BRPI0618160A2

BRPI0618160A2 - inibição da via alternativa complemento para tratamento de danos cerebrais traumáticos, danos na medula espinhal e condições relacionadas

Info

Publication number: BRPI0618160A2
Application number: BRPI0618160-0A
Authority: BR
Inventors: Vernon Michael Holers; Joshua M Thurman; Stephen Tomlinson; Philip F Stahel
Original assignee: Univ Colorado; Musc Found For Res Dev
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2011-08-16
Also published as: CN103505728A; CN101227924A; WO2006128006A1; US8911733B2; JP2008542298A; AU2006249835A1; EP1885398A4; CA2610340C; AU2006249835B2; EP1885398B1; ES2548700T3; EP1885398A1; US20060292141A1; JP5707024B2; JP2012162543A; CA2610340A1

Abstract

<b>INIBIçãO DA VIA ALTERNATIVA COMPLEMENTO PARA TRATAMENTO DE DANOS CEREBRAIS TRAUMáTICOS, DANOS NA MEDULA ESPINHAL E CONDIçõES RELACIONADAS<d>, onde é revelado o uso de agentes e composições que de maneira seletiva inibem a via complementar alternativa para a inibição ou tratamento dano fisiológico resultante do dano cerebral traumático (DCT), dano da medula espinhal (DME), ou condições relacionadas. Os reagentes preferidos para o uso na inibição do dano resultante do DCT ou DME incluem aqueles que inibem o fator B, com anticorpos do antifator B representando um agente particularmente preferido.

Description

"INIBIÇÃO DA VIA ALTERNATIVACOMPLEMENTO PARA TRATAMENTO DE DANOS CEREBRAISTRAUMÁTICOS, DANOS NA MEDULA ESPINHAL E CONDIÇÕESRELACIONADAS"Campo da Invenção

A presente invenção geralmente refere-seaos métodos de tratar danos fisiológicos resultantes de danoscerebrais traumáticos, danos da medula espinhal ou condiçõesrelacionadas, ao inibir de maneira seletiva a via de complementoalternativa e, em uma configuração específica, pela inibição do fatorB.

Histórico da Invenção

A ativação complementar ocorreprimeiramente por três vias: a assim chamada via clássica, a via dalecitina e a via alternativa. As proteínas chave envolvidas naativação da via alternativa são fator B (fB) e fator D (fD). Estasproteínas trabalham em concerto para iniciar e/ou para amplificar aativação de C3, o qual leva à iniciação de um número de eventosinflamatórios. Uma terceira proteína, properdina, estabiliza ocomplexo de C3 e o fator B, mas não é absolutamente exigido paraa via alternativa à função. O fator B, que também ajuda a solubilizarcomplexos imunes, foi relatado para atuar como um fator decrescimento da célula B e pode ativar os monócitos (Takahashi,1980; Hall1 1982; Peters, 1988). Camundongos deficientes do fatorB (-camundongos / fB-) foram gerados e a resposta do anticorpolgG1 aos antígenos dependentes da célula T e sensíveis ao choqueendotóxico aparecem normais nestes camundongos (Matsumoto,1997).

A via de complemento alternativo é,normalmente, iniciado por bactéria, parasitas, vírus ou fungos,apesar dos IgA Abs e determinadas cadeias Ig L também foramrelatadas para ativar esta via. A ativação da via alternativa éiniciada quando circulam as ligações do fator B ao C3 ativado (C3b ou C3H20). Este complexo é, então, unido pelo fator circulante Dpara produzir um fragmento ativo de modo enzimático, C3bBb.C3bBb une C3 gerando C3b, que conduz a inflamação e tambémamplifica o processo de ativação, gerando um Ioop positivo deretorno. Os dois componentes (fator B e fator D) são necessários para possibilitar a ativação da via alternativa.

Estudos recentes mostraram que a viaalternativa do complemento tem um importante papel napatogênese de vários modelos animais da doença. Por exemplo, aativação do complemento dentro do rim após o dano de reperfusão de isquemia dentro do rim (l/R) é mediada quase queexclusivamente pela via alternativa (Thurman et al., 2003, JImmunol 170:1517-1523), e a via alternativa tem um papel crítico nodesenvolvimento da artrite inflamatória. Talvez maissurpreendentemente, os camundongos deficientes na via alternativa demonstraram serem protegidos da nefrite no modelo MRL/lpr danefrite lúpica (Watanabe et al., 2000, J Immunol 164:786-794) e daperda fetal mediada por antifosfolipídeo (Girardi et al., 2003, J ClinInvest 112:1644-1654), modelos que teriam, tradicionalmente, sidoassumidos serem mediados pela via de complemento clássico. Ainda, Nataf et al. mostrou que, em um modelo de encefalomieliteexperimental auto-imune (EEA), em ambos os camundongos C3(-/-)e fator B(-/-), havia pouca infiltração do parênquima por macrófagose células T e, como comparado com seu filhote do tipo wild, ossistemas nervosos centrais (SNC) dos camundongos C3(-/-) e fatorB(-/-) induzidos por EEA são protegidos da desmielinação (Nataf etal., 2000, J. Immunol. 165:5867-5873). Estudos subseqüentes dapatologia auto-imune em camundongos C4 (-/-) no modelo EEAmostrou que o apagamento do gene C4 não modificou de maneirasignificante o tempo do ataque ou a severidade e tempo do EEAinduzido por oligodendrócito mieliná comparado com controles comum sistema complementar totalmente intacto, indicando que acontribuição do complemento murino à patogênese da doençadesmielinizante é realizada pela via alternativa (Boos et al., 2005,Glia 49:158-160).

O dano cerebral traumático (também referidoaqui como DCT) é uma condição com muitos efeitos nocivos àsaúde de um indivíduo que, atualmente, não tem tratamento efetivo.A ativação complementar mostrou envolver-se no desenvolvimentodo dano cerebral após DCT (Bellander et al., 2001, J. Neurotrauma18:1295-1311; Kaczorowski et al., 1995, J. Cereb. Blood FlowMetab. 15:860-864; Keeling et al., 2000, J. Neuroimmunol. 105:20-30; Schmidt et al., 2004, Eur. J. Trauma 30:135-149; Nataf et al.,1999, Trends Neurosci 22:397-402; Stahel et al., 1998, Brain Res.Rev. 27:243-256; Stahel et al., 2001, J. Neurotrauma 18:773-781;Van Beek et al., 2003, Ann NY Acad Sci 992:56-71; Rancan et al.,2003, J. Cereb. Blood Flow & Metab. 23:1070-1074). Entretanto,estes estudos concentram-se nos efeitos da cascata complementarem um ponto onde todas as três vias que ativam a convergênciacomplementar, como em C3 (ver, por exemplo, Rancan et al., 2003,ibid.). Portanto, anterior à presente invenção, não houve relatóriosmostrando se uma das vias complementares é preferencialmenteou exclusivamente ativada como resultado do DCT ou é necessáriapara desenvolver o DCT.A meta imediata no gerenciamento depacientes com danos na cabeça é a prevenção do dano cerebralsecundário por correção rápida da hipotensão, hipoxemia,hipercarbia e hipoglicemia. A principal prioridade no gerenciamentoantecipado dos pacientes de trauma na cabeça é a manutenção deuma pressão de perfusão cerebral adequada (PPC)1 que deveriaestar acima de 70-80 mmHg. As abordagens terapêuticas diferentesobjetivam a redução da pressão intracraniana (RPI) a fim de manteruma PPC adequada. Entre as modalidades terapêuticas estão: aredução das lesões de massa por evacuação cirúrgica dehematomas intracranianos, a redução do inchaço cerebral comdrogas osmóticas (por exemplo, manitol), e a drenagem terapêuticado fluido cerebrospinal (FCS) através de cateteresintraventriculares, Os pacientes com DCT partidos são transferidosà unidade de tratamento intensivo (UTI) no momento inicial etratados de acordo com os protocolos padronizados. As metas daterapia de UTI incluem: realização e manutenção da trocaadequada de gás e estabilidade circulatória, prevenção dehipoxemia e hipercarbia, repetidos mapeamentos por tomografiacomputadorizada programada (TC) para detecção da patologiaintracraniana secundaria tardia, sedação profunda e analgésicapara evitar estresse e dor, realização e manutenção da PPC ótima(> 70 mmHg) e equilíbrio do oxigênio cerebral, prevenção dahipertermia (< 38°C), prevenção da hiperglicemia e hiponatremia,nenhuma elevação principal realizada de maneira rotineira,prevenção de úlceras por estresse e manutenção da integridade damucosa intestinal e profilaxia por fatores complicantes (e.g.pneumonia ou meningite). No evento do ICP elevado (> 15 mmHg,> 5 minutos), os pacientes podem ser tratados por (1)aprofundamento da sedação, analgesia, relaxamento muscular; (2)drenagem do FCS através de cateteres ventriculares; (3)hiperventilação moderada (sob certas circunstâncias); (4)osmoterapia; (5) hipotermia moderada (± 34°C); e (6) comabarbiturato.

Dano da Medula Espinhal (também referidoaqui como DME) é também uma condição do sistema nervosocentral com efeitos muito nocivos na saúde de um indivíduo quenão está em tratamento efetivo no momento. A ativaçãocomplementar mostrou-se estar envolvida no desenvolvimento dedanos após o DME (Anderson et al., 2004, J Neurotrauma21(12):1831-46; Reynolds et al., 2004, Ann N YAcad Sei. 1035:165-78; Rebhun et al., 1991, Ann Allergy 66(4):335-8). Entretanto, comocom o DCT1 estes estudos concentraram-se nos efeitos da cascatacomplementar em um ponto onde todas as três vias que ativa aconvergência complementar, ou sugeriram um papel para todas asvias complementares subseqüentes ao DME. Portanto, anterior àpresente invenção, não houve relatórios mostrando se uma das viascomplementares é preferencialmente ou exclusivamente ativadacomo um resultado do DME, ou é necessária para desenvolver oDME.

O DME é geralmente definido como dano àmedula espinhal que resulta na perda de uma função, comomobilidade ou sentido. As causas freqüentes dos danos sãotraumas (por exemplo, por acidente de carro, tiro, quedas, etc.) oudoença (pólio, espinha dorsal, Ataxia de Friedreich, etc.). A medulaespinhal não precisa estar partida para que ocorra uma perda nofuncionamento. Na verdade, na maioria dos indivíduos com DME, amedula espinhal está intacta, mas os danos a ela resultam na perdada função. Além da perda da sensação ou função motora, osindivíduos com DME podem também experienciar disfunção dointestino e bexiga, disfunção sexual e fértil, inabilidade de regular apressão sangüínea de maneira eficaz, controle reduzido datemperatura do corpo, inabilidade de suar abaixo do nível do dano edor crônica. Os danos muito altos (C-1, C-2) podem resultar naperda das muitas funções involuntárias incluindo a habilidade emrespirar, auxiliares para necessidades respiratórias comoventiladores mecânicos ou marca-passo diafragmático.

Atualmente não há cura para DME. A metaimediata na administração dos pacientes com DME estáconcentrada em diminuir os danos, tão logo possível, após aocorrência do dano. As drogas esteróides como metilprednisolonareduzem o inchaço, que é uma causa comum de danos secundáriosno momento do dano. Há vários tipos de tratamento a curto prazopara o dano da medula espinhal. Primeiro, a espinha na área damedula espinhal é imobilizada para evitar mais danos à espinha(por exemplo, usar halos, moldes, armaduras e tiras). Para reduzir oinchaço na medula espinhal, causada pelo dano, a medicaçãoesteróide é normalmente administrado durante as primeiras 24horas após o dano, apesar da abordagem mais típica sejaadministrar medicação esteróide àqueles pacientes com déficitsneurológicos e uma janela de tempo da iniciação da terapia dentrode menos de 8 horas após o trauma (Bracken, 2001, Spine26(24S):S47-S54). Outro tratamento médico é freqüentementenecessário, dependendo das complicações que possamdesenvolver. Como o dano traumático a uma medula espinhalnormalmente envolve um dano aos ossos e Iigamentos da espinha,a cirurgia pode ser realizada. O objetivo de algumas cirurgias éremover o osso (descompressão) que está pressionando sobre ouna medula espinhal, ou para estabilizar ou realinhar a espinha naárea do dano da medula espinhal quando as vértebras ouIigamentos foram danificados. Hastes de metal ou cages eparafusos podem ser presos à vértebra normal para evitar omovimento da vértebra fraturada e as vértebras devem ser "unidas"usando o enxerto do osso ou o mesmo motivo. O estiramento daespinha através do uso de pesos e polias (chamadas tração) podemtambém ajudar com o alinhamento da espinha.

Apesar dos protocolos para tratamento depacientes com DCT1 complicações potenciais da terapia do DCTpodem incluir: vaso-espasmos cerebrais ou depressãocardiovascular, hepatotoxicidade, imunossupressão e incidênciaelevada das infecções pulmonares. Além disso, apesar dostratamentos para DME poderem apresentar reduções modestas nodano fisiológico, muitos protocolos são primeiramente úteis paraajudar a reduzir a probabilidade de maiores danos e para estabilizaro paciente. Nenhum único protocolo provou ser totalmentesatisfatório para inibir o desenvolvimento do dano fisiológicoresultante do DCT ou DME. Portanto, há uma necessidadecontínua na técnica para processos terapêuticos e reagentes tendomenos toxidade e mais especificidade para sustentar a causa dodano resultante do DCT e DME.

Sumário da Invenção

Uma configuração da presente invençãorefere-se a um método para reduzir ou evitar no mínimo um sintomade danos fisiológicos resultante do dano cerebral traumático (DCT)em um animal ou intensificar a recuperação do DCT no animal. Ométodo inclui de maneira seletiva a inibição do complementoalternativo através de um animal que tenha experienciado DCT. Emum aspecto, o sintoma é selecionado de: vaso-espasmos cerebrais,depressão cardiovascular, hepatotoxicidade, imunossupressão,e/ou infecção pulmonar. Em um outro aspecto, o sintoma éselecionado de um grupo consistido de: hipotensão, hipoxemia,hipercarbia e/ou hipoglicemia.

Uma outra configuração da presenteinvenção refere-se a um método para reduzir ou evitar no mínimoum sintoma de danos fisiológicos resultante do dano da medulaespinhal (DME) em um animal ou intensificar a recuperação doDME no animai. O método inclui de maneira seletiva a inibição docomplemento alternativo através de um animal que tenhaexperimentado DME. Em um aspecto, o sintoma é o inchaço damedula espinhal.

Já uma outra configuração da presente

invenção refere-se ao uso de um agente que inibe de maneiraseletiva o complemento alternativo através de uma composiçãofarmacêutica para o tratamento do dano cerebral traumático (DCT).

Uma outra configuração da presenteinvenção refere-se ao uso de um agente que inibe de maneiraseletiva o complemento alternativo através de uma composiçãofarmacêutica para o tratamento do dano da medula espinhal (DME).

Em quaisquer dos métodos ou usos acimadescritos, a etapa de inibição pode incluir a administração a umanimal, um agente que inibe de maneira seletiva a expressão ouatividade de uma proteína na via complementar alternativa. Aproteína na via complementar alternativa é preferencialmenteselecionada a partir de: Fator B, Fator D e/ou properdina. Estesagentes incluem, mas sem limitações, um inibidor da expressão daproteína da proteína na via complementar alternativa, um inibidor daatividade biológica da proteína na via complementar alternativa,e/ou um antagonista da proteína na via complementar alternativa.

