WO2018117647A1 - 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도 - Google Patents

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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to mutated tau protein fragments and uses thereof. More specifically, the present invention relates to fragments of mutated tau protein consisting of 12 amino acids and compositions for the prevention of degenerative neurological diseases comprising the same as an active ingredient.
  • Alzheimer's disease which accounts for about 50% of the dementia types, is a degenerative neurodegenerative disease that has increased incidence since the age of 65, and is rapidly increasing worldwide as the population ages.
  • Alzheimer's disease As a cause of Alzheimer's disease, accumulation of ⁇ -amyloid, hyperphosphorylation of tau protein, or increased ⁇ -amyloid production of presenilin 1 has been considered to play an important role. Among them, neuronal cytotoxicity due to the accumulation of ⁇ -amyloid has been considered to be a major cause of Alzheimer's dementia (Hardy AJ et al ., Science , 256, 184-185, 1992). However, the failure of Phase III clinical trials of Elielly and Company's Alzheimer's drug candidate, solanezumab, failed to reveal significant neurotoxicity due to the accumulation of ⁇ -amyloid. Therefore, the focus is on the opinion that abnormal hyperphosphorylation of tau protein will act as a cause of Alzheimer's disease.
  • Tau protein is a protein that stabilizes microtubules, proteins that transport cellular material. Tau protein is present in the body in six isoforms and is abundant in neurons of the central nervous system. In addition, when mutations occur in the tau protein, the tau protein is overphosphorylated to abnormally accumulate neurofibrillary tangles (NFTs) in nerve cells, leading to degenerative neurological diseases such as dementia and Parkinson's disease. Hee Choi et al ., Brain & Neuro Rehabilitation , 4, 21-29, 2011).
  • NFTs neurofibrillary tangles
  • the human tau protein which consists of 441 amino acids, has a wide variety of places where post-translational modifications can occur, making it difficult to identify target areas that have the effect of preventing or treating dementia in tau protein. Suffer. Therefore, there is a need for the development of a vaccine or therapeutic agent for neurodegenerative diseases targeting tau protein.
  • the present inventors have studied to develop effective vaccines and therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
  • the mutant tau protein fragment consisting of 12 amino acids effectively produced neutralizing antibodies, and the fragment reduced aggregation of tau protein. It was.
  • the present invention was completed by confirming that the exercise and cognitive abilities of the animal model receiving the fragments were improved in the experiment using the dementia-induced animal model.
  • the present invention provides a mutated tau protein fragment having 12 amino acid sequences.
  • the present invention also provides a vaccine composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the mutated tau protein fragment as an active ingredient.
  • the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds to the mutated tau protein.
  • the present invention also provides a vector comprising a nucleotide sequence encoding the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a host cell transfected with the vector.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising the antibody or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a degenerative neurological disease, comprising administering the vaccine composition to an individual expected to develop or a degenerative neurological disease.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating degenerative neurological disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual in anticipation of or developing a degenerative neurological disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating depression due to degenerative neurological disease comprising the mutated tau protein fragment as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative disease comprising the antibody or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a kit for diagnosing neurodegenerative disease comprising the antibody or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the mutated tau protein fragment of the present invention consists of 12 amino acids for ease of manufacture.
  • injecting the mutated tau protein fragment into an individual as an antigen produces a neutralizing antibody against the mutated tau protein.
  • the mutated tau protein fragments inhibit aggregation of abnormal tau protein. Therefore, the modified tau protein fragment of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases.
  • 1 is a diagram showing the amino acid sequence of the mutated tau protein fragments prepared in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the expression of tau protein in which Tau-P301L dementia mice are acetylated with the whole tau protein and the 280th amino acid through Western blot.
  • Figure 3 is a graph showing the expression of tau protein acetylated total tau protein and the 280th amino acid in Tau-P301L dementia mice over time.
  • FIG. 4 is a photograph showing the expression level of tau protein acetylated 280th amino acid in Tau-P301L dementia mice over time through immunohistochemical staining.
  • 5 is a graph showing the expression level of tau protein acetylated at the 280th amino acid in Tau-P301L dementia mice over time.
  • Figure 6a is a diagram showing that after administration of the K280-ac fragment to Tau-P301L demented mice, the antibody against it.
  • Figure 6b is a diagram showing that after administration of the pT231 fragment to Tau-P301L demented mice, antibodies to it.
  • Figure 6c is a diagram showing that after administration of the Glu391 fragment to Tau-P301L dementia mice, the antibody against it.
  • Figure 6d is a diagram showing that after the administration of the K311ac fragment to Tau-P301L demented mice, antibodies to it.
  • Figure 6e is a diagram showing that after the administration of full-length tau protein to Tau-P301L demented mice, antibodies to it.
  • FIG. 7 is a view confirming the behavioral improvement effect of the demented mouse according to the administration of K280-ac fragment through a Fear conditioning experiment.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the behavioral improvement effect of the dementia mouse according to the administration of K280-ac fragment through a vertical test experiment.
  • 10 is a view confirming the behavioral effect of dementia mice according to the administration of K280-ac fragment through a Water maze experiment.
  • Figure 11 is a comparison of antibody production after the first and second administration of the tau protein N-terminal fragment or K280-ac fragment as a vaccine.
  • FIG. 13 is a graph showing behavioral improvement effects of dementia mice according to K280-ac fragment administration in terms of scores through nesting building test experiments.
  • Figure 16 is a graph showing the time conversion effect of the behavioral improvement effect of the demented mouse according to the administration of K280-ac fragment in terms of scores.
  • 17 is a graph showing the effect of improving the behavior of dementia mice following the administration of K280-ac fragment in terms of rotational speed (rpm) measured through a Rota-rod experiment.
  • 18 is a view confirming the effect of behavioral improvement of dementia mice according to the administration of K280-ac fragment through the Y-maze experiment.
  • 19 is a diagram confirming the behavioral improvement effect of dementia mice following the administration of K280-ac fragment through a Novel object recognition experiment.
  • 20 is a diagram showing the effect of improving the depression of the dementia mice according to the administration of K280-ac fragment by measuring the immobility of the forced swimming test experiment.
  • 21 is a diagram showing the effect of improving the depression of dementia mice in accordance with the administration of K280-ac fragment by measuring the swimming of the forced swimming test experiment.
  • FIG. 22 is a diagram illustrating the effect of improving the depression of dementia mice following the administration of K280-ac fragment by measuring climbing in a forced swimming test experiment.
  • FIG. 22 is a diagram illustrating the effect of improving the depression of dementia mice following the administration of K280-ac fragment by measuring climbing in a forced swimming test experiment.
  • FIG. 23 shows total tau protein (Tau 5), phosphorylated tau protein (pSer396, pThr231) and acetylated tau protein in brain tissue of normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice.
  • Ace-K280 is a view confirming the reduction effect.
  • Figure 24 shows phosphorylated tau protein (pThr231) or acetylated tau protein (Ace-) versus total tau protein (Tau 5) in brain tissue of normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice. It is a figure which shows the ratio of K280).
  • FIG. 25 shows the expression of whole tau protein (Tau 5) and phosphorylated tau protein (pThr231) by immunohistochemical staining after brain tissue from normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice. It is a photograph confirming the quantity.
  • Figure 26 shows the expression of whole tau protein (Tau 5) and phosphorylated tau protein (pThr231) by immunohistochemical staining after brain tissue from normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice. It is a graph showing the quantity.
  • FIG. 27 shows cerebral cortical fractions after extraction of brain tissue from normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm changes in aggregated tau protein following K280-ac fragment administration.
  • Figure 28 is a brain to confirm the changes in the aggregated tau protein of normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the changes of aggregated tau protein following K280-ac fragment administration
  • the cerebral cortex fraction insoluble was analyzed by Western blot for expression of total tau protein (Tau 5), phosphorylated tau protein (pSer396, pThr231) and acetylated tau protein (Ace-K280). to be.
  • FIG. 30 shows IFN- which is an inflammation-related gene through qPCR after extraction of brain tissues from normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the effect of improving inflammation following K280-ac fragment administration. It is a graph which confirmed the expression amount of (gamma).
  • FIG. 31 shows the brain tissues of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice in order to confirm the effects of inflammation on the administration of K280-ac fragments. It is the graph which confirmed the expression amount of 12.
  • FIG. 32 shows the brain tissues of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice in order to confirm the improvement of inflammation following K280-ac fragment administration. It is the graph which confirmed the expression amount of 4.
  • FIG. 33 shows the brain tissues of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice in order to confirm the effects of inflammation on K280-ac fragment administration. It is the graph which confirmed the expression amount of 22.
  • FIG. 34 shows immunohistochemistry after extraction of brain tissue from normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the distribution in the brain tissue of antibodies produced by K280-ac fragment administration. It is a photograph confirmed through dyeing.
