WO2023277627A1 - 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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fusion protein
blood
brain
disease
transferrin receptor
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PCT/KR2022/009461
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김한주
김용호
서민아
이재철
강은성
김남형
이은아
안용일
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주식회사 아임뉴런
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a blood-brain barrier penetrating fusion protein and its use, to a fusion protein comprising an IgG antibody and a helical domain-binding moiety of a transferrin receptor linked to an end of the IgG antibody, and a pharmaceutical use thereof.
  • This patent application is Korean Patent Application No. 10-2021-0087432 filed with the Korean Intellectual Property Office on July 02, 2021, Korean Patent Application No. 10-2021-0194319 filed with the Korean Intellectual Property Office on December 31, 2021, Priority is claimed for Republic of Korea Patent Application No. 10-2022-0080018 filed on June 29, 2022, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the blood-brain barrier is a blood vessel barrier that separates the brain and blood, and serves to isolate the central nervous system, including the brain, from potentially dangerous substances in the blood.
  • the blood-brain barrier is a cerebrovascular-centered structure composed of cells such as brain endothelial cells, astrocytes, and pericytes, and is generally distributed in cerebral blood vessels in brain tissue. there is. Endothelial cells in the blood-brain barrier are tightly bound by tight junctions, and astrocytes and astrocytes surround blood vessels, so substances flowing along the blood inside the blood vessels penetrate the blood vessel barrier and enter the brain tissue. Forms a barrier that selectively inhibits uptake/delivery.
  • This barrier-like structure selectively allows or inhibits the permeation of materials depending on the type and size of the material.
  • water or oxygen which is essential for maintaining life, it can pass through the blood-brain barrier by diffusion, and energy Amino acids and glucose, which are used as sources, can be transported from blood to brain tissue by active transport.
  • toxic substances and pathogens that can potentially affect the brain not only inhibit substance transfer by the blood-brain barrier, but even if permeated, are returned to the blood by the pumping action of cells and enter the brain tissue. It prevents the absorption of and protects the brain tissue.
  • the blood-brain barrier having such a structure acts as a major obstacle in the pharmacological treatment of diseases associated with brain dysfunction, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and brain cancer.
  • diseases associated with brain dysfunction such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and brain cancer.
  • the present inventors have designed an IgG antibody and a fusion protein in which a helical domain-binding moiety of a tetravalent transferrin receptor is linked to the terminus of the IgG antibody.
  • a helical domain-binding moiety of a tetravalent transferrin receptor is linked to the terminus of the IgG antibody.
  • one aspect is an IgG antibody; And a helical region binding moiety of a tetravalent transferrin receptor (TfR) linked to the C-terminal region of the light chain and the C-terminal region of the heavy chain of the IgG antibody, providing a blood-brain barrier-permeable fusion protein will be.
  • TfR tetravalent transferrin receptor
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the fusion protein, a vector containing the polynucleotide, and a cell line transformed with the vector.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with brain dysfunction, comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • One aspect is an IgG antibody; and a helical region binding moiety of a tetravalent transferrin receptor (TfR) linked to the C-terminal region of the light chain and the C-terminal region of the heavy chain of the IgG antibody.
  • TfR tetravalent transferrin receptor
  • BBB Blood-brain barrier
  • blood-brain barrier refers to maintaining life, such as amino acids and glucose, while strictly controlling the movement of substances such as ions, molecules, and pathogens in the blood to brain tissue. It refers to the structure of the cerebrovascular center that enables selective absorption of components essential for
  • the blood-brain barrier consists of cells such as blood-brain barrier endothelial cells, astrocytes, and pericytes. The cells are arranged in a form sharing a common basement membrane, and endothelial cells tightly connected to the blood-brain barrier are distributed on one side of the blood-brain barrier, and astrocytes surrounding blood vessels are distributed on the other side.
  • Blood-brain barrier endothelial cells constitute the walls of capillaries and are connected by very tight and complex tight junctions. This structure forms a physical barrier and serves to inhibit the simple diffusion of most substances, including molecules of average to large size, such as insulin.
  • astrocytes are a type of glial cells in the central nervous system, and affect endothelial cell function, blood flow, and ion balance in the brain through interaction with cerebral blood vessels. Astrocytes use projections called end feet to wrap blood vessels at one end and make close contact with neurons at the other end at synapses.
  • the blood-brain barrier with this structure protects brain tissue from potentially dangerous substances in the blood and at the same time prevents substances effective for the treatment of diseases from being delivered to brain tissue, acting as a major obstacle in pharmacological treatment. do. Therefore, the technique of improving the permeability of the blood-brain barrier can improve the applicability or efficacy of a therapeutic agent in the field of medicine targeting brain tissue.
  • IgG antibody is an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, and refers to a protein molecule that specifically recognizes an antigen and acts as an antigen receptor.
  • the antibody has a heavy chain and a light chain, each heavy chain and light chain comprising a constant region and a variable region.
  • the variable regions of the light and heavy chains contain three variable regions called complementarity-determining regions (CDRs) and four framework regions.
  • CDR mainly serves to bind to an epitope of an antigen.
  • the CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, CDR3 sequentially starting from the N-terminus, and are also identified by the chain in which a particular CDR is located.
  • the antibody may include all of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, full-length antibodies, and antibody fragments including an antigen-binding domain.
  • a full-length antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the full-length antibody may preferably be IgG, and may include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 as subtypes thereof.
  • the antibody may be a native antibody or a recombinant antibody.
  • a native antibody refers to an antibody that has not been genetically engineered, and the risk of immunogenicity that genetically engineered antibodies can have in vivo may be remarkably low.
  • a recombinant antibody refers to a genetically engineered antibody, and has a feature that antigen-binding ability or desired characteristics can be added through genetic manipulation.
  • the antibody fragment refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, and the like.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • An F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • Double-chain Fv (two-chain Fv) is a heavy chain variable region and a light chain variable region are connected by a non-covalent bond.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, restriction digestion of whole antibodies with papain yields Fab, and digestion with pepsin yields F(ab')2 fragments), gene It can also be produced through recombinant technology.
  • the IgG antibody is a subject forming a fusion with the helical region binding moiety of the transferrin receptor, and each of the light chain C-terminus and the heavy chain C-terminus constituting the IgG antibody is connected to the helical region binding moiety of the transferrin receptor or may be connected.
  • These IgG antibodies have enhanced blood-brain barrier selective permeability and can be distributed at a relatively high level in brain tissue compared to other organs and cells.
  • the IgG antibody may be a pharmaceutically active substance for treating or alleviating a disease associated with brain dysfunction.
  • the IgG antibody is used for Alzheimer's disease; stroke, cognitive dysfunction; Dementia with Lewy bodies; frontotemporal dementia; Parkinson's disease; Creutzfeldt-Jakob disease (CJD); Huntington's disease; multiple sclerosis; Gillain-Barre Syndrome (GBS); Amyotrophic Lateral Scleosis (ALS); Paget's disease; cancers including Primary CNS lymphoma (PCNSL), Glioblastoma multiforma, brain metastases, and the like; Progressive multifocal leukoencephalopathy (PML); traumatic brain injury; Pain; epilepsy; autism; Or it may be an antibody for treating or alleviating a disease associated with brain dysfunction such as lysosomal storage disease (LSD), for example, an ⁇ PD-L1 IgG antibody, an anti-Tau IgG antibody, an anti- It may be A ⁇
  • Transferrin receptor TfR
  • transferrin receptor refers to a membrane glycoprotein expressed on the surface of cells that mediates the intracellular uptake of iron from transferrin, a plasma glycoprotein, and is found in normal cells of various tissues. It has been reported that it is not only widely distributed, but also expressed in large amounts in activated immune cells and tumor cells. Therefore, transferrin receptor-mediated delivery technology requires not only effective delivery to brain tissue, but also low delivery to other organs or normal cells other than brain tissue. In fact, it has been reported that transferrin receptor-mediated delivery agents or therapeutics can cause erythrocyte-related toxicity, including decreased reticulocyte count, severe coma, intermittent limb stiffness, systemic stiffness, hemolysis, and hemoglobinuria.
  • the ectodomain of the transferrin receptor is divided into an apical domain, a helical domain, and a protease-like domain, which are known to have different binding affinities to target substances in the process of receptor-mediated transcytosis.
  • the genetic information of the transferrin receptor can be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and for example, the transferrin receptor may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is not limited.
  • the term "transferrin receptor cluster” refers to a cluster in which a plurality of transferrin receptors are densely present in a local area, and the transferrin receptor cluster is distributed in tissues or cells such as blood vessels in a form in which a plurality of transferrin receptors are aggregated can do.
  • the transferrin receptor cluster present in the cerebral blood vessel region may have a specific expression pattern.
  • the specific expression pattern may have a specific expression pattern in other organ tissues or cells.
  • transferrin receptors are densely distributed at a significant level in local regions where clusters are formed, and these brain tissue-specific clusters and expression patterns of transferrin receptors in clusters are characterized by high permeability to the blood-brain barrier, and It can show a close relationship with selective delivery to brain tissue.
  • the term "helical domain binding moiety of transferrin receptor” refers to a functional unit that interacts with a receptor present on the surface of a cell constituting the blood-brain barrier, and specifically, among the domains constituting the transferrin receptor, the helical domain binding moiety It may mean a moiety having an effective binding affinity for the region.
  • the helical domain binding moiety of the transferrin receptor reflects the expression pattern of the transferrin receptor cluster specific to blood vessels in brain tissue, and may be configured in a tetravalent form.
  • the helical region of the transferrin receptor is a functional/structural region exposed to the outside to form an effective tetravalent bond with a plurality of transferrin receptors densely distributed in a cluster of brain tissue blood vessels, which has high permeability to the blood-brain barrier and may contribute to selective delivery to brain tissue. Therefore, the binding moiety capable of binding to the helical domain of the transferrin receptor is linked to an IgG antibody to significantly enhance the blood-brain barrier permeability of the IgG antibody, as well as selective delivery/absorption into brain tissue. It is possible to give functionality that enables.
  • the binding moiety is for forming a fusion by interacting with transferrin receptor clusters distributed in the blood vessel region of brain tissue, and may have binding affinity with a plurality of transferrin receptors in the local region where the cluster is formed.
  • transferrin The helical region of the receptor more specifically, may have binding affinity to at least one amino acid selected from the region from the 606th amino acid to the 665th amino acid based on the transferrin receptor of SEQ ID NO: 1.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may be linked to the C-terminal region of the light chain and the C-terminal region of the heavy chain of the IgG antibody, and thus, the helical region binding moiety of the transferrin receptor may be 4 It can be linked to an IgG antibody in a valent form to exhibit the desired functionality.
  • the helical domain-binding moiety of the transferrin receptor may have a length of 6 to 250 amino acids, for example, the length of the helical domain-binding moiety of the transferrin receptor is 6 to 240 or 6 to 220 amino acids.
  • 6 to 200 6 to 180, 6 to 160, 6 to 140, 6 to 120, 6 to 100, 6 to 80, 6 to 60, 6 to 40, 6 to 20 6 to 10, 10 to 250, 10 to 240, 10 to 220, 10 to 200, 10 to 180, 10 to 160, 10 to 140, 10 to 120, 10 to 100 10 to 80, 10 to 60, 10 to 40, 10 to 20, 20 to 250, 20 to 240, 20 to 220, 20 to 200, 20 to 180, 20 to 160 20 to 140, 20 to 120, 20 to 100, 20 to 80, 20 to 60, 20 to 40, 40 to 250, 40 to 240, 40 to 220, 40 to 200 40 to 180, 40 to 160, 40 to 140, 40 to 120, 40 to 100, 40 to 80, 40 to 60, 60 to 250, 60 to 240, 60 to 220 It may be 60 to 200, 60 to 180, 60 to 160, 60 to 140, 60 to 120, 60 to 100, 60 to 80 amino acids in length, but is not limited thereto.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may include an amino acid sequence in which a unit sequence is repeated 2 to 5 times.
  • the monomer sequences may be linked by fusion or linked by a linker peptide.
  • the linker peptide is 2 to 50 amino acids in length, e.g., 2 to 40, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 5, 5 to 50; It may be 5 to 40, 5 to 30, 5 to 20, 5 to 15, or 5 to 10 amino acids in length, but is not limited thereto.
  • the linker peptide may be, for example, (G l S m ) n (l is 2 to 8, m is 1 to 5, n is 1 to 5).
  • the unit sequence constituting the helical region-binding moiety of the transferrin receptor may include a cell-permeable peptide.
  • the monomer sequence may be illustratively any one of SEQ ID NOs: 3 to 6, but has an effective interaction (hydrogen bond, electrostatic attraction, van der Waals force) with the helical region of the transferrin receptor, that is, effective binding affinity. If it is a monomer sequence, it can be extended and applied without limitation.
  • each of the helical domain binding moieties of the plurality of transferrin receptors may be the same or different.
  • fusion protein refers to a protein formed through the binding of two or more originally separate proteins, or parts thereof, and may optionally include a linker or spacer located between two or more proteins.
  • blood-brain barrier penetrating fusion protein is a protein formed through the binding between an IgG antibody and the helical region-binding moiety of a transferrin receptor, and selectively delivers an effective amount of IgG antibody to brain tissue by penetrating the blood-brain barrier.
  • it may be a general term for proteins containing a functional structure that enables them to be absorbed.
  • the functional structure is modified to have an effective binding affinity by reflecting the structure and expression patterns of the transferrin receptor cluster of vascular endothelial cells specifically distributed in the blood-brain barrier, binding that can bind to the helical region of the transferrin receptor It may include a moiety and a tetravalent bond (linkage) between the C-terminal regions of the heavy and light chains constituting the IgG antibody and the binding moiety.
  • the blood-brain barrier-penetrating fusion protein may include a functional structure in which a tetravalent helical domain binding moiety is connected to the C-terminus of the light chain and the C-terminal region of the heavy chain of the IgG antibody. there is.
  • connection between the C-terminus of the light chain of the IgG antibody and the C-terminal region of the heavy chain and the Helical region binding moiety is fused to the terminal region of the above-mentioned IgG antibody, or by a linker peptide. It may be linked, and the details of the linker peptide are as described above.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein may form a complex by binding to a transferrin receptor that forms a transferrin receptor cluster specifically distributed in blood vessels of the blood-brain barrier.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein may bind to a plurality of transferrin receptors densely distributed in a transferrin receptor cluster compared to other organ tissues or cells.
  • the functional structure is designed to reflect the effective binding affinity with the helical region of the transferrin receptor and the specific distribution/expression pattern of the transferrin receptor cluster distributed in the brain blood vessel region, and the C of the light chain in the IgG antibody.
  • a fusion protein was prepared in which a plurality of helical domain binding moieties of transferrin receptors were linked to the terminal and C-terminal regions of the heavy chain, that is, a total of four terminal regions.
  • the fusion protein is a function derived from a tetravalent moiety having an effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor and a functional structure including the moiety, regardless of the type of IgG antibody and the specific sequence of the binding moiety, It was found that effects such as high permeability to the blood-brain barrier were exerted.
  • a functional structure that can contribute to enhancing the blood-brain barrier permeability of an IgG antibody linked to the binding moiety, inducing selective delivery to brain tissue, and reducing side effects of antibody-based drugs at the same time newly identified.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein comprises a first binding moiety linked to the C-terminal region of the light chain of the IgG antibody; and a second binding moiety linked to the C-terminal region of the heavy chain of the IgG antibody, respectively.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein may be formulated and administered, and for the administration, a conventional fusion protein or antibody-based administration method may be applied without limitation, for example, intravenous administration , intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intraocular administration, intrathecal administration, intracerebroventricular administration, intranasal administration, and the like.
  • the fusion protein can provide an appropriate level of interaction or binding affinity with a partial region of the receptor present on the surface of the cell constituting the blood-brain barrier, that is, the helical region of the transferrin receptor.
  • the fusion partner IgG antibody can be delivered/distributed at a high level in brain tissue.
