KR102196840B1 - 항-타우 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 항-타우 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-타우 항체는 280번째 라이신이 아세틸화된 타우 단백질에 특이적으로 결합하며, 비정상적인 타우 단백질의 응집을 억제시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항-타우 항체를 치매 유발 동물모델에 투여할 경우, 상기 동물모델의 운동능력 및 인지능력을 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항-타우 항체는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-타우 항체 및 이의 용도{ANTI-TAU ANTIBODY AND USE THEREOF}
본 발명은 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 항-타우 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
치매의 발병 형태 중 약 50% 정도를 차지하는 알츠하이머병은 65세 이후로 발병률이 증가하는 퇴행성 뇌신경 질환으로, 인구가 고령화됨에 따라 전세계적으로 급속히 증가하고 있다.
알츠하이머병의 발병 원인으로 β-아밀로이드의 축적, 타우 단백질의 과인산화 또는 프리세닐린 1의 β-아밀로이드 생산 증대가 주요 원인으로 여겨져 왔다. 그 중, β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 알츠하이머성 치매의 주요한 발병 원인일 것으로 생각되어 왔다(Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992). 하지만, 일라이릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Company)의 알츠하이머 신약 후보물질인 솔라네주맙(solanezumab)의 3상 임상실험이 실패하면서 β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 독성이 크지 않음이 밝혀졌다. 이에 따라, 타우 단백질의 비정상적인 과인산화가 알츠하이머병의 주요 발병 원인일 것이라는 의견에 초점이 모아지고 있다.
타우 단백질은 세포물질을 수송하는 단백질인 미세소관(microtubule)을 안정화시키는 단백질이다. 타우 단백질은 인체 내에서 6개의 동형(isoform)으로 존재하며 중추신경계의 뉴런에 풍부하게 존재한다. 또한, 타우 단백질에 돌연변이가 발생하는 경우, 타우 단백질이 과인산화되어 신경세포 내에 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFTs)을 비정상적으로 축적시켜 치매 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011).
하지만, 441개의 아미노산으로 구성되어 있는 인간 타우 단백질은 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어날 수 있는 곳이 매우 다양하여 타우 단백질 내 치매의 예방 또는 치료 효과를 보이는 표적 부분을 발굴하는데 어려움을 겪고 있다. 이러한, 다양한 변형으로 치료제 개발에도 어려움을 겪고 있는 실정이다.
Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992 Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011
이에 본 발명자들은 효과적인 퇴행성 신경 질환의 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 280번째 라이신이 아세틸화된 타우 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체가 타우 단백질의 응집을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 치매 유발 동물모델을 이용한 실험에서 상기 항체를 투여 받은 동물모델의 운동능력 및 인지능력이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편, 또는 상기 항-타우 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 발현벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 기탁번호 KCTC 14155BP의 하이브리도마를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 절편, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 발현벡터 또는 상기 숙주세포를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 항-타우 항체는 280번째 라이신이 아세틸화된 타우 단백질에 특이적으로 결합하며, 비정상적인 타우 단백질의 응집을 억제시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항-타우 항체를 치매 유발 동물모델에 투여할 경우, 상기 동물모델의 운동능력 및 인지능력을 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항-타우 항체는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 K280-ac 타우 단백질 단편을 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 pET-21b-Tau(K18) 발현벡터의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 3은 K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별하기 위해, 항체와 K280-ac와의 결합을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 4는 K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별하기 위해, 항체와 K280-ac와의 결합을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 5는 야생형 타우 단백질(Tau) 및 280번째 아미노산인 라이신을 알라닌으로 치환시킨 타우 단백질(Tau K280A)을 아세틸화시킨 후, 아세틸화에 따라 선별한 ADEL-Y01 항체가 상기 타우 단백질들에 결합하는지 여부를 확인한 도면이다.
도 6은 야생형 타우 단백질의 아세틸화 유무에 따른 ADEL-Y01h01_v01 항체와의 특이적인 결합을 확인한 도면이다.
도 7은 ADEL-Y01m 항체와 K280-ac 단백질 단편과의 결합력을 확인하기 위해, Octet® K2 시스템을 이용해 해리상수(Kd)값을 측정한 도면이다.
도 8은 ADEL-Y01h 항체들(v01 내지 v12)과 K280-ac 단백질 단편과의 결합을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 9는 생후 4개월 또는 12개월이 된 정상 마우스(Wild type) 및 치매 마우스(Tau P301L)의 뇌 조직 내 타우 단백질(Tau5) 및 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK208)의 발현량 및 양상을 나타낸 도면이다.
도 10은 치매 유발 마우스 모델을 이용한 ADEL-Y01m 항체의 뇌실 내 투여시 행동개선 효과를 확인하기 위한 실험 계획을 도식화한 도면이다.
도 11은 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 둥지치기(nesting building) 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(*** p<0.001).
도 12는 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, Y-미로 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 13은 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 수중 미로(Water maze) 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 수중 미로 시험을 수행할 때, 각 구역별 머무른 시간을 나타낸 도면이다(** p<0.01).
도 15는 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 악력 시험(grip strength test)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05, ** p<0.01).
도 16은 치매 유발 마우스 모델을 이용한 ADEL-Y01m 항체의 복강 내 투여시 행동개선 효과를 확인하기 위한 실험 계획을 도식화한 도면이다.
도 17은 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 후, 둥지치기 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05, ** p<0.01).
도 18은 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 후, Y-미로 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 19는 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 후, 수중 미로 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 후, 수중 미로 시험을 수행할 때, 각 구역별 머무른 시간을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 21은 정상 마우스(Wild type) 또는 치매 유발 마우스 모델(Tau P301L)의 대뇌 피질 및 해마 조직 내 발현된 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)과 ADEL-Y01m 항체의 결합을 면역침강법 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 22는 정상 노인 뇌 조직 및 알츠하이머병 환자의 뇌 조직을 ADEL-Y01m 항체를 이용해 면역조직화학염색한 후 촬영한 사진이다.
도 23a는 정상 노인 뇌 조직 또는 알츠하이머병 환자의 뇌 조직 내 발현된 전체 타우 단백질(Tau5), 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 아밀로이드-β 의 발현량을 확인한 도면이다.
도 23b는 정상 노인 뇌 조직 또는 알츠하이머병 환자의 뇌 조직 내 발현된 아세틸화된 타우 단백질과 ADEL-Y01m 항체의 결합을 확인한 도면이다(* p<0.05).
도 24는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5), 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 인산화된 타우 단백질(pSer396)의 발현량을 확인한 도면이다.
도 25는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05, *** p<0.001).
도 26은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 인산화된 타우 단백질(pSer396)의 발현량을 나타낸 도면이다(** p<0.01).
도 27은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 28은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델(Tau-P301L-ADEL-Y01m)의 뇌 조직을 ADEL-Y01m 항체를 이용해 면역조직화학염색한 사진이다.
도 29는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델(Tau-P301L-ADEL-Y01m)의 뇌 조직 내 AT8 및 인산화된 타우 단백질(pT231)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 30은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델(Tau-P301L-ADEL-Y01m)의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5), 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 인산화된 타우 단백질(pT231) 발현량을 확인한 도면이다.
도 31은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 32는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 33은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 인산화된 타우 단백질의 발현량(pT231)을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 34는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 시냅스 관련 단백질(PSD95 및 Synapsin-1)의 발현량을 확인한 도면이다.
도 35는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 PSD95의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 36은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 Synapsin-1의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 37은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 시냅스 관련 단백질(PSD95 및 Synapsin-1)의 발현량을 확인한 도면이다.
도 38은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 PSD95의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 39는 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 Synapsin-1의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 40은 정상 마우스, 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 ADEL-Y01m 항체의 침투 유무 및 타우 단백질과의 결합 유무를 확인한 도면이다.
도 41은 노화된 치매 유발 마우스 모델을 이용한 ADEL-Y01m 항체의 뇌실 내 투여시 행동개선 효과를 확인하기 위한 실험 계획을 도식화한 도면이다.
도 42는 노화된 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 둥지치기 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 43은 노화된 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, Y-미로 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 44는 노화된 치매 유발 마우스 모델에 ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 후, 수중 미로 시험을 수행할 때, 각 구역별 머무른 시간을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 45는 정상 마우스, 노화된 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 노화된 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5), 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 인산화된 타우 단백질(pT231) 발현량을 확인한 도면이다.
도 46은 정상 마우스, 노화된 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 노화된 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 타우 단백질(Tau5)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05, ** p<0.01).
도 47은 정상 마우스, 노화된 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 노화된 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 발현량을 나타낸 도면이다(** p<0.01).
도 48은 정상 마우스, 노화된 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 노화된 치매 유발 마우스 모델의 뇌 조직 내 전체 인산화된 타우 단백질(pT231)의 발현량을 나타낸 도면이다(* p<0.05).
도 49는 정상 마우스, 노화된 치매 유발 마우스 모델 및 ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여받은 노화된 치매 유발 마우스 모델의 대뇌 피질 내 불용성 타우 응집을 분획별로 확인한 도면이다.
도 50은 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포를 용해시킨 후, 웨스턴 블롯을 통해 HA(hemagglutinin), 전체 타우 단백질(Tau5) 및 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 발현량을 확인한 도면이다.
도 51은 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포의 배양액을 수득한 후, 웨스턴 블롯을 통해 HA, 전체 타우 단백질(Tau5) 및 아세틸화된 타우 단백질 발현량을 확인한 도면이다.
도 52는 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포의 배양액을 신경세포에 처리하고 1시간 또는 20시간이 경과하였을 때 세포를 용해시킨 후, 웨스턴 블롯을 통해 세포 내 타우 단백질 응집을 확인한 도면이다.
도 53은 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포의 배양액을 신경세포에 처리하고 1시간 또는 20시간이 경과하였을 때 세포를 용해시킨 후, 웨스턴 블롯 및 면역침강법을 통해 세포 내 타우 단백질 응집을 확인한 도면이다.
