WO2024080843A1 - 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024080843A1
WO2024080843A1 PCT/KR2023/015875 KR2023015875W WO2024080843A1 WO 2024080843 A1 WO2024080843 A1 WO 2024080843A1 KR 2023015875 W KR2023015875 W KR 2023015875W WO 2024080843 A1 WO2024080843 A1 WO 2024080843A1
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WO
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fusion protein
igg antibody
blood
brain
linked
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PCT/KR2023/015875
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김한주
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주식회사 아임뉴런
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a blood-brain barrier permeable fusion protein and its use, and relates to a fusion protein comprising an IgG antibody and a helical region binding moiety of a transferrin receptor linked to the terminus of the IgG antibody, and its medicinal use.
  • This patent application claims priority to Korean Patent Application No. 10-2022-0132729, filed with the Korean Intellectual Property Office on October 14, 2022, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the blood-brain barrier is a blood vessel barrier that isolates the brain and blood, and serves to isolate the central nervous system, including the brain, from potentially dangerous substances in the blood.
  • the blood-brain barrier is a cerebrovascular-centered structure composed of cells such as brain endothelial cells, astrocytes, and pericytes, and is distributed throughout the brain blood vessels within brain tissue. there is.
  • the blood-brain barrier endothelial cells are tightly bound together by tight junctions, and astrocytes and end feet surround the blood vessels, allowing substances flowing along the blood inside the brain blood vessels to penetrate the blood vessel barrier. This forms a barrier that selectively inhibits absorption/delivery into brain tissue.
  • This barrier-like structure selectively allows or inhibits the penetration of substances depending on the type and size of the substance.
  • substances In the case of water and oxygen, which are essential for maintaining life, they can pass through the blood-brain barrier by diffusion, and energy In the case of amino acids or glucose used as sources, they can be transferred from blood to brain tissue by active transport.
  • the transport of toxic substances and pathogens that can potentially affect the brain is not only inhibited by the blood-brain barrier, but even if they penetrate, they are returned to the blood through the pumping action of cells and returned to brain tissue. It plays a role in protecting brain tissue by preventing its absorption.
  • the blood-brain barrier with this structure acts as a major obstacle in the pharmacological treatment of diseases associated with brain dysfunction, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and brain cancer.
  • diseases associated with brain dysfunction such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and brain cancer.
  • the present inventors have developed a method comprising an IgG antibody and a helical region binding moiety of a 4- to 8-valent transferrin receptor linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody.
  • a blood-brain barrier permeable fusion protein when the number of moieties connected to the C-terminal region is equal to or greater than the number of moieties connected to the N-terminal region, the permeability to the blood-brain barrier is improved and delivery efficiency to brain tissue is improved. It was confirmed that improvements could be made, and the present invention was completed based on this.
  • one aspect includes IgG antibodies; And providing a blood-brain barrier permeable fusion protein comprising a helical region binding moiety of a 4 to 8-valent transferrin receptor (TfR) linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody.
  • TfR transferrin receptor
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the fusion protein, a vector containing the polynucleotide, and a cell line transfected with the vector.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with brain dysfunction, comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • One aspect is an IgG antibody; And a blood-brain barrier permeable fusion protein comprising a helical region binding moiety of a 4- to 8-valent transferrin receptor (TfR) linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody,
  • TfR transferrin receptor
  • the 4- to 8-valent helical region binding moiety linked to the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody provides a blood-brain barrier permeable fusion protein that satisfies the conditions of Formula 1 below.
  • C m represents the number of helical region binding moieties linked to the C-terminal region of an IgG antibody
  • N m represents the number of helical region binding moieties linked to the N-terminal region of an IgG antibody.
  • BBB Blood-brain barrier
  • blood-brain barrier refers to strictly controlling the movement of substances such as ions, molecules, and pathogens present in the blood into brain tissue, and maintaining life-sustaining substances such as amino acids and glucose. It refers to a structure centered on the brain blood vessels that enables selective absorption of essential ingredients.
  • the blood-brain barrier is composed of cells such as blood-brain barrier endothelial cells, astrocytes, and pericytes. The cells are arranged in a form that shares a common basement membrane, and on one side of the blood-brain barrier, tightly connected endothelial cells are distributed, and on the other side, astrocytes surrounding blood vessels are distributed.
  • the blood-brain barrier endothelial cells make up the walls of capillaries and are connected by very strong and complex tight junctions.
  • This structure forms a physical barrier that inhibits the simple diffusion of most substances, including average to large sized molecules such as insulin.
  • astrocytes are a type of glial cell of the central nervous system and affect brain endothelial function, blood flow, and ionic balance through interactions with brain blood vessels. Astrocytes use processes called end feet to surround blood vessels at one end and come into close contact with neurons at the synapse at the other end.
  • the blood-brain barrier with this structure not only protects brain tissue from potentially dangerous substances in the blood, but also prevents substances effective in treating diseases from being delivered to brain tissue, acting as a major obstacle in pharmacological treatment. do. Therefore, technology that improves permeability to the blood-brain barrier can improve the applicability or efficacy of therapeutic agents in the field of medicine targeting brain tissue.
  • the term “IgG antibody” refers to an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, and refers to a protein molecule that specifically recognizes the antigen and serves as a receptor for the antigen.
  • the antibody has heavy and light chains, with each heavy and light chain comprising a constant region and a variable region.
  • the variable regions of the light and heavy chains include three variable regions called complementarity-determining regions (CDRs) and four framework regions.
  • CDR mainly functions to bind to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, and CDR3 sequentially starting from the N-terminus, and are also identified by the chain on which a particular CDR is located.
  • the antibody may include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, full-length antibodies, and antibody fragments containing an antigen-binding domain.
  • the full-length antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types and is subclassed as gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and/or alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain may be of the kappa ( ⁇ ) and/or lambda ( ⁇ ) type.
  • the full-length antibody may preferably be IgG, and its subtypes may include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • the antibody may be a natural antibody or a recombinant antibody.
  • Natural antibodies refer to antibodies that have not been genetically modified, and the risk of immunogenicity that genetically modified antibodies may have in vivo may be significantly lower.
  • Recombinant antibodies refer to antibodies that have been genetically engineered, and have the ability to add antigen binding capacity or desired characteristics through genetic manipulation.
  • the antibodies may include Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, single chain Fv (scFv), and scFv-Fc bivalent molecules that can specifically interact with the target of interest, as well as the raw molecule. It may refer to functional antibody fragments such as or a combination thereof, respectively.
  • the antigen-binding fragment may include, but is not limited to, the following, and structures of IgG-like bispecific antibodies known in the art may be employed without limitation: (1) Fab, antibody Fragments comprising monovalent antigen-binding fragments of the molecule, which can be produced by digesting the entire antibody with the enzyme papain to yield portions of the crude light chain and one heavy chain; (2) Fab', a fragment of the antibody molecule that can be obtained by treating the whole antibody with pepsin followed by reduction to yield portions of the crude light and heavy chains; Two Fab' fragments obtained per antibody molecule; (3) (Fab') 2 , a fragment of the antibody that can be obtained by treating the whole antibody with the enzyme pepsin without subsequent reduction and a dimer of two Fab' fragments joined together by two disulfide bonds; (4) Fv, a genetically engineered fragment comprising the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain expressed as two chains; (5) single chain antibodies (SCA or scFv), genetically engineered fragment
  • the IgG antibody is an object that forms a fusion with the helical region binding moiety of the transferrin receptor, and in the light chain and heavy chain constituting the IgG antibody, at least one region of the N-terminal and C-terminal regions, respectively.
  • the binding moiety of the helical region of the transferrin receptor may be linked or conjugated.
  • the IgG antibody may be an antibody or antigen-binding fragment capable of binding to a target antigen known in the art, applicable to treating, alleviating, or detecting diseases associated with brain dysfunction, for example, It may be a pharmaceutically active substance for treating or alleviating diseases associated with brain dysfunction.
  • the IgG antibody may be used to treat Alzheimer's disease; dementia with Lewy bodies; frontotemporal dementia; neurofibrillary tangle-predominant dementia (tangle only dementia); Parkinson's disease; cognitive dysfunction; multiple sclerosis; amyotrophic lateral sclerosis (ALS); traumatic brain injury; progressive supranuclear palsy; corticobasal degeneration; globular glial tauopathy; aging-related tau astrogliopathy; Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE); Brain cancer, including primary CNS lymphoma (PCNSL), glioma, neuroblastoma, glioblastoma multiforma, meningioma, and brain metastases; Pick's disease; anti-IgLON5-related tauopathy; Guadeloupean parkinsonism; nodding syndrome; pain; epilepsy; autism; stroke; Guillain-Barre Syndrome (GBS); Creutzfeldt-Jakob disease (CJD); Huntington's disease
  • Transferrin receptor TfR
  • transferrin receptor refers to a membrane glycoprotein expressed on the surface of cells that mediates intracellular uptake of iron from transferrin, a plasma glycoprotein, and is expressed in normal cells of various tissues. It has been reported that it is not only widely distributed, but also expressed in large amounts in activated immune cells and tumor cells. Therefore, transferrin receptor-mediated delivery technology requires not only effective delivery to brain tissue, but also low-level delivery to organs other than brain tissue or normal cells. In fact, it has been reported that transferrin receptor-mediated transporters or therapeutic agents can cause red blood cell-related toxicities, including decreased reticulocyte count, severe coma, intermittent limb stiffness, general stiffness, hemolysis, and hemoglobinuria.