Em um aspecto, o agente usado em qualquerum dos métodos acima identificados ou usos é um anticorpo, umantígeno, fragmento de ligação destes, ou um polipeptídeo deligação antígena, que seletivamente liga e inibe a proteína na viacomplementar alternativa. Em um aspecto, o anticorpo, oufragmento de ligação antígena destes, liga de maneira seletiva aofator B dentro do domínio da terceira repetição de curto consenso(RCC), onde o anticorpo evita a formação de um complexo C3bBb.Em um aspecto, o anticorpo ou fragmento de ligação antígena desteliga-se ao fator B e evita ou inibe a segmentação do fator B pelofator D. Em um aspecto, o fragmento de ligação de anticorpo ouantígeno liga-se ao domínio da terceira repetição de curto consenso(RCC) do fator humano B. Em um aspecto, o fragmento de ligaçãode anticorpo ou antígena destes liga-se de maneira seletiva a umterceiro domínio da terceira RCC do fator B selecionado de: (a) umepítopo do fator B que inclui no mínimo uma porção do fatorhumano B (SEQ ID NO:2) compreendendo da posição Tyr139 aposição Ser185, ou posições equivalentes a estas em umaseqüência de fator não humano B; (b) um epítopo do fator B queinclui no mínimo uma porção do fator humano B (SEQ ID NO:2)compreendendo da posição Tyr139 à posição Ser141, ou posiçõesequivalentes a estas em uma seqüência de fator não humano B; (c)um epítopo do fator B que inclui no mínimo uma porção do fatorhumano B (SEQ ID NO:2) compreendendo da posição Glu182 àposição Ser185, ou posições equivalentes a estas em umaseqüência de fator não humano B; e/ou (d) um epítopo do fator Bque inclui no mínimo uma porção do fator humano B (SEQ ID NO:2)compreendendo qualquer uma ou mais das seguintes posições ousuas posições equivalentes em uma seqüência de fator nãohumano B: Tyr139, Cys 140, Ser141, Glu182, Gly184, ou Ser185.Em um aspecto, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígenadestes liga-se de maneira seletiva a um terceiro domínio da terceiraRCC do fator B (SEQ ID NO:2) compreendendo uma ou mais dasseguintes posições de aminoácidos ou suas posições equivalentesa uma seqüência de fator não humano B: Ala137, Tyr139, Ser141,Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, e Ser192. Em um aspecto, ofragmento de ligação de anticorpo ou antígena destes liga-se demaneira seletiva a um epítopo do terceiro domínio da terceira RCCdo fator B (SEQ ID NO:2) compreendendo ou consistindo de umadas seguintes posições de aminoácidos ou suas posiçõesequivalentes em uma seqüência de fator não humano B: Ala137,Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, e Ser192. Emoutro aspecto, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígenadestes liga-se de maneira seletiva a um epítopo não-linear dentroda estrutura tridimensional de uma porção do terceiro domínio daterceira RCC do fator B, onde a porção é definida por no mínimo asposições Ala137-Ser192 da SEQ ID NO:2 ou posições equivalenteem uma seqüência de fator não humano B. Em um aspecto, ofragmento de ligação de anticorpo ou antígena destes liga-se demaneira seletiva a um fator B de espécies múltiplas de mamíferos eevita a formação de um complexo C3bBb. Em um aspecto, ofragmento de ligação de anticorpo ou antígena destes liga-se demaneira seletiva a um fator B de humano e de um animalselecionado de um grupo consistindo de primatas não humanos,camundongo, rato, porco, cavalo e coelho. Para qualquer um dosanticorpos acima descritos, o anticorpo pode incluir, mas semlimitações um anticorpo de um isótopo de ativação nãocomplementar ou subclasse, um anticorpo monoclonal, umanticorpo humanizado, um anticorpo bi-específico, e/ou umanticorpo monovalente. Em um aspecto, o fragmento de ligaçãoantígena é um fragmento Fab. Em um aspecto preferido dainvenção, o anticorpo é o anticorpo monoclonal 1379 (produzido porATCC Depósito No. PTA-6230), ou fragmento de ligação antígenadestes.

Nos métodos e usos relacionados ao DCT,em uma configuração preferencial, o agente é administrado demaneira intravenosa ou ao cérebro do animal. Nos métodos e usosrelacionados ao DME, em uma configuração preferencial, o agenteé administrado de maneira intravenosa ou a uma medula espinhalou espaço epidurial da medula espinhal do animal. O agente épreferencialmente administrado ao animal em uma quantia eficazpara reduzir de maneira mensurável no mínimo um sintoma dedanos fisiológicos resultante do DCT ou DME no animal comocomparado na ausência da administração do agente. Com relaçãoao DCT, em um aspecto, o agente é administrado em uma quantiaeficaz para manter uma pressão de perfusão cerebral (PPC) deacima de 70-80 mmHg, ou em uma quantia eficaz para reduzir umapressão intracraniana (ICP). Com relação ao DME, em um aspecto,o agente é administrado em uma quantia eficaz para reduzir oinchaço em uma medula espinhal. Em um aspecto, o agente éadministrado em um portador farmaceuticamente aceitável,incluindo, mas sem limitações, um composto ou composição queseja capaz de cruzar a barreira do sangue cerebral e/ou umexcipiente injetável.Em um aspecto de qualquer um dos métodosou usos acima descritos relacionados ao DCT, há mais uma etapade administração ao animal um outro composto para tratar umsintoma do DCT selecionado a partir de um grupo consistindo de:um defeito físico, um defeito cognitivo e um defeito psicosocial-comportamental-emocional. Este composto pode incluir, mas nãolimitado a, uma droga osmótica, um sedativo, um analgésico, umrelaxante muscular e/ou um barbitúrico.

Em um aspecto de qualquer um dos métodosou usos acima descritos relacionados ao DME, há mais uma etapade administração de um esteróide ao animal.

Em um aspecto de qualquer um dos métodosou usos acima descritos relacionados ao DCT, o método pode aindaincluir o tratamento de um animal com DCT por um protocoloselecionado de: redução das lesões de massa por evacuaçãocirúrgica dos hematomas intracranianos; redução do inchaço docérebro com drogas osmóticas; drenagem terapêutica do fluidocerebrospinal (FCS) através de intracateteres ventricular;mapeamento por tomografia computadorizada (TC); sedação;analgesia; relaxamento muscular; hiperventilação moderada;hipotermia moderada; e/ou coma por barbitúricos.

Em um aspecto de qualquer um dos métodosou usos acima descritos relacionados ao DME1 o método podeainda incluir o tratamento de um animal com DME por um protocoloselecionado de: administração de esteróides; imobilização daespinha; cirurgia de descompressão; cirurgia para estabilizar avértebra; cirurgia para realinhar a vértebra; e/ou tração.

Em qualquer um dos métodos acimadescritos e usos, o animal é preferencialmente um mamífero,incluindo, mas limitado a, um humano.

Outras configurações da presente invençãoreferem-se a (1) um método para reduzir ou evitar no mínimo umsintoma de dano fisiológico resultante do dano cerebral traumático(DCT) em um animal que tenha experienciado DCT, ou (2) ummétodo para reduzir ou evitar no mínimo um sintoma de danosfisiológicos resultantes do dano da medula espinhal (DME) em umanimal que experienciou DME, cada método compreendendo aadministração ao animal de um agente que inibe o fator B ligandoou bloqueando o domínio da terceira repetição de curto consenso(RCC) do fator B. Em um aspecto preferencial destasconfigurações, o agente é um anticorpo ou um fragmento de ligaçãoantígena destes que se liga de maneira seletiva ao fator B.

Uma outra configuração da presenteinvenção refere-se a uma composição compreendendo: (a) umprimeiro agente selecionado a partir de: um anticorpo isolado, umfragmento de ligação antígena deste, e/ou um polipeptídeo deligação antígena, onde o primeiro agente inibe de maneira seletiva aexpressão ou atividade biológica de uma proteína na viacomplementar alternativa; e (b) um segundo agente para otratamento de um sintoma de dano cerebral traumático (DCT). Emum aspecto, o segundo agente é composto para tratar um sintomade DCT selecionado a partir de: um defeito físico, um defeitocognitivo e/ou um defeito psicossocial-comportamental-emocional.

Em um outro aspecto, o segundo agente é selecionado a partir dogrupo consistindo: uma droga osmótica, a sedativo, um analgésico,um relaxante muscular, e um barbitúrico.

Uma outra configuração da presenteinvenção refere-se a uma composição compreendendo: (a) umprimeiro agente selecionado a partir de: um anticorpo isolado, umfragmento de ligação antígena deste, e/ou um polipeptídeo deligação antígena, onde o primeiro agente inibe de maneira seletiva aexpressão ou atividade biológica de uma proteína na via complementar alternativa; e (b) um segundo agente para otratamento de um sintoma de dano da medula espinhal (DME). Emum aspecto, o segundo agente é um esteróide.

Nas composições acima identificadas, oprimeiro agente pode incluir, mas não limitado a, um agente que inibe a expressão ou atividade biológica de uma proteínaselecionada a partir de: Fator B, Fator D e/ou properdina. Em umaspecto, o primeiro agente liga-se ao fator B dentro do domínio daterceira repetição de curto consenso (RCC) e inibe ou evita aformação de um complexo C3bBb. Em um outro aspecto, o primeiro agente é um fragmento de ligação de anticorpo ou antígena deste.Em um aspecto preferencial, o anticorpo é o anticorpo monoclonal1379. Qualquer um dos agentes acima descritos para uso nosmétodos ou usos da invenção pode ser usado na composição dainvenção.

Breve Descrição das Figuras

A Fig. 1 é um diagrama esquemáticoapresentando a construção de uma proteína de fusão do fator B-Ig.

A Fig. 2A é uma linha gráfica mostrando queo antifator B inibiu completamente a via complementar alternativa em uma análise zymosan quando 3 pg foram adicionados a umareação contendo 10 μl de soro.

A Fig. 2B é uma linha gráfica mostrando queo antifator B inibiu completamente a via complementar alternativaem uma análise na Iise dos eritrócitos em coelhos quando 6 μg doanticorpo foram adicionadas a 10 μΙ do soro humano.

A Fig. 3 é uma linha gráfica mostrando que aadministração do antifator B ao camundongo inibe a viacomplementar alternativa.

A Fig. 4 é um desenho esquemáticomostrando um modelo do mapeamento do epítopo mAb1379 nasuperfície do fator humano B.

A Fig. 5 é um desenho esquemáticomostrando um complexo modelado da ligação mAB1379 (umfragmento Fab) ao fator B1 com os lados de ligação antígenos doFab tendo sido modelados para cobrir toda a região mapeada doepítopo.

A Fig. 6 é uma linha gráfica mostrando queCrry-Ig inibe o defeito neurológico após o DCT.

A Fig. 7 é uma linha gráfica mostrando queCrry-Ig inibe a perda de peso após o DCT.

A Fig. 8 é um gráfico de barras mostrandoque a administração do antifator B (mAb 1379) reduz o danocerebral associado com DCT.

A Fig. 9 é uma linha gráfica mostrando que aadministração do antifator B (mAb 1379) melhora a recuperação dodano da medula espinhal.

A Fig. 10 é um gráfico mostrando que osníveis elevados C5a no soro dos camundongos com danoscerebrais C57BL/6 (fB+/+) são atenuados significantemente noscamundongos deficientes do gene do fator B (fB-/-) sem uma viafuncional complementar alternativa.

A Fig. 11 é uma imagem digital de umaanálise por Western blot mostrando a regulação positiva domediador antiapoptótico Bcl-2 no soro e cérebros de camundongosfB-/- após o dano cerebral traumático (DCT), como determinadopela análise por Western blot.

A Fig. 12 é uma imagem digital mostrando amorte da celular neuronal atenuado no hemisfério danificado doscamundongos deficientes do gene do fator B 4 horas apósterminado o dano da cabeça.

A Fig. 13 é uma imagem digital mostrando amorte celular neuronal atenuada no hemisfério danificado doscamundongos deficientes do gene do fator B 24 horas apósterminado o dano da cabeça.

Fig. 14 é uma imagem digital mostrando amorte celular neuronal atenuada no hemisfério danificado doscamundongos deficientes do gene do fator B 7 dias após terminadoo dano da cabeça.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se de modo geralà descoberta dos inventores de que a ativação da cascatacomplementar através da via alternativa é necessária para aindução do dano fisiológico devido ao dano cerebral traumático(DCT), e que a inibição da via complementar alternativa é suficientepara reduzir danos (ou elevar a recuperação) resultante do DCT oudano da medula espinhal (DME). Mais particularmente, ospresentes inventores revelam aqui a descoberta de que a inibiçãoda via alternativa inibe o dano fisiológico (por exemplo, danocerebral) em um modelo experimental do DCT, e também inibedanos (medidos pelo aumento da recuperação) em um modeloexperimental do DME. Conseqüentemente, a presente invençãorefere-se à compostos, composições e o uso destes compostos oucomposições em métodos para a prevenção e/ou tratamento doDCT, DME ou outros danos cerebral ou neuronal, através dainibição seletiva da via complementar alternativa.

Primeiro, os presentes inventores mostrarampela primeira vez um maior papel da via alternativa da ativaçãocomplementar na contribuição à extensão geral da ativaçãocomplementar pós-traumática e à morte celular neuronal secundáriaapós o dano cerebral. Ainda, os inventores demonstraram que ainibição especifica da via complementar alternativa por inibição dofator B, além da inibição geral da via complementar através dainibição de C3 com o uso de um inibidor convertase complementarC3, Crry-lg, ambos inibindo os danos associados com o DCT.Acredita-se que seja a primeira revelação da habilidade para inibir odano fisiológico e os efeitos associados com o DCT ao inibir demodo específico e seletivo o sistema complementar alternativo.

Segundo, os presentes inventores mostraramque a inibição da via complementar alternativa através da inibiçãodo fator B inibe danos associados com o DME. Acredita-se queseja a primeira revelação da habilidade para inibir o dano fisiológicoe os efeitos associados com o DME ao inibir de modo especifico eseletivo o sistema de complemento alternativo.

A identificação do fator B e as outrasproteínas na via complementar alternativa (por exemplo, fator D ouproperdina) como alvos terapêuticos específicos apresenta umaestratégia racional assim como compostos principais que podem serusados para inibir dano fisiológico ou efeitos resultante do DCT ouDME através da inibição seletiva da via complementar alternativa.

Vários inibidores já foram desenvolvidos parainibir o sistema complementar em vários estágios da ativação(Holers, V.M. 2003, Clin Immunol 107:140-151), apesar dosinibidores específicos da via alternativa não terem sido amplamenterelatados. A inibição específica da via alternativa possui váriasvantagens em comparação com os inibidores existentes da cascatacomplementar. Primeiro, porque os presentes inventoresdescobriram que o dano fisiológico devido ao DCT ou DME éprimeiramente mediado pela via alternativa da ativaçãocomplementar, um inibidor específico desta será igualmente eficazcomo um inibidor pan-complementar, ainda deveriam ter menosefeitos imunossupressores. Ainda, C4 -/- os camundongos(camundongos com falta do componente complementar C4 que égenérico às vias complementares clássicas, alternativas e dalecitina), mas sem camundongos fB -/- (fator B deficiente), parecemmais suscetíveis à infecção bacterial experimental sistêmica, quesugere que ao deixar a via clássica intacta, um inibidor da viaalternativa apresenta menos risco para infecção séria. Apesar desomente um paciente humano com deficiência congênita do fator Bter sido relatado (Densen et al., 1996, Mol Immunol 33:68 (Abstract270)), estudos de camundongos deficientes do gene alvo do fator B(fB-/-) não demonstraram ainda um efeito modulador imune paraeste fator (Densen et al., supra; Matsumoto et al., 1997, Proc NatlAcad Sci USA 94:8720-8725). Os pacientes com deficiênciascongênitas dos componentes da via clássica, em contraste,parecem ter um elevado risco de infecção (mais comumentementeStaphylococcus e Streptoeoeeus). Inibição dos componentes da viaclássica ou C3 (comum a todas as vias complementares) podemtambém estar associados com a auto-imunidade (Figueroa eDensen, 1991, Clin Mierobiol Rev 4:359-395), talvez explicandoporque a deficiência do fator B protege camundongos MRL/lpr dedesenvolver glomerulonefrite, mas deficiência de C3 não (Watanabeet al, supra). A inibição seletiva da via alternativa evita a geração daligação derivada do C3 para o receptor C3a receptor assim comopara receptores complementares 1-4 e C5a. Os efeitos do bloqueioda via alternativa podem, na verdade, serem mais diretos, como jápobremente os receptores caracterizados para os produtos deativação Ba ou Bb do fator B que são gerados durante o processode ativação. Assim, a inibição da via alternativa é esperada que sejamais bem tolerada e mais eficaz do que a inibição complementar davia clássica.

