TW202108630A - ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用 - Google Patents

ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用 Download PDF

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Abstract

本發明提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。本文亦提供了ETA抗體與TGF-β Trap融合蛋白質之藥物組合物。本文進一步提供了ETA抗體與TGF-β Trap融合蛋白質用於治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化或心血管纖維化之一或多種症狀之方法。

Description

ETA抗體與TGF-β　Trap的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。本文亦提供了ETA抗體與TGF-β Trap融合蛋白質之藥物組合物。本文進一步提供了ETA抗體與TGF-β Trap融合蛋白質用於治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓或肺纖維化之一或多種症狀之方法。
肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種以肺動脈血壓明顯升高為特徵的罕見進行性疾病。肺動脈高壓已成為威脅人類健康之一個重要疾病，資料顯示在全球範圍內每年各類肺動脈高壓發病率約為2.4至7.6/100萬，患病率約為每百萬人口15至26人，已成為僅次於缺血性心臟病及高血壓的第3位常見之心血管疾病。肺動脈高壓之致病原因人們尚不完全清楚，因其起病隱匿，患者就診時多已處於肺動脈高壓心功能之Ⅲ至Ⅳ級。肺動脈高壓之伴隨症狀通常包括呼吸短促(特別是在運動時)、胸部疼痛、間斷性的昏厥等，另外，隨著病情之延續，肺動脈持續之高壓會使得右心室向肺部供血的持續不暢，最終會導致右心室衰竭。心臟衰竭是肺動脈高壓患者最常見之死亡原因。
目前尚未有根治肺動脈高壓之方法，而藥物治療是肺動脈高壓維持治療之首選。經獲FDA已批准用於肺動脈高壓之治療的藥物均為血管舒張藥物，按機理可分為鈣離子通道阻滯劑、前列環素受體激動劑、5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑、內皮素受體抑制劑等。
肺動脈高壓由肺內或者與肺關聯血管的血管收縮(vasoconstriction)引起心臟對肺供血量不足後，心臟對肺供血壓力補償性增加而引起，其微觀表現有肺小動脈內膜增厚、血管緊縮、重構、僵硬或者血栓造成的局部閉塞，由此血管對肺血液循環之阻力上升(Simonneau等，2004，J. Am. Coll. Cardiol. 43:5S-12S；Barst等，2004，J. Am. Coll. Cardiol. 43:40S-47S)。
內皮素受體(Endthelin Receptor A, ETA,或ETA R)抑制劑能夠有效的阻斷由內皮素引起之血管壓力增加來實現緩解肺動脈高壓之症狀，改善病人之運動能力及血液動力學(Serasli等，2010，Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 5:184-95)。
多項研究表明，轉化生長因子β1 (Transforming growth factor β1, TGF-β1)在多種疾病中發揮重要作用，尤其是在心血管疾病。TGF-β1參與細胞之增殖、分化、遷移及凋亡等活動，藉由調控多種信號路徑促進平滑肌細胞增殖、細胞外基質沈積及內皮間質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT)等過程，由此誘導肺動脈高壓的發生發展(Yan等, 2016，Int. J. Cardiol.，222:368-374；Graham等，2013，Circulation，128:1354-1364；Liu等，2016，Int. J. Biochem. Cell. Biol.，77:141-154)。吡非尼酮(Pirfenidone)作為已經批准的治療肺纖維化的藥物可以藉由抑制TGF-β的表現，減少成纖維細胞增殖且減弱TGF-β誘導之α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白質水準。
TGF-β Trap是由TGF-β二型受體之胞外端組成，其可以與TGF-β1或TGF-β3結合，由此有效的阻斷在肺動脈高壓病程進展中由TGF-β介導之血管平滑肌細胞增殖分化、細胞外基質沈積及內皮間質轉化等過程，緩解肺小動脈血管的纖維化及重構，由此降低肺血液循環阻力，改善右心功能(Goumans等，2018，Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 10:a022210；Yung等，2016，Am. J. Respir. Crit. Care Med.，194:1140-1151)。
本文提供了ETA抑制性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。ETA抑制性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白一方面可以阻斷ETA信號路徑，降低肺循環血管阻力；另一方面可以阻斷TGF-β之信號路徑，緩解肺小動脈血管之纖維化及重構，藉由雙重的作用機制實現治療肺動脈高壓及改善右心功能之目的。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。本文亦提供了其用於治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化以及心血管纖維化之一或多種症狀之方法。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含ETA抗體與TGF-β Trap片段。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個TGF-β Trap及相應數量之肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap胺基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap之羧基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及一個、兩個、三個或四個TGF-β Trap及相應數量之肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap胺基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap之羧基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及兩個TGF-β Trap及兩個肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap胺基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap之羧基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及一個TGF-β Trap及一個肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由上述肽連接子序列(Linker)將上述TGF-β Trap胺基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由上述肽連接子序列(Linker)將上述TGF-β Trap之羧基端與上述ETA抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
本文提供了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述ETA抗體、TGF-β Trap及肽連接子序列係藉由以下所述中之方式融合形成上述融合蛋白質： (1)  藉由一個肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap胺基端與ETA抗體重鏈/輕鏈之羧基端連接：N'-R-Linker-TGF-β Trap-C'；及 (2)  藉由肽連接子序列(Linker)將TGF-β Trap之羧基端與ETA抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接：N'-TGF-β Trap-Linker-R-C'；
其中：N'代表多肽鏈胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，TGF-β Trap代表TGF-β Trap，R為ETA抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列，且Linker代表肽連接子。
本文提供了一種多核苷酸，其編碼本文中所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
本文提供了一種載體，其包含編碼本文中所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質的多核苷酸。
本文提供了一種宿主細胞，其包含本文中所述之載體。
本文提供了一種藥用組合物，其包含本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質及一種藥用可接受之載體。
本文提供了本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺動脈高壓以及肺動脈高壓相關病症之一或多種症狀的藥物中之用途。
本文提供了本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺高壓以及肺高壓相關病症之一或多種症狀的藥物中之用途。
本文提供了本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺纖維化以及肺纖維化相關病症之一或多種症狀的藥物中之用途。
本文提供了本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善心血管纖維化以及心血管纖維化相關病症之一或多種症狀的藥物中之用途。
本文提供了本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於同時治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化或者心血管纖維化兩種及更多種病症之一或多種症狀的藥物中之用途。
本文提供了治療、預防或改善肺動脈高壓以及肺動脈高壓相關病症之一或多種症狀之方法，其包括投與個體治療有效量之本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善肺高壓以及肺高壓相關病症之一或多種症狀之方法，其包括投與個體治療有效量之本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善肺纖維化以及肺纖維化相關病症之一或多種症狀之方法，其包括投與個體治療有效量之本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善心血管纖維化以及心血管纖維化相關病症之一或多種症狀之方法，其包括投與個體治療有效量之本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化或者心血管纖維化的兩種及更多種病症之一或多種症狀之方法，其包括投與個體治療有效量之本文所述之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。
定義 除非本文另外定義，與本文相關之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者所理解的含義。通常，與本文所述藥物學、生物學、生物化學、細胞及組織培養學、生物學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質核酸化學以及雜交相關之命名法及技術為此項技術中熟知且經常使用的。
本文使用標準的單字母或三字母縮寫表明多聚核苷酸及多肽序列。除非另外指明，多肽序列胺基端在左而其羧基端在右，單鏈核酸序列及雙鏈核酸序列之上游鏈的5'端在左而其3'端在右。多肽之具體部分可由胺基酸殘基編號表示，例如胺基酸80至130，或由該位點之實際殘基表示例如Lys80至Lys130。亦可藉由解釋其與參比序列之差異描述具體的多肽或多聚核苷酸序列。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白」均指包含兩個或多個藉由肽健相互連接之胺基酸的分子。此等術語涵蓋例如天然及人工蛋白、蛋白片段及蛋白序列的多肽類似物(例如突變蛋白、變異體及融合蛋白)以及轉錄後或否則為共價或非共價修飾之蛋白。肽、多肽或蛋白可為單體或多聚體。
術語「多肽片段」係指與對應的全長蛋白相比具有胺基端及/或羧基端缺失的多肽。片段長度可為例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200個胺基酸。片段長度可為例如最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10個胺基酸。片段可在其一端或兩端進一步包含一或多個附加胺基酸，例如，來自不同天然蛋白質之胺基酸序列(例如，Fc或白胺酸拉鏈結構域)或人工胺基酸序列(例如，人工連接子序列)。
本文之多肽包括以任何原因及經任何方法修飾之多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白複合物之親和性，(4)改變結合親和性以及(4)賦予或修飾其他物理化學或功能性質。類似物包含多肽之突變蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子內接觸的結構域之外的多肽部分)中進行單個或多個胺基酸替換(例如，保守胺基酸替換)。「保守胺基酸替換」為不顯著改變母體序列結構特性者(例如，替換胺基酸不應破壞母體序列中出現的螺旋或干擾其他賦予母體序列特性或對其功能是必須的二級結構類型)。
多肽之「變異體」包含相對於另一多肽序列在胺基酸序列中插入、缺失及/或替換了一或多個胺基酸殘基之胺基酸序列。本文之變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為經化學修飾的多肽，例如藉由與其他化學部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)結合、磷酸化及糖基化。
除非另外說明，術語「抗體」包括除包含兩個全長重鏈與兩個全長輕鏈之抗體外的其衍生物，變異體、片段及突變蛋白，其實例見下文。
術語「抗體」為包含與抗原結合部分且視情況為允許抗原結合部分採取促進該抗體與該抗原結合之構形的支架或框架部分的蛋白。抗體之實例包括完整抗體、抗體片段(例如抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。該抗體可包含例如可選擇的蛋白支架或具有移植CDR或CDR衍生物的人工支架。該支架包括但不限於包含被引入的例如以穩定化該抗體之三維結構的抗體衍生支架以及包含例如生物相容性多聚體的全合成支架。參見，例如，Korndorfer等，2003，Proteins: Structure，Function and Bioinformatics 53:121-129；Roque等，2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外，可使用模擬肽抗體(「PAMs」)以及基於模擬抗體之支架，其如支架一樣利用纖維蛋白連接素。
抗體可具有例如天然免疫球蛋白的結構。「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，各對具有一個「輕」(約25kDa)與一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈胺基端包括約100至110或更多胺基酸之可變結構域，主要與抗原識別相關。各鏈之羧基端部分確定了主要與效應器作用相關之恆定區。人之輕鏈分為κ及λ輕鏈。重鏈分為μ、δ、α或ε，且確定了抗原的同型，例如分別為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈中，可變及恆定區由約12或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈亦包括約10多個胺基酸的「D」區。參見，Fundamental Immunology Ch.7(Paul編，第2版，Raven Press，1989) (其完整內容以參考形式併於本文用於任何目的)。各輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，此類完整的免疫球蛋白具有兩個結合位點。
天然免疫球蛋白鏈顯示出由三個高度可變區連接之相對保守骨架區(FR)的相同基本結構，亦被稱作互補決定區或CDR。自N端至C端，輕及重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各結構域胺基酸的分配與Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部(US Dept. of Health and Human Services), PHS，NIH，NIH公開案號91-3242，1991中之定義一致。
除非另外指明，「抗體」係指完整的免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合的抗原結合部分。可由重組DNA技術或藉由酶或化學裂解完整抗體產生抗原結合部分。抗原結合部分包括，尤其是，Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、結構域抗體(dAb)，包括互補決定區(CDR)的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體(diabodies)、三功能抗體(triabodies)、四功能抗體(tetrabodies)且至少包含足以賦予多肽特異抗原結合的免疫球蛋白之一部分的多肽。
Fab片段為具有VL 、VH 、CL 及CH1 結構域的單價片段；F(ab')2 片段為具有兩個在鉸鏈區由二硫鍵連接之Fab片段的二價片段；Fd片段具有VH 或VL 結構域；dAb片段具有VH 結構域、VL 結構域或VH 或VL 結構域的抗原結合片段(美國專利號US6,846,634、US6,696,245，美國專利申請公開案號US2005/0202512、US2004/0202995、US2004/0038291、US2004/0009507、US2003/0039958, Ward等，1989，Nature 341:544-546.)。
單鏈抗體(scFv)為其中的VL 扣VH 區由連接子(例如，合成的胺基酸殘基序列)連接以形成連續蛋白質之抗體，其中該連接子足夠長以允許該蛋白鏈摺疊回自身且形成單價抗原結合位點(參見，例如，Bird等，1988，Science 242:423-26及Huston等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83)。
雙功能抗體為包含兩個多肽鏈的二價抗體，其中各多肽鏈包含由連接子連接之VH 及VL 結構域，該連接子很短以致於不允許兩個結構域在相同鏈上的配對，因此允許各結構域與另一多肽鏈上的互補結構域配對(參見，例如，Holliger等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48，及Poljak等，1994，Structure 2:1121-23)。若雙功能抗體之兩個多肽鏈是相同的，則由它們配對得到的雙功能抗體將具有相同的抗原結合位點。具有不同序列的多肽鏈可用於製備具有不同抗原結合位點的雙功能抗體。相似地，三功能抗體及四功能抗體分別為包含三個及四個多肽鏈之抗體且分別形成三個及四個抗原結合位點，其可相同或不同。
可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版, 美國衛生與公眾服務部, PHS, NIH, NIH公開案號91-3242，1991中描述之方法鑑定給定抗體之互補決定區(CDR)及框架區(FR)。可向分子中共價或非共價併入一或多個CDR使其成為抗體。抗體可以較大多肽鏈併入一或多個CDR。可將一或多個CDR共價連接至另一鄉肽鏈，或非共價併入一或多個CDR。CDR允許抗體與具體的相關抗原特異性結合。
抗體可有一或多個結合位點。若多於一個結合位點，該結合位點可與另一個相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有兩個相同的結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體具有兩個不同的結合位點。
術語「鼠源抗體」包括具有一或多個來源於小鼠免疫球蛋白序列的可變區及恆定區的所有抗體。
術語「人類化抗體」是將小鼠抗體分子的互補決定區序列移植至人抗體可變區框架中而製成之抗體。
