被测体的胃癌检测用标志物的量和健常体的该量相比在统计学上有意义的多时，确定为罹患胃癌的方法。
这里所指的“健常体”至少是指未罹患胃癌的个体，优选为健康的个体。并且健常体要和被测体为同一生物种。例如，在供检查的被测体为人(被测人)的情况下，健常体也必须为人(在本说明书中以下称为“健常人”)。健常体的身体条件优选与被测体相同或近似。身体条件例如，在人的情况下，对应于种族、性别、年龄、身高、体重等。
“统计学上有意义的”，可列举例如，所得的值的危险率(有意义水准)小于5%、1%或者0.1%的情况。因此“统计学上有意义的多”是指在将从被测体和健常体分别获得的胃癌检测用标志物的量的差异进行统计学处理时，两者之间存在有意义的差异，并且被测体的上述蛋白质的量要高于健常体的该量。通常，关于体液中的胃癌检测用标志物的量，被测体多达健常体的2倍以上，优选为3倍以上，更优选为4倍以上，最优选为以5倍以上。如果量的差异为3倍以上，则可以说信赖度高，统计学上也有意义的多。统计学的处理的检验方法只要适宜使用能够判断有意义性的有无的公知的检验方法即可，不特别限定。例如，可以使用学生t检验法、多重比较检验法等方法。
健常体的体液中的胃癌检测用标志物的量，优选使用与在上述工序中已经说明的被测体的体液中的胃癌检测用标志物的量的测定方法同样的方法来测定。健常体的体液中的胃癌检测用标志物的量还可以在每逢测定被测体的体液中的胃癌检测用标志物的量时测定，但也可以利用事先测定好的胃癌检测用标志物的量。特别是如果事先测定好各种身体条件的健常体的胃癌检测用标志物的量，并将其数值输入电脑而数据库化，则通过在该电脑中输入被测体的身体条件，就可以马上利用具有与该被测体相比较最适合的身体条件的健常体的胃癌检测用标志物的量，因此是方便的。
被测体的体液中的胃癌检测用标志物的量与健常体的体液中的胃癌测出用标志物的量相比在统计学上有意义的多的情况下，判定该被测体罹患胃癌。对成为本发明的对象的胃癌的病期并没有特别的限制，遍及早期胃癌到晚期胃癌。特别在即使是早期胃癌也能够实现其检测这一点，有本发明的实际效益。“早期胃癌”是指局限于肿瘤发生的局部(粘膜内)，未向周围组织浸润的胃癌，或者即使有浸润其范围也局限于局部的胃癌。早期胃癌包含病期分类的0期和I期，胃癌的早期检测显著提高5年生存率。
这样，根据本发明的胃癌检测方法，包括使用抗体免疫学测定体液样品中的胃癌检测用标志物的工序。通过本发明的方法，不仅可以判定被测体是否罹患胃癌，还可以识别胃癌患者和非胃癌患者。
3.胃癌检测用试剂盒
本发明的第三方式是胃癌检测用试剂盒
“胃癌检测用试剂盒”是指为了检测胃癌罹患的有无、罹患的程度或改善的有无和/或改善的程度，以及为了筛选对预防、改善或者治疗胃癌有用的候选物质，而直接或间接地被利用的试剂盒。
本方式的试剂盒，作为其构成物，包含能够特异性识别并结合以下蛋白质的物质，所述蛋白质是在与胃癌的罹患有关的体液样品中、特别是血液、血清、血浆中表达变动的COTL1蛋白质，优选为具有序列号1所示的氨基酸序列或者其突变体序列的蛋白质。具体地说，包括例如抗COTL1蛋白质抗体等或其片段、或者它们的化学修饰衍生物。这些抗体可以与固相载体结合。此外，还可以包含例如，标记二抗、以及为检测标记所需的底物、载体、清洗缓冲液、样品稀释液、酶底物、反应停止液、纯化的作为标准物质的COTL1蛋白质等、使用说明书等。
实施例
以下通过实施例来更具体地说明本发明。但本发明不受该实施例限制。
＜参考例＞
(1)中空丝过滤器的制作
将膜表面具有截留分子量约5万的孔径的聚砜中空丝100根捆成束，在不使中空丝中空部堵塞的前提下将两末端用环氧树脂系封装剂固定在玻璃管上，制成微型模块。该微型模块(模块A)可用于去除血清或血浆中的高分子量蛋白质，其直径约7mm，长度约为17cm。同样地使用截留分子量约3千的孔径的膜制成用于浓缩低分子量蛋白质的微型模块(模块B)。微型模块在一侧具有与中空丝内腔连接的入口，另一侧的端成为出口。中空丝入口和出口是通过硅管形成的封闭循环系流路，液体受蠕动泵的驱动而在该流路内循环。另外，中空丝外套的玻璃管具备使从中空丝滤出的液体排出的端口，这就构成了一个模块组件。在循环回路的中途介由T字的连接器连接模块，将3根模块A和1根模块B串联连接制成一个中空丝过滤器。将该中空丝过滤器用蒸馏水清洗，填充PBS(含0.15mM NaCl的磷酸缓冲液，pH值7.4)水溶液。分级原液的血清或血浆从该中空丝过滤器的流路入口被注入，分级、浓缩之后由流路出口被排出。注入该中空丝过滤器中的血清或血浆在每个模块A中与分子量约5万的分子筛作用，分子量低于5万的低分子的成分被模块B浓缩、调制。