  • extracellular domain (ectodomain) of the transferrin receptor is divided into an apical domain, a helical domain, and a protease-like domain, and these are known to have different binding affinities to target substances during receptor-mediated transcytosis.
  • the transferrin receptor can be obtained from known databases such as GenBank of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • the transferrin receptor may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but It is not limited.
  • transferrin receptor cluster refers to a cluster in which a plurality of transferrin receptors exist densely in a local area, and the transferrin receptor cluster is distributed in tissues or cells such as blood vessels in the form of a plurality of transferrin receptors clustered together. can do.
  • transferrin receptor clusters present in the brain vascular region may have a specific expression pattern. Specifically, the specific expression pattern may be expressed in other organ tissues or cells.
  • transferrin receptors are distributed at a remarkably dense level within the local area where the cluster is formed, and these brain tissue-specific clusters and the expression pattern of transferrin receptors within the cluster have high permeability to the blood-brain barrier, and It may show a close relationship with selective delivery to brain tissue.
  • binding moiety of the helical region of the transferrin receptor refers to a functional unit that interacts with the receptor present on the surface of the cells constituting the blood-brain barrier, and specifically, the helical region of the region constituting the transferrin receptor. It may refer to a moiety that has effective binding affinity for the region.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor reflects the expression pattern of the transferrin receptor cluster specific for brain tissue blood vessels, and is linked to the IgG antibody to form a plurality of bonds, preferably 2 to 8, more preferably 2 to 8. may be 4 to 8 valent.
  • the helical region of the transferrin receptor is a functional/structural region exposed to the outside to form a plurality of effective bonds with a plurality of transferrin receptors densely distributed in a cluster of blood vessels in brain tissue, and has high permeability to the blood-brain barrier and It may contribute to selective delivery to brain tissue. Therefore, the binding moiety capable of binding to the helical region of the transferrin receptor is linked to an IgG antibody, which can not only significantly improve the blood-brain barrier permeability of the IgG antibody, but also selectively deliver/absorb into brain tissue. It can be given functionality that makes it possible.
  • the binding moiety is intended to form a fusion body by interacting with a transferrin receptor cluster distributed in the brain tissue vascular region, and may have binding affinity with a plurality of transferrin receptors in the local area where the cluster is formed.
  • transferrin It may have binding affinity to the helical region of the receptor, more specifically, to at least one amino acid selected from the region from the 606th amino acid to the 665th amino acid based on the transferrin receptor of SEQ ID NO: 1.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may be linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody, and the 4 to 8-valent helical region binding moiety linked to the terminal region may be
  • Equation 1 the desired function can be achieved:
  • C m represents the number of helical region binding moieties linked to the C-terminal region of an IgG antibody
  • N m may represent the number of helical region binding moieties linked to the N-terminal region of an IgG antibody.
  • the helical region binding moiety may be symmetrically linked to the heavy chain and/or light chain of the IgG antibody.
  • the helical region binding moiety has a longitudinal axis crossing the hinge region of the IgG antibody for an IgG antibody having a “Y-type” structure including a pair of heavy chain peptides and a pair of light chain peptides. It may be connected to the terminal regions of the heavy and/or light chains symmetrically with reference to the reference line.
  • the helical region binding moiety is symmetrically connected to the terminal of the heavy chain or light chain of the IgG antibody, so the C m or N m may each be an even number, for example, C m and N m may each independently be any integer of 0, 2, and 4, where the sum of C m and N m may be any integer of 2, 4, 6, and 8.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may have a length of 6 to 250 amino acids.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may have a length of 6 to 240 amino acids, or 6 to 220 amino acids.
  • the helical region binding moiety of the transferrin receptor may include an amino acid sequence in which the monomeric sequence is repeated 2 to 5 times.
  • the monomer sequences may be connected by fusion or may be connected by a linker peptide.
  • the linker peptide is 2 to 70 amino acids long, for example, 2 to 60 amino acids, 2 to 50 amino acids, 2 to 40 amino acids, 2 to 30 amino acids, 2 to 20 amino acids, 2 to 15 amino acids, 2 to 10 amino acids, It may be 2 to 5, 5 to 50, 5 to 40, 5 to 30, 5 to 20, 5 to 15, or 5 to 10 amino acids in length, but is not limited thereto.
  • the linker peptide may be, for example, (G l S m ) n (l is 2 to 8, m is 1 to 5, n is 1 to 5), (G d Se AS) f (d is 2 to 5) 8, e is 1 to 5, f is 1 to 5), (G 4 S) a (EAAAK) b (G 4 S) a (a, b are integers 1 to 4), [(G 4 S) p (EAAAK) q ] r (p, q, r are integers from 1 to 4).
  • the monomeric sequence constituting the binding moiety of the helical region of the transferrin receptor may include a cell-penetrating peptide.
  • the monomeric sequence can be applied without limitation as long as it has effective interaction (hydrogen bonding, electrostatic attraction, hydrophobic bonding, van der Waals force) with the helical region of the transferrin receptor, that is, effective binding affinity.
  • each of the helical region binding moieties of the plurality of transferrin receptors may be the same or different.
  • fusion protein refers to a protein formed through the combination of two or more originally separate proteins, or parts thereof, and may optionally include a linker or space located between the two or more proteins.
  • blood-brain barrier permeable fusion protein is a protein formed through the bond between an IgG antibody and the helical region binding moiety of a transferrin receptor, and penetrates the blood-brain barrier to selectively deliver an effective amount of IgG antibody to brain tissue.
  • it may be a general term for proteins that contain a functional structure that allows them to be absorbed.
  • the functional structure is modified to have effective binding affinity by reflecting the structure and expression pattern of the transferrin receptor cluster of vascular endothelial cells that are specifically distributed in the blood-brain barrier, and is capable of binding to the helical region of the transferrin receptor. It may include a moiety and a bivalent to octavalent bond (link) between the terminal region of the heavy chain and/or light chain constituting the IgG antibody and the binding moiety.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein may include a functional structure in which a divalent to octavalent helical region binding moiety is connected to the terminal region of the light chain and the terminal region of the heavy chain of the IgG antibody.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein is a form in which a tetravalent to octavalent helical region binding moiety is linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of the IgG antibody, and the C-terminal region It may include a functional structure, characterized in that the number of moieties connected to is the same as or greater than the number of moieties connected to the N-terminal region.
  • connection between the light chain terminal and/or heavy chain terminal regions of the IgG antibody and the helical region binding moiety may be fused to the terminal region of the above-mentioned IgG antibody, or may be linked by a linker peptide, and may be connected by a linker peptide. Details about the peptide are the same as described above.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein may form a complex by binding to a transferrin receptor that forms a transferrin receptor cluster specifically distributed in blood vessels of the blood-brain barrier.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein may bind to a plurality of transferrin receptors that are densely distributed within the transferrin receptor cluster compared to other organ tissues or cells.
  • the functional structure was designed to reflect the effective binding affinity with the helical region of the transferrin receptor and the specific distribution/expression pattern of the transferrin receptor cluster distributed in the brain vascular region, and is comprised of 4 to 8 valent transferrin receptors.
  • a blood-brain barrier permeable fusion protein containing a helical region binding moiety if the number of moieties linked to the C-terminal region is equal to or greater than the number of moieties linked to the N-terminal region, the permeability to the blood-brain barrier is With this improvement, the delivery efficiency to brain tissue could be improved.
  • a functional structure is provided that is linked to the binding moiety and can contribute to improving the blood-brain barrier permeability of the IgG antibody, while inducing selective delivery to brain tissue and reducing the side effects of antibody-based drugs. newly identified.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein is a fusion protein in which the helical region binding moiety of a bivalent transferrin receptor is linked, for example, the moiety may be linked to each C-terminus of the heavy chain, and the helical region binding moiety of the light chain may be linked. A moiety may be connected to each C-terminus.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein is a fusion protein in which the helical region binding moiety of the tetravalent transferrin receptor is linked, for example, the moiety may be linked to each of the N-terminus and C-terminus of the heavy chain, , the moiety may be connected to each of the N-terminus of the light chain and the C-terminus of the light chain, and the moiety may be connected to each of the N-terminus of the light chain and the C-terminus of the heavy chain, and the N-terminus of the heavy chain and the light chain.
  • the moiety may be connected to each of the C-termini of , and the moiety may be connected to each of the C-termini of the light chain and heavy chain.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein is a fusion protein in which the helical region binding moiety of the hexavalent transferrin receptor is linked, for example, gathered at the N-terminus of the light chain, the C-terminus of the light chain, and the C-terminus of the heavy chain, respectively.