術語「抗原結合結構域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為包含與抗原相互作用之胺基酸殘基(或其他部分)且有助於抗體對抗原的特異性及親和力的抗體之部分。對與其抗原特異性結合之抗體而言，此將包括至少部分的至少一個其CDR結構域。
術語「表位」為與抗體(例如，藉由抗體)結合的分子部分。表位可包含分子的非連續部分(例如，在多肽中，在多肽之一級序列中不連續的胺基酸殘基在該多肽之三級及四級結構中相互足夠接近以致於被一個抗體結合)。
兩種多聚核苷酸或兩個多肽序列的「相同百分比」由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package；第10.3版(Accelrys，San Diego，CA)之一部分)使用其默認參數比較序列測定。
術語「多聚核苷酸」、「寡聚核苷酸」及「核酸」可在全文中交替使用且包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物(例如，肽核酸及非天然核苷酸類似物)生成的DNA或RNA類似物及其雜交體。核酸分子可為單鏈或雙鏈。在一個實施方案中，本文之核酸分子包含編碼本文提供抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體連續的開放閱讀框。
若其序列可反向平行排列則兩個單鏈多聚核苷酸是相互「互補的」，此類多聚核苷酸中之各核苷酸與另一多聚核苷酸中之互補核苷酸相反，不會引入空隙且各序列的5'或3'端沒有未配對的核苷酸。若兩種多聚核苷酸可在中等嚴格條件下相互雜交，則一種多聚核苷酸與另一多聚核苷酸「互補」。因此，一種多聚核苷酸可與另一多聚核苷酸互補，但並不是其互補序列。
術語「載體」為可用於將與其相連的另一核酸引入細胞之核酸。載體的一種類型為「質體」，其係指可連接附加核酸區段的線性或環狀雙鏈DNA分子。載體的另一類型為病毒載體(例如，複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒)，其中可將附加DNA區段引入病毒基因組。某些載體可在它們被引入的宿主細胞中自主複製(例如，包含細菌複製起點的細菌載體以及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞時整合入宿主細胞之基因組中且因此與宿主基因組一起複製。
「表現載體」為可引導所選多聚核苷酸表現的載體類型。
若調控序列影響核苷酸序列的表現(例如，表現量、時間或位點)，則核苷酸序列與調控序列「可操作地相連」。「調控序列」為可影響與其可操作相連的核酸的表現(例如，表現量、時間或位點)的核酸。調控基因，例如，直接對受調控核酸發揮作用或藉由一或多個其他分子(例如，與調控序列及/或核酸結合的多聚核苷酸)的作用。調控序列之實例包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。調控序列的進一步實例描述於例如Goeddel，1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 第185卷, Academic Press, San Diego, CA及Baron等, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
術語「宿主細胞」為用於表現核酸例如本文提供核酸的細胞。宿主細胞可為原核生物，例如大腸桿菌，或者其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如菸草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。通常，宿主細胞為可用多肽編碼核酸轉化或轉染的培養細胞，其可接著在宿主細胞中表現。短語「重組宿主細胞」可用於表述用預期表現的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞亦可為包含該核酸但是不以期望水準表現的細胞，除非向該宿主細胞引入了調控序列，使得其與核酸可操作地相連。應理解的是術語宿主細胞不僅指具體的個體細胞亦指該細胞之子代或可能的子代。由於例如突變或環境影響後續世代會出現某些修飾，該子代事實上可能與母體細胞不同但是仍然屬於本文使用之術語範圍。
內皮素受體 內皮素受體(ETA)屬於7-跨膜受體家族的A子族，其藉由異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)與一或多個胞內信號傳導途徑偶聯(Jelinek等，1993, Science 259:1614-1616, Segre等, 1993, Trends Endocrinol. Metab. 4:309-314)。如本文所使用「內皮素受體」與「ETA」或「ETA R」可交替使用。
在一個實施方案中，可選擇本文所述之抗體結合表現於細胞上的膜結合內皮素受體且藉由內皮素受體抑制或阻斷內皮素信號傳導。在一個實施方案中，本文所述之抗體與人內皮素受體特異性結合。在進一步之實施方案中，與人內皮素受體結合之抗體亦可與其他物種之內皮素受體結合，例如大鼠。下文中之實施例提供生成與人膜結合內皮素受體結合的鼠源抗體，在進一步之實施方案中與其他物種之內皮素受體結合。
已知數個物種之內皮素受體的多聚核苷酸及多肽序列。SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6顯示了智人、食蟹獼猴及褐家鼠的序列。序列資料來源於美國國家生物技術資訊中心的GenBank資料庫。
內皮素受體A(ETA)如下： 智人(Homo sapiens)多聚核苷酸(SEQ ID NO: 1)；登錄號：S63938。
智人(Homo sapiens)胺基酸(SEQ ID NO: 2)；登錄號：AAB20278。
食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)多聚核苷酸(SEQ ID NO: 3)；登錄號：JV635771。
食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)胺基酸(SEQ ID NO: 4)；登錄號：AFJ71111。
褐家鼠(Rattus norvegicus)多聚核苷酸(SEQ ID NO: 5)；登錄號：M60786。
褐家鼠(Rattus norvegicus)胺基酸(SEQ ID NO: 6)；登錄號：AAA41114。
內皮素受體A(ETA)抗體
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO:30； b.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48； c.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205； d.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90； e.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114；及 f.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
表一列出本文所述之ETA抗體之輕鏈CDR之胺基酸序列，以及其相應的多聚核苷酸編碼序列。表二列出本文所述之ETA抗體之重鏈CDR之胺基酸序列，以及其相應的多聚核苷酸編碼序列。 表一：輕鏈CDR之胺基酸序列及其多聚核苷酸編碼序列
   CDR1 CDR2 CDR3
A-1 核苷酸 agggccagtcagaacatt ggcacaagcatacac (SEQ ID NO: 7) tatgcttctaagtctatatct (SEQ ID NO: 31) caacatagttatagcttcccgtggacg (SEQ ID NO: 49)
A-1 胺基酸 RASQNIGTSIH (SEQ ID NO: 8) YASKSIS (SEQ ID NO: 32) QHSYSFPWT (SEQ ID NO: 50)或QHSYSWPWT (SEQ ID NO: 205)
A-2 核苷酸 cgagcaagtgaaaatatttacagttatttagca (SEQ ID NO: 9) aatgcaaaaaccttagcagaa (SEQ ID NO: 33) cagcatcattatggtattccgttcacg (SEQ ID NO: 51)
A-2 胺基酸 RASENIYSYLA  (SEQ ID NO: 10) NAKTLAE (SEQ ID NO: 34) QHHYGIPFT (SEQ ID NO: 52)
A-3 核苷酸 cagagcctctttgatattg atggaaagacatatttgaat (SEQ ID NO: 11) ctggtgtctgaattggact ct (SEQ ID NO: 35) tggcaaggtacacattttccgctcacg (SEQ ID NO: 53)
A-3 胺基酸 QSLFDIDGKTYLN (SEQ ID NO: 12) LVSELDS (SEQ ID NO: 36) WQGTHFPLT (SEQ ID NO: 54)
A-4 核苷酸 cgggcaagtcaggacattggtggtagcttaaac (SEQ ID NO: 13) gccacatccagcttagattct (SEQ ID NO: 37) ctacaatatgctagttctccgtatacg (SEQ ID NO: 55)
A-4 胺基酸 RASQDIGGSLN (SEQ ID NO: 14) ATSSLDS (SEQ ID NO: 38) LQYASSPYT (SEQ ID NO: 56)
A-5 核苷酸 agggccagccagactattagcgacttcttacac (SEQ ID NO: 15) tatgcttcccaatccatctct (SEQ ID NO: 39) caaagtggtaacacctttccgtggacg (SEQ ID NO: 57)
A-5 胺基酸 RASQTISDFLH (SEQ ID NO: 16) YASQSIS (SEQ ID NO: 40) QSGNTFPWT (SEQ ID NO: 58)
A-6 核苷酸 agggcaagtgaggacat acacactcaattagcc (SEQ ID NO: 17) ggtgcagccagtttgaaaagt (SEQ ID NO: 41) caacagtataggagtattccgtggacg (SEQ ID NO: 59)
A-6 胺基酸 RASEDIHTQLA (SEQ ID NO: 18) GAASLKS (SEQ ID NO: 42) QQYRSIPWT (SEQ ID NO: 60)
A-7 核苷酸 agatctagtcagtacattgttcatagtactggaaccacctatttagaa (SEQ ID NO: 19) aaagtttccaaccgattttct (SEQ ID NO: 43) tttcaaggttcacattttccattcacg (SEQ ID NO: 61)
A-7 胺基酸 RSSQYIVHSTGT TYLE (SEQ ID NO: 20) KVSNRFS (SEQ ID NO: 44) FQGSHFPFT (SEQ ID NO: 62)
A-8 核苷酸 agatctagtcattaccttgttcatgataacggaaacacctatgttgaa (SEQ ID NO: 21) aaggtttccaaccgattttct (SEQ ID NO: 43) tttcaaggttcacatttcccattcacg (SEQ ID NO: 63)
A-8 胺基酸 RSSHYLVHDNG NTYVE (SEQ ID NO: 22) KVSNRFS (SEQ ID NO: 44) FQGSHFPFT  (SEQ ID NO: 62)
A-9 核苷酸 agatctagtcagaacattgtccatagtactggaaacacctatttagaa (SEQ ID NO: 23) aaagtttccaaccgattttct (SEQ ID NO: 43) tttcaaggttcacattttccattcacg (SEQ ID NO: 61)
A-9 胺基酸 RSSQNIVHSTGN TYLE (SEQ ID NO: 24) KVSNRFS (SEQ ID NO: 44) FQGSHFPFT (SEQ ID NO: 62)
A-10 核苷酸 agtgtcagctcaagtgtaagttacatacac (SEQ ID NO: 25) gacacatccaaactggcttct (SEQ ID NO: 45) caccagtggagtactaacccacccacg (SEQ ID NO: 63)
A-10 胺基酸 SVSSSVSYIH (SEQ ID NO: 26) DTSKLAS (SEQ ID NO: 46) HQWSTNPPT (SEQ ID NO: 64)
A-11 核苷酸    agtgccagctcaagtgtaagttacatgtgc (SEQ ID NO: 27) gacacatccaaactggcttct (SEQ ID NO: 45) cagcagtggagtagtaacccacccacg (SEQ ID NO: 65)
A-11 胺基酸 SASSSVSYMC (SEQ ID NO: 28) DTSKLAS (SEQ ID NO: 46) QQWSSNPPT  (SEQ ID NO: 66)
A-12 核苷酸 cagggcattaacaattat (SEQ ID NO: 29) tatacatcaactttacagtca (SEQ ID NO: 47) cagcagtttagtaaacttcggaca (SEQ ID NO: 67)
A-12 胺基酸 QGINNY (SEQ ID NO: 30) YTSTLQS (SEQ ID NO: 48) QQFSKLRT (SEQ ID NO: 68)
表二：重鏈CDR之胺基酸序列及其多聚核苷酸編碼序列
   CDR1 CDR2 CDR3
A-1 核苷酸 gggttctcactgaccac ttctggcttgggtgttgcc (SEQ ID NO: 69) cacatttggtcggatggtgacacgcgctattacccagccctgaagaac (SEQ ID NO: 91) atgaaggatgatagtctttactttgacaac (SEQ ID NO: 115)
A-1 胺基酸 GFSLTTSGLGVA (SEQ ID NO: 70) HIWSDGDTRYYPALKN (SEQ ID NO: 92) MKDDSLYFDN (SEQ ID NO: 116)
A-2 核苷酸 ggctacacctttactagc tactggatacac (SEQ ID NO: 71) tacattaatcctgacactgattatagtgagtacaat (SEQ ID NO: 93) gcaagtgctggttattatttttttgacttc (SEQ ID NO: 117)
A-2 胺基酸 GYTFTSYWIH (SEQ ID NO: 72) YINPDTDYSEYN (SEQ ID NO: 94) ASAGYYFFDF (SEQ ID NO: 118)
A-3 核苷酸 ggcctcaacattaaagacatctatattcac (SEQ ID NO: 73) aggattgatcctgcgaacggtaagactgcatatgac (SEQ ID NO: 95) ggtaggggggcccac (SEQ ID NO: 119)
A-3 胺基酸 GLNIKDIYIH (SEQ ID NO: 74) RIDPANGKTAYD (SEQ ID NO: 96) GRGAH (SEQ ID NO: 120)
A-4 核苷酸 ggttactcattcaccaactactggatacac (SEQ ID NO: 75) atgattgatccttccgatgctgaaactgggttaaat (SEQ ID NO: 97) gcaagaattggcgattactataatatggactac (SEQ ID NO: 121)
A-4 胺基酸 GYSFTNYWIH (SEQ ID NO: 76) MIDPSDAETGLN (SEQ ID NO: 98) ARIGDYYNMDY (SEQ ID NO: 122)
A-5 核苷酸 ggattcactttcagtgac tatcccatgtct (SEQ ID NO: 77) gttagtgatggtggtggttccacc (SEQ ID NO: 99) acaagacatgcttcctactatagctacgaccattctatggactac (SEQ ID NO: 123)
A-5 胺基酸 GFTFSDYPMS (SEQ ID NO: 78) VSDGGGST (SEQ ID NO: 100) TRHASYYSYDHSMDY (SEQ ID NO: 124)
A-6 核苷酸 ggattcactttcagtagctttggcatgtct (SEQ ID NO: 79) attagtagtgctggtagtttcacc (SEQ ID NO: 101) gcaagacgggggtacgacgttgggtgctttgaccac (SEQ ID NO: 125)
A-6 胺基酸 GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 80) ISSAGSFT (SEQ ID NO: 102) ARRGYDVGCFDH (SEQ ID NO: 126)
A-7 核苷酸 ggattcactttcagtacctatggcatgtct (SEQ ID NO: 81) accattaatactaatggtggtaccacctattatcgagacagtgtgaagggc (SEQ ID NO: 103) gcaagagactacggggc tatggactac (SEQ ID NO: 127)
A-7 胺基酸 GFTFSTYGMS (SEQ ID NO: 82) TINTNGGTTYYR DSVKG (SEQ ID NO: 104) ARDYGAMDY (SEQ ID NO: 128)
A-8 核苷酸 ggattcactttcagtacctatggcatgtct (SEQ ID NO: 81) accataaatactaatggtggtaacacctattattcagacaatgtgaagggc (SEQ ID NO: 105) gcaagagactacggggc tatggactac (SEQ ID NO: 127)
A-8 胺基酸 GFTFSTYGMS (SEQ ID NO: 82) TINTNGGNTYYS DNVKG (SEQ ID NO: 106) ARDYGAMDY (SEQ ID NO: 128)
A-9 核苷酸 ggattcactttcagtagttatggcatgtct (SEQ ID NO: 83) accattagtactaatggtgccaccgccaattatccagacagtgtgaagggc (SEQ ID NO: 107) gcaactgaaaagggagctatgggctac (SEQ ID NO: 129)
A-9 胺基酸 GFTFSSYGMS (SEQ ID NO: 84) TISTNGATANYP DSVKG (SEQ ID NO: 108) ATEKGAMGY (SEQ ID NO: 130)
A-10 核苷酸 gggttttcactgaccacttctggtatgggtgtaggc (SEQ ID NO: 85) cacatttggtgggatgatgataagtactataatccatccctgaagagc (SEQ ID NO: 109) gctcgaagaactgagact atgattacgacagtgctatattactatgctatggactac (SEQ ID NO: 131)
A-10 胺基酸 GFSLTTSGMGVG (SEQ ID NO: 86) HIWWDDDKYYNPSLKS (SEQ ID NO: 110) ARRTETMITTVLYYYAMDY (SEQ ID NO: 132)
A-11 核苷酸 ggattttcactgagcacttctggtttgggtgtaggc (SEQ ID NO: 87) cacatttggtgggatgatgataagtactataatccatcccttaagaga (SEQ ID NO: 111) gctcgaaggagggaagtt aacttcggtattaactattactattctatggactac (SEQ ID NO: 133)
A-11 胺基酸 GFSLSTSGLGVG (SEQ ID NO: 88) HIWWDDDKYYNPSLKR (SEQ ID NO: 112) ARRREVNFGINYYYSMDY (SEQ ID NO: 134)
A-12 核苷酸    ggattcaccttcagtgat tattac (SEQ ID NO: 89) attagaaatcgggctaatggttacacaaca (SEQ ID NO: 113) gtaagagattcctatcactacgggtacttcgatgtc (SEQ ID NO: 135)
A-12 胺基酸 GFTFSDYY (SEQ ID NO: 90) IRNRANGYTT (SEQ ID NO: 114) VRDSYHYGYFDV (SEQ ID NO: 136)