도 54는 K280-ac 단백질 단편 또는 이의 응집체 및 ADEL-Y01h01_v01 항체를 Tau-RD-P301S FRET biosensor 세포에 처리한 후, 타우 단백질 전파 억제 효과를 FRET을 이용하여 확인한 도면이다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 55는 알츠하이머병 환자의 사르코실 불용성 균질액(Sarkosyl insoluble fraction) 및 ADEL-Y01h01_v01 항체를 Tau-RD-P301S FRET biosensor 세포에 처리한 후, 타우 단백질 전파 억제를 확인한 도면이다(** p<0.01).
도 56은 알츠하이머병 환자의 사르코실 불용성 균질액을 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층에 투여한 후, 적출한 뇌 조직을 항-AT8 항체를 이용하여 면역 염색한 사진이다(Ipsi: 동측, Contra: 대측).
도 57은 알츠하이머병 환자의 사르코실 불용성 균질액을 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층에 투여한 후, 적출한 뇌 조직을 항-AT8 항체를 이용하여 면역 염색한 사진이다(DG: dentate gyrus, EC: entorhinal cortex)
도 58 및 도 59는 알츠하이머병 환자의 사르코실 불용성 균질액을 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층에 투여한 후, 적출한 뇌 조직을 항-AT8 항체를 이용하여 염색한 후, 염색 정도를 나타낸 그래프이다(* p<0.05, ** p<0.01).
도 60은 아세틸화된 타우 단백질에 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리한 후, Thioflavin-T 분석을 통해 아세틸화된 타우 단백질의 응집 변화를 확인한 도면이다.
도 61은 타우 단백질(K18), 아세틸화된 타우 단백질(K18+P300) 및 응집된 아세틸화된 타우 단백질(K18+P300+Heparin)에 ADEL-Y01m 항체를 처리한 후, 응집된 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 양의 변화를 확인한 도면이다.
도 62는 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리한 마우스 유래 신경세포에 아세틸화된 타우 단백질 응집체를 처리한 후, 상등액 내 락테이트 디히드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH)의 활성을 나타낸 그래프이다(*** p<0.001).
도 63은 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리한 마우스 유래 신경세포에 아세틸화된 타우 단백질 응집체를 처리한 후, 신경세포의 생존율을 나타낸 그래프이다(* p<0.05, *** p<0.001).
도 64는 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리한 마우스 유래 미세아교세포에 HiLyte?? Fluor 488가 표지된 아세틸화된 타우 단백질 응집체를 처리한 후, 미세아교세포의 HiLyte?? Fluor 488의 형광을 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "항체"란, 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5가지 종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체를 이용한 기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4가지 종류의 동종(isotype)이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 상이할 수 있다.
상기 IgG는 중쇄(heavy chain, 약 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 약 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 안정된 구조(분자량, 약 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 항체마다 아미노산 서열이 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 이루어져 있다. 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-시트(sheet)로 구성되어 있고 분자 내 이화항결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성된다. 상기 부위는 Y자 모양의 두 개의 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 경첩 부위(hinge region)로 연결되어 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다. 항체의 입체구조를 살펴보면, CDR은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉한다.
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 12 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 하기의 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다:
서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편; 및
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
상기 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3가 동일하다면 골격(framework)부분은 변형이 가능하다. 특히, 인간화 항체를 제조하기 위해 일부 골격부분의 아미노산 서열을 변형할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 항-타우 항체의 아미노산 서열 및 서열번호를 정리하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Figure 112020072668218-pat00001
ADEL name VH amino acid sequence 서열번호 VL amino acid sequence 서열번호
Y01m01 EVQLEESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYIRYSGRTYYNPSLKSRISITRDTSKNQFYLQLISVTTEDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 7 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPYTFGGGTKLEIK 12
Y01h01v01 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v02 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v03 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v04 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v05 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v06 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v07 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v08 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v09 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v10 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v11 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v12 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
본 발명의 실시예에 따른 항-타우 항체의 염기서열을 정리하여 하기 표 3에 나타내었다.
ADEL name VH nucleotide sequence
(서열번호) 		VL nucleotide sequence
(서열번호)
Y01m01 16 21
Y01h01v01 17 22
Y01h01v02 17 23
Y01h01v03 17 24
Y01h01v04 18 22
Y01h01v05 18 23
Y01h01v06 18 24
Y01h01v07 19 22
Y01h01v08 19 23
Y01h01v09 19 24
Y01h01v10 20 22
Y01h01v11 20 23
Y01h01v12 20 24
본 발명에서 사용하는 용어 "ADEL-Y01m"이란, 서열번호 25로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 275번째 내지 286번째 아미노산 서열 구간을 가지며 280번째 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 마우스 항체를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "ADEL-Y01h"는 상기 ADEL-Y01m 항체를 인간화시킨 항체를 의미한다. 상기 항체의 항원-결합 절편은 Fab, scFv, F(ab')2 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 절편은 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능(effector function)을 하는 결정가능 영역(Fc region)을 제외한 항원-결합 도메인들을 말하며, 단일 도메인 항체(single domain antibody)나 소형 항체(minibody) 등과 같은 3세대 절편을 포함할 수 있다.
상기 절편은 완전한 구조의 IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 뇌혈관장벽 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있으며, Fc가 없기 때문에 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능을 원하지 않는 경우에 사용한다. 절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point, pI)이 바뀔 수 있다. 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 완전한 구조의 IgG를 사용할 수 있다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 7 내지 11 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열과 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 12 내지 15 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 서열번호 7 내지 11 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 12 내지 15 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항-타우 항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행되거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 항-타우 항체의 단일클론항체는 서열번호 25의 야생형 타우 단백질의 아미노산 서열 중 275번째 내지 286번째 아미노산 서열 구간을 가지며 280번째 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편(K280-ac)을 마우스에 주입하여 수득한 B림프구를 하이브리도마 세포주로 제조함으로써 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열 및/또는 서열번호 21 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하기의 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다;
서열번호 16으로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 17로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 17로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 17로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 18로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 18로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 18로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 19로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 19로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 19로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 20으로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열번호 20으로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 20으로 표시되는 염기서열 및/또는 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르,포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 발현벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus)) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세균성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 상기 생산 방법은 i) 상기 숙주세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
상기 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 기탁번호 KCTC14155BP의 하이브리도마를 제공한다. 상기 기탁번호 KCTC14155BP의 하이브리도마는 ADEL-Y01m을 생산하는 것일 수 있다. 상기 ADEL-Y01m에 대해서는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편에서 전술한 설명을 참조한다.본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 신경 질환이 타우 단백질이 매개된 신경 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환은 타우병증(tauopathy), 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증(chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵 병증(progressive supranuclear palsy), 대뇌 피질 기저 퇴행(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), Lytico-Bodig병, 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 리포푸신증(lipofuscinosis)일 수 있다.
또한, 상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저부 변성(CBD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE) 또는 헌팅턴병일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.
상기 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 아주번트(adjuvant, 면역조정제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 아주번트로는 프로인트 완전 아주번트, 프로인트 불완전 아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 뇌내, 뇌실내, 복강내, 경피, 근육내, 경막내, 정맥내, 피하내 및 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 뇌내, 뇌실내 또는 경막내로 투여되거나 복강내 투여되는 것이 바람직하다.
구체적으로, 상기 뇌내, 뇌실내, 또는 경막내 투여는 혈뇌장벽(BBB, brain blood barrier) 투과의 문제를 고려할 필요 없다는 점에서 유용할 수 있다. 또한, 상기 뇌내 투여(intracerebral administration)는 뇌에 직접 적은 양의 약물을 투여해서 그 지역에 미치는 약물의 영향을 알고 싶은 경우 사용될 수 있다. 상기 뇌실 내 투여(intracerebroventricular administration)는 약물을 뇌실(cerebral ventricle)에 투여하는 방법으로, 뇌의 전체적인 부분에 약물이 미치는 영향을 알고 싶은 경우 사용될 수 있다. 나아가, 경막내 투여(intradural administration)는 척추 아랫부분의 척추뼈 두 개 사이로, 척수 주위의 공간에 바늘을 삽입하여 약물을 척추관으로 주사하는 방법으로, 약물이 뇌, 척수나 뇌 또는 척수를 덮고 있는 조직층(수막)에 신속하거나 국소적인 효과를 주기 위해 필요한 경우 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 뇌실내 투여 뿐만 아니라 복강 내 투여를 통해서도 치매 유발 동물 모델에서 운동능력과 인지능력을 효과적으로 개선하였다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 기준으로 하였을 때 0.0001 ㎎/㎏(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 퇴행성 신경 질환의 발병이 예상되거나, 퇴행성 신경 질환이 발병된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 상술한 바와 동일하다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다. 상기 항-타우 항체가 변이된 타우 단백질에 결합되는 항체일 수 있다. 상기 항체는 상술한 바와 같다.
특히, 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산이 아세틸화가 일어나면 타우 응집 및 타우 단백질이 매개된 신경질환을 유발하는 것으로 확인된 바 있다. 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 서열번호 25로 표시되는 타우 단백질의 아미노산 서열 중 280번째 아미노산이 아세틸화된 278번째 내지 284번째 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하므로, 보다 효과적으로 타우 단백질이 매개된 신경질환을 진단할 수 있다.
상기 항체를 이용하여 이와 결합한 변이된 타우 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 발현벡터, 또는 상기 숙주세포를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 키트를 제공한다.
