KR20240018003A - 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HSPB8의 K141N 또는 K141T 돌연변이에 의한 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델에 관한 것으로, 본 발명의 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현하는 동물 모델에서 샤르코-마리-투스 질환의 증상인 운동 결함, 미토콘드리아 기능 장애 및 마이토파지(mitophagy) 수준 감소가 나타나, HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 변이에 의해 샤르코-마리-투스 질환이 발병되는 것을 확인하였으므로, K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현하는 동물 모델을 샤르코-마리-투스 질환의 동물 모델로 이용할 수 있고, 상기 샤르코-마리-투스 질환의 증상이 PINK1 또는 Parkin의 발현, 및 PINK1 활성화에 의해 현저히 감소되었으므로, 이를 샤르코-마리-투스 질환의 치료 용도에 활용할 수 있다.

Description

샤르코-마리-투스 질환 동물 모델{Charcot-Marie-Tooth disease model animal}
본 발명은 HSPB8의 K141N 또는 K141T 돌연변이에 의한 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델에 관한 것이다.
유전성 말초 신경병은 크게 유전운동감각신경병(hereditary motor and sensory neuropathy; HMSN), 유전운동신경병(herediatary motor neuropathy; HMN) 및 유전감각신경병(herediatary sensory neuropathy; HSN)의 3가지로 구분된다. 이 중 유전운동감각신경병이 대부분을 차지하며, 이는 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-MarieTooth disease; CMT)으로 더 잘 알려져 있다. 샤르코-마리-투스 질환은 1886년에 프랑스인 샤르코(Charcot)와 마리(Marie), 그리고 영국인 투스(Tooth)에 의해 처음으로 알려졌고, 이들의 이름 첫 글자를 따서 CMT 질환이라고 흔히 불리고 있다. 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth; CMT) 질환 또는 유전운동감각신경병(Hereditary motor and sensory neuropathy; HMSN)은 원위유전운동신경병(distal Hereditary Motor Neuropathy; dHMN), 유전감각신경병(Hereditary Sensory Neuropathy; HSN) 및 압박마비유전신경병(Hereditary Neuropathy with a liability to pressure palsy; HNPP)과 같이 임상적으로 이질적 질환(heterogeneous disease)이다. 샤르코-마리-투스 질환은 신경전도검사상 운동신경과 감각신경에 이상이 있는 모든 유전질환을 총칭하며, CMT의 발생빈도는 2500 명당 한 명으로 유전되는 희귀질환 가운데 높은 빈도를 보인다. CMT 환자들은 발과 손의 근육들이 점점 위축되어 힘이 약해지며, 발 모양과 손 모양이 변형되거나 안면 마비 및 청력장애 등이 발생한다. 발병은 주로 10세 전후에 일어나나 드물게는 30 대 이후에도 일어난다. 환자들의 증상은 유전자 돌연변이의 종류에 따라 거의 정상에 가까운 가벼운 상태에서부터 아주 심하여 보행에 도움이 필요하거나 또는 휠체어에 의존해야 하는 정도까지 다양하다. 과거에는 하지 원위부의 근육 위축으로 인하여 샴페인 병을 거꾸로 세운 듯한 다리 모양을 하는 질환으로 비교적 단순하게 인식되어 왔으나, 현재는 단일질환이라기보다는 하나의 질환군(syndrome)으로 인식되고 있다. 최근에는 CMT의 새로운 발병 기전들이 많이 밝혀져서 병태 생리학적 연구뿐만 아니라 복잡한 임상형과 유전형의 분류에 큰 도움을 주었다. 지난 연구기간 동안 유전자 클로닝 기법으로 40개 이상의 유전운동감각신경병에 대한 유전자좌(locus)가 발견되었으며, 20개 이상의 원인 유전자가 밝혀졌다. 그러나 아직도 많은 유전운동감각신경병 환자들에서 이미 알려진 유전자좌와 연관성이 없음을 보여 앞으로도 50개 이상의 발병원인 유전자들이 더 있을 것으로 보고되고 있다. CMT는 유전되는 양상에 따라 상염색체 우성 및 열성유전을 하는 수초결손형(CMT1), 축삭형(CMT2) 및 X-염색체 연관유전을 하는 CMTX형으로 나누어진다. 그리고 같은 CMT 1형인 경우에는 유전자 변이 등이 보고된 순서에 따라 1A, 1B, 1C 등의 차례로 명명되었다. 현재까지 CMT의 발병 원인으로 50 여개 이상의 원인 유전자가 보고되었으며, 원인 유전자의 단일 유전자 돌연변이(single gene mutation)에 의해 발병하여, 증상의 정도는 차이가 있으나 멘델의 법칙을 따라 유전된다. 따라서, 다양한 신경조직을 구성하는 요소들이 점차적으로 그 모습을 드러내고 있는 것으로 유전성 근육병의 종류가 많은 것처럼 유전성 신경병의 종류도 상당히 다양할 것으로 추정된다. 또한, 유전적 결함 및 발병이 직접적으로 연관되므로, CMT 원인 유전자 진단의 결과는 단순한 경향성 또는 발병의 가능성 제시가 아닌 확진의 의미를 가지므로, 유전자 진단 시스템을 활용하기에 매우 적절하다.
