TW202116801A - 抗tau抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關特異性結合tau蛋白之抗tau抗體及其用途。本發明之抗tau抗體可特異性結合tau蛋白，其中第280離胺酸係經乙醯化，且抑制異常tau蛋白的聚集。此外，在將本發明抗tau抗體投予失智症誘發之動物模型的情況中，抗tau抗體可改進動物模型之運動能力與認知能力。據此，本發明之抗tau抗體可有效地用於預防或治療退化性神經疾病。

Description

抗TAU抗體及其用途
本發明係有關特異性結合tau蛋白之抗tau抗體及其用途。
阿茲海默氏症約佔失智症發病類型的50%，為一退化性顱神經疾病，自65歲起發病率呈現上升趨勢，且隨著人口老齡化，在全世界範圍內迅速增長。
據信，阿茲海默氏症之發病原因主要歸因於早老素1 (presenilin 1)引起的β-類澱粉蛋白累積、tau蛋白的過度磷酸化、或β-類澱粉蛋白生成增加。其中，β-類澱粉蛋白累積引起之神經細胞毒性被視為是阿茲海默氏失智症發病的主要原因(Hardy AJet al .,Science , 256, 184-185, 1992)。然而，Eli Lilly and Company之阿茲海默氏症候選新藥索拉珠單抗(solanezumab)的第III期臨床試驗失敗，係因發現由β-類澱粉蛋白累積引起之神經細胞毒性不明顯。因此，焦點擺在以tau蛋白之異常過度磷酸化作為引起阿茲海默氏症發病主因的想法上。
Tau蛋白為一可穩定微管之蛋白，而微管為運輸細胞材料的蛋白。Tau蛋白在人體中存在六個亦異構型，且在中樞神經系統之神經元中甚多。此外，在tau蛋白發生突變之情況中，tau蛋白係經過度磷酸化，使得神經細胞中之神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)異常累積，從而引起退化性神經疾病，如失智症與巴金森氏症(Dong Hee Choiet al .，Brain & NeuroRehabilitation ，4, 21-29，2011)。
然而，由441個胺基酸組成的人類tau蛋白可發生轉譯後修飾之位置範圍很廣，使得在tau蛋白中很難找到對失智症具有預防或治療效果的靶標部位。由於此一各種修飾情況，在開發治療劑方面亦存在難度。
技術問題
據此，發明人研究開發用於退化性神經疾病之有效治療劑。其結果為，發明人發現一抗體，其特異性結合tau蛋白之片段，其中第280離胺酸係經乙醯化，以降低tau蛋白聚集。此外，發明人發現，在使用失智症誘發之動物模型實驗中，該投予抗體之動物模型呈現改進之運動能力與認知能力，從而完成本發明。問題解答
欲解決上述問題，在本發明之一態樣中，提供一 抗tau抗體或其抗原結合片段，其包含一重鏈可變區(VH)，其包括一具有由SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的重鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的重鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的重鏈CDR3；以及一輕鏈可變區(VL) ，其包括一具有由SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列的輕鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
在本發明之另一態樣中，提供一多核苷酸，其編碼抗tau抗體或其抗原結合片段，或抗tau抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。
在本發明之另一態樣中，提供一表現載體，其包含多核苷酸。
在本發明之又另一態樣中，提供一宿主細胞，其中表現載體係導入其中。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於產生抗tau抗體或其抗原結合片段之方法，其包含培養宿主細胞之步驟。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一具有登錄號KCTC 14155BP的融合瘤。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於預防或治療退化性神經疾病之藥學組成物，其包含抗tau抗體或其抗原結合片段，以作為活性成分。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於診斷退化性神經疾病之組成物，其包含抗tau抗體或其抗原結合片段。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於預防、治療、或診斷退化性神經疾病之套組，其包含抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、表現載體、或宿主細胞。本發明之有益效果
本發明之抗tau抗體可特異性結合tau蛋白，其中第280離胺酸係經乙醯化，且抑制異常tau蛋白的聚集。此外，在以本發明之抗tau抗體投予失智症誘發之動物模型的情況中，抗tau抗體可改進動物模型之運動能力與認知能力。據此，本發明之抗tau抗體可有效地用於預防或治療退化性神經疾病。
在下文中，將詳盡描述本發明。
在本發明之一態樣中，提供一抗tau抗體或其抗原結合片段，其包含一重鏈可變區(VH)，其包括一具有由SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的重鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的重鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的重鏈CDR3；以及一輕鏈可變區(VL)，其包括一具有由SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列的輕鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
本文中使用之術語「抗體」意指結合抗原且干擾抗原作用或消除抗原的免疫蛋白。抗體有五種類型(IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE)，且彼等抗體含有由重鏈恆定區基因(μ、δ、γ、α、及ε)分別產生的重鏈。在使用抗體之技術中，主要使用IgG。IgG有四種異構型(IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4)，每一者在結構與功能特性方面皆不同。
IgG形成Y型穩定結構(分子量：約150 kDa)，其由二個重鏈(約50 kDa)蛋白與二個輕鏈(約25 kDa)蛋白組成。在該抗體中，輕鏈與重鏈由可變區(其胺基酸序列在抗體之間彼此不同)與恆定區(其胺基酸序列在抗體之間皆相同)組成。在重鏈恆定區中有CH1、H (鉸鏈)、CH2、及CH3結構域。結構域之每一者由二個β-摺疊組成，且結構域經由分子內雙硫鍵彼此連接。將重鏈與輕鏈的二個可變區結合，形成一抗原結合位點。針對該位點，二個Y型臂上各有一者。能與抗原結合之部位稱作Fab (抗體結合片段)，而不與抗原結合之部位稱作Fc (可結晶片段)。Fab與Fc經由撓性鉸鏈區彼此連接。
本文中使用之術語「CDR」意指高度可變區 ，其為抗體之重鏈與輕鏈可變區中之位點，且其胺基酸序列在抗體之間彼此不同，其中該位點與抗原結合。由抗體之立體結構看來，CDR在抗體表面上具有圈環；且在圈環之下，存在一框架區(FR)，以在結構上支撐CDR。在重鏈與輕鏈之每一者中有三個圈環結構，且將彼等六個區域圈環結構結合在一起以直接接觸抗原。
重鏈可變區可包括選自於由SEQ ID NOs: 7至11所組成群組之任一胺基酸序列，且輕鏈可變區可包括選自於由SEQ ID NOs: 12至15所組成群組之任一胺基酸序列。
此外，抗tau抗體或其抗原結合片段可為選自於下列群組之任一者： 包含一具有由SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段；以及 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段。
在輕鏈可變區或重鏈可變區之CDR1、CDR2、CDR3皆相同之情況中，可修飾其框架部位。特別的是，框架部位之一部分的胺基酸序列可經修飾以製備人源化抗體。
本發明範例之抗tau抗體的胺基酸序列與SEQ ID NOs.總結於下表1與2中。 [表1]
Figure 02_image001
[表2]
ADEL 名稱 VH 胺基酸序列 SEQ ID NO VL 胺基酸序列 SEQ ID NO
Y01m01 EVQLEESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYIRYSGRTYYNPSLKSRISITRDTSKNQFYLQLISVTTEDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 7 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPYTFGGGTKLEIK 12
Y01h01v01 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v02 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v03 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYIRYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 8 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v04 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v05 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v06 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRQSPSRGLEWLGYIRYSGRTYYNPSLKSRITINRDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 9 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v07 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v08 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v09 EVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKALEYLAYIRYSGRTYYNPSLKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 10 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
Y01h01v10 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 13
Y01h01v11 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 14
Y01h01v12 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTVSGDSITSGYWNWFRQAPGKGLEYVGYIRYSGRTYYNPSLKSRFTISRDTSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASVYFTYWGQGTLVTVSS 11 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLDSDGKTYLNWYQQKPGQSPKRLISLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCWQGSHFPYTFGQGTKLEIK 15
本發明範例之抗tau抗體的核苷酸序列總結於下表3中。 [表3]
ADEL 名稱 VH 核苷酸序列 (SEQ ID NO) VL 核苷酸序列 (SEQ ID NO)
Y01m01 16 21
Y01h01v01 17 22
Y01h01v02 17 23
Y01h01v03 17 24
Y01h01v04 18 22
Y01h01v05 18 23
Y01h01v06 18 24
Y01h01v07 19 22
Y01h01v08 19 23
Y01h01v09 19 24
