CN103408662A - 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 - Google Patents
一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103408662A CN103408662A CN2013103556842A CN201310355684A CN103408662A CN 103408662 A CN103408662 A CN 103408662A CN 2013103556842 A CN2013103556842 A CN 2013103556842A CN 201310355684 A CN201310355684 A CN 201310355684A CN 103408662 A CN103408662 A CN 103408662A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- agent
- recombinant protein
- protein
- toad skin
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，属于生物医药技术领域。其特征在于：1）将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂配置成A剂；蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂配置成B剂；2）将小白鼠皮下多点注射A剂，然后正常饲养12-16天，再用B剂皮下注射，以后每隔12-16天注射B剂一次，共注射B剂3-5次；3）将上述处理后小白鼠心脏采血，制得的上清液即为鼠抗血清。上述一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，能用于应对和预测转胶蛋白-2抗肿瘤研究中的具体事件，起到提示和标记转胶蛋白-2的作用；其获取方法简便，成本低廉，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法。
背景技术
抗血清（antiserum）是一种含有多克隆抗体的血清。通过注射抗血清可以传递被动免疫（passive immunity）治疗许多疾病。
两个世纪前，人们将白喉杆菌培养上清中分离到的可溶性毒素注入马体内，得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗的例子。经过两百多年的发展，人们已经可以通过各种免疫手段来获得针对毒素、病毒、细菌乃至癌细胞的特异性抗体。在我国，抗血清的研究利用也比较早。上世纪初，当时的中华民国筹建第一个血清所—青岛商品检验局血清所，一直到抗日战争的先后20年中，研究和生产了多种兽用抗血清，有：牛瘟抗血清、猪瘟抗血清、猪肺疫抗血清、牛出败抗血清、禽霍乱抗血清、猪丹毒抗血清等。建国后，经过近60年的发展，抗血清的研究和应用也已经相当成熟。目前，对血清抗体的研究已进入新的发展阶段，即免疫球蛋白的研究和应用。谈到抗血清，无论是在科学研究中还是在应用实践中，它都起着很大的作用。如在研究中，可用作标准阳性血清；在临床应用中，则是一种很好的治疗性抗体。抗血清的制备技术虽说目前比较成熟，但是还会在不同层面上出现各种各样的问题。抗血清既可以利用病原微生物抗原免疫同种或异种动物后采血提取血清制备，也可以提取耐过的自然感染动物血清制造。通常是给动物适当反复多次注射特定的病原微生物或其代谢产物等物质（抗原、免疫原），促使动物不断产生免疫应答反应（体液免疫与细胞免疫），从而使血清中含有大量相应的特异性抗体，然后采（放）血、分离血清制成，具体的制备过程，各种疾病略有不同，且已有大量的文献报道。
综上所述，动物抗血清制备的常规技术已经比较成熟，但目前市场上的产品却很少，主要是因为安全性问题、抗体效价变化以及抗血清的缺点造成的。因此，以后的研究重点也将集中在这些方面。经研究和临床应用表明，抗血清在特殊的情况下具有很重要的治疗价值，如治疗宠物、珍稀动物等的疾病，以及用于重大疫病的突发性事件的应对和预防，可见，抗血清产品还是具有很大的市场潜力。随着生产抗体的新方法的不断出现、抗体生产工艺的日趋成熟，抗血清的研究和应用将迈入新的阶段。因此，可以相信在不久的将来，抗血清处理技术将会更加完善，动物性免疫球蛋白将应用于临床，新技术抗体研究将成为热点。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法的技术方案，其制备方法简单，高效优良，使用安全且成本低廉。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀，配置成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀，配置成B剂，备用；
2）将小白鼠皮下多点注射45-100ug的A剂，然后正常饲养12-16天，再用B剂皮下注射45-100ug，再正常饲养，以后每隔12-16天注射B剂一次，共注射B剂3-5次，备用；
3）将上述处理后小白鼠直接心脏采血，所得血液于2-6℃下静置10-15h，等血液充分凝聚后，在转速2000-4000rpm下离心25-35min，所得上清液即为鼠抗血清，置于-60-70℃超低温冰箱保存即可；
所述的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白采用以下方法制备：
1）从蟾蜍皮肤cDNA质粒文库筛选，克隆到缺失部分5′-端开放阅读框碱基序列的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白 cDNA；
2）在原核表达系统一一大肠肝菌中表达和生产蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白: 首先构建工程菌并诱导表达，然后高密度发酵工程菌并诱导表达，包涵体分离和洗涤后，将目的蛋白质复性、纯化。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠皮下A剂的注射量为50-80ug，优选60-70 ug。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠注射A剂后正常饲养14-15天，再注射B剂。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠皮下B剂的注射量为50-80ug，优选60-70 ug。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠注射B剂的间隔饲养时间为14-15天。
所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：离心转速为2500-3000rpm，离心时间为28-31min。
上述一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，通过免疫手段获得针对蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的多克隆抗体的血清，在研究转胶蛋白-2抗肿瘤的分子生物学机制的特殊的情况下具有很重要的价值，能用于应对和预测转胶蛋白-2抗肿瘤研究中的具体事件，起到提示和标记转胶蛋白-2的作用；其获取方法简便，成本低廉，效果显著，使用安全且能够快速标记转胶蛋白-2，为转胶蛋白-2抗肿瘤的进程和分子机制研究提供一定的技术依据，可用于实验室及医学上的分析研究。
本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。
具体实施方式
现结合本发明的实施例，进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射45ug的A剂，正常饲养12天，再用B剂皮下注射55ug，再每隔12天注射B剂一次，共重复注射B剂3次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于2℃下静置15h，等血液充分凝聚后，在转速2000rpm下离心35min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