CMT의 유전적 진단은 주요 원인 유전자의 직접 시퀀싱에 의존적이나, 이는 어려운 과정에도 불구하고 낮은 분리 효율을 갖는다. 차세대 시퀀싱(Next-generation Sequenceing; NGS) 기술에 기반한 엑손시퀀싱(Whole Exome Sequencing; WES)의 등장으로 다양한 질환, 특히 CMT와 같은 이질적 질환의 유전적 연구가 확대 및 가속화되고 있다. 또한, 현재 유전운동감각신경병에서 가장 흔한 유형인 CMT1A에 대한 합리적이면서 잠재적인 약물치료법으로 오나프리스톤(onapriston), 아스코르빈산(ascorbic acid) 및 NT-3(neurotrophin-3) 등이 보고된 바 있다. CMT 치료를 위한 약물들 가운데 프로게스테론 수용체의 길항제인 오나프리스톤(onapristone)을 투여한 형질전환 마우스에서 Pmp22 mRNA의 과발현을 감소시키고 부작용이 없이 유전운동감각신경병의 표현형을 호전시킨 보고가 있었고, 말초신경에서 수초형성에 필수적인 물질인 아스코르빈산(ascorbic acid)은 CMT1A 형질전환 마우스에서 수초 재형성 및 유전운동감각신경병의 표현형을 개선하였고, 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3)은 CMT1A 환자군에서 수초화된 신경섬유를 증가시켜 감각 증상 개선효과를 나타냈다고 보고되었다. 따라서, CMT의 정확한 유전적 진단에 따라 발병의 억제 및 유전적 원인에 적합한 맞춤 치료가 가능하게 되었으나, 아직까지 효율적인 유전성 신경 질환의 진단 방법 개발은 미흡한 실정이다. 유전적으로 매우 이질적인 특성을 가진 운동감각신경병의 맞춤 치료를 위하여 먼저 정확한 유전적 진단법이 확립이 요구되고 있다.
한편, 신약과 새로운 치료기술의 개발에 있어서 동물모델을 이용한 실험은 인체를 대상으로한 연구에 선행되어야할 필수불가결한 단계이다. 그러나 인체질환의 종류가 수없이 많음에 비하여 이를 모방하는 동물모델의 종류는 극히 적으며, 이것은 신약과 새로운 치료기술의 개발에 있어서 커다란 제약요소로서 작용하고 있다. 질환 동물의 제작은 사용되는 방법에 따라 특징을 달리하는 다양한 종류가 만들어지며, 실험의 목적에 따라 각기 그 효용이 다르다. 현재까지 알려진 질환 모델동물 제작법을 크게 3가지로 구분해보면 전통적으로 자연발생적인 돌연변이종을 질환 모델로 개발하는 방법이 있었고, 후에 화학물질 투여나 인공세포주 이식 등 실험적 질환유발법이 개발되어 통용되어 왔으며, 분자유전학적 방법이 비약적으로 발전된 최근에는 유전자 도입에 의한 형질전환방법이 강력한 기술로써 각광을 받고 있다. 신약과 새로운 치료법 연구개발의 다양한 욕구를 충족시키기 위해서는 여러 가지 접근법에 의한 질환모델 제작법을 확보하고 이들 간의 협력을 통한 효과적인 모델동물 제작시스템을 수립하는 것이 매우 중요하다
본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환의 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 PINK1 또는 Parkin 단백질, 이를 코딩하는 핵산분자, 또는 이의 활성화제를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료에서 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현하는 동물 모델에서 샤르코-마리-투스 질환의 증상인 운동 결함, 미토콘드리아 기능 장애 및 마이토파지(mitophagy) 수준 감소가 나타나, HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 변이에 의해 샤르코-마리-투스 질환이 발병되는 것을 확인하였으므로, K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현하는 동물 모델을 샤르코-마리-투스 질환의 동물 모델로 이용할 수 있고, 상기 샤르코-마리-투스 질환의 증상이 PINK1 또는 Parkin의 발현, 및 PINK1 활성화에 의해 현저히 감소되었으므로, 이를 샤르코-마리-투스 질환의 치료 용도에 활용할 수 있다.