＜实施例1＞
(1)健常人及胃癌患者血中的蛋白质检定
调制从50多岁～70多岁的胃癌患者6名获得的血清的混合液、以及从同龄的健常人6名获得的血清的混合液。将各混合液通过孔径0.22μm的过滤器过滤除去杂质，调制成蛋白质浓度50mg/mL。将该血浆再用25mM碳酸氢铵溶液(pH值8.0)稀释成12.5mg/mL，使用参考例(1)所示的中空丝过滤器根据分子量进行分级。将分级后的血清样本(总量1.8mL、最多含有250μg的蛋白质)冻结干燥之后，使用100μL的25mM碳酸氢铵溶液溶液(pH值8.0)再次溶解。对于该样本，用总蛋白质量的1/50量的胰蛋白酶，在37℃、2～3小时的条件下进行肽消化，使用脱盐柱(Waters公司)进行脱盐处理后，再使用离子交换柱(KYAテクノロジ一ズ)8分级。将各个级分使用反向柱(KYAテクノロジ一ズ)进一步分级，对于溶出的肽，使用在线连接的质量分析仪Q-TOF Ultima(Micromass公司)，以使用Survey Scan模式进行3次测定。
作为血液蛋白质的鉴定基准，使用如下两个基准，在能够极力排除错误的蛋白质鉴定的条件下进行分析，所述基准为：(i)在属于该蛋白质的肽中，至少一条以上以P值0.05以下的高可靠性被检出；(ii)肽的MS数据的测定值和MS/MS数据的测定值、与肽的理论值之间的误差为0.3道尔顿以下。
将数据在健常人和癌患者之间进行比较，在被鉴定的蛋白质中，作为3次的胃癌患者的样本测定的MASCOT得分的平均值与健常人样本测定MASCOT得分的平均值相比有意义的高的蛋白质，发现了COTL1蛋白质(表1)。
表1
Figure BDA00002091424300221
(2)通过蛋白印迹法检测血液中的COTL1蛋白质
从胃癌患者16名(I期：7名、III期：5名、IV期：4名)以及健常对照12名获得血浆样本。向100μL各样本中加入100μL的Affi-Gel蓝胶(Bio-Rad)和50μL的ProteinA-Sepharose(GE Healthcare)，在4℃下反应一夜，去除了样本中的白蛋白和免疫球蛋白。将这样得到的样本使用SDS上样缓冲液(50mM Tris盐酸、pH值6.8、1mM DTT、5％SDS、10％甘油)进行可溶化和沸腾处理，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(16％)电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。使其与兔多克隆抗体(Proteintech Group公司)以及过氧化物酶标记二抗反应。使用SuperSignal West Femto MaximumSensitivitySubstrate(Pierce公司)使X射线膜感光从而将免疫反应的蛋白质可视化，使用Scion Image(Scion Corporation)通过图像分析将相当于COTL1的条带的信号强度数值化。其结果是，在早期和进展期胃癌患者中，检测到了高于健常对照人的值的血浆中COTL1蛋白质浓度(图1)。
＜比较例1＞
(1)与胃癌检测中的CEA和CA-19的性能比较。
作为比较对象的肿瘤标志物，选择CEA和CA-19。CEA(癌胚抗原)是在临床上最广泛且频繁地被利用的肿瘤标志物的一种，除胃癌之外，在肺癌、乳腺癌、胆道癌、胰腺癌、大肠癌等的检测中使用。另一方面，CA19-9已知主要在胃癌、大肠癌和胰腺癌、胆囊及胆管癌的进展例中显示高的阳性率。然而，两种标志物均灵敏度低，不适合早期癌的检测。
使用CagAg CEA EIA试剂盒(富士レビオ社)测定胃癌患者血浆和健常对照中的CEA水平(图2A)。CEA仅在IV期显示高值，不能检测出早期胃癌。
使用CagAg CA19-9EIA试剂盒(富士レビオ社)测定CA19-9水平(图2B)。虽然存在CA19-9在III期和VI期中显示特别高值的样本，但不能检测出早期胃癌。
由从以上的结果证明，本发明在早期胃癌检测上是极为优异的方法。产业可利用性
本发明由于能通过简易且廉价的方法有效地检测胃癌，因而可以实现胃癌的早期发现、诊断和治疗。此外，通过本发明的方法，能够使用患者血液非侵袭性地检测胃癌，因而可以简便且迅速地检测胃癌。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请均作为参考而引入本说明书中。
Figure IDA00002091425000011
Figure IDA00002091425000021

