KR20180072579A

KR20180072579A - 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180072579A
Application number: KR1020170176279A
Authority: KR
Inventors: 윤승용; 김나영; 김동호
Original assignee: 주식회사 아델
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2018-06-29
Also published as: US20210261633A1; US20190330293A1; KR102032314B1; US11001615B2; WO2018117647A1

Abstract

본 발명은 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 12개의 아미노산으로 구성되어 제조가 용이하다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편을 항원으로서 개체에 주입할 경우, 변이된 타우 단백질에 대한 중화 항체를 생성한다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 비정상적인 타우 단백질의 응집을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도{MODIFIED TAU PROTEIN FRAGMENT AND USE THEREOF}

본 발명은 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 12개의 아미노산으로 이루어진 변이된 타우 단백질의 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방용 조성물에 관한 것이다.

치매의 발병 형태 중 약 50%에 차지하는 알츠하이머병은 65세 이후로 발병률이 증가하는 퇴행성 뇌신경 질환으로, 인구가 고령화됨에 따라 전세계적으로 급속히 증가하고 있다.

알츠하이머병의 발병 원인으로 β-아밀로이드의 축적, 타우 단백질의 과인산화 또는 프리세닐린 1의 β-아밀로이드 생산 증대가 중요한 역할을 할 것으로 여겨져 왔다. 그 중, β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 알츠하이머성 치매의 주요한 발병 원인일 것으로 생각되어 왔다(Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992). 하지만, 일라이릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Company)의 알츠하이머 신약 후보물질인 솔라네주맙(solanezumab)의 3상 임상실험이 실패하면서 β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 크지 않음이 밝혀졌다. 이에 따라 타우 단백질의 비정상적인 과인산화가 알츠하이머병의 발병 원인으로 작용하여 발병할 것이라는 의견에 초점이 모아지고 있다.

타우 단백질은 세포물질을 수송하는 단백질인 미세소관(microtubule)을 안정화시키는 단백질이다. 타우 단백질은 인체 내에서 6개의 동형(isoform)으로 존재하며 중추신경계의 뉴런에 풍부하게 존재한다. 또한, 타우 단백질에 돌연변이가 발생하는 경우, 타우 단백질이 과인산화되어 신경세포 내에 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFTs)을 비정상적으로 축적시켜 치매 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011).

하지만, 441개의 아미노산으로 구성되어 있는 인간 타우 단백질은 단백질 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어날 수 있는 곳이 매우 다양하여 타우 단백질 내 치매의 예방 또는 치료 효과를 보이는 표적 부분을 발굴하는데 어려움을 겪고 있다. 따라서, 타우 단백질을 표적으로 하는 퇴행성 신경 질환의 백신 또는 치료제 개발이 필요한 실정이다.

Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992 Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011