在一個實施方案中，本文所述之抗體包含與表1及表2中之CDR胺基酸序列各相差5、4、3、2或1個單胺基酸添加、替換及/或缺失的序列。在另一個實施方案中，本文所述之抗體包含與表1及表2中之CDR胺基酸序列各相差4、3、2或1個單胺基酸添加、替換及/或缺失的序列。在另一個實施方案中，本文所述之抗體包含與表1及表2中之CDR胺基酸序列各相差3、2或1個單胺基酸添加、替換及/或缺失的序列。在另一個實施方案中，本文所述之抗體包含與表1及表2中之CDR胺基酸序列各相差2或1個單胺基酸添加、替換及/或缺失的序列。在另一個實施方案中，本文所述之抗體包含與表1及表2中之CDR胺基酸序列各相差1個單胺基酸添加、替換及/或缺失的序列。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體(ETA-1抗體)，其包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO:30；及 b.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90。
一方面，ETA-1抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48；及 b.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114。
另一方面，ETA-1抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205；及 b.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體(ETA-2抗體)，其包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48；及 b.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114。
一方面，ETA-2抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO:30；及 b.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90。
另一方面，ETA-2抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205；及 b.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體(ETA-3抗體)，其包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205；及 b.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
一方面，ETA-3抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO:30；及 b.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90。
另一方面，ETA-3抗體亦包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48；及 b.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含：a.一個獨立地選自於以下所列之輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30； b.一個獨立地選自於以下所列之輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48； c.一個獨立地選自於以下所列之輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO:68； d.一個獨立地選自於以下所列之重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90； e.一個獨立地選自於以下所列之重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114；及 f.一個獨立地選自於以下所列之重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 64與SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 136。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含: (a)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 205； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116； (b)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 10； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 34； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 52； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 72； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 94；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 118； (c)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 12； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 36； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 54； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 74； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 96；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 120； (d)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 14； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 38； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 56； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 76； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 98；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 122； (e)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 16； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 40； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 58； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 78； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 100；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 124； (f)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 18； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 42； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 60； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 80； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 102；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 126； (g)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 20或22； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 44； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 62； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 82； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 104或106；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 128； (h)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 24； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 44； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 62； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 84； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 108；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 130； (i)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 26； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 64； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 86； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 110；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 132； (j)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 28； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 66； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 88； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 112；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 134；或 (k)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 30； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 48； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 68； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 90； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 114；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 136。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含: 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 28； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 66； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 88； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 112；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 134。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體，其包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列： a.輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 138(L1)、SEQ ID NO: 140(L2)、SEQ ID NO: 142(L3)、SEQ ID NO: 144(L4)、SEQ ID NO: 146(L5)、SEQ ID NO: 148(L6)、SEQ ID NO: 150(L7)、SEQ ID NO: 152(L8)、SEQ ID NO: 154(L9)、SEQ ID NO: 156(L10)、SEQ ID NO: 158(L11)、SEQ ID NO: 160(L12)、SEQ ID NO: 162(L13)及SEQ ID NO: 164(L14)及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同之胺基酸序列；及 b.重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 166(H1)、SEQ ID NO: 168(H2)、SEQ ID NO: 170(H3)、SEQ ID NO: 172(H4)、SEQ ID NO: 174(H5)、SEQ ID NO: 176(H6)、SEQ ID NO: 178(H7)、SEQ ID NO: 180(H8)、SEQ ID NO: 182(H9)、SEQ ID NO: 184(H10)、SEQ ID NO: 186(H11)、SEQ ID NO: 188(H12)、SEQ ID NO: 190(H13)及SEQ ID NO:192(H14)及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同之胺基酸序列。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體之多聚核苷酸編碼序列包含一或兩個多聚核苷酸序列，其中每種多聚核苷酸列獨立地選自於以下所列多聚核苷酸序列： a.輕鏈可變結構域的多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161及SEQ ID NO: 163及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同的多聚核苷酸序列；及 b.重鏈可變結構域的多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 189及SEQ ID NO: 191及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同的多聚核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體，其包含: a.一個獨立地選自於以下所列之輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO:138(L1)、SEQ ID NO: 140(L2)、SEQ ID NO: 142(L3)、SEQ ID NO: 144(L4)、SEQ ID NO: 146(L5)、SEQ ID NO: 148(L6)、SEQ ID NO: 150(L7)、SEQ ID NO: 152(L8)、SEQ ID NO: 154(L9)、SEQ ID NO: 156(L10)、SEQ ID NO: 158(L11)、SEQ ID NO: 160(L12)、SEQ ID NO: 162(L13)及SEQ ID NO: 164(L14)及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同之胺基酸序列；及 b.一個獨立地選自於以下所列之重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO:166(H1)、SEQ ID NO: 168(H2)、SEQ ID NO: 170(H3)、SEQ ID NO: 172(H4)、SEQ ID NO: 174(H5)、SEQ ID NO: 176(H6)、SEQ ID NO: 178(H7)、SEQ ID NO: 180(H8)、SEQ ID NO: 182(H9)、SEQ ID NO: 184(H10)、SEQ ID NO: 186(H11)、SEQ ID NO: 188(H12)、SEQ ID NO: 190(H13)及SEQ ID NO: 192(H14)及與其有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同之胺基酸序列。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體，其包含: a.一個獨立地選自於以下所列之輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO:138(L1)、SEQ ID NO: 140(L2)、SEQ ID NO: 142(L3)、SEQ ID NO: 144(L4)、SEQ ID NO: 146(L5)、SEQ ID NO: 148(L6)、SEQ ID NO: 150(L7)、SEQ ID NO: 152(L8)、SEQ ID NO: 154(L9)、SEQ ID NO: 156(L10)、SEQ ID NO: 158(L11)、SEQ ID NO: 160(L12)、SEQ ID NO: 162(L13)及SEQ ID NO: 164(L14)；及 b.一個獨立地選自於以下所列之重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO:166(H1)、SEQ ID NO: 168(H2)、SEQ ID NO: 170(H3)、SEQ ID NO: 172(H4)、SEQ ID NO: 174(H5)、SEQ ID NO: 176(H6)、SEQ ID NO: 178(H7)、SEQ ID NO: 180(H8)、SEQ ID NO: 182(H9)、SEQ ID NO: 184(H10)、SEQ ID NO: 186(H11)、SEQ ID NO: 188(H12)、SEQ ID NO: 190(H13)及SEQ ID NO: 192(H14)。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變結構域胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 138及SEQ ID NO: 166(L1H1)、SEQ ID NO: 140及SEQ ID NO: 168(L2H2)、SEQ ID NO: 142及SEQ ID NO: 170(L3H3)、SEQ ID NO: 144及SEQ ID NO:172(L4H4)、SEQ ID NO: 146及SEQ ID NO: 174(L5H5)、SEQ ID NO: 148及SEQ ID NO: 176(L6H6)、SEQ ID NO: 150及SEQ ID NO: 178(L7H7)、SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 180(L8H8)、SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO:182(L9H9)、SEQ ID NO: 156及SEQ ID NO: 184(L10H10)、SEQ ID NO:158及SEQ ID NO: 186(L11H11)、SEQ ID NO: 160及SEQ ID NO: 188(L12H12)、SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 190(L13H13)及SEQ ID NO:164及SEQ ID NO: 192(L14H14)。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含輕鏈與重鏈可變結構域胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 190(L13H13)。