  • FIG. 35 shows the western blot of brain tissues of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice in order to confirm the distribution in the brain tissues of antibodies produced by K280-ac fragment administration. This is a drawing confirmed through.
  • FIG. 36 shows ROI (Region of interest) as a hippocampus for normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the effect of improving image / metabolism index according to K280-ac fragment administration.
  • ROI Region of interest
  • FIG. 37 shows NA-N-acetyl-aspartyl-glutamic acid (NAAG) of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the effects of imaging / metabolic index improvement following K280-ac fragment administration. It is a graph showing the concentration.
  • NAAG NA-N-acetyl-aspartyl-glutamic acid
  • FIG. 38 is a graph showing FA (fractional anisotrophy) values of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the effect of improving the image / metabolism index according to K280-ac fragment administration.
  • FIG. 39 is a graph showing mean diffusivity (MD) values of normal mice, Tau-P301L dementia mice, and Tau-P301L-K280-ac dementia mice in order to confirm an image / metabolism index improvement effect according to K280-ac fragment administration.
  • MD mean diffusivity
  • FIG. 40 is a diagram measuring the expression level of GCP-II in normal mice, Tau-P301L dementia mice and Tau-P301L-K280-ac dementia mice to confirm the effect of reducing GCP-II following administration of K280-ac fragment.
  • the present invention provides mutated tau protein fragments having the following 12 amino acid sequences.
  • the sixth amino acid lysine is acetylated.
  • the mutated tau protein fragment is Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp (SEQ ID NO: 277-283 amino acid sequence acetylated 280th amino acid of the amino acid sequence of the tau protein represented by SEQ. No. 5) or Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu (SEQ ID NO: 6), which is the 278-284th amino acid sequence obtained by acetylating the 280th amino acid sequence of the tau protein represented by SEQ ID NO: 2). It may be a mutated tau protein fragment having seven amino acid sequences.
  • tau protein used in the present invention means a protein that is composed of 441 amino acids and stabilizes microtubules, which are proteins that transport cellular materials. When a mutation occurs in the tau protein, the tau protein may be hyperphosphorylated to abnormally accumulate neurofibrillary tangles (NFTs) in nerve cells, thereby causing degenerative neurological diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • NFTs neurofibrillary tangles
  • the mutated tau protein fragments can be readily prepared by known protein preparation techniques.
  • the mutated tau protein fragment is subjected to acetylation of the 280th amino acid of the full-length tau protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and then treated with a suitable restriction enzyme so as to become a fragment having the 275-286th amino acid sequence.
  • the mutated tau protein fragment may be prepared by preparing a tau protein fragment having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and then acetylating the sixth amino acid, but is not limited thereto.
  • the mutated tau protein fragment is transfected into a host cell with an expression vector comprising a gene encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; Culturing the transfected host cell; Obtaining tau protein fragments from the culture; And acetylating lysine, the sixth amino acid, of the obtained tau protein fragment.
  • the host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell. More specifically, the prokaryotic cell may be Escherichia coli (E. coli) or yeast (Yeast).
  • the eukaryotic cells may be NS / 0 myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid derived cells) or COS cells.
  • the transfection may be transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection ( DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection or electroporation, gene gun.
  • the present invention provides a vaccine composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the mutated tau protein fragment of the present invention as an active ingredient.
  • the degenerative neurological disease may be a tau protein mediated neurological disease.
  • the tau protein mediated neurological disease may be Alzheimer's disease or Parkinson's disease.
  • tauopathy is primary age-related tauopathy, chronic traumatic encephalopathy, progressive supranuclear palsy, cortical basal degeneration (corticobasal) degeneration, frontotemporal dementia, Lytico-Bodig disease, Parkinson's disease, subacute sclerosis meningitis, lead encephalopathy, tuberous sclerosis, Ganglioglioma, gangliocytoma, Meningioangiomatosis, subacute sclerosing panencephalitis, Hallervorden-Spatz disease, lipofucinosis.
  • tauopathy is primary age-related tauopathy, chronic traumatic encephalopathy, progressive supranuclear palsy, cortical basal degeneration (corticobasal) degeneration, frontotemporal dementia, Lytico-Bodig disease, Parkinson's disease, subacute sclerosis meningitis, lead encephalopathy, tuberous sclerosis, Ganglioglioma, gangliocytoma, Meningioang
  • the tau disease is also a group of related disorders collectively referred to as Alzheimer's disease (AD), peak disease (PiD), prefrontal temporal dementia (FTDP-17) with Parkinsonism associated with chromosome 17, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), boxer dementia (DP), Gerstmann-Straussler-Shinker disease (GSSD), Lewy body disease, chronic traumatic encephalopathy (CTE), spinal cord injury, Epilepsy or Huntington's disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • PiD peak disease
  • FTDP-17 prefrontal temporal dementia
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • CJD Creutzfeldt-Jakob disease
  • DP boxer dementia
  • GSSD Gerstmann-Straussler-Shinker disease
  • CTE chronic traumatic encephalopathy
  • spinal cord injury Epilepsy or Huntington's disease.
  • the vaccine composition may further comprise one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carriers, diluents and adjuvants.
  • suitable carriers for the vaccine are known to those skilled in the art and may include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like.
  • Such carriers can be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • non-aqueous carriers may be propylene glycol, polyethylene glycol, edible oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous carriers may comprise water, alcohol / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media.
  • Parenteral carriers may include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactically treated Ringer's or fixed oils.
  • Intravenous carriers may include electrolyte supplements such as those based on Ringer's dextrose, liquids and nutritional supplements, and the like.
  • Preservatives and other additives such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases and the like may further be present.
  • Preferred preservatives may include formalin, thimerosal, neomycin, polymyxin B and amphotericin B.
  • the vaccine composition may further comprise an adjuvant (adjuvant, immunoadjuvant).
  • adjuvant refers to a compound or mixture that enhances the immune response and / or promotes the rate of absorption after inoculation and may include any absorption-promoting agent.
  • Acceptable adjuvants include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, saponins, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lyso lecithin, pluron polyols, polyanions, peptides, oils or hydrocarbon emulsions, keyhole rimpets It may include, but is not limited to, mocyanine, dinitrophenol, and the like.
  • the vaccine composition can be administered via any one of the routes of administration selected from the group consisting of transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous or nasal, preferably by injection.
  • the vaccine composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to exhibit a vaccine effect, and an amount that does not cause side effects or serious or excessive immune responses.
  • the level of effective dose can be determined by the disorder to be treated, the severity of the disorder, the activity of the specific compound, the route of administration, the rate of removal of the protein, the duration of treatment, the drug used in combination with or concurrently with the protein, the age, weight, sex, diet, general, general And various factors, including factors known in the medical condition and the medical field.
  • the dosage of the vaccine composition may be determined in consideration of the age, sex, condition, absorbency of the active ingredient, inactivation rate, and the drug in combination in the patient, and 0.0001 mg /% based on the modified tau protein fragment. It may be administered in kg (body weight) to 100 mg / kg (body weight).
  • the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds to the mutated tau protein fragment of the present invention.
  • antibody refers to an immunoprotein that binds to an antigen and interferes with its action or removes the antigen.
  • IgM immunoglobulins
  • IgD immunoglobulins
  • IgG immunoglobulins
  • IgA immunoglobulins
  • IgE immunoglobulins-like molecules
  • the IgG forms a Y-shaped highly stable structure (molecular weight, about 150 kDa) consisting of two heavy chain (about 50 kDa) proteins and two light chain (about 25 kDa) proteins.
  • the light and heavy chains of an antibody are divided into variable regions with different amino acid sequences and constant regions with the same amino acid sequence.
  • In the heavy chain constant region there are CH1, H (hinge), CH2, CH3 domains. Each domain consists of two ⁇ -sheets and is linked by intramolecular disulfide bonds. Two variable regions of the heavy and light chains are combined to form an antigen binding site.
  • the site is one in each of the two Y-shaped arms, which can bind to such antigens are called Fab (antibody binding fragment), and the sites that cannot bind antigen are called Fc (crystalizable fragment).
  • Fab and Fc are connected by a flexible hinge region.
  • CDR used in the present invention is a hypervariable region, which is a site having an amino acid sequence for each antibody in the heavy and light chain variable regions of the antibody, and means a site that binds to the antigen. Looking at the conformation of the antibody, the CDRs have a loop shape on the surface of the antibody, and under the ring, there is a framework region (FR) that structurally supports it. There are three ring structures in the heavy and light chains, respectively, and these six ring region structures merge with each other to make direct contact with the antigen.
  • the antibody fragment may be any one selected from the group consisting of Fab, scFv, F (ab) 2 and Fv.
