KR102526196B1 - Cotl1을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 미토콘드리아 형태 조절에 중요한 역할을 하고, 이의 발현이 억제될 경우에는 학습능력 및 기억력을 저하시키며, 발현이 억제된 경우, 이를 회복시킬시 인지능이 향상되는 바, 상기 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 인지기능장애의 진단 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

COTL1을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR DIAGNOSIS, PREVENTING OR TREATING COGNITIVE DYSFUNCTION COMPRISING COTL1}

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

2019년 통계청이 발표한 '세계와 한국의 인구 현황 및 전망'에 따르면 우리나라의 65세 이상 고령인구비중은 2045년에 37.0%로 일본(36.7%)을 넘어서는 것으로 나타났다. 이는 유엔의 201개국에 대한 세계인구전망과 통계청의 2017∼2067년 장래인구특별추계를 비교분석한 결과로, 한국의 고령인구 비중은 2019년 14.9%에서 2067년 46.5%까지 전 세계에서 가장 빠른 속도로 커지는 것으로 전망되었다.

한편, 인지기능의 능력을 상실하는 인지기능장애(cognitive dysfunction)는 치매(dementia)와 경도인지장애(mild cognitive impairment)로 나눌 수 있다. 치매(dementia)는 퇴행성 뇌질환 또는 뇌혈관계 질환 등으로 인하여 기억력, 언어능력, 판단력 및 수행능력 등의 기능이 저하됨으로써 일상생활에서 지장을 초래하는 후천적인 다발성 장애이다. 경도인지장애(mild cognitive impairment)는 주관적인 기억력 장애를 호소하거나 객관적인 검사상 이상이 발견되지만, 일상생활을 영위하는데 지장이 없고 정신기능도 정상적으로 유지되어 결코 치매라고는 할 수 없는 상태를 의미한다. 경도인지장애의 발생 이전에 이미 뇌에서는 신경세포를 사멸시키는 과정이 진행되고 있지만, 이 시기에는 아직 아무런 증상이 없고 정상 노화로 인한 기억력 장애와 구별이 어렵다.

경도인지장애는 치매보다 흔하게 나타나며, 60세 노인의 15~30%가 여기에 해당될 수 있고, 나이가 증가할수록 증가한다. 경도인지장애는 매년 15% 정도가 치매의 증상으로 발전하게 된다. 2050년에는 세계 치매 환자가 2013년 대비 3.1배인 1억 명을 넘어설 것으로 전망되고 있으며, 한국은 65세 이상 인구가 20%를 넘는 초고령화로 인해 세계에서 치매 환자가 가장 빨리 늘어나는 국가가 될 것으로 전망되어 중대한 사회적 관심사로 떠오르고 있다.

이처럼 사회가 점차 고령화되면서 노인성 치매는 21세기 인류가 해결해야 할 최대의 보건 문제로 등장하고 있는 바, 치매를 비롯한 인지기능장애의 예방 및 치료를 위한 기능성 물질 및 식품 등의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0042331호 (2014.04.07. 공개)

본 발명의 목적은 인지기능장애와 유의적으로 관련됨을 확인한 인자를 이용한 인지기능장애 진단용 바이오마커 조성물, 진단용 조성물 및 이를 포함하는 인지기능장애 진단키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인자를 측정함으로써 인지기능장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인자 또는 이의 활성화제 등을 포함하는 인지기능장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 인지기능장애 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 인지기능장애 진단용 조성물 및 이를 포함하는 인지기능장애 진단키트를 제공한다.

본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 인지기능장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 미토콘드리아 형태 조절에 중요한 역할을 하고, 이의 발현이 억제될 경우에는 학습능력 및 기억력을 저하시키는 바, 이에 따라 상기 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 인지기능장애의 진단에 유용하게 활용할 수 있다.