  • the tee may be connected, and the moiety may be connected to the N-terminus of the heavy chain, the C-terminus of the light chain, and the C-terminus of the heavy chain, respectively.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein is a fusion protein in which the helical region binding moiety of the octavalent transferrin receptor is linked, for example, the N-terminus of the light chain, the N-terminus of the heavy chain, the C-terminus of the light chain, and the heavy chain. A moiety may be connected to each C-terminus.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein may be formulated and administered, and the administration may be performed by a non-limiting method of administering a conventional fusion protein or antibody-based formulation, for example, intravenous administration. , intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, ocular administration, intrathecal administration, intracerebroventricular administration, intranasal administration, etc.
  • the fusion protein can provide an appropriate level of interaction or binding affinity with a partial region of the receptor present on the surface of the cells constituting the blood-brain barrier, that is, the helical region of the transferrin receptor.
  • the fusion partner IgG antibody
  • Another aspect includes a polynucleotide encoding the fusion protein; A vector containing the polynucleotide; Alternatively, a transfected cell line transfected with the vector is provided.
  • the polynucleotide may be in the form of RNA or DNA, including cDNA and synthetic DNA.
  • DNA can be single-stranded or double-stranded. If single stranded, it may be a coding strand or a non-coding (antisense) strand, and the coding sequence may, as a result of the degeneracy or redundancy of the genetic code, encode the same polypeptide. there is.
  • the polynucleotide may also include variants of the polynucleotides described herein, wherein the variants of the polynucleotide may be naturally occurring allelic variants of the polynucleotide or non-naturally occurring variants of the polynucleotide. You can.
  • An allelic variant is an alternate form of a polynucleotide that may have a substitution, deletion, or addition of one or more nucleotides that does not substantially alter the function of the polynucleotide being encoded. It is well known in the art that a single amino acid can be encoded by more than one nucleotide codon and that the polynucleotide can be easily modified to produce alternating polynucleotides encoding the same peptide.
  • the term “vector” refers to a DNA vehicle capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a genetic construct containing regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • a vector may include expression control elements such as a promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal, and/or enhancer, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may be an expression vector that can stably express the fusion protein in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional vector used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the vector may include a selectable marker for selecting host cells containing the vector and, if the vector is replicable, may include an origin of replication.
  • the vector may self-replicate or be introduced into host DNA, and the vector may be selected from the group consisting of plasmids, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, retroviruses, herpes simplex viruses, and vaccinia viruses. It could be.
  • the vector contains a promoter operable in animal cells, preferably mammalian cells.
  • suitable promoters include promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from the genome of mammalian cells, such as CMV (cytomegalovirus) promoter, T7 promoter, U6 promoter, H1 promoter, MLV (murine leukemia) Virus) LTR (long terminal repeat) promoter, adenovirus early promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, HSV tk promoter, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionein promoter, beta- Actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, promoter of human GM-CSF gene, human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter , mouse
  • CMV cytome
  • a polynucleotide sequence encoding a blood-brain barrier permeable fusion protein may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, thereby regulating said nucleic acid sequence. The sequence will regulate transcription and/or translation of the other nucleic acid sequences.
  • transfection refers to the genetic transformation of cells by infiltrating between cells a DNA chain fragment or plasmid containing a foreign gene of a different type from that of the original cell and combining with the DNA present in the original cell. refers to molecular biological technology that changes The transfection means that a polynucleotide encoding the above-described blood-brain barrier permeable fusion protein, or a vector containing it, is inserted into a host cell to produce the blood-brain barrier permeable fusion protein.
  • the transfected cell line or host cell is preferably prokaryotes such as bacteria, microorganisms including eukaryotes such as yeast, insect-derived cells such as Sf9 cells, mouse-derived cells such as CHO cells, human-derived cells such as HEK293, and It may be any one selected from the group consisting of antibody producing hybridomas, but is not limited thereto.
  • prokaryotes such as bacteria, microorganisms including eukaryotes such as yeast, insect-derived cells such as Sf9 cells, mouse-derived cells such as CHO cells, human-derived cells such as HEK293, and It may be any one selected from the group consisting of antibody producing hybridomas, but is not limited thereto.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with brain dysfunction comprising the fusion protein as an active ingredient; Medicinal use of the fusion protein for the prevention or treatment of diseases associated with brain dysfunction; Alternatively, it provides a method of treating a disease associated with brain dysfunction, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of diseases associated with brain dysfunction by administering the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to any action in which symptoms of a disease associated with brain dysfunction are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition.
  • Disease associated with brain dysfunction which is a disease to be prevented or treated by the pharmaceutical composition, includes Alzheimer's dementia; Dementia with Lewy bodies; frontotemporal dementia; Neurofibrillary tangles - predominant dementia; Parkinson's disease; cognitive dysfunction; multiple sclerosis; amyotrophic lateral sclerosis; traumatic brain injury; Progressive supranuclear palsy; Corticobasal degeneration; glial tauopathy; Age-related tau astrogliopathy; chronic traumatic encephalopathy; brain cancer, including primary central nervous system lymphoma, glioma, neuroblastoma, glioblastoma, meningioma, and brain metastasis; Pick's disease; anti-IgLON5 associated tauopathy; Guadeloupe Parkinsonism; Nohing Syndrome; ache; epilepsy; autism; stroke; Guillian-Barré syndrome; Creutzfeldt-Jakob disease; Huntington's disease; Progressive multifocal leukoencephalopathy;
  • the helical region binding moiety is linked to or added to the N-terminal and C-terminal regions of each IgG antibody, and does not cause any modification to the CDR region or variable region of the IgG antibody. No. Therefore, the high penetrating ability across the blood-brain barrier and the selective delivery efficacy to brain tissue confirmed in one example may lead to improved treatment effects for diseases associated with brain dysfunction.
  • the pharmaceutical composition i.e., a pharmaceutical preparation comprising a fusion protein, comprises the antibody having the desired degree of purity in any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) in the form of a lyophilized preparation or aqueous solution.
  • Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; Antioxidants such as ascorbic acid and methionine; Preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexamethylamine 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; Proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates such as glucose, mannose, or
  • the pharmaceutical compositions may contain additional active ingredients, optionally ingredients with complementary activities that do not adversely affect each other.
  • the type and effective amount of the pharmaceutical composition are determined, for example, depending on the amount of antibody present in the preparation and the clinical parameters of the subject.
  • the active ingredients are placed in microcapsules prepared, for example, by droplet formation techniques or by interfacial polymerization, for example hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly-(methylmethacrylate) microcapsules, respectively, for colloidal drug delivery. They can be delivered in systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in encapsulated form by macroemulsions.
  • compositions can be formulated, dosed, and administered in a manner consistent with medical practice. Factors to consider in this regard include the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to the physician.
  • Antibodies may, but need not, be formulated with one or more agents currently used for the prevention or treatment of disease.
  • the effective amount of the other agent will depend on the amount of antibody present in the agent, the type of disorder or treatment, and other factors. They are generally administered in the same dosages and routes of administration as described herein, or from about 1 to 99% of the dosages described herein, or by any dosage and any route empirically/clinically determined to be appropriate. It is used.
  • the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with other agents.
  • the pharmaceutical composition can be co-administered with at least one additional therapeutic agent.
  • additional therapeutic agents are effective therapeutic agents for the treatment of diseases associated with brain dysfunction and include, but are not limited to: cholinesterase inhibitors (e.g. donepezil, galantamine, lovastigmine and tacrine), NMDA.
  • Receptor antagonists e.g.
  • amyloid beta peptide aggregation inhibitors antioxidants, ⁇ -secretase modulators, nerve growth factor (NGF) mimics or NGF gene therapy agents, PPAR ⁇ agonists, HMS-CoA reduction Enzyme inhibitors (statins), ampakines, calcium channel blockers, GABA receptor antagonists, glycogen synthase kinase inhibitors, intravenous immunoglobulins, muscarinic receptor agonists, nicotinic receptor modulators, active or passive amyloid beta peptides. Immunization, phosphodiesterase inhibitors, serotonin receptor antagonists and anti-amyloid beta peptide antibodies.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition depends on the type of disease being treated, the severity and course of the disease, and the antibody level. Whether administered for prophylactic or therapeutic purposes will be determined based on the previously administered therapy, the patient's clinical history and response to antibodies, and the judgment of the attending physician.
  • the antibody is suitably administered to the patient at once or over a series of treatments, and for the purpose of the present invention, the antibody may be provided in the form of a fusion protein bound to the helical region binding moiety of the transferrin receptor.
  • approximately 1 ⁇ g/kg to 100 mg/kg (e.g., 0.1 mg/kg to 100 mg/kg) of the antibody or fusion protein may be administered, for example, by one or more separate administrations; or it may be an initial candidate dose for administration to a patient, whether by continuous infusion.
  • a typical daily dosage may range from about 1 ⁇ g/kg to 100 mg/kg or more depending on the factors mentioned above. For repeated administration over a period of several days or longer, depending on the condition, treatment will generally continue until the required suppression of disease symptoms occurs.
  • One exemplary dosage of antibody or fusion protein would range from about 0.05 mg/kg to about 100 mg/kg.
  • one or more doses of about 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg or 10 mg/kg, 20 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient.
  • the dosage may be administered intermittently, e.g., weekly or every three weeks (e.g., the patient is administered a dose of about 2 mg/kg to about 20 mg/kg, or e.g., about 6 mg/kg of the antibody or fusion protein). as much as possible) can be administered.