  • Antibody fragments refer to antigen-binding domains, except for the Fc region, which functions as an effector function to transfer antigen-stimulating binding to cells, complement, etc., and is a single domain antibody or a minibody. 3rd generation antibody fragments), and the like.
  • the antibody fragment is smaller in size than the IgG of a complete structure, the penetration rate into the tissue or tumor is good, and since the antibody fragment can be produced by bacteria, there is an advantage of low production cost.
  • the antibody fragment is used when there is no Fc, and it is used when the function of transferring the binding stimulus with the antigen is not desired.
  • Antibody fragments are suitable for diagnostic purposes because of their short half-life in the human body, but the replacement of some basic, acidic or neutral amino acids among the amino acids that make up an antibody can alter its unique isoelectric point (pI). have. Since the isoelectric point change of the antibody can induce changes such as reducing the toxic side effects of the antibody in vivo or increasing the water solubility, the therapeutic antibody can be used with a fully structured IgG in consideration of affinity or structural form.
  • the antibody can be easily prepared by known monoclonal antibody production techniques.
  • the method for producing monoclonal antibodies may be performed by preparing hybridomas using B lymphocytes obtained from immunized animals or by using phage display technology, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a vector comprising a nucleotide sequence encoding the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the present invention provides a host cell transfected with the vector of the present invention.
  • the host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell. More specifically, the prokaryotic cell may be Escherichia coli (E. coli) or yeast (Yeast).
  • the eukaryotic cells may be NS / 0 myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid derived cells) or COS cells.
  • the transfection may be transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection ( DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection or electroporation, gene gun.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient.
  • tauopathy is primary age-related tauopathy, chronic traumatic encephalopathy, progressive supranuclear palsy, cortical basal degeneration (corticobasal) degeneration, frontotemporal dementia, Lytico-Bodig disease, Parkinson's disease, subacute sclerosis meningitis, lead encephalopathy, tuberous sclerosis, Ganglioglioma, gangliocytoma, Meningioangiomatosis, subacute sclerosing panencephalitis, Hallervorden-Spatz disease, lipofucinosis.
  • tauopathy is primary age-related tauopathy, chronic traumatic encephalopathy, progressive supranuclear palsy, cortical basal degeneration (corticobasal) degeneration, frontotemporal dementia, Lytico-Bodig disease, Parkinson's disease, subacute sclerosis meningitis, lead encephalopathy, tuberous sclerosis, Ganglioglioma, gangliocytoma, Meningioang
  • the tau disease also includes Alzheimer's disease (AD), a group of related disorders collectively referred to as frontal temporal dementia (FTDP-17) with Parkinsonism associated with chromosome 17, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), boxer dementia (DP), Gerstmann-Straussler-Shinker disease (GSSD), Lewy body disease, chronic traumatic encephalopathy (CTE), spinal cord injury, epilepsy or Huntington's disease
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and adjuvant.
  • Suitable carriers for the vaccine are known to those skilled in the art and may include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like. Such carriers can be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of non-aqueous carriers may be propylene glycol, polyethylene glycol, edible oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous carriers may comprise water, alcohol / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media.
  • Parenteral carriers may include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactically treated Ringer's or fixed oils.
  • Intravenous carriers may include electrolyte supplements such as those based on Ringer's dextrose, liquids and nutritional supplements, and the like.
  • Preservatives and other additives such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases and the like may further be present.
  • Preferred preservatives may include formalin, thimerosal, neomycin, polymyxin B and amphotericin B.
  • the pharmaceutical composition may further comprise an adjuvant (adjuvant, immunoadjuvant).
  • adjuvant refers to a compound or mixture that enhances the immune response and / or promotes the rate of absorption after inoculation and may include any absorption-promoting agent.
  • Acceptable adjuvants include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, saponins, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lyso lecithin, pluron polyols, polyanions, peptides, oils or hydrocarbon emulsions, keyhole rimpets It may include, but is not limited to, mocyanine, dinitrophenol, and the like.
  • the pharmaceutical composition may be administered via any one of administration routes selected from the group consisting of transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous or nasal, and is preferably administered by injection.
  • the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to exhibit a vaccine effect, and an amount that does not cause side effects or serious or excessive immune responses.
  • the level of effective dose can be determined by the disorder to be treated, the severity of the disorder, the activity of the specific compound, the route of administration, the rate of removal of the protein, the duration of treatment, the drug used in combination with or concurrently with the protein, the age, weight, sex, diet, general, general And various factors, including factors known in the medical condition and the medical field.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is preferably determined in consideration of the age, sex, condition, absorption of the active ingredient, inactivation rate and the drug used in combination with the patient, and 0.0001 mg / kg based on the antibody or fragment thereof. (Body weight) to 100 mg / kg (body weight).
  • the present invention provides a method for preventing or treating degenerative neurological disease, comprising administering the vaccine composition or pharmaceutical composition of the present invention to a subject in anticipated or developing a neurodegenerative disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating depression due to neurodegenerative diseases comprising the mutated tau protein fragment of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing degenerative neurological disease, including an agent for detecting a mutated tau protein or a gene encoding the same.
  • the agent to be detected may be an antibody that binds to the mutated tau protein.
  • the antibody is as described above.
  • Analytical methods for determining the amount of mutated tau protein bound thereto using the antibody include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and radioimmunodiffusion (radioimmunodiffusion). , Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS) , Protein chips, etc., but is not limited thereto.
  • the agent to be detected may be a primer or probe capable of complementarily binding to a gene encoding a mutated tau protein.
  • the primer or probe may be a nucleotide having 10 to 25 consecutive base sequences that complementarily bind in the 5'-end to 3'-end direction of the nucleotide sequence of the mutated tau protein.
  • primers or probes that specifically bind to mutated tau proteins include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assays (RPA; It can be used in methods such as RNase protection assay, northern blotting, gene chip analysis and the like.
  • the term "primer” refers to a nucleic acid sequence having a free 3 'hydroxyl group, capable of forming complementary templates and base pairs, and for template strand copying. By a short nucleic acid sequence that functions as a starting point. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization in the appropriate buffer solution and temperature. In this case, the reagent for the polymerization may be DNA polymerase or reverse transcriptase.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which corresponds to a few bases to several hundred bases, which can achieve specific binding with a gene or mRNA.
  • probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like, and may be labeled for easier detection. It is not limited to this.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods.
  • Such nucleic acids can also be modified using many means known in the art. Examples of such modifications may be methylation, capping, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides.
  • nucleic acid sequences of the present invention can be modified with a label that can directly or indirectly provide a detectable signal.
  • the label may be a radioisotope label, a fluorescent molecule label, a biotin label.
  • the degenerative neurological disease is as described above in the vaccine composition or pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a neurodegenerative diagnosis kit comprising a composition for diagnosing a neurodegenerative disease of the present invention.
  • the kit can be used to measure mRNA or protein expression of mutated tau protein from a subject's sample to diagnose neurodegenerative diseases.
  • primers or probes and antibodies for measuring mRNA or protein levels of the mutated tau protein may be included, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the kit for diagnosing neurodegenerative disease of the present invention may include essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kits include enzymes such as test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, in addition to each primer pair specific for the mutated tau protein gene, DNase, RNAse inhibitors, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • the present invention comprises the steps of: i) measuring the expression level of the modified tau protein acetylated at the 280th amino acid in a sample isolated from an individual suspected of degenerative neurological disease;
  • ii) comparing the mutated tau protein expression level with the mutated tau protein expression level of the normal control sample; And iii) when the mutated tau protein expression level is higher than that of the control group, determining that the individual has a high incidence of degenerative neuropathy.
  • sample used in the present invention is a sample such as tissue, cells, blood, plasma with different amounts of mRNA or protein expression of the mutated tau protein. And the like, but are not limited thereto.
  • Measuring the mRNA may include reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (competitive RT-PCR), real time quantitative RT-PCR, RNase protection assay ( RNase protection method, northern blotting or gene chip, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase reaction
  • competitive RT-PCR competitive reverse transcriptase polymerase reaction
  • real time quantitative RT-PCR RNase protection assay
  • RNase protection method RNase protection method, northern blotting or gene chip, but is not limited thereto.
  • the step of measuring the protein is Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip It may be measured by, but is not limited thereto.
  • the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group can be compared with the amount of antigen-antibody complex formation in the individual. You can judge.
  • the term “antigen-antibody complex” refers to a combination of a mutated tau protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed is determined quantitatively through the magnitude of a signal of a detection label. It is possible.
  • a detection label can be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • the present invention provides the use of the vaccine composition of the present invention for preventing or treating degenerative neurological diseases.
  • the present invention also provides the use of the pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating degenerative neurological diseases.
  • the present invention provides the use of the vaccine composition of the present invention for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases.
  • the present invention also provides the use of the pharmaceutical composition of the present invention for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases.