Dado o benefício terapêutico de grandepotencial de um inibidor específico para a via complementaralternativa para uso nos métodos da presente invenção paratratamento do DCT e DME e condições relacionadas, os presentesinventores desenvolveram vários anticorpos monoclonais inibitóriosdirecionado contra o fator B e testaram um deles em um modeloexperimental do DCT e também em um modelo experimental doDME. Estes anticorpos são descritos em detalhes na Publicação doPedido de Patente dos EUA No. 2005-0260198-A1, publicado em24 de novembro de 2005 e na Publicação PCT No. WO2005/077417, publicada em 25 de agosto de 2005, cada qualincorporada aqui por referência na sua totalidade.

Brevemente, para produzir os anticorpos,camundongos deficientes do gene alvo do fator B (fB-/-) foraminjetados com uma proteína de fusão compreendida do domínio dasegunda e terceira repetição de curto consenso (RCC) do fator Bligado aos domínios da articulação, CH2, e CH3 de um isótopo IgG1de camundongo (ver Fig. 1). Estes domínios RCC foram escolhidosporque são parte do segmento excluído do fator B gene noscamundongos fB-/-. Os camundongos foram classificados parauma resposta imune ao fator B (por exemplo,usando ELISA), ecélulas do baço de um dos camundongos injetados foram ligadas àscélulas do mieloma. Um dos hibridomas resultantes, nomeado1379, produz um IgG1 anticorpo que inibe a ativação da viacomplementar alternativa in vitro (Figs. 2A e 2B) e in vivo (Fig. 3).Especificamente, este anticorpo foi testado em duas análises in vitroda atividade da via alternativa (Figs. 2A e 2B), e mostrou que oanticorpo pode inibir completamente a Iise dos eritrócitos pelo sorohumano, assim, confirmando a habilidade deste reagente parabloquear completamente a ativação da via complementaralternativa. Quando os camundongos foram testados para a inibiçãoda via alternativa em vários momentos após uma única injeção doanticorpo inibitório, 1 mg do anticorpo levou à inibição total dentrode uma hora quando injetado IV e dentro de duas horas quandoinjetado IP (Fig. 3). Os camundongos que receberam uma injeçãoIP de 1mg retiveram inibição total da via alternativa em 24 horas eaqueles que receberam uma injeção de 2mg retiveram inibição totalpor até 48 horas após a injeção. Os inventores também injetaram2mg do anticorpo 1379 anticorpo de maneira repetitiva i.p. Dia sim,dia não, por 14 dias e mostraram que a completa inibição da viacomplementar alternativa foi mantida por no mínimo 48 horas apósa ultima injeção. Além disso, os fragmentos Fab feitos desteanticorpo também resultaram na inibição completa da via alternativaem níveis equimolares aproximadamente como com o anticorpo1379 intacto.

O anticorpo 1379 inibe a ativação da viaalternativa em soro de animais, incluindo camundongos, ratos,humanos, babuínos, macacos reso, macacos cino, porcos, coelhose cavalos (Tabela 1).

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Um painel de anticorpos de antifator Bproduzido pelos inventores é mostrado na Tabela 2. Como acimadiscutido, os inventores mostraram que o mAb 1379 liga e inibefator B humano e de camundongo.

Em contraste o mAb chamado 624 pode ligaro fator B humano e de camundongo, mas sem inibir a via alternativahumana.

Como revelado em uma análise decompetição, os anticorpos 624, 691, e 1231 não bloqueiam aligação por 1379.

Estes anticorpos devem, portanto, ligar aproteína em um local diferente, explicando porque eles ligam o fatorB sem inibir sua função in vitro.

Entretanto, os anticorpos 395, 1322 e 1060são inibidores competitivos do 1379.

Tabela 2

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O mapeamento epítopo foi usado parademonstrar que este anticorpo liga-se ao fator B dentro do domínioda terceira repetição de curto consenso (RCC) e o anticorpo evitoua formação do complexo C3bBb. Ainda, os experimentos paramapear o epítopo para o anticorpo mAb1379 indicaram que o localde ligação do epítopo ou anticorpo do fator B não era linear.Experimentos demonstraram que a introdução de determinadassubstituições de alanina em SCRs 2 e 3 do fator humano B1 masnão SCR1, resultaram na perda ou perda substancial da ligação doanticorpo 1379 ao fator B1 que incluiu mutantes que substituíram:139-Tyr-140-Cys-141-Ser com His-Cys-Pro (as posições sendorelevante ao fator humano B maduro representado por SEQ IDNO:2); e 182-Glu-183-Gly-184-Gly-185-Ser com Gly-Asn-Gly-Val.

A superfície de ligação conservada previstaou epítopo do fator humano B que é reconhecido por mAb1379 foimodelado. Brevemente, a estrutura terciária do fator humano B foiconstruída com base na estrutura tridimensional do CR2-SCR1-2(Banco de Dados de Proteína (PDB) id 1GHQ). A Fig. 4 mostra omodelo da estrutura do fator B com as posições dos aminoácidoscorrespondentes ao epítopo mAb1379 (relativo to SEQ ID N0:2)indicado. Os resíduos que acredita-se que formam o epítopoconformacional para o anticorpo mAb1379 são: Ala137, Tyr139,Ser-141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, e Ser192, apesar doepítopo conter somente alguns, substancialmente todos ou maisresíduos do que é descrito na Fig. 4. A Fig. 5 é um desenhoesquemático mostrando um complexo modelado da ligaçãomAB1379 (um fragmento Fab) ao fator B, com os lados de ligaçãoantígena Fab tendo sido modelado para cobrir toda a região epítopomapeado como definido na Fig. 4.

Os anticorpos que foram produzidos pelospresentes inventores, descritos em mais detalhes na Publicação dopedido De Patente dos EUA No. 2005-0260198-A1 e na PublicaçãoInternacional do PCT No. WO 2005/077417, supra, reconhece olocal no fator B que seja compartilhado entre os humanos e muitasoutras espécies de animais em que os experimentos pré-clínicos aprova de princípios são realizados, assim, permitindo descobertasnos modelos da doença humana a serem prontamente traduzidosem terapias humanas. Acredita-se que estes anticorpos sejam osprimeiros anticorpos contra o fator B que exibe a inibição dasespécies amplas da proteína. Portanto, um local único foi tambémidentificado no fator B contra o qual novos reagentes inibitóriospodem ser desenvolvidos.

Na presente invenção, os inventoresdescobriram e relataram pela primeira vez aqui que a inibição da viaalternativa inibe dano fisiológico em dano cerebral traumático(DCT)1 e também inibe dano fisiológico no dano da medula espinhal(DME) e esta informação pode agora ser usado para criar, isoladoe/ou identificado, novos reagentes terapêuticos para o tratamentodo DCT e DME. Além disso, os anticorpos anteriormenteproduzidos e descritos pelos inventores são excelentes agentespara uso nos métodos da presente invenção.

Uma configuração da presente invençãorefere-se a um método para reduzir ou evitar no mínimo um sintomaou condição (incapacidade, deficiência, dano fisiológico) resultantedo (associado com) dano cerebral traumático (DCT) em um animalou intensificar (aumentar) a recuperação do dano causado peloDCT, compreendendo de maneira seletiva inibir a via complementaralternativa em um animal que experienciou o DCT. Uma outraconfiguração da invenção refere-se a um método para reduzir ouevitar no mínimo um sintoma ou condição (incapacidade,deficiência, dano fisiológico) resultante do (associado com) dano damedula espinhal (DME) em um animal ou intensifica (aumenta) arecuperação do dano causado pelo DME, compreendendo demaneira seletiva a inibição da via complementar alternativa em umanimal que experienciou o DME. Em uma configuração preferencial,o método inclui a administração ao animal de um agente que inibe avia complementar alternada, e particularmente, um agente que inibefator B. Em uma configuração particularmente preferencial, o agenteé um anticorpo do antifator B ou um fragmento de ligação antígenodeste.

Conseqüentemente, os métodos da presenteinvenção incluem uma etapa de inibir de maneira seletiva a viacomplementar alternativa em um animal que tenha, ou esteja norisco de desenvolver, dano fisiológico devido ao DCT ou ao DME1respectivamente. De acordo com a presente invenção, inibir a viacomplementar alternativa em um animal refere-se à inibição daexpressão e/ou a atividade biológica de no mínimo uma proteína oumolécula de ácido nucléico codificando esta proteína que é parte davia complementar alternativa. Estas proteínas incluem, mas nãolimitando-se a, fator B, fator D ou properdina. Inibir "de maneiraseletiva" a via complementar alternativa significa que o método dapresente invenção, preferencialmente ou exclusivamente, inibe a viacomplementar alternativa, mas não inibe, ou ao menos não inibe demaneira substancial, outras vias para ativação complementar,incluindo a via clássica complementar ou via lecitina. Por exemplo,os novos anticorpos do fator B e fragmentos antígenos de ligaçãodestes, da presente invenção, são um exemplo de um reagente queinibe de maneira seletiva a via complementar alternativa. Inibir "demaneira seletiva" a proteína específica significa que o método dapresente invenção, preferencialmente ou exclusivamente, inibe aexpressão e/ou a atividade biológica da proteína específica,, masnão inibe, ou ao menos não inibe de maneira substancial, aexpressão e/ou a atividade biológica de outras proteínas (a menosque esta atividade biológica seja uma que seja dividida, como umevento de fluxo inferior, com a proteína específica).

De acordo com a presente invenção, o danocerebral traumático (DCT) é definido como lesão, ferimento ou danocausado por qualquer tipo de trauma à cabeça, como impacto nacabeça ou agitação. Mais especificamente, o DCT é um danoadquirido no cérebro causado por uma força física externa,resultando na incapacidade total ou parcial ou deficiênciapsicossocial ou ambas. O termo aplica-se aos danos abertos efechados resultando em deficiências em uma ou mais áreas, comocognição; linguagem; memória; atenção; raciocínio; pensamentoabstrato; julgamento; solução de problemas; sensitivo, perceptual, ehabilidades motoras; comportamento psicossocial; funções físicas;processamento de informação; e fala. O termo tipicamente não seaplica aos danos cerebrais que são congênitos ou degenerativos,ou danos cerebrais induzidos por trauma do nascimento trauma,apesar deste último tipo de trauma também poder ser tratado com ouso do método da invenção. O DCT pode resultar em umavariedade de sintomas fisiológicos e psicológicos, condições oudeficiências, incluindo deficiências físicas (por exemplo, fala, visão,audição e outras deficiências sensitivas; dores de cabeça; falta decoordenação motora; espasmo muscular; paresia ou paralisia deum ou ambos os lados e crises convulsivas; deficiências deequilíbrio; e outras deficiências no caminhar), deficiências cognitivas(por exemplo, déficits de memória de curto e longo prazo,concentração deficiente, lentidão de pensamento e concentraçãolimitada, assim como deficiências de percepção, comunicação,habilidades de leitura e escrita, planejamento, ordem e julgamento),e deficiências psicossociais-comportamentais-emocionais (porexemplo, fatiga, oscilações de humor, negação, egocentrismo,ansiedade, depressão, auto-estima reduzida, disfunção sexual,inquietude, falta de motivação, incapacidade de automonitoração,dificuldade com controle emocional, incapacidade de cooperar,agitação, risada ou choro em excesso e dificuldade de se relacionarcom os outros). Uma discussão detalhada do diagnóstico do DCTfoi apresentada acima.

Métodos para diagnosticar o DCT são bemestabelecidos na técnica. Tipicamente, o DCT é diagnosticado pelohistórico de traumas, o status clínico e estudos de imagem, comoraios χ e mapeamento por tomografia computadorizada (TC). Deimportância particular está o uso da pontuação da Escala de Comade Glagow (GCS) de pós reanimação (Teasdale e Jennett, 1974,Lancet 2 (7872):81-84), já que este parâmetro representa umimportante indicador de resultados. Ao avaliar o GCS1 a melhorresposta é usada para calcular a pontuação. Os pacientes comdanos leve na cabeça (GCS 14 ou 15) representam em torno de80% de todos os pacientes com trauma na cabeça admitidos nodepartamento de emergência. 0 dano craniano moderadocorresponde a uma pontuação GCS entre 9 e 13 e está associadocom risco elevado para patologia intracraniana comparada aospacientes com dano craniano leve. Uma pontuação GCS de 8pontos ou menos corresponde a um paciente comatoso, comodefinido pela inabilidade de abrir os olhos, de obedecer a comandose responder verbalmente. Assim, o dano craniano severo é definidocomo uma pontuação GCS de 3 a 8. Ao avaliar o paciente,juntamente com o GCS e avaliação do nível de consciência, umexame neurológico tipicamente inclui a avaliação do tamanho dapupila e a reatividade e uma breve avaliação da função motoraperiférica. O exame clínico ainda inclui a inspeção do escalpo porlacerações, exame do crânio para impressão de fraturas e a buscapor sinais indiretos das fraturas do crânio basilar, incluindoequimose periorbital ("olhos de guaxinin"), equimose retroauricular("sinal de Battle"), rinorréia / otorréia devido ao vazamento de FCS,e paralisia do Vllth nervo. Sob determinadas circunstâncias, umamapeamento por TC é fornecido. Outras causas do coma ou estadoalterado da consciência pode ser investigado na análise, comoclassificação por: drogas, disfunção metabólica, fontes internas e externas de sangramento, dano cerebral não-traumático pre-existente (por exemplo, dano cerebral isquêmico ou hemorrágico),epilepsia, trombose da artéria basilar, meningite bacterial, abscessocerebral ou tumor. A classificação morfológica do dano cranianofechado baseia-se nos resultados no mapeamento por TC de acordo com as diretrizes de Marshall e colegas (Marshall et al., J.Neurosurg. 1991, 75.S14-S20). Lesões intracranianas podem serfocais (sangramento subdural, epidural, intracerebral; "evacuado"vs. "não evacuado") ou difusas (grau l-IV). As discussõesdetalhadas dos parâmetros usados para avaliar o DCT são descritas, por exemplo, in Vos et al., 2002, Eur. J. Neuroi 9:207-219e Gaetz, 2004, Clin. Neurophysioi 115:4-18.

De acordo com a presente invenção, dano damedula espinhal (DME) é definido como qualquer dano, ferimentoou lesão à medula espinhal que resulte em uma perda de função, como mobilidade ou sensibilidade. As causas freqüentes dos danossão traumas (por exemplo, por acidente de carro, tiro, quedas, etc.)ou doença (pólio, espinha dorsal, Ataxia de Friedreich, etc.). Amedula espinhal não tem que estar partida para que uma perda nofuncionamento ocorra. Na maioria dos indivíduos com DME, a medula espinhal está intacta, mas os danos a ela resultam na perdada função. Além da perda da sensação ou função motora, osindivíduos com DME podem também experienciar sintomas,condições, ou deficiência, incluindo disfunção do intestino e bexiga,disfunção sexual e fértil, inabilidade de regular a pressão sangüíneade maneira eficaz, controle reduzido da temperatura do corpo,inabilidade de suar abaixo do nível do dano e dor crônica. Umpaciente com DME pode ter qualquer nível de DME1 comotipicamente definido pelo nível do dano (por exemplo, em ou abaixoda oitava vértebra cervical ou a décima segunda vértebra torácica).Os danos muito altos (C-1,C-2) podem resultar na perda dasmuitas funções involuntárias incluindo a habilidade em respirar,acessórios de necessidades respiratórias como ventiladoresmecânicos ou marca passo diafragmático.

Os métodos para diagnosticar o dano damedula espinhal são bem estabelecidos na técnica. Na sala deemergência, um médico pode ser capaz de excluir a possibilidadede dano da medula espinhal inspecionando de maneira cuidadosauma pessoa lesionada, testando a função sensitiva e osmovimentos e perguntando sobre o acidente. Se a pessoamachucada reclama de dor no pescoço, não está totalmenteacordada ou tem sinais óbvios de fraqueza ou dano neurológico, ostestes de diagnósticos de emergência podem ser necessários.Estes testes podem incluir raios X, mapeamento por tomografiacomputadorizada (TC), imagem ou ressonância magnética (MRI),ou mielografia. Vários exames neurológicos também podem serrealizados. Os efeitos do DME dependem do tipo de lesão e donível da lesão. O DME pode ser geralmente dividido em dois tiposde danos - completo e incompleto. Um dano completo significa quenão há função abaixo do nível da lesão (ou seja, nenhumasensação e nenhum movimento voluntário). Ambos os lados docorpo são igualmente afetados. Uma lesão incompleta significa quehá algum funcionamento abaixo do nível primário da lesão. Umapessoa com lesão incompleta pode ser capaz de mover um membromais do que o outro, pode ser capaz de sentir partes do corpo quenão podem ser movidas ou, pode ter mais funcionamento de umlado do corpo do que do outro. Com os avanços no tratamentoagudo do DME, as lesões incompletas estão se tornando maiscomuns.