实施例2
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射100ug的A剂，正常饲养14天，再用B剂皮下注射100ug，再每隔14天注射B剂一次，共重复注射B剂5次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于6℃下静置10h，等血液充分凝聚后，在转速4000rpm下离心25min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
实施例3
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射100ug的A剂，正常饲养16天，再用B剂皮下注射45ug，再每隔12天注射B剂一次，共重复注射B剂4次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于3℃下静置11h，等血液充分凝聚后，在转速3000rpm下离心30min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
实施例4
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射50ug的A剂，正常饲养15天，再用B剂皮下注射60ug，再每隔14天注射B剂一次，共重复注射B剂3次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于4℃下静置12h，等血液充分凝聚后，在转速2500rpm下离心27min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
实施例5
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射70ug的A剂，正常饲养12天，再用B剂皮下注射80ug，再每隔15天注射B剂一次，共重复注射B剂4次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于5℃下静置13h，等血液充分凝聚后，在转速3500rpm下离心32min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
实施例6
将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀成B剂，然后取小白鼠皮下多点注射90ug的A剂，正常饲养13天，再用B剂皮下注射65ug，再每隔16天注射B剂一次，共重复注射B剂5次，然后从小白鼠直接心脏采血，所得血液于4℃下静置14h，等血液充分凝聚后，在转速2800rpm下离心29min，取上清液，-70℃超低温冰箱保存，即得鼠抗血清。
所述的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白采用以下方法制备：
1）从中华大蟾蜍的皮肤cDNA质粒文库筛选，克隆到缺失部分5′-端开放阅读框碱基序列的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白 cDNA；
2）在原核表达系统一一大肠肝菌中表达和生产蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白: 首先构建工程菌并诱导表达，然后高密度发酵工程菌并诱导表达，包涵体分离和洗涤后，将目的蛋白质复性、纯化。
以下通过试验进一步说明本发明的有益试验结果。
试验一：转胶蛋白-2重组蛋白的诱导表达试验。
试验所用大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞TOP10和BL21购自北京天根生化科技有限公司；PCR试剂盒、限制性核酸内切酶Nco 
、Xho 
、EcoR
购自TAKARA；DNA Ladder、T4ligase、PVDF膜、小白鼠抗His-tag抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小白鼠抗体、超敏Ecl化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所。先使用大肠杆菌感受态细胞BL21将pET-28b-TAGLN2 进行转化，在诱导重组蛋白前一天，取一单菌落接种于LB培养液(Kanamycin:50μg·mL-1)准备前培养。诱导当天，将前培养按1%的体积接种于LB培养液中(Kanamycin:50μg·mL-1)，37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0之间，取一部分菌液作为诱导前的阴性对照，在剩余的菌液加入IPTG(终浓度1mmol·L-1)诱导重组蛋白表达。每隔一小时取1mL菌液(1 h、2 h、3 h、4h)，最后将所有样品进行SDS-PAGE和免疫印迹(western blot)以检测重组蛋白的诱导表达。
免疫印迹试验：SDS-PAGE结束后，将胶浸泡在转印缓冲液中，剪下与胶同样大小的PVDF膜和滤纸，在转印缓冲液浸泡15-20min。从负极到正极按滤纸-胶-PVDF膜-滤纸的顺序组装好转膜用三明治夹心后，放在全湿转印槽中，65V恒压转印3h。封闭：将转印完毕后的PVDF膜在封闭液[50.0 g·L-1脱脂乳溶于TBST (tris-buffered saline Tween-20)]中处理2h，TBST洗涤2次。一抗处理：将小白鼠抗His-tag抗体进行稀释(1:1000)，过夜处理封闭过的膜，TBST洗涤3次。二抗处理：将加辣根过氧化物酶标记山羊抗小白鼠二抗稀释(1:1000)，室温处理2h，TBST洗涤5次。显色：将超敏Ecl化学发光试剂盒中的A、B液等量混合并覆盖于整个PVDF膜，轻微摇动处理5min，然后将尽量去除显色液的PVDF膜用保鲜膜包好，在暗室与X光胶片重叠放入暗盒中，根据亮度确定曝光时间。曝光完成后，将胶片进行显影、定影，将胶片洗涤晾干，最后进行扫描和图像剪辑。
预测pET-28b-TAGLN2的重组蛋白的分子量为21.953 kD。蟾蜍TAGLN2重组蛋白IPTG(1mmol·L-1)诱导表达的实验结果显示，诱导前的样品中在分子质量22.0 kD处无特异性条带出现，而诱导表达1 h后的样品中，有约22 kD的蛋白过量表达。使用小白鼠抗His-tag抗体western blot检测结果显示，只有22 kD处的蛋白条带才能够被该抗体识别，表明该蛋白确实是目的重组蛋白。
Claims (6)
1. 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1的比例混匀，配置成A剂；再将蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混匀，配置成B剂，备用；
2）将小白鼠皮下多点注射45-100ug的A剂，然后正常饲养12-16天，再用B剂皮下注射45-100ug，再正常饲养，以后每隔12-16天注射B剂一次，共注射B剂3-5次，备用；
3）将上述处理后小白鼠直接心脏采血，所得血液于2-6℃下静置10-15h，等血液充分凝聚后，在转速2000-4000rpm下离心25-35min，所得上清液即为鼠抗血清，置于-60-70℃超低温冰箱保存即可；
所述的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白采用以下方法制备：
1）从蟾蜍皮肤cDNA质粒文库筛选，克隆到缺失部分5′-端开放阅读框碱基序列的蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白 cDNA；
2）在原核表达系统一一大肠肝菌中表达和生产蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白: 首先构建工程菌并诱导表达，然后高密度发酵工程菌并诱导表达，包涵体分离和洗涤后，将目的蛋白质复性、纯化。