  • Another aspect is a polynucleotide encoding the fusion protein; a vector containing the polynucleotide; Alternatively, a transformed cell line transformed with the vector is provided.
  • the polynucleotide may be in the form of RNA or DNA, which includes cDNA and synthetic DNA.
  • DNA can be single-stranded or double-stranded. If single-stranded, it may be the coding strand or the non-coding (antisense) strand, and the coding sequence may encode the same polypeptide as a result of degeneracy or redundancy of the genetic code. there is.
  • the polynucleotide may also include a variant of a polynucleotide described herein, which variant of the polynucleotide may be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.
  • An allelic variant is an alternating form of a polynucleotide sequence that may have a substitution, deletion, or addition of one or more nucleotides that does not substantially alter the function of the polynucleotide being encoded (encoded). It is well known in the art that a single amino acid can be encoded by more than one nucleotide codon and that the polynucleotide can be readily modified to produce alternating polynucleotides encoding the same peptide.
  • the term "vector” refers to a vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising regulatory elements operably linked to express a gene insert.
  • a vector according to an embodiment may include expression control elements such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and/or an enhancer, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may be an expression vector capable of stably expressing the fusion protein in a host cell.
  • the expression vector conventional ones used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms may be used.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the vector may include a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, if the vector is replicable, an origin of replication.
  • the vector can replicate autonomously or be introduced into host DNA, wherein the vector is selected from the group consisting of plasmids, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, retroviruses, herpes simplex viruses, and vaccinia viruses. it could be
  • the vector includes a promoter operable in an animal cell, preferably a mammalian cell.
  • suitable promoters include promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from the genome of mammalian cells, such as CMV (Cytomegalovirus) promoter, T7 promoter, U6 promoter, H1 promoter, MLV (Murine Leukemia) promoter.
  • LTR long terminal repeat
  • adenovirus early promoter adenovirus early promoter
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter HSV tk promoter
  • RSV promoter EF1 alpha promoter
  • metallothionein promoter beta- Actin promoter
  • promoter of human IL-2 gene promoter of human IFN gene
  • promoter of human IL-4 gene promoter of human lymphotoxin gene
  • promoter of human GM-CSF gene human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter
  • mouse phosphoglycerate kinase (PGK) promoter Survivin promoter
  • Chinese Hamster Elongation Factor-1 ⁇ CHEF1- ⁇
  • a polynucleotide sequence encoding the blood-brain barrier penetrating fusion protein may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the regulation The sequence will control the transcription and/or translation of said other nucleic acid sequence.
  • transformation means that a piece of DNA chain or a plasmid having a foreign gene of a different kind from that of the original cell penetrates into cells and binds to the DNA existing in the original cell, thereby changing the genetic characteristics of the cell. refers to molecular biological techniques that change
  • the transformation means that the polynucleotide encoding the above-described blood-brain barrier-permeable fusion protein or a vector containing the polynucleotide is inserted into a host cell to produce the blood-brain barrier-permeable fusion protein.
  • the transformed cell line or host cell is preferably a microorganism such as bacteria (E.Coli) or yeast, insect-derived cells such as Sf9 cells, mouse-derived cells such as CHO cells, human-derived cells such as HEK293, and antibodies It may be any one selected from the group consisting of producing hybridomas, but is not limited thereto.
  • a microorganism such as bacteria (E.Coli) or yeast, insect-derived cells such as Sf9 cells, mouse-derived cells such as CHO cells, human-derived cells such as HEK293, and antibodies It may be any one selected from the group consisting of producing hybridomas, but is not limited thereto.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with brain dysfunction comprising the fusion protein as an active ingredient; medical use of the fusion protein for the prevention or treatment of diseases associated with brain dysfunction; Or it provides a method for treating a disease associated with brain dysfunction comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • prevention refers to any activity that suppresses or delays the onset of diseases associated with brain dysfunction by administration of the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change symptoms of diseases associated with brain dysfunction by administration of the pharmaceutical composition.
  • Diseases associated with brain dysfunction which are diseases to be prevented or treated by the pharmaceutical composition include Alzheimer's disease; stroke, cognitive dysfunction; Dementia with Lewy bodies; frontotemporal dementia; Parkinson's disease; Creutzfeldt-Jakob disease (CJD); Huntington's disease; multiple sclerosis; Gillain-Barre Syndrome (GBS); Amyotrophic Lateral Scleosis (ALS); Paget's disease; cancers including Primary CNS lymphoma (PCNSL), Glioblastoma multiforma, brain metastases, and the like; Progressive multifocal leukoencephalopathy (PML); traumatic brain injury; Pain; epilepsy; autism; Or it may be a lysosomal storage disease (LSD), but is not limited thereto.
  • PCNSL Primary CNS lymphoma
  • PML Progressive multifocal leukoencephalopathy
  • traumatic brain injury Pain; epilepsy; autism; Or it may be a lysosomal storage disease (LSD
  • the pharmaceutical composition i.e., a pharmaceutical formulation comprising a fusion protein, comprises an antibody having a desired degree of purity in any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) and lyophilized formulation or aqueous solution.
  • Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid and methionine; Preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexa nol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates such as glucose, mannose, or
  • the pharmaceutical composition may contain additional active ingredients, optionally ingredients having complementary activities that do not adversely affect each other.
  • the type and effective amount of the pharmaceutical composition are determined depending on, for example, the amount of antibody present in the formulation and the clinical parameters of the subject.
  • the active ingredient is incorporated into microcapsules prepared, for example, by droplet formation techniques or interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly-(methylmethacrylate) microcapsules, respectively, for colloidal drug delivery. systems (eg, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or encapsulated form by macroemulsions.
  • the pharmaceutical composition may be formulated, dosed, and administered in a manner consistent with medical practice. Factors to be considered in this regard include the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to the physician.
  • the antibody need not be, but may be formulated with one or more agents currently used for the prevention or treatment of a disease.
  • the effective amount of the other agent depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors. They are generally administered at the same dosages and routes of administration as described herein, or from about 1 to 99% of the dosages described herein, or at any dosage and by any route determined empirically/clinically to be appropriate. used
  • the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with other agents.
  • the pharmaceutical composition may be co-administered with at least one additional therapeutic agent.
  • additional therapeutic agents are effective therapeutic agents for the treatment of diseases associated with brain dysfunction, including but not limited to: cholinesterase inhibitors (such as donepezil, galantamine, lovastigmine and tacrine), NMDA Receptor antagonists (such as memantine), amyloid beta peptide aggregation inhibitors, antioxidants, ⁇ -secretase modulators, nerve growth factor (NGF) mimics or NGF gene therapy agents, PPAR ⁇ agonists, HMS-CoA reducing agents Enzyme inhibitors (statins), ampakines, calcium channel blockers, GABA receptor antagonists, glycogen synthase kinase inhibitors, intravenous immunoglobulins, muscarinic receptor agonists, nicotinic receptor modulators, active or passive amyloid beta peptide
  • cholinesterase inhibitors such as done
  • an appropriate dosage of the pharmaceutical composition depends on the type of disease being treated, the severity and course of the disease, whether the antibody is Whether it is administered for prophylactic or therapeutic purposes will be determined according to the previously administered therapy, the patient's clinical history and response to the antibody, and the judgment of the attending physician.
  • the antibody is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments, and for the purpose of the present invention, the antibody may be provided in the form of a fusion protein linked to a tetravalent helical domain binding moiety of the transferrin receptor.
  • ⁇ g/kg to 100 mg/kg eg 0.1 mg/kg to 100 mg/kg
  • a typical daily dosage may range from about 1 ⁇ g/kg to 100 mg/kg or more, depending on the factors mentioned above.
  • treatment will generally be sustained until the required suppression of disease symptoms occurs.
  • One exemplary dosage of the antibody or fusion protein would be in the range of about 0.05 mg/kg to about 100 mg/kg.
  • one or more doses of about 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg or 10 mg/kg, 20 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient.
  • the dose may be administered intermittently, eg, every week or 3 weeks (eg, such that the patient is administered a dose of about 2 mg/kg to about 20 mg/kg, or, for example, about 6 mg/kg of the antibody or fusion protein). ) can be administered.
  • An initial higher loading dose may be followed by one or more smaller doses.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, mammals such as humans or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cows. means
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein when a formulation containing the fusion protein is administered intravenously, delivery of an IgG antibody in brain tissue is remarkably enhanced by an effective interaction between the binding moiety and the transferrin receptor. Confirmed.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein when a preparation containing the fusion protein is administered intravenously, by the distribution of specific transferrin receptor clusters in the vascular region of brain tissue and effective interaction with the clusters, Compared to other organs and cells, it was confirmed that the IgG antibody exhibited excellent biosafety as it could be selectively delivered at a high level in brain tissue.
  • the fusion protein can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition that requires selective drug delivery to brain tissue, for example, for the prevention or treatment of diseases associated with brain dysfunction. .
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one embodiment.
  • 3 is a result of examining the structure of the binding between the helical domain binding moiety and the helical domain of the transferrin receptor according to one embodiment through cryogenic electron microscopy.
  • hCMEC/D3 human brain endothelial cell line
  • Figure 5 shows the level of IgG1 antibody in brain tissue, compared to the control group, at the time of 4 days after intravenous administration of blood-brain barrier penetrating fusion proteins (F1, F3, F5) according to one embodiment to an animal model. It is the result of numerical comparison with relative values.
  • Figure 6 shows IgG1 in brain tissue at the time of 1 day, 4 days, 7 days, or 14 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to an embodiment to an animal model. This is the result of confirming the antibody level using the Human IgG1 ELISA kit.
  • F3 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 7 is a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F4) according to one embodiment was intravenously administered to an animal model, and then 1, 4, 7, or 14 days elapsed thereafter, IgG1 in brain tissue This is the result of confirming the antibody level using the Human IgG1 ELISA kit.
  • F4 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 8 shows the level of IgG1 antibody in ISF samples at the time of 4 hours, 1 day, or 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to one embodiment to an animal model. This is the result confirmed using the Human IgG1 ELISA kit.
  • F3 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • FIG. 9 is a result of real-time imaging of transcytosis of the fusion protein at the blood-brain barrier after intravenous administration of the blood-brain barrier-permeable fusion protein (F3) according to one embodiment to an animal model having a cranial window.
  • FIG. 10 illustrates intravascular (ROI 1), vessel wall (ROI 2), and extravascular (ROI 3) regions after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to an embodiment to an animal model having a cranial window. This is the result of real-time confirmation of the level of the fusion protein present in
  • 11 is a result of confirming the interaction between the blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) and the transferrin receptor according to one embodiment through negative staining TEM analysis.
  • FIG. 12 is a result of imaging the structure of a complex formed by binding between a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) and a transferrin receptor according to an embodiment.
  • F3 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • FIG. 13 is a graph showing the level of distribution of IgG1 antibody by organ using a Human IgG1 ELISA kit at the time of 1 day after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to an embodiment to an animal model. This is the result of checking.
  • F3 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 14 shows the level of distribution of IgG1 antibody by organ at the time of intravenous administration of blood-brain barrier-permeable fusion protein (F4) to an animal model according to one embodiment, after 1 day from this, using a Human IgG1 ELISA kit. This is the result of checking.
  • F4 blood-brain barrier-permeable fusion protein
  • Figure 15 shows the distribution level of IgG1 antibody by organ at the time of 4 days after intravenous administration of blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) to an animal model according to one embodiment using a Human IgG1 ELISA kit. This is the result of checking.
  • blood-brain barrier penetrating fusion protein F3
  • 16 is a graph showing the distribution level of IgG1 antibody by organ using a Human IgG1 ELISA kit at the time of 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F4) according to one embodiment to an animal model. This is the result of checking.
  • F4 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • 17 is a graph of blood obtained at 0, 1, 4, and 7 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to an embodiment to an animal model. Afterwards, it is the result of confirming the ratio (%) of reticulocytes out of the total red blood cells.
  • F3 blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 18 is a blood-brain barrier permeable fusion protein (F3) according to an embodiment, after intravenous administration to an animal model, thereafter 30 minutes, 120 minutes, 360 minutes, 1 day, 2 days, 4 days, 7 days, or This is the result of confirming the concentration of the fusion protein in plasma after 14 days.
  • F3 blood-brain barrier permeable fusion protein
  • 19 is a result of blood-to-plasma ratio calculation after processing plasma and blood samples with blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to an embodiment.
  • 20 is a result of comparing the amount of transferrin receptor expressed in brain tissue, vascular cells, liver, lung, kidney, and spleen through Western blotting.
  • 21 is a result of confirming the expression patterns of transferrin receptors in brain tissue, liver, lung, and spleen through confocal microscopy images and STED fluorescence images.
  • 24 is a result of confirming the number of transferrin receptor clusters per area in brain tissue blood vessels, reticulocytes, lung, liver, and spleen tissues.
  • 25 is a result of confirming the binding between the helical domain binding moiety and the transferrin receptor according to one embodiment through docking simulation.
  • 26 is a result confirming the thermodynamic structural stability of the binding between the helical region binding moiety and the transferrin receptor according to one embodiment.
  • FIG. 27 is a result of confirming the level of intracellular delivery of the helical domain binding moiety according to one embodiment using a human brain endothelial cell line (hCMEC/D3).
  • hCMEC/D3 human brain endothelial cell line
  • Figure 28 shows the level of IgG1 antibody in ISF samples at the time of 4 hours, 1 day, or 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3a) according to an embodiment to an animal model. This is the result confirmed using the Human IgG1 ELISA kit.
  • F3a blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 29 shows the level of IgG1 antibody in ISF samples at the time of 4 hours, 1 day, or 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3b) to an animal model according to one embodiment. This is the result confirmed using the Human IgG1 ELISA kit.
  • F3b blood-brain barrier penetrating fusion protein
  • Figure 30 compares the level of IgG1 antibody in brain tissue at one day after intravenous administration of blood-brain barrier penetrating fusion proteins (F3a, F3b, F3d) to an animal model according to one embodiment. This is the result.
  • Figure 31 is a blood-brain barrier-permeable fusion protein (F3b') containing an IgG1 antibody that specifically binds to Tau according to one embodiment was intravenously administered to an animal model, and 4 hours after that, ISF The level of IgG1 antibody in the sample was confirmed using a Human IgG1 ELISA kit, and the result was expressed as a multiple of the control group.
  • F3b' blood-brain barrier-permeable fusion protein
  • FIG. 32 is a time point at which 4 hours have elapsed after intravenous administration of a blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3c', F3d') containing an IgG1 antibody that specifically binds to Tau according to one embodiment to an animal model.
  • a blood-brain barrier penetrating fusion protein F3c', F3d'
  • IgG1 antibody that specifically binds to Tau according to one embodiment to an animal model.
  • the level of IgG1 antibody in the ISF sample was confirmed using a Human IgG1 ELISA kit, and the result was expressed as a fold compared to the control group.
  • a fusion protein with enhanced blood-brain barrier permeability was prepared.
  • a fusion protein was prepared in which the helical domain binding moiety of the transferrin receptor was linked to the C-terminal region of the light chain and the C-terminal region of the heavy chain in the IgG1 antibody, that is, a total of four terminal regions.
  • a fusion protein (F5) with linked moieties and (6) a fusion protein (F6) with linked moieties including a plurality of units connected by fusion or a linker to two light chain C-terminal regions were designed and manufactured.
  • the helical region-binding moiety of the transferrin receptor was a unit of SEQ ID NO: 3 (GHHERLKSDEWSVTSG), and an ⁇ PD-L1-binding IgG1 antibody was used as the IgG1 antibody.
  • a 1mL sample was taken with a pipette from the flask containing the cells, and the cell mass was measured. Thereafter, if the cell viability is 95% or more and the cell mass is 4-6 ⁇ 10 6 cells/mL or more, the culture medium stored in an incubator at 37° C. is added and cultured to obtain a cell mass level of 9 ⁇ 10 6 cells. /mL was prepared. Thereafter, transfection was performed on the prepared cells according to the following experimental conditions.