O nível da lesão é muito útil na previsão dequais partes do corpo podem ser afetadas por paralisia e perda dafunção no DME. Lesões cervicais (pescoço) normalmente resultamem quadriplegia. As lesões acima do nível C-4 podem exigir umventilador para a pessoa respirar. As lesões C-5 freqüentementeresultam no controle do ombro e bíceps, mas nenhum controle nopulso ou na mão. As lesões C-6 de modo geral produzem o controledo pulso na função da mão. Os indivíduos com lesões C-7 e T-1podem fortalecer seus braços, mas ainda podem ter problemas dedestreza com a mão e os dedos. As lesões no nível toráxico eabaixo resultam em paraplegia, com as mãos não afetadas. Da T-1a T-8 há com mais freqüência o controle das mãos, mas o controlefraco do tronco como o resultado da falta de controle do músculoabdominal. Lesões T inferiores (T-9 a T-12) permitem bom controledo tronco e bom controle do músculo abdominal. O equilíbrio desentar é muito bom. As lesões lombares e sacras produzemredução dos flexores dos quadris e pernas. As pessoas comtetraplegia têm lesões em um dos oito segmentos cervicais damedula espinhal; aqueles com paraplegia têm lesões nas regiõestoráxica, lombar ou sacra da medula espinhal.

A presente invenção é direcionada para inibiro dano fisiológico e os sintomas ou condições (incapacidades,deficiências) associado com este dano, que resulta do DCT ou DMEcomo descrito em detalhes acima. Como tal, não é necessário queo dano fisiológico ou todos os efeitos da condição sejam totalmenteevitados ou revertidos, apesar dos efeitos do presente métodoprovavelmente prolongarem-se a um benefício terapêuticosignificante para o paciente. Como tal, um benefício terapêuticonão é necessariamente uma completa prevenção ou cura para umacondição particular ou dano fisiológico resultante do DCT ou DME1mas sim, pode incluir um resultado que inclui a redução ouprevenção dos sintomas ou dano fisiológico que resultam do DCTou DME, reduzir ou evitar a ocorrência destes sintomas ou danos(quantitativamente ou qualitativamente), reduzir a severidade destessintomas ou efeitos fisiológico, e/ou aumentar a recuperação dopaciente após experimentar o DCT ou DME. Especificamente, umacomposição da presente invenção, quando administrada a umpaciente, preferencialmente evita danos associados com o danocerebral ou dano da medula espinhal e/ou reduz ou alivia ossintomas ou condições associadas com (resultantes de) o dano,sinais do dano ou mesmo as causas do dano, assim como eleva arecuperação do dano. Como tal, para proteger um paciente dosefeitos fisiológicos ou sintomas resultantes do DCT ou DME (oucondições relacionadas) inclui a prevenção ou redução daocorrência e/ou severidade dos efeitos do dano e tratamento de umpaciente em que os efeitos do dano já estão ocorrendo oucomeçando a ocorrer. Um efeito benéfico pode facilmente ser umahabilidade ordinária na técnica e/ou por um clínico treinado queesteja tratando o paciente. Por exemplo, muitos dos métodos acimadescritos para o diagnóstico do DCT ou DME podem ser usadospara avaliar o paciente antes e após tratamento usando um métododa presente invenção para avaliar o sucesso do tratamento.

Preferencialmente, há uma diferença positiva ou benéfica naseveridade ou ocorrência de no mínimo uma pontuação, valor, oumedida clínica ou biológica usada para avaliar estes pacientesnaqueles que foram tratados de acordo com a presente invençãocomo comparado àqueles que não.

A inibição da via complementar alternativa deacordo com a presente invenção para os propósitos de inibição aodano fisiológico, e os sintomas ou condições (incapacidades,deficiências) associados com este dano, que resulte do DCT ouDME, podem ser realizadas ao afetar diretamente a expressão(transcrição ou tradução) ou atividade biológica de uma proteína navia complementar alternativa, ou por afetar diretamente a habilidadede uma proteína para ligar a uma proteína na via complementaralternativa ou para de outro modo contribuir com a ativação da viacomplementar à via alternativa. Mais especificamente, em umaconfiguração, a expressão de uma proteína refere-se à transcriçãoda proteína ou à tradução da proteína. Portanto, o método dapresente invenção pode inibir a transcrição e/ou a tradução de umaproteína no animal, que naturalmente expressa a proteína (porexemplo, pela administração de um agente que inibe a expressãoda proteína e geneticamente modifica um animal para ter aexpressão de proteína reduzida). Em uma outra configuração, ainibição da via complementar alternativa é definida aqui comoqualquer redução mensurável (detectável) (ou seja, redução,regulação negativa, inibição) da atividade da via, como por qualquerredução mensurável em uma expressão e/ou atividade biológica deuma proteína com uma via complementar alternativa, e poderáincluir bloquear ou inibir a habilidade de uma proteína ou moléculapara atuar na via complementar alternativa.

Os métodos para inibir a expressão de umaproteína incluem, mas não se limitam à, administração de umagente que inibe a expressão da proteína (diretamente ouindiretamente), e geneticamente modifica um animal para terreduzida expressão de proteína (por exemplo, observe que oscamundongos fB-A aqui usados). Preferencialmente, a expressãode proteína é inibida pela administração de um agente (reagente,composto, droga) ao animal que diretamente inibe a expressão deproteína. Estes agentes incluem, mas não se limitam a: umaribozima ou RNAi que seja específica para a RNA codificando aproteína; uma proteína de ligação de DNA ou uma droga que ligue-se a um gene ou RNA codificando a proteína e inibe a expressão daproteína; um aptâmero que ligue-se à proteína; a proteína ou drogaque ligue-se à proteína de maneira intracelular e evita a secreçãoda proteína pela célula que a expressa; e, um ácido nucléico isoladoque reduza a expressão da proteína pela hibridização sob altascondições rigorosas a gene codificando a proteína na célula doanimal (por exemplo, uma molécula de ácido nucléico anti-sentido).Estes compostos que, de maneira seletiva inibem a expressão deuma proteína, podem ser produzidos através de técnicasconhecidas àqueles especializados na técnica.

Conseqüentemente, o método da presenteinvenção inclui o uso de uma variedade de agentes (ou seja,compostos regulatórios) que, ao agir diretamente na proteína na viacomplementar alternativa, inibe de maneira seletiva a expressãoe/ou atividade biológica de uma ou mais proteínas na viacomplementar alternativa de forma que o dano fisiológico associadocom o DCT ou DME seja reduzido em um animal. Os agentes úteisna presente invenção incluem, por exemplo, proteínas, molécula deácido nucléico, anticorpos, e compostos que são produtos dedrogas racionais (ou seja, drogas). Estes agentes são, geralmente,referidos aqui como inibidores.

De acordo com a presente invenção, uminibidor é qualquer agente que inibe, seja por inibição direta ouinibição competitiva, a expressão e/ou atividade biológica de umaproteína (por exemplo, a proteína na via complementar alternativa),e inclui agentes que agem no fator B, fator D ou properdina. Emuma configuração da presente invenção, a inibição da viacomplementar alternativa ou a proteína da via complementaralternativa é aqui definida como qualquer redução mensurável(detectável) (ou seja, redução, regulação negativa, inibição) daatividade biológica de uma proteína na via complementaralternativa. A atividade biológica ou ação biológica de uma proteínarefere-se a qualquer função exibida ou executada de uma forma deocorrência natural da proteína como medido ou observado in vivo(ou seja, no ambiente fisiológico natural da proteína) ou in vitro (ouseja, sob condições laboratoriais). Por exemplo, a atividadebiológica do fator B pode incluir, mas não se limita a, ligação ao C3ativado, solubilização de complexos imunes, atividade decrescimento celular do fator B1 e ativação monócitos. Uma atividadebiológica do fator D pode incluir, mas não se limita a, catálises dasegmentação do fator B quando em complexo com C3, catálises daformação de Ba e Bb. A atividade biológica da properdina podeincluir, mas sem limitações, ligação e estabilização da célula- ouligação do imunocomplexo C3bBb e estabilização do convertaseC3/C5.

De acordo com a presente invenção, aatividade biológica de uma proteína pode ser inibida pela prevençãodireta ou inibindo (reduzindo, diminuindo) a habilidade da proteínade ligar-se e/ou ativar uma outra proteína (por exemplo, C3), assim,inibindo os eventos de fluxo inferior desta ligação.Preferencialmente, a atividade biológica da via complementaralternativa é inibida através da administração de um agente queinibe no mínimo uma proteína em uma via, como agente incluindo,mas não limitado a, um agente que se ligue a uma proteína em umavia ou compete com a proteína em uma via de uma maneira que ahabilidade da proteína para se ligar e/ou ativar uma outra proteínaseja inibida ou prevenida.

Os agentes que inibem uma proteína na viacomplementar alternativa podem incluir, mas não são limitados a,compostos que são produtos da criação de drogas racionais,produtos naturais, e compostos tendo propriedades regulatóriasparcialmente definidas. Um agente regulatório, incluindo umantagonista de uma determinada proteína, pode ser um composto abase de proteína, um composto a base de carboidrato, umcomposto a base de lipídio, um composto a base de ácido nucléico,um composto orgânico natural, um composto orgânico, ou droga,sinteticamente derivado, um anticorpo (incluindo fragmentos deligação antígena destes), ou fragmentos destes. Um tipo particularde agente útil na presente invenção é um antagonista da viacomplementar alternativa, incluindo um antagonista de umaproteína dentro desta via. De acordo com a presente invenção, um"antagonista" refere-se a qualquer composto que inibe (porexemplo, antagoniza, reduz, diminui, bloqueios, reversos, ou altera)o efeito de uma determinada proteína. Mais particularmente, umantagonista é capaz de atuar de uma maneira relativa à atividadeespecífica da proteína, de forma que a atividade biológica de umadeterminada proteína seja diminuída ou bloqueada de uma maneiraque é antagonística (por exemplo, contra, um reverso, contrário a) àação natural de uma proteína. Os antagonistas podem incluir, masnão se limita a, um fragmento de ligação de anticorpo ou antígenadeste, uma proteína, peptídeo, ácido nucléico (incluindo ribozimas eanti-sentido), ou um produto de criação dedroga/composto/peptídeo ou seleção que apresenta o efeitoantagonístico. Por exemplo, a presente invenção inclui quaisquerantagonistas das proteínas naturais, fator B, fator D ou properdina,incluindo antagonistas de anticorpo, proteína/peptídeo antagonistas,ácido nucléico antagonista, ou pequenas moléculas antagonistas(por exemplo, um inibidor de molécula pequena).

Em uma configuração, os agentesregulatórios da presente invenção incluem drogas, incluindopeptídeos, oligonucleotídeos, carboidratos e/ou moléculasorgânicas sintéticas que regulam a produção e/ou função de umaou mais proteínas na via complementar alternativa. Este agentepode ser obtido, por exemplo, a partir das estratégias dediversidade molecular (uma combinação das estratégiasrelacionadas permitindo a rápida construção de bibliotecas demoléculas quimicamente diversas), bibliotecas de compostosnaturais ou sintéticos, em particular de bibliotecas químicas oucombinatórias (ou seja, bibliotecas dos compostos que diferem emseqüência ou tamanho, mas que têm os mesmos blocos deconstrução) ou pela criação de uma droga racional. Veja comoexemplo, Maulik e outros., 1997, Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications e Strategies, Wiley-Liss, Inc., que estáaqui incorporado como referência na sua totalidade.

Em uma estratégia de diversidade molecular,grandes bibliotecas compostas são sintetizadas, por exemplo, apartir de peptídeos, oligonucleotídeos, carboidratos e/ou moléculasorgânicas sintéticas, através de abordagens biológicas, enzimáticase/ou químicas. Os parâmetros críticos no desenvolvimento de umaestratégia de diversidade molecular incluem a diversidade desubunidade, tamanho molecular, e diversidade de biblioteca. A metageral de classificação destas bibliotecas é utilizar a aplicaçãoseqüencial de seleção combinatória para obter as ligações de altaafinidade contra um alvo desejado, e então otimizar as moléculaslíderes através de estratégias aleatórias ou direcionadas. Osmétodos da diversidade molecular são descritos em detalhes emMaulik, e outros., acima.

Em um procedimento de criação de drogaracional, a estrutura tridimensional de um composto regulatóriopode ser analisada, por exemplo, pela ressonância magnéticanuclear (RMN) ou cristalografia raio X. Esta estrutura tridimensionalpode, então, ser usada para prever as estruturas dos compostospotenciais, como agentes regulatórios potenciais através de, porexemplo, modelagem computadorizada. A estrutura compostaprevista pode ser usada para otimizar os compostos líderesderivados, por exemplo, por métodos de diversidade molecular.Além disso, a estrutura do composto prevista pode ser produzidapor, por exemplo, síntese química, tecnologia de DNArecombinante, ou pelo isolamento de um mimotopo a partir de umafonte natural (por exemplo, plantas, animais, bactérias e fungos).

Vários outros métodos da criação da drogacom base na estrutura são revelados em Maulik e outros., 1997,acima. Maulik e outros, revela, por exemplo, métodos de criaçãodirecionada, em que o usuário direciona o processo de criarmoléculas novas a partir de uma biblioteca de fragmento defragmentos apropriadamente selecionados; criação aleatória, emque o usuário usa uma genética ou outro algoritmo paraaleatoriamente modificar os fragmentos e suas combinaçõesenquanto aplicando de maneira simultânea um critério de seleçãopara avaliar a aptidão física dos Iigantes do candidato; e umaabordagem baseada em uma grade em que o usuário calcula aenergia de interação entre três estruturas receptoras dimensionais eas pequenas sondas de fragmentos, seguidas de ligação dos locaisfavoráveis de sonda.

Uma molécula isolada de ácido nucléico queseja útil como um agente para inibir uma proteína (ou suaexpressão) na via complementar alternativa é um anti-sensomolécula de ácido nucléico, um ribozima, siRNA, ou um aptâmero.Como aqui usado, uma molécula anti-senso de ácido nucléico édefinida como uma molécula isolada de ácido nucléico que reduz aexpressão de uma proteína pela hibridização sob condições de altaseveridade a um gene codificando a proteína. Esta molécula deácido nucléico é suficientemente similar ao gene codificando aproteína que a molécula é capaz de hibridizar sob condições de altaseveridade ao filamento codificador do gene ou RNA codificando aproteína natural. A interferência por RNA (RNAi) é um processosegundo o qual o RNA de duplo filamento, e em sistemasmamíferos, RNA de curta interferência (siRNA), é usado para inibirou silenciar a expressão dos genes complementares. Na célulaalvo, os siRNA estão desatados e associados com um complexosilenciador induzido de RNA (RISC), que é, então, guiado àsseqüências de mRNA que são complementares ao siRNA, onde oRISC divide o mRNA. Uma ribozima é um segmento RNA quefunciona através da ligação à metade do RNA alvo e o torna inativopela divisão da espinha dorsal fosfodiéster no local de corteespecífico. Os aptâmeros são filamentos curtos de ácido nucléicosintético (normalmente RNA, mas também DNA) selecionado apartir das bibliotecas aleatórias de ácido nucléico combinatório emvirtude de sua habilidade em ligar-se a uma molécula alvoespecífica, pré-determinada com alta afinidade e especificidade. Osaptâmeros assumem uma estrutura tridimensional definida e sãocapazes de discriminar entre compostos com diferenças muitopequenas na estrutura.

Um gene inclui regiões regulatórias quecontrolam a produção da proteína codificada por aquele gene(como, mas não limitado à, regiões de controle de transcrição,tradução ou pós-tradução) assim como a própria regiãocodificadora. Os genes codificando várias proteínas da viacomplementar alternativa, incluindo fator B, fator D ou properdina,foram identificados e são conhecidos na técnica. Uma moléculaisolada de ácido nucléico is a molécula de ácido nucléico que tenhasido removida a partir de seu ambiente natural (ou, seja, que tenhasido sujeitado à manipulação humana) e pode incluir DNA, RNA1 ouderivados de DNA ou RNA. Como tal, "isolado" não reflete aextensão à qual a molécula de ácido nucléico tenha sido purificada.Uma molécula isolada de ácido nucléico da presente invenção podeser isolada a partir sua fonte natural ou produzida usandotecnologia de DNA recombinante (por exemplo, amplificação dareação de cadeia polimerase (PCR), clonagem) ou síntese química.