2. 如权利要求1所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠皮下A剂的注射量为50-80ug，优选60-70 ug。
3. 如权利要求1所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠注射A剂后正常饲养14-15天，再注射B剂。
4. 如权利要求1所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠皮下B剂的注射量为50-80ug，优选60-70 ug。
5. 如权利要求1所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：小白鼠注射B剂的间隔饲养时间为14-15天。
6. 如权利要求1所述的一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法，其特征在于：离心转速为2500-3000rpm，离心时间为28-31min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013103556842A CN103408662A (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013103556842A CN103408662A (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103408662A true CN103408662A (zh) | 2013-11-27 |
Family
ID=49601714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013103556842A Pending CN103408662A (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103408662A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2226396A1 (en) * | 2003-05-30 | 2010-09-08 | Genomic Health, Inc. | Gene expression markers for response to EGFR inhibitor drugs |
| CN102782500A (zh) * | 2010-03-03 | 2012-11-14 | 东丽株式会社 | 胃癌检测用的标志物和胃癌检测方法 |
-
2013
- 2013-08-15 CN CN2013103556842A patent/CN103408662A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2226396A1 (en) * | 2003-05-30 | 2010-09-08 | Genomic Health, Inc. | Gene expression markers for response to EGFR inhibitor drugs |
| CN102782500A (zh) * | 2010-03-03 | 2012-11-14 | 东丽株式会社 | 胃癌检测用的标志物和胃癌检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李会娟: "家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库》 * |
| 诸葛慧等: "日本蟾蜍TAGLN2 cDNA 的克隆与生物信息学分析", 《药学学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102636641A (zh) | 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 | |
| CN104593332A (zh) | 一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法 | |
| CN102772794A (zh) | 布鲁氏菌病a19分子标记疫苗应用及其免疫学鉴别 | |
| CN102344892A (zh) | Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途 | |
| CN103479996B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用 | |
| CN101074956A (zh) | 一种检测嗜肺军团菌抗原的免疫层析试纸及其制备方法 | |
| CN105137068A (zh) | 氟苯尼考现场检测试纸及其制备、使用方法 | |
| CN105462937A (zh) | 一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN102608332B (zh) | 一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法 | |
| CN103777015A (zh) | 一种检测红霉素的胶体金试纸条及方法 | |
| CN105541977A (zh) | 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用 | |
| CN103275203A (zh) | 中华绒螯蟹高血糖激素的基因工程制备和鉴定方法 | |
| CN106632643B (zh) | 一种中华鲟vtg蛋白抗原及抗体及制备方法和应用 | |
| CN107722121A (zh) | 蜜蜂幼虫芽孢杆菌plmp多抗及其在免疫层析纸的应用 | |
| CN103408662A (zh) | 一种抗蟾皮转胶蛋白-2重组蛋白的鼠抗血清的制备方法 | |
| CN103364546A (zh) | 一种检测呋喃唑酮代谢物的试剂盒及方法 | |
| CN101000345B (zh) | 一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法 | |
| CN103789280A (zh) | 肿瘤特异性抗原人天冬氨酸β羟化酶（HAAH）羧基末端蛋白制备工艺及其在癌症诊断中的应用 | |
| CN105950629A (zh) | 一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法 | |
| CN113754782A (zh) | 一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用 | |
| CN103524362A (zh) | 孔雀石绿人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
| Levisohn et al. | Isolation, ultrastructure and antigenicity of Mycoplasma gallisepticum membranes | |
| CN109580953B (zh) | 一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置及制备方法与用途 | |
| CN103364555A (zh) | 一种检测呋喃西林代谢物的试剂盒及方法 | |
| Guinée et al. | Serotyping of Serratia marcescens using passive haemagglutination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131127 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |