JP3914342B2 - ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する医薬組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫細胞を媒介する疾病の治療用医薬組成物に関し、詳しくは、ｇｐ３４抗原に対して結合し、ｇｐ３４抗原、ＯＸ４０抗原膜蛋白質間の有する生物活性を阻害する能力を有する物質を有効成分とする医薬組成物に関するものであり、より詳細には、ｇｐ３４を介する細胞情報伝達機構に関与しリウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に対する治療作用を有する新規な医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトｇｐ３４抗原は、サイトカインとして分類される腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称する。）リガンドファミリーに属し、当初ヒトＴ細胞白血病ウイルス（以下ＨＴＬＶ−Ｉと称する。）由来転写活性化因子ｐ４０Ｔａｘにより誘導される３４キロダルトンのＴ細胞膜糖蛋白質として同定され、現在ではそのアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Tanakaら：Int. J. Cancer 36, 549(1985),Miuraら：Mol. Cell. Biol. 11, 1313(1991)）。一方、ＯＸ４０抗原はラットの活性化Ｔ細胞抗原として同定された（Patersonら：Mol. Immunol. 24, 1281(1987)）。その後、このｇｐ３４抗原が、ＯＸ４０抗原とリガンドとリセプターの関係にあることがヒト及びマウスにおいて明らかになり、マウスのｇｐ３４のアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Godfreyら：J. Exp. Med. 180, 757(1994)、Baumら：EMBO J. 13, 3992(1994)）。また、本ＯＸ４０抗原が、多発性硬化症、リウマチ、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に含まれる自己免疫として働く活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現しており、これらのＯＸ４０抗原を認識する物質に細胞毒素を結合させてこの自己を攻撃する活性化した状態のＣＤ４陽性Ｔ細胞を特異的に消滅させることにより治療方法として有効であると期待されることが、ラットを用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下ＥＡＥと称する。）実験によって検討され、特許出願及び報告がなされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251、Weinbergら：Nature Med. 2, 183(1996)）。当該報告には、ＣＤ４陽性活性化細胞の中の自己反応性を持つ活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の中にＯＸ４０陽性細胞群があり、それらに対する抗ＯＸ４０免疫療法が、急性あるいは慢性のＣＤ４陽性Ｔ細胞を媒介する自己免疫疾患に処置することに効果があるだろうと記載されている。しかし、この報告では、このＯＸ４０の発現はあくまでも自己免疫疾患に関係する細胞の目印であり、標的となる活性化Ｔ細胞を消滅させることによる治療効果を述べている。この治療方法では、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らかでなく、細胞毒素を結合しなかった抗ＯＸ４０抗体の単独添加が、病態悪化の原因に関係する活性化ＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞の細胞増殖を抑制しなかったことを報告している。また、ＥＡＥにおいて、細胞毒素を結合させた抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナル抗体ではその病態評価点数の上昇が阻害されたと報告されているが、同時に検討された抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナル抗体のみの投与群での効果は陰性対照と同様に述べられていない。これらのことからも、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らかでなかった。また、活性化Ｔリンパ球細胞による媒介が考えられる疾患について、その患者の生検標本を調べることによる患者の炎症症状を検出する方法についても、特許出願がされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251）。
【０００３】
以上述べたとおり、ｇｐ３４とＯＸ４０の機能は、一部分しか明らかになっておらず、ｇｐ３４とＯＸ４０の関係と種々の自己免疫疾患における役割は現在まで全く明らかにされていない。抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体によりこの２分子間で媒介される機能をｇｐ３４側において特異的に阻害することも全く予測されていない。即ち、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病の治療に効果があるかどうかと言うことは不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リウマチあるいは、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病に対する治療剤としてヒトｇｐ３４結合阻害物、詳しくは抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する新規な医薬組成物、及びｇｐ３４に対する結合、特にＯＸ４０に対する結合を阻害することにより、免疫或いは自己免疫疾患を治療する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトｇｐ３４に結合するヒト化モノクローナル抗体と同様の性質を有すると考えられる抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体を取得した。そして、倫理上ヒトｇｐ３４を用いてのリウマチ患者及び多発性硬化症での実験は出来ないため、得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体をコラーゲン関節炎惹起モデルマウス及び実験的自己免疫性脳脊髄炎惹起モデルマウスに投与することにより、リウマチモデル及び多発性硬化症モデルでの病態発症が抑制されることを確認した。本知見は、ＯＸ４０陽性な活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０とｇｐ３４の結合が、リウマチ等の自己免疫疾患を惹起していることを初めて示すものである。本知見は、マウスを用いた実験により得られたものであるが、ｇｐ３４とＯＸ４０とがリガンドとリセプタ−の関係にあることなど、マウスｇｐ３４及びマウスＯＸ４０とヒトｇｐ３４及びヒトＯＸ４０の性質が共通していることからして、マウスでの効果は、ヒトの場合にも当然あるべきものと考え得る。即ち、ヒトｇｐ３４に結合性を有するモノクローナル抗体は、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に対する治療剤とし有効であることが、本知見より一義的に導かれる。
【０００６】
即ち、本発明は、ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物、或いはｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する免疫疾患治療用医薬組成物である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ｇｐ３４結合阻害物とは、ｇｐ３４との結合を阻害しリガンドとリセプタ−の細胞情報伝達を阻害するものであり特にｇｐ３４側に作用し結合を阻害するものである。ｇｐ３４に結合するものとしては特にＯＸ４０が代表的である。ｇｐ３４結合阻害物とは例えばｇｐ３４に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体である。本発明に係るモノクローナル抗体は、例えばラットモノクローナル抗体を含む他種の動物由来で作製した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体の定常部位を組み換えて各種公知の方法を用いてキメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製することにより取得できる。
【０００８】
ヒト及びマウスのｇｐ３４はそのアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を含めて公知である。故に、これらに対するモノクローナル抗体を産生する細胞、特にハイブリドーマは通常知られている方法により作製することが可能であり、該細胞を用いて抗ｇｐ３４モノクローナル抗体を生産することも可能である。
【０００９】
本発明に係るモノクローナル抗体の生産は、例えば上記の抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体を産生する細胞株を各種公知の方法を用いて培養し、得られた粗抗体を精製すればよく、細胞の増殖及び抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体の産生を阻害しない方法であれば特に制限はない。本発明の組成物は、ｇｐ３４モノクロ−ナル抗体等のｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有するものであり、その他医薬的に許容される添加物を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、移植片対宿主病等の免疫疾患、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患の患者に投与される。
【００１０】
【実施例】
以下実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
実施例１ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の作製
ａ）マウスｇｐ３４の免疫
マウスｇｐ３４遺伝子は、ＣｏｎＡ刺激を加えたマウス脾臓細胞から抽出したＲＮＡから逆転写酵素を用いクロ−ニングした（Baumら：EMBO J. 13, pp.3992-4001,(1994)）。このマウスｇｐ３４遺伝子断片をＢＣＭＧＳＮｅｏプラスミド（Karasuyamaら：J. Exp. Med. 172, 969,(1990)）中に導入し、ＢＣＭＧＳＮｅｏ−ｍｇｐ３４プラスミドを作製した。次に、このプラスミドをＷＫＡ／ＨｏｃラットＴ細胞株ＴＡＲＴ−１（Tatenoら：J. Exp. Med. 159, 1105(1984)）に、エレクトロポレ−ション法により遺伝子導入した。その後、ネオマイシン耐性により耐性細胞株を選抜した。マウスｇｐ３４遺伝子の発現は選抜した細胞株より抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認しマウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ−ｍｇｐ３４を得た。本マウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ−ｍｇｐ３４を、８週齢ウィスタ−ラット（日本エス・エル・シ−社製）の後肢肉丘部分に１×１０8個づつ２週間毎に７度植え込み免疫した。その後、最終免疫日から３日後に、このラットから脾臓を取り出した。取り出した脾臓細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬製）により３度洗浄した。また、マウスミエロ−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Schulmanら：Nature 276, 269(1978)）を対数増殖期になるように細胞増殖させＲＰＭＩ−１６４０培地により３度洗浄した。マウスミエロ−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を１：３になるように混和し１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上清を除いた。沈殿した細胞に、３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）液１ｍｌを１分間かけて撹拌しながらゆっくり加え、更に１分間ゆっくり撹拌した。さらに３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくりと静かに撹拌しながら加えた。再度、３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくりと静かに撹拌しながら加えた。さらに、３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地７ｍｌを３分間かけて静かに撹拌しながら加えた。室温で、１０００ｒｐｍ、５分間遠心沈降し、上清を取り除いた。細胞濃度が、５×１０6個／ｍｌになるように３７℃に暖めておいた１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと称する。）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、静かに撹拌し細胞を浮遊させた。浮遊細胞を９６穴の培養プレ−トに、各ウェルあたり５０μｌずつ分注し細胞培養装置で一晩培養した。翌日に、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、１５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）を１００μｌずつ添加した。その後、細胞の増殖状態を観察しながら、１００μｌずつＨＡＴ培地に交換した。このような中、増殖してくる融合細胞をハイブリドーマとして作製した。
【００１１】
ｂ）抗体産生の確認
上記ａ）で作製したハイブリド−マを培養し、培養開始から１２日後に全ての培養上清を回収した。その上清中の抗体活性を、マウスｇｐ３４遺伝子を導入し発現させたマウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４とその親細胞株マウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７（Kondoら：SCIENCE 262, 1874(1993)）をそれぞれ抗原発現細胞及びその陰性対照細胞として用いラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと称する。）により測定した。ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４、ＢＷ５１４７を培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し９６穴Ｕ底プレートにそれぞれ１×１０6個づつ細胞を播種した。これに、４０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加し混合した。この９６穴Ｕ底プレートを氷上で３０分間保温し抗原とよく反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）を用いて細胞を２度洗浄した。遠心分離によりペレットとした細胞塊にＩ125放射性ヨード標識抗マウスイムノグロブリンＧヒツジ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を３０μｌ添加しさらに氷上で３０分間反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）を用いて細胞を３度洗浄した。乾燥器を用い９０℃で１０分間乾燥させて水分を蒸発させた。その後、９６穴Ｕ底プレートを１穴づつハサミにより切り分けてガンマー線測定器（アロカ社製、ＡＲＣ６００）により測定した。ガンマー線検出の値において、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞を用いたもので１０００以上、ＢＷ５１４７細胞を用いたもので５０前後と差の認められたハイブリドーマ培養上清を陽性穴とし、再現性を確かめた。抗体活性の確認できた細胞については、限界希釈法によるクローニングを行った。その結果、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を取得した。
得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株のうち代表的な株であるＴＯＬ−１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０９にて、茨城県つくば市東１丁目１番１号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１０年９月１８日より寄託されている。
【００１２】
ｃ）抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（日本エス・エル・シ−社製）に０．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を１日目と７日目の２度腹腔内に投与した。２度目の投与３日後に、２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した上記取得のハイブリドーマ株ＴＯＬ−１を一匹当たり１０8個腹腔内投与した。そして、２週間後に腹水を回収した。回収した腹水には、終濃度が０．０２％になるようにアジ化ナトリウムを添加し室温で一晩放置した。翌日放置した腹水を４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し上清を回収した。この培養上清を、直径０．４５μｍのフィルターに通した後、プロテインＡカラムキット（バイオラッド社製）にかけイムノグロブリン画分を回収した。この回収溶液に対し、５０％飽和硫酸アンモニウム（和光純薬社製）分画を行った後、生理的濃度のＰＢＳ（−）に再溶解した。これを、ＰＢＳ（−）に対して透析処理後、０．２μｍのフィルターにより濾過し無菌処理した後、以降の実験に使用した。
【００１３】
実施例２ フローサイトメーター解析による抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウスｇｐ３４抗原結合性の確認
マウスｇｐ３４抗原に結合するヒトＯＸ４０細胞外領域とヒトイムノグロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（以下ｓｈＯＸ４０−Ｆｃと称する。米Ｉｍｍｕｎｅｘ社より供与）を用いてマウスｇｐ３４抗原を発現しているＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に対する結合性を検討した。１．５ｍｌマイクロチューブに１×１０6個の細胞を回収し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿させた。その沈殿細胞に、０．５％仔牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称する。）含有ＰＢＳ（−）５００μｌを添加し洗浄した。再度、５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿させた。その後、これらの細胞を３μｌヒト血清、１６μｌ０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）に懸濁して、４℃、３０分間保温した。さらに、それらのチュ−ブの一方にｓｈＯＸ４０−Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）２０μｌを添加・懸濁し、４℃、３０分間保温させ、マウスｇｐ３４とヒトＯＸ４０を結合させた。再度、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌを添加し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離により２度洗浄した。それらのチューブにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣと称する。）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）（２５μｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加・懸濁し、４℃、２０分間保温した。そして、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌに懸濁しＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンデイッキンソン社製）によりフローサイトメーター解析を行った。
その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃのみがマウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に結合した。このことから、ＢＷ５１４７細胞でのマウスｇｐ３４の発現が確認できた（図１（図１））。
次に、本マウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応系に１０μｇ／ｍｌとなるように実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体を添加し反応させた。そして、フローサイトメーター解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃと結合することにより標識されたＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞の蛍光強度が抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の添加により低下した。このことより、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞とｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応が抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体により阻害されることが明らかになった（図２（図２））。
【００１４】
実施例３ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎モデルに対する有効性の検討
自己免疫疾患の一つであるヒトリウマチのモデル・ウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎に対する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。
７週齢で購入した雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本エス・エル・シ−社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すように、コラーゲン関節炎を誘導した。ウシ関節由来Ｋ４２タイプ２コラーゲン（コラーゲン技術研修会製）を０．３％酢酸水溶液に溶解し４ｍｇ／ｍｌとした。等量のフロイントコンプリートアジュバント（和光純薬工業社製）を加え氷中で超音波破砕装置を用いてミセル化した。このコラーゲン２００μｇ当量のコラーゲン液１００μｌをマウス尾根部に皮内投与した。さらに、初期感作後２１日目に再度尾根部に同量のコラーゲン液を投与し追加感作した。
抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与については、追加感作のコラーゲン投与開始後、３０ｍｇ／ｋｇ重の抗体量で１週間に５回ずつ４週間腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分を同量同様に投与した。試験及びコントロールをそれぞれ８個体ずつ供試した。
関節炎症状の評価は、以下のような５段階の判定を行い、四肢合わせて最高１６点として行った。関節炎点数をつけ経時的に行った。
０点：症状なし
１点：四肢のうち指などの小関節が１本のみ腫脹発赤
２点：小関節２本以上、あるいは手、足首の比較的大きな関節が腫脹発赤
３点：１本の手、足全体が発赤腫脹
４点：さらにその１本の手、足の腫脹発赤が最大限に達している
但し、マウスの関節炎の症状は１本の手、足の腫脹発赤が最大に達しその後腫脹が徐々に衰退して関節が変形剛直化する場合が多かった。この場合その後の症状の改善を判断できなかったので、評価点数を３とした。
その結果、図３（図３）に示すとおり、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリンＧ投与群に比べコラーゲン関節炎の病態発症が抑制された。
【００１５】
実施例４ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する有効性の検討
自己免疫疾患の一つであるヒト多発性硬化症のモデル・実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。
９〜１４週齢で購入した雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（ゴキタブリーディングサービス社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すように、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。１５０μｌＰＢＳ（−）中に溶解したプロテオリピッドタンパク質（以下ＰＬＰと称する。サワディーテクノロジー社製）２００μｇと等量のフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン株式会社製）を加え、連結針を用いてミセル化しＰＬＰ乳化液を作製した。このＰＬＰ２００乳化液３００μｌを後２肢肉丘部分と尾根部４箇所に試験開始日に皮下投与した。さらに、初期感作７日後に再度同量のＰＬＰ乳化液を投与し、追加感作した。この間、２００μｌＰＢＳ（−）中に溶解した百日咳毒素（Bordetella pertussis toxin、Sigma社製）３００ｎｇを試験開始日および試験開始２日後に腹腔内投与した。実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与については、５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で初回感作のＰＬＰ乳化液投与開始から２日毎に８回１４日後まで腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分の同量を同様に投与した。試験群及びコントロール群のそれぞれに４個体ずつ供試した。
実験的自己免疫性脳脊髄炎症状の評価は、以下のような６段階の判定を行い、最高５点として行った。
０点：症状なし
１点：尾の緊張低下
２点：軽度な後肢の不全対麻痺および運動失調
３点：重度な後肢の不全対麻痺および運動失調
４点：四肢麻痺
５点：実験的自己免疫性脳脊髄炎による死亡
但し、それぞれの群において実験的自己免疫性脳脊髄炎によって死亡した動物については、試験終了まで評価点数を５点とした。
その結果を図４（図４）に示す。各群の評価点数を平均して示した抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリンＧ投与群に比べ実験的自己免疫性脳脊髄炎の病態発症が抑制された。
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、マウスｇｐ３４に対して結合しマウスＯＸ４０との結合を阻害する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体がリウマチ疾患のモデルであるウシタイプ２コラーゲン関節炎の発症と多発性硬化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症を抑制することが明らかになった。そこで、ヒト化した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体を用いることにより、少なくとも現在知られている免疫細胞を含めたｇｐ３４とＯＸ４０の両膜結合型蛋白質を通して行う両抗原の細胞情報伝達を阻害することにより、リウマチを含めた多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患、および移植片対宿主病に対する予防、治療効果が期待できる。このような特性から、本発明により提供される抗ヒトｇｐ３４モノクローナルヒト化抗体を含有する医薬組成物は、ヒト自己免疫疾患に対する有用な薬剤となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスｇｐ３４発現細胞に対するｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合特異性を示す図である。
【図２】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウスｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合阻害を示す図である。白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加前の蛍光強度を、黒塗りの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加後の蛍光強度を示す。
【図３】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン関節炎発症抑制の有効性を示す図である。コラ−ゲン関節炎誘導後の個々の検体における関節炎評価点数の経時変化である。図中、各シンボルは一頭一頭の個体を示している。
【図４】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の実験的自己免疫性脳脊髄炎発症抑制の有効性を示す図である。実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導後の各群の検体における実験的自己免疫性脳脊髄炎評価点数の平均値の経時変化である。図中、白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体投与群を、黒塗りの部分は、ラットイムノグロブリンＧ投与群を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫細胞を媒介する疾病の治療用医薬組成物に関し、詳しくは、ｇｐ３４抗原に対して結合し、ｇｐ３４抗原、ＯＸ４０抗原膜蛋白質間の有する生物活性を阻害する能力を有する物質を有効成分とする医薬組成物に関するものであり、より詳細には、ｇｐ３４を介する細胞情報伝達機構に関与しリウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に対する治療作用を有する新規な医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトｇｐ３４抗原は、サイトカインとして分類される腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称する。）