상기 키트는 퇴행성 신경 질환을 진단하기 위해 개체의 시료로부터 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 변이된 타우 단백질의 발현량을 측정하기 위해 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
개체로부터 시료를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 "시료"란 변이된 타우 단백질의 발현량이 차이 나는 조직, 세포, 혈액, 혈장 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단백질을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS, 단백질 칩에 의하여 측정하는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서 항원-항체 복합체의 형성량과 개체에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 타우 단백질이 매개된 신경질환을 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 변이된 타우 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 등이 있다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료하기 위한 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
I. 변이된 타우 단백질 단편 및 이의 항체 제조
제조예 1. 변이된 타우 단백질 단편의 제조
변이된 타우 단백질 단편을 제조하기 위해, 441개의 아미노산으로 이루어진 타우 단백질(2N4R)의 아미노산 서열 중 알츠하이머병의 병인기전으로 작용하며 타우 유전자 변형 마우스 모델에 능동면역을 하면 인지능력 개선효과를 보이는 타우 단백질 단편을 선별하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 미세소관(microtubule) 결합 도메인에 위치한 타우 단백질 단편의 아미노산 서열 중 12개의 아미노산으로 이루어진 구간을 지정하였다.
구체적으로, 서열번호 25의 야생형 타우 단백질 아미노산 서열 중 275번째 내지 286번째 아미노산 서열 구간을 가지며 280번째 아미노산이 아세틸화된 단백질 단편을 K280-ac로 명명하였다. 상기 K280-ac 단백질 단편은 (주) 펩트론에 주문 의뢰하여 제작하였다.
또한, N-말단에 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)가 결합된 K280-ac 단백질 단편은 ANYGEN(남면, 대한민국)에 주문 의뢰하여 제작하였다. 상기 N-말단에 KLH가 결합된 K280-ac 단백질 단편은 0.05% TFA 중의 아세토 니트릴의 5% 내지 65% 농도 구배 조건에서 Shimadzu HPLC 10AVP 시스템(순도 91.8 %)을 이용해 정제하였다.
나아가, 서열번호 25의 야생형 타우 단백질 아미노산 서열 중 244번째 내지 372번째 아미노산(서열번호 26)을 포함하는 RD(Repeat domain) 1, 2, 3 및 4 단백질 단편을 K18로 명명하였다. 상기 K18 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 세포에 형질도입시켜 K18 단백질 단편을 생산하였다.
구체적으로, 상기 K18 단백질 단편은 다음과 같이 제조하였다. 먼저, pET-21b-Tau(K18) 발현벡터를 BL21(DE3) 대장균에 형질도입시킨 후, 50 ㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 37℃ 온도로 600 nm 파장의 O.D.값(optical density)이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양하였다(도 2). 그 후, 0.5 mM 농도의 IPTG를 처리하고 3시간 동안 37℃ 온도에서 배양하고, 18시간 동안 18℃ 온도에서 배양하였다.
18시간 후, 형성된 단일 콜로니를 50 ㎍/㎖ 농도의 암피실린이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 약 16시간 동안 37℃ 온도, 220 rpm 조건에서 종균 배양(starter culture)하였다. 상기 종균 배양액을 50 ㎍/㎖ 농도의 암피실린이 포함된 5 L의 LB 배지가 들어있는 삼각플라크스에 1:500 비율로 접종한 후, 4시간 동안 37℃ 온도에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 3,500 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 남은 펠렛을 -20℃ 온도에서 냉동하였다.
상기 냉동한 펠렛을 25 ㎖/g 비율로 용해버퍼(20 mM Tris-HCl, 1 mM 페닐메틸포릴 플루오리드(phenylmethylsulfonylfluoride, pH 8.0)에 재부유 시켜주었다. JY99-IIDN 초음파 균질기를 이용해 1,500 W 조건에서 30분간 세포를 용해시켰다. 그 후, 4℃ 온도 및 15,000 rpm 조건에서 20분간 원심분리 하고, 상층액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다.
상기 여과액을 A 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0)로 평형화시킨 5 ㎖ Hi-Trap SP 컬럼에 여과하였다. 비특이적인 결합을 제거하기 위해, 5 CV(column volume)의 A 버퍼로 세척한 후, 10 CV의 B 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl)를 이용하여 0 내지 1 M NaCl의 농도 구배로 용리하였다.
K18 단백질 단편이 포함된 분획을 모은 후, 상기 분획을 C 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole)로 평형화시킨 5 ㎖ His-Trap SP 컬럼에 여과하였다. 비특이적인 결합을 제거하기 위해, 10 CV의 C 버퍼로 세척하였다. 그 후, 20 CV의 D 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 100 mM imidazole)로 용출시켰다. 정제된 K18 단백질 단편이 포함된 용출액을 10 kDa 분자량의 원심분리필터를 사용하여 농축하였다.
아세틸화된 K18 단백질 단편(acK18)은 HEPES((2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산, 10 mM, pH 7.4), 50 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT(dithiothreitol), 2.5 mM EGTA, 0.1 mM EDTA의 아세틸화 버퍼에 8 μM 농도의 K18 단백질 단편, 125 μM 농도의 Acetyl CoA와 0.5 ㎍ 아세틸기전이효소(acetyltransferase)인 P300 효소를 30℃ 온도에서 3시간 반응시켜 제조하였다.
K18 단백질 단편의 응집체는 25 μM 농도의 K18 단백질 단편을 DTT 25 mM 용액에 24℃ 온도에서 1시간 동안 녹이고, HEPES((2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산, 10 mM, pH 7.4), NaCl(100 mM), 헤파린(25 mM) 용액에 37℃ 온도에서 700 rpm 조건으로 Eppendorf Thermomixer C를 이용하여 교반 용해(agitation)시켜 제조하였다.
제조예 2. 변이된 타우 단백질 단편에 결합하는 항체의 제조
제조예 1에서 제조한 K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 국내 마우스 단일클론 항체 개발회사인 AbFrontier사에 주문 의뢰하였으며, 마우스에 K280-ac 단백질 단편을 항원으로 주입하여 수득한 B림프구를 하이브리도마 세포로 제작하였다. 그 후, K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포주를 ELISA를 통해 스크리닝하였다. 또한, 국내 대학교 항체 개발 연구진에 K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위해 파지디스플레이라이브러리 스크리닝(phage display library screening)을 진행하였다.
그 결과, 1종의 마우스 하이브리도마 세포주(mouse hybridoma cell line)가 최종적으로 선정되었고, 파지디스플레이라이브러리 스크리닝을 통해 선정한 후보들은 마우스 하이브리도마 세포주보다 항체의 결합력(affinity)이 낮아 제외하였다. 상기 마우스 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체를 in vitro에서 K280-ac 단백질 단편과의 결합을 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통해 확인하였다.
그 결과, #15E5 하이브리도마 세포주(clone #1)로부터 생산된 항체가 K280-ac 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 상기 #15E5 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체를 최종 선별하였으며 이를 ADEL-Y01m으로 명명하였다.
이 마우스 항체를 종래에 알려진 항체 가변영역 분석, CDR 규명, 분자 모델링, 인간생식계열항체분석, CDR 이식 및 유전자 염기서열 책임분석 기법을 이용하여 인간화 항체를 제작하였고, 이를 ADEL-Y01h(v01 내지 v10)로 명명하였다.
한편, 상기 #15E5 하이브리도마 세포주를 2020년 3월 18일자로 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 세포기탁하여 미생물 기탁번호 KCTC14155BP를 부여받았다.
실험예 1. 항원 특이적 결합 확인
제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01m 항체의 아세틸화된 타우 단백질에 대한 특이적인 결합을 확인하기 위해, 야생형 타우 단백질 및 280번째 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환된 타우 단백질(Tau K280A)을 in vitro에서 아세틸화시켰다. 이때, 야생형 타우 단백질 및 Tau K280A 단백질의 아세틸화는 제조예 1의 아세틸화된 K18 단백질 단편 제조 방법과 동일한 방법으로 수행되었다. 그 후, 웨스턴 블롯을 통해 ADEL-Y01m 항체의 항원-항체 특이적인 결합 반응을 확인하였다.
먼저, 브래드포드 분석(Bradford Assay)을 통해 야생형 타우 단백질 및 Tau K280A 단백질의 농도를 측정하였다. 각각의 단백질을 4X 샘플 버퍼(60 mM Tris-HCl [pH 6.8], 2% w/v SDS, 25% v/v 글리세롤, 14.4 mM v/v β-메르캅토에탄올 및 브로모페놀 블루)에 혼합하였다. 그 후, 각각의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후, 전기영동이 끝난 겔을 분리하여 PVDF 막(BioRad, California, USA)으로 옮겨 주었다. 블로킹 버퍼(PBS 버퍼에 0.1% v/v 트윈-20 [PBST], 3% w/v BSA 또는 5% v/v 탈지유(skim milk))를 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후, 1차 항체로 항-아세틸-라이신 항체(anti-acetyl-lysine, Cell Signaling, 9441) 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PVDF 막을 워싱 버퍼(PBS 버퍼에 0.1% v/v 트윈-20 [PBST])로 3회 세척한 후, HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 처리하였다. PVDF 막에 화학 발광 시약(Thermo Fisher Scientific)을 처리한 후 x-선 필름 및 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 측정 및 분석하였다.
그 결과, ADEL-Y01m 항체가 Tau K280A 단백질 및 아세틸화된 Tau K280A 단백질과 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, ADEL-Y01m 항체는 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체임을 확인하였다.
또한, 제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01h01_v01 항체와의 특이적 결합을 확인하기 위해, K280-ac 단백질 단편과 K18 단백질 단편을 이용해 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 진행하였다. 이때, ADEL-Y01h01_v01 항체 및 HRP가 표지된 항-인간 IgG 항체(Bioxcell, BE0297)를 이용하였다.
그 결과, ADEL-Y01h01_v01 항체가 K280-ac 단백질 단편에서 높은 항체 결합력을 나타내는 것을 확인하였다(도 6).
실험예 2. 항원-항체 결합력 확인
제조예 1에서 제조한 K280-ac 단백질 단편과 제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01m 항체와의 결합력을 Octet® K2 System(Fortebio)을 통해 측정하였다.