  • transfected cells were obtained. Thereafter, the sample containing the transfected cells was centrifuged at 4500 rpm and 25° C. for 15 minutes, and the supernatant was recovered therefrom. Thereafter, the supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m filter, and the filtrate was refrigerated for 24 hours and stored in a deep freezer at -80° C. until use. Thereafter, purification was performed on the filtrate to obtain each fusion protein.
  • the helical domain-binding moiety of the transferrin receptor was named a helical domain-binding moiety or a binding moiety
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein was named a fusion protein.
  • a 10 uM L7 TfR sample was prepared using 50 mM Tris, 150 mM NaCl, and pH 7.6 buffer solution. Thereafter, vitrification was performed on the L7 TfR sample using a Quantifoil Cu 1.2/1.3 400mesh grid. At this time, in order to enhance the interaction between the sample and the grid, a negative charge discharge was induced on the surface of the grid using a glow discharger. Then, 3 ⁇ l of L7 TfR sample was injected onto the discharged grid, and vitrification was performed under blotting time (7 sec), blotting force (0), waiting time (0 sec), 4 ° C, and 95% humidity conditions. .
  • cryo-EM analysis was performed using 200 kV Glycios, 300 kV Krios G4, and Falcon 4, K3 detectors.
  • the lens was set under the conditions of spherical aberration rate (2.7), 0 50uM aperture, magnification (120K), and exposure time (6.55 seconds).
  • the analysis was conducted under the conditions of 50 fractions per sample, 225 frames, pixel value 0.894 ⁇ /pix, dose rate 6.1 e/px/s, and total dose 49.93 e/ ⁇ 2 , and the defocus range was Analysis was performed within the range of -1.25 to -2.75, and after picking a total of 5 million or more particles, the initial 2D classification was performed using them.
  • helical domain-binding moiety confirmed to bind to the transferrin receptor in Example 1-2 above can be transferred into hCMEC/D3 cells, human brain endothelial cells constituting the human blood-brain barrier, by the above-described interaction wanted to check.
  • the hCMEC/D3 cells were cultured at 37° C. under 5% CO 2 conditions using a synthetic culture medium of Endothelial Cell Basal Medium 2 (EBM2) containing growth factors.
  • EBM2 Endothelial Cell Basal Medium 2
  • the cells were separated, and 4 ⁇ 10 3 cells were added to 40 ⁇ L of the culture medium, which was dispensed into a 384-well plate, centrifuged for 10 seconds, and 37° C., 5% Cells were adhered to the plate by culturing for 18 hours or longer under CO 2 conditions.
  • 500 ⁇ L of 1x PBS was added to 1 mg of the binding moiety peptide, mixed, and the concentration thereof was measured by ultraviolet-visible spectroscopy, and the peptide was diluted to a final concentration of 200 ⁇ M and stored at 4° C. Thereafter, the 200 ⁇ M peptide was diluted in the EBM2 culture medium at a concentration 5 times the treatment concentration.
  • the level of uptake of IgG1 antibody into brain tissue by intravenous administration of the blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one example was evaluated.
  • Formulations containing 20 mg/kg of fusion proteins were intravenously administered to 10-week-old C57BL/6 mice, and as a control, a group intravenously administered with only IgG1 antibody was used. After 4 days from this, the mouse was anesthetized, and blood was collected from the blood vessel inside the eye or the abdominal vena cava. Thereafter, physiological saline was perfused to remove blood. Then, the brain of the mouse was removed, and the brain tissue was quickly frozen in liquid nitrogen and stored in a deep freezer until use. Meanwhile, after homogenizing the extracted brain tissue using a protein extraction solution, the homogenized brain tissue sample was dissolved at 4° C. for 24 hours using a rotary mixer.
  • a brain tissue lysate (Brain lysate).
  • the level of IgG1 antibody in brain tissue lysate was measured using Human IgG1 ELISA kit. Specifically, a standard (STD) was prepared by diluting to each concentration using a protein extraction solution, and a sample (SPL) containing brain tissue lysate was prepared according to each dilution ratio using a protein extraction solution, This was added by 50uL per well. Thereafter, 50 uL of Ab cocktail included in the ELISA kit was additionally added to each well, and reacted at 4° C. for 16 hours.
  • the level of IgG1 antibody in the brain tissue was quantified and compared with the control group as a relative value, compared to the control group, the heavy chain C-terminal and It was confirmed that the level of IgG1 antibody in brain tissue increased about 80-fold in the tetravalent fusion protein-administered group, that is, the F3-administered group, in which binding moieties were linked to each of the four C-terminal regions of the light chain.
  • the bivalent fusion protein administration group that is, the F1 and F3 administration groups, in which binding moieties were linked to the heavy chain C-terminus or the two C-terminal regions of the light chain, used the same binding moiety
  • the level of IgG1 antibody was higher than that of the control group. No significant difference was shown.
  • a tetravalent fusion protein (F3 or F4) was formulated into 10-week-old C57BL/6 mice and administered intravenously through the tail vein. After 7 days or 14 days, the level of IgG1 antibody in brain tissue was measured in the same manner as in Example 2-1. Then, a standard curve was obtained using 4 Parameter Logistic Regression, from which the concentration of IgG1 antibody present in the sample (SPL) was calculated.
  • the level of IgG1 antibody in the brain tissue of the F3-administered group was significantly higher than that of the control group until the 14th day after administration.
  • a high level of delivery was shown from about 25 times to about 320 times compared to the control group.
  • the level of IgG1 antibody in the brain tissue of the F4-administered group was about 18 to about 160 times higher than that of the control group.
  • fusion protein fusion protein present in the ISF sample
  • the amount of the fusion protein that entered the brain parenchyma from blood vessels, that is, the amount of the fusion protein that penetrated the blood-brain barrier was evaluated. Specifically, after anesthetizing a 7-week-old C57BL/6 mouse, the skin of the head of the mouse was incised, and a hole was formed in the skull adjacent to the hippocampus region using a drill. Thereafter, a guide cannula was inserted into the skull hole formed above, and it was fixed using a resin.
  • the mouse After the incised skin was sutured so that the perforated area of the skull was not exposed to the outside, the mouse was allowed to recover for 2 weeks. Thereafter, a formulation containing 20 mg/kg of the fusion protein (F3) was intravenously administered to the recovered mice through the tail vein.
  • F3 the fusion protein
  • the mouse was anesthetized, and an activated probe for detecting IgG1 antibody was inserted into the probe guide cannula of the mouse. Thereafter, while flowing cerebrospinal fluid (CSF) containing BSA at a constant rate, interstitial fluid (ISF) samples containing the fusion protein were collected and stored at -20°C. Then, the level of IgG1 antibody in the ISF sample was measured using a Human IgG1 ELISA kit. Specifically, after preparing a standard (STD) and sample (SPL) diluted according to each concentration using N.S sample buffer, 50uL of each was added to each well.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • SPL sample
  • an animal model with a cranial window and a two-photon microscope were used to acquire images of the cerebrovascular region in real time and to confirm the transcytosis of fusion proteins at the blood-brain barrier.
  • structural images were acquired through a two-photon microscope from the region where the pial blood vessels originate to a depth of about 300 ⁇ m including cortical layers 2-3.
  • Tie2-GFP Tg mice acquired GFP signals through the first channel of a two-photon microscope without additional administration of an external fluorescent substance, and the boundary of cerebrovascular endothelial cells, that is, structural images were confirmed.
  • a region containing at least 3 segments of blood vessels from the postcapillary venule was acquired for 20 minutes under the condition of having a spatial resolution of 100 nm or less and a visual resolution of 1 minute or less.
  • all the acquired time-series images were matched with the first time-series image and matched with the coordinates of the first time-series image.
  • the region clustered near the vessel wall is called intravascular (ROI 1). Region of interest), blood vessel wall (ROI 2), and extravascular (ROI 3) regions were reassigned to observe changes in the concentration of Alexa-568 bound to the fusion protein in the three ROIs over time.
  • the fusion protein that is, the interaction between the tetravalent binding moiety and the transferrin receptor Negative staining Transmission Electron Microscope (TEM) analysis was performed to confirm the action. Specifically, samples in which the fusion protein and transferrin receptor (TfR) were added together were prepared as experimental groups, and as a control group, (1) only native TfR was added, (2) only IgG1 antibody without binding moiety was added. Group, (3) a group in which an IgG1 antibody containing no binding moiety and TfR were added together was set.
  • TfR transferrin receptor
  • the grid specimen prepared as described above was observed using a 60kV Jeol Gatan TEM, and negative staining sample analysis was performed on a magnification of 60K - 200K.
  • each of the tetravalent binding moieties according to one embodiment interacts with the helical domain of the transferrin receptor to form a complex.
  • the experimental results in Example 2-1 show that the interaction in the complex can be a major factor in improving the permeability to the blood-brain barrier. indicates that there is
  • the fusion protein comprising a functional structure in which a tetravalent binding moiety is linked to the C-terminus of the light chain and the C-terminus of the heavy chain of an antibody according to an embodiment, when administered intravenously, binds to the helical region of the transferrin receptor and Through the effective interaction of the high permeability to the blood-brain barrier, it was found that through this, the delivery of the IgG1 antibody to the brain tissue was remarkably enhanced.
  • the distribution level of the IgG1 antibody by organ by administration of the blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one example was evaluated. Specifically, a formulation containing 20 mg/kg of a fusion protein (F3 or F4) was intravenously administered to 8-week-old C57BL/6 male mice, and as a control group, a group to which only IgG1 antibody was intravenously administered was used. After that, at the time of 1 day or 4 days, the level of IgG1 antibody in a total of 6 organs (brain, lung, spleen, kidney, liver, muscle) was measured in the same manner as in Example 2-1 above. and compared.
  • a formulation containing 20 mg/kg of a fusion protein F3 or F4
  • a group to which only IgG1 antibody was intravenously administered was used.
  • the level of IgG1 antibody in a total of 6 organs was measured in the same manner as in Example 2-1 above. and compared.
  • the IgG1 antibody administered intravenously as a control showed the highest distribution in the lungs and relatively low distribution in the brain tissue among the organs, whereas the F3 and F4 administration groups showed very high levels in the brain tissue compared to other organs. It was confirmed that the IgG1 antibody was distributed. From the above results, the fusion protein comprising a functional structure according to one embodiment reduces the distribution of IgG antibody in tissues other than brain tissue due to its selective distribution to brain tissue when administered intravenously, thereby reducing the side effects of antibody-based drugs. It was found that it can contribute to alleviating
  • the effect on reticulocyte one of the cells in which a large amount of transferrin receptor is expressed, was examined.
  • a formulation containing 20 mg/kg or 50 mg/kg of the fusion protein (F3) was intravenously administered to 8-week-old C57BL/6 mice through the tail vein.
  • a blood sample of 50 ⁇ l was obtained from the inner blood vessel of the mouse using a heparinized capillary tube.
  • the mixed solution was allowed to stand at room temperature for a certain period of time. Thereafter, the stained blood sample was smeared on a slide glass and observed under a microscope to calculate the percentage (%) of reticulocytes out of total red blood cells. Meanwhile, as a control group, a group to which IgG1 antibody was intravenously administered was used.
  • the proportion of reticulocytes out of total red blood cells was similar to that of the control group.
  • a formulation containing 20 mg/kg of the fusion protein (F3) was intravenously administered to mice through the tail vein.
  • blood samples were obtained from the mice. Thereafter, the plasma sample was separated by centrifugation, pretreatment for liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) was performed, and then LC-MS analysis was performed on the sample.
  • LC-MS liquid chromatography mass spectrometry
  • the plasma PK profile of the group administered with the blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one embodiment was similar to that of the control group. Indicates that the distribution of the fusion protein is insignificant.
  • Blood-to-plasma ratio peak of blood supernatant area ratio / peak area ratio of plasma
  • blood-brain barrier penetrating fusion protein (F3) according to one embodiment was added to plasma and blood samples to a final concentration of 40 ⁇ g/mL, and then left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, blood samples were centrifuged, and blood supernatants were separately obtained.
  • the plasma and blood supernatant samples were mixed with a PBS solution containing a surfactant and magnetic beads, and after culturing the mixture, the culture was washed twice with PBS containing a surfactant. After adding RapiGest surfactant and dithiothreitol, incubation was performed at 60° C. for 50 minutes, and then left at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 1) Iodoacetic acid was added and incubated for 30 minutes at room temperature in the dark, 2) Trypsin was added and cultured at 60 ° C for 24 hours, 3) HCl was added and cultured at 37 ° C. Incubation was performed sequentially for 30 minutes.
  • the culture was centrifuged to obtain a supernatant, then Trypsin was added, and Blood-to-plasma ratio (peak area ratio of blood supernatant / peak area ratio of plasma) was measured using LC-MS Calculated. Meanwhile, as a control group, an IgG1 antibody-treated group was used.
  • the blood-to-plasma ratio of the group administered with the blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one embodiment also showed a similar level to that of the control group. It was found that this was due to the fact that a bond between the containing reticulocyte and the fusion protein was not formed.
  • the blood-brain barrier penetrating fusion protein according to one embodiment did not have a high level of transferrin receptor-mediated transmission in organs other than brain tissue, and from this, selective delivery to brain tissue was confirmed.
  • a fusion protein comprising a functional structure in which a tetravalent binding moiety is linked to the light chain C-terminus and the heavy chain C-terminus of an antibody according to one embodiment, as confirmed in the above example, due to its high permeability to the blood-brain barrier, It was experimentally confirmed that delivery of the IgG1 antibody to brain tissue was markedly enhanced, and high biosafety was exhibited due to selective delivery to brain tissue compared to other organs.
  • the transferrin receptor is expressed in large amounts in blood vessels and blood cells in brain tissue, and a significant level of transferrin receptor is expressed in the spleen as well. confirmed that there is From the above experimental results, the selective delivery of the fusion protein to the brain tissue according to one embodiment does not result only from the quantitative difference in expression of transferrin receptor for each organ, but is based on transferrin receptor having a specific expression pattern and one embodiment. This indicates that the interaction between the binding moieties according to the present invention, or the functional structure capable of forming such an interaction, may act as a major factor.
  • the blood was removed by perfusion with physiological saline.
  • the brain tissue was perfused with saline and 4% paraformaldehyde in order to prepare brain tissue samples for brain section staining using immunohistology.
  • the brain tissue was added to a mold, and after adding enough tissue freezing medium to sufficiently submerge the brain tissue, it was stored in a deep freezer at -70 ° C for one day. Frozen brain blocks were sectioned into 40 ⁇ m-thick sections by a cryostat. The sections were stored in a PBS solution containing 0.1% sodium azide until use.
  • the tissue sections were added to the 24-well plate and reacted with 500 ⁇ l of PBS solution containing 0.5% Triton-X 100 at room temperature for 20 minutes. Then, after replacing the solution with a PBS solution, it was mixed using a plate stirrer. Thereafter, the tissue sections were added to a PBS solution containing 5% BSA and 0.1% Triton-X 100, allowed to react at room temperature for 2 hours, and washed three times with the PBS solution. After the addition of transferrin receptor antibody and CD31 antibody, the reaction was induced overnight at 4° C., and washed three times with PBS solution.
  • anti-Rat Alexa488 and anti-Goat Alexa568 were added thereto, reacted at room temperature for 2 hours, and then washed three times with a PBS solution. Subsequently, a PBS solution containing DAPI was added, and reacted at room temperature for 10 minutes. After the tissue section treated as described above was placed on a slide glass, 100 ⁇ l of mounting solution was applied. Thereafter, the tissue sections treated as above were covered with cover glass and sealed.