Claims (9)

1.一种胃癌检测方法，其中，体外测定来源于被测体的体液中存在的胃癌检测用标志物的量，并基于该量来确定胃癌的罹患，所述胃癌检测用标志物包含COTL1蛋白质、该COTL1蛋白质的突变体和/或它们的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，上述COTL1蛋白质为序列号1所示的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在被测体的上述胃癌检测用标志物的量和健常体的该量相比统计学上有意义的多时，确定为罹患胃癌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，上述统计学上有意义的多的量是健常体的2倍以上。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，其中，上述测定使用能和上述胃癌检测用标志物特异性结合的物质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，上述能和胃癌检测用标志物特异性结合的物质为抗COTL1抗体、抗COTL1突变体抗体和/或它们的片段。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的方法，其中，上述胃癌为早期胃癌。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的方法，其中，上述体液样品为血液或尿。
9.一种胃癌检测用试剂盒，其包含抗COTL1抗体、抗COTL1突变体抗体、它们的片段和/或它们的化学修饰衍生物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103408662A (zh) * 2013-08-15 2013-11-27 浙江农林大学 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031757A1 (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 東レ株式会社 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法
WO2015181804A2 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Pontificia Universidad Católica De Chile Method and assay for the non-invasive detection of early gastric cancer by the combined use of methylated reprimo cell-free dna and pepsinogen i/ii
KR101970764B1 (ko) * 2017-05-19 2019-04-22 아주대학교산학협력단 조혈모세포의 항상성 유지에 관여하는 cotl1 단백질 및 이의 용도
KR102526196B1 (ko) * 2019-11-19 2023-04-27 아주대학교산학협력단 Cotl1을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물
WO2021101257A1 (ko) * 2019-11-19 2021-05-27 아주대학교산학협력단 Cotl1을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030175288A1 (en) * 2000-07-31 2003-09-18 Kyogo Itoh Tumor antigen
WO2008099972A1 (ja) * 2007-02-16 2008-08-21 Shimadzu Corporation 上皮性卵巣癌の組織型識別マーカー、及びそれを用いた組織型に基づく上皮性卵巣癌の罹患の識別法
CN101492506A (zh) * 2008-12-05 2009-07-29 中国人民解放军第四军医大学 胃癌多药耐药性鉴别诊断用ciapin1单克隆抗体及其制备方法
CN101519686A (zh) * 2008-02-29 2009-09-02 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 用于胃癌和胃癌组织转移的分子检测方法和试剂盒

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5314804A (en) * 1992-03-24 1994-05-24 Serim Research Corporation Test for Helicobacter pylori
JPH1054830A (ja) 1996-08-12 1998-02-24 Omomo Souuemon テストストリップの製造システム
AU2002359817A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to gastric specific genes and proteins
WO2005001126A1 (en) 2003-06-12 2005-01-06 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Detection kit for gastric cancer and metastatic gastric cancer
US7943306B2 (en) * 2005-01-12 2011-05-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Gene expression signature for prediction of human cancer progression
DE102006056784A1 (de) 2006-12-01 2008-06-05 Meyer, Helmut E., Prof.Dr. Biomarker für die Diagnose von Pankreaskrebs
JP4863404B2 (ja) 2008-08-22 2012-01-25 株式会社オメガ スクラバー機構
WO2010053816A2 (en) 2008-10-29 2010-05-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Biomarkers for diagnosis of breast cancer
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030175288A1 (en) * 2000-07-31 2003-09-18 Kyogo Itoh Tumor antigen
WO2008099972A1 (ja) * 2007-02-16 2008-08-21 Shimadzu Corporation 上皮性卵巣癌の組織型識別マーカー、及びそれを用いた組織型に基づく上皮性卵巣癌の罹患の識別法
CN101519686A (zh) * 2008-02-29 2009-09-02 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 用于胃癌和胃癌组织转移的分子检测方法和试剂盒
CN101492506A (zh) * 2008-12-05 2009-07-29 中国人民解放军第四军医大学 胃癌多药耐药性鉴别诊断用ciapin1单克隆抗体及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKATSURA T ET AL.: "Cellular and humoral immune responses to a human pancreatic cancer antigen, coactosin-like protein, originally defined by the SEREX method", 《EUR J IMMUNOL》, vol. 32, no. 3, 31 March 2002 (2002-03-31), XP001189053, DOI: doi:10.1002/1521-4141(200203)32:3<826::AID-IMMU826>3.0.CO;2-Y *
NAKATSURA T ET AL.: "Gene cloning of immunogenic antigens overexpressed in pancreatic cancer", 《BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN》, vol. 281, no. 4, 9 March 2001 (2001-03-09), pages 936 - 944, XP002948571, DOI: doi:10.1006/bbrc.2001.4377 *
PATRICK PROVOST ET AL.: "Coactosin-like protein, a human F-actin-binding protein : critical role of lysine-75", 《BIOCHEM. J.》, vol. 359, 1 January 2001 (2001-01-01), XP055066565 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103408662A (zh) * 2013-08-15 2013-11-27 浙江农林大学 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法

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Publication number Publication date
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WO2011108628A1 (ja) 2011-09-09

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