ADEL-Y01m 항체를 제조사의 매뉴얼에 따라 AR2G 바이오센서로 고정하였다. 바이오 센서의 표면을 물로 10분 동안 수화시킨 후, 20 mM EDC(1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) 및 10 mM s-NHS(N- hydroxysulfosuccinimide) 혼합물을 이용하여 활성화시켰다. 활성화된 바이오 센서를 10 mM 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)를 이용하여 ADEL-Y01m 항체로 고정시키고, 5분 동안 1M 에탄올 아민(pH 8.0)으로 퀀칭(Quenching)하였다. ADEL-Y01m 항체가 고정된 바이오 센서를 1X PBS 버퍼(pH 7.4)에 60초 동안 담가 베이스라인을 설정한 후, 상이한 농도의 K280-ac 단백질 단편(항원) 또는 BSA가 결합된 펩타이드가 포함된 웰에 60초 동안 담가두었다. 그 후, 다시 바이오 센서를 1X PBS 버퍼(pH 7.4)에 10분 동안 담가 해리시켰다. 실험 데이터는 Octet Data Analysis(SW 버전: 9.0.0.10)에 의해 평가되었다.
그 결과, ADEL-Y01m 항체와 K280-ac 단백질 단편과의 결합력을 나타내는 항원의 해리상수(Kd) 값이 2.57x10-10 M으로 측정되었다(도 7).
또한, 제조예 1에서 제조한 K280-ac 단백질 단편과 제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01h(v01 내지 v12) 항체들과의 결합을 ELISA를 통해 측정하였다.
먼저, K280-ac 단백질 단편을 250 ng/well로 플레이트에 처리를 하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 워싱 버퍼로 3회 세척한 후, 1차 항체는 8개의 농도(2 ㎍, 1 ㎍, 0.5 ㎍, 0.25 ㎍, 0.12 ㎍, 0.06 ㎍, 0.03 ㎍, 0.01 ㎍)로 처리되었다. 2차 항체는 HRP가 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하였다.
그 결과, ADEL-Y01h(v01 내지 v10) 항체들이 K280-ac 단백질 단편과 높은 항체 결합력을 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
II. 동물모델을 이용한 ADEL-Y01m 항체의 치료효과 확인
제조예 3. 치매 마우스 모델 준비
Tau-P301L 돌연변이 유전자를 발현하는 JNPL3 마우스를 Taconic사로부터 구입하여 아산생명과학 연구원 동물실에서 C57bl/6 마우스와 5대에 걸쳐 여교배(back-crossing)를 진행하였다. 그 후, 무특이병원체(specific pathogen free, SPE)의 조건에서 사육하였다.
실험예 3. 치매 마우스 모델 특성 확인
실험에 사용된 Tau-P301L 치매 마우스 모델은 정상 마우스와 비교하여, 노화에 따라 뇌 조직 내 타우 단백질의 축적의 차이를 나타내었다. 제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01m 항체를 이용한 면역 블롯팅을 진행하였다.
정상 마우스와 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 적출 후, 뇌조직으로 사르코실 프렉션(Sarkosyl fractions)을 통해 가용성, 불용성(soluble, insoluble) 단백질을 분리했다. 뇌 샘플을 RAB 완충용액(100 mM MES, 0.75 M NaCl, 1 mM EGTA, 0.5 mM MgSO4, 2 mM DTT, pH 6.8 + protease/phosphatase inhibitors)으로 풀어주었다. 샘플을 아이스에서 20분 동안 인큐베이션하고 4℃에서 20분 동안 9,000 rpm에서 원심 분리 하였다. 원심 분리 후 상층액을 수집 하였다(가용성 단백질). 펠렛은 추출 완충용액(1% 살코실, 10 mM 트리스, 10% 수크로오즈, 0.85 M NaCl, 1 mM EGTA, pH 7.4)로 풀어주었다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 4℃에서 20분 동안 13,000 rpm에서 원심 분리 하였다. 원심 분리 후 상층액을 수집 하였다(타우 응집체). 분리된 단백질로 실험예 1과 동일한 방법으로 방법으로 웨스턴 블롯을 진행하였다.
그 결과, 12개월 된 치매 마우스 모델의 뇌 조직 내 아세틸화된 타우 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 생후 4개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스와 유사한 수준의 타우 단백질 발현을 보이고 있으나, 중증의 치매증상을 보이는 12개월의 치매 마우스 모델은 정상 마우스에 비해 약 2배 가까운 타우 단백질을 발현하는 것을 확인하였다(도 9).
실험예 4. ADEL-Y01m 항체의 행동개선 효과 확인: 뇌실 내 투여
ADEL-Y01m 항체의 치료효과를 확인하기 위해, 제조예 3에서 제조한 Tau-P301L 치매 마우스들의 가쪽 뇌실(lateral ventricle)에 삼투압 펌프(osmotic pump)를 이용하여 ADEL-Y01m 항체를 도 10에 나타낸 실험 스케줄 계획대로 투여하였다.
실험예 4.1. 둥지치기 시험을 통한 행동개선 효과 확인
마우스의 다중모달 뇌 기능(multimodal brain function)을 확인할 수 있는 둥지치기 시험(nesting building test)를 수행하였다.
구체적으로, 사육중인 케이지에 있는 깔짚의 2/3를 제거하고 멸균한 솜(5 cm x 5 cm) 4겹을 마우스 케이지에 넣어주었다. 한 케이지에 한 마리의 마우스가 들어가도록 하였다. 다음 날 아침에 둥지를 완성시킨 정도를 분석하였다.
둥지 완성도에 따른 점수는 1점 내지 5점으로 나누어 산출하였다. 제공된 멸균한 솜이 90% 이상 유지되거나, 거의 닿지 않은 경우 1점으로 계산하였으며, 멸균한 솜이 50% 내지 90% 정도 유지되며 부분적으로 찢어진 경우 2점으로 계산하였다. 멸균한 솜이 50% 이상 찢겨 케이지 주변으로 퍼진 경우 3점으로 계산하였고, 멸균한 솜이 90% 이상 찢어져 케이지 측면에 모여 있는 경우 4점으로 계산하였다. 멸균한 솜이 완전히 찢어지고 케이지 측면에 완벽한 둥지 모양을 형성한 경우 5점으로 계산하였다.
그 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 둥지 완성도 점수(building score)가 60% 가량 감소하였고, ADEL-Y01m 항체를 투여한 치매 마우스(Tau-P301L-ADEL-Y01m)의 경우, 정상 마우스의 둥지 완성도 점수와 유사한 것을 확인하였다(도 11).
실험예 4.2. Y-미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
인지기능 회복을 확인하기 위해 Y-미로(Y-maze) 시험을 수행하였다. Y-미로 시험은 단기 기억(short term memory) 능력을 확인하기 위한 실험이다. 구체적으로, Y 모양으로 생긴 상자에 A, B, C 구역을 설정하고, B 구역을 막은 상태로 마우스를 5분 동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 한 시간 뒤에 B 구역을 막은 상자를 제거하고 모든 구역이 열려있는 상태에서 마우스의 움직임을 5분 동안 관찰하였다.
그 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스보다 50% 정도 감소한 100초 이내였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스와 유사한 150초 내외였다. 이를 통해, Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 단기 기억 능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 12).
실험예 4.3. 수중 미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
마우스의 학습과 기억 능력을 평가하기 위해 수중 미로 테스트를 수행하였다. 수중 미로 테스트에 사용되는 장비와 프로그램은 아산생명과학연구원 실험 동물실에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 구체적으로, 수중 미로 테스트는 총 5일이 소요되며, 4일 동안 도피대(platform)와 도피대 위치에 대한 단서(visual cue)를 두고 마우스를 트레이닝 시켰다.
상기 학습은 도피대가 있는 수영장(1.4 m 지름, 45 cm 깊이)에 약 26.5 cm의 깊이가 되도록 물(29±0.5 ℃)을 채운 후, 단서로만 도피대를 기억할 수 있도록 물을 뿌옇게 만들기 위해 전지분유 1.5L를 첨가하였다. 그 후, 마우스를 60초 동안 자유롭게 수영하도록 적응시키고, 1분 동안 도피대 위에 있도록 하였다. 실험은 총 3개의 서로 다른 시작 위치에서 4세트씩 총 12번 수행하였다. 시험 1회가 끝날 때마다 30초의 쉬는 시간을 주었으며, 한 세트가 끝날 때는 30분 내지 45분의 쉬는 시간을 주었다.
4일간의 학습 후, 5일차에 평가를 진행하였다. 평가를 위한 실험에서는 도피대를 두지 않고, 단서만 보고 도피대가 있던 위치에 잘 찾아가는지를 확인하기 위해 그 구역에 머무는 횟수를 측정하였다. 또한, 마우스가 1분 내에 도피대가 있던 위치에 도달하도록 하였고, 1분 내에 도피대 위치에 도달하지 못하면 수영장에서 건져내었다.
먼저, 4일 간의 학습 동안 마우스의 도피대를 찾는데 걸리는 시간을 측정한 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, 4일 동안 도피대를 찾는데 걸리는 시간이 20초 이상인 반면, 정상 마우스와 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, 2일째부터 도피대를 찾는데 걸리는 시간이 20초 이하로 감소하였다(도 13).
또한, 5일째에 도피대가 위치했었던 NW 구역에 머무른 시간을 평가한 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, NW 구역에 10초 이내로 머무른 반면, 정상 마우스 및 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, NW 구역에 20초 이내로 머무른 것을 확인하였다(도 14).