リガンドファミリーに属し、当初ヒトＴ細胞白血病ウイルス（以下ＨＴＬＶ−Ｉと称する。）由来転写活性化因子ｐ４０Ｔａｘにより誘導される３４キロダルトンのＴ細胞膜糖蛋白質として同定され、現在ではそのアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Tanakaら：Int. J. Cancer 36, 549(1985),Miuraら：Mol. Cell. Biol. 11, 1313(1991)）。一方、ＯＸ４０抗原はラットの活性化Ｔ細胞抗原として同定された（Patersonら：Mol. Immunol. 24, 1281(1987)）。その後、このｇｐ３４抗原が、ＯＸ４０抗原とリガンドとリセプターの関係にあることがヒト及びマウスにおいて明らかになり、マウスのｇｐ３４のアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Godfreyら：J. Exp. Med. 180, 757(1994)、Baumら：EMBO J. 13, 3992(1994)）。また、本ＯＸ４０抗原が、多発性硬化症、リウマチ、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に含まれる自己免疫として働く活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現しており、これらのＯＸ４０抗原を認識する物質に細胞毒素を結合させてこの自己を攻撃する活性化した状態のＣＤ４陽性Ｔ細胞を特異的に消滅させることにより治療方法として有効であると期待されることが、ラットを用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下ＥＡＥと称する。）実験によって検討され、特許出願及び報告がなされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251、Weinbergら：Nature Med. 2, 183(1996)）。当該報告には、ＣＤ４陽性活性化細胞の中の自己反応性を持つ活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の中にＯＸ４０陽性細胞群があり、それらに対する抗ＯＸ４０免疫療法が、急性あるいは慢性のＣＤ４陽性Ｔ細胞を媒介する自己免疫疾患に処置することに効果があるだろうと記載されている。しかし、この報告では、このＯＸ４０の発現はあくまでも自己免疫疾患に関係する細胞の目印であり、標的となる活性化Ｔ細胞を消滅させることによる治療効果を述べている。この治療方法では、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らかでなく、細胞毒素を結合しなかった抗ＯＸ４０抗体の単独添加が、病態悪化の原因に関係する活性化ＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞の細胞増殖を抑制しなかったことを報告している。また、ＥＡＥにおいて、細胞毒素を結合させた抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナル抗体ではその病態評価点数の上昇が阻害されたと報告されているが、同時に検討された抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナル抗体のみの投与群での効果は陰性対照と同様に述べられていない。これらのことからも、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らかでなかった。また、活性化Ｔリンパ球細胞による媒介が考えられる疾患について、その患者の生検標本を調べることによる患者の炎症症状を検出する方法についても、特許出願がされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251）。
【０００３】
以上述べたとおり、ｇｐ３４とＯＸ４０の機能は、一部分しか明らかになっておらず、ｇｐ３４とＯＸ４０の関係と種々の自己免疫疾患における役割は現在まで全く明らかにされていない。抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体によりこの２分子間で媒介される機能をｇｐ３４側において特異的に阻害することも全く予測されていない。即ち、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病の治療に効果があるかどうかと言うことは不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リウマチあるいは、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病に対する治療剤としてヒトｇｐ３４結合阻害物、詳しくは抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する新規な医薬組成物、及びｇｐ３４に対する結合、特にＯＸ４０に対する結合を阻害することにより、免疫或いは自己免疫疾患を治療する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトｇｐ３４に結合するヒト化モノクローナル抗体と同様の性質を有すると考えられる抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体を取得した。そして、倫理上ヒトｇｐ３４を用いてのリウマチ患者及び多発性硬化症での実験は出来ないため、得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体をコラーゲン関節炎惹起モデルマウス及び実験的自己免疫性脳脊髄炎惹起モデルマウスに投与することにより、リウマチモデル及び多発性硬化症モデルでの病態発症が抑制されることを確認した。本知見は、ＯＸ４０陽性な活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０とｇｐ３４の結合が、リウマチ等の自己免疫疾患を惹起していることを初めて示すものである。本知見は、マウスを用いた実験により得られたものであるが、ｇｐ３４とＯＸ４０とがリガンドとリセプタ−の関係にあることなど、マウスｇｐ３４及びマウスＯＸ４０とヒトｇｐ３４及びヒトＯＸ４０の性質が共通していることからして、マウスでの効果は、ヒトの場合にも当然あるべきものと考え得る。即ち、ヒトｇｐ３４に結合性を有するモノクローナル抗体は、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に対する治療剤とし有効であることが、本知見より一義的に導かれる。
【０００６】
即ち、本発明は、ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物、或いはｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する免疫疾患治療用医薬組成物である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ｇｐ３４結合阻害物とは、ｇｐ３４との結合を阻害しリガンドとリセプタ−の細胞情報伝達を阻害するものであり特にｇｐ３４側に作用し結合を阻害するものである。ｇｐ３４に結合するものとしては特にＯＸ４０が代表的である。ｇｐ３４結合阻害物とは例えばｇｐ３４に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体である。本発明に係るモノクローナル抗体は、例えばラットモノクローナル抗体を含む他種の動物由来で作製した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体の定常部位を組み換えて各種公知の方法を用いてキメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製することにより取得できる。
【０００８】