도 1은 형질전환 초파리들의 HSPB8 발현 및 수명 분석 결과를 나타낸 도이다:
A: 대조군 초파리 elav (elav-GAL4), 야생형 HSPB8 발현 초파리 (elav HSPB8 WT ), HSPB8K141T 발현 초파리 (elav HSPB8 K141T ) 및 HSPB8K141E 발현 초파리 (elav HSPB8 K141E )의 면역 블롯 분석 결과;
B: 5일령 초파리의 현미경 사진;
C: 수컷 초파리의 수명 곡선; 및
D: 암컷 초파리의 수명 곡선.
도 2는 HSPB8 돌연변이에 의해 감각 이상(sensory defects) 발생을 확인한 도이다:
A: ppk-GAL4 드라이버로 형질전환된 L3 유충 (ppk)의 열 통각 분석 결과; 및
B: 40℃에서 ppk 발현 유충, HSPB8WT 발현 유충 (ppk HSPB8 WT ), HSPB8 K141T 발현 유충 (ppk HSPB8 K141T ) 및 HSPB8 K141E 발현 유충 (ppk HSPB8 K141E )의 열 통각에 대한 반응 지연 분석 결과.
도 3은 HSPB8 돌연변이에 의한 운동 능력 변화를 확인한 도이다:
elav: 대조군 초파리;
elav HSPB8 WT : 야생형 HSPB8 발현 초파리;
elav HSPB8 K141T : HSPB8 K141T 발현 초파리;
elav HSPB8 K141E : HSPB8 K141E 발현 초파리;
A 및 B: 5일령 초파리 (A) 및 15일령 초파리 (B)의 평균 걷는 속도; 및
C 및 D: 5일령 초파리 (C) 및 15일령 초파리 (D)의 이동 궤적.
도 4는 돌연변이에 의한 미토콘드리아 기능 장애 발생 및 PINK1 및 parkin의 도입에 의한 미토콘드리아 기능 장애 회복을 확인한 도이다:
elav HSPB8 WT : 야생형 HSPB8 발현 초파리
elav HSPB8 WT : 야생형 HSPB8 발현 초파리;
elav HSPB8 K141T : HSPB8 K141T 발현 초파리;
elav HSPB8 K141E : HSPB8 K141E 발현 초파리;
elav HSPB8 K141T PINK1: HSPB8 K141T 및 PINK1 발현 초파리;
elav HSPB8 K141E PINK1: HSPB8 K141E 및 PINK1 발현 초파리;
elav HSPB8 K141T Parkin: HSPB8 K141T 및 Parkin 발현 초파리;
elav HSPB8 K141E Parkin: HSPB8 K141E 및 Parkin 발현 초파리;
A: 초파리 유충 VNC에서 측정된 미토콘드리아 막 전위 (ΔΨ);
B: 초파리 유충 VNC의 mt-Keima 형광 이미지;
C: 초파리 유충 VNC의 마이토파지의 정량 분석;
D: 15일령 초파리의 등반 능력 분석;
E: 15일령 초파리의 평균 걷는 속도; 및
F: 암컷 초파리의 이동 궤적.
도 5는 운동 신경 특이적 HSPB8 돌연변이 발현에 의한 운동 결함을 확인한 도이다:
D42: 운동 신경 특이적 D42-GAL4 발현 초파리;
D42 HSPB8 WT : 운동 신경 특이적 HSPB8WT 발현 초파리;
D42 HSPB8 K141T : 운동 신경 특이적 HSPB8 K141T 발현 초파리;
D42 HSPB8 K141E : 운동 신경 특이적 HSPB8 K141E 발현 초파리;
A: 5일령 초파리의 평균 걷는 속도;
B: 15일령 초파리의 평균 걷는 속도;
C: 5일령 초파리의 이동 궤적; 및
D: 15일령 초파리의 이동 궤적.
도 6은 KR 투여 (1 및 5 mM)에 의한 PINK1 활성화에 따른 15일령 수컷 형질전환 초파리 (elav HSPB8 WT , elav HSPB8 K141T 및 elav HSPB8 K141E )의 운동 능력 회복을 확인한 도이다:
A: 초파리의 평균 걷는 속도;
B: 이동 궤적; 및
C: 등반 능력 분석.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 명세서에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 HSPB8(small heat shock protein B8) 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출하는 것은 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질 또는 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 검출하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 HSPB8 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 아비머(avidity multimer), 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함할 수 있으며, 상기 단백질 돌연변이 검출은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체일 수 있으며, 면역학적 활성을 가진 단편은 상기 항체의 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편 또는 디아바디(diabody)일 수 있다.