또한, 상기 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제를 이용하여 인지기능장애를 보다 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스 해마(hippocampus)에 COTL1 유전자를 다시 주입(injection)하여 발현을 유도한 Cotl1-GFP 이미지 및 COTL1을 염색한 이미지이다.
도 2는 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스, COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스 및 정상 마우스의 수동 회피 실험(Passive avoidance test)에서 암실(dark room)로 이동하는 시간(transfer latency)을 나타낸 것이다.
도 3은 COTL1 발현 억제 마우스, COTL1 발현 억제회복 마우스 및 정상 마우스의 수중 미로 실험(Morris water maze test)에서 4일 동안 도피대를 찾아가는 시간(escape latency)을 나타낸 것이다.
도 4는 COTL1 발현 억제 마우스, COTL1 발현 억제회복 마우스 및 정상 마우스의 수중 미로 실험에서 4일 후 도피대를 제거한 후 마우스가 도피대 근처에서 머문 시간(time spent in target quadrant)을 나타낸 것이다.
도 5는 COTL1 발현 억제 마우스, COTL1 발현 억제회복 마우스 및 정상 마우스의 Y-Maze 실험에서 자발적 변경률(spontaneous alternation)을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스, COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스 및 정상 마우스를 이용한 수동 회피 실험 등을 통해 인지능 저하와 COTL1의 관련성을 확인하고, 이의 발현이 감소할 때 인지기능이 저하되고 이의 발현이 증가될 때 인지기능이 회복될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 인지기능장애 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "COTL1"는 콕토신 유사 단백질(Coactosin-like protein)로, 이의 유전자는 액틴 세포 골격을 조절하는 액틴 결합 단백질 중 하나를 암호화하며, 이의 단백질은 F-액틴에 결합하고 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase, ALOX5)와 상호작용하여 안정화된다. "콕토신 유사 F-액틴 결합 단백질(coactosin like F-actin binding protein)", "CLP" 라고도 하며, COTL1과 실질적으로 동일한 활성을 가진 이의 생리학적 활성 단편 또는 이와의 융합 단백질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인지기능장애는 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 학습장애(learning disorder), 실인증(agnosia), 건망증(amnesia), 실어증(aphasia), 픽병(Pick disease), 경도인지장애(mild cognitive impairment) 및 빈스완거 병(Binswangers disease)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 치매, 알츠하이머성 치매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 인지기능장애 발병 또는 진행 여부, 바람직하게는 치매 발병 또는 진행 여부를 확인하는 것일 수 있다.

상기 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성이 억제될 경우, 기억력, 학습력 등의 인지기능이 저하되는 바, 상기 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성 변화를 통해 인지기능장애 여부를 진단할 수 있다.

본 명세서에서, "바이오마커"란, 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 이의 변화 여부 등을 확인할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있고, 이를 이용하여 본 발명과 같이 인지기능장애를 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오마커는 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내고, 이의 발현량의 변화가 유의성 있는 결과를 보이므로 신뢰도가 높은 마커로 볼 수 있으며, 이에 따라 예측된 결과는 타당하게 신뢰될 수 있다.

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 인지기능장애 진단용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 COTL1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 COTL1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA polymerase 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머는 상기 유전자에 특이적인 프라이머로, 통상적으로 7 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서, "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 형성될 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서, "항체(antibody)"는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 "펩타이드(peptide)"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있고, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있어, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 인지기능장애는 치매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명은 상기의 인지기능장애 진단용 조성물을 포함하는 인지기능장애 진단키트를 제공한다.

상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 키트는 인지기능장애 진단을 위한, 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치를 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등을 포함할 수 있고, 상기 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD(o-phenylene diamine), 또는 TMB(tetramethyl benzidine)가 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 인지기능장애는 치매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 인지기능장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서, "피검체"란 인지기능장애 발병 여부를 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체로, 상기 피검체는 인지기능장애가 발병할 수 있는 동물이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 구체적으로 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 상기 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 정상 대조군과 차이나는 혈액, 혈청, 혈청 유래 엑소좀, 조직, 소변 및 타액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준이 정상 대조군의 발현수준보다 낮을 경우, 인지기능장애로 진단할 수 있다.

상기 유전자의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역분석(radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(complement fixation assay) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질을 처리한 시료에서 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 처리한 시료의 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 인지기능장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 인지기능장애 치료제 후보 물질의 존재 또는 부존재 하에서 상기 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로, COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 활성화제, 인지기능장애 개선 또는 치료제 등을 스크리닝 하는데 유용하게 사용될 수 있다.