ヒト及びマウスのｇｐ３４はそのアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を含めて公知である。故に、これらに対するモノクローナル抗体を産生する細胞、特にハイブリドーマは通常知られている方法により作製することが可能であり、該細胞を用いて抗ｇｐ３４モノクローナル抗体を生産することも可能である。
【０００９】
本発明に係るモノクローナル抗体の生産は、例えば上記の抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体を産生する細胞株を各種公知の方法を用いて培養し、得られた粗抗体を精製すればよく、細胞の増殖及び抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体の産生を阻害しない方法であれば特に制限はない。本発明の組成物は、ｇｐ３４モノクロ−ナル抗体等のｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有するものであり、その他医薬的に許容される添加物を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、移植片対宿主病等の免疫疾患、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患の患者に投与される。
【００１０】
【実施例】
以下実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
実施例１ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の作製
ａ）マウスｇｐ３４の免疫
マウスｇｐ３４遺伝子は、ＣｏｎＡ刺激を加えたマウス脾臓細胞から抽出したＲＮＡから逆転写酵素を用いクロ−ニングした（Baumら：EMBO J. 13, pp.3992-4001,(1994)）。このマウスｇｐ３４遺伝子断片をＢＣＭＧＳＮｅｏプラスミド（Karasuyamaら：J. Exp. Med. 172, 969,(1990)）中に導入し、ＢＣＭＧＳＮｅｏ−ｍｇｐ３４プラスミドを作製した。次に、このプラスミドをＷＫＡ／ＨｏｃラットＴ細胞株ＴＡＲＴ−１（Tatenoら：J. Exp. Med. 159, 1105(1984)）に、エレクトロポレ−ション法により遺伝子導入した。その後、ネオマイシン耐性により耐性細胞株を選抜した。マウスｇｐ３４遺伝子の発現は選抜した細胞株より抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認しマウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ−ｍｇｐ３４を得た。本マウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ−ｍｇｐ３４を、８週齢ウィスタ−ラット（日本エス・エル・シ−社製）の後肢肉丘部分に１×１０8個づつ２週間毎に７度植え込み免疫した。その後、最終免疫日から３日後に、このラットから脾臓を取り出した。取り出した脾臓細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬製）により３度洗浄した。また、マウスミエロ−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Schulmanら：Nature 276, 269(1978)）を対数増殖期になるように細胞増殖させＲＰＭＩ−１６４０培地により３度洗浄した。マウスミエロ−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を１：３になるように混和し１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上清を除いた。沈殿した細胞に、３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）液１ｍｌを１分間かけて撹拌しながらゆっくり加え、更に１分間ゆっくり撹拌した。さらに３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくりと静かに撹拌しながら加えた。再度、３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくりと静かに撹拌しながら加えた。さらに、３７℃に暖めておいたＲＰＭＩ−１６４０培地７ｍｌを３分間かけて静かに撹拌しながら加えた。室温で、１０００ｒｐｍ、５分間遠心沈降し、上清を取り除いた。細胞濃度が、５×１０6個／ｍｌになるように３７℃に暖めておいた１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと称する。）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、静かに撹拌し細胞を浮遊させた。浮遊細胞を９６穴の培養プレ−トに、各ウェルあたり５０μｌずつ分注し細胞培養装置で一晩培養した。翌日に、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、１５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）を１００μｌずつ添加した。その後、細胞の増殖状態を観察しながら、１００μｌずつＨＡＴ培地に交換した。このような中、増殖してくる融合細胞をハイブリドーマとして作製した。
【００１１】
ｂ）抗体産生の確認
上記ａ）で作製したハイブリド−マを培養し、培養開始から１２日後に全ての培養上清を回収した。その上清中の抗体活性を、マウスｇｐ３４遺伝子を導入し発現させたマウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４とその親細胞株マウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７（Kondoら：SCIENCE 262, 1874(1993)）をそれぞれ抗原発現細胞及びその陰性対照細胞として用いラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと称する。）により測定した。ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４、ＢＷ５１４７を培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し９６穴Ｕ底プレートにそれぞれ１×１０6個づつ細胞を播種した。これに、４０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加し混合した。この９６穴Ｕ底プレートを氷上で３０分間保温し抗原とよく反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）を用いて細胞を２度洗浄した。遠心分離によりペレットとした細胞塊にＩ125放射性ヨード標識抗マウスイムノグロブリンＧヒツジ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を３０μｌ添加しさらに氷上で３０分間反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）を用いて細胞を３度洗浄した。乾燥器を用い９０℃で１０分間乾燥させて水分を蒸発させた。その後、９６穴Ｕ底プレートを１穴づつハサミにより切り分けてガンマー線測定器（アロカ社製、ＡＲＣ６００）により測定した。ガンマー線検出の値において、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞を用いたもので１０００以上、ＢＷ５１４７細胞を用いたもので５０前後と差の認められたハイブリドーマ培養上清を陽性穴とし、再現性を確かめた。抗体活性の確認できた細胞については、限界希釈法によるクローニングを行った。その結果、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を取得した。