이에 본 발명자들은 효과적인 퇴행성 신경 질환의 백신 및 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 12개의 아미노산으로 구성된 변이된 타우 단백질 단편이 효과적으로 중화항체를 생성하고, 상기 단편이 타우 단백질의 응집을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 치매 유발 동물모델을 이용한 실험에서 상기 단편을 투여 받은 동물모델의 운동능력 및 인지능력이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적 달성을 위해, 본 발명은 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 벡터를 형질주입시킨 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 백신 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 12개의 아미노산으로 구성되어 제조가 용이하다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편을 항원으로서 개체에 주입할 경우, 변이된 타우 단백질에 대한 중화 항체를 생성한다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 비정상적인 타우 단백질의 응집을 억제한다. 따라서, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 제조한 변이된 타우 단백질 단편들의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 시간이 경과함에 따라 Tau-P300L 치매 마우스에서 전체 타우 단백질 및 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 3은 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 전체 타우 단백질 및 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 면역조직화학염색을 통해 나타낸 사진이다.
도 5는 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6a은 Tau-P301L 치매 마우스에 K280-ac 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6b은 Tau-P301L 치매 마우스에 pT231 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6c은 Tau-P301L 치매 마우스에 Glu391 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6d는 Tau-P301L 치매 마우스에 K311ac 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6e는 Tau-P301L 치매 마우스에 전장의 타우 단백질을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 7은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Fear conditioning 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 8은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Strength test 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 9는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 vertical test 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 10은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Water maze 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 11은 타우 단백질 N-말단 단편 또는 K280-ac 단편을 백신으로서 1차 및 2차 투여한 후 항체 생성량을 비교한 도면이다.
도 12는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 nesting building test 실험을 통해 확인한 사진이다.
도 13은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 nesting building test 실험을 통해 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스와 정상 마우스의 트레이닝 패턴(sec)을 나타낸 도면이다.
도 15는 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스와 정상 마우스의 트레이닝 패턴(rpm)을 나타낸 도면이다.
도 16은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Rota-rod 실험을 통해 측정한 시간을 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Rota-rod 실험을 통해 측정한 회전수(rpm)를 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Y-maze 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 19는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Novel object recognition 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 20은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 immobility를 측정하여 확인한 도면이다.
도 21은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 swimming을 측정하여 확인한 도면이다.
도 22는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 climbing을 측정하여 확인한 도면이다.
도 23은 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서의 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 경감효과를 확인한 도면이다.
도 24는 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서의 전체 타우 단백질(Tau 5) 대비 인산화된 타우 단백질(pThr231) 또는 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 비율을 나타낸 도면이다.
도 25는 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 면역조직화학염색하여 전체 타우 단백질(Tau 5) 및 인산화된 타우 단백질(pThr231)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 26은 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 면역조직화학염색한하여 전체 타우 단백질(Tau 5) 및 인산화된 타우 단백질(pThr231)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 27은 K280-ac 단편 투여에 따른 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 대뇌 피질 분획(soluble)을 웨스턴 블롯을 통해 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 28은 K280-ac 단편 투여에 따른 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 뇌조직을 적출한 후 대뇌 피질 분획(insoluble)을 웨스턴 블롯을 통해 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 29는 K280-ac 단편 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 웨스턴 블롯을 통해 시냅스 관련 단백질들의 발현량을 확인한 사진이다.
도 30은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IFN-γ의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 31은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-12의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 32는 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-4의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 33은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-22의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 34는 K280-ac 단편 투여로 생성된 항체의 뇌조직 내 분포를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후, 면역조직화학염색을 통해 확인한 사진이다.
도 35는 K280-ac 단편 투여로 생성된 항체의 뇌조직 내 분포를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후, 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 36은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스를 ROI(Region of interest)를 해마로 지정하여 MR spectroscopy(MRS) 촬영한 사진이다.
도 37은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamic acid) 농도를 나타낸 그래프이다.
도 38은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 FA(fractional anisotrophy) 값을 나타낸 그래프이다.
도 39는 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 MD(mean diffusivity) 값을 나타낸 그래프이다.
도 40은 K280-ac 단편 투여에 따른 GCP-II 감소 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 GCP-II 의 발현량을 측정한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편을 제공한다.

Val-Gln-Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu-Ser-Asn (서열번호 1)

상기 6번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 277 내지 283번째 아미노산 서열인 Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp(서열번호 5) 또는 서열번호 2으로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 278 내지 284번째 아미노산 서열인 Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu(서열번호 6)와 같이 7개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "타우 단백질"이란, 441개의 아미노산으로 구성되며, 세포물질을 수송하는 단백질인 미세소관(microtubule)의 안정화시키는 단백질을 의미한다. 상기 타우 단백질에 돌연변이가 발생하는 경우, 타우 단백질이 과인산화되어 신경세포 내에 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFTs)을 비정상적으로 축적시켜 알치하이머병 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환을 유발할 수 있다.

상기 변이된 타우 단백질 단편은 공지의 단백질 제조 기술로 용이하게 제조될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 전장의 타우 단백질의 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 후, 275 내지 286번째 아미노산 서열을 갖는 단편이 되도록 적합한 제한효소를 처리하여 제조될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 타우 단백질 단편을 제조한 후 6번째 아미노산을 아세틸화시켜 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포로 형질주입하는 단계; 형질주입된 숙주세포를 배양하는 단계; 배양물로부터 타우 단백질 단편을 수득하는 단계; 및 수득된 타우 단백질 단편의 6번째 아미노산인 라이신을 아세틸화 시키는 단계를 포함하는 제조방법을 통해 제조할 수 있다.