本文亦可用「LxHy」符號來表示本文所述之ETA抗體，其中「x」對應於輕鏈可變區且「y」對應於重鏈可變區。例如，L2H1係指具有包含SEQ ID NO: 140(L2)胺基酸序列之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 166(H1)胺基酸序列之重鏈可變區的抗體。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含選自L1-L14之輕鏈可變區或選自H1-H14之重鏈可變區及其片段、衍生物、突變蛋白或變異體的抗體。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 138與SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 150與SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 152與SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 154與SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 156與SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 158與SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 160與SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 162與SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 164與SEQ ID NO: 192。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含SEQ ID NO: 138輕鏈可變結構域胺基酸序列或SEQ ID NO: 166重鏈可變結構域胺基酸序列。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體包含SEQ ID NO: 138輕鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO: 166的重鏈可變結構域胺基酸序列之組合。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體亦包含恆定胺基酸序列，其中每個恆定胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 194及SEQ ID NO: 196；及b.重鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 198及SEQ ID NO: 206。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體亦包含恆定胺基酸序列，其中每個恆定胺基酸序列獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈恆定胺基酸序列之組合：
a.輕鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 194及重鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO:198之組合；
b.輕鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 194及重鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 206之組合；
c.輕鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 196及重鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO:198之組合；
d.輕鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 196及重鏈恆定胺基酸序列SEQ ID NO: 206之組合。
在一個實施方案中，本文所述之抗體包含本文所列輕鏈及重鏈CDR及FR(框架)之胺基酸序列。在一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈CDR1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈CDR2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈CDR3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈CDR1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈CDR2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈CDR3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈FR1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈FR2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列輕鏈的FR3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之輕鏈FR4序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈FR1序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列重鏈之FR2序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈FR3序列。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列之重鏈FR4序列。
在一個實施方案中，該抗體之CDR3序列與本文所列輕重鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 116之組合相差最多不超過6、5、4、3、2或1單胺基酸添加、替換及/或缺失。在另一個實施方案中，該抗體之輕鏈CDR3序列與本文所列輕鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 50相差不得超過6、5、4、3、2或1單胺基酸添加、替換及/或缺失。在另一個實施方案中，該抗體之輕鏈CDR3序列與本文所列輕鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 50相差不得超過6、5、4、3、2或1單胺基酸添加、替換及/或缺失，且該抗體之重鏈CDR3序列與本文所列重鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 116或SEQ ID NO: 118相差最多不超過6、5、4、3、2或1單胺基酸添加、替換及/或缺失。在另一個實施方案中，該抗體進一步包含1、2、3、4、5或6 個本文所列輕重鏈CDR輕重鏈序列組合。在另一個實施方案中，該抗體進一步包含1、2、3、4、5或6個CDR輕重鏈序列組合，各序列獨自與本文所列輕重鏈輕重鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 116之組合相差最多不超過6、5、4、3、2或1單胺基酸。在另一個實施方案中，該抗體包含本文所列輕鏈可變區的CDR及重鏈可變區的CDR。在另一實施方案中，該抗體包含本文所列之1、2、3、4、5及/或6個CDR輕重鏈序列組合。
在一個實施方案中，該抗體(例如抗體或抗體片段)包含本文所列L1輕鏈可變結構域序列。在一個實施方案中，該輕鏈可變結構域包含與L1之輕鏈可變結構域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1胺基酸差異之胺基酸序列，其中各該序列之差異獨立為一個胺基酸殘基的缺失、插入或替換。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結構域包含與L1之輕鏈可變結構域序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%相同之胺基酸序列。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含與L1多聚核苷酸編碼序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%相同的核苷酸編碼序列。在另一個實施方案中，該輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含在中等條件下與L1之輕鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交的多聚核苷酸序列。在另一個實施方棠中，該輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含在嚴格條件下與L1之輕鏈可變結構域的多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交的多聚核苷酸序列。
在一個實施方案中，該抗體(例如抗體或抗體片段)包含本文所列H1重鏈可變結構域序列。在另一個實施方案中，該可變結構域包含選與H1之重鏈可變結構域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1胺基酸差異之胺基酸序列，其中各該序列之差異獨立為一個胺基酸殘基的缺失、插入或替換。在另一個實施方案中，該重鏈可變結構域包含與H1的重鏈可變結構域序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%相同之胺基酸序列。在另一個實施方案中，該重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含與H1多聚核苷酸編碼序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%相同的核苷酸編碼序列。在另一個實施方案中，該重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含在中等嚴格條件下與H1的重鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交的多聚核苷酸序列。在一個實施方案中，該重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包含在嚴格條件下與H1的重鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交的多聚核苷酸序列。
在一個實施方案中，本文所述之抗體包括包含組合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13或L14H14的抗體，或其期望表型(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE及IgD)，或其Fab或F(ab')2 片段。
在一個實施方案中，本文所述之抗體包括包含組合L1H1的抗體，或其類轉換的抗體(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE及IgD)，或其Fab或F(ab')2 片段。
本文所述之抗體(例如，抗體、抗體片段及抗體衍生物)可包含此項技術中已知的恆定區中任何一個。輕鏈恆定區可為例如κ或λ型輕鏈恆定區，例如小鼠κ或λ型輕鏈恆定區。重鏈恆定區可為例如α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區，例如小鼠α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區。在一個實施方案中，該輕鏈或重鏈恆定區為天然恆定區的片段、衍生物、變異體或突變蛋白。
在一個實施方案中，本文所述之抗體進一步包含恆定輕鏈κ或λ結構域或此等的片段。輕鏈恆定區序列及其多聚核苷酸提編碼序列供如下：多聚核苷酸(κ)，(SEQ ID NO: 193)；胺基酸(κ)，(SEQ ID NO: 194)；多聚核苷酸(λ)，(SEQ ID NO: 195)；胺基酸(λ)，(SEQ ID NO: 196)。
在另一個實施方案中，本文所述之抗體進一步包含重鏈恆定結構域或其片段。重鏈恆定區序列及其多聚核苷酸編碼序列提供如下：多聚核苷酸(IgG4)，(SEQ ID NO: 197)；胺基酸(IgG4)，(SEQ ID NO: 198)。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體選自鼠源抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、Fab片段、F(ab')x 片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體及IgG4抗體。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體為ETA單株抗體。在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體為自鼠源ETA抗體。本文所述之ETA抗體為人類化ETA抗體。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體為單株抗體A-1 (其包含SEQ ID NO: 138與SEQ ID NO: 166)、A-7 (其包含SEQ ID NO: 150與SEQ ID NO: 178)、A-8 (其包含SEQ ID NO: 152與SEQ ID NO: 180)、A-9 (其包含SEQ ID NO: 154與SEQ ID NO: 182)、A-10 (其包含SEQ ID NO: 156與SEQ ID NO: 184)、A-11 (其包含SEQ ID NO: 158與SEQ ID NO: 186)、A-12 (其包含SEQ ID NO: 160與SEQ ID NO: 188)、A-13 (其包含SEQ ID NO: 162與SEQ ID NO: 190)或A-14 (其包含SEQ ID NO: 164與SEQ ID NO: 192)。
抗體及抗體片段 在一個實施方案中，本文所述之抗體為完整抗體(包括具有全長重及/或輕鏈的多株、單株、嵌合、人類化或人類抗體)。在另一個實施方案中，本文所述之抗體為抗體片段，列如F(ab')2 、Fab、Fab'、Fv、Fc或Fd片段，且可整合入單結構域抗體、單鏈抗體、最大抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、內抗體(intrabodies)、二鏈抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及bis-scFv(參見，例如Hollinger及Hudson，2005，Nature Biotechnology 23:1126-1136)。在另一個實施方案中，本文所述之抗體亦包括抗體多肽例如美國專利號US6,703,199中所公開的彼等者，包括纖維結合素多肽單抗體。在另一個實施方案中，本文所述之抗體亦包括其他抗體多肽公開於美國專利申請公開案號US2005/0238646，其為單鏈多肽。
在一個實施方案中，使用核苷酸引子擴增在雜交瘤中表現相關單株抗體之基因的可變區。此等引子可由一般熟習此項技術者合成或自商業來源購買(參見，例如Stratagene，La Jolla，California)，此等廠商銷售鼠及人可變區引子包括VHa 、VHb 、VHc 、VHd 、CH1 、VL 及CL 區的引子。此等引子可用於擴增重鏈或輕鏈可變區，然後將其分別插入載體例如IMMUNOZAPTMH或ILLLFFLUNOZAPTML(Stratagene)中。然後將此等載體引入大腸桿菌、酵母或哺乳動物為基礎的表現系統。可使用此等方法產生大量包含VH 及VL 結構域融合之單鏈蛋白(參見Bird等，1988，Science 242:423-426)。
一旦使用上述任何免疫及其他技術獲得了根據本文生產抗體之細胞，可根據本文所述標準方法藉由分離且自其擴增DNA或mRNA對特異抗體基因進行選殖。定序由其產生的抗體且鑑定CDR，可如之前所述對編碼CDR之DNA進行操作以生成根據本文所述之其他抗體。
本文所述之抗體較佳在本文描述的基於細胞之測定法中及/或本文描述的體內測定法中調節內皮素信號傳導及/或交叉阻斷本申請所述抗體之一的結合及/或經本申請所述抗體之一被結合ETA交叉阻斷。因此可使用本文所述測定法鑑定該類結合劑。
在一些實施方案中，藉由首先鑑定在本文描述的基於細胞之及/或體內測定法中與過表現ETA的細胞結合及/或中和及/或交叉阻斷本申請描述的抗體及/或經本申請描述的抗體之一被結合ETA交叉阻斷的抗體以生成抗體。
熟習此項技術者應理解的是一些蛋白質，例如抗體，可能進行可多種轉錄後修飾。此等修飾的類型及程度取決於用於表現該蛋白的宿主細胞株以及培養條件。該類修飾包括糖基化作用、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸異構化及天冬醯胺脫醯胺作用之變化。由於羧肽酶的作用頻繁修飾導致羧端鹼性殘基(例如離胺酸或精胺酸)的丟失(如Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134中所述)。
生產鼠單株抗體之可選擇方法為將雜交瘤細胞注入同源基因小鼠的腹膜腔，例如經處理(例如姥鮫烷初次免疫)促進形成包含單株抗體之腹水的小鼠。可藉由多種已確立的技術分離及純化單株抗體。該類分離技術包括使用蛋白A-瓊脂糖的親和層析法、分子排阻層析法及離子交換層析法，參見，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12頁及第2.9.1-2.9.3頁；Baines等，「Purification of Immunoglobulin G(IgG),」Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104頁(The Humana Press公司，1992)。可使用基於抗體之特殊性質(例如，重鏈或輕鏈同型、結合特異性等)篩選的適當配位體藉由親和層析法純化單株抗體。固定化於固體載體的適當配位體之實例包括蛋白A、蛋白G、抗恆定區(輕鏈或重鏈)抗體、抗獨特型抗體以及TGF-p結合蛋白或其片段或變異體。
可使用抗體結合位點中央的互補決定區(CDR)的分子進化分離親和性增加的抗體，例如對c-erbB-2親和性增加的抗體，如Schier等，1996，J. Mol. Biol. 263:551-567所述。因此，該類技術可用於製備人內皮素受體的抗體。例如可在偵測是否存在內皮素受體的活體外或活體內測定法中使用針對人內皮素受體的抗體。
亦可藉由任何傳統技術製備抗體。例如，可由天然表現此等抗體之細胞將其純化(例如，可由生產抗體之雜交瘤將其純化)或使用此項技術中任何已知的技術在重組表現系統中產生。參見，例如，Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A New Dimensionin Biological Analyses, Kennet等編，Plenum Press(1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual, Harlowand Land編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。此在下文的核酸部分論述。
可藉由任何已知技術製備抗體且篩選期望性質。一些技術涉及分離編碼相關抗體(例如，抗內皮素受體抗體)的多肽鏈(或其部分)的核酸，且藉由重組DNA技術操作核酸。該核酸可與另一相關核酸融合或經修飾(例如藉由誘變或其他傳統技術)以添加、缺失或替換一或多個胺基酸殘基。
當需要提高根據本文包含一或多個上述CDR的抗體之親和性時，可藉由多種親和成熟方案包括維持CDR (Yang等，1995，J. Mol. Biol. 254:392-403)、鏈替換(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大腸桿菌的突變株(Low等，1996，J. Mol. Biol. 250:350-368)DNA重排(Patten等，1997，Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733)、噬菌體展示(Thompson等，1996，J. Mol. Biol. 256:7-88)以及其他PCR技術(Crameri等，1998，Nature 391：28 8-291)。所有此等親和力成熟方法論述於Vaughan等，1998，Nature Biotechnology 16:535-539中。
在一個實施方案中，本文所述之抗體為抗內皮素受體片段。該片段可完全由抗體衍生序列組成或可包含附加序列。抗原結合片段之實例包括Fab、F(ab')2 、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及結構域抗體，其他實例提供於Lunde等，2002，Biochem. Soc. Trans. 30:500-06。