  • mutated tau protein fragments were selected from the amino acid sequence of tau protein consisting of 441 amino acids, which are thought to act as the pathogenesis of Alzheimer's disease. As shown in FIG. 1, 12 amino acid sequence segments of the amino acid sequences of four mutated tau protein fragments located in the microtubule domain were designated.
  • a protein fragment having an amino acid sequence of 275 to 286 and an acetylated 280th amino acid in the tau protein amino acid sequence was designated as K280-ac, a protein having an amino acid sequence of 226 to 236 and a phosphorus of 231 amino acid.
  • the fragment was named pT231.
  • the protein fragment having the 381 to 391 amino acid sequence interval of the tau protein amino acid sequence and the C-terminal truncation of the 391th amino acid was named Glu391, and the 303 to 316 amino acid sequence interval and the 306 to 311th protein fragment.
  • the protein fragment whose amino acid was acetylated was named VQIVYK-ac.
  • the K280-ac, pT231, Glu391, and VQIVYK-ac protein fragments were prepared by ordering from Peptron Co., Ltd.
  • mutated tau protein fragments prepared in Preparation Example 1 were actively immunized by administration to Tau-P301L dementia mice, followed by memory tests such as Fear conditioning test, Morris water maze test, Grip strength test, and vertical test. An exercise test was performed to compare the improvement effect of each mutated tau protein fragment. Of the four mutated tau protein fragments, the K280-ac fragment showed an improvement similar to that of normal mice.
  • JNPL3 mice expressing the Tau-P301L mutant gene were purchased from Tanonic Corporation and back-crossed over five generations with C57bl / 6 mice in the animal laboratory of Asan Life Science Research Institute. Thereafter, the animals were bred under conditions of specific pathogen free (SPE).
  • SPE specific pathogen free
  • Tau protein fragments were administered with carriers, keyholelimpet hemocyanin (KLH) and aluminum adfuvant. At this time, the administration was administered through intraperitoneal injection (IP injection). Actively-immunized demented mice with the K280-ac fragment were named Tau-P301L-K280-ac.
  • mice wild type 2N4R
  • Tau mutant mice hereinafter, Tau-P301L
  • the Tau-P301L dementia mouse model used in the experiment showed a difference in the accumulation of tau protein with aging compared to normal mice. Specifically, the dementia mouse model at 4 months of age shows similar levels of tau protein as normal mice, but the 12 month dementia mouse model with severe dementia symptoms expresses tau protein nearly twice that of normal mice. It was confirmed. It was confirmed that the amount of acetylated tau protein of the 12-month-old demented mouse model was increased by immunoblotting using the ADEL-Y01h antibody prepared in Preparation Example 2 (FIGS. 2 and 3). In addition, it was confirmed by immunoblotting that the 280th amino acid lysine tau protein in dementia mouse model was increased through immunohistochemical staining in hippocampus, which is important for cognitive function (Fig. 4 and Fig. 4). 5).
  • mice bred in Preparation Example 2 were tamed by the process of holding each mouse for 5 minutes every day for three consecutive days and moving them in the hand.
  • mice were placed in training for 10 minutes to get used to them. Specifically, the mouse was placed in an experimental cage, and the experiment was repeated three times to give an electrical stimulation to the floor immediately after hearing the beep, so that the mouse became a fear conditional learning about the beep. All tests were recorded on Limelight (Actimetrics) and computers.
  • mice were placed in the experimental cage again for 10 minutes and the baseline freeze reaction time was measured while beeping. At this time, the freezing reaction is a state in which there is no movement other than the action for the animal to breathe. Then, the bottom of the box was washed several times and wiped again with ethanol to remove all the smell of the mouse. At the same time, the doors of the boxes were opened and the fans were vented to let air out. Even when only water was used, the same steps were followed for consistency of the situation.
  • the freezing reaction time of the normal mouse was about 150 seconds, and the freezing reaction time of the Tau-P301L demented mouse was within 100 seconds.
  • Tau-P301L-K280-ac dementia mice actively immunized with K280-ac polypeptide exhibited a freeze reaction time of about 150 seconds as in normal mice.
  • freezing reaction time did not recover in demented mice actively immunized with the remaining three mutated tau protein fragments.
  • a grip test was performed to confirm the strength of the mice.
  • the iron ball used in the experiment used behavior equipment provided by Asan Life Science Research Institute.
  • the iron bundle used a 40 g iron bundle. Holding the tail end of the mice prepared in Preparation Example 2, the forefoot of the mouse was placed on the iron bundle so as to grab a 40 g iron bundle. Then, while holding the tail of the mouse to lift the height of about 30cm, the time until the mouse misses the iron ball was measured and compared for each mouse.
  • the grip force measurement time of the normal mouse was less than 10 seconds, and the grip force measurement time of the Tau-P301L dementia mouse was within 5 seconds.
  • Tau-P301L-K280-ac dementia mice were measured at about 12 seconds longer than the grip time of normal mice.
  • the biomeasurement time did not increase significantly. This confirmed that the grip strength of Tau-P301L-K280-ac dementia mice was restored to the level of normal mice.
  • mice were bred in Preparation Example 2.
  • the vertical grid used behavioral equipment provided in the laboratory animal laboratory of Asan Life Science Research Institute. Specifically, the mice were placed on a vertical grid apparatus and the vertical grid was raised and lowered to measure the time until falling on the grid.
  • the vertical grid measurement time of the normal mouse was within 10 seconds
  • the vertical grid measurement time of the Tau-P301L dementia mouse was within 5 seconds.
  • dementia mice actively immunized with the remaining three mutated tau protein fragments did not significantly increase the vertical grid measurement time.
  • An underwater maze test was performed to evaluate the learning and memory abilities of mice.
  • the equipment and programs used for the underwater maze test were made using behavioral equipment provided in the laboratory animal laboratory of Asan Life Science Research Institute. Specifically, the underwater maze test takes a total of five days, and the mouse was trained for four days with a cue on the platform and the location of the shelters.
  • the lesson is to fill the pool (1.4 m diameter, 45 cm depth) with water (29 ⁇ 0.5 ° C.) to a depth of about 26.5 cm, and then pour water so that the water can be remembered only with clues. L was added. The mice were then acclimated to swim freely for 60 seconds and left on the shelters for 1 minute. The experiment was carried out a total of 12 times with 4 sets of 3 different starting positions. 30 seconds of rest were given at the end of each test and 30-45 minutes of rest at the end of one set.
  • test time allowed to reach the location where the shelters were in one minute and was pulled out of the pool if they could not reach the shelters location within one minute.
  • the number of arrivals of normal mice was measured about 3 times, and the number of arrivals of Tau-P301L dementia mice was about 1 times.
  • Tau-P301L-K280-ac dementia mice were measured about three times, similar to the number of arrivals of normal mice.
  • the number of mice actively immunized with the Glu391 and VQIVYKac fragments was increased, and the mice that were actively immunized with the pT231 fragment had the lowest number of times of reaching the platform, similar to the Tau-P301L dementia mice. .
  • Rota-rod experiment was performed to confirm the exercise capacity. Specifically, rota-rod was performed for 5 days in order to check the motor ability of the mouse.
  • Y-maze experiments were performed to confirm cognitive recovery. Specifically, A, B, C zones were set in the Y-shaped box, and the mouse was freely moved for 5 minutes while blocking the B zone. After an hour, the box blocking the zone B was removed and the mouse movement was observed for 5 minutes with all zones open. As a result, it was confirmed that the cognitive function of the Tau-P301L-K280-ac dementia mice was restored compared to the Tau-P301L mice in which the measurement time was reduced by 50% compared to the normal mice in Y-maze (FIG. 18).
  • the forced swimming test was conducted to confirm the depression improving effect of Tau-P301L dementia mice prepared in Preparation Example 2.
  • the experiment was conducted for a total of two days. On the first day, the mice were accustomed to this situation for 15 minutes with 2/3 water in a transparent 2 L beaker. Place the mouse in water for 5 minutes under the same conditions as the first day of the second day and observe the movement.
  • the indicators for swimming in the water (Swimming / S), the indicators for climbing up the beaker wall (Climbling / C), and the indicators floating in the water without any movement (Immobility / I) were analyzed.
  • brain tissues of Tau-P301L-K280-ac dementia mice, P301L-K280-ac dementia mice, and normal mice prepared in Preparation Example 2 were extracted and related to inflammation. QPCR was performed on the genes.
  • mice To identify antibodies in brain tissues of Tau-P301L-K280-ac dementia mice, P301L-K280-ac dementia mice, and normal mice prepared in Preparation Example 2, the brain tissues were extracted after cardiac perfusion with cold saline. Immunohistochemical staining and Western blot for mouse immunoglobulin-G were performed.