Y01h01v10 20 22
Y01h01v11 20 23
Y01h01v12 20 24
本文中使用之術語「ADEL-Y01m」意指特異性結合蛋白片段之小鼠抗體，其具有，在SEQ ID NO: 25代表之tau蛋白胺基酸序列中，第275至第286胺基酸序列部分，其中第280胺基酸係經乙醯化。此外，本文中使用之術語「ADEL-Y01h」意指將ADEL-Y01m抗體人源化所得之抗體。
抗體之抗原結合片段可為選自於由Fab、scFv、F(ab')2 、及Fv所組成群組之任一者。該片段意指可結晶區(Fc區)以外之抗原結合結構域，其具有將抗原結合所引起之刺激傳遞至細胞、補體、或其類似物的功能(效應子功能)，且可包括第三代片段，如單一結構域抗體與微型抗體(minibody)。
該片段之優點為，由於尺寸小於完整結構之IgG，因此進入血腦障壁時有良好滲透率，且由於其可在細菌中生產的事實，生產成本較低。此外，由於抗體片段缺乏Fc，因此可在不需要將結合抗原所引起之刺激傳遞至細胞、補體、或其類似物之功能的情況下使用抗體片段。由於該片段在人體內之半衰期短，適合進行活體診斷。然而，在構成抗體之胺基酸中，一些鹼性、酸性、或中性胺基酸可彼此替換，從而改變抗體本身固有的等電點(pI)。此類抗體等電點的改變，可造成諸如抗體體內毒性副作用降低或水溶性增加等變化。因此，在治療型抗體之情況中，考量到其親和力或結構形式，可使用完整IgG結構。
抗tau抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區可具有重鏈可變區序列，其含有選自於SEQ ID NOs: 7至11之任一胺基酸序列，或與重鏈可變區序列可具有95%、97%、98%、或99%同源性。
抗tau抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區可具有輕鏈可變區序列，其含有選自於SEQ ID NOs: 12至15之任一胺基酸序列，或與輕鏈可變區序列可具有至少95%、97%、98%、或99%同源性。
抗tau抗體或其抗原結合片段與重鏈可變區序列(含有選自於SEQ ID NOs: 7至11之任一胺基酸序列)和輕鏈可變區序列(含有選自於SEQ ID NOs: 12至15之任一胺基酸序列)可具有至少95%、97%、98%、或99%同源性。
利用已知之單株抗體製備技術，可容易地製備抗tau抗體。製備單株抗體之方法，可以源自免疫性動物之B淋巴球製備融合瘤或以噬菌體顯示技術(phage display technique)進行。然而，該方法不侷限於此。
作為本發明之實施例，藉由將B淋巴球製成融合瘤細胞株，可容易地製備抗tau抗體之單株抗體，該B淋巴球係藉由將蛋白片段(K280-ac)注射至小鼠而得，該片段具有SEQ ID NO: 25之野生型tau蛋白胺基酸序列之第275至第286胺基酸序列部分，其中第280胺基酸係經乙醯化。
在本發明之另一態樣中，提供一編碼抗tau抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。在本發明之又另一態樣中，提供一編碼抗體之重鏈或輕鏈的多核苷酸，該抗體包括抗tau抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區與輕鏈可變區。特別的是，多核苷酸可包括選自於由SEQ ID NOs: 16至20所組成群組之任一核苷酸序列及/或選自於由SEQ ID NOs: 21至24所組成群組之任一核苷酸序列。
多核苷酸可為選自於下列群組之任一者： 包括由SEQ ID NO: 16所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 21所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 17所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 22所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 17所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 23所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 17所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 24所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 18所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 22所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 18所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 23所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 18所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 24所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 19所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 22所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 19所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 23所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 19所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 24所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 20所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 22所示之核苷酸序列的多核苷酸； 包括由SEQ ID NO: 20所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 23所示之核苷酸序列的多核苷酸；以及 包括由SEQ ID NO: 20所示之核苷酸序列及/或由SEQ ID NO: 24所示之核苷酸序列的多核苷酸。
利用取代、刪除、或插入一或多個核苷酸或其組合，可修飾多核苷酸。在利用化學合成製備核苷酸序列之情況中，可使用本領域中已知之合成方法，如描述於Engels and Uhlmann，Angew Chem Int Ed Engl.，37:73-127，1988中之彼等。此類方法可包括三酯法、亞磷酸酯法、亞磷醯胺法、及H-磷酸酯法、PCR與其他自動引子法、在固體撐體上之寡核苷酸合成法、及其類似方法。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一表現載體，其包含多核苷酸。表現載體可為質體DNA、噬菌體DNA、或其類似物，且亦可包括商業上開發之質體(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP、及其類似物)、大腸桿菌衍生之質體(pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119、及其類似物)、枯草桿菌衍生之質體(pUB110、pTP5、及其類似物)、酵母菌衍生之質體(YEp13、YEp24、YCp50、及其類似物)、噬菌體DNAs (Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、及其類似物)、動物病毒載體(反轉錄病毒、腺病毒、牛痘病毒、及其類似物)、昆蟲病毒載體(桿狀病毒)、及其類似物。在表現載體中，蛋白之表現水平、修飾、及其類似物取決於宿主細胞，因此最好選擇並使用最適合該目的的宿主細胞。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一 宿主細胞，其包含表現載體。用於細胞轉形之可包括但不侷限於，哺乳類動物源、植物源、昆蟲源、真菌源、或細菌源之細胞。針對哺乳類動物細胞，可使用CHO細胞、F2N細胞、CSO細胞、BHK細胞、鮑氏黑色素瘤細胞(Bowes melanoma cells)、HeLa細胞、911細胞、AT1080細胞、A549細胞、HEK 293細胞、HEK293T細胞、或其類似物；然而，哺乳類動物細胞不侷限於此。可使用本領域技術人員已知之任何可作為哺乳類動物宿主細胞的細胞。
此外，在將表現載體導入宿主細胞之情況中，可使用以下方法：CaCl2 沉澱法；哈納漢氏法(Hanahan's method)，其中將一稱作二甲基亞碸(DMSO)的還原性物質與CaCl2 沉澱法組合使用，以提高效率、電穿孔法、 磷酸鈣沉澱法、原生質體融合法、碳化矽纖維攪拌法、農桿菌介導之轉形法、PEG介導之轉形法、硫酸葡聚醣法、脂質轉染胺法、乾化/抑制介導之轉形法、及其類似物。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一製造抗體或其抗原結合片段之方法，其包含一培養宿主細胞之步驟。特別的是，該製造方法之步驟可包含：i)培養宿主細胞以取得培養基；以及ii)從培養基收集抗體或其抗原結合片段。
宿主細胞之培養步驟可以本領域已知之方法進行。特別的是，可分批進行培養，或以分批進料或重複分批進料方式連續進行。
從培養基中收集抗體或其抗原結合片段之步驟可以本領域已知之方法進行。特別的是，可以下列方法進行收集：離心法、過濾法、萃取法、噴霧法、乾燥法、蒸發法、沉澱法、結晶法、電泳法、部分溶解法(如，硫酸銨沉澱法)、層析法(如，離子交換法、親和力法、疏水性法、或粒徑排除層析法)、及其類似方法。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一具有登錄號KCTC14155BP之融合瘤。具有登錄號KCTC14155BP之融合瘤可產生ADEL-Y01m。針對ADEL-Y01m，參考以上關於抗tau抗體或其抗原結合片段之描述。在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於預防或治療退化性神經疾病之藥學組成物，其包含，作為活性成分，抗tau抗體或其抗原結合片段。
退化性神經疾病可為tau蛋白介導之神經疾病。特別的是，tau蛋白介導之神經疾病可為tau蛋白病、原發性年齡相關性tau蛋白病、慢性創傷性腦病、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、額顳失智症、利蒂科-博迪格疾病(Lytico-Bodig disease)、巴金森氏症、亞急性硬化性腦膜炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病(meningioangiomatosis)、亞急性硬化性泛腦炎、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、或脂褐質症。
此外，tau蛋白病可為阿茲海默氏症(AD)、進行性核上神經麻痺症 (PSP)、皮質基底核退化症 (CBD)、匹克症(Pick’s disease，PiD)、一群統稱為連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)的疾病、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症 (ALS)、庫賈氏病 (Creutzfeld-Jakob disease，CJD)、拳擊手型失智症(DP)、吉斯曼-史特斯勤-先克症 (Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease，GSSD)、路易體症(Lewy body disease)、慢性創傷性腦病 (CTE)、或亨汀頓氏症(Huntington’s disease)。
藥學組成物可進一步包含選自於藥學上可接受載體、稀釋劑、及佐劑之一或多者。藥學組成物之適用載體為本領域技術人員已知，且可包括但不侷限於，蛋白質、糖類、及其類似物。載體可為水性或非水性溶液、懸浮液、及乳液。非水性溶液載體之範例可包括丙二醇、聚乙二醇、食用油諸如橄欖油、及可注射型有機酯諸如油酸乙酯。
水性溶液載體之範例可包括水、酒精/水性溶液、乳液、或包括鹽類緩衝介質之懸液。用於非經口投予之載體的範例可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖液、及氯化鈉溶液、乳酸林格氏液、或非揮發性油。用於靜脈注射之載體的範例可包括電解質補充劑(如，以林格氏葡萄糖液為主之電解質補充劑)、液體、及營養補充劑。可額外存在防腐劑與其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、及惰性氣體。較佳之防腐劑可包括福馬林、硫柳汞、新黴素、多黏菌素B、及兩性黴素B。