得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株のうち代表的な株であるＴＯＬ−１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０９にて、茨城県つくば市東１丁目１番１号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１０年９月１８日より寄託されている。
【００１２】
ｃ）抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（日本エス・エル・シ−社製）に０．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を１日目と７日目の２度腹腔内に投与した。２度目の投与３日後に、２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した上記取得のハイブリドーマ株ＴＯＬ−１を一匹当たり１０8個腹腔内投与した。そして、２週間後に腹水を回収した。回収した腹水には、終濃度が０．０２％になるようにアジ化ナトリウムを添加し室温で一晩放置した。翌日放置した腹水を４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し上清を回収した。この培養上清を、直径０．４５μｍのフィルターに通した後、プロテインＡカラムキット（バイオラッド社製）にかけイムノグロブリン画分を回収した。この回収溶液に対し、５０％飽和硫酸アンモニウム（和光純薬社製）分画を行った後、生理的濃度のＰＢＳ（−）に再溶解した。これを、ＰＢＳ（−）に対して透析処理後、０．２μｍのフィルターにより濾過し無菌処理した後、以降の実験に使用した。
【００１３】
実施例２ フローサイトメーター解析による抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウスｇｐ３４抗原結合性の確認
マウスｇｐ３４抗原に結合するヒトＯＸ４０細胞外領域とヒトイムノグロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（以下ｓｈＯＸ４０−Ｆｃと称する。米Ｉｍｍｕｎｅｘ社より供与）を用いてマウスｇｐ３４抗原を発現しているＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に対する結合性を検討した。１．５ｍｌマイクロチューブに１×１０6個の細胞を回収し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿させた。その沈殿細胞に、０．５％仔牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称する。）含有ＰＢＳ（−）５００μｌを添加し洗浄した。再度、５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿させた。その後、これらの細胞を３μｌヒト血清、１６μｌ０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）に懸濁して、４℃、３０分間保温した。さらに、それらのチュ−ブの一方にｓｈＯＸ４０−Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）２０μｌを添加・懸濁し、４℃、３０分間保温させ、マウスｇｐ３４とヒトＯＸ４０を結合させた。再度、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌを添加し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離により２度洗浄した。それらのチューブにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣと称する。）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）（２５μｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加・懸濁し、４℃、２０分間保温した。そして、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌに懸濁しＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンデイッキンソン社製）によりフローサイトメーター解析を行った。
その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃのみがマウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に結合した。このことから、ＢＷ５１４７細胞でのマウスｇｐ３４の発現が確認できた（図１（図１））。
次に、本マウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応系に１０μｇ／ｍｌとなるように実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体を添加し反応させた。そして、フローサイトメーター解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃと結合することにより標識されたＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞の蛍光強度が抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の添加により低下した。このことより、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞とｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応が抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体により阻害されることが明らかになった（図２（図２））。
【００１４】
実施例３ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎モデルに対する有効性の検討
自己免疫疾患の一つであるヒトリウマチのモデル・ウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎に対する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。
７週齢で購入した雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本エス・エル・シ−社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すように、コラーゲン関節炎を誘導した。ウシ関節由来Ｋ４２タイプ２コラーゲン（コラーゲン技術研修会製）を０．３％酢酸水溶液に溶解し４ｍｇ／ｍｌとした。等量のフロイントコンプリートアジュバント（和光純薬工業社製）を加え氷中で超音波破砕装置を用いてミセル化した。このコラーゲン２００μｇ当量のコラーゲン液１００μｌをマウス尾根部に皮内投与した。さらに、初期感作後２１日目に再度尾根部に同量のコラーゲン液を投与し追加感作した。
抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与については、追加感作のコラーゲン投与開始後、３０ｍｇ／ｋｇ重の抗体量で１週間に５回ずつ４週間腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分を同量同様に投与した。試験及びコントロールをそれぞれ８個体ずつ供試した。
関節炎症状の評価は、以下のような５段階の判定を行い、四肢合わせて最高１６点として行った。関節炎点数をつけ経時的に行った。
０点：症状なし
１点：四肢のうち指などの小関節が１本のみ腫脹発赤
２点：小関節２本以上、あるいは手、足首の比較的大きな関節が腫脹発赤
３点：１本の手、足全体が発赤腫脹