실험예 4.4. 악력 시험을 통한 행동개선 효과 확인
마우스의 근력을 확인하기 위해 악력 시험을 수행하였다. 시험에 사용된 철 뭉치는 아산생명과학연구원에 구비되어 있는 행동장비를 사용하였다. 이때, 철 뭉치는 40 g 철 뭉치를 사용하였다. 상기 제조예 3에서 준비한 마우스들의 꼬리 끝부분을 잡고, 마우스의 앞발이 40 g의 철 뭉치를 움켜잡을 수 있도록 철 뭉치 위에 올려놓았다. 그 후, 마우스의 꼬리를 쥔 채 약 30 ㎝ 높이로 들어 올려서, 마우스가 철 뭉치를 놓칠 때까지의 시간을 측정하여 각 마우스 별로 비교하였다.
그 결과, 정상 마우스의 악력 측정 시간은 20초 이내였으며, Tau-P301L 치매 마우스의 악력 측정 시간은 5초 이내로 나타났다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 악력 측정 시간보다 긴 20초 이상으로 측정되었다(도 15). 이를 통해 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스 운동능력이 회복된 것을 확인하였다.
실험예 5. ADEL-Y01m 항체의 행동개선 효과 확인: 복강 내 투여
ADEL-Y01m 항체의 치료 효능을 확인하기 위해, 제조예 3에서 제조한 Tau-P301L 치매 마우스들의 복강 내로 3개월 동안 도 16에 나타낸 실험 스케줄 계획대로 투여하였다.
실험예 5.1. 둥지치기 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.1과 동일한 방법으로 마우스의 다중모달 뇌 기능을 확인할 수 있는 둥지치기 시험를 수행하였다.
그 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 둥지 완성도 점수 가 60% 가량 감소하였고, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 둥지 완성도 점수와 유사한 것을 확인하였다(도 17).
실험예 5.2. Y-미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.2와 동일한 방법으로 인지기능 회복을 확인하기 위해 Y-미로 시험을 수행하였다. 그 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스보다 50% 정도 감소한 80초 내외였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스와 유사한 110초 내외였다. 이를 통해, Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 단기 기억 능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 18).
실험예 5.3. 수중 미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.3과 동일한 방법으로 수중 미로 시험을 수행하였다. 그 결과, 4일 간의 학습 동안 마우스의 도피대를 찾는데 걸리는 시간을 측정한 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, 4일 동안 도피대를 찾는데 걸리는 시간이 20초 이내인 반면, 정상 마우스와 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, 3일째부터 도피대를 찾는데 걸리는 시간이 15초 이하로 감소하였다(도 19).
또한, 5일째에 도피대가 위치했었던 NW 구역에 머무른 시간을 평가한 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, NW 구역에 20초 이하로 머무른 반면, 정상 마우스 및 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, NW 구역에 25초 가량 머무른 것을 확인하였다(도 20).
실험예 6. ADEL-Y01m 항체와 마우스 조직 내 발현한 변이된 타우 단백질과의 특이적 결합 확인 I
정상 마우스 및 제조예 3에서 제조한 Tau-P301L 치매 마우스의 대뇌 피질과 해마 조직에 대해 IgG 및 ADEL-Y01m 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation, IP) 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.
먼저, 증류수에 1% Tx-100, 100mM NaCl, 50mM HEPES를 넣고 pH 7.4로 맞춘 샘플버퍼를 준비하였다. 그 후, 정상 마우스 또는 Tau-P301L 치매 마우스의 대뇌 피질과 해마 조직을 샘플버퍼를 이용하여 재부유시킨 샘플에 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리한 후, 24시간 동안 반응시켰다. 그 후, 샘플에 100 ㎕의 protein G-agarose bead(GE Healthcare Life Sciences)를 처리하여 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 4℃에서 1분 동안 6,000 rpm으로 원심분리하여 샘플을 수집하고, 0.1% Triton X-100가 첨가된 PBS로 3회 세척하였다. 샘플에 1X 샘플 버퍼에서 처리한 후, 웨스턴 블롯을 진행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, IgG, ADEL-Y01m 항체 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다.
그 결과, Tau-P301L 치매 마우스의 대뇌피질과 해마 조직 내에서 ADEL-Y01m 항체와 280번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 특이적인 결합 반응을 확인하였다. 또한, 이를 통해, ADEL-Y01m 항체가 in vivo 상태의 뇌 조직 내에 발현한 변이된 타우 단백질과 잘 결합하는 것을 확인하였다(도 21).
실험예 7. ADEL-Y01m 항체와 인간 조직내 발현한 변이된 타우 단백질과의 결합 확인 II
ADEL-Y01m 항체와 인간 뇌 조직 내에 발현한 변이된 타우 단백질과의 특이적 결합 확인하기 위해, 정상 노인 뇌 조직과 알츠하이머병 환자 뇌 조직의 측두엽 피질(temporal cortex)에 대해 ADEL-Y01m 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 수행하였다.
먼저, 정상 노인 및 알츠하이머병 환자의 뇌 조직의 측두엽 피질을 각각 절편화하여 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 상기 뇌 조직은 Netherlands Brain Bank에서 제공 받았다. 상기 절편을 1X PBS로 세척하고, 0.1% 트리톤 X-100이 첨가된 1X PBS로 실온에서 10분 동안 투과시켰다. 그 후, 상기 절편을 세척하고 실온에서 1시간 동안 3% BSA를 포함하는 PBS로 블로킹시켰다. 상기 절편을 1X PBS로 세척하고 ADEL-Y01m 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
다음날, DAB(diaminobenzidine) 염색을 위해, 1차 항체와 하룻밤 동안 반응시킨 절편을 1X PBS로 세척하였다. 2차 항체는 비오티닐화된 항 마우스 IgG 항체(Vector Laboratories, California, USA)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 절편을 1X PBS로 세척하고 avidin-biotin-peroxidase complex(Vector Laboratories, California, USA) 처리하고 반응시켰다. 뇌 조직 절편을 DAB 용액에서 10분 동안 반응시킨 후, 1X PBS로 세척하여 캐나다 발삼(Canada balsam, Sigma-Aldrich)에 장착하였다. Zeiss 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 찰영하였으며, AxioVision Imaging System을 사용하여 처리되었다.
그 결과, 정상 노인의 측두엽 피질에서는 ADEL-Y01m 항체를 이용한 염색이 관찰되지 않은 반면, 알츠하이머병 환자의 측두엽 피질에서는 ADEL-Y01m 항체를 이용한 염색이 관찰되었다. 또한, 이를 통해, ADEL-Y01m 항체가 in vivo 상태의 뇌 조직 내에 발현한 변이된 타우 단백질과 잘 결합하는 것을 확인하였다(도 22).
또한, 정상 노인 뇌 조직과 알츠하이머병 환자 뇌 조직을 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077), 항-아밀로이드-β 항체(Covance, SIG-39300), 항-GAPDH 항체(Millipore, MAB374) 및 HRP가 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하였다.
그 결과, 정상 노인의 뇌 조직에 비해 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 전체 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질, 아밀로이드-β의 발현량이 증가된 것을 확인하였다(도 23a). 특히, 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)이 약 3배 정도 많은 것을 확인하였다(도 23b).
실험예 8. ADEL-Y01m 항체의 뇌실 내 투여 후 타우 병리 경감 효과 확인
ADEL-Y01m 항체 투여에 따른 타우 병리 경감 효과를 확인하기 위해, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 뇌실에 투여한 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 전체 타우 단백질(Tau5), 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 타우 단백질의 아미노산 서열 중 396번째 아미노산인 세린이 인산화된 타우(Ser396)의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-pSer396 항체(Thermo, 44-752G), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, 정상 마우스의 뇌 조직과 비교하여, IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에전체 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질 및 인산화된 타우 단백질이 더 많은 양 존재함을 확인하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 전체 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질 및 인산화된 타우 단백질이 더 적은 양으로 존재하였다(도 24 내지 도 27).
또한, 상기 마우스들의 뇌 조직 내 타우 단백질의 아미노산 서열 중 202번째 아미노산인 세린, 205번째 아미노산인 트레오닌이 인산화된 타우 단백질(pSer202/pThr205) 및 인산화된 타우(pT231)의 발현량을 확인하기 위해 면역조직화학염색을 진행하였다. 이때, 면역조직화학염색은 실험예 7과 동일한 방법으로 진행하였으며, 1차 항체로 항-AT8 항체(Thermo, MN1020) 및 항-pT231 항체(Thermo, MN1040)를 이용하였다.
그 결과, IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서 정상 마우스의 뇌 조직보다 인산화된 타우 단백질의 발현량이 증가하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 인산화된 타우 단백질의 발현량이 감소하였다(도 28 및 도 29).
실험예 9. ADEL-Y01m 항체의 복강 내 투여 후 타우 병리 경감 효과 확인
ADEL-Y01m 항체 투여에 따른 타우 병리 경감 효과를 확인하기 위해, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 50 mg/kg 용량으로 복강 내 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 전체 타우 단백질(Tau5)과 아세틸화된 타우 및 인산화된 타우(pT231)의 발현량을 Semi-denaturating 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이때, semi-denaturating 웨스턴 블롯은 실험예 1의 웨스턴 블랏과 동일한 방법으로 진행하되, 마우스 뇌 조직을 β-메르캅토에탄올 없이 2X laemmli 샘플 버퍼에 혼합하였다. 또한, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-pT231 항체(Thermo, MN1040), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, 정상 마우스의 뇌 조직과 비교하여, IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에 다중체(oligomer) 형태의 전체 타우 단백질, 인산화된 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질이 더 많은 양 존재함을 확인하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 전체 타우 단백질, 인산화된 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질이 현저히 적은 양으로 존재하였다(도 30 내지 도 33).
실험예 10. ADEL-Y01m 항체의 시냅스 개선 효과 확인: 뇌실 내 투여
ADEL-Y01m 항체 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 50 mg/kg 용량으로 뇌실에 투여한 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 시냅스 관련 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-PSD95 항체(Abcam, ab2723), 항-synapsin-1 항체(Chemicon, MAB355), 항-β-actin 항체(Sigma, A5441) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서 정상 마우스의 뇌 조직보다 PSD59 및 synapsin-1의 발현량이 증가하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 뇌실 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 PSD59 및 synapsin-1의 발현량이 감소하였다(도 34 내지 도 36).