藥學組成物可進一步包含佐劑(免疫調節劑或免疫增強劑)。佐劑意指在接種後可增強免疫反應及/或加速吸收率之化合物或混合物，且可包括任何吸收促進劑。可接受之佐劑可包括但不侷限於，弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)、皂苷、礦物凝膠氫(如，氧化鋁)、界面活性劑(如，溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇、聚陰離子、胜肽、油或烴乳液、鑰孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基酚、及其類似物。
藥學組成物可通過選自於由腦內、腦室、腹腔、經皮、肌肉、硬腦膜、靜脈、皮下、及鼻腔投予途徑所組成群組之任一途徑投予，且較佳地利用腦內、腦室、硬腦膜、或腹腔途徑投予。
特別的是，腦內、腦室、或硬腦膜投予可能有用，係因無需考慮血腦障壁(BBB)滲透的問題。此外，在需要將少量藥物直接投予大腦特定區域以了解該藥物對大腦中該區域之作用的情況下，可使用腦內投予。腦室投予為將藥物投予腦室之方法，且可用於需要了解藥物對大腦整個區域之作用的情況。此外，硬腦膜投予為將針插入脊柱下部兩椎骨間之脊髓周圍空間中而注射藥物至椎管中的方法，且可用於大腦、脊髓、或覆蓋大腦或脊髓之組織層(腦膜)需要藥物以提供快速或局部作用的情況。
依據本發明之具體實施例，通過腹腔投予以及腦室投予，本發明之抗體能有效改進失智症誘發之動物模型的運動能力與認知能力。
藥學組成物係以藥學上之有效量投予。本文中使用之術語「藥學上有效量」意指足以使得藥學組成物呈現治療作用而無副作用或嚴重或過度免疫反應的量。有效量之水平可依據各種因素而變，包括欲治療之疾病、疾病嚴重程度、特定化合物之活性、投予途徑、蛋白去除率、治療時間、藥物結合蛋白使用或與蛋白同時使用、個體年齡、體重、性別、飲食習慣、整體健康狀況、及醫學領域已知之因素。
考量年齡、性別、病況、其體內活性成分吸收程度、失活率、及結合物中使用之藥物，以理想地決定藥學組成物的劑量。基於抗體或其抗原結合片段，藥學組成物可以0.0001 mg/kg (體重)至300 mg/kg (體重)之量投予。
在本發明之又另一態樣中，提供一用於預防或治療退化性神經疾病之方法，其包含一將抗tau抗體或其抗原結合片段投予預期會罹患退化性神經疾病或已罹患退化性神經疾病之個體的步驟。
抗tau抗體或其抗原結合片段係如上述。
抗tau抗體或其抗原結合片段之劑量範圍取決於病患之體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、投予時間、投予方法、排泄率、及疾病嚴重程度。每天或每週可以約0.001 mg/kg至300 mg/kg的量投予單一劑量。有效量可由治療病患的醫師決定。
抗tau抗體或其抗原結合片段之有效量取決於各種因素，如病患之年齡、體重、症狀特徵與程度、當前治療類型、治療次數、劑型、及投予途徑， 且可由相關領域專家輕鬆確定。
抗tau抗體或其抗原結合片段可與上述藥理或生理組分一起或依序投予，且亦可結合額外之常規治療劑投予，其中抗tau抗體或其抗原結合片段可與常規治療劑依序或同時投予。此投予可為單次或多次投予。考量到所有上述因素，重要的是投予最小量之藥物，該量能產生最大效用而無副作用，且本領域技術人員可輕鬆決定該量。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於診斷退化性神經疾病之組成物，其包含抗tau抗體或其抗原結合片段。抗tau抗體可為一結合經修飾之tau蛋白的抗體。抗體係如上述。
特別的是，經確定，tau蛋白胺基酸序列第280胺基酸之乙醯化導致tau聚集及tau蛋白介導之神經疾病。抗tau抗體或其抗原結合片段結合由SEQ ID NO: 25所示之tau蛋白胺基酸序列的表位，其含有第278至第284胺基酸，其中第280胺基酸係經乙醯化，因此可用於更有效地診斷tau蛋白介導之神經疾病。
在使用該抗體之情況中，用於確定與其結合之經修飾tau蛋白之量的試驗包括但不侷限於，西方墨點法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、放射免疫擴散法、歐氏(Ouchterlony)免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫組織學染色法、免疫沉澱法、補體固定法、螢光活化之細胞分選法(FACS)、蛋白晶片法、及其類似方法。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於預防、治療、或診斷退化性神經疾病之套組，其包含抗tau抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、表現載體、或宿主細胞。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一用於退化性神經疾病之診斷套組，其包含抗tau抗體或其抗原結合片段。
套組可用於測定個體樣本中經修飾之tau蛋白的表現水平，從而診斷退化性神經疾病。此外，可涵蓋適合試驗方法之抗體，以及組成物、溶液、或包括一或多個其他成分的裝置，以測定修飾之tau蛋白的表現水平。
從個體分離樣本之過程，可以已知之方法進行。本文中使用之術語「樣本」包括但不侷限於，諸如組織、細胞、血液、及血漿等樣本，其各具有不同表現水平之修飾之tau蛋白，及其類似物。
此外，測定蛋白之步驟，可以西方墨點法、ELISA、放射免疫分析法、放射免疫擴散法、歐氏免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫組織學染色法、免疫沉澱法、補體固定法、FACS、或蛋白晶片法進行。然而，本發明不侷限於此。
通過上述試驗方法，可比較正常對照組中形成之抗原-抗體複合體的量與個體中形成之抗原-抗體複合體的量，並確定tau蛋白介導之神經疾病。
本發明中使用的術語「抗原-抗體複合體」意指經修飾之tau蛋白與其之特異性抗體的共軛體，且形成之抗原-抗體複合體的量可通過檢測標記之信號大小進行定量測定。此類檢測標記可選自於由酵素、螢光物質、配體、冷光物質、微顆粒、氧化還原分子、及放射性同位素組成之群組，但不侷限於此。在以酵素作為檢測標記之情況中，可用的酵素包括β-葡萄醣醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化酶、鹼性磷酸酶、及其類似物。配體包括但不侷限於，生物素衍生物及其類似物。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一抗tau抗體或其抗原結合片段之用途，用於預防或治療 退化性神經疾病。
在本發明之仍又另一態樣中，提供一抗tau抗體或其抗原結合片段之用途，以製備一用於預防或治療退化性神經疾病之藥劑。
在下文中，將通過實施例的方式詳細描述本發明。然而，以下實施例僅旨在說明本發明，且本發明不侷限於此。I. 製備修飾之 tau 蛋白片段及針對其之抗體 製備例 1. 製備修飾之 tau 蛋白片段
欲製備修飾之tau蛋白片段，選擇tau蛋白片段，其係由441個胺基酸組成的tau蛋白(2N4R)胺基酸序列，在阿茲海默氏症的發病機制中起作用，且在tau基因修飾之小鼠模型的主動免疫中顯示認知能力改進效果。如圖1所示，在位於微管結合結構域之tau蛋白片段胺基酸序列中，指定一由12個胺基酸組成的部分。
特別的是，在SEQ ID NO: 25之野生型tau蛋白胺基酸序列中，該蛋白片段具有第275至第286的胺基酸序列部分，其中第280胺基酸係經乙醯化，並稱作K280-ac。K280-ac蛋白片段係由Peptron製造。
此外，以鑰孔帽貝血藍素(KLH)結合於N端的K280-ac蛋白片段係由ANYGEN (Nam-myeon，南韓)製造。以KLH結合於N端的K280-ac蛋白片段係以Shimadzu HPLC 10AVP系統純化(純度為91.8%)，其中濃度梯度條件為含有0.05% TFA的5%至65%乙腈。
此外，重複結構域(RDs) 1、2、3、及4之蛋白片段含有SEQ ID NO: 25之野生型tau蛋白胺基酸序列，其中第244至第372胺基酸(SEQ ID NO: 26)稱作K18。將含有編碼K18蛋白片段之基因的載體轉導至大腸桿菌細胞以產生K18蛋白片段。
特別的是，K18蛋白片段以下列方式製造。首先將pET-21b-Tau (K18)表現載體(圖2)轉導至大腸桿菌BL21 (DE3)，並在溫度37°C之含有50 μg/ml濃度之安比西林的LB培養基中培養，直到600 nm波長之光密度值(O.D.)達到0.6至0.8。隨後，以0.5 mM濃度之IPTG處理，且所得物在37°C之溫度下培養3小時，並在18°C之溫度下培養18小時。
在18小時後，將形成的單一菌落培養在含有50 μg/ml濃度之安比西林的5 ml LB培養基中，並在37°C之溫度與220 rpm的條件下培養約16小時。起始培養基以1:500之比例接種至錐形瓶中，其中放入5 L含有濃度50 μg/ml之安比西林的LB培養基，接著在37°C之溫度下培養4小時。隨後，培養物以3500 rpm離心30分鐘。然後，移除上清液，並將所得沉澱物冷凍於-20°C。
冷凍之沉澱物以25 ml/g的比例重新懸浮於裂解緩衝液(20 mM Tris-HCl，1 mM苯基甲基磺醯基氟化物，pH 8.0)中。利用JY99-IIDN超音波均質機，在1,500 W條件下，將細胞裂解30分鐘。隨後，所得物在4°C之溫度與15,000 rpm的條件下離心20分鐘，接著上清液以0.45 μm濾膜進行過濾。
通過5 mL His-Trap SP管柱(以緩衝液A (20 mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡)，將濾液過濾。欲移除非特異性結合，以5個管柱體積(CV)之緩衝液A清洗， 接著以10 CV之緩衝液B (20 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl)之0至1 M NaCl的濃度梯度進行溶析。
收集含有K18蛋白片段之分液，接著通過5 mL Hi-Trap SP管柱(以緩衝液C (20 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，50 mM咪唑))過濾。欲移除非特異性結合，以10 CV之緩衝液C清洗。隨後，以20 CV之緩衝液D (20 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，100 mM咪唑)進行溶析。利用10 kDa分子量離心濾膜，將含有經純化之K18蛋白片段之溶析物濃縮。
在溫度30°C下，藉由將(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES，10 mM，pH 7.4)之乙醯化緩衝液、50 mM NaCl、1.5 mM MgCl2 、0.5 mM二硫蘇糖醇(DTT)、2.5 mM EGTA、0.1 mM EDTA與8 μM濃度之K18蛋白片段、125 μM濃度之乙醯CoA、及0.5 μg之P300酵素(其為乙醯轉移酶)反應3小時，製備乙醯化K18蛋白片段(acK18)。
在24°C溫度下，將25 μM濃度之K18蛋白片段溶解於25 mM DTT之溶液中1小時，並在37°C溫度下，以700 rpm之Eppendorf Thermomixer C，於(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES，10 mM，pH 7.4)、NaCl (100 mM)、肝素(25 mM)之溶液中進行攪拌，製備K18蛋白片段之聚集體。製備例 2. 製備結合修飾之 tau 蛋白片段之抗體
在製備例1中，特異性結合K280-ac蛋白片段之抗體係由AbFrontier (南韓小鼠單株抗體開發公司)製造。以K280-ac蛋白片段(作為抗原)注射小鼠所得之B淋巴球稱作融合瘤細胞。隨後，通過ELISA，篩選產生可特異性結合K280-ac蛋白片段之抗體的細胞株。此外，噬菌體顯示庫篩選係由南韓大學的抗體開發研究人員進行，以開發出特異性結合K280-ac蛋白片段的抗體。
其結果為，最終選擇一小鼠融合瘤細胞株(小鼠融合瘤細胞株)，且排除通過噬菌體顯示庫篩選而選擇的候選物，係因其產生的抗體親和力比小鼠融合瘤細胞株的低。通過西方墨點法與ELISA，體外檢查小鼠融合瘤細胞株產生之抗體與K280-ac蛋白片段的結合。
其結果確定，由#15E5融合瘤細胞株(殖株#1)產生之抗體為特異性結合K280-ac蛋白片段的抗體(圖3與4)。最終選擇由#15E5融合瘤細胞株產生的抗體並稱作ADEL-Y01m。
始於此小鼠抗體，以常規之已知技術(包括抗體可變區分析、CDR調查、分子建模、人類種系抗體分析、CDR嫁接、及基因定序)產生人源化抗體，且彼等人源化抗體稱作ADEL-Y01h (v01至v10)。