상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)일 수 있다. 상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.

상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection) 또는 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun)을 통해 수행될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 알츠하이머병 또는 파킨슨병일 수 있다.

구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환(Tauopathy)은 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 리포푸신증(lipofuscinosis)일 수 있다.

또한, 상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병일 수 있다.

상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.

수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 아주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 아주번트로는 프로인트 완전 아주번트, 프로인트 불완전 아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

상기 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. "치료상 유효량"의 결정시, 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.

상기 백신 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 변이된 타우 단백질 단편을 기준으로 하였을 때 0.0001mg/kg(체중) 내지 100mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편에 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "항체"란, 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε으로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 동종(isotype)이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 상이할 수 있다.

상기 IgG는 중쇄(heavy chain, 약 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 약 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 약 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있다. 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-시트(sheet)로 구성되어 있고 분자 내 이화항결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성된다. 상기 부위는 Y자 모양의 두 개의 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 경첩 부위(hinge region)로 연결되어 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다. 항체의 입체구조를 살펴보면, CDR은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉한다.

또한, 상기 항체 절편은 Fab, scFv, F(ab)² 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 항체 절편은 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능(effector function)을 하는 결정가능 영역(Fc region)을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 단일 도메인 항체(single domain antibody)나 소형 항체(minibody) 등과 같은 3세대 항체 절편을 포함할 수 있다.

또한, 상기 항체 절편은 완전한 구조의 IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있다. 또한, 상기 항체 절편은 Fc가 없기 때문에 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체 절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point, pI)이 바뀔 수 있다. 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 완전한 구조의 IgG를 사용할 수 있다.

상기 항체는 공지의 단일클론 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행되거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 벡터가 형질주입된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환(Tauopathy)은 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 리포푸신증(lipofuscinosis)일 수 있다.

상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 아주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 아주번트로는 프로인트 완전 아주번트, 프로인트 불완전 아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 항체 또는 이의 절편을 기준으로 하였을 때 0.0001mg/kg(체중) 내지 100mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 백신 조성물 또는 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 변이된 타우 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.

상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 상술한 바와 같다.

상기 항체를 이용하여 이와 결합한 변이된 타우 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 변이된 타우 단백질의 염기서열 중 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 상보적인 결합을 하는 10개 내지 25개의 연속적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 변이된 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(northernblotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, 중합반응을 위한 시약은 DNA 중합효소 또는 역전사효소일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 이러한 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형일 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 서열을 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 표지는 방사성 동위원소 표지, 형광성 분자 표지, 바이오틴 표지일 수 있다.

상기 퇴행성 신경 질환은 백신 조성물 또는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.

본 발명은 본 발명의 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 키트를 제공한다.

상기 키트는 퇴행성 신경 질환을 진단하기 위해 개체의 시료로부터 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 발현량을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 및 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 퇴행성 신경 질환 진단용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는, 변이된 타우 단백질 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명은 i) 퇴행성 신경 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하는 단계;

ii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량과 정상 대조군 시료의 변이된 타우 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 퇴행성 신경 질환 발병 확률이 높다는 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

개체로부터 시료를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 "시료"란 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 발현량이 차이 나는 조직, 세포, 혈액, 혈장 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 mRNA를 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 유전자 칩을 이용해 측정할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 단백질을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS, 단백질 칩에 의하여 측정하는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서 항원-항체 복합체의 형성량과 개체에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 오존 노출 여부를 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 변이된 타우 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 등이 있다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

I. 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 항체 제조

제조예 1. 변이된 타우 단백질 단편 제조

변이된 타우 단백질 단편을 제조하기 위하여, 441개의 아미노산으로 이루어진 타우 단백질의 아미노산 서열 중 알츠하이머병의 병인기전으로 작용할 것으로 추정되는 4개의 변이된 타우 단백질 단편을 선별하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 미세소관(microtubule) 도메인에 위치한 4개의 변이된 타우 단백질 단편의 아미노산 서열 중 12개의 아미노산 서열 구간을 지정하였다.