실험예 11. ADEL-Y01m 항체의 시냅스 개선 효과 확인: 복강 내 투여
ADEL-Y01m 항체 투여에 따른 시냅스 개선 효과를 확인하기 위해, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 50 mg/kg 용량으로 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 시냅스 관련 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 10과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서 정상 마우스의 뇌 조직보다 PSD59 및 synapsin-1의 발현량이 증가하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 PSD59 및 synapsin-1의 발현량이 감소하였다복강 내 투여(도 37 내지 도 39).
실험예 12. ADEL-Y01m 항체의 복강 내 투여 후, 뇌 조직 내 항체 침투 및 항원과의 결합 확인
ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 후, 뇌 조직 내 항체 분포를 확인하기 위해, ADEL-Y01m 항체를 50 mg/kg 용량으로 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스를 생리식염수로 심장 관류한 후, 뇌 조직을 적출하여 PGS(Protein-G sepharose)로 면역침강법을 수행하였다. 그 후, 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 항체가 검출되지 않았다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직 내에 항체가 존재하는 것을 확인하였다(도 40).
실험예 13. 노화된 치매 마우스 모델에서 ADEL-Y01m 항체의 행동개선 효과 확인: 복강 내 투여
ADEL-Y01m 항체의 치료 효능을 확인하기 위해, 제조예 3과 동일한 방법으로 생후 14개월된 노화 마우스를 이용하여 노화된 치매 마우스 모델을 제작하였다. 노화된 치매 마우스 모델을 이용해 제조예 2에서 제조한 ADEL-Y01m 항체를 도 41에 나타낸 실험 스케줄 계획대로 투여하였다.
실험예 13.1. 둥지치기 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.1과 동일한 방법으로 마우스의 다중모달 뇌 기능을 확인할 수 있는 둥지치기 시험를 수행하였다.
그 결과, 정상 마우스에 비해 Tau-P301L 치매 마우스에서 둥지 완성도 점수 가 60% 가량 감소하였고, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, 정상 마우스의 둥지 완성도 점수와 유사한 것을 확인하였다(도 42).
실험예 13.2. Y-미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.2와 동일한 방법으로 인지기능 회복을 확인하기 위해 Y-미로 시험을 수행하였다.
그 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스보다 25% 정도 감소한 80 초 내외였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, A 또는 C 구역에 머무르는 시간이 정상 마우스와 유사한 120 초 내외였다. 이를 통해, Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 단기 기억 능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 43).
실험예 13.3. 수중 미로 시험을 통한 행동개선 효과 확인
실험예 4.3과 동일한 방법으로 수중 미로 시험을 수행하였다.
그 결과, 5일째에 도피대가 위치했었던 NW 구역에 머무른 시간을 평가한 결과, Tau-P301L 마우스의 경우, NW 구역에 10초 이내로 머무른 반면, 정상 마우스 및 ADEL-Y01m 항체를 투여한 Tau-P301L-ADEL-Y01m 치매 마우스의 경우, NW 구역에 25초 이상 머무른 것을 확인하였다(도 44).
실험예 14. 노화된 치매 마우스 모델에서 ADEL-Y01m 항체의 타우 병리 경감 효과 확인: 복강 내 투여
ADEL-Y01m 항체 투여에 따른 타우 병리 경감 효과를 확인하기 위해, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 50 mg/kg로 복강 내 투여한 노화된 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 전체 타우 단백질(Tau5)과 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280) 및 인산화된 타우(pT231)의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-pT231 항체(Thermo, MN1040), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서 다중체 형태의 전체 타우 단백질, 인산화된 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질의 발현이 증가하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 전체 타우 단백질, 인산화된 타우 단백질, 아세틸화된 타우 단백질의 발현이 현저하게 감소하였다(도 45 내지 도 48).
또한, IgG 또는 ADEL-Y01m 항체 50 mg/kg 복강 내 투여한 노화된 Tau-P301L 치매 마우스 및 정상 마우스의 뇌 조직을 적출하여 대뇌 피질 조직을 포름산을 이용해 부분 분리하여 불용성 타우 응집(insoluble tau aggregates)을 semi-denaturating 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이때, semi-denaturating 웨스턴 블롯은 실험예 9와 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서 불용성 타우 응집이 증가하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직에서는 IgG를 복강 내 투여한 Tau-P301L 치매 마우스의 뇌 조직보다 불용성 타우 응집이 현저하게 감소하였다(도 49).
III. 항-타우 항체의 타우 전파 억제 효과 확인
실험예 15. 아세틸화된 타우 단백질의 타우 응집 및 전파 확인
먼저, 야생형 타우 단백질(Tau)을 아세틸기전이효소(acetyltransferase)인 P300 효소와 in vitro에서 반응시켰다. 배양된 신경세포에 상기 P300과 반응시킨 아세틸화된 타우 단백질(Tau-K280-ac)을 처리하고, 아세틸화된 타우 단백질이 세포 내 응집을 유도하는지 확인하기 위해, 아세틸화된 타우 단백질 또는 야생형 타우 단백질을 처리하고 1시간 및 20시간이 경과하였을 때 공여 세포의 용해물(Donor cell lysate)을 항-HA 항체(sigma-aldrich, #11867423001)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077), 항-β-actin 항체(Sigma, A5441), 항-HA 항체(sigma, #11867423001) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다. 그 결과, 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포의 용해물에서 전체 타우 단백질(Tau5) 및 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 응집이 증가하는 것을 확인하였다(도 50).
또한, 세포 밖으로 분비되는 타우 단백질 양이 변화되는지 확인하기 위해, 공여 세포 배양액(Donor cell media)을 항-HA 항체(sigma-aldrich, #11867423001)를 이용하여 면역침강법을 진행한 후 웨스턴 블롯을 수행하였다.
구체적으로, 공여 세포의 배양액을 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한 후, 공여 세포의 배양액에 protein G-agarose bead(GEHealthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1 ㎕의 항-HA 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, Protein G sepharose bead를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 4℃에서 1분 동안 6,000 rpm으로 원심분리하여 샘플을 수집하고, 0.1% Triton X-100가 첨가된 PBS로 2회 세척 하였다. 샘플에 샘플버퍼를 처리한 후, 웨스턴 블롯을 진행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 상기 공여 세포 용해물에서 수행한 것과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 아세틸화된 타우 단백질을 처리한 공여 세포의 배양액에서 전체 타우 단백질(Tau5) 및 아세틸화된 타우 단백질(Tau-acK280)의 양이 증가한 것을 확인하였다(도 51).
또한, 상기 공여 세포의 배양액(Donor cell media)을 또다른 신경세포(수여 세포, Recipient cell)에 처리하고 1시간 또는 20시간이 경과하였을 때 수여 세포의 용해물(Recipient cell lysate)을 수집하여 각각의 샘플에서 타우 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 웨스턴 블랏은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 항-Tau5 항체(Invitrogen, AHB0042), 항-아세틸-K280 항체(Anaspec, AS-56077), 항-β-actin 항체(Sigma, A5441), 항-HA 항체(sigma, #11867423001) 및 HRP가 표지된 항-마우스 IgG 항체(Bioxcell, BE0083)를 사용하였다.
그 결과, 아세틸화된 타우 단백질이 처리된 공여 세포의 배양액(Donor cell media; Tau-ac-HA)을 처리한 수여 세포의 용해물에서 타우 단백질 응집을 확인하였다(도 52 및 도 53).
실험예 16. ADEL-Y01h 항체의 타우 전파 억제 효과 확인: in vitro
ADEL-Y01h01_v01 항체의 in vitro 상에서의 타우 전파(tau seeding) 억제 효과를 확인하기 위해, Tau-FRET stable cell system에 K280-ac 단백질 단편(mAC), 이의 응집체(aAC) 또는 알츠하이머병 환자 뇌 조직의 사르코실 불용성 균질액(Sarkosyl insoluble fraction)을 투여하고 타우 전파 정도를 측정하였다. 타우가 전파된 세포에 IgG와 ADEL-Y01h01_v01 항체를 각각 투여해서 비교 분석하였다.
먼저, 세포에 처리할 K280-ac 단백질 단편의 응집체를 준비하였다. K280-ac 단백질 단편의 응집체는 25 μM 농도의 K280-ac 단백질 단편을 DTT 25 mM 용액에 24℃ 온도에서 1시간 동안 녹이고, HEPES((2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산, 10 mM, pH 7.4), NaCl(100 mM), 헤파린(25 mM) 용액에 37℃ 온도에서 700 rpm 조건으로 Eppendorf Thermomixer C를 이용하여 교반 용해시켜 제조하였다.
그 후, HEK293 Tau RD P301S-FRET Biosensor(ATCC CRL-3275)를 96-웰-플레이트에 각 웰당 3.5Х104 세포수로 분주하였다. 18시간 후, 각 웰에 상기 HEK293 Tau RD P301S-FRET Biosensor가 60% 정도 코팅된 것을 확인한 후, 8.75 ㎕의 OPTI-MEM, 1.25 ㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen) 및 K280-ac 단백질 단편, 이의 응집체 또는 사르코실 불용성 균질액을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 각 웰에 상기 혼합물을 처리한 후, 37℃ 온도에서 24시간 동안 배양한 후, CLARIOstar®(BMG Labtech) 장비를 이용하여 형광파장을 분석하였다.