可經胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈及輕鏈可變結構域(Fv區)形成單鏈抗體，由此得到單多肽鏈。已藉由將編碼肽連接子的DNA融合在編碼兩個可變結構域多肽(VL 及VH )的DNAs之間製備該單鏈Fv (scFv)。所得多肽可摺疊回自身形成抗原結合單體，或它們可形成多聚體(例如，二聚體、三聚體或四聚體)，取決於兩個可變結構域之間的柔性連接子的長度(Kortt等，1997，Prot. Eng. 10:423；Kortt等2001，Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合包含多肽之不同VL 及VH ，可形成與不同表型結合的多體scFvs(Kriangkum等，2001，Biomol. Eng. 18:31-40)。已研發的用於生產單鏈抗體之技術包括美國專利號US4,946,778；Bird，1988，Science 242:423；Huston等，1988, PNAS USA 85:5879-5883；Ward等，1989，Nature 334:544-546；deGraaf等，2002，Methods Mol. Biol. 178:379-87申描述的彼等者。來源於本文所述之抗體之單鏈抗體包括但不限於包含可變結構域組合L1H1的scFvs，均涵蓋於本文。
亦可藉由抗體之蛋白水解作用例如根據傳統方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗體獲得來源於抗體之抗原結合片段。舉例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗體提供稱作F(ab')2 的SS片段生產抗體片段。可使用巰基還原劑進一步裂解此片段產生3.5S Fab'單價片段。可選擇的方案有，使用巰基保護基團進行該裂解反應得到二硫鍵的裂解；另外亦可以使用木瓜蛋白酶的酶裂解直接產生兩個單價Fab片段及一個Fc片段。此等方法描述於例如Goldenberg，美國專利號US4,331,647，Nisonoff等，1960，Arch. Biochem. Biophys. 89:230；Porter，1959，Biochem. J. 73:119；Edelman等，Methods in Enzymology l:422(Academic Press，1967)；以及Andrews及Titus, J.A. Current Protocols in Immunology(Coligan等編，John Wiley & Sons, 2003)，第2.8,1-2.8.10頁及第2.10A.1-2.10A.5頁。其他裂解抗體之方法，例如製備重鏈以形成單價重、輕鏈片段(Fd)，進一步裂解片段或亦可使用其他酶、化學或基因技術，只要片段與可被該完整抗體識別的抗原結合。
另一種形式的抗體片段為包含一或多個抗體互補決定區(CDR)的肽。可藉由構建編碼相關CDR的多肽獲得CDR。例如可藉由使用聚合酶鏈式反應用抗體生成細胞之mRNA作為模板合成可變區製備該類多肽，參見，例如，Larrick等，1991，Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Courtenay-Luck，「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,」 Monoclonal Antibodies:Production, Engineering and Clinical Application，Ritter等編，第166頁(Cambridge University Press，1995)；及Ward等，「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,」Monoclonal Antibodies:Principles and Applications，Birch等編，第137頁(Wiley-Liss公司，1995)。該抗體片段可進一步包含本文所述抗體之至少一個可變結構域。因此，例如，V區結構域可為單體且是VH 或VL 結構域，其可以如下文所述之至少等於1×10-7 M或更低的親和度獨立與內皮素受體結合。
該可變區結構域可為任何天然可變結構域或其基因工程形式。基因工程形式係指使用重組DNA工程技術產生的可變區結構域。該基因工程形式包括例如藉由向特異抗體之胺基酸序列插入、缺失或改變由特異抗體可變區產生的。具體實例包括包含只含一個CDR以及視情況來自一個抗體之一或多個框架胺基酸及來自另一抗體之可變區結構域剩餘部分，且由基因工程組裝成的可變區結構域。
可變區結構域可與至少一個其他抗體結構域或其片段在C端胺基酸共價連接。因此，舉例而言，存在於可變區結構域的VH 結構域可與免疫球蛋白CH1 結構域或其片段相連。相似地，VL 結構域可與CK 結構域或其片段相連。以此種方式，例如，該抗體可為Fab片段，其中抗原結合結構域包含它們的C端分別與CH1 及CK 結構域共價連接之聯合VH 及VL 結構域。可用其他胺基酸延長CH1 結構域，例如以提供鉸鏈區或如Fab'片段中之部分鉸鏈結構域或提供其他結構域，例如抗體CH2 及CH3 結構域。
抗體之衍生物及變異體 例如可藉由隨機誘變或藉由定點誘變(例如寡聚核苷酸誘導的定點誘變)改變編碼對應於胺基酸序列A-1的核苷酸序列L1及H1以產生與未突變多聚核苷酸相比包含一或多個具體核苷酸替換、缺失或插入的經改變的多聚核苷酸。用於產生該類改變的技術實例描述於Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik, 1985，BioTechniques, 3:12-19；Smith等，1981, Genetic Engineering: Principles and Methods，Plenum Press；以及美國專利號US4,518,584及US4,737,462。此等及其他方法可用於產生例如與未衍生化抗體相比具有期望性質例如親和性、親和力或對內皮素受體的特異性增強、活體內或活體外活性或穩定性增強或體內副作用降低的抗內皮素受體抗體之衍生物。
本文領域的其他抗內皮素受體抗體衍生物包括抗內皮素受體抗體或其片段與它蛋白或多肽之共價或聚集結合物，例如藉由表現包含與抗內皮素受體抗體多肽之N端或C端融合之異源多肽之重組融合蛋白。例如，該結合肽可為異源信號(或引導)多肽，例如酵母α因子前導肽或例如表位標籤的肽。包含融合蛋白的抗體可包含被添加以輔助抗體之純化或鑑定的肽(例如多聚組胺酸)。抗體亦可與FLAG肽連接，如Hopp等，1988, Bio/Technology 6:1204及美國專利號US5,011,912所述。FLAG肽具有高抗原性且提供被特異單株抗體(mAb)可逆結合的表位，允許已表現重組蛋白的快速偵測及方便純化。可商業購買(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)用於製備其中FLAG肽與給定多肽融合之融合蛋白的試劑，在另一個實施方案中，包含一或多個抗體之寡聚體可用作內皮素受體拮抗劑或用更高級的寡聚體。寡聚體可以是共價連接之或非共價連接之二聚體、三聚體或更高的寡聚體形式。可使用包含兩個或更多個抗體之寡聚體，其中一個實例為同型二聚體。其他寡聚體包括異二聚體、同型三聚體、異三聚體、同型四聚體、雜四聚體等。
一個實施方案是針對包含多個抗體之寡聚體，它們藉由與抗體融合之肽部分之間的共價或非共價相互作用連接。該類肽可為肽間隔子(spacer)或具有促進寡聚化作用性質的肽。白胺酸拉鏈及某些來源於抗體之多肽為可促進抗體寡聚化的肽，如下文詳細描述。
在具體之實施方案中，寡聚體包含兩個至四個抗體。寡聚體的抗體可為任何形式，如上文所述任何形式，例如變異體或片段。較佳地，該寡聚體包含具有內皮素受體結合活性的抗體。
在一個實施方案中，使用來源於免疫球蛋白的多肽製備寡聚體。製備包含一些與抗體衍生多肽(包括Fc結構域)的不同部位融合之異源多肽已描述於例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535；Byrn等，1990，Nature 344:677；及Hollenbaugh等，Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, Current Protocols in Immunology，Suppl. 4，第10.19.1-10.19.11頁。本文之一個實施方案是針對包含兩個由融合抗內皮素受體抗體之內皮素結合片段與抗體之Fc區產生的融合蛋白的二聚體。可藉由以下方式製備二聚體：例如在適當的表現載體中插入編碼融合蛋白的基因融合，在用重組表現載體轉化的宿主細胞中表現該融合基因且允許已表現融合蛋白像抗體分子一樣組裝，其中Fc部分之間的鏈間二硫鍵形成二聚體。
如本文所使用術語「Fc多肽」包括來源於抗體Fc區的天然及突變蛋白形式的多肽。亦包括包含促進二聚體化的鉸鏈區的該類多肽之截短形式。包含Fc部分(以及由其形成的寡聚體)的融合蛋白提供了在蛋白A或蛋白G柱子上進行親和層析法方便純化的優勢。
PCT申請案W093/10151(以參考形式併於本文)中一種適當的Fc多肽為自N端鉸鏈區延伸至人IgG1抗體之Fc區的天然C端的單鏈多肽。另一種可用之Fc多肽為美國專利號US5,457,035及Baum等，1994, EMBO J. 13:3992-4001中描述之Fc突變蛋白。該突變蛋白之胺基酸序列與W093/10151中所示天然Fc序列之胺基酸序列相同，除了胺基酸19由白胺酸變為丙胺酸，胺基酸20由白胺酸變為麩醯胺酸以及胺基酸22由甘胺酸變為丙胺酸。該突變蛋白表現出對Fc受體的親和力降低。在其他實施方案中，抗內皮素受體抗體之重鏈及/或輕鏈可被取代為抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。
或者，該寡聚體為包含多個抗體之融合蛋白，包含或不包含間隔肽(spacer peptide)。此等適當的間隔肽描述於美國專利號US4,751,180及US4,935,233。
製備寡聚抗體之另一種方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈結構域為促進它們所存在的蛋白寡聚化作用之肽。最初發現白胺酸拉鏈存在於數種DNA結合蛋白中(Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此後發現存在於各種不同蛋白中。在已知的白胺酸拉鏈中為可二聚體化或三聚體化的天然肽或其衍生物。適用於生產可溶寡聚蛋白的白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請案W094/10308，來源於肺表面活性蛋白D (SPD)的白胺酸拉鏈描述於Hoppe箏，1994，FEBS Letters 344:191，以參考形式併於本文。允許與其融合之異源蛋白穩定三聚體化的經修飾的白胺酸拉鏈的使用描述於Fanslow等，1994，Semin. Immunol. 6:267-78。在一種方法中，在適當的宿主細胞中表現包含與白胺酸拉鏈肽融合之抗內皮素受體抗體片段或衍生物的重組融合蛋白，自培養物上清中收集可溶寡聚抗內皮素受體抗體片段或其衍生物。
在另一個實施方案中，該抗體衍生物可包含至少本文公開的CDR中之一者。舉例而言，可將一或多個CDR整合入已知的抗體骨架區(IgG1，IgG2等)或與適當的載體結合以增強其半衰期。適當載體包括但不限於Fc、白蛋白、轉鐵蛋及類似物質。此等及其他適當的載體為此項技術中已知。該結合CDR肽可為單體、二聚體、四聚體或其他形式。在一個實施方案中，一或多個水溶性多聚體在結合劑的一或多個特異位點結合，例如在胺基端。在一個實例中，抗體衍生物包含一或多個水溶性多聚體附著物包括但不限於聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。參見，例如，美國專利號US4,640,835、US4,496,689、US4,301,144、US4,670,417、US4,791,192及US4,179,337，在一些實施方案中，衍生物包含一或多個一甲氧基．聚乙二醇、葡聚糖、纖維素或其他基於碳水化合物的聚合物，聚(N-乙烯基吡咯酮)。聚乙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及該類聚合物之混合物。在一些實施方案中，一或多個水溶性聚合物與一或多個側鏈隨機結合。在一些實施方案中。PEG可提高結合劑例如抗體之治療作用。一些該類方法描述於例如美國專利號US6,133,426，其以參考形式以任何目的併於本文。
應當理解的是本文所述之抗體可具有至少一個胺基酸替換，只要該抗體保留了結合特異性。因此，抗體結構之修飾包含於本文範疇。此等可包括不破壞抗體內皮素受體結合能力的胺基酸替換，其可為保守或非保守的。保守胺基酸替換可包括非天然胺基酸殘基，其通常經化學肽合成整合而不是生物系統合成。此等包括擬肽及其他反向或倒轉形式的胺基酸部分。保守胺基酸替換亦可涉及用非天然殘基替換天然胺基酸殘基，使得對該位點胺基酸殘基的極性或電荷作用很小或沒有作用。非保守替換可涉及一類胺基酸或胺基酸類似物的一個成員與具有不同物理性質(例如，體積、極性、疏水性、電荷)的另一類胺基酸的成員交換。
而且，熟習此項技術者可生成在各期望胺基酸殘基上包含胺基酸替換的待測變異體。可使用熟習此項技術者已知的活性測定法篩選該類變異體。該類變異體可用於收集關於適當變異體的資訊。舉例而言，若發現某一胺基酸殘基可引起活性破壞、非期望的降低或不當的活性，可避免具有該類變化的變異體。換言之，基於自此等習知試驗收集之資訊，熟習此項技術者可輕鬆確定應避免進一步替換(單獨或與其他突變組合)的胺基酸。
技術人員可使用已知技術確定如本文所列之多肽之適當變異體。在一些實施方案中，熟習此項技術者可藉由靶向對於活性不重要的區域鑑定經改變後不會破壞活性的分子適當區域。在一些實施方案中，可鑑定在相似多肽中保守的殘基或分子部分。在一些實施方案中，甚至可保守替換對於生物活性或結構重要的區域而不破壞生物活性或不會有不利作用於多肽結構。此外，熟習此項技術者可考察結構．功能研究鑑定對活性或結構重要的相似多肽中之殘基。鑒於此對比，可預測對應於在相似蛋白中對活性或結構重要的胺基酸殘基的蛋白質中胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可為此等經預測重要的胺基酸殘基選擇化學相似胺基酸替換。
熟習此項技術者亦可分析與相似多肽之結構相關之三維結構及胺基酸序列。鑒於該類資訊，熟習此項技術者可預測就三維結構而言抗體之胺基酸殘基比對。在一些實施方案中，熟習此項技術者可選擇不對經預測在蛋白質表面的胺基酸殘基進行顯著改變，因為該類殘基可能參與與其他分子的重要相互作用。許多科學出版物致力於二級結構之預測。參見，Moult，1996，Curr. Op. Biotech. 7:422-427，Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222；Chou等，1978，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148；Chou等，1979，Ann. Rev. Biochem. 47:251-276及Chou等，Biophys. J. 26:367-384。此外，目前可使用電腦程式輔助預測二級結構。舉例而言，序列同一性大於30%或相似性大於40%的兩種多肽或蛋白質通常具有相似的高級結構。近期蛋白結構資料庫(PDB)的增長增強了二級結構的可預測性，包括多肽或蛋白結構中潛在的摺疊數量。參見，Holm等，1999，Nucl. Acid. Res. 27:244-247。已表明(Brenner等，1997，Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376)在給定多肽或蛋白質中存在有限數量之摺疊且一旦確定了臨界數量之結構，結構預測將變得顯著更加精確。預測二級結構的其他方法包括「穿接(threading)」 (Jones，1997，Curr. Opin. Struct. Biol., 7:377-87；Sippl等，1996，Structure 4:15-19；「圖譜分析(profile analysis)」(Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等，1990，Meth. Enzym. 183:146-159；Gribskov等，1987，PNAS USA 84:4355-4358及「進化聯繫(evolutionary linkage)」(參見Holm，見上文(1999)，及Brenner，見上文(1997))。在一些實施方案中，抗體變異體包括糖基化變異體，其中與母體多肽之胺基酸序列相比改變了糖基化位點的數量及/或類型。在一些實施方案中，變異體與天然蛋白質相比具有更多或更少數量之N連接糖基化位點。或者，去除該序列的替換可移除現有N連接糖鏈。亦提供了N連接糖鏈的重排，其中去除了一或多個N連接糖鏈位點(通常為天然存在的彼等者)且創造了一或多個新的N連接位點。其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，與母體胺基酸序列相比其中缺失或由另一胺基酸(例如絲胺酸)替換一或多個半胱胺酸殘基。當抗體必須摺疊成生物活性構形時(例如在分離可溶包涵體之後)可用半胱胺酸變異體。半胱胺酸變異體通常比天然蛋白質具有較少的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數個半胱胺酸以最小化未配對半胱胺酸引起之相互作用。
熟習此項技術者可在需要該類替換時確定期望的胺基酸替換(保守或非保守)。在一些實施方案中，胺基酸替換可用於鑑定人內皮素受體抗體之重要殘基或者增加或降低本文所述人內皮素受體抗體之親和力。根據一些實施方案，較佳的胺基酸替換為以下：(1)降低蛋白質水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白質複合物的結合親和力，(4)改變結合親和力及/或(4)賦予或修飾該類多肽上的其他物理化學或功能性質。根據一些實施方案，可在天然存在序列中(在一些實施方案中，在形成分子間接觸的結構域之外的多肽部分)進行單個或多個胺基酸替換(在一些實施方案中為保守胺基酸替換)。在一些實施方案中，保守胺基酸替換通常不會本質上改變母體序列的結構特性(例如，替換胺基酸不應破解存在於母體序列中之螺旋或干擾特徵化母體序列的其他類型二級結構)。此項技術中認可的多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins，Structures and Molecular Principles，Creighton編，W.H. Freeman公司(1984)；Introduction to Protein Structure，Branden及Tooze編，Garl and Publishing(1991)；以及Thornton等，1991，Nature 354:105，其以參考形式併於本文。
在一些實施方案中，本文所述之抗體可與多聚體、脂類或其他部分(moieties)化學鍵合。抗原結合試劑可包含至少一個本文描述的CDR，其摻入生物相容性骨架結構中。在一個實例中，該生物相容性骨架結構包含足以形成構形穩定結構支持或骨架或支架的多肽或其部分，其可在侷限的表面區域展示可與抗原結合的一或多個胺基酸序列(例如，CDR、可變區等)。該類結構可為天然存在多肽或多肽「摺疊」(結構基序)，或相對與天然多肽或摺疊可具有一或多個修飾，例如胺基酸添加、缺失或替換。此等支架可來源於任何物種(或多於一個物種)的多肽，例如，人類、其他哺乳動物、其他脊椎動物、無脊椎動物、細菌或病毒。生物可溶性骨架結構通常係基於蛋白質支架或骨架而不是免疫球蛋白結構域。舉例而言，可使用基於纖維結合素、錨蛋白、脂質運載蛋白(lipocalin)、新抑癌蛋白、細胞色素b、CP1鋅指蛋白、PST1、捲曲螺旋、LACI-D1、Z結構域及澱粉酶抑肽結構域(參見，例如，Nygren及Uhlen, 1997，Current Opinionin Structural Biology 7:463-469)。
此外，熟習此項技術者可認識到適當的結合劑包括此等抗體之部分，例如一或多個重鏈CDR1、CDR2、CDR3、輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，如本文所具體公開。至少一個重鏈CDR1、CDR2、CDR3、CDR1、CDR2及CDR3區具有至少一個胺基酸替換，只要該抗體保留了非替換CDR的結合特異性。該抗體之非CDR部分可為非蛋白分子，其中該結合劑交叉阻斷本文公開的抗體與人ETA的結合及/或抑制經該受體之內皮素信號傳導。該抗體之非CDR部分可為非蛋白質分子，其中該抗體在競爭結合測定法中顯示出與至少抗體A-1/A-2之一所顯示相似的與人ETA肽的結合類型，及/或中和內皮素的活性。抗體之非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體為重組結合蛋白或合成肽，且該重組結合蛋白交叉阻斷本文公開的抗體與人ETA的結合及/或中和活體內或活體外內皮素活性。抗體之非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體為重組抗體，且該重組抗體在競爭結合測定法中顯示出與至少抗體A-1/A-2之一所顯示相似的與人ETA肽的結合類型，及/或中和內皮素信號傳導。