  • An initial higher loading dose may be followed by one or more lower doses.
  • the term “subject” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, mammals such as humans or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cattle. means.
  • the blood-brain barrier permeable fusion protein includes a helical region binding moiety of a tetravalent to octavalent transferrin receptor linked to at least one of the N-terminal and C-terminal regions of an IgG antibody, wherein the C-terminal
  • the number of moieties connected to the region is equal to or greater than the number of moieties connected to the N-terminal region, it was confirmed that delivery of IgG antibodies in brain tissue was significantly enhanced by effective interaction between the moiety and the transferrin receptor. did.
  • the fusion protein can be used as an active ingredient in pharmaceutical compositions for the medical field requiring selective drug delivery to brain tissue, for example, for the prevention or treatment of diseases associated with brain dysfunction. .
  • Figure 1 is a diagram schematically showing an exemplary structure of a blood-brain barrier permeable fusion protein according to an embodiment.
  • Figure 2 shows the blood-brain barrier permeability fusion protein (4V-#01, 4V-#02, 4V-#03) to which a tetravalent helical region binding moiety according to an embodiment is administered intravenously to an animal model, and then This is the result of confirming the level of IgG1 antibodies in brain tissue after 4 days using the Human IgG1 ELISA kit.
  • Figure 3 shows brain tissue 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier permeable fusion protein (6V-#01) linked to a hexavalent helical domain binding moiety according to one embodiment to an animal model. This is the result of confirming the level of my IgG1 antibody using the Human IgG1 ELISA kit.
  • a blood-brain barrier permeable fusion protein (6V-#01) linked to a hexavalent helical domain binding moiety
  • Figure 4 shows brain tissue 4 days after intravenous administration of a blood-brain barrier permeable fusion protein (8V-#01) linked to an octavalent helical domain binding moiety according to an embodiment to an animal model. This is the result of confirming the level of my IgG1 antibody using the Human IgG1 ELISA kit.
  • a fusion protein with improved blood-brain barrier permeability linked to a tetravalent transferrin receptor helical domain binding moiety was prepared in which the number of moieties connected to the C-terminal region is equal to or greater than the number of moieties linked to the N-terminal region.
  • the monomer of SEQ ID NO: 3 (SHHERLKSDEWSVTSGGL) was used as the helical region binding moiety of the transferrin receptor, and the anti-PD-L1 IgG1 antibody was used as the IgG1 antibody.
  • a 1 mL sample was collected with a pipette from a flask containing cells, and the cell mass was measured. Afterwards, if the cell survival rate is more than 95% and the cell mass is more than 4 ⁇ 6 ⁇ 106 cells/mL, add culture medium stored in an incubator at 37°C and culture it so that the cell mass level is 9 ⁇ 106 cells/mL. Ready. Afterwards, transfection was performed on the prepared cells according to the following experimental conditions.
  • feed media and enhancer are processed on the 1st day of culture, and feed media is processed and cultured on the 4th day of culture.
  • Transfected cells were obtained when the cell viability was below 70% or when 8 days had elapsed from the date of transfection.
  • the sample containing the transfected cells was centrifuged at 4500 rpm and 25°C for 15 minutes, and the supernatant was recovered therefrom.
  • the supernatant is filtered using a 0.22 ⁇ m filter.
  • the filtrate was purified using purification techniques such as affinity chromatography and size exclusion chromatography to obtain each fusion protein.
  • the purified antibody was analyzed by SEC-HPLC (size exclusion high performance liquid chromatography), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), and mass spectrometry to confirm the purification results.
  • the valence of the helical region binding moiety of the transferrin receptor and the C-terminal and N-terminal linking sites of the IgG antibody linked to the moiety are as follows.
  • a fusion protein with improved blood-brain barrier permeability linked to the hexavalent transferrin receptor helical domain binding moiety is prepared.
  • the fusion protein in which the number of moieties linked to the C-terminal region is equal to or greater than the number of moieties linked to the N-terminal region is as described above. It was prepared in the same way.
  • the valence of the helical region binding moiety of the transferrin receptor and the C-terminal and N-terminal linking sites of the IgG antibody linked to the moiety are as follows.
  • a fusion protein with improved blood-brain barrier permeability linked to an octavalent transferrin receptor helical domain binding moiety An octavalent fusion protein in which the number of moieties linked to the C-terminal region was the same as the number of moieties linked to the N-terminal region was prepared in the same manner as above. Meanwhile, in the fusion protein according to this example, the valence of the helical region binding moiety of the transferrin receptor and the C-terminal and N-terminal linking sites of the IgG antibody linked to the moiety are as follows.
  • a tetravalent fusion protein in which the number of moieties linked to the N-terminal region was greater than the number of moieties linked to the C-terminal region was prepared in the same manner as above. Meanwhile, in the fusion protein according to this comparative example, the valence of the helical region binding moiety of the transferrin receptor and the C-terminal and N-terminal linking sites of the IgG antibody linked to the moiety are as follows.
  • a hexavalent fusion protein in which the number of moieties linked to the N-terminal region was greater than the number of moieties linked to the C-terminal region was prepared in the same manner as above. Meanwhile, in the fusion protein according to this comparative example, the valence of the helical region binding moiety of the transferrin receptor and the C-terminal and N-terminal linking sites of the IgG antibody linked to the moiety are as follows.
  • the level of absorption of IgG1 antibodies into brain tissue was evaluated by intravenous administration of a blood-brain barrier permeable fusion protein to which a tetravalent helical domain binding moiety is linked according to an example.
  • a preparation containing 20 mg/kg of fusion protein (4V-#01, 4V-#02, 4V-#03, or 4V-C#01) was intravenously administered to C57BL/6 mice through the caudal vein; After 4 days, the mouse was anesthetized and blood was collected from the blood vessels inside the eyes or the abdominal vein. Afterwards, blood was removed by perfusion with physiological saline.
  • the brain of the mouse was extracted, and the extracted brain tissue was rapidly frozen with liquid nitrogen and stored in a deep freezer until use. Meanwhile, the extracted brain tissue was homogenized using a protein extraction solution, and then the homogenized brain tissue sample was dissolved at 4°C using a rotating mixer. Afterwards, the dissolved brain tissue sample was centrifuged, and the supernatant was obtained to prepare a brain tissue lysate. Afterwards, the level of IgG1 antibody in the brain tissue lysate was measured using a human IgG1 ELISA kit.
  • a standard (STD) was prepared by diluting to each concentration using a protein extraction solution, and a sample (SPL) containing brain tissue lysate was prepared according to each dilution ratio using a protein extraction solution. 50uL of this was added to each well. Afterwards, an additional 50uL of Ab cocktail contained in the ELISA kit was added to each well, and then reacted at 4°C. After washing the plate, 100 uL of TMB substrate was added to each well. Subsequently, when the O.D value of STD1 reached 1.0 at a wavelength of 600 nm using a microplate reader, stop solution was added, the value at a wavelength of 450 nm was measured, and a standard curve was created using 4 parameter logistic regression. obtained, and from this, the concentration of IgG1 antibody present in the sample (SPL) was calculated. Meanwhile, in this experimental example, a group administered intravenously only IgG1 antibody was used as a control group.
  • the level of IgG1 antibodies in the brain tissue of the group administered the blood-brain barrier permeable fusion protein 4V-#01, 4V-#02, or 4V-#03 according to one embodiment was observed to be high.
  • the level of absorption of IgG1 antibodies into brain tissue was evaluated by intravenous administration of a blood-brain barrier permeable fusion protein to which a hexavalent helical domain binding moiety is linked according to an example.
  • a preparation containing a fusion protein (6V-#01, 6V-C#01, or 6V-C#02) according to an example, IgG1 present in the sample
  • the concentration of antibody was calculated.
  • a group administered intravenously only IgG1 antibody was used as a control group.
  • a fusion protein in which the number of moieties linked to the N-terminal region is greater than the number of moieties linked to the C-terminal region, that is, the N-terminus of the light chain, the N-terminus of the heavy chain, and Fusion protein 6V-C#01, in which a moiety is linked to each of the C-termini of the heavy chain, or fusion protein 6V-C#, in which a moiety is linked to each of the N-terminus of the light chain, the N-terminus of the heavy chain, and the C-terminus of the light chain.
  • the level of IgG1 antibodies in the brain tissue of the 02 administration group was low on the 4th day after intravenous administration
  • the level of IgG1 antibodies in the brain tissue of the blood-brain barrier permeable fusion protein 6V-#01 administration group was observed to be high.
  • the above results show that even in blood-brain barrier permeable fusion proteins with hexavalent helical region binding moieties, when the number of moieties linked to the C-terminal region is greater than the number of moieties linked to the N-terminal region, the IgG antibody is absorbed into the brain. This indicates that it can be delivered to the organization at a high level.
  • the level of absorption of IgG1 antibodies into brain tissue was evaluated by intravenous administration of a blood-brain barrier permeable fusion protein linked to an octavalent helical domain binding moiety according to an example.
  • concentration of IgG1 antibody present in the sample was calculated for a preparation containing the fusion protein (8V-#01) according to one example.
  • a group administered intravenously only IgG1 antibody was used as a control group.