Como aqui usado, a referência às condiçõesde hibridização refere-se às condições padrões de hibridizaçãocujas moléculas de ácidos nucléicos são usadas para identificarmoléculas similares de ácidos nucléicos. Estas condições padrõessão reveladas, por exemplo, em Sambrook e outros., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press,1989. Sambrook e outros., ibid., é incorporado como referênciaaqui na sua totalidade (veja, especificamente, páginas 9.31-9.62).

Ainda, a fórmula para calcular a hibridização apropriada econdições de purificação para alcançar a hibridização permitindovários graus de incompatibilidade de nucleotídeos é revelada, porexemplo, em Meinkoth e outros., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth e outros., ibid., está incorporada pela referência aquina sua totalidade.

Em uma configuração preferencial dapresente invenção, o agente usado para inibir a proteína da viacomplementar alternativa para o propósito de inibir o danofisiológico que resulta do DCT ou DME (e os sintomas ou condições(deficiência, incapacidades) associadas com este dano), é umanticorpo ou um fragmento de ligação antígeno deste. De modosimilar, um polipeptídeo de ligação antígena é tambémparticularmente preferido para uso na presente invenção. Em umaspecto, o anticorpo de maneira seletiva liga-se à proteína da viacomplementar alternativa de modo que a proteína seja inibida ouprevenida da ligação a uma outra proteína com a qual normalmenteinterage (sob condições naturais ou fisiológicas). Em um outroaspecto o anticorpo de maneira seletiva liga-se à proteína, de modoque a proteína seja inibida ou prevenida da ativação de uma outraproteína com a qual ela normalmente interage, mesmo que umaproteína possa ao menos parcialmente ligar-se à outra proteína.

Particularmente, os anticorpos preferidos e fragmentos antígenosde ligação destes para uso na inibição seletiva da via complementaralternativa para o propósito de inibir o dano fisiológico que resultado DCT ou DME são descritas em detalhes abaixo (por exemplo, osanticorpos fator B aqui descritos, e particularmente, o anticorpomAb1379 aqui descrito em detalhes).

Preferencialmente, um fragmento de ligaçãode anticorpo ou antígeno deste, úteis na presente invenção liga-se àproteína selecionada a partir de fator B, fator D ou properdina. Maispreferencialmente, a invenção inclui um fragmento de ligação deanticorpo ou antígeno deste que se liga ao fator B, e seu uso para opropósito de inibir o dano fisiológico que resulta de DCT ou DME.Os anticorpos (e fragmentos antígenos de ligação destes) que demaneira seletiva liga-se ao fator B e inibe a via complementaralternativa de acordo com a invenção são descritas eexemplificadas aqui em detalhes. Em uma configuração, ofragmento de ligação de anticorpo ou antígeno deste liga-se a umasuperfície de ligação conservada ou epítopo desta proteína (porexemplo, fator B) que é conservado entre as espécies animais eparticularmente mamíferos, espécies (ou seja, o anticorpo é dereatividade cruzada com uma proteína a partir de duas ou maisespécies diferentes de mamíferos). Em particular, a presenteinvenção inclui um anticorpo que se liga ao fator B a partir de aomenos duas, e preferencialmente, as várias espécies diferentes demamíferos, incluindo, mas não se limitando a, humano, primatanão-humano, camundongo, rato, porco, cavalo e coelho.Preferencialmente, a presente invenção inclui um anticorpo que seliga ao fator B de humano e ao menos uma espécie animaladicional, e preferencialmente, ao menos uma espécie mamíferaadicional, incluindo, mas sem limitações, primata não-humano,camundongo, rato, porco, cavalo e coelho. Em uma configuração, ofragmento de ligação de anticorpo ou antígeno deste liga-se aterceira repetição de curto consenso (RCC) de fator B. Em umaconfiguração, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígenodeste liga-se a uma região do fator B que evita a classificação dofator B por fator D. Em uma configuração, o anticorpo é umanticorpo monoclonal. Em uma configuração, o anticorpo é oanticorpo aqui referido como 1379 (ou seja, o anticorpo produzidopela linha celular hibridoma do mesmo número, também tendoATCC Designação de Depósito PTA-6230), ou um fragmento deligação antígeno deste.

O hibridoma aqui descrito como 1379 (oumAb1379) foi depositado em 21 de setembro de 2004, na AmericanType Culture Collection (ATCC, localizada na 10801 University Blvd,Manassas, VA 20110-2209), sob os termos do tratado deBudapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos Para Fins de Procedimento de Patente, e recebeua Designação de Depósito da ATCC PTA-6230.

De acordo com a presente invenção, otamanho mínimo de uma proteína, porção de uma proteína (porexemplo, fragmento, porção, domínio, etc.), ou região ou epítopo deuma proteína, é um tamanho suficiente para servir como um epítopoou superfície de ligação conservada para a geração de umanticorpo ou como um alvo em uma análise in vitro. Em umaconfiguração, a proteína da presente invenção é no mínimo 4, 5, 6,7 ou 8 aminoácidos em comprimento (por exemplo, adequado paraum anticorpo epítopo ou como um peptídeo detectável em umaanálise), ou no mínimo 25 aminoácidos em comprimento, ou nomínimo 50 aminoácidos em comprimento, ou no mínimo 100aminoácidos em comprimento, ou no mínimo 150 aminoácidos emcomprimento, e assim por diante, em qualquer comprimento entre 4aminoácidos e até o comprimento total de uma proteína ou porçãodesta ou maior, em números inteiros (por exemplo, 8, 9, 10,...25,26,...500, 501,...).

A seqüência de nucleotídeos para o gene eregião codificadora codificando o fator humano B e outras proteínascomplementares, assim como a seqüência de aminoácido destasproteínas, é bem conhecida na técnica. Por exemplo, o gene fatorhumano B e outras proteínas complementares são encontrados noAcesso da Base de Dados NCBI No. NG_000013. A seqüênciacodificadora para o fator B é encontrada no Acesso da Base deDados NCBI No. NM_001710 e a seqüência de aminoácido parafator B prepro-proteína é encontrada no Acesso da Base de DadosNCBI No. NP_001701 ou P00751. A seqüência de aminoácido paraAcesso da Base de Dados NCBI No. P00751, que a seqüência daprepro-proteína do fator B, é representada aqui por SEQ ID NO:1.As seqüências de outras espécies de animais são tambémconhecidas na técnica. Através da comparação, na seqüência dofator B do camundongo (por exemplo, ver Acesso da Base deDados NCBI No. P04186, aqui representado por SEQ ID NO:6), odomínio da terceira RCC está localizado nas posições 160-217desta pré-proteína do aminoácido 761, e a proteína do fator B domurino maduro proteína atravessa as posições 23-761 da SEQ IDNO:6. A seqüência codificadora para o fator humano D éencontrado no Acesso da Base de Dados NCBI No. NM_001928.2 ea seqüência do aminoácido para a prepro-proteína do fator humanoD é encontrada no Acesso da Base de Dados NCBI No. NP_001919(aqui representado como SEQ ID NO:7). A seqüência codificadorapara a properdina humana é encontrada no Acesso da Base deDados NCBI No. NM_002621.1 e a seqüência de aminoácido para aproperdina humana é encontrado no Acesso da Base de DadosNCBI No. NP_002612 (aqui representado por SEQ ID NO:8).

A pré-proteína do fator humano Brepresentada por SEQ ID NO:1 é uma proteína de aminoácido 764com um peptídeo indicador atravessando das posições 1-25 doaminoácido. A cadeia madura do fator B corresponde às posições26-764 da SEQ ID NO:1 e é aqui representado por SEQ ID NO:2.As três regiões RCC do fator humano B estão aqui representadaspor SEQ ID NO:3 (SCR1, também conhecida como Sushi 1,atravessando da posição 35 à posição 100 da SEQ ID NO:1 ou daposição 5 à posição 75 da SEQ ID NO:2), SEQ ID NO:4 (SCR2,também conhecida como Sushi 2, atravessando da posição 101 àposição 160 da SEQ ID NO:1 ou da posição 76 para a posição daSEQ ID NO:2), e SEQ ID NO:5 (SCR3, também conhecida comoSushi 3, atravessando da posição 163 à posição 220 da SEQ IDNO:1 ou da posição 138 à posição 195 da SEQ ID NO:2).

Com base no mapeamento do epítopo dofator B usando os fragmentos descritos por Hourcade, 1995, J. Biol.Chem., em uma configuração preferida, um anticorpo do antifator Bútil na presente invenção, liga-se preferencialmente a um epítopoou superfície de ligação conservada dentro ou contendo uma partedo domínio da terceira RCC, e mais preferencialmente, a umepítopo do fator humano B que inclui ao menos uma porção daseqüência compreendendo da posição Tyr139 à posição Ser185com relação proteína ao fator B maduro (SEQ ID NO:2), a umepítopo do fator humano B que inclui ao menos uma porção daseqüência compreendendo da posição Tyr139 à posição Ser141com respeito à proteína madura do fator B (SEQ ID NO:2), a umepítopo do fator humano B que inclui ao menos uma porção daseqüência compreendendo à posição Glu182 à posição Serl 85 comrespeito ao fator maduro da proteína B (SEQ ID NO:2), a umepítopo do fator B que inclui ao menos uma porção do fator humanoB (SEQ ID NO:2) compreendendo uma ou mais das seguintesposições ou suas posições equivalentes em seqüência do fator não-humano B sequence: Tyr139, Cys 140, Ser141, Glu182, Gly184, ouSer185, ou a um epítopo do fator B que inclui ao menos uma porçãodas posições equivalentes com respeito às espécies animais nãohumanas. Um dos especialistas na técnica pode prontamentealinhar a seqüência do fator humano B com a seqüência do fator Ba partir de espécies de animais e determina as posições dasregiões RCC e as porções específicas das terceiras regiões RCCcorrespondendo às posições do aminoácido acima. Por exemplo, asseqüências específicas podem ser alinhadas uma a outra com ouso da seqüência BLAST 2 como descrito em Tatusova e Madden,(1999), "Blast 2 dequences - a new tool for comparing protein andnucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250,incorporados aqui por referência na sua totalidade.

Com base na modelagem e mapeamentoadicional do epítopo de um anticorpo útil exemplar na invenção, emuma outra configuração preferencial, um anticorpo antifator B útil napresente invenção, preferencialmente liga-se a um epítopo(superfície de ligação conservada) dentro ou contendo um parte ouporção do domínio da terceira RCC do fator B que inclui ao menosuma ou mais das seguintes posições de aminoácidos, com relaçãoao SEQ ID NO:2, ou suas posições equivalentes em uma seqüênciafator não-humano Β: A137, Y139, S141, E182, S185, T189, E190, eS192. Em um aspecto da invenção, o epítopo está dentro oucontando uma parte da porção do domínio da terceira RCC do fatorB que inclui todos ou substancialmente todos (ao menos cinco, seisou sete das seguintes posições de aminoácidos da SEQ ID NO:2,ou suas posições equivalentes em uma seqüência de fator não-humano B: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, e Ser192. Em um outro aspecto, o epítopo reconhecido porum anticorpo do antifator B útil na presente invenção está dentro oucontém uma parte ou porção do domínio da terceira RCC do fator Bconsistindo das seguintes posições do aminoácido da SEQ IDNO:2, ou suas posições equivalentes em uma seqüência do fator não-humano B: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189,Glu190, e Ser192.

Em uma configuração, o epítopo reconhecidopelo anticorpo útil fator B em uma invenção pode também serdefinido mais particularmente como sendo um epítopo não linear localizado dentro da estrutura tridimensional de uma porção dodomínio da terceira RCC do fator Β. A porção que contém o epítopoé a estrutura tridimensional do fator B que é definidosubstancialmente todas as posições (por exemplo, ao menos 90%)de aminoácidos Ala137-Ser192 da SEQ ID NO:2, ou posiçõesequivalentes na seqüência do fator não-humano B, quando estaseqüência é arranjada de modo adaptável como acontece naseqüência natural de comprimento total do fator B. Um modelo daestrutura tridimensional do fator B, que ilustra um epítopo paramAb1379, é ilustrado na Fig. 4 e na Fig. 5, por exemplo. Como aquiusado, a "estrutura tridimensional" ou "estrutura terciária" de umaproteína refere-se ao arranjo dos componentes de uma proteína emtrês dimensões. Este termo é bem conhecido aos especialistas natécnica. Como aqui usado, o termo "modelo" refere-se àrepresentação de um meio tangível da estrutura tridimensional deuma proteína, polipeptídio ou peptídeo. Por exemplo, um modelopode ser uma representação da estrutura tridimensional em umarquivo eletrônico, em uma tela de computador, em um pedaço depapel (ou seja, em um meio bidimensional), e/ou como uma figurado tipo ball-and-stick.

De acordo com a presente invenção, um"epítopo" de uma determinada proteína ou peptídeo ou outramolécula é geralmente definido, com relação aos anticorpos, comouma parte ou local em uma molécula maior à qual um anticorpo oufragmento de ligação antígena deste se ligará e uma oposição a umanticorpo será produzida. O termo epítopo pode ser usado demaneira intercambiável com o termo "determinante antigênico","local de ligação do anticorpo", ou "superfície de ligaçãoconservada" de uma determinada proteína ou antígeno. Maisespecificamente, um epítopo pode ser definido pelos resíduos deaminoácido envolvidos na ligação do anticorpo e também por suaconformação no espaço tridimensional (por exemplo, um epítopoadaptável ou a superfície de ligação conservada). Um epítopo podeser incluído nos peptídeos pequenos como os resíduos deaminoácido 4-6, ou podem ser incluídos em segmentos maiores deuma proteína, e não precisam ser compreendidos de resíduos deaminoácido contíguo quando se referindo à estrutura tridimensionalde um epítopo, particularmente com relação a um epítopo deligação anticorpo. Os epítopos de ligação de anticorpos sãofreqüentemente epítopos adaptáveis ao invés de um epítoposeqüencial (ou seja, linear epítopo), ou em outras palavras, umepítopo definido por resíduos de aminoácido preparadostridimensional à superfície de uma proteína ou polipeptídio ao qualum anticorpo liga-se. Como acima mencionado, o epítopo adaptávelnão é compreendido de uma seqüência contígua dos resíduos deaminoácidos, mas sim, os resíduos são talvez amplamenteseparados na seqüência de proteína primária, e são unidas paraformar uma superfície de ligação pelo caminho que proteína seenvolve em sua adaptação nativa de modo tridimensional. Oepítopo reconhecido pelo mAb1379 é um epítopo adaptável quenão é um epítopo linear.

Um especialista na técnica identifica e/ouepítopos de montagem adaptáveis e/ou epítopos usando técnicasconhecidas, incluindo análise mutacional (por exemplo, mutagênesede local direcionado); proteção da degradação proteolítica(impressão proteína); análise mimotope através do uso, porexemplo, peptídios sintéticos e pepscan, BIACORE ou ELISA;mapeamento de competição de anticorpo; classificação debiblioteca de peptídio combinatorial; espectômetro de massa detempo de vôo de dessorção/ionização de laser de matriz assistida(MALDI-TOF); ou modelagem tridimensional (por exemplo, usandoqualquer programa se software adequado, mas sem limitações,MOLSCRIPT 2.0 (Avatar Software AB1 Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Stockholm, Sweden), o programa de apresentação gráfica O(Jones e outros., Acta Crystallography, vol. A47, p. 110, 1991), oprograma de apresentação gráfico GRASP, ou o programa deapresentação gráfico INSIGHT). Por exemplo, pode-se usarreposição molecular ou outras técnicas e a estrutura tridimensionalconhecida de uma proteína relacionada ao modelo da estruturatridimensional do fator B e prevê o epítopo conformacional daligação do anticorpo a esta estrutura. Na verdade, pode-se usaruma ou qualquer combinação destas técnicas para definir a ligaçãodo anticorpo epítopo. A Figs. 4 e 5 ilustram o uso da modelagemtridimensional, combinado com a informação da análise mimotope eanálise mutacional, para identificar o epítopo do fator B anticorpoútil na presente invenção.