另一方面，#15E5融合瘤細胞株於2020年3月18日保管在Korean Collection for Type Cultures (KCTC)，並指定微生物登錄號KCTC14155BP。實驗例 1. 確定抗原特異性結合
欲確定製備例2製備之ADEL-Y01m抗體與乙醯化之tau蛋白的特異性結合，進行野生型tau蛋白與tau蛋白(Tau K280A)(其中第280胺基酸離胺酸以丙胺酸替代)之體外乙醯化。在此，以與製備例1中之乙醯化K18蛋白片段的製備方法相同的方式進行野生型Tau蛋白與Tau K280A蛋白之乙醯化。隨後，通過西方墨點法，檢查ADEL-Y01m抗體之抗原-抗體特異性結合反應。
首先，通過Bradford試驗，測定野生型Tau蛋白與Tau K280A蛋白的濃度。將各蛋白與4X樣本緩衝液(60 mM Tris-HCl [pH 6.8]，2% w/v SDS，25% v/v甘油，14.4 mM v/v β-巰乙醇，以及溴酚藍)混合。隨後，各蛋白在SDS-PAGE凝膠上進行電泳分析。隨後，將電泳凝膠分開並轉移至PVDF薄膜(BioRad，California，USA)。以阻斷緩衝液(含有0.1% v/v Tween-20 [PBST]，3% w/v BSA，或5% v/v脫脂牛奶之PBS緩衝液)處理，且反應進行1小時。隨後，以抗乙醯基-離胺酸抗體(抗乙醯基-離胺酸，Cell Signaling，9441)或ADEL-Y01m抗體(作為一級抗體)處理，且反應於4°C下進行隔夜。隔日，PVDF薄膜以清洗緩衝液(含有0.1% v/v Tween-20 [PBST]之PBS 緩衝液)清洗三次，且隨後以HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)處理。PVDF薄膜化學放光試劑(Thermo Fisher Scientific)處理。隨後，以x-光片與ImageJ軟體(NIH，Bethesda，MD)進行測定與分析。
其結果確定，ADEL-Y01m抗體不結合Tau K280A蛋白與乙醯化之Tau K280A蛋白(圖5)。由彼等結果確定，ADEL-Y01m抗體為僅特異性結合tau蛋白(第280胺基酸離胺酸係經乙醯化)的抗體。
此外，欲確定製備例2中製備之ADEL-Y01h01_v01抗體的特異性結合，以如上述使用K280-ac蛋白片段與K18蛋白片段之相同方式進行西方墨點法。在此，使用ADEL-Y01h01_v01抗體與HRP標記之抗人類IgG抗體 (Bioxcell，BE0297)。
其結果確定，ADEL-Y01h01_v01抗體對K280-ac蛋白片段呈現高的抗體親和力(圖6)。實驗例 2. 確定抗原 - 抗體親和力
通過Octet® K2系統(Fortebio)，測定製備例1中製備之K280-ac蛋白片段與製備例2中製備之ADEL-Y01m抗體之間的親和力。
依據製造商之手冊，將ADEL-Y01m抗體固定在AR2G生物感應器上。以水將生物感應器表面水合10分鐘，且隨後以20 mM 1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與10 mM N-羥基磺基琥珀醯亞胺(s-NHS)之混合物活化。利用10 mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)，將ADEL-Y01m抗體固定在經活化之生物感應器上，並以1M乙醇胺(pH 8.0)淬滅5分鐘。將固定了ADEL-Y01m抗體之生物感應器浸入1X PBS緩衝液(pH 7.4)中60秒鐘，以建立基線。隨後，將生物感應器浸入含有不同濃度之K280-ac蛋白片段(抗原)或BSA結合之胜肽的培養孔中60秒鐘。隨後，將生物感應器再次浸入1X PBS緩衝液(pH 7.4)中10分鐘，以便發生解離。利用Octet Data Analysis軟體(SW版本：9.0.0.10)評估實驗數據。
其結果為，針對ADEL-Y01m抗體與K280-ac蛋白片段間之親和力，抗原解離常數(Kd)值經測定為2.57 × 10-10 M (圖7)。
此外，利用ELISA，測定製備例1中製備之K280-ac蛋白片段與製備例2中製備之ADEL-Y01h (v01至v12)抗體的結合。
首先，培養盤以K280-ac蛋白片段(250 ng/孔)處理，且反應在4°C下進行隔夜。隔日，以清洗緩衝液清洗三次，且隨後以8個濃度(2 μg，1 μg，0.5 μg，0.25 μg，0.12 μg，0.06 μg，0.03 μg，0.01 μg)的一級抗體處理。以HRP標記之抗人類IgG 抗體作為二級抗體。
其結果確定，針對K280-ac蛋白片段，ADEL-Y01h (v01至v10)抗體呈現高的抗體親和力(圖8)。II. 使用動物模型確定 ADEL-Y01m 抗體造成之治療效果 製備例 3. 準備失智症小鼠模型
表現Tau-P301L突變體基因之JNPL3小鼠係購自Taconic，且在Asan Institute for Life Sciences之實驗動物房中與C57bl/6小鼠交配五代。隨後，小鼠在特定無病源體(SPE)條件下飼養。實驗例 3. 確定失智症小鼠模型特徵
相較於正常小鼠，用於實驗之Tau-P301L失智症小鼠模型表現出隨年齡之大腦組織中tau蛋白之累積差異。以製備例2中製備之ADEL-Y01m抗體進行免疫染色。
從正常小鼠與Tau-P301L失智症小鼠提取大腦，並通過腦組織之Sarkosyl分液法，將可溶性與不可溶性蛋白分開。以RABuffer B (100 mM MES，0.75 M NaCl，1 mM EGTA，0.5 mM MgSO4 ，2 mM DTT，pH 6.8 + 蛋白酶/磷酸酶抑制劑)將大腦樣本均質化。將樣本置於冰上20分鐘，並於4°C下以9,000 rpm離心20分鐘。在離心後，收集上清液(可溶性蛋白)。以萃取緩衝液(1% Sarkosyl，10 mM Tris，10%蔗糖，0.85 M NaCl，1 mM EGTA，pH 7.4)均質化沉澱物。樣本置於室溫下1小時，於4°C下以13,000 rpm離心20分鐘。在離心後，收集上清液(tau聚集體)。以如實驗例1中之相同方式，將分開之蛋白進行西方墨點法。
其結果確定，12個月大失智症小鼠模型之腦組織中呈現乙醯化之tau蛋白數量的增加。特別的是，經確定，4個月大失智症小鼠模型呈現類似於正常小鼠的tau蛋白表現水平，且相較於正常小鼠，發生嚴重失智症狀之12個月大失智症小鼠模型之tau蛋白呈現約2倍的表現水平(圖9)。實驗例 4. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之行為改進效果：腦室投予
欲確定ADEL-Y01m抗體造成之治療效果，依據圖10中所示之實驗時間表，以滲透泵將ADEL-Y01m抗體投予製備例3中製備之Tau-P301L失智症小鼠之側腦室。實驗例 4.1. 藉由築巢測試確定行為改進效果
進行築巢測試，可確定小鼠的多元大腦功能。
特別的是，移除小鼠飼養籠中三分之二的墊料，並在籠中放置四層無菌棉(5 cm × 5 cm)。容許一隻小鼠進入籠中。第二天早晨，分析巢的完成度。
將巢的完成度分成1至5分，以計算積分。針對所提供之無菌棉維持90%以上或幾乎未觸摸之情況，則以1分計算；而針對無菌棉維持約50%至90%且部分撕裂之情況， 則以2分計算。針對無菌棉撕裂50%以上且在籠子周圍散開之情況，則以3分計算；而針對無菌棉撕裂90%以上且在籠子側面聚集之情況，則以4分計算。針對無菌棉完全撕裂且籠子側面形成完整巢形之情況，則以5分計算。
其結果確定，相較於正常小鼠，Tau-P301L失智症小鼠(Tau-P301L-ADEL-Y01m)之築巢積分呈現減少約60%，而投予ADEL-Y01m抗體之失智症小鼠呈現類似於正常小鼠的築巢積分(圖11)。實驗例 4.2. 藉由 Y 型迷宮測試確定行為改進效果
進行Y型迷宮測試，以確定認知功能之恢復。Y型迷宮測試為確定短期記憶能力之實驗。特別的是，在Y型框中設置A、B、及C區，且在擋住B區之狀態下容許小鼠自由移動5分鐘。在一小時後，排除擋住B區的狀態，並在所有的區皆打開之狀態下觀察小鼠的運動5分鐘。
其結果為，在Tau-P301L小鼠之情況中，停留在A或C區的時間為100秒鐘或更短，其相較於正常小鼠，減少約50%。另一方面，在投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，停留在A或C區的時間為約150秒鐘，其類似於正常小鼠。由彼等結果確定，Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之短期記憶能力恢復(圖12)。實驗例 4.3. 藉由水迷宮測試確定行為改進效果
進行水迷宮測試，以評估小鼠的學習與記憶能力。針對用於水迷宮測試之設備與程序，使用Asan Institute for Life Sciences實驗動物室擁有的行為學設備。特別的是，水迷宮測試總共花費5天。在安置平台與平台目視提示之狀態下，將小鼠進行4天培訓。
藉由在平台泳池(直徑1.4 m，深度45 cm)中注水(29 ± 0.5°C)至約26.5 cm的深度，且隨後添加1.5 L的全脂奶粉使水變渾濁，以便小鼠可僅憑提示記住平台，以進行學習。隨後，小鼠適應且自由地泳行60秒鐘，接著在平台上休息1分鐘。該實驗總共進行12次，其中在三個不同起始位置使用4組設定。在每一測試結束時，給予30秒鐘的休息時間。在一組設定結束時，給予30至45分鐘的休息時間。
在4天的學習之後，在第5天進行測試。在評估實驗中，未放置平台，而是僅通過提示，確定小鼠是否有效地待在平台位置，從而測定其於放置平台區之停留次數。此外，容許小鼠在一分鐘內到達放置平台之位置。若小鼠無法在一分鐘內到達平台位置，則將小鼠從泳池中移出。
首先，測定小鼠在4天學習中找到平台所花費的時間。其結果為，在Tau-P301L小鼠之情況中，在4天內發現平台所需之時間為20秒鐘或更長。另一方面，在正常小鼠與投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，從第二天開始，找到平台所需之時間減少至20秒鐘或更短(圖13)。
此外，在第5天，對停留在放置平台之NW區所花費的時間進行評估。其結果確定，Tau-P301L小鼠在NW區停留10秒鐘或更短的時間，而正常小鼠與投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠在NW區停留20秒鐘或更短的時間(圖14)。實驗例 4.4. 藉由握力測試確定行為改進效果
進行握力測試，以確定小鼠之肌肉強度。針對實驗中使用之鐵束，使用Asan Institute for Life Sciences擁有的行為學設備。在此，以一個重40克的鐵束作為鐵束。將製備例3中製備之小鼠尾巴握住，並將其前腳放置於40 g鐵束上，以便小鼠可抓住鐵束。隨後，在握住小鼠尾巴之狀態下，將其抬高至約30 cm高度。測定小鼠脫離鐵束的時間，並比較個別的小鼠。
其結果為，正常小鼠所呈現抓握強度之測得時間為20秒鐘或更短，而Tau-P301L失智症小鼠所呈現抓握強度之測得時間為5秒鐘或更短。相反地，在投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，抓握強度之測得時間為20秒鐘或更長，其比正常小鼠的時間更長 (圖15)。由彼等結果確定，投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之運動能力恢復。實驗例 5. 確定 ADEL-Y01m 抗體之行為改進效果：腹腔投予
欲確定ADEL-Y01m抗體之治療功效，依據圖16所示之實驗時間表，製備例3中製備之Tau-P301L失智症小鼠以腹腔投予ADEL-Y01m抗體3個月。實驗例 5.1. 藉由築巢測試確定行為改進效果
以如實驗例4.1之相同方式進行築巢測試，以確定小鼠的多元大腦功能。
其結果確定，相較於正常小鼠，Tau-P301L失智症小鼠的築巢積分呈現約60%減少，且投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠呈現類似於正常小鼠的築巢積分(圖17)。實驗例 5.2. 藉由 Y 型迷宮測試確定行為改進效果
進行Y型迷宮測試，如實驗例4.2中之方式，以確定認知功能恢復。其結果為，在Tau-P301L小鼠之情況中，停留在A或C區之時間為約80秒，其相較於正常小鼠減少約50%。另一方面，在投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，停留在A或C區之時間為約110秒，其類似於正常小鼠。由彼等結果確定，Tau-P301L-A DEL-Y01m失智症小鼠之短期記憶能力恢復(圖18)。實驗例 5.3. 藉由水迷宮測試確定行為改進效果
以如實驗例4.3之相同方式進行水迷宮測試。測定小鼠在4天學習中找到平台所花費之時間。其結果為，在Tau-P301L小鼠之情況中，在4天中找到平台所花費之時間為20秒鐘或更短。另一方面，在正常小鼠與投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，從第3天開始，找到平台所花費之時間減少至15秒鐘或更短(圖19)。