核酸 一方面，本文提供分離的核酸分子。該核酸分子包含例如編碼全部或部分抗體之多聚核苷酸，例如本文抗體之一條鏈或兩條鏈，或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體；足以用作雜交探針的多聚核苷酸；PCR引子或用於鑑定、分析、突變或擴增編碼多肽之多聚核苷酸的定序引子；用於抑制多聚核苷酸表現的反義核酸以及其互補序列。該核酸可為任何長度。例如其長度可為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多個核苷酸，及/或包含一或多個附加序列，例如調控序列，及/或是較大核酸例如載體之一部分。該核酸可為單鏈或雙鏈且包含RNA及/或DNA核苷酸以及其人工變異體(例如，肽核酸)。
可自經ETA抗原免疫的小鼠B細胞中分離編碼抗體多肽(例如，重鏈或輕鏈、僅可變結構域或全長)的核酸。可藉由習知方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)分離該核酸。
編碼重鏈及輕鏈可變區的核酸序列如上文所示。熟練的技術人員可理解由於遺傳密碼的簡併性，本文公開的各多肽序列可由更多數量之其他核酸序列編碼。本文提供編碼本文所述之抗體之各簡併核苷酸序列。
本文進一步提供在具體雜交條件下與其他核酸(例如，包含任何A-1/A-2之核苷酸序列的核酸)雜交的核酸。雜交核酸之方法為此項技術中熟知。參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定義，例如，中等嚴格條件使用包含5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)的預洗溶液、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH8.0)、約50%甲醯胺的雜交緩衝液、6×SSC及55℃的雜交溫度(或其他相似的雜交溶液，例如包含絢50%甲醯胺的，以42℃雜交)，且溶離條件為60℃，使用0.5×SSC、0.1% SDS。嚴格雜交條件在6×SSC中於45℃雜交，然後於68℃在0.1×SSC、0.2% SDS中洗滌一次或多次。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交嚴格度，使得包含相互之間至少65、70、75、80、85、90、95、98或99%同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互雜交。影響雜交條件選擇的基本參數及設計適當條件的指導列於例如Sambrook，Fritsch及Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，第9及11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等編，John Wiley & Sons公司，第2.10及6.3-6.4節)且可由具有一般熟習此項技術者基於例如DNA之長度及/或鹼基組成輕鬆確定。可藉由突變在核酸中引入變化，藉此導致其編碼的多肽(例如，抗原結合蛋白)胺基酸序列之變化。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變。在一個實施方案中，使用例如定點誘變方案改變一或多個具體胺基酸殘基。在另一個實施方案中，使用例如隨機誘變方案改變一或多個隨機選擇的殘基。無論其如何生成，可表現突變多肽且篩選期望性質。
可將突變引入核酸而不顯著改變其編碼多肽之生物學活性。例如，可進行引起非必需胺基酸殘基處胺基酸替換的核苷酸替換。在一個實施方案中，突變本文為L-1至L-2及H-1至H-2提供的核苷酸序列或其片段、變異體或衍生物，使得其編碼包含本文所示L-1至L-2及H-1至H-2的胺基酸殘基的一或多個缺失或替換，成為兩個或多個序列相異的殘基。在另一個實施方案中，誘變作用在本文所示L-1至L-2及H-1至H-2的一或多個胺基酸殘基附近插入一個胺基酸成為兩個或多個序列相異的殘基。或者，可將一或多個突變引入核酸以選擇性改變其編碼多肽之生物學活性(例如，與ETA結合)。例如，該突變可在數量上或性質上改變生物學活性。量變之實例包括增加、降低或消除該活性。質變之實例包括改變抗體之抗原特異性。
在另一方面，本文提供適於用做引子或偵測本文核酸序列的雜交探針的核酸分子。本文之核酸分子可僅包含編碼本文全長多肽之核酸序列之一部分，例如，可用作探針或引子或編碼本文多肽活性部分的片段(例如，ETA結合部分)的片段。基於本文核酸序列的探針可用於偵測該核酸或相似核酸，例如編碼本文多肽之轉錄物。該探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。該類探針可用於鑑定表現該多肽之細胞。
在另一方面，本文提供包含編碼本文多肽或其部分之核酸的載體。載體之實例包括但是不限於質體、病毒載體、非游離基因哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。本文之重組表現載體可包含適於該核酸在宿主細胞中表現的形式的本文核酸。該重組表現載體包括一或多個調控序列，基於用於表現的宿主細胞進行篩選，其與該預表現的核酸序列可操作性相連。調控序列包括引導核苷酸序列在多個種類宿主細胞中組成型表現的(例如，SV40早期基因強化子、勞斯氏肉瘤病毒啟動子及細胞巨化病毒啟動子)，引導僅在某些宿主細胞中核苷酸序列的表現的(例如，組織特異調控序列，參見Voss等，1986，Trends Biochem. Sci. 11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整內容以參考形式併於本文)以及引導核苷酸序列響應具體處理或條件的誘導型表現的(例如，哺乳動物細胞中之金屬硫堇啟動子與原核及真核系統二者中之四環黴素反應(tet-sesponsive)啟動子及/或鏈黴素反應啟動子(同前))。熟習此項技術者應理解表現載體的設計取決於例如用於轉化的宿主細胞之選擇、所需蛋白表現量等因素。本文之表現載體可引入宿主細胞，藉此產生由本文所述核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
另一方面，本文提供可引入本文表現載體的宿主細胞。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。原核宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。更高級之真核細胞包括昆蟲細胞、酵母細胞以及哺乳動物源的確立細胞株。適當哺乳動物宿主細胞株之實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或它們的衍生物例如Veggie CHO及在無血清培養基中生長的相關細胞株(參見Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(參見Urlaub等，1980，PNAS USA77:4216-20)。其他CHO細胞株包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)及UV20(ATCC#CRL-1862)，其他宿主細胞包括猴腎細胞之COS-7株(ATCC#CRL-1651) (參見Gluzman等，1981，Cell23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCCCCL-163)，AM-1/D細胞(描述於美國專利號US6,210,924)、HeLa細胞、BHK(ATCCCRL-10)細胞株、來源於非洲綠猴腎細胞株CV1之CV1/EBNA細胞株(ATCCCCL-70) (參見McMahan等，1991，EMBO J. 10:2821)、人胚腎細胞例如293，293EBNA或MSR293、人上皮A431細胞、人C010220細胞、其他經轉化靈長動物細胞株、正常二倍體細胞、來源於初生組織體外培養物之細胞株、初移植體、HL-60、U937、HaK或傑卡特(Jurkat)細胞。用於細菌、真菌、酵母及哺乳細胞宿主之適當純系與表現載體描述於Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual, Elsevier, 1985)。
可藉由傳統轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於穩定的哺乳動物轉染而言，取決於使用之表現載體及轉染技術，已知只有一小部分細胞可將外源DNA鏊合入其基因組中。為了鑑定及篩選此等整合子，通常將編碼篩選標記(例如抗生素抗性)的基因與所關注基因一起引入宿主細胞。較佳的篩選標記包括可賦予藥物(如G418、潮黴素及甲胺喋呤)抗性的彼等者。在其他方法中可藉由藥物篩選鑑別包含被引入核酸的穩定轉染細胞(例如，整合了篩選基因之細胞可存活，而其他細胞則死亡)。
可在提高多肽表現之條件下培養已轉化細胞，可藉由習知蛋白純化方法回收多肽。一種該純化方法描述於下文實施例。預用於本文之多肽包括基本同源的重組哺乳動物抗內皮素受體抗體多肽，其基本不含污染性內源材料。
抗體之活性 在一個實施方案中，本文所述之抗體與內皮素受體特異性結合，抑制信號傳導且顯示出治療性生物作用，例如降低動物模型之肺動脈高壓。在另一個實施方案中，本文所述之抗體是能與人內皮素受體特異性結合之鼠源抗體或人類化抗體。該類抗體包括可減少或中和內皮素信號傳導的拮抗或中和抗體。
在一個實施方案中，本文所述之抗體與人內皮素受體ETA結合時之Kd 大約為0.01 nM至1000 nM、0.1 nM至500 nM、0.5 nM至200 nM、1 nM至200 nM或10 nM至100 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體與人內皮素受體ETA結合時之Kd 大約為1 nM至200 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體與人內皮素受體ETA結合時之Kd 大約為10 nM至100 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體與人內皮素受體ETA結合時之Kd 大約為1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM或100 nM。
在一個實施方案中，本文所述之抗體在降低人內皮素信號傳導之IC50 值大約為0.01 nM至500 nM、0.1 nM至200 nM、0.5 nM至200 nM、1 nM至200 nM或10 nM至100 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體在降低人內皮素信號傳導之IC50 值大約為1 nM至200 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體在降低人內皮素信號傳導之IC50 值大約為10 nM至100 nM。在另一個實施方案中，本文所述之抗體在降低人內皮素信號傳導之IC50 值大約為1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM或100 nM。
在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體具有一或多個以下所列之性質： a.當與人內皮素受體ETA結合時，其Kd 與上述參比抗體相同或更優； b.當抑制人內皮素受體ETA之內皮素活化時，其IC50 與上述參比抗體相同或更優；及 c.該ETA抗體在人內皮素受體ETA上與上述參比抗體交叉競爭結合。
在另一個實施方案中，本文所述之ETA抗體是具有一或多個以下所列之性質之抗體： a.當與人內皮素受體ETA結合時，其Kd 與參比ETA抗體相同或更優； b.當抑制人內皮素受體ETA之內皮素活化時，其IC50 與參比ETA抗體相同或更優；及 c.該ETA抗體在人內皮素受體ETA上，與參比ETA抗體交叉競爭結合。
在一方面，上述參比抗體包含輕鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 138及重鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO:166之組合。在另一方面，上述參比抗體為單株抗體A-1、A-2、A-7、A-9或A-12。在本文中，術語「基本相似」意為與參比抗體之IC50 或Kd 可比或大約是參比抗體之IC50 或Kd 值之200%、180%、160%、150%、140%、120%、110%、100%、99%、98%、97%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或50%。在一個實施方案中，參比抗體包括，例如，具有重鏈及輕鏈組合L1H1或L2H2的抗體。在另一個實施方案中，參比抗體包括ETA抗體A-1。在一個實施方案中，本文所述之ETA抗體可與人內皮素受體特異性結合，且能降低動物模型的肺動脈高壓。在一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低2%。在另一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低約5%。在另一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低約10%。在另一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低約15%。在另一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低約20%，在另一個實施方案中，與未處理動物相比肺動脈高壓降低約25%。肺動脈高壓降低量由劑量控制，對於動物或人類患者而言，治療有效劑量是為將肺動脈高壓降低至正常範圍之劑量。
TGF-β Trap 在一個實施方案中，本文所述之TGF-β Trap是一可以阻斷TGF-β的功能的蛋白。在另一個實施方案中，本文所述之TGF-β Trap包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 207。在另一個實施方案中，本文所述之TGF-β Trap之胺基酸序列為：SEQ ID NO: 207。
肽連接子(Linker) 在一個實施方案中，本文所述之肽連接子(Linker)包含各獨立地選自於以下中之一者之胺基酸序列：SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209及SEQ ID NO: 210。
在一個實施方案中，本文所述之肽連接子之胺基酸序列為：SEQ ID NO: 208。在另一個實施方案中，本文所述之肽連接子之胺基酸序列為：SEQ ID NO: 209。在另一個實施方案中，本文所述之肽連接子之胺基酸序列為：SEQ ID NO: 210。
ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質 在一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含一個本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap片段。
在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含一個本文所述之ETA抗體以及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個TGF-β Trap及同樣數量之肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接。
在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含一個本文所述之ETA抗體以及一個、兩個、三個或四個TGF-β Trap及同樣數量之肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接。
在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含一個本文所述之ETA抗體以及一個或兩個TGF-β Trap及經同樣數量之肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接。
在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含一個本文所述之ETA抗體以及兩個TGF-β Trap及兩個肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與該ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接。
在一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接。在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之輕鏈之羧基端連接。在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之重鏈之羧基端連接。
在一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 207及SEQ ID NO: 210。
在一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其中上述ETA抗體、TGF-β Trap及肽連接子序列係藉由以下所述中之方式融合形成上述融合蛋白質： (3)    藉由一個肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之重鏈/輕鏈之羧基端連接：N'-R-Linker-TGF-β Trap-C'；及 (4)    藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接：N'-TGF-β Trap-Linker-R-C'；
其中：N'代表多肽鏈胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，TGF-β Trap代表TGF-β Trap，R為上述ETA抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列，且Linker代表肽連接子。
在一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 211或SEQ ID NO: 212。在另一個實施方案中，本文所提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 211及SEQ ID NO: 212。
ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質之生物學活性 ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質之生物學活性包含TGF-β Trap之生物學活性及ETA抗體之生物學活性。ETA之抗體抑制劑能夠有效地阻斷由內皮素引起之血管壓力增加來實現緩解肺動脈高壓之症狀，改善病人之運動能力及血液動力學。「TGF-β Trap生物學活性」係指ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在體內結合且阻斷TGF-β引起之細胞應激反應，且顯示出治療作用之生物學活性，例如肺動脈高壓、肺高壓及肺纖維化的其他相關症狀。前述細胞應激反應包括但是不限於降低肺動脈壓、降低主動脈壓，以及相關之心臟及肺血管重構變化。綜合了TGF-β Trap及ETA抗體之生物學活性，本文所述之TGF-β Trap融合蛋白質可以用於治療多種與TGF-β及ETA相關聯之疾病及病症。該融合蛋白質藉由作用於TGF-β及/或ETA發揮其生物學作用，因此可以用本文所述之TGF-β Trap融合蛋白質治療對「降低TGF-β刺激」或對「降低ETA刺激」做出有利反應之疾病及病症的個體。此等個體稱為「需要降低TGF-β刺激」或「需要降低ETA刺激」之個體。包括肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化及心血管纖維化之其他相關症狀。
在一個實施方案中，ETA抗體或TGF-β Trap融合蛋白質之生物學活性變化是用鈣流實驗及報導基因偵測方法來偵測的，定量ETA抗體或TGF-β Trap融合蛋白質在體外抑制ETA且阻斷TGF-β的功能。
藥物組合物 在一個實施方案中，本文提供了藥物組合物，其包括本文提供之一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，與一或多種可藥用載體。
在一個實施方案中，本文所述之藥用組合物係用於靜脈或皮下注射。
治療方法 在一個實施方案中，本文提供了本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺動脈高壓以及肺動脈高壓相關病症的藥物中之用途。
在另一個實施方案中，本文提供了本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺高壓以及肺高壓相關病症的藥物中之用途。
在另一個實施方案中，本文提供了本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善肺纖維化以及肺纖維化相關病症的藥物中之用途。
在另一個實施方案中，本文提供了本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善心血管纖維化以及心血管纖維化相關病症的藥物中之用途。