일 구현예에서, 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 HSPB8 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 특이적으로 인식하는 프라미어쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 HSPB8 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 검출은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩, multiplex PCR 또는 ddPCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 존재 여부를 확인하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전자", "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 DNA 분자, RNA 분자 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 비제한적으로 DNA 분자, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 및 RNA 분자, 예를 들어 가이드 RNA, 전령 RNA 또는 합성 RNA를 포함한다. 더욱이, 본 명세서에 사용되는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 AR 또는 AR-V7 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 상기 HSPB8의 아미노산 치환 돌연변이에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 또는 Parkin 단백질, 이의 활성화제, 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 샤르코-마리-투스 질환은 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이에 의한 샤르코-마리-투스 질환일 수 있다.
일 구현예에서, PINK1의 활성화제는 키네틴 리보사이드(kinetin riboside, KR) (N6-furfuryl adenine riboside)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이에 의한 운동 결함, 미토콘드리아 기능 장애 또는 마이토파지(mitophagy) 수준 감소 증상을 개선시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델은 신경세포, 운동 신경세포 또는 다중-수지상 감각 신경세포에서 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델은 초파리(Drosophila)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델에서 신경세포(뉴런) 특이적 프로모터 elav, 운동 신경세포 특이적 프로모터 D42 또는 다중-수지상 감각 신경 세포(multi-dendritic sensory neurons) 특이적 프로모터 ppk에 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 작동가능하게 연결되어 신경세포, 운동세포 또는 다중-수지상 감각 신경 세포 특이적으로 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질이 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "작동가능하게 연결된"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 프로모터는 다양한 성질 및 기원일 수 있고 다양한 성질을 가진다. 이는 사용된 프로모터의 선택이 특히 해당 유전자에 좌우되기 때문이다. 이에 따라, 프로모터는 예를 들면 강하거나 약하고, 편재되거나 조직/세포에 특이적이거나, 생리적 또는 병리생리적 상태에 특이적인 프로모터에서 유도될 수 있다(활성은 세포 분화 상태 또는 세포 사이클의 특정 단계에 좌우됨). 프로모터는 진핵생물, 원핵생물, 바이러스, 동물, 식물, 인공, 인간 등의 기원일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 코딩하는 핵산 및 이에 작동 가능하게 연결된 신경세포 특이적 프로모터를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델 제작용 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 신경세포 특이적 프로모터는 신경세포(뉴런) 특이적 프로모터 elav, 운동 신경세포 특이적 프로모터 D42 또는 다중-수지상 감각 신경 세포 특이적 프로모터 ppk일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료에서 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 대상으로부터 분리된 시료에서 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이가 검출된 경우, 상기 대상이 샤르코-마리-투스 질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 피검 화합물 또는 조성물을 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 세포주 또는 동물 모델에 처리하고; 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 세포주 또는 동물 모델에서 미토콘드리아 기능 장애 정도를 측정하며; 및 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 미토콘드리아 기능 장애가 개선된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 피검 화합물 또는 조성물을 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 세포주 또는 동물 모델에 처리하고; 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 세포주 또는 동물 모델에서 PINK1 또는 Parkin의 발현, 또는 이의 활성을 확인하며; 및 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 PINK1 또는 Parkin의 발현, 또는 이의 활성이 증가한 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HSPB8 돌연변이 동물 모델 제작 및 확인