  • the brain tissue of the group administered fusion protein 8V-#01 where moieties were linked to the N-terminus of the light chain, the N-terminus of the heavy chain, the C-terminus of the light chain, and the C-terminus of the heavy chain, respectively.
  • the level of my IgG1 antibodies was observed to be high 4 days after intravenous administration.
  • the above results are similar to the above-mentioned experimental results, when the number of moieties connected to the C-terminal region is the same as the number of moieties connected to the N-terminal region, that is, the blood-brain barrier permeability to which the octavalent helical region binding moiety is connected.
  • the fusion protein indicates that IgG antibodies can be delivered to brain tissue at high levels.

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Abstract

본 출원은 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질로서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 것인, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, IgG 항체 및 상기 IgG 항체 말단에 연결된 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질 및 이의 의약적 용도에 관한 것이다. 본 특허출원은 2022년 10월 14일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2022-0132729호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
뇌혈관장벽(blood-brain barrier: BBB)은 뇌와 혈액을 격리시키는 혈관 장벽으로서, 뇌를 포함하는 중추신경계를 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 격리시키는 역할을 한다. 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 성상세포(astrocyte), 및 혈관주위세포(pericyte) 등의 세포로 이루어진 뇌혈관 중심의 구조체이며, 뇌 조직 내 뇌 혈관에 전반적으로 분포해 있다. 뇌혈관장벽 내피세포는 밀착 연접(tight junction)으로 단단하게 결합되어 있고, 성상세포와 성상세포 종족(end feet)은 혈관 주변을 에워싸고 있어, 뇌혈관 내부 혈액을 따라 흐르는 물질이 혈관장벽을 투과하여 뇌 조직으로 흡수/전달되는 것을 선택적으로 저해하는 장벽을 형성한다. 이러한 장벽과 같은 구조는 물질의 종류와 크기에 따라 선택적으로 물질 투과를 허용하거나 또는 투과를 억제시키게 되는데, 생명 유지에 필수적인 물이나 산소의 경우는 확산에 의해 뇌혈관장벽을 통과할 수 있고, 에너지원으로 사용되는 아미노산이나 글루코스의 경우에는 능동 수송에 의해 혈액에서 뇌 조직으로 전달될 수 있다. 그러나, 뇌에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 독성 물질, 및 병원균 등은 뇌혈관장벽에 의해 물질 전달이 억제될 뿐만 아니라 설사 투과된다 할지라도 세포의 펌핑 작용에 의해 다시 혈액으로 되돌아오게 되어 뇌 조직으로의 흡수를 막아, 뇌 조직을 보호하는 역할을 한다.
그러나, 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 뇌암 등과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 실제로, 400~500 Dalton 이하의 분자량을 갖는 극히 일부의 치료 약물만이 뇌혈관장벽을 투과할 수 있는 것으로 보고된 바 있으며, 대부분의 치료 약물은 뇌혈관장벽에 의해 뇌 조직에 전달되지 못하거나 극 소량만이 전달되어 표적 기관인 뇌 조직에서의 효능이 발휘되지 못하고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 약물의 지용성화를 통해 내피세포의 세포막을 직접 통과시키는 기술, 선천적 영양소 전달 체계를 통한 전달 기술, 및 수용체 매개 트랜스시토시스(transcytosis)를 이용한 항체 기반의 전달 기술이 제안되었다. 그러나 이러한 기술들은 뇌 뿐만 아니라 다른 장기에도 작용하기 때문에 체내 부작용의 우려가 존재하며, 환자 별 전달의 효능 차이로 인해 적정 농도 또는 함량을 정하기 어렵다는 문제로 인해 임상적 활용에는 한계가 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성 증진 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 향상시키기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나(한국 공개 특허 제10-2021-0005647호), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명자들은 이러한 종래 기술의 한계점을 극복하기 위하여, IgG 항체 및 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 경우, 뇌혈관장벽에 대한 투과성이 증진되어 뇌 조직으로 전달 효율이 향상될 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질주입된 세포주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질로서,
상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역에 연결된 4 내지 8가의 helical 영역 결합 모이어티는 하기 식 1의 조건을 만족하는 것인, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공한다.
[식 1]
Cm ≥ Nm
상기 식 1에서, Cm은 IgG 항체의 C-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타내고, Nm은 IgG 항체의 N-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타낸다.
뇌혈관장벽(Blood-brain barrier: BBB )
본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽(blood-brain barrier: BBB)"은 혈액 내 존재하는 이온, 분자, 병원체와 같은 물질에 대한 뇌 조직으로의 이동을 엄격하게 제어하면서, 아미노산, 글루코스 등 생명 유지에 필수적인 성분들에 대한 선택적인 흡수를 가능하게 하는 뇌혈관 중심의 구조체를 지칭한다. 상기 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포, 성상세포, 및 혈관주위세포 등의 세포들로 이루어진다. 상기 세포들은 공통의 기저막을 공유하는 형태로 배열되고, 뇌혈관장벽의 일 측면에는 단단하게 연결된 뇌혈관장벽 내피세포, 다른 면에는 혈관 주변을 에워싸고 있는 성상세포가 분포한다. 뇌혈관장벽 내피세포는 모세혈관의 벽을 구성하며, 매우 단단하고 복잡한 밀착 연접(tight junction)으로 연결되어 있다. 이러한 구조는 물리적인 장벽을 형성하여 인슐린과 같은 평균 크기에서 큰 크기의 분자를 포함한 대부분의 물질의 단순 확산을 저해하는 역할을 한다. 또한, 성상세포는 중추신경계의 신경아교세포(glial cell)의 일종으로, 뇌 혈관과의 상호 작용을 통해 뇌의 내피 세포 기능, 혈액 흐름, 이온 균형에 영향을 미친다. 성상세포는 종족(end feet)이라는 돌기(process)를 이용해 한쪽 끝으로는 혈관을 감싸고 다른 쪽 끝은 시냅스(synapse)에서 뉴런과 밀접하게 접촉한다. 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 뇌 조직을 보호함과 동시에, 질병의 치료에 유효한 물질이 뇌 조직으로 전달되는 것 역시 방해하므로, 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 따라서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 기술은 뇌 조직을 타겟으로 하는 의약 분야에서 치료제의 응용 가능성 또는 효능을 향상시킬 수 있다.
IgG 항체 (IgG antibody)
본 명세서에서 용어, "IgG 항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자로서, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 지칭한다. 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전장(full-length) 항체, 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 상기 전장 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및/또는 알파2(α2)를 가질 수 있다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및/또는 람다(λ) 타입일 수 있다. 상기 전장 항체는 바람직하게 IgG일 수 있으며, 이의 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 천연형 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 천연형 항체란 유전자 조작을 가하지 않은 항체를 뜻하며, 생체 내에서 유전자 조작된 항체가 지닐 수 있는 면역원성(immunogenicity)의 위험성이 현저히 낮을 수 있다. 재조합 항체란 유전자 조작된 항체를 의미하며, 유전자 조작을 통하여 항원 결합력이나 원하는 특징을 추가할 수 있는 특징이 있다.
또한, 상기 항체는 미가공 분자뿐만 아니라 원하는 표적과 특이적으로 상 호작용할 수 있는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 및 scFv-Fc 이가 분자와 같은 기능적 항체 단편 또는 이들의 조합을 각각 의미할 수 있다. 또한, 상기 항원-결합 단편은 예시적으로 다음을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 IgG-like bispecific 항체의 구조가 비제한적으로 채용될 수 있다: (1) Fab, 항체 분자의 단가 항원-결합 단편을 포함하고, 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 미가공 경쇄 및 하나의 중쇄의 부분을 수득하도록 생산될 수 있는 단편; (2) Fab', 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 미가공 경쇄 및 중쇄의 부분을 수득하도록 얻을 수 있는 항체 분자의 단편; 항체 분자 당 획득된 두 개의 Fab' 단편; (3) (Fab')2, 전체 항체를 후속적 환원 없이 효소 펩신으로 처리하여 획득될 수 있는 항체의 단편 및 두 개의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 두 개의 Fab' 단편의 이량체; (4) Fv, 두 개의 사슬로서 발현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 단편; (5) 단일 사슬 항체 (SCA 또는 scFv), 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 분자; (6) scFv-Fc, 단일 사슬 Fv (scFv)를 IgG 및 Fc 영역과 같은 면역글로불린 (Ig)으로부터의 힌지 영역과 융합시켜 생성된 분자.