  • Confocal fluorescence images for stained samples were obtained using a STED microscope. Filming was done with LAS-X software, and the light source intensity was adjusted to UV intensity 4% and White laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%). Magnification was performed using a 40X objective lens and setting the pixel resolution to 284 nm, and images were acquired for a total thickness of 20 ⁇ m with a thickness of 1 ⁇ m per tissue slice. In addition, STED fluorescence images for the stained samples were obtained using a STED microscope. Filming was done with LAS-X software, and the light source intensity was adjusted to UV intensity 6% and White laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%).
  • magnification For magnification, a 100X Objective lens was used, and software zoom and STED functions were used. In addition, the magnification was photographed by setting the pixel resolution to 50 nm, and an image of a total thickness of 3 ⁇ m was obtained with a thickness of 100 nm per tissue slice.
  • the acquired images were analyzed using ImageJ and MATLAB software.
  • Gaussian Blur was performed by setting the sigma value to 1.0, and each image was cut to the same size and a representative image was created to fit the color channel.
  • background subtraction was performed using a rolling ball algorithm using a plugin of ImageJ software.
  • the green signal which is the signal of the transferrin receptor, was normalized according to the intensity histogram, and a binary image was obtained using a local thresholding method.
  • the analyze particle function was used to select only pixels with an area of 2500 nm 2 or more, which is the minimum pixel unit, to secure a distribution of cluster sizes.
  • the distribution map of transferrin receptors observed in a total of 40 cells per organ for 10 cells and tissues for each organ in a total of 4 C57BL/6 mice was used as a sample.
  • the distribution map result obtained from ImageJ was converted into a histogram using MATLAB, and a trend line of the histogram was obtained using a smooth function.
  • transferrin receptors expressed in liver, lung, spleen, and brain tissues were distributed in the form of transferrin receptor clusters.
  • FIG. 22 as a result of comparing the quantitative distribution of the size of transferrin receptor clusters expressed in brain tissue, reticulocytes, liver, lung, and spleen, the blood vessel region of brain tissue showed relatively It was confirmed that small-sized transferrin receptor clusters were densely packed.
  • the average intensity value of the entire transferrin receptor cluster between brain tissue blood vessels and reticulocytes was compared, and transferrin receptor clusters per area of brain tissue blood and area, reticulocyte, lung, liver, and spleen tissue The number of was evaluated. Specifically, after imaging the transferrin receptor cluster in the same manner as in Example 6-2, the masked transferrin receptor cluster was extracted as a pixel having an area of 2500 nm 2 or more, which is the minimum pixel unit, using the analyze particle function. Afterwards, the extracted image was made into a mask image and the number of clusters was counted using the analyze particle function. In addition, using MATLAB, the intensity of the green signal was calculated in the cluster mask by multiplying the mask image obtained from ImageJ with the background subtracted image.
  • the distribution pattern of the specific transferrin receptor cluster in the vascular region of brain tissue is a functional structure in which a tetravalent binding moiety according to an embodiment is linked to the C-terminus of the light chain and the C-terminus of the heavy chain of the antibody. It indicates that it can affect the interaction with the fusion protein containing.
  • the specific expression pattern of the transferrin receptor cluster that induces specific interactions in these brain tissues acts as a factor enabling high permeability to the blood-brain barrier and selective uptake of IgG1 antibodies into brain tissues.
  • fusion proteins containing various helical domain-binding moieties and IgG1 antibodies were prepared.
  • various moieties having effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor that is, SEQ ID NO: 3 (GHHERLKSDEWSVTSG), SEQ ID NO: 4 (SHHERLKSDEWSVTSGGL), A binding moiety of SEQ ID NO: 5 (SHHERLKSDTWSVESGGL) or SEQ ID NO: 6 (SHHERLKSDKWDVESGGL) was introduced, and independently of the above, the antibody was an IgG1 antibody that binds to ⁇ PD-L1 (anti-PD-L1), and an IgG1 that binds to Tau.
  • An antibody (anti-Tau) was introduced.
  • the binding between the helical region binding moiety of the fusion protein prepared in the above example and the transferrin receptor (TfR) was confirmed through docking simulation. Specifically, docking simulation was performed to confirm whether the binding moieties corresponding to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6 have binding ability to the transferrin receptor helical region.
  • the structures of the binding moieties of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6 were modeled using the Rosetta Relax program, and the positions expected to interact with the transferrin receptor helical region were determined through structural information and thermodynamic calculations. modeled.
  • Example 1-3 The above experiment was conducted to determine whether the Helical domain-binding moiety, which was confirmed to bind to the transferrin receptor in the above example, could be transferred into hCMEC/D3 cells, which are human brain endothelial cells constituting the human blood-brain barrier, by the above-described interaction. It was confirmed in the same manner as in Example 1-3.
  • various moieties having effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor that is, various moieties having effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor, that is, A group using a binding moiety comprising a unit of SEQ ID NO: 3 (F3a), and a group using a binding moiety comprising a unit of SEQ ID NO: 4 (F3b), using a binding moiety comprising a unit of SEQ ID NO: 5
  • the functionality of the group (F3c) and the group (F3d) using the binding moiety comprising the unit of SEQ ID NO: 6 was evaluated by evaluating the level of IgG1 antibody in ISF samples and the level of IgG1 antibody in brain tissue using animal models. Confirmed.
  • a 7-week-old C57BL/6 mouse was fixed to a stereotaxic frame, and after anesthetizing the mouse, the skin of the head of the mouse was incised, and a hole was formed in the skull adjacent to the hippocampus region using a drill. Thereafter, a guide cannula was inserted into the skull hole formed above, and it was fixed using a resin. After the incised skin was sutured so that the perforated area of the skull was not exposed to the outside, the mouse was allowed to recover for 2 weeks.
  • a formulation containing 20 mg/kg of the fusion protein was intravenously administered to the recovered mice through the tail vein.
  • various moieties having effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor that is, the sequence A group using a binding moiety containing the unit of SEQ ID NO: 3 (F3a) and a group using a binding moiety containing the unit of SEQ ID NO: 4 (F3b) were used, respectively.
  • a control group a group to which only IgG1 antibody was intravenously administered was used.
  • the mouse was anesthetized, and a membrane-activated probe was inserted into the guide cannula of the mouse for antibody detection. Thereafter, while flowing cerebrospinal fluid (CSF) containing 0.2% BSA at a constant rate, an interstitial fluid (ISF) sample containing the fusion protein was collected and stored at -20 ° C. . Then, the level of IgG1 antibody in the ISF sample was measured using a Human IgG1 ELISA kit.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • ISF interstitial fluid
  • standard was prepared by diluting to each concentration using N.S sample buffer, and samples (SPL) were prepared according to each dilution ratio using N.S sample buffer, and then 50uL was added to each well. did Thereafter, 50 uL of Ab cocktail included in the ELISA kit was additionally added to each well, and incubated at 4° C. for 16 hours. Then, after washing the plate, 100 uL of TMB substrate was added to each well. Subsequently, when the OD value of STD1 reached 1.0 at a wavelength of 600 nm using a microplate reader, a stop solution was added and the value at a wavelength of 450 nm was measured.
  • a fusion protein that is, a fusion protein having a binding moiety comprising the unit of SEQ ID NO: 3 (F3a), a fusion protein having a binding moiety comprising the unit of SEQ ID NO: 4, was administered to 10-week-old C57BL/6 mice.
  • F3b a fusion protein having a binding moiety containing a unit of SEQ ID NO: 6
  • F3d fusion protein having a binding moiety containing a unit of SEQ ID NO: 6
  • the brain of the mouse was removed, and the brain tissue was quickly frozen in liquid nitrogen and stored in a deep freezer until use. Meanwhile, after homogenizing the extracted brain tissue using a protein extraction solution, the homogenized brain tissue sample was dissolved at 4° C. for 24 hours using a rotary mixer. Thereafter, the lysed brain tissue sample was centrifuged, and a supernatant was obtained therefrom to prepare a brain tissue lysate (Brain lysate). Then, the level of IgG1 antibody in brain tissue lysate was measured using Human IgG1 ELISA kit.
  • a standard (STD) was prepared by diluting to each concentration using a protein extraction solution, and a sample (SPL) containing brain tissue lysate was prepared according to each dilution ratio using a protein extraction solution, This was added by 50uL per well. Thereafter, 50 uL of Ab cocktail included in the ELISA kit was additionally added to each well, and incubated at 4° C. for 16 hours. Then, after washing the plate, 100 uL of TMB substrate was added to each well. Subsequently, when the OD value of STD1 reached 1.0 at a wavelength of 600 nm using a microplate reader, a stop solution was added and the value at a wavelength of 450 nm was measured.
  • a group administered with a fusion protein according to one embodiment that is, a fusion protein containing various binding moieties having unique properties of binding to the helical region of the transferrin receptor (F3a, F3b, F3d) confirmed that the level of IgG1 antibody in brain tissue was increased compared to the control group.
  • the fusion protein according to one embodiment is a function derived from a moiety having an effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor, has high permeability to the blood-brain barrier, and high delivery of IgG1 antibody to brain tissue. It was found that the same effect was exerted.
  • the type of IgG1 antibody was modified into an IgG1 antibody (anti-Tau) that binds to Tau, and based on this, having an effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor A group using various moieties, that is, a binding moiety comprising a unit of SEQ ID NO: 4 (F3b'), and a group using a binding moiety comprising a unit of SEQ ID NO: 5 (F3c'), a unit of SEQ ID NO: 6 Blood-brain barrier permeation efficiency for the group (F3d') using a binding moiety containing was evaluated in the same manner as in Example 7-2.
  • the fusion protein according to one embodiment is a function derived from a moiety having an effective binding affinity to the helical region of the transferrin receptor, regardless of the type of IgG1 antibody, high permeability to the blood-brain barrier, and It was found that an effect such as high delivery of the IgG1 antibody to the brain tissue was exhibited.

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Abstract

본 출원은 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포주, 및 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, IgG 항체 및 상기 IgG 항체 말단에 연결된 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질 및 이의 의약적 용도에 관한 것이다. 본 특허출원은 2021년 07월 02일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0087432호, 2021년 12월 31일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0194319호, 2022년 6월 29일에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0080018호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
뇌혈관장벽(Blood-brain barrier: BBB)은 뇌와 혈액을 격리시키는 혈관 장벽으로서, 뇌를 포함하는 중추신경계를 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 격리시키는 역할을 한다. 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포(Brain endothelial cell), 성상세포(Astrocyte), 및 혈관주위세포(Pericyte) 등의 세포로 이루어진 뇌혈관 중심의 구조체이며, 뇌 조직 내 뇌 혈관에 전반적으로 분포해 있다. 뇌혈관장벽 내피세포는 밀착 연접(Tight junction)으로 단단하게 결합되어 있고, 성상세포와 성상세포 종족은 혈관 주변을 에워싸고 있어, 뇌혈관 내부 혈액을 따라 흐르는 물질이 혈관장벽을 투과하여 뇌 조직으로 흡수/전달되는 것을 선택적으로 저해하는 장벽을 형성한다. 이러한 장벽과 같은 구조는 물질의 종류와 크기에 따라 선택적으로 물질 투과를 허용하거나 또는 투과를 억제시키게 되는데, 생명 유지에 필수적인 물이나 산소의 경우는 확산에 의해 뇌혈관장벽을 통과할 수 있고, 에너지원으로 사용되는 아미노산이나 글루코스의 경우에는 능동 수송에 의해 혈액에서 뇌 조직으로 전달될 수 있다. 그러나, 뇌에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 독성 물질, 및 병원균 등은 뇌혈관장벽에 의해 물질 전달이 억제될 뿐만 아니라 설사 투과된다 할지라도 세포의 펌핑 작용에 의해 다시 혈액으로 되돌아오게 되어 뇌 조직으로의 흡수를 막아, 뇌 조직을 보호하는 역할을 한다.
그러나, 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 뇌암 등과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 실제로, 400~500 Dalton 이하의 분자량을 갖는 극히 일부의 치료 약물만이 뇌혈관장벽을 투과할 수 있는 것으로 보고된 바 있으며, 대부분의 치료 약물은 뇌혈관장벽에 의해 뇌 조직에 전달되지 못하거나 극 소량만이 전달되어 표적 기관인 뇌 조직에서의 효능이 발휘되지 못하고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 약물의 지용성화를 통해 내피세포의 세포막을 직접 통과시키는 기술, 선천적 영양소 전달 체계를 통한 전달 기술, 및 수용체 매개 트랜스시토시스(Transcytosis)를 이용한 항체 기반의 전달 기술이 제안되었다. 그러나 이러한 기술들은 뇌 뿐만 아니라 다른 장기에도 작용하기 때문에 체내 부작용의 우려가 존재하며, 환자 별 전달의 효능 차이로 인해 적정 농도 또는 함량을 정하기 어렵다는 문제로 인해 임상적 활용에는 한계가 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성 증진 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 향상시키기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나(한국 공개 특허 제10-2021-0005647호), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명자들은 이러한 종래 기술의 한계점을 극복하기 위하여, IgG 항체 및 상기 IgG 항체 말단에 4가의 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질을 고안하였으며, 상기 융합 단백질은 뇌 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터 발현 패턴 및 이에 따른 상기 뇌 혈관 영역 내 클러스터와의 특이적인 상호 작용에 의해, 뇌혈관장벽에 대한 투과성이 증진되어 뇌 조직으로 전달 효율이 향상되었을 뿐만 아니라, 타 조직에 비해 뇌 조직에 선택적으로 IgG 항체가 높은 수준으로 분포함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(Transferrin receptor: TfR)의 Helical 영역 결합 모이어티를 포함하는, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(Transferrin receptor: TfR)의 Helical 영역 결합 모이어티를 포함하는, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공한다.
뇌혈관장벽(Blood-brain barrier: BBB )
본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽(Blood-brain barrier: BBB)"은 혈액 내 존재하는 이온, 분자, 병원체와 같은 물질에 대한 뇌 조직으로의 이동을 엄격하게 제어하면서, 아미노산, 글루코스 등 생명 유지에 필수적인 성분들에 대한 선택적인 흡수를 가능하게 하는 뇌혈관 중심의 구조체를 지칭한다. 상기 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포, 성상세포, 및 혈관주위세포 등의 세포들로 이루어진다. 상기 세포들은 공통의 기저막을 공유하는 형태로 배열되고, 뇌혈관장벽의 일 측면에는 단단하게 연결된 뇌혈관장벽 내피세포, 다른 면에는 혈관 주변을 에워싸고 있는 성상세포가 분포한다. 뇌혈관장벽 내피세포는 모세혈관의 벽을 구성하며, 매우 단단하고 복잡한 밀착 연접(Tight junction)으로 연결되어 있다. 이러한 구조는 물리적인 장벽을 형성하여 인슐린과 같은 평균 크기에서 큰 크기의 분자를 포함한 대부분의 물질의 단순 확산을 저해하는 역할을 한다. 또한, 성상세포는 중추신경계의 신경아교세포(Glial cell)의 일종으로, 뇌 혈관과의 상호 작용을 통해 뇌의 내피 세포 기능, 혈액 흐름, 이온 균형에 영향을 미친다. 성상세포는 종족(End feet)이라는 돌기(Process)를 이용해 한쪽 끝으로는 혈관을 감싸고 다른 쪽 끝은 시냅스(Synapse)에서 뉴런과 밀접하게 접촉한다. 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 뇌 조직을 보호함과 동시에, 질병의 치료에 유효한 물질이 뇌 조직으로 전달되는 것 역시 방해하므로, 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 따라서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 기술은 뇌 조직을 타겟으로 하는 의약 분야에서 치료제의 응용 가능성 또는 효능을 향상시킬 수 있다.
IgG 항체 (IgG antibody)
본 명세서에서 용어, "IgG 항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자로서, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 지칭한다. 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전장(full-length) 항체, 및 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 전장 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 바람직하게 IgG일 수 있으며, 이의 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 천연형 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 천연형 항체란 유전자 조작을 가하지 않은 항체를 뜻하며, 생체 내에서 유전자 조작된 항체가 지닐 수 있는 면역원성(immunogenicity)의 위험성이 현저히 낮을 수 있다. 재조합 항체란 유전자 조작된 항체를 의미하며, 유전자 조작을 통하여 항원 결합력이나 원하는 특징을 추가할 수 있는 특징이 있다.
상기 항체 단편은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 명세서에서, 상기 IgG 항체는 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티와 융합체를 이루는 대상으로서, IgG 항체를 구성하는 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단 각각은 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티가 연결 또는 접합되어 있을 수 있다. 이러한 IgG 항체는 뇌혈관장벽 선택적 투과성이 증진되고, 타 장기 및 세포에 비해 뇌 조직에 상대적으로 높은 수준으로 분포할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 약학적 활성 물질일 수 있다. 상기 IgG 항체는 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease); 뇌졸중, 인지기능 장애; 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia); 파킨슨병 (Parkinson`s disease); 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD); 헌팅톤병 (Huntington`s disase); 다발성 경화증 (multiple sclerosis); 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome: GBS); 근 위축 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Scleosis: ALS); 파제트 (Paget) 질환; 원발성 중추신경계 림프종(Primary CNS lymphoma; PCNSL), 교모세포종(Glioblastoma multiforma), 뇌전이암 등을 포함하는 암; 진행성 다초점 백질뇌병증(Progressive multifocal leukoencephalopathy; PML); 외상성 뇌 손상; 통증 (Pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증; 또는 리소솜 축적질환 (Lysosomal storage disease: LSD)과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 항체일 수 있고, 예를 들어, αPD-L1 IgG 항체, 또는 anti-Tau IgG 항체, anti-Aβ IgG 항체, anti-TDP-43 IgG 항체, anti-alpha-synuclein IgG 항체, anti-SIGLEC3 IgG, 또는 anti-TREM2 IgG 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 (Transferrin receptor: TfR)
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체(Transferrin receptor: TfR)"는 혈장 당단백질인 트랜스페린으로부터 철의 세포 내 흡수를 매개하는 세포의 표면상에 발현된 막 당단백질을 지칭하며, 다양한 조직의 정상 세포에 광범위하게 분포되어 있을 뿐만 아니라, 활성화된 면역 세포 및 종양 세포 등에도 다량으로 발현되어 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달기술은 뇌 조직으로의 유효한 전달 뿐만 아니라, 뇌 조직 이외 다른 장기 또는 정상 세포에 대한 낮은 전달이 요구된다. 실제로, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달체 또는 치료제는 망상적혈구 수의 감소, 심한 혼수, 간헐적인 사지 경직, 전신 경직, 용혈 및 헤모글로빈뇨증을 포함한 적혈구 관련 독성을 야기할 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, 상기 트랜스페린 수용체의 세포막외 도메인(ectodomain)은 Apical 도메인, Helical 도메인 및 Protease-like 도메인으로 구분되며, 이들은 수용체 매개 트랜스시토시스(Transcytosis) 과정에서 타겟 물질과 상이한 결합 친화력을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기 트랜스페린 수용체의 유전 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 수득할 수 있으며, 예를 들어, 상기 트랜스페린 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 클러스터(Transferrin receptor cluster)
본 명세서에서 용어,"트랜스페린 수용체 클러스터"는 복수 개의 트랜스페린 수용체가 국소 영역에서 밀집하게 존재하는 군집을 지칭하며, 상기 트랜스페린 수용체 클러스터는 복수 개의 트랜스페린 수용체들이 뭉쳐져 있는 형태로 혈관 등의 조직 또는 세포에 분포할 수 있다. 특히, 다른 장기 조직 또는 세포에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 달리, 뇌 혈관 영역에 존재하는 트랜스페린 수용체 클러스터는 특이적인 발현 패턴을 갖는 것일 수 있다, 구체적으로, 상기 특이적인 발현 패턴은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 클러스터가 형성된 국소 영역 내 트랜스페린 수용체가 현격한 수준으로 조밀하게 분포되어 있는 상태를 지칭하며, 이러한 뇌 조직 특이적인 클러스터 및 클러스터 내 트랜스페린 수용체의 발현 패턴은 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 뇌 조직으로의 선택적 전달과 밀접한 연관 관계를 나타낼 수 있다.
트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티"는 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체와 상호 작용하는 기능적 단위를 지칭하며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체를 구성하는 영역 중 Helical 영역에 대하여 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티를 의미하는 것일 수 있다. 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관에 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 발현 패턴을 반영한 것으로서, 4가의 형태로 구성될 수 있다. 여기서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역은 뇌 조직 혈관의 클러스터 내 조밀하게 분포된 복수 개의 트랜스페린 수용체와 유효한 4가의 결합이 형성되도록 외부로 노출된 기능적/구조적 영역이며, 이는 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달에 기여할 수 있다. 따라서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과의 결합이 가능한, 결합 모이어티는 IgG 항체와 연결되어 상기 IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 현격하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 뇌 조직으로의 선택적인 전달/흡수를 가능하게 하는 기능성을 부여할 수 있다.
상기 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관 영역에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 상호 작용하여 융합체를 형성하기 위한 것으로서, 상기 클러스터가 형성된 국소 영역 내 복수의 트랜스페린 수용체와 결합 친화력을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역, 보다 구체적으로, 서열번호 1의 트랜스페린 수용체를 기준으로 606번째 아미노산부터 665번째 아미노산까지의 영역 중 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산과 결합 친화력을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결될 수 있으며, 이에, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 4가의 형태로 IgG 항체에 연결되어, 목적하는 기능성을 발휘할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 6 내지 250개의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티의 길이는 6 내지 240개, 6 내지 220개, 6 내지 200개, 6 내지 180개, 6 내지 160개, 6 내지 140개, 6 내지 120개, 6 내지 100개, 6 내지 80개, 6 내지 60개, 6 내지 40개, 6 내지 20개, 6 내지 10개, 10 내지 250개, 10 내지 240개, 10 내지 220개, 10 내지 200개, 10 내지 180개, 10 내지 160개, 10 내지 140개, 10 내지 120개, 10 내지 100개, 10 내지 80개, 10 내지 60개, 10 내지 40개, 10 내지 20개, 20 내지 250개, 20 내지 240개, 20 내지 220개, 20 내지 200개, 20 내지 180개, 20 내지 160개, 20 내지 140개, 20 내지 120개, 20 내지 100개, 20 내지 80개, 20 내지 60개, 20 내지 40개, 40 내지 250개, 40 내지 240개, 40 내지 220개, 40 내지 200개, 40 내지 180개, 40 내지 160개, 40 내지 140개, 40 내지 120개, 40 내지 100개, 40 내지 80개, 40 내지 60개, 60 내지 250개, 60 내지 240개, 60 내지 220개, 60 내지 200개, 60 내지 180개, 60 내지 160개, 60 내지 140개, 60 내지 120개, 60 내지 100개, 60 내지 80개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 단위체 서열이 2회 내지 5회 반복되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 2 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 5개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 링커 펩타이드는 예를 들어, (GlSm)n(l은 2 내지 8, m은 1 내지 5, n은 1 내지 5)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티를 구성하는 단위체 서열은 세포 투과성 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 예시적으로 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나일 수 있으나, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과의 유효한 상호 작용(수소결합, 정전기적 인력, 반데르발스힘), 즉, 유효한 결합 친화력을 갖는 단위체 서열이라면, 비제한적으로 확장 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 복수 개의 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티 각각은 동일하거나, 상이한 것일 수 있다.
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질
본 명세서에서 용어, "융합 단백질"은 둘 이상의 본래 별개인 단백질, 또는 이의 일부의 결합을 통해 형성된 단백질을 지칭하며, 선택적으로, 둘 이상의 단백질 사이에 위치하는 링커 또는 스페이스를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질"은 IgG 항체 및 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티간 결합을 통해 형성된 단백질로서, 뇌혈관장벽을 투과하여 유효한 양의 IgG 항체가 뇌 조직에 선택적으로 전달 또는 흡수될 수 있도록 하는 기능적 구조를 포함하는 단백질을 총칭하는 것일 수 있다. 상기 기능성 구조는 뇌혈관장벽에 특이적으로 분포하는 혈관내피세포의 트랜스페린 수용체 클러스터의 구조 및 이들의 발현 양상을 반영하여 유효한 결합 친화력을 갖도록 변형된 것으로서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합할 수 있는 결합 모이어티, 및 IgG 항체를 구성하는 중쇄 및 경쇄의 C-말단 영역과 상기 결합 모이어티간 4가의 결합(연결)을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역에, 4가의 Helical 영역 결합 모이어티가 연결된 형태의 기능적 구조를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역과 Helical 영역 결합 모이어티와의 연결은 상기 언급한 IgG 항체의 말단 영역에 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있으며, 링커 펩타이드에 대한 사항은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 트랜스페린 수용체 클러스터 내 조밀하게 분포된, 복수의 트랜스페린 수용체와 결합하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 기능적 구조는 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과의 유효한 결합 친화력, 및 뇌 혈관 영역에 분포하는 트랜스페린 수용체 클러스터의 특이적인 분포/발현 양상을 반영하여 고안된 것으로서, IgG 항체 내 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 C-말단 영역, 즉, 총 4개의 말단 영역에 복수 개의 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합단백질을 제조하였다. 이후, 상기 융합 단백질을 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 뇌 조직에서 IgG 항체를 포함하는 융합 단백질의 전달이 현격하게 증진되었을 뿐만 아니라, 다른 장기에 비해 뇌 조직에서 IgG 항체가 높은 수준으로 분포되고, 특히, 망상적혈구를 포함하는 정상 세포 및 다른 장기 조직에 미치는 영향은 미미함을 확인하였다. 또한, 상기 융합 단백질은 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 4가의 모이어티 및 이를 포함하는 기능적 구조로부터 비롯된 기능으로서, IgG 항체의 종류, 및 결합 모이어티의 구체적인 서열에 구애받지 않고, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다. 따라서, 일 실시예에서는 상기 결합 모이어티와 연결된, IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 증진시킴과 동시에 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 유도하고, 항체 기반 약물의 부작용을 경감시키는데 기여할 수 있는 기능적 구조를 새롭게 규명하였다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역에 연결된 제1 결합 모이어티; 및 상기 IgG 항체의 중쇄 C-말단 영역에 연결된 제2 결합 모이어티를 각각 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 제제화되어 투여되는 것일 수 있고, 상기 투여는 통상적인 융합 단백질, 또는 항체 기반 제제의 투여 방법이 비제한적으로 적용될 수 있고, 예를 들어, 정맥 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강 투여, 안구 투여, 척수강내 (Intrathecal) 투여, 뇌실 내 (Intracerebroventricular) 투여, 비강 내 투여 등일 수 있다. 이러한 투여 조건 하에서, 상기 융합 단백질은 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체의 일부 영역, 즉, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과의 적절한 수준의 상호 작용, 또는 결합 친화력을 제공할 수 있는 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티와의 연결을 통하여, 융합 파트너인 IgG 항체가 뇌 조직 내 높은 수준으로 전달/분포될 수 있도록 할 수 있다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
하기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 형질전환 세포주에 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
본 명세서에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, T7 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 설바이빈 (Survivin) 프로모터, 및 Chinese Hamster Elongation Factor-1α (CHEF1-α) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 용어, “작동 가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
형질전환 세포주
본 명세서에서 용어, "형질전환"은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 형질전환은 전술한 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터가 숙주 세포 내로 삽입되어 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 생산하는 것을 의미한다.
상기 형질전환 세포주 또는 숙주 세포는 바람직하게는 박테리아 (E.Coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, Sf9 세포 등의 곤충 유래 세포, CHO 세포 등의 마우스 유래 세포, HEK293 등의 사람 유래 세포 및 항체 생산 하이브리도마로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물; 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 융합 단백질의 의약적 용도; 또는 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
하기 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 의약적 용도, 또는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 명세서에서 용어, “예방”은 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, “치료”는 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약제학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 “뇌 기능 장애와 연관된 질환”은 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease); 뇌졸중, 인지기능 장애; 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia); 파킨슨병 (Parkinson`s disease); 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD); 헌팅톤병 (Huntington`s disase); 다발성 경화증 (multiple sclerosis); 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome: GBS); 근 위축 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Scleosis: ALS); 파제트 (Paget) 질환; 원발성 중추신경계 림프종(Primary CNS lymphoma; PCNSL), 교모세포종(Glioblastoma multiforma), 뇌전이암 등을 포함하는 암; 진행성 다초점 백질뇌병증(Progressive multifocal leukoencephalopathy; PML); 외상성 뇌 손상; 통증 (Pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증; 또는 리소솜 축적질환 (Lysosomal storage disease: LSD)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물, 즉, 융합 단백질을 포함하는 제약 제제는, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도는 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메치오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤;카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 포도당, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 트윈™, 틀루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 추가적인 활성 성분, 임의로 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 종류 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 항체의 양, 및 대상체의 임상 파라미터에 따라 결정된다. 상기 활성 성분은 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 의해 봉입된 형태로 전달될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 의료 실무에 일치하는 방식으로 제제화, 투약, 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려해야 할 인자로는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 기타 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 설명된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법
상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법은 상기 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시-투여될 수 있다. 상기 추가의 치료제는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 치료에 효과적인 치료제로서, 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 콜린에스테라제 억제제 (예컨대 도네페질, 갈란타민, 로바스티그민 및 타크린), NMDA 수용체 길항제 (예컨대 메만틴), 아밀로이드 베타 펩티드 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조절물질, 신경 성장 인자 (NGF) 모방체 (mimic) 또는 NGF 유전자 요법제, PPARγ 효능제, HMS-CoA 환원효소 억제제 (스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, 정맥내 이뮤노글로불린, 무스카린성 (muscarinic) 수용체 효능제, 니코틴 수용체 조절물질, 능동 또는 수동 아밀로이드 베타 펩티드 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-아밀로이드 베타 펩티드 항체.
또한, 대상 질환의 예방 또는 치료를 위해, 상기 약제학적 조성물의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료되는 질환의 종류, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전에 시행된 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 상기 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여되며, 본 발명의 목적 상, 상기 항체는 4가의 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티와 결합된 융합 단백질의 형태로 제공되는 것일 수 있다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어 0.1 mg/kg ~ 100 mg/kg)의 항체 또는 융합 단백질이 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여에 의한 것인지, 또는 연속 주입에 의한 것인지 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 일반적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 또는 그보다 긴 기간 동안에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 요구되는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg, 20 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어 환자에게 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 예를 들어 약 6 mg/kg 용량의 항체 또는 융합 단백질이 투여되도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 보다 적은 용량이 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 양상에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 따르면, 상기 융합 단백질 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체간 유효한 상호 작용에 의해, 뇌 조직에서 IgG 항체의 전달이 현격하게 증진됨을 확인하였다.
또한, 일 양상에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 따르면, 상기 융합 단백질 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 뇌 조직 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터 분포 및 상기 클러스터와의 유효한 상호 작용에 의해, 타 장기 및 세포에 비해 뇌 조직에서 선택적으로 IgG 항체가 높은 수준으로 전달될 수 있는 바, 우수한 생체 안전성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 융합 단백질은 뇌 조직에 대한 선택적인 약물 전달을 필요로 하는 의약 분야, 예를 들어, 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 트랜스페린 수용체를 초저온 전자 현미경법을 통해 이미지화한 것으로서, 트랜스페린 수용체 내 Helical 영역을 확인한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 Helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체의 Helical 영역간 결합을 초저온 전자 현미경법을 통해 구조를 규명한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 Helical 영역 결합 모이어티의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1, F3, F5)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 대조군 대비 상대적인 값으로 수치화하여 비교한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 1일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F4)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 1일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌혈관 장벽에서 융합 단백질의 transcytosis 현상을 실시간으로 이미징한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 혈관내 (ROI 1), 혈관벽(ROI 2) 및 혈관밖(ROI 3) 영역에 존재하는 융합 단백질의 수준을 실시간으로 확인한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)과 트랜스페린 수용체간 상호 작용을 Negative staining TEM 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)과 트랜스페린 수용체간 결합에 의해 형성된 복합체의 구조를 이미지화하여 나타낸 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F4)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 16은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F4)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 0일, 1일, 4일, 및 7일이 경과한 시점에서, 혈액을 수득한 뒤, 전체 적혈구 세포 중 망상 적혈구 세포가 차지하는 비율(%)을 확인한 결과이다.