1-1. HSPB8 K141N/K141T 돌연변이 모델 제작
HSPB8(small heat shock protein B8) (HSP22라고도 불림) 유전자의 K141N 돌연변이 동물 모델 및 K141T 돌연변이 동물 모델을 제작하기 위해, 신경(뉴런) 특이적 GAL4 드라이버인 elav-GAL4, 운동 신경세포 특이적 GAL4 드라이버인 D42-GAL4 및 다중-수지상 감각 신경(multi-dendritic sensory neurons) 특이적 GAL4 드라이버인 ppk-GAL4를 각각 이용하여 초파리 신경에서 야생형 인간 HSPB8(HSPB8WT), K141T 돌연변이 HSPB8(HSPB8K141T) 및 K141E 돌연변이 HSPB8(HSPB8K141E)의 UAS 전이유전자(transgene)를 특이적으로 발현하는 초파리 모델들을 제작하였다. 구체적으로, 하기의 프라이머쌍을 이용하여 QuikChange™site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies)로 인간 HSPB8의 cDNA에 K141T 및 K141E 돌연변이를 각각 유도하였다: HSPB8 K141T 정방향 프라이머: 5'-ctg cag gaa gct gga ttt tcg ttg tga agt tct tag aaa ca-3' 및 K141T 역방향 프라이머: 5'-tgt ttc taa gaa ctt cac aac gaa aat cca gct tcc tgc ag), 및 HSPB8 K141E 정방향 프라이머: 5'-gaa gct gga ttt tct ctg tga agt tct tag aaa caa tgc cac c-3' 및 K141E 역방향 프라이머: 5'-ggt ggc att gtt tct aag aac ttc aca gag aaa atc cag ctt c-3'. 그 후, 야생형 HSPB8 cDNAs 및 상기 돌연변이 HSPB8 cDNAs를 각각 pACU2 벡터에 삽입하고 yw;PBac y[+]-attP-3B VK00001 배아에 미세주입하였다. elav-GAL4, ppk-GAL4 및 D42-GAL4 계통(lines)은 Bloomington Stock Center에서 구매하였다. 또한, UAS-PINK1 및 UAS-Parkin을 발현시킨 초파리 계통도 Park et al., 2006에 기재된 방법으로 제작하였다. 제작한 초파리 계통들의 유전형은 하기와 같다: elav (elav-GAL4/+); elav HSPB8 WT (elav-GAL4/+; UAS-HSPB8 WT /+); elav HSPB K141T (elav-GAL4/+; UAS-HSPB8 K141T /+); elav HSPB K141E (elav-GAL4/+;; UAS-HSPB8 K141E /+); ppk (ppk-GAL4/+); ppk HSPB8 WT (ppk-GAL4/UAS-HSPB8 WT ); ppk HSPB K141T (ppk-GAL4/UAS-HSPB8 K141T ); ppk HSPB K141E (ppk-GAL4/UAS-HSPB8 K141E ); D42 (D42-GAL4/+); D42 HSPB8 WT (UAS-HSPB8 WT /+; D42-GAL4/+); D42 HSPB K141T (UAS- HSPB K141T /+; D42-GAL4/+); D42 HSPB K141E (UAS-HSPB8 K141E /+; D42-GAL4/+); elav HSPB K141T PINK1 (elav-GAL4/+; UAS-HSPB8 K141T /UAS-PINK1); elav HSPB K141T Parkin (elav-GAL4/+; UAS-HSPB8 K141T /UAS-Parkin); elav HSPB K141E PINK1 (elav-GAL4/+; UAS-HSPB8 K141E /UAS-PINK1); elav HSPB K141E Parkin (elav-GAL4/+; 및 UAS-HSPB8 K141E /UAS-Parkin).
1-2. 돌연변이 모델 검증
상기에서 제작한 형질전환 초파리들의 HSPB8 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하고, 이들의 수명 분석을 수행하였다. 구체적으로, HSPB8의 발현을 확인하기 위해, 20개의 10일령 수컷 초파리 머리를 파쇄 버퍼로 파쇄한 후, 파쇄물을 원심분리하고, SDS 샘플 버퍼를 첨가하여 가열하였다. 그 후 샘플들을 SDS-PAGE젤에 전기영동하고 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 블로킹 용액과 30분 인큐베이션한 뒤 항-HSPB8 항체 (1:1,000, Cell Signaling Technology, #95357) 또는 항-베타-액틴 항체 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, SC-1616)를 일차 항체로 이용하여 Kang et al., 2020에 기재된 바와 같이 반응시키고 ImageQuant LAS 4000 system (GE Healthcare Life Sciences)을 이용하여 멤브레인에 결합된 항체를 검출하였다. 또한, 수명 분석을 위해, 90마리의 초파리를 3개의 군 (각 군의 n = 30)으로 나눠 각각 바이알로 옮긴 뒤, 25℃에서 3일 또는 4일마다 생존 점수를 매겼다. 그 후, Online Application Survival Analysis 2 Lifespan Assays (http://sbi.postech.ac.kr/oasis2)를 이용하여 각 유전형이 개체의 수명에 미치는 영향을 확인하기 위해 누적 생존 데이터에 대해 Kaplan-Meier 추정 및 로그-순위 검정법(log-rank test)을 수행하였다.
그 결과, 형질전환 초파리들이 성공적으로 성체로 발달하였으며, 이들 간 HSPB8의 단백질 발현 수준은 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다 (도 1A 및 B). 또한, 수명 분석 결과, 야생형 및 HSPB8 돌연변이의 발현이 수명의 부분적 감소를 야기했으나, 15일 이내에 생존율의 유의한 감소는 관찰되지 않았다 (도 1C 및 D).