在進一步之實施方案中，本文提供了本文所述之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質在製備用於同時治療、預防或改善肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化或者心血管纖維化兩種及更多種病症的藥物中之用途。
本文中，術語「個體」係指哺乳動物，包括人類，可與術語「患者」交替使用。
術語「治療」包括減輕至少一種症狀或病症之其他態樣，或者減輕疾病嚴重性。本文提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質不需要產生完全治癒之作用，或根除疾病之所有症狀或表現，亦即可構成有效治療劑。如相關領域所公認，作為治療劑之藥物可減少給定疾病狀態的嚴重程度，但不需消除疾病之所有表現即可被認為是有效之治療劑。相似地，預防給藥治療不需在預防症狀出現上完全有效即可構成有效預防劑。只減少疾病之影響(例如，藉由減少其症狀之數量或嚴重度，或藉由提高另一治療作用，或藉由產生另一有效作用)，或者減少個體中疾病發生或加重的可能性就已經足夠。本文之一個實施方案涉及包含以足以誘導反應具體病症嚴重性的指示劑高於基線水準的持續改善之量及時間投與患者ETA抗體與TGF-β Trap融合蛋白質之方法。
ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質藥物組合物可採用任意適當技術包括但不限於非經腸、局部或吸入給藥。若是注射，可藉由例如關節內、靜脈內、肌肉內、損傷區內、腹膜內或皮下途徑，以快速注射或連續輸注投與藥用組合物。可考慮例如在疾病或損傷部位局部給藥，如透皮給藥及埋植劑持續釋放給藥。吸入給藥包括例如鼻腔或口腔吸入、採用噴霧劑、以氣霧劑形式吸入抗體等等。其他選擇包括口腔製劑包括片劑、糖漿劑或錠劑。
以包含一或多種其他組分例如生理學可接受載體、輔料或稀釋劑之組合物形式投與本文提供之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質是有利的。組合物可視情況額外包含一或多種如下所述之生理學活性劑。在多個具體實施方案中，組合物包含除一或多種本文提供之抗體(例如鼠源抗體或人類化抗體)與TGF-β Trap融合蛋白質之外的一種、兩種、三種、四種、五種或六種生理學活性劑。
在一個實施方案中，藥物組合物包含本文提供之鼠源抗體或人類化抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質以及一或多種選自以下之物質：pH適合於抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質之緩衝液、抗氧化劑例如抗壞血酸、低分子量多肽(例如含少於10個胺基酸之多肽)、蛋白質、胺基酸、糖例如糊精、複合物例如EDTA、麩胱甘肽、穩定劑及輔料。根據適當工業標準，亦可加入防腐劑。可使用適當輔料溶液作為稀釋劑將組合物配製成凍乾粉末。適當組分在所用劑量及濃度下對受者無毒。可用於藥物處方組分之進一步實例見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)及20版(2000)，Mack Publishing Company提供醫學從業者使用之套組，其包括一或多種本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質以及治療本文論述任何病症之標籤或其他說明。在一個實施方案中，套組包括以上述組合物形式裝在一或多個管型瓶中之一或多種抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質的無菌製劑。
給藥劑量及頻率可根據以下因素而改變：給藥途徑、所用具體抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質、所治疾病之性質及嚴重度、症狀為急性還是慢性以及患者之體積及總體症狀。可藉由此項技術中熟知之方法確定適當劑量，例如在臨床試驗中包括劑量放大研究。
本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質可在例如一段時間內按規律間隔給藥一次或多次。在具體實施方案中，在至少一個月或更長時間給藥一次投與鼠源抗體或人類化抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，例如一個、兩個或三個月或者甚至不確定。對於治療慢性症狀，長期治療通常最有效。但是，對於治療急性症狀，短期給藥例如自一週至六週就已足夠。通常，投與人類抗體直至患者表現出所選體徵或指示劑高於基線水準的醫學相關改善度為止。
本文提供之治療方案之一個實例包括以適當劑量一週一次或者更長的皮下注射抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質治療肺動脈高壓、肺高壓、肺纖維化及心血管纖維化之症狀。可持續每週或每月投與抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質直至達成所需結果例如病人症狀消退。可按需要重新治療，或者，可選擇地，投與維持劑量。
可在使用抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質治療之前、進行中及/或之後監測病人肺動脈壓，以偵測其壓力之任何變化。對於某些病症，肺動脈壓之變化可隨例如疾病進程等因素而變化。可用已知技術測定肺動脈壓。
本文提供之方法及組合物之具體實施方案涉及使用例如抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質及一或多種內皮素拮抗劑、兩種或更多種本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，或者本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質及一或多種其他內皮素拮抗劑。在進一步之實施方案中，單獨或與其他用於治療使患者痛苦之症狀之藥劑組合投與本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質。此等藥劑之實例包括蛋白質以及非蛋白質藥物。當聯合投與多種藥物時，如此項技術中所熟知其劑量應相應調整。「聯合給藥」組合療法不限於同時給藥，亦包括在涉及投與患者至少一種其他治療劑之療程中至少投與一次抗原及蛋白之治療方案。
另一方面，本文提供製備治療肺動脈高壓、肺高壓及肺纖維化症狀之方法，其包含本文提供之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質與醫藥學可接受輔料中之混合物，用於治療上述疾病之相關病症。藥劑製備方法如上所述。
本文進一步提供可特異性結合人ETA之抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質相關之組合物、套組及方法。提供了核酸序列及其衍生物及片段，其包含編碼人ETA結合性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質全部或部分的多聚核苷酸序列，例如編碼全部或部分人ETA結合性抗體、抗體片段、抗體衍生物與TGF-β Trap的融合蛋白質的核酸序列。本文進一步提供包含該核酸序列之載體，以及包含該類核酸及/或載體之細胞。所提供方法包括，例如，製備、鑑定或分離人ETA結合性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質之方法，測定人ETA結合性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質是否仍然可以與ETA結合之方法、人ETA結合性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質阻斷TGF-β引起之信號轉導、以及將人ETA結合性抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質投與模型動物測定體內生物學活性之方法。
下面藉由具體實例，對本文之技術方案作進一步的說明。
本文中，若非特指，所採用之原料及設備等均可自市場購得或是此項技術中常用的。下述實例中之方法，如無特別說明，均為此項技術中之習知方法。
1.  抗體基因之選殖及次選殖 收集分泌抗體之雜交瘤細胞，按照QIAGEN之mRNA抽提套組操作規程，提取雜交瘤細胞之mRNA。然後將提取後之mRNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄引子為小鼠輕、重鏈恆定區之特異性引子，重鏈逆轉錄引子為(5'-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC -3') (SEQ ID NO: 199)，輕鏈逆轉錄引子為(5'-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO: 200)及(5'- TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO: 201)。RT-PCR之反應條件為：25 ℃ 5分鐘(min)；50 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。將逆轉錄之cDNA用0.1 mM之TE稀釋至500 µL，加入至超濾離心管(Amicon Ultra-0.5)中，2000 g離心10 min；棄濾液，再加500 µL之0.1 mM的TE，2000 g離心10 min；棄濾液，將製備管倒置於新的離心管中，2000 g離心10 min，得到純化後之cDNA；取10 µL之純化後的cDNA作為模板，加入4 µL之5×加尾緩衝液(Promega，市售)，4 µL之dATP (1 mM)及10 U之末端轉移酶(Promega，市售)後混勻，37℃孵育5 min後65℃ 5 min；然後以加上PolyA尾之cDNA為模板，PCR擴增抗體之輕、重鏈可變區基因。上游引子均為OligodT，重鏈下游引子為(5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3') (SEQ ID NO: 202)及(5'-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3') (SEQ ID NO: 203)，輕鏈下游引子為(5'- ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3') (SEQ ID NO: 204)。PCR反應條件：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30秒(s)，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40次循環；72 ℃ 7 min；PCR產物連接至PMD 18-T載體(Takara Bio，市售)後進行定序。所選殖之抗體之CDR序列見表一及表二。
基於已定序得到之抗體之DNA序列設計PCR引子，由此將完整輕鏈、重鏈信號肽及可變域以及小鼠IgG1恆定區與表現載體pTM5相連。
2.  抗體融合蛋白基因表現質體之製備 人TGF-β Trap (hTGF-β Trap)基因序列與抗ETA抗體藉由重疊PCR之方法，將hTGF-β Trap基因融合於重鏈抗體C端。藉由PCR引子將融合蛋白重鏈可變區5'端帶入Nhe1酶切位點，融合蛋白3'端帶入Not1酶切位點，由此將完整之重鏈與hTGF-β Trap融合蛋白基因裝入表現載體pTM5；同樣，將輕鏈可變區5'端帶入Nhe1酶切位點，3'端帶入Bsiw1酶切位點，由此將完整之輕鏈可變區序列與已裝入輕鏈恆定區之表現載體pTM5相連。
3.  抗體融合蛋白之短暫表現 接種5×105 /mL之懸浮HEK293或者CHO表現細胞株至轉瓶中，經過24小時(h) 37℃，5% CO2 旋轉培養後，密度達至1×106 /mL後被用於轉染。轉染過程中使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉染介質，將其與DNA(DNA用量為每1×106 個細胞0.5 µg，其中抗體輕鏈及重鏈之比重為3:2)混合，PEI與DNA之質量混合較佳配比為3:1。兩者混合物在靜置孵育15分鐘後被加入至細胞培養中。細胞在接受PEI與DNA混合物後繼續37℃，5% CO2 旋轉培養24 h後，向細胞培養液中加入0.5%之胰蛋白腖作為表現需要的添加物，最後在表現完成後(大於96 h)收集細胞上清液用於抗體之純化分離。
4.  抗體融合蛋白之純化分離 收集之細胞上清液經過高速(8000 rpm，15 min)離心去除細胞以及細胞碎片後，再用0.45 µm濾膜過濾澄清，澄清後之上清被用於純化。純化過程由層析儀完成。上清首先流過蛋白G親和層析柱，上清中包含之抗體在此期間與蛋白G親和層析柱的配位體相結合後被滯留於柱內，然後低pH值(小於等於3.0)之溶離緩衝液灌洗層析柱解離與層析柱結合的抗體，收集到之抗體溶離液的低pH值用1 M之Tris-HCl迅速中和以保護抗體不變性失活。得到之抗體融合蛋白溶離液經過16 h之透析後置換成PBS緩衝體系。
5. 鈣流實驗偵測抗ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白在體外阻斷ETA之生物學活性 以每孔25000個接種共表現hETA-水母素之CHO-DHFR細胞至黑色96孔細胞培養盤，37℃培養過夜。第二天除去細胞上清液，加入50 µl底物腔腸素h (coelenterazine h) (Promega，市售)避光孵育2 h，再加入50 µl純化後之抗體或融合蛋白繼續孵育30 min。在Molecular Devices之SpectraMax L酶標儀上採用自動進樣器灌注內皮素1，在40 s內偵測瞬間鈣流變化，記錄出峰時間及峰值。如圖一所示，ETA抗體及ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白都能有效地抑制細胞內人ETA介導之Ca2+ 變化。
6. 報導基因實驗偵測抗ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白在體外阻斷TGF-β信號路徑 以每孔34000個接種穩定表現SBE-螢光素酶之4T1細胞至96孔細胞培養盤，37℃培養過夜。第二天，預先將3 ng/ml之TGF-β1與梯度稀釋好之ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白，在室溫下進行等體積預孵30 min。預孵期間，96孔細胞培養盤中除去培養基上清液，用無血清培養基清洗細胞表面兩次，吸去殘液。96孔細胞培養盤中再加入100 μL預先反應好之反應液，37℃繼續孵育6小時。孵育結束後，加入100 μL Bright Glo化學發光底物(Promega)，最後將細胞裂解物轉移至白色96孔盤，在SpectraMax L酶標儀(Molecular Devices)上讀取相對螢光強度。圖2顯示了報導基因實驗偵測ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白阻斷TGF-β1活化TGF-β1受體之抑制性曲線。
7.  抗體融合蛋白對博萊黴素誘發C57BL/6小鼠肺纖維化之體內活性 博萊黴素(BLM)經氣管給藥誘導正常C57BL/6小鼠肺纖維化模型(BPF)，用於評價腹腔注射投與h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap在該模型上之治療肺纖維化作用。小鼠經2%異氟烷麻醉，仰臥固定於實驗台上，迅速將留置針軟管插入氣管。取100 μL規格之微量注射器按體重吸取一定量之生理鹽水溶液(正常對照組)或博萊黴素溶液(2.5 mg/kg)，經留置針軟管插入達至軟骨環間隙，按照50 μL/20 g之用量向氣管內緩慢注入藥液。注射後迅速將小鼠直立且旋轉，使藥液在肺內均勻分佈。動物按照體重進行隨機分組，正常組12隻、模型組20隻、h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap低、高劑量組各14隻，造模後一天按照方案投與h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap或空白製劑，連續給藥3週，藉由動物生存期、肺臟病變情況等指標評價藥物療效。如圖3顯示，模型組肺部病理Masson染色大部分肺泡結構消失、肺泡間隔增寬，大量膠原纖維沈積，說明博萊黴素氣管給藥成功誘導正常C57BL/6小鼠肺纖維化，h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap低、高劑量組對上述肺纖維化指標均有明顯之改善作用，且量效關係明顯。另外，如圖4顯示，h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap治療後能延長小鼠之生存時間，表明藥物能夠抑制肺纖維化之進程。
以上所述之實施例只是本發明之一種較佳方案，並非對本發明作任何形式上之限制，在不超出申請專利範圍所記載的技術方案之前提下亦有其他變體及改型。
圖1顯示了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap(其包含SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 207及SEQ ID NO: 210)抑制人ETA介導之Ca2+ 變化之結果。 圖2顯示了抗ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap阻斷TGF-β1活化TGF-β1受體之結果。 圖3顯示了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap對肺纖維化有明顯改善之作用。 圖4顯示了ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白h15F3-(G4 S)4 -TGF-β Trap能夠顯著提高肺纖維化小鼠生存率/生存期之結果。
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Claims (50)

  1. 一種ETA抗體與TGF-β Trap的融合蛋白質，其結構特徵在於：上述融合蛋白質包含ETA抗體與TGF-β Trap片段。
  2. 如請求項1之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30； b.     輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48； c. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205； d.     重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90； e. 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114；及 f. 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30；及 b.     重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88及SEQ ID NO: 90。
  4. 如請求項1至3中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 48；及 b.     重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 114。
  5. 如請求項1至4中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205；及 b.     重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
  6. 如請求項1至5中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 205。
  7. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 136。
  8. 如請求項1至7中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 50與SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 64與SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 66與SEQ ID NO: 134及SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 136。