  • MR spectroscopy of Tau-P301L-K280-ac dementia mice, P301L-K280-ac dementia mice, and normal mice prepared in Preparation Example 2 to confirm the effect of K280-ac fragments (MRS) was performed.
  • Region of interest (ROI) was designated hippocampus (FIG. 36).
  • NAAG N-acetyl-aspartyl-glutamic acid
  • DTI diffusion tensor imaging
  • a test that can assess the degree of structural connectivity or orientation of cerebral white matter is a technique used to evaluate brain damage in early Alzheimer's disease.
  • changes in mean diffusivity mean mean diffusivity and are associated with demylation and diffuse axonal injury, and changes in fractional anisotrophy have been shown to increase structural orientation. it means.
  • FA and MD values were decreased (FIGS. 38 and 39). This confirmed that brain injury occurred in the dementia model mouse and the NAAG level was decreased.
  • GCP-II glutamate carboxypeptidase-2, folate hydrolase 1
  • GCP-II glutamate carboxypeptidase-2, folate hydrolase 1
  • P301L-K280-ac demented mice and normal mice were extracted and Western blots were performed.

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Abstract

본 발명은 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 12개의 아미노산으로 구성되어 제조가 용이하다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편을 항원으로서 개체에 주입할 경우, 변이된 타우 단백질에 대한 중화 항체를 생성한다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 비정상적인 타우 단백질의 응집을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도
본 발명은 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 12개의 아미노산으로 이루어진 변이된 타우 단백질의 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방용 조성물에 관한 것이다.
치매의 발병 형태 중 약 50%에 차지하는 알츠하이머병은 65세 이후로 발병률이 증가하는 퇴행성 뇌신경 질환으로, 인구가 고령화됨에 따라 전세계적으로 급속히 증가하고 있다.
알츠하이머병의 발병 원인으로 β-아밀로이드의 축적, 타우 단백질의 과인산화 또는 프리세닐린 1의 β-아밀로이드 생산 증대가 중요한 역할을 할 것으로 여겨져 왔다. 그 중, β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 알츠하이머성 치매의 주요한 발병 원인일 것으로 생각되어 왔다(Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992). 하지만, 일라이릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Company)의 알츠하이머 신약 후보물질인 솔라네주맙(solanezumab)의 3상 임상실험이 실패하면서 β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 크지 않음이 밝혀졌다. 이에 따라 타우 단백질의 비정상적인 과인산화가 알츠하이머병의 발병 원인으로 작용하여 발병할 것이라는 의견에 초점이 모아지고 있다.
타우 단백질은 세포물질을 수송하는 단백질인 미세소관(microtubule)을 안정화시키는 단백질이다. 타우 단백질은 인체 내에서 6개의 동형(isoform)으로 존재하며 중추신경계의 뉴런에 풍부하게 존재한다. 또한, 타우 단백질에 돌연변이가 발생하는 경우, 타우 단백질이 과인산화되어 신경세포 내에 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFTs)을 비정상적으로 축적시켜 치매 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011).
하지만, 441개의 아미노산으로 구성되어 있는 인간 타우 단백질은 단백질 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어날 수 있는 곳이 매우 다양하여 타우 단백질 내 치매의 예방 또는 치료 효과를 보이는 표적 부분을 발굴하는데 어려움을 겪고 있다. 따라서, 타우 단백질을 표적으로 하는 퇴행성 신경 질환의 백신 또는 치료제 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 효과적인 퇴행성 신경 질환의 백신 및 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 12개의 아미노산으로 구성된 변이된 타우 단백질 단편이 효과적으로 중화항체를 생성하고, 상기 단편이 타우 단백질의 응집을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 치매 유발 동물모델을 이용한 실험에서 상기 단편을 투여 받은 동물모델의 운동능력 및 인지능력이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명은 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 벡터를 형질주입시킨 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 백신 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 12개의 아미노산으로 구성되어 제조가 용이하다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편을 항원으로서 개체에 주입할 경우, 변이된 타우 단백질에 대한 중화 항체를 생성한다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 비정상적인 타우 단백질의 응집을 억제한다. 따라서, 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편은 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 제조한 변이된 타우 단백질 단편들의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 전체 타우 단백질 및 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 3은 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 전체 타우 단백질 및 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 면역조직화학염색을 통해 나타낸 사진이다.
도 5는 시간이 경과함에 따라 Tau-P301L 치매 마우스에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 타우 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6a은 Tau-P301L 치매 마우스에 K280-ac 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6b은 Tau-P301L 치매 마우스에 pT231 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6c은 Tau-P301L 치매 마우스에 Glu391 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6d는 Tau-P301L 치매 마우스에 K311ac 단편을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 6e는 Tau-P301L 치매 마우스에 전장의 타우 단백질을 투여한 후, 이에 대한 항체가 생성되었는지 확인한 도면이다.
도 7은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Fear conditioning 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 8은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Strength test 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 9는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 vertical test 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 10은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Water maze 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 11은 타우 단백질 N-말단 단편 또는 K280-ac 단편을 백신으로서 1차 및 2차 투여한 후 항체 생성량을 비교한 도면이다.
도 12는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 nesting building test 실험을 통해 확인한 사진이다.
도 13은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 nesting building test 실험을 통해 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스와 정상 마우스의 트레이닝 패턴(sec)을 나타낸 도면이다.
도 15는 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스와 정상 마우스의 트레이닝 패턴(rpm)을 나타낸 도면이다.
도 16은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Rota-rod 실험을 통해 측정한 시간을 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Rota-rod 실험을 통해 측정한 회전수(rpm)를 점수로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Y-maze 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 19는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 행동개선 효과를 Novel object recognition 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 20은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 immobility를 측정하여 확인한 도면이다.
도 21은 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 swimming을 측정하여 확인한 도면이다.
도 22는 K280-ac 단편 투여에 따른 치매 마우스의 우울증 개선 효과를 forced swimming test 실험의 climbing을 측정하여 확인한 도면이다.
도 23은 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서의 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 경감효과를 확인한 도면이다.
도 24는 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서의 전체 타우 단백질(Tau 5) 대비 인산화된 타우 단백질(pThr231) 또는 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 비율을 나타낸 도면이다.
도 25는 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 면역조직화학염색하여 전체 타우 단백질(Tau 5) 및 인산화된 타우 단백질(pThr231)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 26은 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 면역조직화학염색한하여 전체 타우 단백질(Tau 5) 및 인산화된 타우 단백질(pThr231)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 27은 K280-ac 단편 투여에 따른 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 대뇌 피질 분획(soluble)을 웨스턴 블롯을 통해 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 28은 K280-ac 단편 투여에 따른 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 응집된 타우 단백질의 변화를 확인하기 위해 뇌조직을 적출한 후 대뇌 피질 분획(insoluble)을 웨스턴 블롯을 통해 전체 타우 단백질(Tau 5), 인산화된 타우 단백질(pSer396, pThr231) 및 아세틸화된 타우 단백질(Ace-K280)의 발현량을 확인한 사진이다.
도 29는 K280-ac 단편 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 웨스턴 블롯을 통해 시냅스 관련 단백질들의 발현량을 확인한 사진이다.
도 30은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IFN-γ의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 31은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-12의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 32는 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-4의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 33은 K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후 qPCR을 통해 염증 관련 유전자인 IL-22의 발현량을 확인한 그래프이다.
도 34는 K280-ac 단편 투여로 생성된 항체의 뇌조직 내 분포를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후, 면역조직화학염색을 통해 확인한 사진이다.
도 35는 K280-ac 단편 투여로 생성된 항체의 뇌조직 내 분포를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직을 적출한 후, 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 36은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스를 ROI(Region of interest)를 해마로 지정하여 MR spectroscopy(MRS) 촬영한 사진이다.
도 37은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamic acid) 농도를 나타낸 그래프이다.
도 38은 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 FA(fractional anisotrophy) 값을 나타낸 그래프이다.
도 39는 K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 MD(mean diffusivity) 값을 나타낸 그래프이다.
도 40은 K280-ac 단편 투여에 따른 GCP-II 감소 효과를 확인하기 위해 정상 마우스, Tau-P301L 치매 마우스 및 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 GCP-II 의 발현량을 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편을 제공한다.
Val-Gln-Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu-Ser-Asn (서열번호 1)
상기 6번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 277 내지 283번째 아미노산 서열인 Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp(서열번호 5) 또는 서열번호 2으로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 278 내지 284번째 아미노산 서열인 Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu(서열번호 6)와 같이 7개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "타우 단백질"이란, 441개의 아미노산으로 구성되며, 세포물질을 수송하는 단백질인 미세소관(microtubule)의 안정화시키는 단백질을 의미한다. 상기 타우 단백질에 돌연변이가 발생하는 경우, 타우 단백질이 과인산화되어 신경세포 내에 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFTs)을 비정상적으로 축적시켜 알치하이머병 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환을 유발할 수 있다.