즉, 상기 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준을 증가시키는 물질은 인지기능장애 치료제로서 선택될 수 있다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 발현촉진제 또는 활성화제는 공지된 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현촉진제 또는 활성화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 직접적 또는 간접적으로 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다

상기 COTL1 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성을 증진시키면, 인지기능장애가 예방 또는 치료될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제의 활성 또는 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 인지기능장애가 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 인지기능장애의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 인지기능장애의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 COTL1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현촉진제 또는 활성화제의 유효 용량은 인지기능장애 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 인지기능장애 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 인지능 개선 동물실험

스코폴라민(scopolamine)은 학습능력 및 기억력을 저하시키는 물질로 기억력 및 인지능력 개선 효능시험에 폭넓게 사용되고 있다. 마우스를 총 3군 [COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스, COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스 및 정상 마우스]으로 분리하여 동물실험을 실시하였으며, 스코폴라민을 투여하지 않은 정상 대조군을 제외한 모든 군에 0.9% 생리식염수에 0.25 mg/mL 농도로 용해한 스코폴라민(Lot No.: SLBP0022V, Sigma Aldrich, MO, U.S.A.)을 투여하여 기억력 감소를 유발하였다.

<실시예 2> 인지능 개선 수동 회피 실험

수동 회피 시험(Passive avoidance test)은 명실(white room)과 암실(dark room)로 구성된 조건화 상자에서 이루어졌다. white room에 시험동물을 위치시키고 등을 켜면 어두운 곳을 좋아하는 시험동물은 dark room으로 이동하게 되며, dark room은 전기 자극을 줄 수 있도록 설계되어 있다.

간략하게, 시험동물에 스코폴라민을 투여하고 white room에 위치시킨 후, 등을 켜서 dark room으로 이동하도록 한 후, 전기 자극을 주어 dark room의 전기 자극을 학습을 통해 기억나게 하였다. 다음 날 시험동물을 white room에 위치시키고 등을 켠 후 dark room으로 이동하는 시간(transfer latency time)을 측정하여 전날의 전기 자극이 학습 및 기억이 되었는지를 평가하였다.

구체적으로, 조건화 상자(수동 회피 시험상자)의 불 꺼진 white room에 시험동물을 위치시키고, 60초간 적응시킨 후 white room의 LED 등을 켬과 동시에 길로틴 도어(guillotine door)를 열어 주었다. 180초 동안 dark room 탐색과 적응시간을 주었다.

다음 날 위 과정을 시행하였으며, 한 번 더 반복하여 불이 켜지고 dark room에 들어가는 시간이 30초 내외가 되도록 적응시켰다. 다음 날 학습 1시간 전에 0.9% 생리식염수에 0.25 mg/mL로 용해한 스코폴라민을 4 ml/kg 농도로 복강투여 하였다. 스코폴라민 투여 30분 후 불 꺼진 white room에 시험동물을 위치시키고, 10초 후 LED 등을 켬과 동시에 guillotine door를 열어주었으며, 시험동물이 dark room으로 들어가면 guillotine door를 닫고 0.5 mA로 3초간 전기 자극을 주었다.

검사 시행은 학습 시행 24시간 후에 실시하였으며, 시험동물이 dark room에 들어가는데 걸리는 시간을 타이머로 측정하였다. 300초 동안 dark room에 들어가지 않으면 시험을 종료하였다.

결과적으로 시험동물이 dark room에 들어가는데 걸리는 시간은 정상 마우스 및 COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스 보다 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스가 더 빠른 것은 확인한 바 (도 2), 이를 통해 COTL1은 기억력 장애를 유발시킬 수 있는 유전자로 판단하였다.

<실시예 3> 인지능 개선 수동 미로 실험

수중 미로 시험(Morris water maze test)은 수중 미로를 사분원으로 나누어 그 중 한 곳에 도피대를 숨겨 놓고, 도피대가 있는 방향에 공간 단서를 부착하여 시험동물이 출발 위치와 상관없이 공간 단서를 인지하여 도피대를 찾아가는 능력을 평가하는 방법이다. 시험동물에 스코폴라민을 투여하여 학습능력 및 기억력 저하를 유발시킨 후 수중 미로 시험을 실시하여 인지능력 개선에 대한 COTL1의 유전자 발현을 평가하였다. 수중 미로 시험은 SMART video tracking system(Smart 3.0, Panlab Harvard Apparatus, Spain)을 통해 실시하였다.