그 결과, K280-ac 단백질 단편이 처리된 세포에서 ADEL-Y01h01_v01 항체가 투여됐을 때 integrated FRET density가 감소되었고, K280-ac 단백질 단편의 응집체가 처리된 세포에서 ADEL-Y01h01_v01 항체가 투여됐을 때도 integrated FRET density가 감소되었다(도 54). 또한, 알츠하이머병 환자 뇌 조직의 사르코실 불용성 균질액이 처리된 세포에서 ADEL-Y01h01_v01항체가 투여됐을 때 integrated FRET density가 감소되었다(도 55). 이를 통해, ADEL-Y01h01_v01 항체가 투여되면 타우 전파가 억제되는 것을 확인하였다.
실험예 17. ADEL-Y01m 항체의 타우 전파 억제 효과 확인: in vivo
ADEL-Y01m 항체의 in vivo 상에서의 타우 전파 억제 효과를 확인하기 위해, 알츠하이머 환자의 사르코실 불용성 균질액을 제조예 3에서 제작한 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층에 투여하기 2주 전부터 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 정맥 주사하였다. 사르코실 불용성 균질액을 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층에 투여한 후, 각각의 마우스를 희생시켜 뇌 조직을 적출한 후, 동결 절편하였다. 상기 뇌 절편을 항-AT8 항체를 이용하여 조직면역염색하여 타우 전파 정도를 확인하였다.
구체적으로, 브라카 스테이지(Braak stage) 4의 알츠하이머병 환자로부터 뇌 조직의 사르코실 불용성 균질액(3 ㎕, 3.3 ㎍/㎕)을 초음파 처리하여 6개월령 Tau-P301L 치매 마우스의 왼쪽 해마 CA1 층(전-후: -1.9 mm, 내부-외부: 1.5 mm, 좌: -1.8 mm)에 주입하였다. 사르코실 불용성 균질액 투여 2주 전부터 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 20 mg/kg/week 용량으로 Tau-P301L 치매 마우스에 정맥 주사하였으며, 사르코실 불용성 균질액 투여한 주부터 12주차까지 일주일에 한 번씩 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 정맥 내 투여하였다. 이 때, 사르코실 불용성 균질액은 10 ㎕의 유리 주사기(Hamilton, 0.49 mm, Reno, NV)를 사용하여 0.2 ㎕/min의 속도로 주입하였고, 역류를 방지하기 위해 바늘을 제거하기 전 5분간 대기 후 제거하였다. 12주 후 각각의 마우스를 희생시켜 뇌 조직을 적출하고, Leica CM1860를 이용하여 30 ㎛ 두께의 동결 절편으로 절단하였다.
조직 면역 염색을 위해 뇌 절편을 버퍼(1 % NGS 0.2 % Triton X-100 및 30 % H2O2와 PBS)로 세척 하였다. 뇌 절편에 1% NGS와 0.2 % Triton X-100이 포함된 PBS 및 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS 용액으로 여러 번 세척한 후, 2차 항체(Vector Laboratories)를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후, Vectastain ABC 키트(Vector Laboratories)를 이용하여 면역염색을 진행하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 염색된 뇌 절편은 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 분석하였으며, 해마를 포함하는 3개의 뇌 절편을 정량화 하였다. 항-AT8 항체로 염색된 신경세포는 실험에 사용된 뇌 절편 및 3명의 블라인드 테스터에 의해 측정되었으며, 특정 임계값 수준에서 정량 분석하였다. IgG가 투여된 Tau-P301L 치매 마우스 7마리와 ADEL-Y01m 항체가 투여된 Tau-P301L 치매 마우스 8마리의 Bregma -1.75와 -2.25 사이 3개의 뇌 절편들이 분석에 이용되었다. T-검정이 통계 분석에 사용되었다.
그 결과, IgG가 투여된 Tau-P301L 치매 마우스에서 환자 불용성 균질액을 투여한 쪽과 반대쪽 뇌 영역(피질, 해마)에서 신경세포체 염색이 강하게 확인되었다. 반면, ADEL-Y01m 항체가 투여된 Tau-P301L 치매 마우스에서는 해마와 피질에서 염색이 감소하였다(도 56 내지 도 59).
실험예 18. ADEL-Y01m/ADEL-Y01h 항체의 타우 응집 및 전파 억제 효과 확인
ADEL-Y01m 항체의 타우 응집(aggregation) 억제 효과를 확인하기 위해, in vitro 타우 응집 분석(tau aggregation assay)을 진행하였다. In vitro에서 생산한 K18 단백질 단편을 1.5 ㎍의 P300과 1 mM 농도의 Acetyl-CoA와 함께 30℃ 온도에서 3시간 동안 반응시켜 아세틸화시켰다. 그 후, K18 단백질 단편 단량체와 25 μM 농도의 아세틸화된 K18 단백질 단편(K18-P301L)을 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 25 mM 농도의 헤파린 57, HEPES(10 mM, pH 7.4) 및 NaCl(100 mM)를 처리하고 700 rpm 조건에서 교반하여 타우 단백질의 응집을 유도하였다. 그 후, 웨스턴 블롯과 thioflavin-T assay를 통해 ADEL-Y01m 항체를 이용하여 타우 응집 및 전파 억제 효과를 분석하였다. 아세틸화된 타우 단백질이 응집되었을 때에 비해 ADEL-Y01h 항체가 처리되었을 때 아세틸화된 타우 단백질의 응집이 억제되는 것을 thioflavin-T assay를 통해 확인하였다.
먼저, 피브릴화 반응을 위해, 10 M 내지 20 M 아세틸화된 타우 단백질(2N4R)을 100 mM 아세트산 나트륨 버퍼(pH 7.0)에서 헤파린(Sigma-Aldrich) 및 2 mM 농도의 DTT와 첨가된 용액에서 37℃에서 배양하였다. 단백질 및 ThT 용액 (1:1 비율)을 각각의 웰에 첨가하였다. 상이한 시점에서의 ThT 형광 분석을 450 nm (여기) 및 510 nm (방출) 파장에서 CLARIOstar(독일 오르 텐 베르크 소재의 BMG Labtech)를 사용하여 측정하였다.
아세틸화된 단백질 응집체를 배양된 마우스 신경세포에 처리하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
실험을 위해, 프라이머리 대뇌 피질 뉴런(DIV10)에 단량체 K18-P301L, 응집된 K18-P301L, 아세틸화된 K18-P301L을 3 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리 하였다. K18 단백질 처리 이전에 뉴런에 ADEL-Y01m 항체를 3 ㎍/㎖로 30분 전처리 하였다.
그 결과, 신경세포로 타우 응집체가 많이 들어오고 내재 타우 단백질의 응집을 유도시킨 것으로 보이나, ADEL-Y01m 항체를 같이 처리해주면, 이러한 현상들이 감소되는 것으로 확인하였다(도 60 및 도 61).
실험예 19. ADEL-Y01m 항체의 신경세포 보호 효과 확인
ADEL-Y01m 항체의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위해, 먼저, 배아기(embryonic day)의 마우스 뇌로부터 대뇌 피질의 신경세포를 분리하였다. 구체적으로, 16일차의 마우스를 희생시켜 뇌 조직을 적출하여 대뇌 피질을 분리하였다. 그 후, 상기 대뇌 피질 조직을 칼슘 및 마그네슘 프리 HBSS(Hank's balanced salt solution) 내에서 절개하고 37℃에서 15분 동안 0.125% 트립신 용액에서 배양하였다. 20% 태아소혈청 함유 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 처리하여 트린십을 불활성화시키고, 대뇌 피질 조직을 피펫을 이용하여 분쇄하였다. 얻어진 세포 현탁액을 B27 보충제(GibcoBRL)로 보강된 NB배지(neurobasal mediu)에서 희석하였고, 50 ㎍/㎖의 폴리-D-라이신-(Sigma) 및 1㎍/㎖의 라미닌-(GibcoBRL)으로 코팅된 플레이트에 분주하였다. 신경세포는 10일 동안 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양한 후, 3 ㎍/㎖의 아세틸화된 K18 단백질 단편 응집체와 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 처리하고 24시간 동안 반응시켰다.
24시간 후, 상등액을 회수하여 세포독성 탐지 키트(Cytotoxicity Detection Kit, LDH, Roche Applied Sciences)를 이용하여 분석하였다. 세포사멸을 정량화하는 발색법(colorimetric assay)은 손상된 신경세포의 세포기질에서 상등액으로 분비되는 락테이트 디히드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH) 활성을 측정하는 방법을 이용하였다. Tecan Infinite® 200 장비를 이용하여 490 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 결과는 음성 대조군(Blank)과 비교하여 세포생존율 백분율로 표시하였다.
또한, 세포 생존율은 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 환원 분석을 이용하여 측정하였다. TecanInfinite®200 장비를 이용하여 540 nm 파장의 흡광도를 측정하였고, 결과는 음성 대조군(Blank)과 비교하여 백분율로 표시하였다.
또한, 결과는 2개의 독립된 배양물, 6 웰(wells) 조건에서의 결과이고, 모든 수치는 평균(mean)±s.e. 평균(mean)으로 표시하였다. Tukey의 다중 비교 검정으로 단방향 분산 분석이 통계 분석에 사용되었다.
그 결과, 도 62에 나타난 바와 같이, IgG를 처리한 신경세포에서 LDH 활성이 높은 것을 확인하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 처리한 신경세포에서는 IgG를 처리한 신경세포보다 LDH 활성이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 63에 나타난 바와 같이, IgG를 처리한 신경세포의 생존율이 크게 감소하였다. 반면, ADEL-Y01m 항체를 처리한 신경세포의 생존율은 IgG를 처리한 신경세포의 생존율보다 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해, ADEL-Y01m 항체가 아세틸화된 타우 단백질 응집으로 인한 신경세포의 손상으로부터 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 20. ADEL-Y01m 항체의 미세아교세포의 식균작용 촉진 효과 확인
ADEL-Y01m 항체의 미세아교세포의 식균작용 촉진 효과를 확인하기 위해, 먼저, 태어난지 2일 내지 3일된 마우스의 대뇌 피질로부터 일차 미세아교세포(primary microglia)를 분리하였으며, 문헌(McDonald DR et al., J Neurosci. 1997;17:2284-94)에 기재된 방법에 따라 배양하였다.