Como aqui usado, o termo "de maneiraseletiva liga-se a" refere-se à ligação específica de uma proteína àoutra (por exemplo, um anticorpo, fragmento deste, ou ligaçãoassociada a um antígeno), onde o nível de ligação, como medidopor qualquer análise padrão (por exemplo, uma imunoanálise), éestatisticamente e significantemente maior do que o controle defundo para a análise. Por exemplo, quanto executando umaimunoanálise, os controles tipicamente incluem uma reação nalâmina well/tubo que contém o anticorpo ou fragmento de ligaçãoantígeno sozinho (ou seja, na ausência do antígeno), onde umaquantia da reatividade (por exemplo, ligação não específica àlâmina well) pelo fragmento de ligação de anticorpo ou antígenadeste na ausência do antígeno é considerado que seja secundária.A ligação pode ser medida com o uso de uma variedade demétodos padrão na técnica, incluindo, mas não limitado a: Westernblot, immunoblot, análise imunoabsorvente ligada à enzima (ELISA),radioimunoanálise (RIA), imunoprecipitação, ressonância de plasmade superfície, quimioluminiscência, polarização fluorescente,fosforescência, análise imunoquímica, espectômetro de massa detempo de vôo de dessorção/ionização de laser de matriz assistida(MALDI-TOF); ou modelagem tridimensional, microcitometria,microanálise, microscopia, seleção de célula ativada porfluorescência (FACS), e citometria de fluxo.

Uma configuração da presente invençãoinclui o use de um fragmento de ligação de anticorpo ou antígenodeste que é um inibidor competitivo da ligação do fator B aoanticorpo do antifator B (por exemplo, anticorpo monoclonal 1379)para inibir o dano fisiológico e os efeitos associados com DCT ouDME. De acordo com a presente invenção, o inibidor competitivodo fator B liga-se a um anticorpo do antifator B da presenteinvenção é um inibidor (por exemplo, um outro anticorpo oufragmento de ligação antígeno ou polipeptídio) que se liga ao fator Bno mesmo ou similar epítopo como o anticorpo conhecido doantifator B da presente invenção (por exemplo, mAb 1379) como aligação do anticorpo conhecido do antifator B ao fator B é inibida.Um inibidor competitivo pode ligar-se ao alvo (por exemplo, fator B)com uma maior afinidade para o alvo do que o anticorpo do antifatorΒ. A inibidor competitivo pode ser usado de modo similar àqueleaqui descrito para o anticorpo do antifator B 1379 (por exemplo,para inibir a via complementar alternativa, para inibir danofisiológico ou efeitos causados pelo DCT ou DME). Por exemplo,uma configuração da invenção refere-se ao uso de um anticorpoisolado ou fragmento de ligação antígeno já que, especificamente,se liga ao fator B, onde o anticorpo ou fragmento deste inibe demaneira competitiva mAb1379 para uma ligação específica ao fatorB, e onde, quando o anticorpo ou fragmento deste liga-se ao fatorB, a via complementar alternativa é inibida ou de maneiraalternativa, a habilidade de mAb1379 para inibir a via complementaralternativa é inibida. Uma outra configuração refere-se ao uso deum anticorpo isolado ou fragmento deste que de modo específicoliga-se ao fator B, onde o anticorpo isolado ou fragmento deste inibede maneira competitiva um segundo anticorpo ou fragmento destaligação para ligação específica ao fator B1 e onde o segundoanticorpo ou fragmento deste liga-se ao domínio da terceira RCC dofator B.As análises de competição podem serrealizadas com o uso de técnicas padrões na técnica (por exemplo,ELISA competitiva ou outras análises de ligações). Por exemplo,inibidores competitivos podem ser detectados e quantificados porsua habilidade para inibir a ligação do fator B a um anticorpoconhecido e rotulado do antifator B (por exemplo, o mAb 1379). Asanálises da competição anticorpo-anticorpo na presença do fatorhumano B são descritas na Publicação de Pedido de Patente dosEUA No. 2005-0260198-A1 e na Publicação Internacional PCT No.WO 2005/077417, supra. Os inibidores competitivos da ligação dofator B ao antifator B 1379 são também descritos na Publicação dePedido de Patente dos EUA No. 2005-0260198-A1 e na PublicaçãoInternacional PCT No. WO 2005/077417, supra.

De acordo com a presente invenção,anticorpos são caracterizados em que eles compreendem osdomínios da imunoglobulina e como tal, são membros dasuperfamília da imunoglobulina das proteínas. Falando de modogeral, uma molécula de anticorpo compreende dois tipos de cadeia.Um tipo de cadeia é referido como a cadeia pesada ou cadeia Heooutro é referido como cadeia leve ou cadeia L. As duas cadeias sãoapresentadas em um raio equimolar, com cada molécula deanticorpo tipicamente tendo duas cadeias H e duas cadeias L. Asduas cadeias H são unidas por ligações bissulfeto e cada cadeia Hé ligada à cadeia L por uma ligação bissulfeto. Há somente doistipos de cadeias L referidas como cadeias Iambda (λ) e kappa (κ).Em contraste, há cinco grandes classes de cadeias H referidascomo isótopos. As cinco classes incluem imunoglobulina M (IgM ouμ), imunoglobulina D (IgD ou δ), imunoglobulina G (IgG ou λ),imunoglobulina A (IgA ou a), e imunoglobulina E (IgE ou ε). Ascaracterísticas distintas entre estes isótopos são definidas pelodomínio constante da imunoglobulina são discutidas em detalhesabaixo. As moléculas de imunoglobulina humana compreendemnove isótopos, IgM, IgD1 IgE1 quatro subclasses de IgG incluindoIgGI (γ1), lgG2 (γ2), lgG3 (γ3) e lgG4 (γ4), e duas subclasses deIgA incluindo IgAI (a1) e lgA2 (o2). Em humanos, IgG subclasse 3e IgM são os ativadores complementares mais potentes (sistemacomplementar clássico), enquanto IgG subclasse 1 e a umaextensão até mesmo menor, 2, são ativadores de moderados abaixo sistema complementar clássico. lgG4 subclasse não ativa osistema complementar (clássico ou alternativo). O único isótopo deimunoglobulina humana conhecido para ativar o isótopo conhecidopara ativar o sistema complementar alternativo é IgA. Noscamundongos, as subclasses de IgG são IgGI, lgG2a, lgG2b elgG3. Murino IgGI não ativa o complemento, enquanto os lgG2a,lgG2b e lgG3 são ativadores complementares.

Cada cadeia H ou L de uma molécula deimunoglobulina compreende duas regiões referidas como domíniosvariáveis da cadeia L (VL domínios) e domínios constantes dacadeia L (CL domínios), e domínios variáveis de cadeia H (VHdomínios) e domínios constantes da cadeia H (CH domínios). Umdomínio completo Ch compreende três subdomínios (CH1, CH2,CH3) e uma região de articulação. Juntas, uma cadeia H e umacadeia L podem formar um braço de uma molécula deimunoglobulina tendo uma região variável de imunoglobulina. Amolécula completa de imunoglobulina compreende dois braçosassociados (por exemplo, bissulfeto ligado). Assim, cada braço detoda a imunoglobulina compreende uma região Vh+l, e uma regiãoCh+l- Como aqui usado, o termo "região variável" ou "região V"refere-se e região Vh+l (também conhecido como um Fv fragmento),uma região Vl ou uma região VH. Também como aqui usado, otermo "região constante" ou "região C" refere-se a uma região Ch+l,região Cl ou uma região CH.

A digestão limitada de uma imunoglobulinacom uma protease pode produzir dois fragmentos. Um fragmento deligação antígeno é referido como um Fab, um Fab', ou umfragmento F(ab')2. Um fragmento sem a habilidade de ligar-se a umantígeno é referido como um fragmento Fe. Um fragmento Fabcompreende um braço de uma molécula de imunoglobulinacontendo uma cadeia L (domínios Vl + CL) emparelhado com aregião Vh e a porção da região Ch (domínio CH1). Um fragmentoFab' corresponde a um fragmento Fab com parte da regiãoarticulada ligada ao domínio CH1. Um fragmento F(ab')2corresponde aos fragmentos Fab' que são, normalmente,covalentemente ligados um ao outro através de uma ligaçãobissulfeto, tipicamente nas regiões articuladas.

O domínio Ch define o isótopo de umaimunoglobulina e confere características funcionais diferentesdependendo do isótopo. Por exemplo, regiões μ constantespossibilitam a formação de agregados pentaméricos das moléculasIgM e regiões α constantes possibilitam a formação de dímeros.

A especificidade antígena de uma moléculade imunoglobulina é conferida pela seqüência de aminoácido deuma variável, ou V, região. Como tal, as regiões V de moléculadiferentes de imunoglobulinas podem variar de maneira significantedependendo de sua especificidade de antígeno. As porçõesdeterminadas da região V são mais conservadas do que outros esão referidos como regiões de estrutura (regiões FW). Emcontraste, porções determinadas de uma região V são altamentevariáveis e são regiões hipervariáveis designadas. Quando osdomínios Vl e Vh emparelham em uma molécula de imunoglobulina,as regiões hipervariáveis a partir de cada domínio associado ecriam Ioops hipervariáveis que formam os locais de ligaçãoantígeno. Assim, os Ioops hipervariáveis determinam especificidadede uma imunoglobulina e são designadas regiões determinantes dacomplementaridade (CDRs) porque suas superfícies sãocomplementares aos antígenos.

Outras variabilidades das regiões V sãoconferidas pela variabilidade combinatória dos segmentos de genesque codificam uma imunoglobulina da região V. Genes daimunoglobulina compreendem segmentos múltiplos de genes dalinha germinal que se rearranjam de maneira somática para formarum gene de imunoglobulina rearranjado que codifica uma moléculade imunoglobulina. As regiões Vl são codificadas por um segmentode gene de uma cadeia LVe segmento de gene J (segmento deunião). As regiões Vh são codificadas por uma cadeia do segmentode gene H V, o segmento de gene D (segmento de diversidade) esegmento de gene J (segmento de união).

Ambos segmentos do gene da cadeia Leacadeia H V contêm três regiões de variabilidade substancial deseqüência de aminoácidos. Estas regiões são referidas comocadeia L CDR1, CDR2 e CDR3, e cadeia H CDR1, CDR2 e CDR3,respectivamente. O comprimento de uma cadeia L CDR1 podevariar de maneira substancial entre diferentes regiões VL. Porexemplo, o comprimento de CDR1 pode variar de 7 aminoácidos a17 aminoácidos. Em contraste, os comprimentos da cadeia L CDR2e CDR3 tipicamente não variam regiões diferentes das regiões VL.O comprimento de uma cadeia H CDR3 pode variarsubstancialmente entre diferentes regiões VH. Por exemplo, ocomprimento de CDR3 pode variar de 1 aminoácido a 20aminoácidos. Cada região CDR de cadeia LeH são ladeadas porregiões FW.

Outros aspectos funcionais de uma moléculade imunoglobulina incluem a valência de uma molécula deimunoglobulina, a afinidade de uma molécula de imunoglobulina, ea avidez de uma molécula de imunoglobulina. Como aqui usado,afinidade refere-se à força com a qual uma molécula deimunoglobulina liga-se a um antígeno em um único local em umamolécula de imunoglobulina (ou seja, uma ligação Fab de fragmentomonovalente a um antígeno monovalente). A afinidade difere daavidez, que se refere à soma total da força com a qual umaimunoglobulina liga-se a um antígeno. A afinidade de ligação daimunoglobulina pode ser medida através de técnicas padrões natécnica, como técnicas de ligação competitiva, a diálise de equilíbrioou métodos BIAcore. Como aqui usado, a valência refere-se aonúmero de locais de ligação antígenas diferentes por molécula deimunoglobulina (ou seja, o número de locais de ligação antígena pormolécula de anticorpo do fragmento de ligação antígeno). Porexemplo, uma molécula de imunoglobulina monovalente podesomente pode se ligar a um antígeno de uma vez, ao passo queuma molécula de imunoglobulina bivalente pode se ligar a dois oumais antígenos de uma vez, e assim por diante. Ambos osanticorpos monovalentes e bivalentes que de maneira seletivaligam-se às proteínas da via complementar alternativa são aquiincluídos.

Em uma configuração, o anticorpo é umanticorpo bi- ou multiespecífico. Um anticorpo bi-específco (oumultiespecífico) é capaz da ligação de dois (ou mais) antígenos,como com um anticorpo bivalente (ou multivaiente), mas, nestecaso, os antígenos são antígenos diferentes (ou seja, o anticorpoexibe especificidade dual ou maior). Por exemplo, um anticorpoque, de maneira seletiva, liga-se a uma proteína na viacomplementar alternativa de acordo com a presente invenção (porexemplo, um anticorpo do antifator B como aqui descrito) pode serconstruído como um anticorpo bi-específico, onde a especificidadeda segunda ligação antígena é para um alvo desejado. Portanto, umanticorpo bi-específico incluído na presente invenção inclui umanticorpo tendo: (a) uma primeira porção (por exemplo, uma porçãoantígena da primeira ligação) a qual se liga à proteína na viacomplementar alternativa (por exemplo, fator B); e (b) uma segundaporção que se liga a uma molécula celular de superfície expressadapor uma célula. Nesta configuração, a segunda porção pode ligar-sea qualquer molécula de superfície celular. Uma molécula desuperfície celular preferida é um receptor ou ligante, de modo queanticorpo é alto de uma célula em particular ou tipo de tecido e/ou aum local particular em um animal ao qual o anticorpo éadministrado. Em uma configuração, a especificidade da segundaligação antígena é para um receptor complementar. Um receptorcomplementar particularmente preferido inclui, mas não se limita a,receptor complementar do tipo 2 (CR2). Os anticorpos que, demaneira seletiva, se ligam a CR2 e poderiam, portanto, ser usadosnesta configuração da invenção como são descritos, por exemplo,na Patente EUA No. 6.820.011.

Em uma configuração, os anticorpos dapresente invenção incluem anticorpos humanizados. Os anticorposhumanizados são moléculas tendo um local de ligação antígenaderivados de uma imunoglobulina a partir de espécies nãohumanas, as partes remanescentes derivadas da imunoglobulina damolécula sendo derivada de uma imunoglobulina humana. O localde ligação antígena pode completar regiões variáveis unidas emdomínios humanos constantes ou somente as regiõesdeterminantes da complementaridade (CDRs) montadas nasregiões de estrutura humana apropriada nos domínios variáveis. Osanticorpos humanizados podem ser produzidos, por exemplo, pelamodelagem dos domínios variáveis do anticorpo e produziranticorpos usando técnicas de engenharia genética, comomontagem CDR (abaixo descrito). Uma descrição de várias técnicaspara a produção dos anticorpos humanizados é encontrada, porexemplo, em Morrison e outros. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA15 81:6851-55; Whittle e outros. (1987) Prot. Eng. 1:499-505; Co eoutros. (1990) J. Immunol. 148:1149-1154; Co e outros. (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869-2873; Carter e outros. (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. 89:4285-4289; Routledge e outros. (1991)Eur. J. Immunol. 21:2717-2725 e Publicação da Patente PCT Nos.WO 91/09967; WO 91/09968 e WO 92/113831.

Os anticorpos isolados da presente invençãopodem incluem soro contendo estes anticorpos, ou anticorpos quetenham sido purificados em graus variados. Os anticorpos inteirosda presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais. Demaneira alternativa, os equivalentes funcionais dos anticorposinteiros, como fragmentos antígenos de ligação em que um ou maisdomínios de anticorpos são truncados ou ausentes (por exemplo,Fv, Fab, Fab', ou F(ab)2 fragmentos), assim como anticorpos oufragmentos antígenos de ligação geneticamente projetados deste,incluindo anticorpos de cadeia simples, anticorpos humanizados(discutidos acima), anticorpos que pode ligar-se mais do que umepítopo (por exemplo, anticorpo bi-específicos), ou anticorpos quepodem ligar-se a um ou mais antígenos diferentes (por exemplo,anticorpo bi- ou multiespecíficos), podem também ser empregadosem uma invenção.