구체적으로, 수중 미로를 사분원으로 나누고 사분원의 남서쪽 중앙에 도피대를 세운 후 수면 1 cm 아래가 잠기도록 물을 채우고, 색소(Kids paint(black), Kidsmomart, Korea)를 풀어 도피대가 보이지 않도록 하였다. 도피대를 두는 위치에 공간을 인지할 수 있는 도형 모양의 공간 단서를 수중 미로 안쪽 벽에 부착하였다. 시험동물에 스코폴라민을 1 mg/kg 농도로 복강투여 (3 mL, 23 G, Doowon meditec Co., Korea) 하고, 30분 동안 home cage에 방치한 후 수중 미로 시험을 실시하였다.

시험동물을 도피대 위에서 10초간 머무르게 하고 도피대를 찾아갈 수 있도록 학습 시행을 4회 실시하였으며, 학습 때 마다 다른 방향에서 출발시키고, 학습 시행 마다 시험동물이 도피대를 찾아가는 시간(escape latency time)을 기록하였으며, 이와 같은 과정을 4일간 반복 수행하였다. 훈련은 하루에 4번 연속적으로 수행하였고 도피대에 도달하는 시간을 측정하여 평균값을 산출하였다.

결과적으로 정상 마우스 및 COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스와 비교하였을 때 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스가 수중 미로에서 도피대에 도달하는 시간이 길었으며 이로부터 인지능 장애가 있음을 확인할 수 있었다 (도 3).

또한, 실험 5일째 도피대를 제거한 후 도피대 구역에 도달한 횟수(Entries), 도피대 구역에 머무는 시간(Time spent in target quadrant)을 측정한 결과, 정상 마우스 및 COTL1 발현 억제회복(COTL1 Rescue) 마우스 보다 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스에서 수치가 낮게 관찰되었다 (도 4).

<실시예 4> 인지능 개선 Y-maze 실험

Y-Maze는 설치류가 새로운 환경을 탐색하려는 의지를 측정하기 위한 행동 시험이다. 설치류는 일반적으로 이전에 방문했던 곳으로 돌아가지 않고 새로운 미로의 팔을 탐색하는 것을 선호하므로, Y-maze는 공간 작업 기억(spatial working memory)을 측정하는데 많이 사용되는 방법이다. 본 실시예에서는 스코폴라민을 시험동물에 투여하여 일시적인 기억력 손상을 유발한 후 Y-maze에서 새로운 팔을 찾아가는 기억력 평가를 실시하였다.

서로 120°각도를 이루는 3개의 불투명한 플라스틱 팔이 있는 Y 형 미로에서 시험동물은 3개의 팔을 자유롭게 탐색한다. 시험동물이 공간을 인지한다면 3개의 팔을 연속적으로 순차 방문하게 되고, 인지능력이 떨어지면 순차 방문이 이루어지지 않는다. 따라서 인지능력이 좋을수록 순차적으로 팔에 방문한 횟수가 증가된다.

자발적 변경률(spontaneous alternation)을 계산하기 위하여 8분간 시험동물이 방문한 팔의 이름을 기록하였다. 시험동물이 네 발이 모두 팔 안으로 진입하였을 때 해당 팔에 방문한 것으로 하였다. 측정은 SMART video tracking system(Smart 3.0, Panlab Harvard Apparatus, Spain)으로 실시하였다.

세 개의 서로 다른 팔에 차례로 들어간 경우 1점씩 부여하여, spontaneous alternation은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 식 1에 의해 계산하였다.

<식 1>

alternation을 계산할 수 없는 경우 (가지에 4회 이하로 들어간 경우), 데이터 산출 및 통계분석에서 제외하였다.

그 결과, spontaneous alternation은 정상 마우스 및 COTL1 발현 억제회복 마우스보다 COTL1 발현 억제 마우스에서 통계학적으로 유의하게 감소되는 것으로 나타났다 (도 5).

상기 결과로부터 COTL1이 인지능 장애를 유발시킬 수 있는 유전자로 판단되며, COTL1 발현이 억제된 마우스에 COTL1 유전자를 다시 주입하여 이의 발현을 유도한 경우, 복구가 되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (13)

1. (1) COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스에 후보물질을 처리하는 단계;
   (2) 상기 후보물질을 처리한 전과 후의 COTL1 발현 억제(COTL1 knock-out) 마우스에서 COTL1의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
   (3) 후보물질을 처리한 전과 후의 COTL1의 발현이 증가한 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 인지기능장애 치료제 스크리닝 방법.
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