도 18은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 30분, 120분, 360분, 1일, 2일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 혈장 내 융합 단백질의 농도를 확인한 결과이다.
도 19는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)을 혈장 및 혈액 샘플에 처리한 후, Blood-to-plasma ratio를 산출한 결과이다.
도 20은 뇌 조직, 혈관 세포, 간, 폐, 신장, 및 비장에 발현된 트랜스페린 수용체의 양을 웨스턴 블롯을 통하여 비교한 결과이다.
도 21은 뇌 조직, 간, 폐, 및 비장에서 트랜스페린 수용체의 발현 양상을 공초점 현미경 이미지 및 STED 형광 이미지를 통하여 확인한 결과이다.
도 22는 뇌 조직 혈관, 망상 적혈구, 간, 폐, 및 비장에 형성된 트랜스페린 수용체 클러스터의 양적 분포를 클러스터의 크기에 따라 비교한 결과이다.
도 23은 뇌 조직 혈관과 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체 클러스터의 intensity 평균값을 비교한 결과이다.
도 24는 뇌 조직 혈관, 망상적혈구, 폐, 간, 및 비장 조직의 면적당 트랜스페린 수용체 클러스터의 개수를 확인한 결과이다.
도 25는 일 실시예에 따른 Helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체 간 결합을 도킹 시뮬레이션을 통해 확인한 결과이다.
도 26은 일 실시예에 따른 Helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 27은 일 실시예에 따른 Helical 영역 결합 모이어티의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 28은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3a)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 29는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3b)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 30은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3a, F3b, F3d)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 비교한 결과이다.
도 31은 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 (F3b')을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4시간이 경과한 시점에서, ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 32는 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 (F3c', F3d')을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4시간이 경과한 시점에서, ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조 및 결합 모이어티의 기능성 평가
1-1. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
본 실시예에서는 뇌혈관장벽 투과성이 증진된 융합 단백질을 제조하고자 하였다. 이를 위하여, IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역, 즉, 총 4개의 말단 영역에 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질을 제조하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, (1) 중쇄 C-말단 2개의 영역에 단일의 단위체로 구성된 모이어티가 연결된 융합 단백질(F1), (2) 중쇄 C-말단 2개의 영역에 융합 또는 링커에 의해 연결된 복수 개의 단위체를 포함하는 모이어티가 연결된 융합 단백질(F2), (3) 중쇄 C-말단 및 경쇄 C-말단 4개의 영역에 단일의 단위체로 구성된 모이어티가 연결된 융합 단백질(F3), (4) 중쇄 C-말단 및 경쇄 C-말단 4개의 영역에 융합 또는 링커에 의해 연결된 복수 개의 단위체를 포함하는 모이어티가 연결된 융합 단백질(F4), (5) 경쇄 C-말단 2개의 영역에 단일의 단위체로 구성된 모이어티가 연결된 융합 단백질(F5), (6) 경쇄 C-말단 2개의 영역에 융합 또는 링커에 의해 연결된 복수 개의 단위체를 포함하는 모이어티가 연결된 융합 단백질(F6)을 설계 및 제조하였다. 한편, 본 실시예에서 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 서열번호 3(GHHERLKSDEWSVTSG)의 단위체를 사용하였으며, 상기 IgG1 항체로는 αPD-L1에 결합하는 IgG1 항체를 사용하였다.
구체적으로, 세포가 포함된 플라스크로부터 1mL의 샘플을 피펫으로 채취하고, cell mass를 측정하였다. 이후, 세포 생존율이 95% 이상이고, cell mass가 4~6×106 cells/mL 이상이면, 37℃의 incubator에서 보관된 배양 배지를 첨가하고 이를 배양하여, cell mass 수준이 9×106 cells/mL이 되도록 준비하였다. 이후, 상기 준비된 세포를 대상으로, 하기의 실험 조건에 따라 형질감염을 수행하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2022009461-appb-I000001
이후, 세포 생존율이 85% 이하가 되거나, 형질감염을 수행한 날로부터 7일이 경과한 때, 형질감염된 세포를 수득하였다. 이후, 상기 형질감염된 세포가 포함된 샘플을 4500rpm, 25℃조건에서 15분간 원심분리하여, 이로부터 상층액을 회수하였다. 이후, 상기 상층액을 0.22μm 필터를 사용하여 여과하고, 상기 여과물을 24시간 냉장 보관한 뒤, 이를 사용 전까지 -80℃의 deep freezer에 보관하였다. 이후, 상기 여과물에 대한 정제를 수행하여, 각각의 융합 단백질을 수득하였다.
한편, 이하의 실시예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티는 Helical 영역 결합 모이어티, 또는 결합 모이어티로 명명하였으며, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 융합 단백질로 명명하였다.
1-2. 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과 결합 모이어티간 결합 확인
상기 실시예 1-1에서 제조된 융합 단백질의 Helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체(Transferrin recepto: TfR) 간 결합을 초저온 전자 현미경법 (Cryo-electron microscopy: Cryo-EM)으로 확인하였다.
유리화 동결시편을 제작하기 위하여, 50mM Tris, 150mM NaCl, 및 pH 7.6 완충 용액을 사용하여 10uM의 L7 TfR 샘플 시료를 준비하였다. 이후, Quantifoil Cu 1.2/1.3 400mesh 그리드를 사용하여, 상기 L7 TfR 샘플 시료에 대한 유리화(Vitrification)를 진행하였다. 이때, 샘플 시료와 그리드간 상호 작용을 증진시키고자, Glow discharger를 사용하여 그리드 표면의 음전하 방전을 유도하였다. 이후, 상기 방전된 그리드 위에 3㎕의 L7 TfR 샘플 시료를 주입하고, blotting time (7초), blotting force (0), waiting time (0초), 4℃, 95% 습도 조건에서 유리화를 진행하였다. 또한, Cryo-EM 분석은 200kV Glycios, 300kV Krios G4, 및 Falcon 4, K3 Detector를 사용하여 수행하였다. 이때, 렌즈는 구면 수차율 (2.7), 0 50uM 조리개, 배율(120K), Exposure time (6.55초)의 조건으로 설정되었다. 또한, 한 샘플 당 50개의 Fraction, 225 Frames, Pixel value 0.894 Å/pix, Dose rate 6.1 e/px/s, Total dose 49.93 e/Å2 조건에서 분석이 진행되었으며, defocus range는 0.25의 간격을 통한 -1.25 ~ -2.75 범위 내에서 분석을 진행하여, 총 500만개 이상의 파티클을 picking한 후, 이를 사용하여 초기 2D Classification을 진행하였다. 이후, 최종 약 200만개의 파티클을 선별하여 3D refinement시키고, C1, C2 symmetry를 각각 적용하여 ~3.4Å의 resolution의 3D electron density map을 도출하였다. 해당 맵에서, TfR, Transferrin의 Co-complex model (PDB:3s9n)을 겹치어, 기존의 결합 방식과 Helical 영역 결합 모이어티의 결합 방식 비교를 통하여 결합 위치, 핵심 잔기를 예측하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 트랜스페린 수용체와의 상호 작용에 적용될 수 있는 Helical 영역이 외부로 노출되어 있음을 확인하였고, 3.4Å의 resolution의 3D electron density map에서 트랜스페린 수용체와 트랜스페린의 endogenous binding mode를 유지하는 모델을 맞추어 보았을 때, 예측한 이상적인 범위에서 기존의 트랜스페린 수용체에서 나타나지 않았던, Glycosylation에 준하는 Electron density가 존재함을 확인하였다. 또한, 상기 결합 모이어티와의 결합은 알파 나선 구조의 형상에 부합되도록 형성되었으며, 이를 통하여, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과 결합 모이어티간 상호작용을 확인하였다.
1-3. 인간 뇌 내피 세포 내 전달 확인
상기 실시예 1-2에서 트랜스페린 수용체와의 결합을 확인한 Helical 영역 결합 모이어티가 전술한 상호 작용에 의해, 인간 혈액뇌장벽을 구성하는 인간 뇌 내피 세포인, hCMEC/D3 세포 내로 전달될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 hCMEC/D3 세포는 성장인자가 포함된 Endothelial Cell Basal Medium 2 (EBM2) 합성 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 이후, 세포 포화도가 80%이 되었을 때, 세포를 분리시킨 후, 40μL의 배양액에 4×103 세포를 첨가하여, 이를 384 웰 플레이트에 분주하고, 10초간 원심 분리한 후, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 18시간 이상 배양하여 세포를 플레이트 상에 부착시켰다. 한편, 1mg의 결합 모이어티 펩타이드에 1x PBS 500μL을 첨가하고, 이를 혼합하여 자외선-가시광선 분광기로 이의 농도를 측정한 뒤, 상기 펩타이드의 최종 농도가 200μM가 되도록 희석하여 4℃조건에서 보관하였다. 이후, 상기 200μM 농도의 펩타이드를 처리 농도의 5배 농도로 EBM2 배양액에 희석하였다. 각 웰에 5배 농도로 희석한 10μL의 펩타이드를 분주한 후, 1,000rpm에서 10초간 원심분리하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2시간 배양하였다. 이후, 상기 배양된 세포를 1x PBS로 세척하고, 각 웰에 75μL의 4% PFA를 분주하고, 실온에서 30분간 보관하여 이들을 고정화하였다. 이 때, 상기 4% PFA에 Hoechst용액을 첨가하여, 핵 염색을 동시에 진행하였으며, 이로부터 30분 후, Cytation5 (Biotek)를 통해 세포를 이미징하여 세포 내 전달 수준을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3) 이용한 세포 내 전달 수준 평가를 진행한 결과, 결합 모이어티의 유효한 세포 내 전달을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 뇌혈관장벽에 대한 투과 수준 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 평가하였다.
2-1. 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준 평가
10주령 C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질(F1, F3, F5)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 눈 안쪽의 혈관 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취하였다. 이후, 생리식염수를 관류(perfusion)시켜 혈액을 제거하였다. 뒤이어, 상기 마우스의 뇌를 적출하고, 상기 적출된 뇌 조직을 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤, 사용 전까지 deep freezer에 보관하였다. 한편, 적출된 뇌 조직을 단백질 추출 용액을 사용하여 균질화시킨 뒤, 상기 균질화된 뇌 조직 샘플을 회전 믹서를 사용하여, 4℃에서 24시간 용해시켰다. 이후, 상기 용해된 뇌 조직 샘플을 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하여 뇌 조직 용해물(Brain lysate)을 준비하였다. 이후, 뇌 조직 용해물 내 IgG1 항체의 수준은 Human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 단백질 추출 용액을 사용하여 각 농도에 맞게 희석하여 Standard(STD)를 준비하였으며, 단백질 추출 용액을 사용하여 각각의 희석 배율에 맞춰 뇌 조직 용해물을 포함하는 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이를 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450 nm에서의 값을 측정 후 4 Parameter Logistic Regression을 사용하여 표준 곡선(Standard curve)을 획득하고, 이로부터 샘플 (SPL) 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 정맥 투여 후 4일이 경과한 시점에서, 상기 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 대조군 대비 상대적인 값으로 수치화하여 비교한 결과, 대조군에 비해, 중쇄 C-말단 및 경쇄 C-말단 4개의 영역 각각에 결합 모이어티가 연결된 4가 융합단백질 투여 군, 즉, F3 투여군은 약 80배 가량 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다. 반면, 중쇄 C-말단 또는 경쇄 C-말단 2개의 영역에 결합 모이어티가 연결된 2가 융합단백질 투여군, 즉, F1 및 F3 투여군은 동일한 결합 모이어티를 사용하였음에도 불구하고, IgG1 항체의 수준은 대조군과 유의적인 차이를 보여주지 못하였다.
2-2. 시간대별 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준 평가
상기의 실험 결과에 기초하여, 10주령 C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 4가의 융합 단백질(F3, 또는 F4)을 제제화한 뒤, 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 이로부터 1일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 상기 실시예 2-1과 동일한 방식으로 측정하였다. 이후, 4 Parameter Logistic Regression을 사용하여 표준 곡선(Standard curve)을 획득하고, 이로부터 샘플 (SPL) 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, F3 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 투여 후 14일째까지 대조군에 비해 현저히 높게 관찰되었다. 구체적으로, F3 투여군의 경우, 대조군 대비 약 25배에서 약 320배까지 높은 수준의 전달을 보여주었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, F4 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 대조군 대비 약 18배에서 약 160배까지 높은 수준의 전달 보여주었다.
2-3. ISF 샘플을 이용한 뇌 조직 내 IgG 항체의 수준 평가
본 실험에서는 뇌혈관장벽을 투과한 후, brain parenchyma에 결합하지 않은 형태로 존재하는 융합 단백질(ISF 샘플에 존재하는 융합 단백질)의 양을 검출한 뒤, 상기 검출 값에 대한 recovery를 진행하여, 뇌 혈관으로부터 뇌 실질로 유입된 융합 단백질의 양, 즉, 뇌혈관장벽을 투과한 융합 단백질의 양을 평가하였다. 구체적으로, 7주령 C57BL/6 마우스를 마취시킨 뒤, 상기 마우스 두부의 피부를 절개하고, drill을 사용하여 해마 영역과 인접한 두개골에 천공을 형성하였다. 이후, 상기 형성된 두개골 천공에 Guide cannula를 삽입하고, 레진으로 사용하여 이를 고정시켰다. 상기 절개된 피부를 봉합하여 두개골 천공 영역이 외부로 노출되지 않도록 처치한 뒤, 상기 마우스를 2주간 회복시켰다. 이후, 상기 회복된 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질(F3)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다.
상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, IgG1 항체 검출을 위해 활성화시킨 프로브를 마우스의 probe guide cannula에 삽입하였다. 이후, 일정한 속도로 BSA가 포함된 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid)을 흘려주면서, 상기 융합 단백질이 포함된 간질액(ISF: interstitial fluid) 샘플을 채취한 뒤, 이를 -20℃ 조건에서 보관하였다. 이후, 상기 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준은 Human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, N.S sample buffer를 사용하여 각 농도에 맞게 희석한 Standard(STD) 및 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이들을 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 16시간 인큐베이팅하였다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450nm에서의 값을 측정하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 융합 단백질을 투여한 군(F3)은 대조군에 비해 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다.