此外，在第5天，對停留在放置平台之NW區所花費的時間進行評估。其結果確定，Tau-P301L小鼠在NW區停留20秒鐘或更短的時間，而正常小鼠與投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠在NW區停留25秒鐘的時間(圖20)。實驗例 6. 確定 I ADEL-Y01m 抗體與小鼠組織中表現之經修飾之 tau 蛋白間之特異性結合
利用IgG與ADEL-Y01m抗體，將製備例3中製備之正常小鼠與Tau-P301L失智症小鼠之大腦皮質與海馬廻組織進行免疫沉澱法(IP)與西方墨點法。
首先，利用將1% Tx-100、100 mM NaCl、及50 mM HEPES(pH調整至pH 7.4)添加至蒸餾水中，以製備樣本緩衝液。接下來，以樣本緩衝液再懸浮正常小鼠與Tau-P301L失智症小鼠之大腦皮質與海馬廻組織，以便取得再懸浮之樣本。所得樣本之每一者以IgG或ADEL-Y01m抗體處理，且反應進行24小時。隨後，以100 μl之蛋白G-瓊脂糖珠粒(GE Healthcare Life Sciences)處理樣本，且反應在4°C下進行隔夜。隔日，在4°C下以6,000 rpm離心1分鐘，以收集樣本，並以含有0.1% Triton X-100之PBS進行三次清洗。以1X 樣本緩衝液處理樣本，並進行西方墨點法。在此，以如實驗例1之相同方式進行西方墨點法，並使用IgG、ADEL-Y01m抗體、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體。
其結果確定，在Tau-P301L失智症小鼠之大腦皮質與海馬廻組織中，ADEL-Y01m抗體與tau蛋白(Tau-acK280)之間有特異性結合反應，其中第280胺基酸離胺酸係經乙醯化。此外，由彼等結果確定，ADEL-Y01m抗體在體內有效地結合大腦組織中表現之經修飾之tau蛋白(圖21)。實驗例 7. 確定 II ADEL-Y01m 抗體與人類組織中表現之修飾之 tau 蛋白間之特異性結合
欲確定ADEL-Y01m抗體與人類大腦組織中表現之修飾之tau蛋白之間的特異性結合，利用ADEL-Y01m抗體，將正常老年人與阿茲海默氏症病患腦組織之顳葉皮質進行免疫組織化學染色。
首先，將正常老年人與阿茲海默氏症病患腦組織之顳葉皮質之每一者切片，並置於載玻片上。腦組織由Netherlands Brain Bank提供。切片以1X PBS清洗，並在室溫下以含有0.1% Triton X-100之1X PBS進行10分鐘滲透反應。隨後，切片在室溫下以含有3% BSA之PBS清洗與阻斷歷時1小時。切片以1X PBS清洗，並在4°C下與ADEL-Y01m抗體反應隔夜。
隔日，針對二胺基聯苯胺(DAB)染色，切片在與一級抗體反應隔夜之後，以1X PBS清洗。切片在室溫下與作為二級抗體的生物素化抗小鼠IgG抗體(Vector Laboratories，California，USA)反應1小時。切片以1X PBS清洗，以抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶複合體(Vector Laboratories，California，USA)處理，並使其反應。使大腦組織切片在DAB溶液中反應10分鐘，接著以1X PBS清洗。將切片安裝在加拿大香膠(Sigma-Aldrich)上。切片以Zeiss顯微鏡(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)成像，並以AxioVision Imaging System處理影像。
其結果為，在正常老年人顳葉皮質中未觀察到ADEL-Y01m抗體染色，而在阿茲海默氏症病患顳葉皮質中觀察到ADEL-Y01m抗體染色。此外，由彼等結果確定，體內ADEL-Y01m抗體與大腦組織中表現之修飾之tau蛋白的結合良好(圖22)。
此外，通過西方墨點法，分析正常老年人與阿茲海默氏症病患腦組織。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，且使用抗Tau5抗體 (Invitrogen，AHB0042)、抗乙醯基-K280 抗體 (Anaspec，AS-56077)、抗類澱粉蛋白-β抗體(Covance，SIG-39300)、抗GAPDH抗體(Millipore，MAB374)、及HRP標記之抗人類IgG抗體。
其結果為，相較於正常老年人腦組織，觀察到阿茲海默氏症病患腦組織中之完整tau蛋白、乙醯化之tau蛋白、及類澱粉蛋白-β的表現水平增加(圖23A)。特別的是，在阿茲海默氏症病患腦組織中，觀察到有約3倍以上的乙醯化tau蛋白(Tau-acK280)(圖23B)。實驗例 8. 確定腦室投予 ADEL-Y01m 抗體後之 tau 蛋白病緩解 效果
欲確定投予ADEL-Y01m抗體之後的tau蛋白病緩解效果，提取以腦室投予IgG或ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並通過西方墨點法，檢查完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及tau蛋白胺基酸序列中第396胺基酸絲胺酸磷酸化之tau (Ser396)的表現水平。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗pSer396抗體(Thermo，44-752G)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果確定，相較於正常小鼠之腦組織，以腦室投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中存在更高量的完整tau蛋白、乙醯化之tau蛋白、及磷酸化之tau蛋白。另一方面，相較於以腦室投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織，以腦室投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中存在更低量的完整tau蛋白、乙醯化之tau蛋白、及磷酸化之tau蛋白(圖24至27)。
此外，進行免疫組織化學染色，以確定小鼠腦組織中tau蛋白胺基酸序列之第202胺基酸絲胺酸與第205胺基酸蘇胺酸磷酸化所得之tau蛋白(pSer202/pThr205)及磷酸化之tau (pT231)的表現水平。在此，以如實驗例7中之相同方式進行免疫組織化學染色，並以抗AT8抗體(Thermo，MN1020)與抗pT231抗體(Thermo，MN1040)作為一級抗體。
其結果為，相較於正常小鼠之腦組織，以腦室投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠腦組織中，觀察到磷酸化之tau蛋白的表現水平增加。另一方面，相較於以腦室投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織，以腦室投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中觀察到磷酸化之tau蛋白的表現水平減少(圖28與29)。實驗例 9. 確定腹腔投予 ADEL-Y01m 抗體後之 tau 蛋白病緩解 效果
欲確定投予ADEL-Y01m抗體之後的tau蛋白病緩解效果，提取腹腔投予50 mg/kg之量的IgG或ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並通過半變性西方墨點法，檢查完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau、及磷酸化之tau (pT231)的表現水平。在此，以如實驗例1中之相同方式進行半變性西方墨點法，除了將小鼠大腦組織與2X laemmli樣本緩衝液混合而無β-巰乙醇以外。此外，使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗pT231抗體(Thermo，MN1040)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果確定，相較於正常小鼠之腦組織，以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠腦組織中存在更高量之完整tau蛋白、磷酸化之tau蛋白、及乙醯化之tau蛋白的寡聚體形式。另一方面，相較於以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠腦組織，以腹腔投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠腦組織中存在明顯更低量的完整tau蛋白、磷酸化之tau蛋白、及乙醯化之tau蛋白(圖30至33)。實驗例 10. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之突觸改進效果：腦室投予
欲確定投予ADEL-Y01m抗體之後的突觸改進效果，提取以腦室投予50 mg/kg之量的IgG或ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並對突觸相關之蛋白進行西方墨點法。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗PSD95抗體(Abcam，ab2723)、抗突觸素-1抗體(Chemicon，MAB355)、抗β-actin抗體(Sigma，A5441)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果為，相較於正常小鼠之腦組織，以腦室投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中觀察到PSD59與突觸素-1的表現水平增加。另一方面，相較於以腦室投予IgG Tau-P301L失智症小鼠之腦組織，以腦室投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中觀察到PSD59與突觸素-1的表現水平減少(圖34至36)。實驗例 11. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之突觸改進效果：腹腔投予
欲確定投予ADEL-Y01m抗體之後的突觸改進效果，提取以腹腔投予50 mg/kg之量的IgG或ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並對突觸相關之蛋白進行西方墨點法。在此，以如實驗例10中之相同方式進行西方墨點法。
其結果為，相較於正常小鼠之腦組織，以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中PSD59與突觸素-1的表現水平增加。另一方面，相較於以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織，以腹腔投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中觀察到PSD59與突觸素-1的表現水平減少(圖37至39)。實驗例 12. 確定腹腔投予 ADEL-Y01m 抗體後之 ADEL-Y01m 抗體滲透至腦組織及其結合抗原
欲確定腹腔投予ADEL-Y01m抗體之後大腦組織中的抗體分佈，以腹腔投予50 mg/kg之量的ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠進行生理鹽水的心臟灌注。隨後，提取其腦組織，並以蛋白-G瓊脂糖(PGS)進行免疫沉澱法。隨後，以抗小鼠IgG抗體進行西方墨點法。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果為，在以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠腦組織中未檢測到抗體。另一方面，經確定，抗體存在於以腹腔投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠的腦組織中(圖40)。實驗例 13. 確定在老年失智症小鼠模型中 ADEL-Y01m 抗體造成之行為改進效果：腹腔投予
欲確定ADEL-Y01m抗體之治療功效，以如製備例3中之14個月大老年小鼠生產老年失智症小鼠模型。利用老年失智症小鼠模型，依據圖41所示之實驗時間表，投予製備例2中製備之ADEL-Y01m抗體 。實驗例 13.1. 藉由築巢測試確定行為改進效果
以如實驗例4.1之相同方式進行築巢測試，其可確定小鼠之多元大腦功能。
其結果確定，相較於正常小鼠，Tau-P301L失智症小鼠的築巢積分呈現減少約60%，且投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠呈現類似於正常小鼠的築巢積分(圖42)。實驗例 13.2. 藉由 Y 型迷宮測試確定行為改進效果