구체적으로, 타우 단백질 아미노산 서열 중 275 내지 286번째 아미노산 서열 구간을 가지며 280번째 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편을 K280-ac로 명명하였고, 226 내지 236번째 아미노산 서열 구간을 가지며 231번째 아미노산이 인산화된 단백질 단편을 pT231로 명명하였다. 또한, 타우 단백질 아미노산 서열 중 381 내지 391번째 아미노산 서열 구간을 가지며 391번째 아미노산의 C-말단이 절단(truncation)된 단백질 단편을 Glu391로 명명하였으며, 303 내지 316번째 아미노산 서열 구간을 가지며 306 내지 311번째의 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편을 VQIVYK-ac로 명명하였다. 상기 K280-ac, pT231, Glu391 및 VQIVYK-ac 단백질 단편은 (주) 펩트론에 주문 의뢰하여 제작하였다.

II. 동물모델을 이용한 변이된 타우 단백질 단편의 치료효과 확인

제조예 1.에서 제조한 4가지의 변이된 타우 단백질 단편을 Tau-P301L 치매 마우스에 투여하여 능동면역된 후, Fear conditioning test, Morris water maze test 등의 기억력 테스트, Grip strength test, Vertical test 등의 운동능력 테스트 등을 수행하여 각각의 변이된 타우 단백질 단편별 개선효과를 비교하였다. 상기 4가지 변이된 타우 단백질 단편 중, K280-ac 단편에서 정상 마우스와 유사한 정도의 개선 효과를 나타내었다.

제조예 2. 치매 마우스 모델 준비 및 능동면역

Tau-P301L 돌연변이 유전자를 발현하는 JNPL3 마우스를 Tanonic사로부터 구입하여 아산생명과학 연구원 동물실에서 C57bl/6 마우스와 5대에 걸쳐 back-crossing을 진행하였다. 그 후, 무특이병원체(specific pathogen free, SPE)의 조건에서 사육하였다. 능동면역을 위해 태어난 지 3개월이 될 때부터 6개월간, 차례대로 2주, 2주, 4주, 4주, 5주, 4주 및 1주의 간격으로 제조예 1.에서 제조한 4개의 변이된 타우 단백질 단편을 담체(carrier)인 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyholelimpet hemocyanin, KLH) 및 알루미늄 아주반트(adfuvant)와 함께 투여하였다. 이때, 투여는 복강내주사(intraperitoneal injection, IP injection)를 통해 투여하였다. K280-ac 단편을 투여하여 능동면역된 치매 마우스를 Tau-P301L-K280-ac로 명명하였다.

이중 대조군으로 사용될 정상 마우스(wild type 2N4R)와 Tau 돌연변이 마우스(이하, Tau-P301L)에는 KLH와 알루미늄 아주반트만을 투여하였다.

실험예 2. 치매 마우스 모델 특성 확인

실험에 사용된 Tau-P301L 치매 마우스 모델은 정상 생쥐에 비해, 노화에 따라 타우 단백질의 축적의 차이를 나타내었다. 구체적으로, 생후 4개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스와 유사한 수준의 타우 단백질 발현을 보이고 있으나, 중증의 치매증상을 보이는 12개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스에 비해 약 2배 가까운 타우 단백질을 발현하는 것을 확인하였다. 제조예 2.에서 제조한 ADEL-Y01h 항체를 이용한 면역 블롯팅에 의해 12개월 된 치매 마우스 모델의 아세틸화된 타우 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3). 또한, 인지기능에 중요한 해마(hippocampus) 부위에서도 면역조직화학염색을 통해 치매 마우스 모델에서의 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우단백질이 증가된 것을 면역 블롯팅을 통해 확인하였다(도 4 및 도 5).

실험예 3. 변이된 타우 단백질 단편에 대한 항체 생성 확인

제조예 1. 에서 제조한 4개의 변이된 타우 단백질 단편에 대한 항체가 형성되었는지 확인하기 위해, 각각의 변이된 타우 단백질 단편 또는 전장의 타우 단백질을 마지막으로 투여한 후 혈장을 이용하여 ELISA를 수행하였다.

그 결과, VQIVYKac(K311-ac) 단편에 대한 항체는 잘 생성되지 않았으며, K280-ac, pT231 또는 Glu391 단편에 대한 항체는 잘 생성되는 것을 확인하였다(도 6a 내지 도 6e).