상기 변이된 타우 단백질 단편은 공지의 단백질 제조 기술로 용이하게 제조될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 전장의 타우 단백질의 280번째 아미노산을 아세틸화 시킨 후, 275 내지 286번째 아미노산 서열을 갖는 단편이 되도록 적합한 제한효소를 처리하여 제조될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 타우 단백질 단편을 제조한 후 6번째 아미노산을 아세틸화시켜 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 변이된 타우 단백질 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포로 형질주입하는 단계; 형질주입된 숙주세포를 배양하는 단계; 배양물로부터 타우 단백질 단편을 수득하는 단계; 및 수득된 타우 단백질 단편의 6번째 아미노산인 라이신을 아세틸화 시키는 단계를 포함하는 제조방법을 통해 제조할 수 있다.
상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)일 수 있다. 상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection) 또는 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun)을 통해 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 알츠하이머병 또는 파킨슨병일 수 있다.
구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환(Tauopathy)은 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 리포푸신증(lipofuscinosis)일 수 있다.
또한, 상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병일 수 있다.
상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.
수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 아주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 아주번트로는 프로인트 완전 아주번트, 프로인트 불완전 아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.
상기 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. "치료상 유효량"의 결정시, 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
상기 백신 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 변이된 타우 단백질 단편을 기준으로 하였을 때 0.0001mg/kg(체중) 내지 100mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편에 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "항체"란, 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε으로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 동종(isotype)이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 상이할 수 있다.
상기 IgG는 중쇄(heavy chain, 약 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 약 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 약 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있다. 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-시트(sheet)로 구성되어 있고 분자 내 이화항결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성된다. 상기 부위는 Y자 모양의 두 개의 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 경첩 부위(hinge region)로 연결되어 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다. 항체의 입체구조를 살펴보면, CDR은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉한다.
또한, 상기 항체 절편은 Fab, scFv, F(ab)2 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 항체 절편은 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능(effector function)을 하는 결정가능 영역(Fc region)을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 단일 도메인 항체(single domain antibody)나 소형 항체(minibody) 등과 같은 3세대 항체 절편을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체 절편은 완전한 구조의 IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있다. 또한, 상기 항체 절편은 Fc가 없기 때문에 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체 절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point, pI)이 바뀔 수 있다. 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 완전한 구조의 IgG를 사용할 수 있다.
상기 항체는 공지의 단일클론 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행되거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 벡터가 형질주입된 숙주세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)일 수 있다. 상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection) 또는 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun)을 통해 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환(Tauopathy)은 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 리포푸신증(lipofuscinosis)일 수 있다.
또한, 상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병일 수 있다.상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.
수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 아주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 아주번트로는 프로인트 완전 아주번트, 프로인트 불완전 아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 항체 또는 이의 절편을 기준으로 하였을 때 0.0001mg/kg(체중) 내지 100mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 백신 조성물 또는 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 변이된 타우 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 상술한 바와 같다.
상기 항체를 이용하여 이와 결합한 변이된 타우 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 변이된 타우 단백질의 염기서열 중 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 상보적인 결합을 하는 10개 내지 25개의 연속적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 변이된 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(northernblotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, 중합반응을 위한 시약은 DNA 중합효소 또는 역전사효소일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 이러한 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형일 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 서열을 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 표지는 방사성 동위원소 표지, 형광성 분자 표지, 바이오틴 표지일 수 있다.
상기 퇴행성 신경 질환은 백신 조성물 또는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.
본 발명은 본 발명의 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 키트를 제공한다.
상기 키트는 퇴행성 신경 질환을 진단하기 위해 개체의 시료로부터 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 발현량을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 및 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 퇴행성 신경 질환 진단용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는, 변이된 타우 단백질 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명은 i) 퇴행성 신경 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
ii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량과 정상 대조군 시료의 변이된 타우 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 퇴행성 신경 질환 발병 확률이 높다는 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
개체로부터 시료를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 "시료"란 변이된 타우 단백질의 mRNA 또는 단백질 발현량이 차이 나는 조직, 세포, 혈액, 혈장 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 mRNA를 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 유전자 칩을 이용해 측정할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS, 단백질 칩에 의하여 측정하는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서 항원-항체 복합체의 형성량과 개체에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 오존 노출 여부를 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 변이된 타우 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 등이 있다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
I. 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 항체 제조
제조예 1. 변이된 타우 단백질 단편 제조
변이된 타우 단백질 단편을 제조하기 위하여, 441개의 아미노산으로 이루어진 타우 단백질의 아미노산 서열 중 알츠하이머병의 병인기전으로 작용할 것으로 추정되는 4개의 변이된 타우 단백질 단편을 선별하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 미세소관(microtubule) 도메인에 위치한 4개의 변이된 타우 단백질 단편의 아미노산 서열 중 12개의 아미노산 서열 구간을 지정하였다.
구체적으로, 타우 단백질 아미노산 서열 중 275 내지 286번째 아미노산 서열 구간을 가지며 280번째 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편을 K280-ac로 명명하였고, 226 내지 236번째 아미노산 서열 구간을 가지며 231번째 아미노산이 인산화된 단백질 단편을 pT231로 명명하였다. 또한, 타우 단백질 아미노산 서열 중 381 내지 391번째 아미노산 서열 구간을 가지며 391번째 아미노산의 C-말단이 절단(truncation)된 단백질 단편을 Glu391로 명명하였으며, 303 내지 316번째 아미노산 서열 구간을 가지며 306 내지 311번째의 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편을 VQIVYK-ac로 명명하였다. 상기 K280-ac, pT231, Glu391 및 VQIVYK-ac 단백질 단편은 (주) 펩트론에 주문 의뢰하여 제작하였다.
II. 동물모델을 이용한 변이된 타우 단백질 단편의 치료효과 확인
제조예 1.에서 제조한 4가지의 변이된 타우 단백질 단편을 Tau-P301L 치매 마우스에 투여하여 능동면역된 후, Fear conditioning test, Morris water maze test 등의 기억력 테스트, Grip strength test, Vertical test 등의 운동능력 테스트 등을 수행하여 각각의 변이된 타우 단백질 단편별 개선효과를 비교하였다. 상기 4가지 변이된 타우 단백질 단편 중, K280-ac 단편에서 정상 마우스와 유사한 정도의 개선 효과를 나타내었다.
제조예 2. 치매 마우스 모델 준비 및 능동면역
Tau-P301L 돌연변이 유전자를 발현하는 JNPL3 마우스를 Tanonic사로부터 구입하여 아산생명과학 연구원 동물실에서 C57bl/6 마우스와 5대에 걸쳐 back-crossing을 진행하였다. 그 후, 무특이병원체(specific pathogen free, SPE)의 조건에서 사육하였다. 능동면역을 위해 태어난 지 3개월이 될 때부터 6개월간, 차례대로 2주, 2주, 4주, 4주, 5주, 4주 및 1주의 간격으로 제조예 1.에서 제조한 4개의 변이된 타우 단백질 단편을 담체(carrier)인 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyholelimpet hemocyanin, KLH) 및 알루미늄 아주반트(adfuvant)와 함께 투여하였다. 이때, 투여는 복강내주사(intraperitoneal injection, IP injection)를 통해 투여하였다. K280-ac 단편을 투여하여 능동면역된 치매 마우스를 Tau-P301L-K280-ac로 명명하였다.
이중 대조군으로 사용될 정상 마우스(wild type 2N4R)와 Tau 돌연변이 마우스(이하, Tau-P301L)에는 KLH와 알루미늄 아주반트만을 투여하였다.
실험예 2. 치매 마우스 모델 특성 확인
실험에 사용된 Tau-P301L 치매 마우스 모델은 정상 생쥐에 비해, 노화에 따라 타우 단백질의 축적의 차이를 나타내었다. 구체적으로, 생후 4개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스와 유사한 수준의 타우 단백질 발현을 보이고 있으나, 중증의 치매증상을 보이는 12개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스에 비해 약 2배 가까운 타우 단백질을 발현하는 것을 확인하였다. 제조예 2.에서 제조한 ADEL-Y01h 항체를 이용한 면역 블롯팅에 의해 12개월 된 치매 마우스 모델의 아세틸화된 타우 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3). 또한, 인지기능에 중요한 해마(hippocampus) 부위에서도 면역조직화학염색을 통해 치매 마우스 모델에서의 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우단백질이 증가된 것을 면역 블롯팅을 통해 확인하였다(도 4 및 도 5).
실험예 3. 변이된 타우 단백질 단편에 대한 항체 생성 확인
제조예 1. 에서 제조한 4개의 변이된 타우 단백질 단편에 대한 항체가 형성되었는지 확인하기 위해, 각각의 변이된 타우 단백질 단편 또는 전장의 타우 단백질을 마지막으로 투여한 후 혈장을 이용하여 ELISA를 수행하였다.