본 명세서에서, 상기 IgG 항체는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와 융합체를 이루는 대상으로서, 상기 IgG 항체를 구성하는 경쇄 및 중쇄에서, 각각의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 어느 하나 이상의 영역은 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결 또는 접합되어 있을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료, 완화, 또는 검출하는데 적용 가능한, 당업계 공지의 표적 항원과 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있고, 예를 들어, 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 약제학적 활성 물질일 수 있다. 상기 IgG 항체는 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease); 루이체 치매(dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매(frontotemporal dementia); 신경원 섬유 매듭-우세 치매(tangle only dementia); 파킨슨병(Parkinson`s disease); 인지기능 장애; 다발성 경화증(multiple sclerosis); 근 위축 측삭 경화증(amyotrophic Lateral sclerosis: ALS); 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury); 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy); 피질기저핵변성(corticobasal degeneration); 신경교 타우병증(globular glial tauopathy); 노화 관련 타우 성상교병증(aging-related tau astrogliopathy); 만성 외상성 뇌병증(chronic Traumatic Encephalopathy: CTE); 원발성 중추신경계 림프종(primary CNS lymphoma: PCNSL), 신경교종(glioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 교모세포종(glioblastoma multiforma), 뇌수막종(meningioma), 및 뇌 전이암 등을 포함하는 뇌암; 피크병(Pick's disease); 항-IgLON5 관련 타우병증(anti-IgLON5-related tauopathy); 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism); 나딩신드롬(nodding syndrome); 통증(pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증(autism); 뇌졸중(stroke); 길리안-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome: GBS); 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD); 헌팅톤병(Huntington`s disase); 진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy: PML); 우울증(depression); 외상후 스트레스 장애(post traumatic stress disorder: PTSD); 및 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disease: LSD)과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 항체일 수 있고, 예를 들어, anti-PD-L1 IgG 항체, anti-PD1 IgG 항체, anti-Tau IgG 항체, anti-HER2 IgG 항체, anti-Aβ IgG 항체, anti-TDP-43 IgG 항체, anti-alpha-synuclein IgG 항체, anti-SIGLEC3 IgG 항체, 또는 anti-TREM2 IgG 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 (Transferrin receptor: TfR)
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)"는 혈장 당단백질인 트랜스페린으로부터 철의 세포 내 흡수를 매개하는 세포의 표면상에 발현된 막 당단백질을 지칭하며, 다양한 조직의 정상 세포에 광범위하게 분포되어 있을 뿐만 아니라, 활성화된 면역 세포 및 종양 세포 등에도 다량으로 발현되어 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달기술은 뇌 조직으로의 유효한 전달뿐만 아니라, 뇌 조직 이외 다른 장기 또는 정상 세포에 대한 낮은 전달이 요구된다. 실제로, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달체 또는 치료제는 망상적혈구 수의 감소, 심한 혼수, 간헐적인 사지 경직, 전신 경직, 용혈 및 헤모글로빈뇨증을 포함한 적혈구 관련 독성을 야기할 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, 상기 트랜스페린 수용체의 세포막외 도메인(ectodomain)은 apical 도메인, helical 도메인 및 protease-like 도메인으로 구분되며, 이들은 수용체 매개 트랜스시토시스(transcytosis) 과정에서 타겟 물질과 상이한 결합 친화력을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기 트랜스페린 수용체의 유전 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 수득할 수 있으며, 예를 들어, 상기 트랜스페린 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 클러스터(Transferrin receptor cluster)
본 명세서에서 용어,"트랜스페린 수용체 클러스터"는 복수 개의 트랜스페린 수용체가 국소 영역에서 밀집하게 존재하는 군집을 지칭하며, 상기 트랜스페린 수용체 클러스터는 복수 개의 트랜스페린 수용체들이 뭉쳐져 있는 형태로 혈관 등의 조직 또는 세포에 분포할 수 있다. 특히, 다른 장기 조직 또는 세포에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 달리, 뇌 혈관 영역에 존재하는 트랜스페린 수용체 클러스터는 특이적인 발현 패턴을 갖는 것일 수 있다, 구체적으로, 상기 특이적인 발현 패턴은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 클러스터가 형성된 국소 영역 내 트랜스페린 수용체가 현격한 수준으로 조밀하게 분포되어 있는 상태를 지칭하며, 이러한 뇌 조직 특이적인 클러스터 및 클러스터 내 트랜스페린 수용체의 발현 패턴은 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 뇌 조직으로의 선택적 전달과 밀접한 연관 관계를 나타낼 수 있다.
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티"는 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체와 상호 작용하는 기능적 단위를 지칭하며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체를 구성하는 영역 중 helical 영역에 대하여 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티를 의미하는 것일 수 있다. 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관에 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 발현 패턴을 반영한 것으로서, 상기 IgG 항체와 연결되어 복수 개의 결합을 형성하며, 바람직하게는 2 내지 8가, 더욱 바람직하게는 4 내지 8가일 수 있다. 여기서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역은 뇌 조직 혈관의 클러스터 내 조밀하게 분포된 복수 개의 트랜스페린 수용체와 유효한 복수 개의 결합이 형성되도록 외부로 노출된 기능적/구조적 영역이며, 이는 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달에 기여할 수 있다. 따라서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 결합이 가능한, 결합 모이어티는 IgG 항체와 연결되어 상기 IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 현격하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 뇌 조직으로의 선택적인 전달/흡수를 가능하게 하는 기능성을 부여할 수 있다.
상기 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관 영역에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 상호 작용하여 융합체를 형성하기 위한 것으로서, 상기 클러스터가 형성된 국소 영역 내 복수의 트랜스페린 수용체와 결합 친화력을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체의 helical 영역, 보다 구체적으로, 서열번호 1의 트랜스페린 수용체를 기준으로 606번째 아미노산부터 665번째 아미노산까지의 영역 중 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산과 결합 친화력을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나에 연결될 수 있으며, 상기 말단 영역에 연결된 4 내지 8가의 helical 영역 결합 모이어티는 하기 식 1의 조건을 만족함으로써, 목적하는 기능을 발휘할 수 있다:
[식 1]
Cm ≥ Nm
상기 식 1에서, Cm은 IgG 항체의 C-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타내고, Nm은 IgG 항체의 N-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 대칭적으로 연결된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 helical 영역 결합 모이어티는 1쌍의 중쇄 펩타이드 및 1쌍의 경쇄 펩타이드를 포함하는 "Y형" 구조를 갖는 IgG 항체에 대하여, 상기 IgG 항체의 경첩(hinge) 부위를 가로지르는 종축을 기준선으로 하여 대칭적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 말단 영역에 연결될 수 있다.
일 구체예에서, 전술한 바와 같이, 상기 helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 대칭적으로 연결되므로, 상기 Cm 또는 Nm은 각각 짝수 개일 수 있고, 예를 들어, 상기 Cm 및 Nm은 각각 독립적으로 0, 2, 및 4 중 어느 하나 정수일 수 있으며, 여기서, 상기 Cm과 Nm의 합은 2, 4, 6 및 8 중 어느 하나의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 6 내지 250개의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 길이는 6 내지 240개, 6 내지 220개, 6 내지 200개, 6 내지 180개, 6 내지 160개, 6 내지 140개, 6 내지 120개, 6 내지 100개, 6 내지 80개, 6 내지 60개, 6 내지 40개, 6 내지 20개, 6 내지 10개, 10 내지 250개, 10 내지 240개, 10 내지 220개, 10 내지 200개, 10 내지 180개, 10 내지 160개, 10 내지 140개, 10 내지 120개, 10 내지 100개, 10 내지 80개, 10 내지 60개, 10 내지 40개, 10 내지 20개, 20 내지 250개, 20 내지 240개, 20 내지 220개, 20 내지 200개, 20 내지 180개, 20 내지 160개, 20 내지 140개, 20 내지 120개, 20 내지 100개, 20 내지 80개, 20 내지 60개, 20 내지 40개, 40 내지 250개, 40 내지 240개, 40 내지 220개, 40 내지 200개, 40 내지 180개, 40 내지 160개, 40 내지 140개, 40 내지 120개, 40 내지 100개, 40 내지 80개, 40 내지 60개, 60 내지 250개, 60 내지 240개, 60 내지 220개, 60 내지 200개, 60 내지 180개, 60 내지 160개, 60 내지 140개, 60 내지 120개, 60 내지 100개, 60 내지 80개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 단위체 서열이 2회 내지 5회 반복되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 2 내지 70개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2 내지 60개, 2 내지 50개, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 5개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 링커 펩타이드는 예를 들어, (GlSm)n(l은 2 내지 8, m은 1 내지 5, n은 1 내지 5), (GdSeAS)f(d는 2 내지 8, e는 1 내지 5, f는 1 내지 5),　(G4S)a(EAAAK)b(G4S)a(a, b는 1 내지 4의 정수), [(G4S)p(EAAAK)q]r(p, q, r은 1 내지 4의 정수)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 구성하는 단위체 서열은 세포 투과성 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 유효한 상호 작용(수소결합, 정전기적 인력, 소수성 결합, 반데르발스힘), 즉, 유효한 결합 친화력을 갖는 단위체 서열이라면, 비제한적으로 확장 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 복수 개의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티 각각은 동일하거나, 상이한 것일 수 있다.