실험예 4. 공포 조건화(Fear conditioning) 실험

상기 제조예 2.에서 사육한 마우스들을 대상으로 공포 조건화 실험을 수행하였다. 구체적으로, 공포 조건화 실험을 수행하기 전에, 마우스들을 3일 연속으로 매일 5분간, 각 마우스들을 잡고 손에서 움직이도록 하는 과정을 통해 길들여지도록 하였다.

공포 조건화 실험 수행 전날에는 마우스를 10분간 트레이닝 상황에 놓아 익숙해지도록 하였다. 구체적으로, 실험 케이지에 마우스를 넣고 삐 소리를 들려준 직후 바닥에 전기 자극을 주는 실험을 3회 반복하여, 마우스가 삐 소리에 대한 공포 조건화 학습이 되도록 하였다. 모든 테스트들은 Limelight(Actimetrics) 및 컴퓨터에 기록되었다.

다음날, 마우스를 다시 10분간 실험 케이지에 넣고 삐 소리를 들려주는 동안 기저선 동결 반응 시간을 측정하였다. 이때, 동결 반응은 동물이 숨쉬기 위한 행동 외에는 움직임이 없는 상태이다. 이후, 상자의 밑바닥을 여러 번 세척하고 에탄올로 다시 닦아내어 마우스의 냄새를 모두 제거하였다. 동시에 상자의 문을 열고 환풍기를 틀어 공기를 내보냈다. 물만 사용했을 경우에도, 상황의 일관성을 위해 동일한 단계를 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 동결 반응 시간은 약 150초를 나타내고, Tau-P301L 치매 마우스의 동결 반응 시간은 100초 이내를 나타내었다. 반면, K280-ac 폴리펩타이드로 능동면역된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스와 같이 약 150초의 동결 반응 시간을 나타내었다. 한편, 나머지 3가지의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 동결 반응 시간이 회복되지 않았다.

실험예 5. 악력 테스트(Grip Strength Test)

마우스의 근력을 확인하기 위해 악력 테스트를 수행하였다. 실험에 사용된 철 뭉치는 아산생명과학연구원에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 이때, 철 뭉치는 40 g 철 뭉치를 사용하였다. 상기 제조예 2.에서 준비한 마우스들의 꼬리 끝부분을 잡고, 마우스의 앞발이 40 g의 철 뭉치를 움켜잡을 수 있도록 철 뭉치 위에 올려놓았다. 그 후, 마우스의 꼬리를 쥔 채 약 30cm 높이로 들어 올려서, 마우스가 철 뭉치를 놓칠 때까지의 시간을 측정하여 각 마우스 별로 비교하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 악력 측정 시간은 10초 이내였으며, Tau-P301L 치매 마우스의 악력 측정 시간은 5초 이내로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 악력 측정 시간보다 긴 약 12초로 측정되었다. 한편, 나머지 3개의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 약력 측정 시간은 유의미하게 증가하지 않았다. 이를 통해 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 악력이 정상 마우스의 정도로 회복한 것을 확인하였다.

실험예 6. 수직 그리드 테스트(Vertical Grid test)

상기 제조예 2.에서 사육한 마우스를 대상으로 수직 그리드 테스트 수행하였다. 수직 그리드는 아산생명과학연구원 실험 동물실에 구비되어 있는 행동 장비를 사용하였다. 구체적으로, 마우스들을 수직 그리드 장치에 올려놓고, 수직 그리드를 올라갔다가 내려오게 하여, 그리드 상에서 떨어질 때까지의 시간을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 수직 그리드 측정 시간은 10초 이내였으며, Tau-P301L 치매 마우스의 수직 그리드 측정 시간은 5초 이내로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 수직 그리드 측정 시간과 동일한 10초로 측정되었다. 한편, 나머지 3개의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 수직 그리드 측정 시간은 유의미하게 증가하지 않았다.

실험예 7. 수중 미로 테스트(Water maze test)

마우스의 학습과 기억 능력을 평가하기 위해 수중 미로 테스트를 수행하였다. 수중 미로 테스트에 사용되는 장비와 프로그램은 아산생명과학연구원 실험 동물실에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 구체적으로, 수중 미로 테스트는 총 5일이 소요되며, 4일 동안 도피대(platform)와 도피대 위치에 대한 단서(visual cue)를 두고 마우스를 트레이닝 시켰다.