그 결과, VQIVYKac(K311-ac) 단편에 대한 항체는 잘 생성되지 않았으며, K280-ac, pT231 또는 Glu391 단편에 대한 항체는 잘 생성되는 것을 확인하였다(도 6a 내지 도 6e).
실험예 4. 공포 조건화(Fear conditioning) 실험
상기 제조예 2.에서 사육한 마우스들을 대상으로 공포 조건화 실험을 수행하였다. 구체적으로, 공포 조건화 실험을 수행하기 전에, 마우스들을 3일 연속으로 매일 5분간, 각 마우스들을 잡고 손에서 움직이도록 하는 과정을 통해 길들여지도록 하였다.
공포 조건화 실험 수행 전날에는 마우스를 10분간 트레이닝 상황에 놓아 익숙해지도록 하였다. 구체적으로, 실험 케이지에 마우스를 넣고 삐 소리를 들려준 직후 바닥에 전기 자극을 주는 실험을 3회 반복하여, 마우스가 삐 소리에 대한 공포 조건화 학습이 되도록 하였다. 모든 테스트들은 Limelight(Actimetrics) 및 컴퓨터에 기록되었다.
다음날, 마우스를 다시 10분간 실험 케이지에 넣고 삐 소리를 들려주는 동안 기저선 동결 반응 시간을 측정하였다. 이때, 동결 반응은 동물이 숨쉬기 위한 행동 외에는 움직임이 없는 상태이다. 이후, 상자의 밑바닥을 여러 번 세척하고 에탄올로 다시 닦아내어 마우스의 냄새를 모두 제거하였다. 동시에 상자의 문을 열고 환풍기를 틀어 공기를 내보냈다. 물만 사용했을 경우에도, 상황의 일관성을 위해 동일한 단계를 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 동결 반응 시간은 약 150초를 나타내고, Tau-P301L 치매 마우스의 동결 반응 시간은 100초 이내를 나타내었다. 반면, K280-ac 폴리펩타이드로 능동면역된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스와 같이 약 150초의 동결 반응 시간을 나타내었다. 한편, 나머지 3가지의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 동결 반응 시간이 회복되지 않았다.
실험예 5. 악력 테스트(Grip Strength Test)
마우스의 근력을 확인하기 위해 악력 테스트를 수행하였다. 실험에 사용된 철 뭉치는 아산생명과학연구원에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 이때, 철 뭉치는 40 g 철 뭉치를 사용하였다. 상기 제조예 2.에서 준비한 마우스들의 꼬리 끝부분을 잡고, 마우스의 앞발이 40 g의 철 뭉치를 움켜잡을 수 있도록 철 뭉치 위에 올려놓았다. 그 후, 마우스의 꼬리를 쥔 채 약 30cm 높이로 들어 올려서, 마우스가 철 뭉치를 놓칠 때까지의 시간을 측정하여 각 마우스 별로 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 악력 측정 시간은 10초 이내였으며, Tau-P301L 치매 마우스의 악력 측정 시간은 5초 이내로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 악력 측정 시간보다 긴 약 12초로 측정되었다. 한편, 나머지 3개의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 약력 측정 시간은 유의미하게 증가하지 않았다. 이를 통해 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 악력이 정상 마우스의 정도로 회복한 것을 확인하였다.
실험예 6. 수직 그리드 테스트(Vertical Grid test)
상기 제조예 2.에서 사육한 마우스를 대상으로 수직 그리드 테스트 수행하였다. 수직 그리드는 아산생명과학연구원 실험 동물실에 구비되어 있는 행동 장비를 사용하였다. 구체적으로, 마우스들을 수직 그리드 장치에 올려놓고, 수직 그리드를 올라갔다가 내려오게 하여, 그리드 상에서 떨어질 때까지의 시간을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 수직 그리드 측정 시간은 10초 이내였으며, Tau-P301L 치매 마우스의 수직 그리드 측정 시간은 5초 이내로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 수직 그리드 측정 시간과 동일한 10초로 측정되었다. 한편, 나머지 3개의 변이된 타우 단백질 단편으로 능동면역된 치매 마우스들에서는 수직 그리드 측정 시간은 유의미하게 증가하지 않았다.
실험예 7. 수중 미로 테스트(Water maze test)
마우스의 학습과 기억 능력을 평가하기 위해 수중 미로 테스트를 수행하였다. 수중 미로 테스트에 사용되는 장비와 프로그램은 아산생명과학연구원 실험 동물실에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 구체적으로, 수중 미로 테스트는 총 5일이 소요되며, 4일 동안 도피대(platform)와 도피대 위치에 대한 단서(visual cue)를 두고 마우스를 트레이닝 시켰다.
상기 학습은 도피대가 있는 수영장(1.4 m 지름, 45cm 깊이)에 약 26.5 cm의 깊이가 되도록 물(29±0.5℃)을 채운 후, 단서로만 도피대를 기억할 수 있도록 물을 뿌옇게 만들기 위해 전지분유 1.5L를 첨가하였다. 그 후, 마우스들을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 적응시키고, 1분 동안 도피대 위에 있도록 하였다. 실험은 총 3개의 서로 다른 시작 위치에서 4세트씩 총 12번 수행하였다. 테스트 1회가 끝날 때마다 30초의 쉬는 시간을 주었으며, 한 세트가 끝날 때는 30 내지 45분의 쉬는 시간을 주었다.
4일간의 학습 후, 5일차에 테스트를 수행하였다. 평가를 위한 실험에서는 도피대를 두지 않고, 단서만 보고 도피대가 있던 위치에 잘 찾아가는지를 확인하기 위해 그 구역에 머무는 횟수를 측정하였다. 테스트 시간은 1분 내에 도피대가 있던 위치에 도달하도록 하였고, 1분 내에 도피대 위치에 도달하지 못하면 수영장에서 건져내었다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 도달 횟수는 약 3회로 측정되었으며, Tau-P301L 치매 마우스의 도달 횟수는 약 1회로 나타났다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 도달 횟수와 유사한 약 3회로 측정되었다. 그 다음으로 Glu391, VQIVYKac 단편으로 능동면역된 마우스의 순서로 증가된 횟수를 나타냈으며, pT231 단편으로 능동면역된 마우스의 경우 플랫폼에 도달한 횟수가 가장 낮아 Tau-P301L 치매 마우스와 비슷한 결과를 나타내었다.
실험예 8. 변이된 타우 단백질의 항체 생성률 확인
실험예 3. 내지 실험예 7.을 통해 4가지의 변이된 타우 단백질 단편 중 항체 생성이 잘 되며, 치료 효과가 우수한 K280-ac 단편을 선별하였다. 또한, K280-ac 단편의 백신으로서 효용성이 있는지 확인하기 위해, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 타우 단백질의 N-말단 단편과 K280-ac 단편을 투여하여 1차 및 2차 부스팅 후 항체 생성률을 비교하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 1차 및 2차 부스팅에서 타우 단백질의 N-말단 단편보다 K280-ac 단편의 항체 생성률이 높은 것을 확인하였다.
실험예 9. K280-ac 단편의 행동개선 효과 확인
제조예 2.에서 제작한 Tau-P301L 치매 마우스의 운동능력과 인지기능 변화를 확인하기 위해 행동실험을 진행하였다. 마우스의 다중모달 뇌 기능(multimodal brain function)을 확인 할 수 있는 nest building test를 수행하였다.
구체적으로, 사육중인 케이지에 있는 깔짚의 2/3를 제거하고 멸균한 솜(5cm x 5cm) 4겹을 마우스 케이지에 넣어주었다. 한 케이지에 한 마리의 마우스가 들어가도록 하였다. 다음날 아침에 둥지를 완성시킨 정도를 분석하였다.
그 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 building score가 50% 가량 감소하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 building score와 유사하게 회복되는 것을 확인하였다(도 12 및 도 13).
또한, 운동능력을 확인하기 위해 Rota-rod 실험을 수행하였다. 구체적으로, 마우스의 운동능력을 확인하기 위해 5일간 Rota-rod를 진행하였다.
구체적으로, 마우스를 회전하는 로터에서 얼마나 오래 견디는지를 측정하는 것으로, 4일 동안 트레이닝하고 5일차에 운동능력을 측정하였다. 트레이닝은 RPM을 올려주면서 로터에 버티는 시간과 최종 RPM을 측정하여 하루에 3회씩 반복하였다. 5일차에 동일 조건에서 실험을 진행하되 반복 없이 1회만 결과를 측정하였다(도 14 및 도 15). 그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 rpm과 시간이 정상 마우스만큼 증가된 것을 확인하였다(도 16 및 도 17).