실시예 2. 돌연변이에 의한 감각 증상(sensory symptoms) 확인
HSPB8 돌연변이에 의해 감각 이상(sensory defects)이 발생하는지 확인하기 위해, 초파리 유충을 이용하여 열 통각 분석(thermal nociception assay)을 수행하였다. 구체적으로, ppk-GAL4를 이용하여 다중-수지상 감각 신경(multi-dendritic sensory neurons)에서 HSPB8 전이유전자를 발현시킨 HSPB8 WT 초파리, HSPB8 K141N 돌연변이 초파리 및 HSPB8 K141T 돌연변이 초파리의 각 L3 유충(larvae) (부화 후 [AEL] 120h) (최소 50마리)를 증류수로 헹군 뒤 패트리 디쉬에 놓고 10초 동안 순응시키고 현미경으로 관찰하면서 각 유충의 복부 A4-A5 세그먼트를 마이크로프로세서로 온도가 조절되는 맞춤 제작된 0.6-mm 너비의 열 프로브로 터치하였다. 회피적인 나선형 롤링(corkscrewlike rolling) 반응을 유발하는데 걸린 시간을 통증 평가(withdrawal latency)로 측정하였고, 컷오프 값인 20초 이내에 롤링 반응을 보이지 않은 유충은 반응이 없는 것으로 간주하였다. 그 결과, 모든 유충은 36℃의 열 프로브에는 반응을 보이지 않은 반면, 46℃의 열 프로브에는 빠른 롤링 반응을 보였다 (도 2A). 이에, 열 프로브의 온도를 40℃로 선택한 뒤, ppk 발현 유충, HSPB8WT 발현 유충 (ppk HSPB8 WT ), HSPB8 K141T 발현 유충 (ppk HSPB8 K141T ) 및 HSPB8 K141E 발현 유충 (ppk HSPB8 K141E )에서 각각 열 통각 분석을 수행하고 반응 지연을 분석하였다. 그 결과, 각 유충의 군에서 유의적인 차이가 발견되지 않아, HSPB8 전이 유전자가 초파리 열 통각 모델에서 감각 이상을 유도할 수 없음을 확인하였다 (도 2B).
실시예 3. 돌연변이에 의한 운동 능력 감소 확인
3-1. 행동 분석
HSPB8의 돌연변이에 따른 운동 활동 변화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 제작한 형질전환 초파리 계통 HSPB8 WT , HSPB8 K141T 및 HSPB8 K141E (elav, elav HSPB8 WT , elav HSPB8 K141T 및 elav HSPB8 K141E )의 행동을 각각 디지털 비디오 카메라로 기록하고 걷는 궤적(trajectory) 및 속도를 Ctrax 및 Matlab.로 계산하였다. 구체적으로, HSPB8 WT (elav HSPB8 WT ), HSPB8 K141T (elav HSPB8 K141T ) 또는 HSPB8 K141E (elav HSPB8 K141E )를 발현하는 5일령의 성충 수컷 형질전환 초파리를 각각 카메라가 설치된 675 mm×440 mm×410 mm 크기의 단열 상자에 넣어 25℃에서 30분 동안 적응시키고, 높이 2 mm 및 직경 60 mm의 투명하고 둥근 공간에서의 자유로운 움직임을 30.06 fps(초당 프레임)로 기록했다. 기록된 비디오는 Ctrax를 이용하여 MATLAB 파일로 변환하고 평균 속도 및 궤적 그래프를 얻기 위해 behavioral microarray toolbox를 사용하였다.
그 결과, HSPB8 WT 을 발현하는 초파리군은 elav-GAL4 드라이버만을 발현하는 대조군 초파리와 움직임에서 유의한 차이를 나타내지 않았으나, HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 를 발현하는 초파리군은 걸음 속도 및 궤적에서 명백한 결함을 나타냈다 (도 3A 및 B). 이와 같은 돌연변이 특이적 운동 결함은 5일령 암컷 초파리에게서도 나타났다. 또한, 15일령 초파리의 운동 능력을 측정했을 때, HSPB8 WT 초파리군은 지속적으로 운동 능력에 유의미한 변화가 없는 것으로 나타났으나, HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 초파리군은 5일령 초파리일때에 비해 심각한 운동 능력 감소를 나타냈다 (도 3C 및 D).
3-2. 등반 분석
알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 다양한 신경퇴행성질환의 초파리 모델에서 운동 결함을 확인하는데 유용한 것으로 입증된 등반 능력을 등반 분석(climbing assay)도 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 HSPB8 WT , HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 를 발현하는 초파리군들 (n=15)를 climbing ability test vials로 옮긴 후 상온에서 1h 동안 환경 순응시키고, 바이알을 두드려 파리들을 바닥으로 떨어트린 뒤 등반하는 파리의 수를 10초 동안 계수하였다. 각 군에 대해 10번 시도한 뒤 등반 점수 (총 파리 수에 대한 등반 파리수의 백분율)을 계산하였다.
그 결과, HSPB8 WT 의 발현은 등반 능력에 유의미한 차이를 유도하지 않았으나, HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 의 발현은 5일령 수컷 초파리 및 암컷 초파리 모두에게 현저한 운동 감소를 유도하였다 (도 4A 및 B). 이와 같은 등반능 손실은 HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 를 발현하는 15일령 초파리에서도 일관되게 관찰되었다 (도 4A 및 B).