상기 학습은 도피대가 있는 수영장(1.4 m 지름, 45cm 깊이)에 약 26.5 cm의 깊이가 되도록 물(29±0.5℃)을 채운 후, 단서로만 도피대를 기억할 수 있도록 물을 뿌옇게 만들기 위해 전지분유 1.5L를 첨가하였다. 그 후, 마우스들을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 적응시키고, 1분 동안 도피대 위에 있도록 하였다. 실험은 총 3개의 서로 다른 시작 위치에서 4세트씩 총 12번 수행하였다. 테스트 1회가 끝날 때마다 30초의 쉬는 시간을 주었으며, 한 세트가 끝날 때는 30 내지 45분의 쉬는 시간을 주었다.

4일간의 학습 후, 5일차에 테스트를 수행하였다. 평가를 위한 실험에서는 도피대를 두지 않고, 단서만 보고 도피대가 있던 위치에 잘 찾아가는지를 확인하기 위해 그 구역에 머무는 횟수를 측정하였다. 테스트 시간은 1분 내에 도피대가 있던 위치에 도달하도록 하였고, 1분 내에 도피대 위치에 도달하지 못하면 수영장에서 건져내었다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 도달 횟수는 약 3회로 측정되었으며, Tau-P301L 치매 마우스의 도달 횟수는 약 1회로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 도달 횟수와 유사한 약 3회로 측정되었다. 그 다음으로 Glu391, VQIVYKac 단편으로 능동면역된 마우스의 순서로 증가된 횟수를 나타냈으며, pT231 단편으로 능동면역된 마우스의 경우 플랫폼에 도달한 횟수가 가장 낮아 Tau-P301L 치매 마우스와 비슷한 결과를 나타내었다.

실험예 8. 변이된 타우 단백질의 항체 생성률 확인

실험예 3. 내지 실험예 7.을 통해 4가지의 변이된 타우 단백질 단편 중 항체 생성이 잘 되며, 치료 효과가 우수한 K280-ac 단편을 선별하였다. 또한, K280-ac 단편의 백신으로서 효용성이 있는지 확인하기 위해, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 타우 단백질의 N-말단 단편과 K280-ac 단편을 투여하여 1차 및 2차 부스팅 후 항체 생성률을 비교하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 1차 및 2차 부스팅에서 타우 단백질의 N-말단 단편보다 K280-ac 단편의 항체 생성률이 높은 것을 확인하였다.

실험예 9. K280-ac 단편의 행동개선 효과 확인

제조예 2.에서 제작한 Tau-P301L 치매 마우스의 운동능력과 인지기능 변화를 확인하기 위해 행동실험을 진행하였다. 마우스의 다중모달 뇌 기능(multimodal brain function)을 확인 할 수 있는 nest building test를 수행하였다.

구체적으로, 사육중인 케이지에 있는 깔짚의 2/3를 제거하고 멸균한 솜(5cm x 5cm) 4겹을 마우스 케이지에 넣어주었다. 한 케이지에 한 마리의 마우스가 들어가도록 하였다. 다음날 아침에 둥지를 완성시킨 정도를 분석하였다.

그 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 building score가 50% 가량 감소하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 building score와 유사하게 회복되는 것을 확인하였다(도 12 및 도 13).

또한, 운동능력을 확인하기 위해 Rota-rod 실험을 수행하였다. 구체적으로, 마우스의 운동능력을 확인하기 위해 5일간 Rota-rod를 진행하였다.

구체적으로, 마우스를 회전하는 로터에서 얼마나 오래 견디는지를 측정하는 것으로, 4일 동안 트레이닝하고 5일차에 운동능력을 측정하였다. 트레이닝은 RPM을 올려주면서 로터에 버티는 시간과 최종 RPM을 측정하여 하루에 3회씩 반복하였다. 5일차에 동일 조건에서 실험을 진행하되 반복 없이 1회만 결과를 측정하였다(도 14 및 도 15). 그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 rpm과 시간이 정상 마우스만큼 증가된 것을 확인하였다(도 16 및 도 17).