４点：さらにその１本の手、足の腫脹発赤が最大限に達している
但し、マウスの関節炎の症状は１本の手、足の腫脹発赤が最大に達しその後腫脹が徐々に衰退して関節が変形剛直化する場合が多かった。この場合その後の症状の改善を判断できなかったので、評価点数を３とした。
その結果、図３（図３）に示すとおり、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリンＧ投与群に比べコラーゲン関節炎の病態発症が抑制された。
【００１５】
実施例４ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する有効性の検討
自己免疫疾患の一つであるヒト多発性硬化症のモデル・実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。
９〜１４週齢で購入した雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（ゴキタブリーディングサービス社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すように、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。１５０μｌＰＢＳ（−）中に溶解したプロテオリピッドタンパク質（以下ＰＬＰと称する。サワディーテクノロジー社製）２００μｇと等量のフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン株式会社製）を加え、連結針を用いてミセル化しＰＬＰ乳化液を作製した。このＰＬＰ２００乳化液３００μｌを後２肢肉丘部分と尾根部４箇所に試験開始日に皮下投与した。さらに、初期感作７日後に再度同量のＰＬＰ乳化液を投与し、追加感作した。この間、２００μｌＰＢＳ（−）中に溶解した百日咳毒素（Bordetella pertussis toxin、Sigma社製）３００ｎｇを試験開始日および試験開始２日後に腹腔内投与した。実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与については、５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で初回感作のＰＬＰ乳化液投与開始から２日毎に８回１４日後まで腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分の同量を同様に投与した。試験群及びコントロール群のそれぞれに４個体ずつ供試した。
実験的自己免疫性脳脊髄炎症状の評価は、以下のような６段階の判定を行い、最高５点として行った。
０点：症状なし
１点：尾の緊張低下
２点：軽度な後肢の不全対麻痺および運動失調
３点：重度な後肢の不全対麻痺および運動失調
４点：四肢麻痺
５点：実験的自己免疫性脳脊髄炎による死亡
但し、それぞれの群において実験的自己免疫性脳脊髄炎によって死亡した動物については、試験終了まで評価点数を５点とした。
その結果を図４（図４）に示す。各群の評価点数を平均して示した抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリンＧ投与群に比べ実験的自己免疫性脳脊髄炎の病態発症が抑制された。
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、マウスｇｐ３４に対して結合しマウスＯＸ４０との結合を阻害する抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体がリウマチ疾患のモデルであるウシタイプ２コラーゲン関節炎の発症と多発性硬化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症を抑制することが明らかになった。そこで、ヒト化した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体を用いることにより、少なくとも現在知られている免疫細胞を含めたｇｐ３４とＯＸ４０の両膜結合型蛋白質を通して行う両抗原の細胞情報伝達を阻害することにより、リウマチを含めた多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患、および移植片対宿主病に対する予防、治療効果が期待できる。このような特性から、本発明により提供される抗ヒトｇｐ３４モノクローナルヒト化抗体を含有する医薬組成物は、ヒト自己免疫疾患に対する有用な薬剤となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスｇｐ３４発現細胞に対するｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合特異性を示す図である。
【図２】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウスｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合阻害を示す図である。白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加前の蛍光強度を、黒塗りの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加後の蛍光強度を示す。
【図３】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン関節炎発症抑制の有効性を示す図である。コラ−ゲン関節炎誘導後の個々の検体における関節炎評価点数の経時変化である。図中、各シンボルは一頭一頭の個体を示している。
【図４】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体の実験的自己免疫性脳脊髄炎発症抑制の有効性を示す図である。実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導後の各群の検体における実験的自己免疫性脳脊髄炎評価点数の平均値の経時変化である。図中、白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体投与群を、黒塗りの部分は、ラットイムノグロブリンＧ投与群を示す。
Claims (10)
- ｇｐ３４抗体を有効成分として含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- ｇｐ３４抗体が、ｇｐ３４側に作用してｇｐ３４とＯＸ４０との結合を阻害するものである請求項１に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- 自己免疫疾患が、Ｔ細胞が関与するものである請求項１に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- 自己免疫疾患が、リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病のうち少なくとも一つである請求項１に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- 自己免疫疾患が、多発性硬化症である請求項４に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- 自己免疫疾患が、リウマチである請求項４に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- ｇｐ３４抗体を有効成分として含有する免疫疾患治療用医薬組成物。
- ｇｐ３４抗体が、ｇｐ３４側に作用してｇｐ３４とＯＸ４０との結合を阻害するものである請求項７に記載の免疫疾患治療用医薬組成物。
- 免疫疾患が、Ｔ細胞が関与するものである請求項７に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。
- 免疫疾患が、移植片対宿主病である請求項７に記載の免疫疾患治療用医薬組成物。
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