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질
본 명세서에서 용어, "융합 단백질"은 둘 이상의 본래 별개인 단백질, 또는 이의 일부의 결합을 통해 형성된 단백질을 지칭하며, 선택적으로, 둘 이상의 단백질 사이에 위치하는 링커 또는 스페이스를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질"은 IgG 항체 및 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티간 결합을 통해 형성된 단백질로서, 뇌혈관장벽을 투과하여 유효한 양의 IgG 항체가 뇌 조직에 선택적으로 전달 또는 흡수될 수 있도록 하는 기능적 구조를 포함하는 단백질을 총칭하는 것일 수 있다. 상기 기능성 구조는 뇌혈관장벽에 특이적으로 분포하는 혈관내피세포의 트랜스페린 수용체 클러스터의 구조 및 이들의 발현 양상을 반영하여 유효한 결합 친화력을 갖도록 변형된 것으로서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합할 수 있는 결합 모이어티, 및 IgG 항체를 구성하는 중쇄 및/또는 경쇄의 말단 영역과 상기 결합 모이어티간 2가 내지 8가의 결합(연결)을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 말단, 및 중쇄의 말단 영역에, 2가 내지 8가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 형태의 기능적 구조를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에, 4가 내지 8가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 형태로서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 것을 특징으로 하는, 기능적 구조를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체의 경쇄 말단 및/또는 중쇄 말단 영역과 helical 영역 결합 모이어티와의 연결은 상기 언급한 IgG 항체의 말단 영역에 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있으며, 링커 펩타이드에 대한 사항은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 트랜스페린 수용체 클러스터 내 조밀하게 분포된, 복수의 트랜스페린 수용체와 결합하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 기능적 구조는 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 유효한 결합 친화력, 및 뇌 혈관 영역에 분포하는 트랜스페린 수용체 클러스터의 특이적인 분포/발현 양상을 반영하여 고안된 것으로서, 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 경우, 뇌혈관장벽에 대한 투과성이 증진되어 뇌 조직으로 전달 효율이 향상될 수 있었다. 따라서, 일 실시예에서는 상기 결합 모이어티와 연결된, IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 증진시킴과 동시에 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 유도하고, 항체 기반 약물의 부작용을 경감시키는데 기여할 수 있는 기능적 구조를 새롭게 규명하였다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 2가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질로서, 예를 들어, 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 경쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 4가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질로서, 예를 들어, 중쇄의 N-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 경쇄의 N-말단 및 경쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 경쇄의 N-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 중쇄의 N-말단 및 경쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 경쇄 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 6가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질로서, 예를 들어, 경쇄의 N-말단, 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있고, 중쇄의 N-말단, 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 8가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질로서, 예를 들어, 경쇄의 N-말단, 중쇄의 N-말단, 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 제제화되어 투여되는 것일 수 있고, 상기 투여는 통상적인 융합 단백질, 또는 항체 기반 제제의 투여 방법이 비제한적으로 적용될 수 있고, 예를 들어, 정맥 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강 투여, 안구 투여, 척수강내(intrathecal) 투여, 뇌실 내 (intracerebroventricular) 투여, 비강 내 투여 등일 수 있다. 이러한 투여 조건 하에서, 상기 융합 단백질은 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체의 일부 영역, 즉, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 적절한 수준의 상호 작용, 또는 결합 친화력을 제공할 수 있는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와의 연결을 통하여, 융합 파트너인 IgG 항체가 뇌 조직 내 높은 수준으로 전달/분포될 수 있도록 할 수 있다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터로 형질주입된 형질주입 세포주를 제공한다.
하기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 형질주입 세포주에 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
본 명세서에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 DNA 운반체 (vehicle)로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, T7 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, MLV(murine Leukemia Virus) LTR(long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 설바이빈 (survivin) 프로모터, 및 Chinese Hamster Elongation Factor-1α (CHEF1-α) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 용어, “작동 가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
형질주입 세포주
본 명세서에서 용어, "형질주입"은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 형질주입은 전술한 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터가 숙주 세포 내로 삽입되어 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 생산하는 것을 의미한다.
상기 형질주입 세포주 또는 숙주 세포는 바람직하게는 박테리아와 같은 원핵생물, 효모와 같은 진핵생물을 포함하는 미생물, Sf9 세포 등의 곤충 유래 세포, CHO 세포 등의 마우스 유래 세포, HEK293 등의 사람 유래 세포 및 항체 생산 하이브리도마로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물; 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 융합 단백질의 의약적 용도; 또는 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
하기 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 의약적 용도, 또는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 명세서에서 용어, “예방”은 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, “치료”는 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약제학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 “뇌 기능 장애와 연관된 질환”은 알츠하이머 치매; 루이체 치매; 전측두엽 치매; 신경원 섬유 매듭-우세 치매; 파킨슨병; 인지기능 장애; 다발성 경화증; 근 위축 측삭 경화증; 외상성 뇌 손상; 진행핵상마비; 피질기저핵변성; 신경교 타우병증; 노화 관련 타우 성상교병증; 만성 외상성 뇌병증; 원발성 중추신경계 림프종, 신경교종, 신경모세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 및 뇌 전이암 등을 포함하는 뇌암; 피크병; 항-IgLON5 관련 타우병증; 과들루프 파킨슨증; 나딩신드롬; 통증; 뇌전증; 자폐증; 뇌졸중; 길리안-바레 증후군; 크로이츠펠트-야곱병; 헌팅톤병; 진행성 다초점 백질뇌병증; 우울증; 외상후 스트레스 장애; 및 리소솜 축적 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 기술은 뇌 조직을 타겟으로 하는 의약 분야에서 치료제로서의 효능과 높은 연관성이 있다고 보고된 바 있다. 더욱이, 일 실시예에 따른 융합 단백질에서, helical 영역 결합 모이어티는 IgG 항체 각각의 N 말단 및 C-말단 영역에 연결 또는 추가되는 것으로, IgG 항체의 CDR 영역, 또는 가변 영역에 대하여 어떠한 변형도 야기하지 않는다. 따라서, 일 실시예에 확인한 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과능 및 뇌조직으로의 선택적인 전달 효능은, 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 치료 효과 향상으로 이어질 수 있다.
상기 약제학적 조성물, 즉, 융합 단백질을 포함하는 제약 제제는, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도는 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메치오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤;카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 포도당, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 추가적인 활성 성분, 임의로 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 종류 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 항체의 양, 및 대상체의 임상 파라미터에 따라 결정된다. 상기 활성 성분은 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 의해 봉입된 형태로 전달될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 의료 실무에 일치하는 방식으로 제제화, 투약, 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려해야 할 인자로는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 기타 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 설명된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법
상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법은 상기 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시-투여될 수 있다. 상기 추가의 치료제는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 치료에 효과적인 치료제로서, 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 콜린에스테라제 억제제 (예컨대 도네페질, 갈란타민, 로바스티그민 및 타크린), NMDA 수용체 길항제 (예컨대 메만틴), 아밀로이드 베타 펩티드 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조절물질, 신경 성장 인자 (NGF) 모방체 (mimic) 또는 NGF 유전자 요법제, PPARγ 효능제, HMS-CoA 환원효소 억제제 (스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, 정맥내 이뮤노글로불린, 무스카린성 (muscarinic) 수용체 효능제, 니코틴 수용체 조절물질, 능동 또는 수동 아밀로이드 베타 펩티드 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-아밀로이드 베타 펩티드 항체.
또한, 대상 질환의 예방 또는 치료를 위해, 상기 약제학적 조성물의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료되는 질환의 종류, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전에 시행된 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 상기 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여되며, 본 발명의 목적 상, 상기 항체는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와 결합된 융합 단백질의 형태로 제공되는 것일 수 있다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어 0.1 mg/kg ~ 100 mg/kg)의 항체 또는 융합 단백질이 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여에 의한 것인지, 또는 연속 주입에 의한 것인지 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 일반적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 또는 그보다 긴 기간 동안에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 요구되는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg, 20 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자에게 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 예를 들어 약 6 mg/kg 용량의 항체 또는 융합 단백질이 투여되도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 보다 적은 용량이 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 양상에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 따르면, IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하며, 여기서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 경우, 상기 모이어티와 트랜스페린 수용체간 유효한 상호 작용에 의해, 뇌 조직에서 IgG 항체의 전달이 현격하게 증진됨을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 융합 단백질은 뇌 조직에 대한 선택적인 약물 전달을 필요로 하는 의약 분야, 예를 들어, 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 예시적인 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 4가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(4V-#01, 4V-#02, 4V-#03)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 6가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(6V-#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 8가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(8V-#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 Human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 내지 실시예 5. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
1. Tetra-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
본 실시예에서는 4가의 트랜스페린 수용체 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성이 증진된 융합 단백질을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 4가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 융합 단백질을 제조하였다. 한편, 본 실시예에서 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 서열번호 3(SHHERLKSDEWSVTSGGL)의 단위체를 사용하였으며, 상기 IgG1 항체로는 anti PD-L1 IgG1 항체를 사용하였다. 구체적으로, 세포가 포함된 플라스크로부터 1mL의 샘플을 피펫으로 채취하고, cell mass를 측정하였다. 이후, 세포 생존율이 95% 이상이고, cell mass가 4~6Х106 cells/mL 이상이면, 37℃의 incubator에서 보관된 배양 배지를 첨가하고 이를 배양하여, cell mass 수준이 9Х106 cells/mL이 되도록 준비하였다. 이후, 상기 준비된 세포를 대상으로, 하기의 실험 조건에 따라 형질주입을 수행하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000001
이후, 배양 1일 feed media와 enhancer를 처리하고, 배양 4일 feed media를 처리하여 배양한다. 세포 생존율이 70%이하가 되거나, 형질주입을 수행한 날로부터 8일이 경과한 때, 형질주입된 세포를 수득하였다. 이후, 상기 형질주입된 세포가 포함된 샘플을 4500rpm, 25℃조건에서 15분간 원심분리하여, 이로부터 상층액을 회수하였다. 이후, 상기 상층액을 0.22μm 필터를 사용하여 여과한다. 이후 상기 여과물에 대한 정제는 친화도 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토 그래피 등의 정제 기술을 이용하여 각각의 융합 단백질을 수득하였다. 상기 정제된 항체는 SEC-HPLC (size exclusion high performance liquid chromatography), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), 질량분석방법으로 분석하여 정제 결과를 확인하였다.