아울러, 인지기능 회복을 확인하기 위해 Y-maze 실험을 수행하였다. 구체적으로, Y모양으로 생긴 상자에 A,B,C 구역을 설정하고, B구역을 막은 상태로 마우스를 5분 동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 한 시간 뒤에 B구역을 막은 상자를 제거하고 모든 구역이 열려있는 상태에서 마우스의 움직임을 5분 동안 관찰하였다. 그 결과, Y-maze에서 정상 마우스보다 측정 시간이 50% 감소한 Tau-P301L 마우스에 비해 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 인지기능이 회복된 것을 확인하였다(도 18).

또한, Novel object recognition으로 기억실험을 수행하였다. 물체가 없는 흰색 상자에 (45cm x 45cm x 36cm) 5분동안 마우스를 자유롭게 움직이게 하며 공간에 익숙해지도록 하였다. 동일한 물체 두 개를 흰색 상자에 넣은 후 마우스를 5분동안 탐색하게 하면서 각 물체에 머무르는 시간을 측정하였다. 4시간 후 설치한 물체 중 하나를 다른 모형으로 대체하고 5분 동안 마우스의 움직임과 물체에 머무르는 시간을 측정하였다. Tau-P301L 마우스의 novel object에 머무는 시간이 정상 마우스보다 50% 감소하였지만, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 novel object에 머무는 시간은 정상 마우스만큼 증가된 것을 확인하였다(도 19).

이러한 결과를 통해 K280-ac 단편을 투여하면 운동능력 및 인지기능 회복되는 것을 확인하였다.

실험예 10. K280-ac 단편의 우울증 개선효과 확인

제조예 2.에서 제작한 Tau-P301L 치매 마우스의 우울증 개선효과를 확인하기 위해 forced swimming test를 진행하였다. 총 2일동안 실험이 진행되며 첫날에는 투명한 2 L 비커에 2/3 정도 물을 담고 15분간 마우스를 이 상황에 익숙해지도록 하였다. 이틀째 첫날과 동일한 조건에서 5분 동안 마우스를 물에 놓고 움직임을 관찰한다. 물속에서 수영을 하는 지표(Swimming/S), 비커 벽 주변을 타고 올라가려 하는 지표(Climbling/C), 아무런 움직임 없이 물에 떠있는 지표 (Immobility/I)를 각각 분석하였다.

그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서 우울증 개선 효과를 나타냄을 확인하였다(도 20 내지 도 22).

실험예 11. K280-ac 단편의 타우 병리 경감 효과 확인

K280-ac 단편 투여에 따른 타우 병리 경감 효과를 확인하기 위해 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 웨스턴 블롯 및 면역화학 조직염색을 수행하였다.

웨스턴 블롯 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 증가된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 감소된 것을 확인하였다(도 23). 특히, 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우 단백질이 Tau-P301L 치매 마우스에서 정상 마우스에 비해 약 2배 증가하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 정상 마우스만큼 감소된 것을 확인하였다(도 24).

또한, 면역조직화학염색에서도 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 감소된 것을 확인 하였다(도 25 및 도 26).

실험예 12. K280-ac 단편의 타우 응집 경감 효과 확인

K280-ac 단편 투여에 따른 타우 응집 경감 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 대뇌 피질을 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 대뇌 피질 분획(soluble 또는 insoluble)에서 전체 타우 단백질, 인산화 타우 단백질 및 아세틸 타우 단백질 모두 감소된 것을 확인하였다(도 27 및 도 28).

실험예 13. K280-ac 단편의 시냅스 개선 효과 확인

K280-ac 단편 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 PSD95, NMDA receptor, synaptophysin, synapsin-1 등 시냅스 관련 단백질들의 발현량이 감소된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우 정상 마우스만큼 PSD95, NMDA receptor, synaptophysin, synapsin-1 등 시냅스 관련 단백질들의 발현량이 회복된 것을 확인하였다(도 29).

실험예 14. K280-ac 단편의 염증 개선 효과 확인

K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 염증 관련 유전자에 대해 qPCR을 수행하였다.