以如實驗例4.2之相同方式進行Y型迷宮測試，以確定認知功能的恢復。
其結果為，在Tau-P301L小鼠之情況中，停留在A或C區的時間為約80秒鐘，其相較於正常小鼠，減少約25%。另一方面，在投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之情況中，停留在A或C區的時間為約120秒鐘，其類似於正常小鼠。由彼等結果確定，Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠之短期記憶能力恢復(圖43)。實驗例 13.3. 藉由水迷宮測試確定行為改進效果
以如實驗例4.3之相同方式進行水迷宮測試。
其結果為，在第5天，對停留在放置平台之NW區所花費的時間進行評估。其結果確定，Tau-P301L小鼠在NW區停留10秒鐘或更短的時間，而正常小鼠與投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L-ADEL-Y01m失智症小鼠在NW區停留25秒鐘或更短的時間(圖44)。實驗例 14. 確定在老年失智症小鼠模型中 ADEL-Y01m 抗體造成之 tau 蛋白病緩解 效果：腹腔投予
欲確定投予ADEL-Y01m抗體之後的tau蛋白病-緩解效果，提取腹腔投予50 mg/kg之量的IgG或ADEL-Y01m抗體之老年Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並通過西方墨點法，檢查完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及磷酸化之tau (pT231)的表現水平。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗pT231抗體(Thermo, MN1040)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果為，以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠之腦組織中觀察到完整tau蛋白、磷酸化之tau蛋白、及乙醯化之tau蛋白之寡聚體形式的表現水平增加。另一方面，相較於以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠的腦組織，以腹腔投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠腦組織中觀察到完整tau蛋白、磷酸化之tau蛋白、及乙醯化之tau蛋白的表現水平明顯減少(圖45至48)。
此外，提取以腹腔投予50 mg/kg之量的IgG或ADEL-Y01m抗體之老年Tau-P301L失智症小鼠與正常小鼠的腦組織，並以甲酸從其中部分分離出腦皮質組織。在腦皮質組織中，通過半變性 西方墨點法，檢查不溶性tau聚集體。在此，以如實驗例9中之相同方式進行半變性西方墨點法。
其結果為，以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠腦組織中觀察到不溶性tau聚集體的增加。另一方面，相較於以腹腔投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠的腦組織，以腹腔投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠的腦組織中觀察到不溶性tau聚集體的明顯減少(圖49)。III. 確定抗 tau 抗體之 Tau 種植 ( Tau seeding) 抑制效果 實驗例 15. 確定 Tau 聚集與乙醯化之 tau 蛋白之種植
首先，體外反應野生型Tau蛋白(Tau)與P300酵素(乙醯基轉移酶)。培養之神經細胞以經P300反應之乙醯化tau蛋白(Tau-K280-ac)處理。欲確定是否乙醯化之tau蛋白誘發細胞內聚集，以乙醯化之tau蛋白或野生型Tau蛋白進行處理，並在經過1小時或20小時後，以抗HA抗體(Sigma-Aldrich，#11867423001)對供體細胞裂解液進行西方墨點法。
在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、抗β-肌動蛋白抗體(Sigma，A5441)、抗HA抗體(Sigma，#11867423001)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。其結果為，以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞裂解液觀察到完整tau蛋白(Tau5)與乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的聚集增加  (圖50)。
此外，欲確定分泌至細胞外之tau蛋白的量是否改變，以抗HA抗體(Sigma-Aldrich，#11867423001)進行供體細胞培養基的免疫沉澱法，接著進行西方墨點法。
特別的是，以13,000 rpm將供體細胞培養基離心1分鐘，以移除細胞碎片。隨後，以蛋白G-瓊脂糖珠粒(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)處理供體細胞培養基，並使其在4°C下反應1小時。接下來，進行以1 µl之抗HA抗體處理，並使反應在4°C下進行隔夜。隔日，添加蛋白G-瓊脂糖珠粒，並使反應在4°C下進行1小時。隨後，在4°C下以6,000 rpm進行離心1分鐘，以收集樣本。每一樣本以含有0.1% Triton X-100之PBS清洗二次。以樣本緩衝液處理樣本，接著進行西方墨點法。在此，以如供體細胞裂解液進行之相同方式進行西方墨點法。
其結果為，以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞培養基中觀察到完整tau蛋白(Tau5)與乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的量增加(圖51)。
此外，以供體細胞培養基處理其他神經細胞(受體細胞)，當經過1小時或20小時後，收集受體細胞裂解液。利用tau抗體，進行每一樣本的西方墨點法。在此，以如實驗例1中之相同方式進行西方墨點法，並使用抗Tau5抗體(Invitrogen，AHB0042)、抗乙醯基-K280抗體(Anaspec，AS-56077)、抗β-肌動蛋白抗體(Sigma，A5441)、抗HA抗體(Sigma，#11867423001)、及HRP標記之抗小鼠IgG抗體(Bioxcell，BE0083)。
其結果為，以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞培養基(Tau-ac-HA)處理的受體細胞裂解液中觀察到tau蛋白聚集體(圖52與53)。實驗例 16. 確定 ADEL-Y01h 抗體造成之 tau 種植抑制效果：體外
欲確定ADEL-Y01h01_v01抗體造成之體外tau種植抑制效果，將阿茲海默氏症病患腦組織中之K280-ac蛋白片段(mAC)、其聚集體(aAC)、或Sarkosyl不溶部分投予tau-FRET穩定細胞系統，並測定tau種植之水平。Tau種植之細胞係分別以IgG與ADEL-Y01h01_v01抗體投予。隨後進行比較分析。
首先，欲用於處理細胞之K280-ac蛋白片段聚集體的製備如下。在溫度24°C下，將K280-ac蛋白片段(濃度25 μM)溶於25 mM DTT溶液中1小時，並將所得產物攪拌溶解於(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES，10 mM，pH 7.4)、NaCl (100 mM)、及肝素(25 mM)之溶液中，其係在37°C溫度下，以700 rpm之Eppendorf Thermomixer C進行。藉此，製備K280-ac蛋白片段之聚集體。
隨後，將HEK293 Tau RD P301S-FRET生物感應器(ATCC CRL-3275)分配於每孔3.5 × 104 個細胞的96孔培養盤中。在18小時後，確定是否每一培養孔中約60%塗覆HEK 293 Tau RD P301S-FRET生物感應器。隨後，將8.75 μl之OPTI-MEM、1.25 μl之Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、及K280-ac蛋白片段、其聚集體、或Sarkosyl不溶部分混合，並使混合物在室溫下反應20分鐘。隨後，每一孔以混合物進行處理，接著在溫度37°C下進行培養24小時。隨後，利用CLARIOstar® (BMG Labtech)儀器進行螢光波長分析。
其結果為，在投予ADEL-Y01h01_v01抗體之情況中，以K280-ac蛋白片段處理之細胞呈現集成式FRET密度的減少；且在投予ADEL-Y01h01_v01抗體之情況中，以K280-ac蛋白片段之聚集體處理的細胞亦呈現集成式FRET密度的減少(圖54)。此外，在投予ADEL-Y01h抗體之情況中，以阿茲海默氏症病患腦組織中之Sarkosyl不溶部分處理的細胞呈現集成式FRET密度的減少(圖55)。由彼等結果確定，在投予ADEL-Y01h01_v01抗體之情況中，抑制tau種植。實驗例 17. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之 tau 種植抑制效果：體內
欲確定ADEL-Y01m抗體造成之體內tau種植抑制效果，在開始以阿茲海默氏症病患之Sarkosyl不溶部分投予製備例3產生之Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層的前2週，預先靜脈注射IgG或ADEL-Y01m抗體。將Sarkosyl不溶部分投予Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層。接下來，在每隻小鼠犧牲時提取大腦組織，並將切片冷凍。大腦切片以抗AT8抗體進行免疫組織染色，並檢查tau種植的水平。
特別的是，將布拉克IV期(Braak stage IV)之阿茲海默氏症病患大腦組織中之Sarkosyl不可溶片段(3 µl，3.3 µg/µl)進行超因波震盪，並注射6個月大Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層(前後側：-1.9 mm，內外側：1.5 mm，左側：-1.8 mm)中。在投予Sarkosyl不可溶片段前之2週開始，以20 mg/kg/週之量的IgG或ADEL-Y01m抗體靜脈注射Tau-P301L失智症小鼠；且小鼠從投予Sarkosyl不可溶片段當週至第12週，以每週一次靜脈投予IgG或ADEL-Y01m抗體。在此，Sarkosyl不可溶片段以0.2 µl/min之速率注射，其係使用10 µl玻璃注射器(Hamilton，0.49 mm，Reno，NV)，並在等待5分鐘後取下針頭，以防止回流。在12週後，在每隻小鼠犧牲時提取大腦組織，並以Leica CM1860將其切成30 μm厚的冷凍切片。
針對免疫組織染色，每一大腦切片以緩衝液A (1% NGS，0.2% Triton X-100，及30% H2 O2 ，以及PBS)清洗。大腦切片以含有1% NGS與0.2% Triton X-100，以及IgG或ADEL-Y01m抗體之PBS進行處理，並使其在4°C下反應隔夜。大腦切片以PBS溶液清洗數次，接著在室溫下以二級抗體 (Vector Laboratories)反應1小時。隨後，大腦切片以Vectastain ABC套組(Vector Laboratories)進行免疫染色，且免疫染色係依據製造商之手冊進行。以ImageJ軟體(NIH，Bethesda，MD)分析經染色之大腦切片，並量化三個含有海馬迴的大腦切片。針對以抗AT8抗體染色之神經細胞，由三名盲測人員以實驗中使用之大腦切片進行評量，並在特定閾值水平時進行定量分析。取7隻投予了IgG之Tau-P301L失智症小鼠與8隻投予了ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠中介於Bregma -1.75與Bregma -2.25之間的三個大腦切片進行分析。利用t-檢定進行統計分析。
其結果為，相對於投予病患之不可溶片段，在投予IgG之Tau-P301L失智症小鼠中，大腦區域(皮質，海馬迴)中明顯觀察到神經細胞體的染色。另一方面，在投予ADEL-Y01m抗體之Tau-P301L失智症小鼠中，海馬迴與皮質中觀察到染色減少(圖56至59)。實驗例 18. 確定 ADEL-Y01m/ADEL-Y01h 抗體造成之 tau 聚集與種植抑制效果