2-4. 동물 모델의 뇌 혈관 이미징을 통한 IgG 항체 수준 평가
본 실험에서는, 두개골 창(Cranial window)을 갖는 동물 모델 및 이광자 현미경을 사용하여, 실시간으로 뇌혈관 영역의 영상을 획득하고 뇌혈관 장벽에서 융합 단백질의 transcytosis 현상을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 두개골 창을 갖는 Tie2-GFP Tg 마우스를 이용해 Pial 혈관이 시작되는 영역부터 cortical layer 2-3를 포함하는 ~300μm 정도의 깊이까지 이광자 현미경을 통해 구조 영상을 획득하였다. 이때, Tie2-GFP Tg 마우스는 외부 형광 물질의 추가 투여 없이 이광자 현미경의 제1 채널을 통해 GFP 신호를 획득하여 뇌혈관 endothelial 세포의 경계, 즉, 구조 영상을 확인하였다. 상기 외부 물질의 투여 없이 뇌혈관 영상을 최초 1회 획득한 후 Alexa-568이 결합된 융합 단백질의 transcytosis를 관찰하기 위하여, Alexa-568와 결합된 융합 단백질 26 mg/kg을 미정맥을 통해 주입하였다. 상기 융합단백질의 주입 후 4일째 획득한 영상과 동일한 3차원 영역의 구조 영상을 획득하였다. 이때, 제1채널로 GFP를, 제2채널로 융합 단백질에 결합된 Alexa-568의 형광을 획득하였다. 또한, 상기의 구조 영상을 획득한 직후, postcapillary venule로부터 최소 3분절 이상의 혈관이 포함되는 영역을 100nm 이하의 공간 해상도와 1분 이내의 시해상도를 가지는 조건에서 20분 동안 획득하였다. Transcytosis 현상을 관찰하기 위하여 획득된 모든 시계열 영상을 최초의 시계열 영상에 정합 하여 최초의 시계열 영상의 좌표로 정합 한 뒤, 제1채널 GFP 신호로 혈관내, 혈관벽 및 혈관밖의 영역으로 구분하였다. 상기 제1채널 GFP 신호로 구분된 혈관내, 혈관벽 및 혈관밖의 영역을 기준으로 제2채널에서 관찰되는 융합 단백질에 결합된 Alexa-568 신호 중, 혈관벽 근처에서 군집화 되어 있는 영역을 혈관내(ROI 1; Region of interest), 혈관벽(ROI 2) 및 혈관밖(ROI 3) 영역으로 재지정 하여 시간별로 3개 ROI 에서의 융합 단백질에 결합된 Alexa-568 농도 변화를 관찰하였다.
일 실시예에 따른 융합 단백질 주입 후 4일째의 실시간 transcytosis 변화를 3개 ROI에서 20분 동안 실시간으로 관찰한 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 혈관내(ROI 1)융합 단백질의 농도 변화는 관찰할 수 없었으며, 군집이 존재하는 혈관벽(ROI 2)에서의 융합 단백질은 10분 동안 군집을 형성한 뒤, 혈관 바깥쪽으로 이동하며 융합 단백질의 농도가 낮아지다가 더 이상 군집이 관찰되지 않는 순간부터 (>10분) 이의 농도가 평형 상태로 관찰되는 것을 확인하였다. 또한, 혈관밖(ROI 3)의 영역에서 융합 단백질의 농도 변화는 최초 혈관벽(ROI 2)에서 관찰된 융합 단백질 군집이 약 6분뒤 혈관밖의 영역에 도달함과 동시에 융합 단백질의 농도가 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이후 약 12분째 농도가 최대치에 도달한 뒤, 점차 감소하는 것으로 관찰되었다. 상기 결과를 통해 융합 단백질의 transcytosis가 뇌 혈관 장벽 부근에서의 군집화를 통해 일어나며, 이후, 수 분 이내에 상기 융합 단백질은 혈관밖으로 빠져나감을 알 수 있었다.
실시예 3. 트랜스페린 수용체와의 상호 작용 평가
상기 실시예 2에서 확인한 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성은 결합 모이어티와 뇌 조직에 존재하는 트랜스페린 수용체간 상호 작용에 기인한다는 전제 하에서, 상기 융합 단백질, 즉, 4가의 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체간 상호 작용을 확인하고자 Negative staining Transmission Electron Microscope(TEM) 분석을 진행하였다. 구체적으로, 상기 융합 단백질과 트랜스페린 수용체(TfR)가 함께 첨가된 샘플을 실험군으로 준비하였고, 대조군으로서 (1) Native TfR만 첨가된 군, (2) 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체만 첨가된 군, (3) 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체와 TfR이 함께 첨가된 군을 설정하였다. 모든 샘플은 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4조건의 완충용액을 사용하여 15uM 기준으로 정량화하였고, 융합 단백질/IgG1 항체와 TfR가 함께 첨가된 군은 Molar ratio (1:2) 조건으로 이들을 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 반응을 진행하였다. 이후, 모든 샘플을 적정 농도로 희석한 뒤, TEM 그리드 샘플링을 진행하였다. 전자현미경 시편을 위한 그리드는 400 mesh F/C Cu 그리드를 사용하였으며, 상기 준비된 10ul의 샘플을 그리드 위에 주입하고 1분간 반응시킨 후 필터페이터를 이용하여 이를 제거하였다. 이후, 10ul의 2% 우라닐아세테이트 용액을 상기 그리드 위에 주입한 후, 다시 필터페이터를 이용하여 남은 용액을 제거하였다. 또한, 상기 그리드를 상온 조건에서 12시간 정도 노출시켜 남아있는 수분을 전부 제거하였다. 상기와 같이 준비된 그리드 시편은 60kV Jeol Gatan TEM을 사용하여 관찰하였으며, 60K - 200K 배율상에서 Negative staining 샘플 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체와 TfR이 함께 첨가된 군(도 11의 (c))은, Native TfR 및 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체 중 어느 하나만 첨가한 군(도 11의 (a), 및 (b))과 마찬가지로, 각각의 성분들이 상대적으로 균질하게 분포하였는 바, 이들간 상호 작용이 없음을 확인하였다. 반면, 일 실시예에 따른 융합 단백질 및 Native TfR이 첨가된 군(도 11의 (d))은 트랜스페린 수용체와의 상호 작용에 의해 복합체를 형성하였다. 또한, 이러한 실험 결과에 미루어 볼 때, 도 12에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티 각각은 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과 상호 작용하여 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 특히, 상기 실시예 2-1에서의 실험 결과(도 5 참조)를 고려해 볼 때, 본 실시예의 실험 결과는 상기 복합체 내에서의 상호 작용이 뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 주요한 요소가 될 수 있음을 나타내는 것이다.
상기의 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티가 항체의 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단에 연결된 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질은, 정맥 투여 시 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과의 유효한 상호 작용을 통해 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성을 나타내며, 이를 통하여, IgG1 항체에 대한 뇌 조직으로의 전달이 현격하게 증진됨을 알 수 있었다.
실시예 4. 뇌 조직에 대한 선택적인 전달 효능 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 투여에 의한 IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 평가하였다. 구체적으로, 8주령 C57BL/6 수컷 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질(F3 또는 F4)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 이후, 이로부터 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, 총 6개의 장기 (뇌, 폐, 비장, 신장, 간, 근육) 내 IgG1 항체의 수준을 상기 실시예 2-1과 동일한 방식으로 측정하여 비교하였다.
그 결과, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기 별 분포 수준은 도 13, 및 도 14에 나타낸 바와 같고, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준은 도 15, 및 도 16에 나타낸 바와 같다.
즉, 대조군으로서 정맥 투여된 IgG1 항체는 장기 중 폐에서의 분포가 가장 높게 관찰되고 뇌 조직에서의 분포는 상대적으로 낮게 관찰되었던 반면, F3 및 F4 투여군은 다른 장기에 비해 뇌 조직에서 매우 높은 수준의 IgG1 항체가 분포됨을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질은 정맥 투여 시 뇌 조직에 대한 선택적인 분포로 인해, 뇌 조직 외 다른 조직에서의 IgG 항체 분포를 감소시킴으로써, 항체 기반 약물의 부작용을 경감시키는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 뇌 조직에 대한 선택적인 전달 및 부작용 경감 효과 평가
5-1. 망상적혈구 수준 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 투여한 후, 트랜스페린 수용체가 다량 발현되어 있는 세포 중 하나인 망상적혈구(Reticulocyte)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 8주령 C57BL/6 마우스에 20mg/kg 또는 50mg/kg의 융합 단백질(F3)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. 상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 0일, 1일, 4일, 또는 7일이 경과한 시점에서, 마우스의 눈 안쪽 혈관으로부터 50㎕의 혈액 샘플을 heparinized capillary tube를 사용하여 수득하였다. 이후, 30㎕의 혈액 샘플과 100ul의 New methylene blue 용액을 혼합한 뒤, 상기 혼합 용액을 실온에서 일정 기간 방치하였다. 이후, 염색된 혈액 샘플을 슬라이드 글라스에 도말한 뒤, 이를 현미경으로 관찰하여 전체 적혈구 세포 중 망상 적혈구 세포가 차지하는 비율(%)을 산출하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체를 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질이 투여된 군에서, 전체 적혈구 세포 중 망상적혈구 세포가 차지하는 비율은 대조군과 유사한 수준을 나타내었다.
5-2. 약동학적 평가
본 실험에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 마우스에 투여한 후, 혈장에서의 약동학적 평가를 수행하였다. 구체적으로, 마우스에 20mg/kg의 융합단백질(F3)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. 상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 30분, 120분, 360분, 1일, 2일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 마우스로부터 혈액 샘플을 수득하였다. 이후, 원심분리하여 혈장 시료를 분리한 후, 액체크로마토그래프 질량분석 (LC-MS)을 위한 전처리를 수행하고, 이어서, 상기 시료를 대상으로 LC-MS 분석을 실시하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체를 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질이 투여된 군의 혈장 PK 프로필은 대조군과 유사하였는 바, 상기의 실험 결과는 트랜스페린 수용체를 포함하는 여러 장기에 대한 융합 단백질의 분포가 미미함을 나타낸다.
5-3. Blood-to-plasma ratio 산출
상기의 실험 결과가 뇌 조직에 대한 선택적인 전달, 즉, 트랜스페린 수용체를 포함하는 망상 적혈구 세포 및 다른 장기 조직과의 비-결합으로부터 비롯된 것임을 검증하고자, Blood-to-plasma ratio (혈액 상층액의 peak area ratio / 혈장의 peak area ratio)를 산출하였다. 구체적으로, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F3)의 최종 농도 40 μg/mL가 되도록 혈장 및 혈액 샘플에 첨가한 후, 이를 30분 동안 실온에 방치하였다. 이후, 혈액 샘플에 대해서는 원심분리 후, 혈액 상층액을 별도로 수득하였다. 상기 혈장 및 혈액 상층액 샘플을 계면 활성제가 포함된 PBS 용액, 및 자성 비드와 혼합하고, 상기 혼합물을 배양한 뒤, 상기 배양물을 계면 활성제가 포함된 PBS로 2회 세척하였다. 여기에, RapiGest 계면활성제 및 dithiothreitol을 첨가한 뒤, 60℃조건에서 50분 동안 배양하고, 이를 10 분간 실온에 방치하였다. 이후, 여기에 1) Iodoacetic acid를 첨가한 뒤, 실온의 암 조건에서 30분간 배양, 2) Trypsin을 첨가한 뒤, 60℃조건에서 24시간 배양, 3) HCl을 첨가한 뒤, 37℃조건에서 30분간 배양을 순차적으로 실시하였다. 이후, 상기 배양물을 원심분리하여, 상층액을 수득한 뒤, Trypsin을 첨가하고, LC-MS를 이용하여 Blood-to-plasma ratio (혈액 상층액의 peak area ratio / 혈장의 peak area ratio)를 산출하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체 처리 군을 사용하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질이 투여된 군의 Blood-to-plasma ratio 역시 대조군과 유사한 수준을 보여주었는 바, 상기의 실험 결과는 트랜스페린 수용체를 포함하는 망상 적혈구 세포와 융합 단백질간 결합이 형성되지 않았다는 점으로부터 기인한 것임을 알 수 있었다. 또한, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌 조직이외 다른 장기에서 트랜스페린 수용체 매개 전달의 수준이 높지 않으며, 이로부터 뇌 조직에 대한 선택적인 전달을 확인하였다.
실시예 6. 트랜스페린 수용체의 뇌 조직에서의 특이적인 발현 양상 확인
일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티가 항체의 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단에 연결된 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질은 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성으로 인해, IgG1 항체에 대한 뇌 조직으로의 전달이 현격하게 증진될 뿐만 아니라, 타 장기 대비 뇌 조직에 대한 선택적인 전달로 인해, 높은 생체 안전성을 나타냄을 실험적으로 확인하였다.
이러한 효능은 일 실시예에 따른 결합 모이어티와 뇌 조직에 존재하는 트랜스페린 수용체간 상호 작용에 기인한다는 전제 하에서, 본 실시예에서는 뇌 조직에 분포하는 트랜스페린 수용체의 발현 양상 및 이의 특성을 확인하고자 하였다.
6-1. 트랜스페린 수용체의 장기별 분포 확인
8주령 C57BL/6 마우스의 안와정맥 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취한 뒤, 생리식염수를 관류(perfusion)시켜 혈액을 제거하였다. 관류가 완료된 마우스로부터 뇌 조직을 적출하고, 상기 뇌 조직으로부터 brain vessel, parenchyma와 choroid plexus를 별도로 분리한 뒤, RIPA buffer를 이용하여 total protein을 추출하였다. 간, 폐, 신장, 비장과 같은 다른 장기에 대해서는 소량의 조직을 채취하여 RIPA buffer를 이용하여 total protein을 추출하였다. 상기 추출한 단백질을 sample buffer와 섞은 후 denaturation 하여 SDS-PAGE gel에 loading 한 후 PVDF membrane에 transfer 하였다. 이후, anti-TfR과 beta-actin antibody를 1차 항체로 사용하여 각각의 단백질 밴드를 membrane 상에서 확인한 뒤, Image J software를 이용하여 이들의 intensity를 측정하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 각 장기에서 발현된 트랜스페린 수용체를 정량화하여 확인한 결과, 트랜스페린 수용체는 뇌 조직 내 혈관, 및 혈액 세포에서 다량 발현되며, 비장에서도 유의적인 수준의 트랜스페린 수용체가 발현되어 있음을 확인하였다. 상기의 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질의 뇌 조직에 대한 선택적인 전달은 단지 각 장기별 트랜스페린 수용체 발현의 양적 차이로부터 비롯된 것이 아니라, 특이적 발현 양상을 갖는 트랜스페린 수용체와 일 실시예에 따른 결합 모이어티간 상호 작용, 또는 이러한 상호 작용을 형성할 수 있는 기능적 구조가 주요한 요인으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
6-2. 트랜스페린 수용체 클러스터의 발현 양상 비교
8주령 C57BL/6 마우스의 안와정맥 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취한 뒤, 생리식염수를 관류시켜 혈액을 제거하였다. 한편, 뇌 조직은 saline 및 4% paraformaldehyde로 순서대로 perfusion하여 면역조직학법을 이용한 뇌 절편 염색을 위한 뇌 조직 시료를 준비하였다. 이후, 뇌 절편의 제작을 위하여, 상기 뇌 조직을 틀에 첨가하고, 여기에 Tissue freezing medium 을 뇌 조직이 충분이 잠길 수 있을 만큼 첨가한 후, 이를 -70℃의 deep freezer에 하루 동안 보관하였다. 빙결된 뇌 블록은 Cryostat 에 의해 40 μm 두께의 절편으로 절편화되었다. 상기 절편은 0.1% sodium azide이 포함된 PBS 용액에 사용 전까지 보관되었다.
이후, 24-웰 플레이트에 조직 절편을 첨가하고, 이를 0.5% Triton-X 100이 포함된 500μl의 PBS 용액과 상온에서 20분간 반응시켰다. 이후, 상기 용액을 PBS 용액으로 교체한 뒤, 플레이트 교반기를 사용하여 이를 혼합하였다. 이후, 조직 절편을 5% BSA 및 0.1% Triton-X 100이 포함된 PBS 용액에 첨가하고, 이를 2시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 여기에 Transferrin receptor 항체, 및 CD31 항체를 첨가한 후, 4℃조건에서 밤새도록 반응을 유도한 후, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이후, 여기에 anti-Rat Alexa488 및 anti-Goat Alexa568을 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 다시 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어서, DAPI가 포함된 PBS 용액을 첨가하고, 이를 상온에서 10분간 반응시켰다. 상기와 같이 처리된 조직 절편을 Slide glass 상에 올린 뒤, 100㎕의 mounting solution을 도포하였다. 이후, 상기와 같이 처리된 조직 절편을 cover glass로 덮은 뒤, 이를 sealing 하였다.