3-3. 운동 신경 이상 확인
운동 신경(motor neuron) 이상이 HSPB8-관련된 인간 병리에서 주요 증상이기 때문에, D42-GAL4 드라이버를 이용하여 초파리의 운동 신경에서 HSPB8 WT , HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 전이유전자(transgene)를 발현시키고, 형질전환 초파리의 표현형으로서 운동 능력을 상기 실시예 3-1 및 3-2에 기재된 방법으로 확인하였다.
그 결과, HSPB8 WT 를 발현하는 초파리군에서는 대조군에 비해 유의미한 등반 능력 변화가 관찰되지 않은 반면, HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 를 발현하는 초파리군들에서는 대조군 또는 HSPB8 WT 발현군에 비해 운동 능력이 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (도 4C 및 D). 또한, 비디오 트래킹 분석에서도 D42-GAL4 드라이버를 이용하여 HSPB8 전이 유전자를 발현하는 초파리의 걷는 속도 및 궤적이 현저히 감소하는 것으로 나타나 (도 5), 인간 HSPB8 돌연변이의 운동 신경에서의 발현이 지속적으로 운동 능력을 감소시키는 것을 확인하였다. 이를 통해, 인간 HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 의 발현이 초파리에서 명확한 운동 결함을 발생시키는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 돌연변이에 의한 미토콘드리아 기능 장애 확인
4-1. 미토콘드리아 막 전위
다발성 신경퇴행성 질환(multiple neurodegenerative diseases)의 병태생리학에서 미토콘드리아 기능 장애(mitochondrial dysfunction)가 필수적인 역할을 하는 것이 보고된 바 있으므로, HSPB8의 돌연변이가 초파리의 신경에서 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 각 HSPB8 형질전환 초파리군의 유충의 VNC(ventral nerve cord) (운동 신경을 포함하는 포유동물의 척수(spinal cord)와 기능적으로 대응됨)에서 막 전위를 TMRM로 측정하였다. 구체적으로, 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, 각 형질전환 초파리군의 유충의 VNC를 PBS에서 절개하고, 2.5 nM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, Molecular Probes, MA) (in PBS+0.1% Triton X-100)로 30분 동안 염색하였다. TMRM 형광은 Zeiss LSM 800 콘포칼 현미경을 이용하여 분석하였으며, TMRM 신호 강도는 Zeiss Zen 소프트웨어를 이용하여 측정하였으며, 평균 TMRM 형광 강도 (±SD)는 10개의 독입적인 샘플에 대해 계산되었다.
그 결과, 미토콘드리아 막 전위(transmembrane potential)는 HSPB8 K141T 돌연변이 유충 및 HSPB8 K141E 돌연변이 유충 모두에게서 야생형 형질전환 유충에 비해 내내 감소하여 (도 4A), HSPB8 돌연변이 초파리가 운동 능력 손실 및 미토콘드리아 기능 장애와 같은 환자들의 표현형을 성공적으로 나타내는 것을 확인하였다.
4-2. 마이토파지 수준
HSPB8 돌연변이에 의해 유도된 미토콘드리아 결함을 추가로 조사하기 위해, elav-GAL4 드라이버에 미토콘드리아 표적 형광 프로브인 mt-Keima(mitochondria-targeted fluorescent protein Keima)를 함께 발현시킨 HSPB8 형질전환 초파리 유충의 VNC에서, mt-Keima의 특성 (미토콘드리아의 물리적 pH8.0에서 mt-Keima가 440nm에서 여기 피크를 나타내고 마이토파지 후 산성 리소좀 내의 pH4.5에서 mt-Keima의 여기 피크가 586nm로 이동)을 이용하여 미토콘드리아 QC(mitochondria quality control) 기전에 필수적인 마이토파지(mitophagy)의 수준을 확인하였다. 구체적으로, mt-Keima를 발현하는 각 군의 유충의 VNC를 PBS에서 절개하고 Zeiss LSM 800 콘포칼 현미경을 이용하여 mt-Keima의 형광을 595-700 nm 여기 대역폭(bandwidth)을 이용한 두 개의 순차적인 여기 레이저 (488 nm 및 555 nm)로 이미지화하였으며, 이 이미지를 Zeiss Zen을 이용하여 픽셀 단위로 분석하였다. 마이토파지 수준 (마이토파지의 %)는 총 픽셀수로 나눈 높은 적/녹 비율을 가지는 픽셀의 수로 정의되었다. 평균 마이토파지 수준 (±SD)은 10개의 독립적인 샘플에 대해 계산되었다.
그 결과, 마이토파지 수준 또한 HSPB8 K141T 돌연변이 유충 및 HSPB8 K141E 돌연변이 유충 모두에서 야생형 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다 (도 4B).