그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서 IFN-γ, IL-4 및 IL-22 유전자가 증가되고, IL-12 유전자가 감소된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우 P301L-K280-ac 치매 마우스보다 IFN-γ, IL-4 및 IL-22 유전자가 감소하였으며, IL-12 유전자가 증가한 것을 확인하였다(도 30 내지 도 33).

실험예 15. 뇌 조직 내 K280-ac 백신으로 유도된 항체 분포 확인

제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직 내 항체를 확인하기 위해, 차가운 생리식염수로 심장 관류한 후, 뇌조직을 적출하여 마우스 면역글로불린-G에 대한 면역조직화학염색과 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스 내에서 항체가 존재하는 것을 확인하였다(도 34 및 도 35).

실험예 16. K280-ac 단편의 영상/대사 지표 개선 효과 확인

K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스를 대상으로 MR spectroscopy(MRS)를 수행하였다. ROI(Region of interest)는 해마로 지정하였다(도 36). 다양한 대사지표들 가운데, NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamic acid)가 P301L-K280-ac 치매 마우스에서 정상 마우스에 비해 약 50% 정도 감소하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서 NAAG 가 회복되는 것을 확인하였다(도 37).

또한, 뇌백질의 구조적인 연결 정도나 방향성을 평가할 수 있는 검사인 DTI(Diffusion tensor imaging)는 초기 알츠하이머 병에서 뇌 손상을 평가하는데 사용되는 기법이다. 병리 연구에서 MD(mean diffusivity)의 변화는 평균 확산성을 의미하며 탈수초화(demylination)와 축삭손상(Diffuse axonal injury)과 연관이 있다는 보고가 있고, FA(fractional anisotrophy)의 변화는 구조적 방향성 증가를 의미한다. 9개월 된 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌들보(corpus callosum)에서 FA값과 MD값이 감소되어있는 것을 확인하였다(도 38 및 도 39). 이를 통해 치매모델 마우스에서 뇌손상이 일어났고, NAAG level이 감소된 것을 확인하였다.

실험예 17. K280-ac 단편 투여에 따른 GCP -II 감소 효과 확인

GCP-II(glutamate carboxypeptidase-2, folate hydrolase 1)는 NAAG를 분해하는 NAAG peptidase로서, GCP-II의 증가가 NAAG를 감소시키는 원인일 가능성이 있어 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 GCP-II 의 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 정상 마우스만큼 GCP-II 의 발현량이 감소된 것을 확인하였다(도 40).

<110> ADEL, Inc. <120> MODIFIED TAU PROTEIN FRAGMENT AND USE THEREOF <130> FPD/201711-0107 <150> KR 2016-0175705 <151> 2016-12-21 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for mutated tau protein fragment <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> ACETYLATOIN, <400> 1 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for tau protein fragment <400> 3 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid seqeunce for Tau N-terminal fragment <400> 4 Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for mutated tau protein fragment <400> 5 Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for mutated tau protein fragment <400> 6 Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu 1 5

Claims

하기 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편:
Val-Gln-Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu-Ser-Asn (서열번호 1)
상기 6번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 것을 특징으로 한다.
제1항의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환인 것인, 백신 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 백신 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병인 것인, 백신 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 백신 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 및 비강으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항의 변이된 타우 단백질 단편에 결합하는 항체 또는 이의 절편.
제 8항에 있어서,
상기 항체 절편은 Fab, scFv, F(ab)² 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 절편.
제8항의 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터.
제10항의 벡터가 형질주입된 숙주세포.
제 11항에 있어서,
상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것인, 숙주세포.
제 12항에 있어서,
상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)인 것인, 숙주세포.
제 12항에 있어서,
상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포인 것인, 숙주세포.
제8항의 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 15항에 있어서,
상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 약학 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병인 것인, 약학 조성물.
제2항의 백신 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료방법.
제15항의 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료방법.
제1항의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물.
변이된 타우 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
제 21항에 있어서,
상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체인 것인, 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
제 21항에 있어서,
상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것인, 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
제21항의 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단 키트.
i) 퇴행성 신경 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
ii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량과 정상 대조군 시료의 변이된 타우 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
iii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 퇴행성 신경 질환 발병 확률이 높다는 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환에 대한 정보 제공방법.