Os anticorpos geneticamente projetados dainvenção incluem aqueles produzidos por técnicas DNArecombinantes padrões, envolvendo a manipulação e reexpressão da variável do anticorpo codificador de DNA e/ou regiõesconstantes. Exemplos particulares incluem, anticorpos quiméricos,onde os domínios Vh e/ou Vl do anticorpo vêm de uma fontediferente como comparado ao remanescente do anticorpo, eanticorpos implantado no CDR (e fragmentos antígenos de ligação deste), em que ao menos uma seqüência de CDR e opcionalmenteao menos um aminoácido de estrutura de região variável é (são)derivado(s) de uma fonte e as porções remanescentes da variável eas regiões constantes (como apropriado) são derivados de umafonte diferente. A construção de anticorpos quiméricos e implantados no CDR são descritos, por exemplo, em Pedidos dePatente Européia: EP-A 0194276, EP-A 0239400, EP-A 0451216 eEP-A 0460617.

Em uma configuração, anticorpos quiméricossão produzidos de acordo com a presente invenção compreendendo domínios de anticorpos variáveis que se ligam àproteína na via complementar alternativa (por exemplo, fator B) eunidos a estes domínios, uma proteína que serve como umsegundo meio alvo. Por exemplo, o meio alvo pode incluir umaproteína que esteja associada à célula ou tecido a ser alvo ou comum sistema particular no animal. Por exemplo, o meio alvo podeser uma seletina ou uma porção de um receptor complementar. Umreceptor complementar preferido para uso neste aspecto dainvenção inclui um receptor complementar do tipo 2 (CR2). O usode CR2 e porções deste em uma fusão ou proteína quimérica (porexemplo, como um sistema de administração) é descrito emdetalhes na Patente EUA No. 6.820.011.

De modo geral, na produção de umanticorpo, um animal experimental adequado, como, por exemplo,mas não limitado a, um coelho, uma ovelha, um hamster, umporquinho da índia, um camundongo, um rato, ou um frango, éexposto a um antígeno contra o qual um anticorpo é desejado.Tipicamente, um animal é imunizado com uma quantia efetiva deantígeno que é injetado no animal. Uma quantia efetiva de antígenorefere-se a uma quantia necessária para induzir a produção deanticorpo pelo animal. O sistema imunológico do animal é, então,permitido responder por um período pré-determinado de tempo. Oprocesso de imunização pode ser repetido até que o sistemaimunológico seja descoberto para produzir anticorpos ao antígeno.A fim de obter anticorpos policlonais específicos para o antígeno, osoro é coletado do animal que contém os anticorpos desejados (ouno caso de um frango, o anticorpo pode ser coletado dos ovos).Este soro é útil como um reagente. Os anticorpos policlonais podemser ainda purificados a partir do soro (ou ovos) através de, porexemplo, tratamento do soro com sulfato de amônio. Anticorposmonoclonais podem ser produzidos de acordo com a metodologiade Kohler e Milstein (Nature 256:495-497, 1975). Por exemplo, oslinfócitos B são recuperados do baço (ou qualquer tecido adequado)de um animal imunizado e, então, unidos com células mielomaspara obter uma população de células hibridomas capazes decrescimento contínuo em meio de cultura adequado. As hibridomasproduzem o anticorpo desejado selecionado através do teste dehabilidade do anticorpo produzido pela hibridoma para se ligar aoantígeno desejado.

Um método preferencial para produziranticorpos da presente invenção inclui (a) administração a umanimal uma quantia efetiva de uma proteína ou peptídeo (porexemplo, ao fator B proteína ou peptídeo incluindo domínios deste)para produzir os anticorpos e (b) recuperando os anticorpos. Em umoutro método, anticorpos da presente invenção são produzidos demaneira recombinante. Por exemplo, uma vez que uma linhacelular, por exemplo, uma hibridoma, expressando um anticorpo deacordo com a invenção que foi obtida, é possível clonar desta ocDNA e identificar os genes de região variável codificando oanticorpo desejado, incluindo as seqüências codificando os CDRs.A partir daqui, os anticorpos e fragmentos antígenos de ligação deacordo com a invenção podem ser obtidos pela preparação de umou mais vetores de expressão replicáveis contendo ao menos aseqüência de DNA codificando o domínio variável do anticorpo decadeia pesada ou leve e opcionalmente outras seqüências deporções remanescentes de DNA de cadeias pesadas e/ou levesdesejadas, e transformando/transfectando uma célula hospedeiraapropriado, em que a produção do anticorpo ocorrerá. Ashospedeiras de expressão adequada incluem bactéria, (porexemplo, um subgrupo E. coli), fungos, (em particular levedos, porexemplo membros do gênero Pichia, Saccharomyces, ouKluyveromyces,) e linhas celulares de mamíferos, por exemplo umalinha celular não produtora de mieloma, como uma linha NSO decamundongo, ou células CHO. A fim de obter transcrição e traduçãoeficaz, a seqüência de DNA em cada vetor deve incluir seqüênciasregulatórias apropriadas, particularmente uma seqüência promotorae líder operavelmente ligadas à seqüência do domínio. Os métodosparticulares para a produção de anticorpos desta maneira são, demodo geral, bem conhecidos e usados de maneira rotineira. Porexemplo, os procedimentos biológicos moleculares básicos comodescrito por Maniatis e outros. (Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, New York, 1989); a seqüência de DNA pode serrealizada como descrito em Sanger e outros. (PNAS 74, 5463,(1977)) e o manual de seqüência Amersham International plc; e amutagênese direto no local pode ser executado de acordo com ométodo de Kramer e outros. (Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)) e omanual Anglian Biotechnology Ltd.. Ainda, há numerosaspublicações, incluindo especificações de patente, detalhe detécnicas adequadas para a preparação de anticorpos pelamanipulação do DNA1 criação dos vetores de expressão etransformação das células apropriadas, por exemplo como revisadopor Mountain A e Adair, J R em Biotechnology e GeneticEngineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992,Intercept, Andover, UK) e nos Pedidos de Patente Européiasanteriormente mencionadas.

Métodos alternativos empregando, porexemplo, tecnologia de exposição de fago (ver, por exemplo, US5969108, US 5565332, US 5871907, US 5858657) ou o método deanticorpo de linfócito selecionado de US 5627052 pode também serusado para a produção dos fragmentos de anticorpos e/ou antígenoda invenção, como está prontamente aparente ao especialista.

A invenção também se estende ao uso depolipeptídios não anticorpo, algumas vezes referido como parceirosde ligação antígena ou polipeptídios de ligação antígena, que foramcriados para ligar-se de maneira seletiva e causar a neutralizaçãoou inibição de uma proteína de acordo com a presente invenção.

Exemplos da criação destes polipeptídios, que possuem umaespecificidade de Iigante prescrito, são dados em Beste e outros.(,Proc. Natl. Acad. Sei. 96:1898-1903, 1999), aqui incorporados porreferência em sua totalidade.

A presente invenção também inclui umaformulação ou composição para reduzir o dano fisiológico associadocom o DCT ou DME. A formulação compreende: (a) qualquer umou mais inibidores da via complementar alternativa, como aquidescrito (por exemplo, um anticorpo do antifator B aqui descrito); e(b) ao menos um portador farmaceuticamente aceitável.

Em uma configuração, a formulação oucomposição podem incluir um ou mais agentes adicionais, comooutro agente que seja adequado para tratar ao menos um sintoma,ou dano fisiológico associado com, DCT (por exemplo,drogasosmóticas, sedativos, analgésicos, relaxantes musculares,barbitúricos, etc.). Além disso, a formulação pode ser administradaa um paciente em conjunto com uma outra terapia ou protocolo queseja usado para tratar ou melhorar os danos associados com DCT.Estas terapias ou protocolos incluem, mas não se limitam a:redução das lesões de massa pela evacuação cirúrgica doshematomas intracranianos; a redução do inchaço do cérebro comdrogas osmóticas (por exemplo,mannitol); a drenagem terapêuticado fluido cerebroespinhal (FCS) através de intracateteresventriculares; realização e manutenção da troca adequada de gás eestabilidade circulatória; prevenção de hipoxemia e hipercarbia;mapeamento repetido de TC para a detecção da patologiaintracraniana secundaria retardada; sedação e analgesia profundapara evitar estresse e dor; realização e manutenção de eficientePPC (> 70 mmHg) e equilíbrio do oxigênio cerebral; evitação dehipertermia (< 38°C); prevenção de hiperglicemia e hiponatremia;prevenção da elevação da cabeça realizada de maneira rotineira;prevenção de ulceras de estresse e manutenção da integridade damucosa do intestino; profilaxia para fatores de complicação (porexemplo, pneumonia ou meningite); terapia concentrada napressão intracraniana (ICP) (por exemplo, aprofundamento dasedação, analgesia, relaxamento muscular; drenagem FCS atravésde cateteres ventriculares; hiperventilação moderada sob certascircunstancias; osmoterapia; hipotermia moderada (± 34°C); e/oucoma por barbitúricos); e/ou atenuação por gás (CO) naneuroinflamação. Vários tratamentos para DCT são bemconhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Royo eoutros., 2003, Current Opin. Pharmacoi 3:27-32; Dutton e McCunn,2003, Current Opin. Crit. Care 9:503-509; Elf e outros., 2003, Eur. J.Trauma 29:74-80; Ghajaret a\., 2000, Lancet 356:923-929.

Em outra configuração, a formulação oucomposição pode incluir um ou mais agentes adicionais, como outroagente que seja adequado para o tratamento de ao menos umsintoma, ou dano fisiológico associado com, DME (porexemplo,esteróides, como metilpredinisolona). Além disso, aformulação pode ser administrada a um paciente juntamente comoutra terapia ou protocolo que seja usado para tratar ou aprimorar odano associado com DME. Estas terapias ou protocolos incluem,mas não se limitam a: imobilização da espinha; cirurgia dedescompressão; cirurgia para estabilizar a vértebra; cirurgia pararealinhar a vértebra; tração. Vários tratamentos para DME são bemconhecidos na técnica e são descritas, por exemplo, em Ramer eoutros 2005, Spinal Cord 43(3): 134-61.

De acordo com a presente invenção, um"portador farmaceuticamente aceitável" inclui excipientesfarmaceuticamente aceitáveis e/ou veículos de administraçãofarmaceuticamente aceitáveis, que são adequados para uso naadministração da formulação ou composição a um local in vivoadequada. Um local in vivo adequado é preferencialmente qualquerlocal onde a via complementar alternativa pode ser inibida, mas emuma configuração preferencial está no tecido cerebral de umpaciente que possa ou esteja com risco de desenvolver danofisiológico associado com o DCT ou DME. Os portadoresfarmaceuticamente aceitáveis preferidos são capazes de manter umagente usado em uma formulação da invenção de forma que, com achegada do agente no local alvo em um paciente, o agente é capazde agir no seu alvo (por exemplo, uma proteína que é umcomponente da via complementar alternativa), preferencialmenteresultando em um benefício terapêutico ao paciente.

Os excipientes adequados da presenteinvenção incluem excipientes ou fórmulas que transportam ouajudam a transportar, mas não de modo específico almeja umacomposição a uma célula ou tecido (também referido aqui comoportadores sem alvo). Exemplos de excipientes farmaceuticamenteaceitáveis incluem, mas sem limitações, água, tampãofosfato/salina, solução de Ringer, solução dextrose, soluçõescontendo soro, solução de Hank, outras soluções fisiologicamenteaquosas, óleos, ésteres e glicóis. Portadores aquosos podem contersubstâncias auxiliares adequadas necessárias para aproximar ascondições fisiológicas ao receptor, por exemplo, pelo aumento daestabilidade química e isotonicidade. Substâncias auxiliaresadequadas incluem, por exemplo, acetato de sódio, cloreto desódio, Iactato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio eoutras substâncias usadas para produzir tampão de fosfato, tampãoTris, e tampão de bicarbonato buffer. Substâncias auxiliares podemtambém incluir preservativos, como timerosal, m- ou o-cresol,formalina e álcool benzol. Formulações da presente invençãopodem ser esterilizadas por métodos convencionais e/ouliofilizados.

Um tipo de portador farmaceuticamenteaceitável inclui formulação de liberação controlada que é capaz deliberar lentamente uma composição da presente invenção umanimal. Como aqui usado, a formulação de liberação controladacompreende um agente da presente invenção em um veiculo deliberação controlada. Veículos de liberação controlada adequadosincluem, mas não se limitam a, polímeros biocompatíveis, outrasmatrizes poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas,extratos bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão,lipossomas, lipoesferas, e sistemas de administraçãotransdérmicas. Outros portadores adequados incluem qualquerportador possa ser ligado ou incorporado com o agente que estendea meia vida do agente a ser administrado. Este portador pode incluirqualquer portador de proteína adequado ou mesmo um segmentode fusão que estende a meia vida de uma proteína quandoadministrada in vivo. Veículos de administração adequados foramanteriormente aqui descritos, e incluem, mas sem limitações,lipossomas, vetores virais ou outros veículos de administração,incluindo ribozimas. Veículos de administração contendo lipídiosnaturais incluem células e membranas celulares. Veículos deadministração contendo lipídios artificiais incluem Iipossomas emicelas. Um veículo de administração da presente invenção podeser modificado para ter como alvo um local em local em particularem um paciente, assim tendo como alvo e fazendo uso de umagente inibidor naquele local. Modificações adequadas incluemmanipular a fórmula química da porção lipídio do veículo deadministração e/ou introduzir um agente alvo no veículo capaz deter como alvo, de modo específico, um veículo de administração aum local preferido, por exemplo, uma célula preferida. Outro veículoadequado de administrações inclui partícula de ouro, poli-L-lisina/conjugados molecular de DNA, e cromossomos artificiais.

Um portador farmaceuticamente aceitávelque é capaz de ter um alvo é referido como um "veículo alvo deadministração." Os veículos alvo de administração da presenteinvenção são capazes de administrar uma formulação, incluindo umagente inibitório, a um local alvo em um paciente. Um "local alvo"refere-se a um local em um paciente ao qual se deseja administraruma formulação terapêutica. Por exemplo, um local alvo pode serqualquer célula ou tecido que seja alvo por injeção direta ouadministração através do uso de lipossomas, vetores virais ou outroveículo de administração, incluindo ribozimas. Um veículo deadministração da presente invenção pode ser modificado para tercomo alvo um local em particular em um animal, assim, tendo comoalvo e fazendo uso de uma molécula de ácido nucléico naquelelocal. Modificações adequadas incluem a manipulação de umafórmula da porção lipídio do veículo de administração e/ouintrodução no veículo de um composto capaz de, de modoespecífico, ter como alvo um veículo de administração a um localpreferido, por exemplo, um tipo de célula ou tecido preferido (porexemplo, ao cérebro ou ao sistema nervoso central).Especificamente, ter um alvo refere-se a fazer um veículo deadministração ligar-se a uma célula em particular pela interação docomposto no veículo a uma molécula na superfície da célula.Compostos alvos adequados incluem Iigantes capazes de, demaneira seletiva (ou seja.de modo específico), ligar uma outramolécula em um local em particular. Exemplos destes Iigantesincluem anticorpos, antígenos, receptores e Iigantes receptores.Exemplos particularmente úteis incluem quaisquer Iigantes queestejam associados com uma via complementar (por exemplo,CR2,C3, C3d, C3dg, iC3b, C3b) ou quaisquer Iigantes (porexemplo,seletinas) que estejam associados com o tipo de célula,tipo de tecido, ou local no animal a ser tratado.

Manipular a fórmula química da porção lipídiodo veículo de administração pode modular o alvo extracelular ouintracelular do veículo de administração. Por exemplo, um químicopode ser adicionado à fórmula de lipídio de um Iipossoma que alteraa carga da bicamada de lipídio do lipossoma de modo que olipossoma funde-se com as células específicas tendo característicasde carga específicas. Em uma configuração, um veículo alvo deadministração pode ser uma formulação que permite que umcomposto cruze a barreira sangue-cerebral.