그 후, 미세아교세포의 식균 작용 분석을 위해, 아세틸화된 K18 단백질 단편에 HiLyte?? Fluor 488을 제조업체의 지침에 따라 표지하였다. HiLyte?? Fluor 488가 표지된 아세틸화된 K18 단백질을 응집시키기 위해, 37℃에서 헤파린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 2 mM DTT를 포함하는 100 mM 아세트산 나트륨 버퍼(pH 7.0)에 각각 배양하여 응집을 유도하였다.
미세아교세포를 5×104 세포수/웰로 12-웰-플레이트에서 분주한 후, 상기 아세틸화된 K18 단백질 단편 응집체(3 ㎍/㎖)를 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 아세틸화된 K18 단백질 단편 응집체 처리 전에 4.5 ㎍/㎖ 농도의 IgG 또는 ADEL-Y01m 항체를 30분 전에 전처리 하였다. 식균 작용 분석을 위해서 트립신을 처리하여 세포를 분리한 후, 1 % PFA (paraformaldehyde)로 고정하였다. 유세포 측정을 위해, 200 ㎕의 2% 소태아 혈청을 포함하는 HBSS 용액을 처리하여 FACSCanto ?? II(BD Biosciences) 장비 및 488 형광 필터를 이용하여 분석하였다.
그 결과, IgG를 처리한 미세아교세포보다 ADEL-Y01m 항체를 처리한 미세아교세포의 식균 작용이 촉진된 것을 확인하였다(도 64).
통계 분석
GraphPad 소프트웨어(GraphPad Prism v7.0 and GraphPad Prism v8.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 one-way ANOVA(Tukey's post hoc test)와 Student's t-test에 의해 분석되었다. 0.05 미만의 p값은 유의한 것으로 간주하였다.
생물자원센터(KCTC) KCTC14155BP 20200318
<110> ADEL, Inc. <120> ANTI-TAU ANTIBODY AND USE THEREOF <130> FPD202005-0033 <150> KR 10-2019-0085233 <151> 2019-07-15 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of CDR1 (VH) <400> 1 Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of CDR2 (VH) <400> 2 Ile Arg Tyr Ser Gly Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of CDR3 (VH) <400> 3 Ala Ser Val Tyr Phe Thr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of CDR1 (VL) <400> 4 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of CDR2 (VL) <400> 5 Leu Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 15 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VH) <400> 16 gaggtgcagc tggaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60 acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttact ggaactggat ccggaaattc 120 ccagggaata aacttgagta catggggtac ataaggtaca gtggtagaac ttactacaat 180 ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat caaagaacca gttctacctg 240 cagttgattt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag tgtttacttt 300 acttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctaca 339 <210> 17 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VH) <400> 17 gaggtgcagc tgcaagaaag cggacccggt ttagtgaagc ccagccagac tttatcttta 60 acttgtaccg tgagcggcga ctccatcacc agcggctact ggaactggat cagacagcct 120 cccggcaagg gtttagagta catcggctac attcgttaca gcggtcgtac ctactacaac 180 ccctctttaa agtctcgtgt gaccatctct cgtgacacca gcaagaacca gttctcttta 240 aagctgagca gcgtgacagc cgccgacaca gccgtgtact actgcgccag cgtgtacttc 300 acctactggg gccaaggtac tttagtgacc gtctcgagc 339 <210> 18 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VH) <400> 18 gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgga ctggtgaagc ccagccagac actgtcttta 60 acttgtgccg tgagcggcga tagcatcacc agcggctact ggaactggat tcgtcagagc 120 cctagcagag gtttagagtg gctgggctac atcagataca gcggtcgtac ctactacaac 180 ccctctttaa agtctcgtat caccatcaat cgtgacacca gcaagaacca gttctcttta 240 cagctgaaca gcgtgacccc agaagacacc gccgtgtact actgcgccag cgtgtacttc 300 acctactggg gccaaggtac tttagtgacc gtctcgagc 339 <210> 19 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VH) <400> 19 gaggtgactt taaaggagag cggacccact ttagtgaagc ccacccagac tttaacttta 60 acttgtaccg tgagcggcga cagcatcacc agcggctact ggaactggat cagacagccc 120 cccggcaaag ctttagagta tttagcctac attcgttaca gcggtcgtac atactacaac 180 ccctctttaa agtctcgtct gaccatcact cgtgacacca gcaagaacca agttgtgctg 240 accatgacca acatggaccc cgtggacacc gccacctact actgcgccag cgtgtatttc 300 acctactggg gccaaggtac tttagtgacc gtctcgagc 339 <210> 20 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VH) <400> 20 gaggtgcagc tggtggagag cggcggagga ctggtgcaac ccggtcgttc tttaaggctg 60 agctgcaccg tgagcggcga cagcatcacc tccggctact ggaactggtt tcgtcaagct 120 cccggtaaag gtttagagta cgtgggctac attcgttaca gcggtcgtac ctactacaat 180 ccctctttaa agtctcgttt caccatctct cgtgacacca gcaagaacat cgcctattta 240 cagatgaact ctttaaagac cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag cgtgtacttc 300 acctactggg gccaaggtac tttagtgacc gtctcgagc 339 <210> 21 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 21 gatgttttga tgacccaaac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct ctctggtgtc taagctggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agccgagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggttc acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaga 336 <210> 22 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 22 gacgtggtga tgacccagag ccctttatct ttacccgtta cactgggcca gcccgcctct 60 atcagctgca agagcagcca gtctttactg gatagcgacg gcaagaccta tttaaactgg 120 ttccagcaga gacccggcca gagccccaag aggctgatct ctttagtgag caagctggac 180 agcggcgtgc ccgatcgttt cagcggaagc ggcagcggca cagacttcac tttaaagatc 240 tctcgtgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct ggcaaggtag ccacttcccc 300 tacaccttcg gccaaggtac caagctcgag atcaag 336 <210> 23 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 23 gacgtggtga tgacacagag ccccgattct ttagctgtgt ctttaggcga gagagccacc 60 atcaactgca agtccagcca gtctttactg gacagcgacg gcaagaccta tttaaactgg 120 taccagcaga agcccggcca gagccccaag aggctcatct ctttagtgag caagctggac 180 agcggcgtgc ccgataggtt cagcggaagc ggcagcggca ccgacttcac tttaaccatc 240 agctctttac aagctgagga tgtggccgtg tactactgct ggcaaggtag ccacttcccc 300 tacaccttcg gccaaggtac caagctcgag atcaag 336 <210> 24 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-tau antibody of variable region (VL) <400> 24 gaggtggtgc tgacccagag ccccggtact ttatctttaa gccccggtga gagagccact 60 ttaagctgca agagcagcca gtctttactg gacagcgacg gcaagaccta tttaaactgg 120 taccagcaga agcccggcca gagccccaag aggctgatct ctttagtgag caagctggac 180 agcggcatcc ccgacagatt cagcggaagc ggcagcggca ccgacttcac tttaaccatc 240 tctcgtctgg agccagaaga cttcgccgtg tactactgct ggcaaggtag ccacttcccc 300 tacaccttcg gccaaggtac caagctcgag atcaag 336 <210> 25 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 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Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1;
    서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 7 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 12 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 절편은 하기의 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편:
    서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편;
    서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편; 및
    서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 절편은 Fab, scFv, F(ab')2 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
  5. 제1항의 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  7. 제6항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
  8. 제7항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 생산하는 방법.
  9. 제2항에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 기탁번호 KCTC 14155BP의 하이브리도마.
  11. 제1항의 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 퇴행성 신경 질환은 타우 단백질이 매개된 신경 질환이고,
    상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환은 타우병증(tauopathy), 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증(chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵 병증(progressive supranuclear palsy), 대뇌 피질 기저 퇴행(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), 리티코-보디그 병(Lytico-Bodig disease) 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저부 변성(CBD), 피크병(PiD), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전두측두 치매(FTDP-17)로 총칭되는 관련 장애들의 그룹, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 크레이츠펠트-야콥병(CJD), 권투선수 치매(DP), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(GSSD), 루이소체 질환, 만성 외상성 뇌병증(CTE) 또는 헌팅턴병인 것인, 약학 조성물.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 뇌내, 뇌실내, 복강내, 경피, 근육내, 경막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것인, 약학 조성물.
  16. 제1항의 항-타우 항체 또는 이의 항원-결합 절편을 포함하는 퇴행성 신경질환의 진단용 조성물로서,
    상기 퇴행성 신경질환은 타우 단백질이 매개된 신경 질환이고,
    상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환은 타우병증(tauopathy), 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증(chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵 병증(progressive supranuclear palsy), 대뇌 피질 기저 퇴행(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), 리티코-보디그 병(Lytico-Bodig disease) 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 조성물.
  17. 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 절편, 제5항의 폴리뉴클레오티드, 제6항의 발현벡터, 또는 제7항의 숙주세포를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료 또는 진단용 키트로서,
    상기 퇴행성 신경질환은 타우 단백질이 매개된 신경 질환이고,
    상기 타우 단백질이 매개된 신경 질환은 타우병증(tauopathy), 원발성 노화 타우병증(primary age-related tauopathy), 만성 외상성 뇌증(chronic traumatic encephalopathy), 진행성 핵 병증(progressive supranuclear palsy), 대뇌 피질 기저 퇴행(corticobasal degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), 리티코-보디그 병(Lytico-Bodig disease) 파킨슨증, 아급성 경화성 뇌막염, 리드 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 신경절신경아교종(Ganglioglioma), 신경절세포종(gangliocytoma), 수막혈관종증(meningioangiomatosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease) 또는 리포푸신증(lipofuscinosis)인 것인, 키트.
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