欲確定ADEL-Y01m抗體造成之tau聚集抑制效果，進行體外tau聚集試驗。藉由在30℃溫度下與1.5 μg P300和1 mM乙醯基-CoA反應3小時，以體外產生乙醯化之K18蛋白片段。隨後，單體K18蛋白片段在室溫下與25 μM乙醯化之K18蛋白片段(K18-P301L)反應1小時。隨後，所得產物以25 mM 肝素57、HEPES (10 mM，pH 7.4)、及NaCl (100 mM)處理，並在700 rpm條件下攪拌，以誘發tau蛋白聚集。隨後，通過西方墨點法與硫代黃素-T試驗，以ADEL-Y01m抗體分析tau聚集體及其種植抑制效果。由硫代黃素-T試驗確定，相較於乙醯化之tau蛋白聚集之情況，乙醯化之tau蛋白的聚集體在進行ADEL-Y01h抗體處理之情況下受到抑制。
首先，針對纖維化反應，在37°C下，將10 M至20 M之乙醯化tau蛋白(2N4R)培養於溶液(於100 mM之醋酸鈉緩衝液(pH 7.0)中加入濃度2 mM之肝素(Sigma-Aldrich)與DTT)中。每一孔加入蛋白與ThT溶液(比率為1:1)。利用CLARIOstar® (BMG Labtech，Ortenberg，Germany)，在450 nm (激發)與510 nm (發射)波長下，測定不同時間點的ThT螢光分析。
以乙醯化蛋白之聚集體處理經培養之小鼠神經細胞，並進行西方墨點法以確定結果。
在該實驗中，以濃度3 μg/ml之單體K18-P301L、聚集之K18-P301L、或乙醯化之K18-P301L處理主要腦皮質神經元(DIV10) 24小時。在處理K18蛋白之前，神經元以3 μg/ml之ADEL-Y01m抗體預先處理30分鐘。
其結果為，觀察到許多tau聚集體進入神經細胞並誘發內生性tau蛋白的聚集；然而，經確定，在同時以ADEL-Y01m抗體處理之情況中，此現象減少(圖60與61)。實驗例 19. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之神經細胞保護效果
欲確定ADEL-Y01m抗體造成之神經細胞保護效果，在胚胎時期，首先從小鼠大腦中分離出腦皮質神經細胞。特別的是，在犧牲16天大之小鼠時提取大腦組織，並由其中分離出腦皮質。隨後，在不含鈣與鎂之漢氏平衡鹽液(HBSS)中解剖腦皮質組織，並在37°C下培養於0.125%胰蛋白酶溶液中15分鐘。處理含有20%胎牛血清之杜氏改良依氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)使胰蛋白酶失活，並以移液管將腦皮質組織粉碎。所得之細胞懸液以補充有B27補充劑(GibcoBRL)之NB培養基(神經基礎培養基)稀釋，並分配至以50 μg/ml之聚-D-離胺酸(Sigma)與1 μg/ml之層連結蛋白(laminin)(GibcoBRL)塗覆之培養盤上。神經細胞在37°C與5% CO2 之條件中培養10天。隨後，經培養之神經細胞以3 μg/ml之乙醯化K18蛋白片段聚集體與IgG或ADEL-Y01m抗體處理，並使其反應24小時。
在24小時後，收集上清液，並以細胞毒性檢測套組(LDH，Roche Applied Sciences)分析。針對量化細胞死亡之比色試驗，使用測定乳酸脫氫酶(LDH)活性之方法，該酵素從損壞之神經細胞細胞質中釋放至上清液。利用TecanInfinite® 200儀器，測量490 nm波長之吸光度。其結果以細胞存活百分比表示，並與陰性對照組(空白組)相比較。
此外，利用MTT (噻唑基藍四唑鎓溴化物，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)還原試驗測定細胞存活率。利用TecanInfinite® 200儀器，測量540 nm波長之吸光度，其結果以百分比表示，並與陰性對照組(空白組)相比較。
此外，實驗結果係於兩獨立培養基與6個培養孔之條件下取得，且所有數值皆以平均值± s.e.表示。統計分析係以單因子ANOVA伴隨Tukey's多重比較檢定進行。
其結果為，如圖62所示，在IgG處理之神經細胞中觀察到高的LDH活性。另一方面，相較於IgG處理之神經細胞，在ADEL-Y01m抗體處理之神經細胞中觀察到低的LDH活性。此外，如圖63所示，在IgG處理之神經細胞中觀察到存活率大大地減少。另一方面，相較於IgG處理之神經細胞，在ADEL-Y01m抗體處理之神經細胞中觀察到存活率明顯增加。由彼等結果確定，ADEL-Y01m抗體對乙醯化tau蛋白之聚集體造成之神經細胞損傷呈現保護效果。實驗例 20. 確定 ADEL-Y01m 抗體造成之微膠質細胞吞噬促進效果
欲確定ADEL-Y01m抗體造成之微膠質細胞l吞噬促進效果，首先從2至3天大小鼠之大腦皮質中分離出主要微膠質細胞，並依據McDonald DR等人於J Neurosci . 1997；17: 2284-94所述之方法培養。
隨後，在微膠質細胞l吞噬之分析方面，依據製造商之說明，以HiLyte™ Fluor 488標記乙醯化之K18蛋白片段。針對HiLyte™ Fluor 488標記之乙醯化K18蛋白之聚集，在37°C下分別將蛋白培養於含有肝素(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)與2 mM DTT之100 mM醋酸鈉緩衝液(pH 7.0)中，以便誘發其聚集。
微膠質細胞以每孔5×104 個細胞分配於12孔培養盤中，隨後在37°C下使乙醯化K18蛋白片段之聚集體(3 μg/ml)反應2小時。在以乙醯化K18蛋白片段之聚集體處理前30分鐘，預先處理濃度4.5 μg/ml之IgG或ADEL-Y01m抗體。在吞噬之分析方面，處理胰蛋白酶以分離細胞，接著以1%多聚甲醛(PFA)固定。針對流式細胞術，以含有200 μl之2%胎牛血清之HBSS溶液進行處理，並以FACSCanto™ II (BD Biosciences)儀器與488螢光濾膜進行分析。
其結果為，相較於IgG處理之微膠質細胞，以ADEL-Y01m抗體處理之微膠質細胞觀察到促進之吞噬作用(圖64)。統計分析
統計分析係利用GraphPad軟體(GraphPad Prism v7.0與GraphPad Prism v8.0，GraphPad Software，San Diego，CA，USA)進行。數據係以單因子ANOVA (Tukey's事後檢定)與Student's t-檢定分析。將P值小於0.05視為具有顯著差異。 [登錄號] 保管機構名稱：Korean Collection for Type Cultures (KCTC) 登錄號：KCTC14155BP 登錄日期：2020年3月18日
圖1顯示本發明實施例中製備之K280-ac tau蛋白片段示意圖。
圖2顯示本發明實施例中使用之pET-21b-Tau (K18)表現載體示意圖。
圖3顯示通過西方墨點法，確定抗體與K280-ac (其為蛋白片段)間之結合，以選擇可特異性結合K280-ac的單株抗體。
圖4顯示通過ELISA，確定抗體與K280-ac (其為蛋白片段)間之結合，以選擇可特異性結合K280-ac的單株抗體。
圖5顯示以野生型tau蛋白(Tau)與tau蛋白(Tau K280A)(其中第280胺基酸離胺酸係經丙胺酸取代)進行乙醯化，接著確定是否所選擇之ADEL-Y01抗體與tau蛋白之每一者結合取決於乙醯化。
圖6顯示確定野生型tau蛋白與ADEL-Y01h_v01抗體之特異性結合取決於野生型tau蛋白之乙醯化。
圖7顯示利用Octet® K2系統，測定解離常數(Kd)值，以確定ADEL-Y01m抗體與K280-ac (其為蛋白片段)間之親和力。
圖8顯示通過ELISA，確定ADEL-Y01h 抗體(v01至v12)與K280-ac (其為蛋白片段)每一者間之結合。
圖9顯示4個月大或12個月大之正常小鼠(野生型)與失智症小鼠(Tau P301L)腦組織中tau蛋白(Tau5)與乙醯化tau蛋白(Tau-acK208)的表現水平與樣貌。
圖10顯示用於確定失智症誘發之小鼠模型在腦室投予ADEL-Y01m抗體後達到行為改進效果的實驗時間表。
圖11顯示失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行築巢測試所得之結果(*** p＜0.001)。
圖12顯示失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行Y型迷宮測試所得之結果(* p＜0.05)。
圖13顯示失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行水迷宮測試所得之結果。
圖14顯示失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行水迷宮測試時在每一區的停留時間(** p＜0.01)。
圖15顯示失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行握力測試所得之結果(* p＜0.05，** p＜0.01)。
圖16顯示用於確定失智症誘發之小鼠模型在腹腔投予ADEL-Y01m抗體後達到行為改進效果的實驗時間表示意圖。
圖17顯示失智症誘發之小鼠模型以腹腔投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行築巢測試所得之結果(* p＜0.05，** p＜0.01)。
圖18顯示失智症誘發之小鼠模型以腹腔投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行Y型迷宮測試所得之結果(* p＜0.05)。
圖19顯示失智症誘發之小鼠模型以腹腔投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行水迷宮測試所得之結果。
圖20顯示失智症誘發之小鼠模型以腹腔投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行水迷宮測試時在每一區的停留時間(* p＜0.05)。
圖21顯示通過免疫沉澱法與西方墨點法，確定正常小鼠(野生型)或失智症誘發之小鼠模型(Tau P301L)大腦皮質與海馬廻組織中表現之ADEL-Y01m抗體與乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)間之結合。
圖22顯示正常老年人腦組織與阿茲海默氏症病患腦組織在以ADEL-Y01m抗體進行免疫組織化學染色之後拍攝的照片。
圖23A顯示確定正常老年人腦組織或阿茲海默氏症病患腦組織中完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及β-類澱粉蛋白的表現水平。
圖23B顯示確定正常老年人腦組織或阿茲海默氏症病患腦組織中表現之乙醯化tau蛋白與ADEL-Y01m抗體間之結合(* p＜0.05)。
圖24顯示確定正常小鼠之腦組織、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型中完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及磷酸化之tau蛋白(pSer396)的表現水平。
圖25顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型腦組織中完整tau蛋白(Tau5)的表現水平(* p＜0.05，*** p＜0.001)。
圖26顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型腦組織中磷酸化之tau蛋白(pSer396)的表現水平(** p＜0.01)。
圖27顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的表現水平。
圖28顯示以正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型的腦組織(Tau-P301L-ADEL-Y01m) 使用ADEL-Y01m抗體進行免疫組織化學染色的照片。
圖29顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型(Tau-P301L-ADEL-Y01m)之腦組織中AT8與磷酸化之tau蛋白(pT231)的表現水平(* p＜0.05)。
圖30顯示確定正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型(Tau-P301L-ADEL-Y01m)之腦組織中完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及磷酸化之tau蛋白(pT231)的表現水平。
圖31顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中完整tau蛋白(Tau5)的表現水平(* p＜0.05)。
圖32顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的表現水平(* p＜0.05)。
圖33顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中磷酸化之tau蛋白(pT231)的表現水平(* p＜0.05)。
圖34顯示正常小鼠之腦組織、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型中突觸相關蛋白(PSD95與突觸素-1)的表現水平。