아울러, 인지기능 회복을 확인하기 위해 Y-maze 실험을 수행하였다. 구체적으로, Y모양으로 생긴 상자에 A,B,C 구역을 설정하고, B구역을 막은 상태로 마우스를 5분동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 한 시간 뒤에 B구역을 막은 상자를 제거하고 모든 구역이 열려있는 상태에서 마우스의 움직임을 5분 동안 관찰하였다. 그 결과, Y-maze에서 정상 마우스보다 측정 시간이 50% 감소한 Tau-P301L 마우스에 비해 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 인지기능이 회복된 것을 확인하였다(도 18).
또한, Novel object recognition으로 기억실험을 수행하였다. 물체가 없는 흰색 상자에 (45cm x 45cm x 36cm) 5분동안 마우스를 자유롭게 움직이게 하며 공간에 익숙해지도록 하였다. 동일한 물체 두 개를 흰색 상자에 넣은 후 마우스를 5분동안 탐색하게 하면서 각 물체에 머무르는 시간을 측정하였다. 4시간 후 설치한 물체 중 하나를 다른 모형으로 대체하고 5분 동안 마우스의 움직임과 물체에 머무르는 시간을 측정하였다. Tau-P301L 마우스의 novel object에 머무는 시간이 정상 마우스보다 50% 감소하였지만, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 novel object에 머무는 시간은 정상 마우스만큼 증가된 것을 확인하였다(도 19).
이러한 결과를 통해 K280-ac 단편을 투여하면 운동능력 및 인지기능 회복되는 것을 확인하였다.
실험예 10. K280-ac 단편의 우울증 개선효과 확인
제조예 2.에서 제작한 Tau-P301L 치매 마우스의 우울증 개선효과를 확인하기 위해 forced swimming test를 진행하였다. 총 2일동안 실험이 진행되며 첫날에는 투명한 2 L 비커에 2/3 정도 물을 담고 15분간 마우스를 이 상황에 익숙해지도록 하였다. 이틀째 첫날과 동일한 조건에서 5분 동안 마우스를 물에 놓고 움직임을 관찰한다. 물속에서 수영을 하는 지표(Swimming/S), 비커 벽 주변을 타고 올라가려 하는 지표(Climbling/C), 아무런 움직임 없이 물에 떠있는 지표 (Immobility/I)를 각각 분석하였다.
그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서 우울증 개선 효과를 나타냄을 확인하였다(도 20 내지 도 22).
실험예 11. K280-ac 단편의 타우 병리 경감 효과 확인
K280-ac 단편 투여에 따른 타우 병리 경감 효과를 확인하기 위해 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 웨스턴 블롯 및 면역화학 조직염색을 수행하였다.
웨스턴 블롯 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 증가된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 감소된 것을 확인하였다(도 23). 특히, 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우 단백질이 Tau-P301L 치매 마우스에서 정상 마우스에 비해 약 2배 증가하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 정상 마우스만큼 감소된 것을 확인하였다(도 24).
또한, 면역조직화학염색에서도 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 뇌조직에서 인산화된 타우 단백질 및 아세틸화된 타우 단백질이 감소된 것을 확인 하였다(도 25 및 도 26).
실험예 12. K280-ac 단편의 타우 응집 경감 효과 확인
K280-ac 단편 투여에 따른 타우 응집 경감 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 대뇌 피질을 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 대뇌 피질 분획(soluble 또는 insoluble)에서 전체 타우 단백질, 인산화 타우 단백질 및 아세틸 타우 단백질 모두 감소된 것을 확인하였다(도 27 및 도 28).
실험예 13. K280-ac 단편의 시냅스 개선 효과 확인
K280-ac 단편 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 PSD95, NMDA receptor, synaptophysin, synapsin-1 등 시냅스 관련 단백질들의 발현량이 감소된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우 정상 마우스만큼 PSD95, NMDA receptor, synaptophysin, synapsin-1 등 시냅스 관련 단백질들의 발현량이 회복된 것을 확인하였다(도 29).
실험예 14. K280-ac 단편의 염증 개선 효과 확인
K280-ac 단편 투여에 따른 염증 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 염증 관련 유전자에 대해 qPCR을 수행하였다.
그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서 IFN-γ, IL-4 및 IL-22 유전자가 증가되고, IL-12 유전자가 감소된 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스의 경우 P301L-K280-ac 치매 마우스보다 IFN-γ, IL-4 및 IL-22 유전자가 감소하였으며, IL-12 유전자가 증가한 것을 확인하였다(도 30 내지 도 33).
실험예 15. 뇌 조직 내 K280-ac 백신으로 유도된 항체 분포 확인
제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직 내 항체를 확인하기 위해, 차가운 생리식염수로 심장 관류한 후, 뇌조직을 적출하여 마우스 면역글로불린-G에 대한 면역조직화학염색과 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스 내에서 항체가 존재하는 것을 확인하였다(도 34 및 도 35).
실험예 16. K280-ac 단편의 영상/대사 지표 개선 효과 확인
K280-ac 단편 투여에 따른 영상/대사 지표 개선 효과를 확인하기 위해, 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스를 대상으로 MR spectroscopy(MRS)를 수행하였다. ROI(Region of interest)는 해마로 지정하였다(도 36). 다양한 대사지표들 가운데, NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamic acid)가 P301L-K280-ac 치매 마우스에서 정상 마우스에 비해 약 50% 정도 감소하였고, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서 NAAG 가 회복되는 것을 확인하였다(도 37).
또한, 뇌백질의 구조적인 연결 정도나 방향성을 평가할 수 있는 검사인 DTI(Diffusion tensor imaging)는 초기 알츠하이머 병에서 뇌 손상을 평가하는데 사용되는 기법이다. 병리 연구에서 MD(mean diffusivity)의 변화는 평균 확산성을 의미하며 탈수초화(demylination)와 축삭손상(Diffuse axonal injury)과 연관이 있다는 보고가 있고, FA(fractional anisotrophy)의 변화는 구조적 방향성 증가를 의미한다. 9개월 된 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌들보(corpus callosum)에서 FA값과 MD값이 감소되어있는 것을 확인하였다(도 38 및 도 39). 이를 통해 치매모델 마우스에서 뇌손상이 일어났고, NAAG level이 감소된 것을 확인하였다.
실험예 17. K280-ac 단편 투여에 따른 GCP -II 감소 효과 확인
GCP-II(glutamate carboxypeptidase-2, folate hydrolase 1)는 NAAG를 분해하는 NAAG peptidase로서, GCP-II의 증가가 NAAG를 감소시키는 원인일 가능성이 있어 제조예 2.에서 제조된 Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스, P301L-K280-ac 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 적출하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 GCP-II 의 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 반면, Tau-P301L-K280-ac 치매 마우스에서는 정상 마우스만큼 GCP-II 의 발현량이 감소된 것을 확인하였다(도 40).

Claims (29)

  1. 하기 12개의 아미노산 서열을 갖는 변이된 타우 단백질 단편:
    Val-Gln-Ile-Ile-Asn-Lys-Lys-Leu-Asp-Leu-Ser-Asn (서열번호 1)
    상기 6번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 것을 특징으로 한다.
  2. 제1항의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환인 것인, 백신 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵 병증(progressive supranuclear palsy), 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성 (corticobasal degeneration), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 백신 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병인 것인, 백신 조성물.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 백신 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 및 비강으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  8. 제1항의 변이된 타우 단백질 단편에 결합하는 항체 또는 이의 절편.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 항체 절편은 Fab, scFv, F(ab)2 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 절편.
  10. 제8항의 항체 또는 이의 절편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터가 형질주입된 숙주세포.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것인, 숙주세포.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)인 것인, 숙주세포.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포인 것인, 숙주세포.
  15. 제8항의 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환이 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증 (chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질기저부 변성(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis) , 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 약학 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 척수손상(spinal cord injury), 간질(epilepsy) 또는 헌팅턴병인 것인, 약학 조성물.
  18. 제2항의 백신 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료방법.
  19. 제15항의 약학 조성물을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료방법.
  20. 제1항의 변이된 타우 단백질 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환으로 인한 우울증 치료용 약학 조성물.
  21. 변이된 타우 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질에 결합하는 항체인 것인, 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 검출하는 제제가 변이된 타우 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것인, 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.
  24. 제21항의 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단 키트.
  25. i) 퇴행성 신경 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 280번째 아미노산이 아세틸화된 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
    ii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량과 정상 대조군 시료의 변이된 타우 단백질 발현량을 비교하는 단계; 및
    iii) 상기 변이된 타우 단백질 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 퇴행성 신경 질환 발병 확률이 높다는 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환에 대한 정보 제공방법.
  26. 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 2항의 백신 조성물의 용도.
  27. 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제15항의 약학 조성물의 용도.
  28. 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제2항의 백신 조성물의 용도.
  29. 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제15항의 약학 조성물의 용도.
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