한편, 본 실시예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 가수 및 상기 모이어티와 연결된 IgG 항체의 C-말단 및 N-말단 연결 부위 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[실시예 1]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000002
[실시예 2]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000003
[실시예 3]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000004
2. Hexa-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
본 실시예에서는 6가의 트랜스페린 수용체 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성이 증진된 융합 단백질을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 6가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 융합 단백질을 상기와 동일한 방식으로 제조하였다. 한편, 본 실시예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 가수 및 상기 모이어티와 연결된 IgG 항체의 C-말단 및 N-말단 연결 부위 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[실시예 4]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000005
3. Octa-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
본 실시예에서는 8가의 트랜스페린 수용체 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성이 증진된 융합 단백질을 제조하고자 하였다. C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일한 8가의 융합 단백질을 상기와 동일한 방식으로 제조하였다. 한편, 본 실시예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 가수 및 상기 모이어티와 연결된 IgG 항체의 C-말단 및 N-말단 연결 부위 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[실시예 5]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000006
[비교예]
비교예 1 내지 비교예 3. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
1. Tetra-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수 보다 많은 4가의 융합 단백질을 상기와 동일한 방식으로 제조하였다. 한편, 본 비교예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 가수 및 상기 모이어티와 연결된 IgG 항체의 C-말단 및 N-말단 연결 부위 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[비교예 1]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000007
2. Hexa-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수 보다 많은 6가의 융합 단백질을 상기와 동일한 방식으로 제조하였다. 한편, 본 비교예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 가수 및 상기 모이어티와 연결된 IgG 항체의 C-말단 및 N-말단 연결 부위 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[비교예 2]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000008
[비교예 3]
Figure PCTKR2023015875-appb-img-000009
[실험예]
실험예 1. Tetra-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 기능성 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 4가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 평가하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질(4V-#01, 4V-#02, 4V-#03, 또는 4V-C#01)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 눈 안쪽의 혈관 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취하였다. 이후, 생리식염수를 관류(perfusion)시켜 혈액을 제거하였다. 뒤이어, 상기 마우스의 뇌를 적출하고, 상기 적출된 뇌 조직을 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤, 사용 전까지 deep freezer에 보관하였다. 한편, 적출된 뇌 조직을 단백질 추출 용액을 사용하여 균질화시킨 뒤, 상기 균질화된 뇌 조직 샘플을 회전 믹서를 사용하여, 4℃에서 용해시켰다. 이후, 상기 용해된 뇌 조직 샘플을 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하여 뇌 조직 용해물(Brain lysate)을 준비하였다. 이후, 뇌 조직 용해물 내 IgG1 항체의 수준은 human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 단백질 추출 용액을 사용하여 각 농도에 맞게 희석하여 standard(STD)를 준비하였으며, 단백질 추출 용액을 사용하여 각각의 희석 배율에 맞춰 뇌 조직 용해물을 포함하는 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이를 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 반응시켰다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450 nm에서의 값을 측정 후 4 parameter logistic regression을 사용하여 표준 곡선(standard curve)을 획득하고, 이로부터 샘플(SPL) 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다. 한편, 본 실험예에서 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 경쇄의 N-말단 및 중쇄의 N-말단 각각에 모이어티가 연결된 융합 단백질 4V-C#01 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 정맥 투여 후 4일째 낮았던 반면, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 4V-#01, 4V-#02, 또는 4V-#03 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 높게 관찰되었다. 상기 결과는 4가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일하거나 많은 경우에 한하여, IgG 항체가 뇌 조직으로 높은 수준으로 전달될 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 2. Hexa-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 기능성 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 6가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 평가하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방식으로, 일 실시예에 따른 융합 단백질 (6V-#01, 6V-C#01, 또는 6V-C#02)을 포함하는 제제에 대하여, 샘플 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다. 한편, 본 실험예에서 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수보다 많은 융합 단백질, 즉, 경쇄의 N-말단, 중쇄의 N-말단 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 융합 단백질 6V-C#01, 또는 경쇄의 N-말단, 중쇄의 N-말단, 및 경쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 융합 단백질 6V-C#02 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 정맥 투여 후 4일째 낮았던 반면, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 6V-#01 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 높게 관찰되었다. 상기 결과는 6가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서도, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수에 비해 많은 경우, IgG 항체가 뇌 조직으로 높은 수준으로 전달될 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 3. Octa-valency를 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 기능성 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 8가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 평가하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방식으로, 일 실시예에 따른 융합 단백질(8V-#01)을 포함하는 제제에 대하여, 샘플 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다. 한편, 본 실험예에서 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 경쇄의 N-말단, 중쇄의 N-말단, 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 각각에 모이어티가 연결된 융합 단백질 8V-#01 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 정맥 투여 후 4일째 높게 관찰되었다. 상기 결과는 전술한 실험 결과와 마찬가지로, C-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수가 N-말단 영역에 연결된 모이어티의 개수와 동일한 경우, 즉, 8가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은, IgG 항체가 뇌 조직으로 높은 수준으로 전달될 수 있음을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. IgG 항체; 및
    상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역 중 적어도 하나의 영역에 연결된 4 내지 8가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질로서,
    상기 IgG 항체의 N-말단 및 C-말단 영역에 연결된 4 내지 8가의 helical 영역 결합 모이어티는 하기 식 1의 조건을 만족하는 것인, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질:
    [식 1]
    Cm ≥ Nm
    상기 식 1에서, Cm은 IgG 항체의 C-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타내고, Nm은 IgG 항체의 N-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수를 나타낸다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터(transferrin receptor cluster)를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것인, 융합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것인, 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 약제학적 활성 물질인 것인, 융합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환은 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease); 루이체 치매(dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매(frontotemporal dementia); 신경원 섬유 매듭-우세 치매(tangle only dementia); 파킨슨병(Parkinson`s disease); 다발성 경화증(multiple sclerosis); 근 위축 측삭 경화증(amyotrophic Lateral sclerosis: ALS); 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury); 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy); 피질기저핵변성(corticobasal degeneration); 신경교 타우병증(globular glial tauopathy); 노화 관련 타우 성상교병증(aging-related tau astrogliopathy); 만성 외상성 뇌병증(chronic Traumatic Encephalopathy: CTE); 뇌암; 피크병(Pick's disease); 항-IgLON5 관련 타우병증(anti-IgLON5-related tauopathy); 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism); 나딩신드롬(nodding syndrome); 통증(pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증(autism); 뇌졸중(stroke); 길리안-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome: GBS); 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD); 헌팅톤병(Huntington`s disase); 진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy: PML); 우울증(depression); 외상후 스트레스 장애(post traumatic stress disorder: PTSD); 또는 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disease: LSD)인 것, 융합 단백질.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 IgG 항체는 anti-PD-L1 IgG 항체, anti-PD1 IgG 항체, anti-Tau IgG 항체, anti-HER2 IgG 항체, anti-Aβ IgG 항체, anti-TDP-43 IgG 항체, anti-alpha-synuclein IgG 항체, anti-SIGLEC3 IgG 항체, 또는 anti-TREM2 IgG 항체인 것인, 융합 단백질.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 트랜스페린 수용체 내 서열번호 2의 helical 영역으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 아미노산과 결합 친화력을 갖는 것인, 융합 단백질.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 링커 펩타이드에 의해 상기 IgG 항체의 C-말단 영역 및 N-말단 영역에 연결된 것인, 융합 단백질.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 복수 개의 결합 모이어티 각각은 동일하거나, 상이한 것인, 융합 단백질.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체의 C-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수(Cm) 또는 상기 IgG 항체의 N-말단 영역에 연결된 helical 영역 결합 모이어티의 개수(Nm)는 각각 짝수 개인 것인, 융합 단백질.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄에 대칭적으로 연결된 것인, 융합 단백질.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 12의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 청구항 13의 벡터로 형질주입된 형질주입 세포주.
  15. 청구항 1의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환은 알츠하이머 치매; 루이체 치매; 전측두엽 치매; 신경원 섬유 매듭-우세 치매; 파킨슨병; 다발성 경화증; 근 위축 측삭 경화증; 외상성 뇌 손상; 진행핵상마비; 피질기저핵변성; 신경교 타우병증; 노화 관련 타우 성상교병증; 만성 외상성 뇌병증; 뇌암; 피크병; 항-IgLON5 관련 타우병증; 과들루프 파킨슨증; 나딩신드롬; 통증; 뇌전증; 자폐증; 뇌졸중; 길리안-바레 증후군; 크로이츠펠트-야곱병; 헌팅톤병; 진행성 다초점 백질뇌병증; 우울증; 외상후 스트레스 장애; 또는 리소솜 축적 질환인 것, 약제학적 조성물.
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