염색된 샘플에 대한 공초점 형광 이미지는 STED 현미경을 사용하여 수득하였다. LAS-X software로 촬영하며 UV intensity 4%, White laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%)로 광원 세기를 조절하였다. Magnification은 40X Objective lens를 사용하고, pixel resolution 284nm를 설정하여 촬영을 진행하였으며, 하나의 조직 절편 당 1μm 두께로 총 20μm 두께에 대한 이미지를 획득하였다. 또한, 염색된 샘플에 대한 STED 형광 이미지는 STED 현미경을 사용하여 수득하였다. LAS-X software로 촬영하며 UV intensity 6%, White laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%)로 광원 세기를 조절하였다. Magnification은 100X Objective lens를 사용하고, software zoom 및 STED 기능을 이용하였다. 또한, 상기 Magnification은 pixel resolution 50nm를 설정하여 촬영을 진행하였으며, 하나의 조직 절편 당 100nm 두께로 총 3μm 두께에 대한 이미지를 획득하였다.
이후, 획득된 이미지를 ImageJ와 MATLAB software를 사용하여 분석하였다. 공초점 이미지 및 STED 이미지 분석을 위한 전처리 과정으로서, sigma 값을 1.0으로 설정하여 Gaussian Blur를 진행하였으며, 각각의 이미지를 같은 크기로 자르고 색상 채널에 맞게 대표 이미지를 제작하였다. Signal-to-noise ratio를 높이기 위하여 ImageJ software의 plugin을 활용하여 background subtraction을 rolling ball algorithm을 통해 진행하였다. 트랜스페린 수용체의 signal인 green signal을 intensity histogram에 맞게 정규화하고, local thresholding method를 이용하여 binary 이미지를 획득하였다. Masking된 복수 개의 트랜스페린 수용체 클러스터는 analyze particle 기능을 이용하여 최소 pixel 단위인 2500nm2 이상의 넓이를 지닌 pixel만을 선택하여 클러스터 크기의 분포도를 확보하였다. 상기 분포도는 총 4마리의 C57BL/6 마우스에서 각 장기별 10개의 세포 및 조직에 대하여, 장기당 총 40개의 세포에서 관찰된 transferrin receptor의 분포도를 표본으로 하였다. 또한, MATLAB을 이용하여 ImageJ에서 얻은 분포도 결과를 histogram으로 전환하고, smooth function을 이용하여 histogram의 추세선을 획득하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 간, 폐, 비장, 뇌 조직에 발현된 트랜스페린 수용체는 트랜스페린 수용체 클러스터 형태로 분포하고 있음을 확인하였다. 또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직, 망상 적혈구, 간, 폐, 및 비장에서 발현된 트랜스페린 수용체 클러스터의 크기에 대한 양적 분포를 비교한 결과, 뇌 조직의 혈관 영역에서는 타 조직과 다르게 상대적으로 작은 크기의 트랜스페린 수용체 클러스터가 밀집되어 있음을 확인하였다.
6-3. 장기별 트랜스페린 수용체 클러스터의 특성 평가
장기별 트랜스페린 수용체 클러스터의 특성을 평가하고자, 뇌 조직 혈관과 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체 클러스터의 intensity 평균값을 비교하고, 뇌 조직 혈과 영역, 망상적혈구, 폐, 간, 및 비장 조직의 면적당 트랜스페린 수용체 클러스터의 개수를 평가하였다. 구체적으로, 실시예 6-2과 동일한 방식으로 트랜스페린 수용체 클러스터를 이미징한 뒤, Masking된 트랜스페린 수용체 클러스터를 analyze particle 기능을 이용하여 최소 pixel 단위인 2500nm2 이상의 넓이를 지닌 pixel로 추출하였다. 이후, 추출된 이미지를 Mask 이미지로 만들고 analyze particle 기능으로 cluster의 개수를 세었다. 또한, MATLAB을 이용하여 ImageJ에서 얻은 Mask 이미지와, background subtraction을 수행한 image를 곱하여 cluster Mask에서 Green signal의 intensity를 계산하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직 혈관에서, 더 많은 green signal intensity가 관찰되었으며, 이는 뇌 조직 혈관의 트랜스페린 수용체 클러스터는 망상 적혈구에 비해, 더욱 많은 수의 트랜스페린 수용체가 밀집해 있음을 나타낸다. 또한, 각 장기별로 면적당 cluster의 개수를 측정한 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직 혈관은 다른 장기들의 세포들에 비해 더 적은 cluster의 개수를 가지고 있음을 확인하였다. 상기의 결과를 종합하면, 뇌 조직 혈관의 트랜스페린 수용체는 클러스터 형태로 존재하고, 이러한 뇌 조직 혈관 영역의 트랜스페린 수용체 클러스터는 다른 장기에 비해 상대적으로 적은 수로 존재하는 반면, 전체적인 트랜스페린 수용체의 발현 수준은 다른 장기에 비해 오히려 높게 관찰되었는 바, 보다 밀집되어 있는 트랜스페린 수용체의 발현 패턴을 나타냄을 알 수 있었다.
상기의 실험 결과를 종합하면, 뇌 조직의 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 분포 양상은 일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티가 항체의 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단에 연결된 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질과의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 이러한 뇌 조직에서의 특이적인 상호 작용을 유도하는 트랜스페린 수용체 클러스터의 특이적인 발현 패턴은-뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성 및 IgG1 항체에 대한 뇌 조직으로의 선택적인 흡수를 가능하게 하는 인자로 작용함을 알 수 있었다.
실시예 7. 플랫폼 기능성 평가
본 실시예에서는 뇌혈과장벽 투과 및 뇌조직으로의 선택적인 전달을 위한 기능적 구조를 유지한 채, 상기 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티 또는 IgG1 항체의 종류를 변형시킨 경우에도, 상기 실시예에서 확인한 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 기능성이 발휘될 수 있는지 여부를 평가하였다.
7-1. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조 및 결합 모이어티의 기능성 평가
(1) 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 다양한 Helical 영역 결합 모이어티 및 IgG1 항체를 포함하는 융합 단백질을 제조하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 융합 단백질(F3)의 구조를 기준으로, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 유효한 결합 친화력을 갖는 다양한 모이어티, 즉, 서열번호 3(GHHERLKSDEWSVTSG), 서열번호 4 (SHHERLKSDEWSVTSGGL), 서열번호 5 (SHHERLKSDTWSVESGGL), 또는 서열번호 6 (SHHERLKSDKWDVESGGL)의 결합 모이어티를 도입하였고, 상기와 독립적으로 항체는 αPD-L1에 결합하는 IgG1 항체(anti-PD-L1), 및 Tau에 결합하는 IgG1 항체 (anti-Tau)를 도입하였다.
(2) 트랜스페린 수용체의 Helical 영역과 결합 모이어티간 결합 확인
상기 실시예에서 제조된 융합 단백질의 Helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체 (Transferrin receptor: TfR) 간 결합을 도킹 시뮬레이션을 통해 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 해당하는 결합 모이어티가 트랜스페린 수용체 Helical 영역에 결합능을 가지는 지 확인하기 위해 도킹 시뮬레이션을 진행하였다. 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 결합 모이어티의 구조를 RosettaRelax 프로그램을 사용하여 구조를 모델링 하고 트랜스페린 수용체 Helical 영역과 상호작용할 것으로 예상되는 위치를 구조정보 및 열역학적 계산을 통해 모델링 하였다. 이후 결합 모이어티의 위치를 임의로 변경하고 Helical 영역과의 상호작용을 계산해 가장 안정한 위치를 찾아가는 도킹 시뮬레이션을 RosettaDocking 프로그램을 사용하여 진행하였다. 각 서열번호 당 20,000 번의 시뮬레이션을 진행하였고 나온 데이터를 초기 모델링 구조와의 상동성과 열역학적 구조 안정성을 기준으로 분석하였다.
그 결과, 도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 해당하는 결합 모이어티가 트랜스페린 수용체 Helical 영역에 안정적으로 결합하는 것을 확인하였다.
(3) 인간 뇌 내피 세포 내 전달 확인
상기 실시예에서 트랜스페린 수용체와의 결합을 확인한 Helical 영역 결합 모이어티가 전술한 상호 작용에 의해, 인간 혈액뇌장벽을 구성하는 인간 뇌 내피 세포인, hCMEC/D3 세포 내로 전달될 수 있는지 여부를 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 확인하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3) 이용한 세포 내 전달 수준 평가를 진행한 결과, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에 해당하는 결합 모이어티의 세포 내 전달을 확인할 수 있었다.
7-2. 결합 모이어티에 따른 기능성 평가
상기 실시예 1의 융합 단백질(F3)의 구조를 기준으로, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 유효한 결합 친화력을 갖는 다양한 모이어티, 즉, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 유효한 결합 친화력을 갖는 다양한 모이어티, 즉, 서열번호 3의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3a), 및 서열번호 4의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3b), 서열번호 5의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3c), 및 서열번호 6의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3d)에 대한 기능성을 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준 평가 및 동물 모델을 이용한 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준 평가를 통해 확인하였다.
(1) ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준 평가
7주령 C57BL/6 마우스를 stereotaxic 틀에 고정하고, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 상기 마우스 두부의 피부를 절개하고, drill을 사용하여 해마 영역과 인접한 두개골에 천공을 형성하였다. 이후, 상기 형성된 두개골 천공에 Guide cannula를 삽입하고, 레진으로 사용하여 이를 고정시켰다. 상기 절개된 피부를 봉합하여 두개골 천공 영역이 외부로 노출되지 않도록 처치한 뒤, 상기 마우스를 2주간 회복시켰다.
상기 회복된 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. 본 실시예에서는 결합 모이어티 종류에 따른 기능성을 평가하기 위하여, 상기 실시예 1의 융합 단백질(F3)의 구조를 기준으로, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 유효한 결합 친화력을 갖는 다양한 모이어티, 즉, 서열번호 3의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3a), 및 서열번호 4의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3b)을 각각 사용하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 항체 검출을 위해 멤브레인을 활성화시킨 프로브를 마우스의 guide cannula에 삽입하였다. 이후, 일정한 속도로 0.2% BSA가 포함된 뇌척수액 (CSF: cerebrospinal fluid)을 흘려주면서, 상기 융합 단백질이 포함된 간질액 (ISF: interstitial fluid) 샘플을 채취한 뒤, 이를 -20℃ 조건에서 보관하였다. 이후, 상기 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준은 Human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, N.S sample buffer를 사용하여 각 농도에 맞게 희석하여 Standard(STD)를 준비하였으며, N.S sample buffer를 사용하여 각각의 희석 배율에 맞춰 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이들을 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 16시간 인큐베이팅하였다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450nm에서의 값을 측정하였다.
그 결과, 도 28 및 도 29에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 융합 단백질, 즉 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합하는 고유의 특성을 보유하는 다양한 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 투여한 군은 모두 대조군에 비해 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준이 증가되었으며, 이는 주입 후 4일이 경과된 시점까지 유지되었다.
(2) 동물 모델을 이용한 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준 평가
10주령 C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질, 즉, 서열번호 3의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 갖는 융합 단백질(F3a), 서열번호 4의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 갖는 융합 단백질(F3b), 및 서열번호 6의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 갖는 융합 단백질(F3d)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 이로부터 1일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 눈 안쪽의 혈관 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취하고, 생리식염수를 관류시켜 혈액을 제거하였다. 뒤이어, 상기 마우스의 뇌를 적출하고, 상기 적출된 뇌 조직을 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤, 사용 전까지 deep freezer에 보관하였다. 한편, 적출된 뇌 조직을 단백질 추출 용액을 사용하여 균질화시킨 뒤, 상기 균질화된 뇌 조직 샘플을 회전 믹서를 사용하여, 4℃에서 24시간 용해시켰다. 이후, 상기 용해된 뇌 조직 샘플을 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하여 뇌 조직 용해물(Brain lysate)을 준비하였다. 이후, 뇌 조직 용해물 내 IgG1 항체의 수준은 Human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 단백질 추출 용액을 사용하여 각 농도에 맞게 희석하여 Standard(STD)를 준비하였으며, 단백질 추출 용액을 사용하여 각각의 희석 배율에 맞춰 뇌 조직 용해물을 포함하는 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이를 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 16시간 인큐베이팅하였다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450 nm에서의 값을 측정하였다.
그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 융합 단백질, 즉 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합하는 고유의 특성을 보유하는 다양한 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 투여한 군(F3a, F3b, F3d)은 모두 대조군에 비해, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질은 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티로부터 비롯된 기능으로서, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 IgG1 항체의 뇌 조직으로의 높은 전달과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다.
7-3. IgG1 항체 종류에 따른 기능성 평가
상기 실시예 1의 융합 단백질(F3)의 구조에서, IgG1 항체의 종류를 Tau에 결합하는 IgG1 항체 (anti-Tau)로 변형시키고, 이를 기준으로 하여, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 유효한 결합 친화력을 갖는 다양한 모이어티, 즉, 서열번호 4의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3b'), 및 서열번호 5의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3c'), 서열번호 6의 단위체를 포함하는 결합 모이어티를 사용한 군(F3d')에 대한 뇌혈관장벽 투과 효능 상기 실시예 7-2와 동일한 방식으로 평가하였다.
그 결과, 도 31 및 도 32에 나타낸 바와 같이, 전술한 본원 기능적 구조가 유지된 상태에서, 트랜스페린 수용체의 Helical 영역 결합 모이어티의 융합 파트너인 IgG1 항체의 종류를 변경한 경우에도(F3b', F3c', F3d'), 모두 대조군에 비해 ISF 샘플 내 상기 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질은 트랜스페린 수용체의 Helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티로부터 비롯된 기능으로서, IgG1 항체의 종류에 구애 받지 않고, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 IgG1 항체의 뇌 조직으로의 높은 전달과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (21)

  1. IgG 항체; 및
    상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(Transferrin receptor: TfR)의 Helical 영역 결합 모이어티를 포함하는, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터(Transferrin receptor cluster)를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것인, 융합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌 조직에 선택적으로 전달되는 것인, 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 트랜스페린 수용체 내 서열번호 2의 Helical 영역으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 아미노산과 결합 친화력을 갖는 것인, 융합 단백질.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 6 내지 250개의 아미노산 길이를 가지는 것인, 융합 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 단위체 서열이 2회 내지 5회 반복되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단위체 서열은 융합되어 연결된 것인, 융합 단백질.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 단위체 서열은 링커 펩타이드에 의해 연결된 것인, 융합 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 2 내지 50개의 아미노산 길이를 가지는 것인, 융합 단백질.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 복수 개의 결합 모이어티 각각은 동일하거나, 상이한 것인, 융합 단백질.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 약제학적 활성 물질인 것인, 융합 단백질.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환은 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease), 뇌졸중, 인지기능 장애, 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia), 파킨슨병 (Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병 (Huntington`s disase), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome: GBS), 근 위축 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Scleosis: ALS), 파제트 (Paget) 질환, 암, 진행성 다초점 백질뇌병증(Progressive multifocal leukoencephalopathy; PML), 외상성 뇌 손상, 통증 (Pain), 뇌전증(epilepsy), 자폐증, 또는 리소솜 축적질환 (Lysosomal storage disease: LSD)인 것인, 융합 단백질.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것인, 융합 단백질.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 링커 펩타이드에 의해 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된 것인, 융합 단백질.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 2 내지 50개의 아미노산 길이를 가지는 것인, 융합 단백질.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역에 연결된 제1 결합 모이어티; 및 상기 IgG 항체의 중쇄 C-말단 영역에 연결된 제2 결합 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 청구항 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 청구항 18의 벡터로 형질전환된 형질전환 세포주.
  20. 청구항 1의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환은 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease), 뇌졸중, 인지기능 장애, 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia), 파킨슨병 (Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병 (Huntington`s disase), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome: GBS), 근 위축 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Scleosis: ALS), 파제트 (Paget) 질환, 암, 진행성 다초점 백질뇌병증(Progressive multifocal leukoencephalopathy; PML), 외상성 뇌 손상, 통증 (Pain), 뇌전증 (epilepsy), 자폐증, 또는 리소솜 축적질환 (Lysosomal storage disease: LSD)인 것인, 약제학적 조성물.
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