圖35顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中PSD95的表現水平(* p＜0.05)。
圖36顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腦室投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中突觸素-1的表現水平(* p＜0.05)。
圖37顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中突觸相關蛋白(PSD95與突觸素-1)的表現水平。
圖38顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中PSD95的表現水平(* p＜0.05)。
圖39顯示正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型之腦組織中突觸素-1的表現水平(* p＜0.05)。
圖40顯示確定ADEL-Y01m抗體是否滲透正常小鼠、失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之失智症誘發之小鼠模型的腦組織，以及是否抗體結合tau蛋白。
圖41顯示用於確定老年失智症誘發之小鼠模型在腦室投予ADEL-Y01m抗體後達到行為改進效果的實驗時間表示意圖。
圖42顯示老年失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行築巢測試所得之結果(* p＜0.05)。
圖43顯示老年失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行Y型迷宮測試所得之結果(* p＜0.05)。
圖44顯示老年失智症誘發之小鼠模型以腦室投予ADEL-Y01m抗體且隨後進行水迷宮測試時在每一區的停留時間(* p＜0.05)。
圖45顯示確定正常小鼠、老年失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之老年失智症誘發之小鼠模型之腦組織中完整tau蛋白(Tau5)、乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)、及磷酸化之tau蛋白(pT231)的表現水平。
圖46顯示確定正常小鼠、老年失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之老年失智症誘發之小鼠模型之腦組織中完整tau蛋白(Tau5)的表現水平(* p＜0.05，** p＜0.01)。
圖47顯示確定正常小鼠、老年失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之老年失智症誘發之小鼠模型之腦組織中乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的表現水平(** p＜0.01)。
圖48顯示確定正常小鼠、老年失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之老年失智症誘發之小鼠模型之腦組織中完整磷酸化之tau蛋白(pT231)的表現水平(* p＜0.05)。
圖49顯示針對每一分液，確定正常小鼠、老年失智症誘發之小鼠模型、及腹腔投予ADEL-Y01m抗體之老年失智症誘發之小鼠模型之大腦皮質中的不溶性tau聚集體。
圖50顯示藉由處理乙醯化之tau蛋白，將供體細胞溶解，且隨後通過西方墨點法，確定血球凝集素(HA)、完整tau蛋白(Tau5)、及乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的表現水平。
圖51顯示取得以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞之培養基，且隨後通過西方墨點法，確定血球凝集素(HA)、完整tau蛋白(Tau5)、及乙醯化之tau蛋白(Tau-acK280)的表現水平。
圖52顯示以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞之培養基處理神經細胞，當經過1小時或20小時，將細胞溶解，且隨後通過西方墨點法，確定細胞內之tau蛋白聚集體。
圖53顯示以乙醯化之tau蛋白處理之供體細胞之培養物處理神經細胞，當經過1小時或20小時，將細胞溶解，且隨後通過西方墨點法與免疫沉澱法，以確定細胞內之tau蛋白聚集體。
圖54顯示以K280-ac (其為蛋白片段)或其聚集體及ADEL-Y01h01_v01抗體處理Tau-RD-P301S FRET生物感應器細胞，且隨後利用FRET，確定其tau蛋白之種植抑制效果(** p＜0.01，*** p＜0.001)。
圖55顯示以阿茲海默氏症病患之Sarkosyl不溶部分與ADEL-Y01h01_v01抗體處理Tau-RD-P301S FRET生物感應器細胞，且隨後確定tau蛋白種植之抑制作用(** p＜0.01)。
圖56顯示將源自阿茲海默氏症病患之Sarkosyl不溶部分投予Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層，且隨後以抗AT8 抗體免疫染色提取之腦組織(Ipsi：同側，Contra：對側)的照片。
圖57顯示將源自阿茲海默氏症病患之Sarkosyl不溶部分投予Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層，且隨後以抗AT8 抗體免疫染色提取之腦組織(DG：齒狀迴，EC：內嗅皮質)的照片。
圖58與59顯示將源自阿茲海默氏症病患之Sarkosyl不溶部分投予Tau-P301L失智症小鼠左海馬迴之CA1層，以抗AT8 抗體染色提取之腦組織，且隨後測定染色程度(* p＜0.05，** p＜0.01)。
圖60顯示以IgG或ADEL-Y01m抗體處理乙醯化之tau蛋白，且隨後通過硫代黃素-T分析，確定乙醯化之tau蛋白聚集的變化。
圖61顯示以ADEL-Y01m抗體處理tau蛋白(K18)、乙醯化之tau蛋白(K18 + P300)、及聚集之乙醯化之tau蛋白(K18 + P300 + 肝素)，且隨後確定聚集之乙醯化之tau蛋白量的變化(Tau-acK280)。
圖62顯示以乙醯化之tau蛋白聚集體處理IgG或ADEL-Y01m抗體處理之小鼠衍生之神經細胞，且隨後測定上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性(*** p＜0.001)。
圖63顯示以乙醯化之tau蛋白聚集體處理IgG或ADEL-Y01m抗體處理之小鼠衍生之神經細胞，且隨後測定神經細胞的存活率(*p＜0.05，***p＜0.001)。
圖64顯示以HiLyte™ Fluor 488標記之乙醯化之tau蛋白聚集體處理IgG或ADEL-Y01m抗體處理之小鼠衍生之微膠質細胞，且隨後測定微膠質細胞之HiLyte™ Fluor 488的螢光。
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Claims (17)

  1. 一種抗tau抗體或其抗原結合片段，其包含： 一重鏈可變區(VH)，其包括一具有由SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的重鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的重鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的重鏈CDR3；以及 一輕鏈可變區(VL)，其包括一具有由SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列的輕鏈CDR1；一具有由SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及一具有由SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  2. 如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包括選自於由SEQ ID NOs: 7至11所組成群組之任一胺基酸序列，且該輕鏈可變區包括選自於由SEQ ID NOs: 12至15所組成群組之任一胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係選自於下列群組之任一者： 包含一具有由SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段； 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段；以及 包含一具有由SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列的重鏈可變區與一具有由SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗tau抗體或其抗原結合片段。
  4. 如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段，其中該片段為選自於由Fab、scFv、F(ab')2 、及Fv所組成群組之任一者。
  5. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段。
  6. 一種表現載體，其包含： 如請求項5之多核苷酸。
  7. 一種宿主細胞，其包含： 如請求項6之 表現載體。
  8. 一種用於產生如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段的方法，其包含： 一培養如請求項7之宿主細胞的步驟。
  9. 一種多核苷酸，其編碼一抗體之重鏈或輕鏈，該抗體包括如請求項2所述之重鏈可變區與輕鏈可變區。
  10. 一種具有登錄號KCTC 14155BP的融合瘤。
  11. 一種用於預防或治療退化性神經疾病的藥學組成物，其包含作為活性成分的： 如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段。
  12. 如請求項11之藥學組成物，其中該退化性神經疾病為tau蛋白介導之神經疾病。
  13. 如請求項12之藥學組成物，其中該tau蛋白介導之神經疾病為tau蛋白病、原發性年齡相關性tau蛋白病、慢性創傷性腦病、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、額顳失智症、利蒂科-博迪格疾病(Lytico-Bodig disease)、巴金森氏症、亞急性硬化性腦膜炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、神經膠質瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病(meningioangiomatosis)、亞急性硬化性泛腦炎、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、或脂褐質症。
  14. 如請求項13之藥學組成物，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏症(AD)、進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底核退化症(CBD)、匹克症(Pick’s disease，PiD)、一群統稱為連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)的疾病、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease，CJD)、拳擊手型失智症(DP)、吉斯曼-史特斯勤-先克症 (Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease，GSSD)、路易體症(Lewy body disease)、慢性創傷性腦病 (CTE)、或亨汀頓氏症(Huntington’s disease)。
  15. 如請求項11之藥學組成物，其中該藥學組成物係通過選自於由腦內、腦室、腹腔、經皮、肌肉、硬腦膜、靜脈、皮下、及鼻腔投予途徑所組成群組之任一途徑投予。
  16. 一種用於診斷退化性神經疾病的組成物，其包含： 如請求項1之抗tau抗體或其抗原結合片段。
  17. 一種用於預防、治療、或診斷退化性神經疾病的套組，其包含： 如請求項1之抗體或其抗原結合片段、如請求項5之多核苷酸、如請求項6之表現載體、或如請求項7之宿主細胞。
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