  9. 如請求項1至8中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含 (a)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 8； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 32； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 205； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 70； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 92；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 116； (b)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 10； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 34； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 52； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 72； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 94；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 118； (c)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 12； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 36； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 54； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 74； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 96；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 120； (d)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 14； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 38； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 56； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 76； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 98；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 122； (e)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 16； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 40； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 58； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 78； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 100；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 124； (f)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 18； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 42； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 60； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 80； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 102；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 126； (g)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 20或22； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 44； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 62； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 82； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 104或106；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 128； (h)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 24； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 44； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 62； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 84； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 108；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 130； (i)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 26； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 64； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 86； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 110；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 132； (j)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 28； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 66； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 88； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 112；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 134；或 (k)    輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 30； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 48； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 68； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 90； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 114；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 136。
  10. 如請求項9之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 28； 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 46； 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 66； 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 88； 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 112；及 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 134。
  11. 如請求項1至9中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 164；及 b.     重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 192。
  12. 如請求項1至11中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體之多聚核苷酸編碼序列包含一或兩個多聚核苷酸序列，其中每個多聚核苷酸序列獨立地選自於以下所列多聚核苷酸序列： a. 輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161及SEQ ID NO: 163； b.     重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 189及SEQ ID NO: 191。
  13. 如請求項1至12中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 138及SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 140及SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 142及SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 144及SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 146及SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 148及SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 150及SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 156及SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 160及SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 164及SEQ ID NO: 192。
  14. 如請求項1至13中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 164。
  15. 如請求項1至14中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 192。
  16. 如請求項1至15中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 138與SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 150與SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 152與SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 154與SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 156與SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 158與SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 160與SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 162與SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 164與SEQ ID NO: 192。
  17. 如請求項16之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138或SEQ ID NO: 166。
  18. 如請求項16之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含SEQ ID NO: 138及SEQ ID NO: 166胺基酸序列之組合。
  19. 如請求項16之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 162或SEQ ID NO: 190。
  20. 如請求項16之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含SEQ ID NO: 162及SEQ ID NO: 190胺基酸序列之組合。
  21. 如請求項1至20中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含一或兩個胺基酸序列，其中每個胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a. 輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 194及SEQ ID NO: 196； b.     重鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 198及SEQ ID NO: 206。
  22. 如請求項1之融合蛋白質，其中上述ETA抗體具有一或多個以下所列之性質： a.當與人內皮素受體ETA結合時，其Kd 與參比ETA抗體相同或更優； b.當抑制人內皮素受體ETA之內皮素活化時，其IC50 與參比ETA抗體相同或更優；及 c.該ETA抗體在人內皮素受體ETA上與參比ETA抗體交叉競爭結合。
  23. 如請求項22之融合蛋白質，其中上述ETA抗體在人內皮素受體ETA上與上述參比ETA抗體交叉競爭結合。
  24. 如請求項22或23之融合蛋白質，其中上述參比ETA抗體包含如請求項1至21中任一項之抗體。
  25. 如請求項24之融合蛋白質，其中上述參比ETA抗體包含輕鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 138及重鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 166之組合或輕鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 162及重鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 190之組合。
  26. 如請求項1至25中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含鼠源ETA抗體或人類化ETA抗體。
  27. 如請求項1至26中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體包含ETA單株抗體。
  28. 如請求項1至27中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體之降低人內皮素信號傳導之IC50 值大約為1 nM至200 nM或10 nM至100 nM。
  29. 如請求項1至28中任一項之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個TGF-β Trap及肽連接子(Linker)；該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接，或者該融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接。
  30. 如請求項29之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含一種ETA抗體以及一個、兩個、三個或四個TGF-β Trap及肽連接子(Linker)。
  31. 如請求項29之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含一種ETA抗體及兩個TGF-β Trap以及兩個肽連接子(Linker)。
  32. 如請求項29之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含一種ETA抗體、一個TGF-β Trap及一個肽連接子(Linker)。
  33. 如請求項29至32中任一項之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之羧基端連接。
  34. 如請求項29至33中任一項之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質藉由肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之重鏈之羧基端連接。
  35. 如請求項29至34中任一項之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 92及SEQ ID NO: 116。
  36. 如請求項29至35中任一項之融合蛋白質，其中上述融合蛋白質包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 207及SEQ ID NO: 210。
  37. 如請求項29至36中任一項之融合蛋白質，其中上述ETA抗體、TGF-β Trap及肽連接子序列係藉由以下所述中之方式融合形成上述融合蛋白質： (1)    藉由一個肽連接子序列將TGF-β Trap胺基端與所述ETA抗體之重鏈/輕鏈之羧基端連接：N'-R-Linker-TGF-β Trap-C'；及 (2)    藉由肽連接子序列將TGF-β Trap之羧基端與所述ETA抗體之輕鏈或重鏈之胺基端連接：N'-TGF-β Trap-Linker-R-C'； 其中：N'代表多肽鏈胺基端，C'代表多肽鏈之羧基端，TGF-β Trap代表TGF-β Trap，R為上述ETA抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列，且Linker代表肽連接子。
  38. 如請求項1至37中任一項之融合蛋白質，其中上述TGF-β Trap包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 207。
  39. 如請求項29至38中任一項之融合蛋白質，其中上述肽連接子(Linker)的序列各自獨立地包含以下中之一者之胺基酸序列：SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209及SEQ ID NO: 210。
  40. 如請求項39的融合蛋白質，其中上述肽連接子(Linker)的包含胺基酸序列：SEQ ID NO: 210。
  41. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至40中任一項之融合蛋白質。
  42. 一種載體，其包含如請求項41之多核苷酸。
  43. 一種宿主細胞，其包含如請求項42之載體。
  44. 一種藥用組合物，其包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質及藥用可接受之載體。
  45. 一種包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質之用途，係用以製備用於預防、改善或治療肺動脈高壓的藥物。
  46. 一種包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質之用途，係用以製備用於預防、改善或治療肺高壓的藥物。
  47. 一種包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質之用途，係用以製備用於預防、改善或治療肺纖維化的藥物。
  48. 一種包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質之用途，係用以製備用於預防、改善或治療心血管纖維化的藥物。
  49. 一種包含如請求項1至40中任一項之融合蛋白質之用途，係用以製備用於預防、改善或治療肺動脈高壓，肺高壓，肺纖維化或者心血管纖維化兩種及更多種病症的藥物。
  50. 如請求項45至49中任一項之用途，其中上述藥物係用於靜脈或皮下注射。
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