이를 통해, HSPB8 단백질의 돌연변이가 미토콘드리아 QC를 방해하여 결과적으로 미토콘드리아의 기능을 손상시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. PINK1 및 parkin 의 도입에 의한 미토콘드리아 기능 장애 회복
HSPB8 돌연변이에 의한 초파리에서의 미토콘드리아 활성 및 QC 감소가 PINK1 또는 Parkin에 의해 회복되는지 확인하기 위해, PINK1 또는 Parkin의 전이 유전자를 HSPB8 돌연변이 초파리에 도입하고 (elav HSPB8 K141T PINK1, elav HSPB8 K141E PINK1, elav HSPB8 K141T Parkin 및 elav HSPB8 K141E Parkin) 미토콘드리아 막 전위, 마이토파지 수준 및 운동 능력 변화를 확인하였다. 그 결과, HSPB8 K141T 또는 HSPB8 K141E 형질전환 초파리 모두에서 PINK1 또는 Parkin의 발현에 의해 미토콘드리아 막 전위 손실이 회복되었으며 (도 4A), 감소된 마이토파지 수준, 감소된 등반 능력, 걷는 속도 및 운동 궤적도 회복되는 것으로 나타났다 (도 4C 내지 F).
상기의 미토콘드리아 활성 및 마이토파지 회복과 동반되는 운동 결함 회복 결과를 통해, 미토콘드리아 기능 장애가 HSPB8 돌연변이에 의해 유도되는 신경병증(neuropathies)의 발병에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
실시예 6. PINK1 활성화에 의한 미토콘드리아 기능 장애 회복
PINK1의 활성화에 의해 HSPB8 돌연변이 초파리의 운동 결함도 회복되는지 확인하기 위해, 미토콘드리아 탈분극(mitochondrial depolarization)과 독립적으로 PINK1을 활성화시키는 키네틴 리보사이드(kinetin riboside, KR) (N6-furfuryl adenine riboside)를 1일령 HSPB8 WT 초파리, HSPB8 K141N 돌연변이 초파리 및 HSPB8 K141T 돌연변이 초파리에 각각 1 mM 또는 5 mM로 14일 동안 경구투여한 후 비디오 트래킹 분석 및 등반 분석으로 운동 활성(locomotor activity)을 확인하였다.
그 결과, 야생형 형질전환 초파리는 KR 투여에 의해 운동 활성이 대조군 (비히클 투여군)에 비해 변하지 않은 것으로 나타나 (도 6A 내지 C), KR에 의한 부작용이 없음을 확인할 수 있었다. 또한, HSPB8 돌연변이 형질전환 초파리에서, KR의 투여 농도에 의존적으로 운동 활성이 현저히 회복되는 것으로 나타났다 (도 6A 내지 C).
이를 통해, PINK1 활성화가 HSPB8 돌연변이에 의해 유도되는 표현형을 회복시킬 수 있으며, KR이 HSPB8-관련된 발병을 억제할 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. HSPB8(small heat shock protein B8) 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 질환의 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 HSPB8 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 아비머(avidity multimer), 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 HSPB8 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 특이적으로 인식하는 프라미어쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 키트.
  5. 제 4항에 있어서, RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 샤르코-마리-투스 질환의 진단용 키트.
  6. PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 또는 Parkin 단백질, 이의 활성화제, 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이에 의한 샤르코-마리-투스 질환인, 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 키네틴 리보사이드(kinetin riboside, KR) (N6-furfuryl adenine riboside)를 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 6항에 있어서, 운동 결함 또는 미토콘드리아 기능 장애를 개선하는, 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델.
  11. 제 10항에 있어서, 신경세포, 운동 신경세포 또는 다중-수지상 감각 신경세포에서 K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 발현하는 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델.
  12. 제 10항에 있어서, 초파리(Drosophila)인 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델.
  13. 제 10항에 있어서, K141N 또는 K141T 돌연변이 HSPB8 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 신경(뉴런) 특이적 프로모터 elav, 운동 신경세포 특이적 프로모터 D42 또는 다중-수지상 감각 신경 세포(multi-dendritic sensory neurons) 특이적 프로모터 ppk에 작동가능하게 연결된 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델.
  14. 대상으로부터 분리된 시료에서 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 대상으로부터 분리된 시료에서 HSPB8 단백질의 K141N 또는 K141T 돌연변이가 검출된 경우, 상기 대상이 샤르코-마리-투스 질환이 발병할 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환의 발병 가능성을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  16. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 K141N 또는 K141T 돌연변이를 포함하는 HSPB8 단백질을 발현하는 세포주 또는 동물 모델에 처리하고;
    2) 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 세포주 또는 동물 모델에서 미토콘드리아 기능 장애 정도를 측정하며; 및
    3) 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 미토콘드리아 기능 장애가 개선된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.

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