Um veículo de administração útil para umavariedade de rotas de administração e agentes é um lipossoma. UmIipossoma é capaz de permanecer estável em um animal por umaquantia suficiente do tempo de administração de uma molécula deácido nucléico descrita na presente invenção a um local preferidono animal. Um lipossoma, de acordo com a presente invenção,compreende uma composição de lipídio que seja capaz deadministrar uma molécula de ácido nucléico ou outro composto aum local específico ou selecionado em um animal. Um Iipossomade acordo com a presente invenção, compreende composição delipídio que seja capaz de fundir-se com a membrana plasmática dacélula alvo para administrar uma molécula de ácido nucléico emuma célula. Lipossomas adequados para uso com a presenteinvenção incluem qualquer lipossoma. Lipossomas preferenciais dapresente invenção incluem aqueles Iipossomas tipicamente usadosem, por exemplo, métodos de administração de genes conhecidosàqueles especializados na técnica. Mais Lipossomas preferidoscompreendem Iipossomas tendo uma composição lipídicapolicatiônica e/ou lipossomas, tendo um colesterol principalconjugado a um glicol polietileno. O lipossoma complexo com umamolécula de ácido nucléico ou agente inibitório da presenteinvenção pode ser alcançado através de métodos padrões natécnica.

Outro veículo de administração compreendeum vetor viral. Um vetor viral inclui uma molécula isolada de ácidonucléico útil no método da presente invenção, em que as moléculasde ácido nucléico são colocadas em uma cobertura viral quepermite a entrada do DNA na célula. Um número de vetores viraispode ser usado, incluindo, mas não se limita a, aqueles baseadosem alfavírus, vírus da catapora, adenovírus, vírus do herpes,lentivírus, vírus adeno-associados e retrovírus.

Agentes e formulações da presente invençãopodem ser administrados a qualquer animal ou paciente, epreferencialmente a humanos. De acordo com a presenteinvenção, administração de um agente ou formulação é útil parainibir qualquer sintoma de dano fisiológico associado com DCT,DME1 ou similar ou condições relacionadas. Pacientes que sãocandidatos adequados para o método da presente invençãoincluem, mas não se limitam a, pacientes que tenham, ou estão emrisco de desenvolvimento (por exemplo,são prováveis ou previstasde desenvolverem-se), o dano fisiológico ao cérebro ou medulaespinhal e condições relacionadas a este dano, como um resultadoda lesão (incluindo lesão traumática) ou doença.

De acordo com a presente invenção, adeterminação dos protocolos aceitáveis para administrar um agenteou uma composição incluindo o agente, incluindo a rota daadministração e a quantia eficaz de um agente a ser administrado aum animal, pode ser conseguida por especialistas na técnica. Umagente ou composição da presente invenção pode ser administradoin vivo ou ex vivo. Rotas in vivo adequadas de administraçãopodem incluir, mas não se limitam a, rota oral, nasal, inalada,tópica, intratraqueal, transdérmica, retal, cerebral (porexemplo,intracraniano), espinhal (por exemplo,intraespinhal ou aoespaço epidurial de uma medula espinhal), e parenteral. As rotasparenterais preferidas podem incluir, mas não se limitam a, rotasubcutânea, intradérmica, intravenosa, intramuscular, eintraperitoneal. Rotas tópicas preferidas incluem inalação poraerossol (ou seja, spray) ou administração tópica de superfície napele de um animal. Preferencialmente, um agente é administradopor rotas sistêmicas (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa),com administração intravenosa sendo particularmente preferida, oupor administração ao cérebro, medula espinhal, ou o espaçoepidurial de uma medula espinhal. Para o dano cerebral traumático,a administração por administração intravenosa ou ao cérebro épreferida. Para o dano da medula espinhal, a administração poradministração intravenosa, a administração da medula espinhal, ouadministração ao espaço epidurial de uma medula espinhal épreferida. Ex vivo refere-se à realização de parte da etapa deadministração externa ao paciente.

As técnicas para administração de agentes ecomposições ao cérebro e sistema nervoso central incluem, mas selimitam a, administração intravenosa, administração intraperitoneal,administração intra-arterial com ruptura da barreira de sanguecerebral, infusão contínua de drogas através do cérebro com o usode métodos de convenção elevada, implantação, infusão intratecal,administração intraventricular, administração intersticial eadministração intra-espinhal. As Administrações intravenosas,intraperitoneal, intramuscular, e intra-espinhal podem ser realizadasatravés de métodos padrão na técnica. A administração poraerossol (inalação) pode ser realizada através do uso de métodospadrões na técnica (veja, por exemplo, Stribling e outros., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 189:11277-11281, 1992, que é incorporadoaqui por como referência na sua totalidade). Os portadoresadequados para administração com aerossol são acima descritos.Os dispositivos para administração de formulações em aerossolincluem, mas não se limita a, inaladores pressurizados de dosesmétricas (MDI), inaladores de pó seco (DPI), e dispositivos desoluções métricas (MSI), e incluem dispositivos que sãonebulizadores e inaladores. Administração oral pode ser realizadapela mistura de uma composição terapêutica da presente invençãoa um portador capaz de resistir à degradação por enzimasdigestivas no intestino de um animal. Exemplos destes portadoresincluem cápsulas plásticas ou tabletes, como aqueles conhecidosna técnica. Técnicas de injeção direta são particularmente úteispara a administração de uma molécula recombinante de ácidonucléico a uma célula ou tecido que seja acessível por cirurgia, eparticularmente, em ou próximo à superfície corpórea. Aadministração de uma composição localizada na área de uma célulaalvo refere-se a uma injeção da composição centímetros epreferencialmente, milímetros da célula alvo ou tecido.

Vários métodos de administração e veículode administração revelados aqui revelaram-se eficazes para aadministração de uma molécula de ácido nucléico a uma célula alvoou tecido, onde a molécula de ácido nucléico transfectou a célula efoi expresso. Em muitos estudos, a administração e expressão bemsucedida de um gene heterólogo foi conseguida nos tipos de célulapreferidos e/ou através do uso de um veículo de administração erotas de administração preferidas da presente invenção. Aadministração de numerosas seqüências de ácido nucléico a umavariedade de tecidos alvos foi conseguida pela administração dosvetores virais codificando as seqüências de ácido nucléico. (porexemplo, veja, de muitos exemplos, vetor retroviral; Blaese eoutros, 1995, Science 270:475-480; Bordignon e outros, 1995,Science 270:470-475), administração nasal (CFTR-vetor associadoao adenovírus), administração intracoronária (vetor adenoviral evírus Hemaglutinatinador do Japão, veja acima), administraçãointravenosa (vetor viral adeno-associado; Koeberl e outros., 1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:1426-1431). Millecamps e outros,relataram o alvo dos vetores adenovirais aos neurônios usandoelementos intensificadores restritivos de neurônios colocados acimado promotor para transgenes (promotor fosfoglicerato). Estesvetores foram administrados aos camundongos e ratos de modointramuscular e intracerebral, respectivamente, resultando natransfecção bem sucedida especifica dos neurônios e expressão dotransgene in vivo (Millecamps e outros., 1999, Nat. Biotechnol.17:865-869). Bennett e outros, relatado ao uso do vetor viraladeno-associado para administrar e expressar um gene por injeçãosubretinal na retina neural in vivo por mais de 1 ano (Bennett, 1999,ibid.).

Uma única dose adequada de um agenteinibidor para administrar a um animal é uma dose que seja capaz dereduzir ou evitar ao menos um sintoma do dano fisiológico devidoao DCT ou DME em um animal quando administrado uma ou maisvezes por um período de tempo adequado. Uma dose únicapreferida de um agente, incluindo proteínas, pequenas moléculas eanticorpos, para uso no método aqui descrito, compreende entre0.01 micrograma x quilograma"1 e 10 miligramas x quilograma"1 depeso corpóreo de um animal. Uma dose única mais preferida deum agente compreende entre 1 micrograma x quilograma"1 e 10miligramas x quilograma"1 de peso corpóreo de um animal. Umadose única mais preferida de um agente compreende entre 5microgramas x quilograma"1 e 7 miligramas x quilograma"1 de pesocorpóreo de um animal. Uma dose única mais preferida de umagente compreende entre 10 microgramas x quilograma"1 e 5miligramas x quilograma"1 de peso corpóreo de um animal. Umadose particularmente preferida de um agente compreende entre 0.1miligramas x quilograma"1 e 5 miligramas x quilograma"1 de pesocorpóreo de um animal, se o agente for administrado por aerossol.Uma outra dose única particularmente preferida de um agentecompreende entre 0.1 micrograma x quilograma"1 e 10 microgramasx quilograma"1 de peso corpóreo de um animal, se o agente foradministrado de forma parental.

Em uma configuração, uma dose apropriadaúnica de uma mistura de ácido nucléico: Iipossoma da presenteinvenção é de 0.1 pg a 100 pg per kg de peso corpóreo do pacienteao qual a mistura está sendo administrada. Em uma outraconfiguração, uma dose apropriada única é de 1 pg a 10 pg per kgde peso corpóreo. Em uma outra configuração, uma doseapropriada única de mistura de ácido nucléico:lipid é ao menos 0.1pg de ácido nucléico, mais preferencialmente ao menos 1 pg deácido nucléico, mesmo mais preferencialmente ao menos 10 pg doácido nucléico, mesmo mais preferencialmente ao menos 50 pg deácido nucléico, e mesmo mais preferencialmente ao menos 100 pgdo ácido nucléico.

Uma dose única preferida de um anticorpocompreende entre 1 ng χ quilograma"1 e menos de 1 mg χquilograma"1 de peso corpóreo de um animal. Uma dose única maispreferida de um anticorpo compreende entre 20 ng χ quilograma"1 e600 pg χ quilograma"1 de peso corpóreo do animal. Uma doseúnica mais preferida de um anticorpo, particularmente quando oanticorpo formulação é administração por nebulização, compreendeentre 20 ng χ quilograma"1 e 600 pg χ quilograma"1 de pesocorpóreo do animal, e mais preferencialmente, entre 20 ng χquilograma"1 e 500 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente,entre 20 ng χ quilograma"1 e 400 pg χ quilograma"1, e maispreferencialmente, entre 20 ng χ quilograma"1 e 300 pg χquilograma"1, e mais preferencialmente, entre 20 ng χ quilograma"1 e200 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre 20 ng χquilograma"1 e 100 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente,entre 20 ng χ quilograma"1 e 50 pg χ quilograma"1 de peso corpóreodo animal.

Uma outra dose única preferida de umanticorpo, particularmente quando o anticorpo formulação éadministração por nebulização, compreende entre 200 ng χquilograma"1 e 600 μg χ quilograma"1 de peso corpóreo do animal, emais preferencialmente, entre 200 ng χ quilograma"1 e 500 μg χquilograma"1, e mais preferencialmente, entre 200 ng χ quilograma"1e 400 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre 200 ng χquilograma"1 e 300 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente,entre 200 ng χ quilograma"1 e 200 pg χ quilograma"1, e maispreferencialmente, entre 200 ng χ quilograma'1 e 100 pg χquilograma"1, e mais preferencialmente, entre 200 ng χ quilograma"1e 50 pg χ quilograma"1 de peso corpóreo do animal.

Uma outra dose única preferida de umanticorpo, particularmente quando o anticorpo formulação éadministração por inalação direta de um inalador, compreende entre2 ng χ quilograma"1 e 100 pg χ quilograma"1 de peso corpóreo doanimal, e mais preferencialmente, entre 2 ng χ quilograma"1 e 50 pgχ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre 2 ng χ quilograma"1e 10 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre 2 ng χquilograma"1 e 5 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre2 ng χ quilograma"1 e 1 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente,entre 2 ng χ quilograma"1 e 0,5 pg χ quilograma"1, e maispreferencialmente, entre 2 ng χ quilograma"1 e 0,25 pg χ quilograma"1, e mais preferencialmente, entre 2 ng χ quilograma"1 e 0,1 pg χquilograma"1 de peso corpóreo do animal.

Em uma outra configuração, o anticorpo éadministrado a uma dose de menos de 500 pg anticorpo por mililitrode formulação, e preferencialmente, menos de 250 pg anticorpo pormililitro de formulação, e mais preferencialmente, menos de 100 pganticorpo por mililitro de formulação, e mais preferencialmente,menos de 50 pg anticorpo por mililitro de formulação, e maispreferencialmente, menos de 40 pg anticorpo por mililitro deformulação, e mais preferencialmente, menos de 30 pg anticorpopor mililitro de formulação, e mais preferencialmente, menos de 20pg anticorpo por mililitro de formulação, e mais preferencialmente,menos de 10 pg anticorpo por mililitro de formulação, e ainda maispreferencialmente, entre 5 pg anticorpo e 10 pg anticorpo pormililitro de formulação.

De acordo com o método da presenteinvenção, uma quantia eficaz de um agente que inibe o danofisiológico devido ao DCT ou DME para administrar a um animalcompreende uma quantia que seja capaz de reduzir ao menos umsintoma ou indicador dano fisiológico devido DCT ou DME, ou écapaz de aumentar a recuperação do DCT ou DME, sem ser tóxicoao animal. Uma quantia que é tóxica a um animal compreendequalquer quantia que causa danos à estrutura ou função de umanimal (ou seja, venenoso).

Em uma configuração da presente invenção,em um animal que experienciou o DCT ou DME, uma quantidadeeficaz de um agente para administrar a um animal é umaquantidade que reduz mensuravelmente ao menos um sintoma ouindicador do dano fisiológico devido ao DCT ou DME no animalcomo comparado anterior à administração do agente ou comocomparado na ausência da administração do agente. Em umaoutra configuração, uma quantidade eficaz de um agente paraadministrar a um animal é uma quantidade que reduzmensuravelmente ao menos um sintoma ou indicador do danodevido ao DCT ou DME no animal como comparado a um nível dosintoma em uma população de animais que tenha experienciado deuma maneira substancialmente similar o DCT ou DME onde oagente não foi administrado. O agente é preferencialmente capazde reduzir ao menos um sintoma ou indicador do dano fisiológicodevido DCT (por exemplo, dano cerebral) ou DME (por exemplo,dano na medula espinhal) em um animal, mesmo quando o agenteé administrado após o início dos sintomas físicos do dano. Maispreferencialmente, uma quantidade eficaz do agente é umaquantidade que reduz o(s) sintoma(s) ou indicador(s) do danodevido ao DCT ou DME ao ponto onde o(s) sintoma(s) ouindicador(s) não é mais detectado no paciente. Em umaconfiguração, uma quantidade eficaz do agente é uma quantidadeque aumenta a recuperação do paciente do DCT ou DME, comomedido por cessação ou reverso de um sintoma ou indicador dodano fisiológico, ou como medido por uma melhora em umapontuação mensurável ou biologicamente detectável, valor, oumedida das funções neurais e relacionadas no paciente.

Em uma configuração preferida, uma doseadequada de um agente da presente invenção é uma dose eficazpara inibir a expressão ou atividade biológica de ao menos umaproteína na via complementar alternativa, como aqui descrito (porexemplo, fator B, fator D ou properdina), como comparado naausência da administração do agente. Os métodos de medição deuma expressão ou atividade biológica de uma proteína foramdescritos acima. Em uma outra configuração, uma dose adequadade um agente da presente invenção é uma dose quemensuravelmente inibe a via complementar alternativa da invenção.A ativação do complemento e inibição deste pode ser medidaatravés de técnicas/análises que são bem conhecidas na técnica.Por exemplo, pode-se realizar uma análise in vitro da deposição deC3 em partículas de zimosana A, como descrito nos exemplos.Pode-se também testar a habilidade do agente para inibir a Iise doseritrócitos não sensíveis pelo soro humano. A extrapolação de invitro resulta em dosagens in vivo com base nestas análises estádentro da habilidade dos especialistas na técnica.

Um especialista na técnica determinará queo número de doses de um agente a ser administrado a um animal édependente da extensão do DCT ou DME e antecipado ouobservado o dano fisiológico associado com a lesão, assim como aresposta de um paciente individual ao tratamento. Os métodos paradiagnosticar o DCT e o DME1 incluindo a severidade das condiçõesestão descritos acima e são conhecidos aos especialistas datécnica. Além disso, o clínico será capaz de determinar o tempoapropriado para administração do agente de modo eficaz parareduzir o sintoma (s) associado com ou resultante do DCT ou DMEno animal. Preferencialmente, o agente é administrado dentro de 48horas, e mais preferencialmente 36 horas, e mais preferencialmente24 horas, e mais preferencialmente dentro 12 horas, e maispreferencialmente dentro 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2horas, ou 1 hora, ou mesmo minutos após o evento que causou oDCT ou DME. Em uma configuração, o agente é administradoassim que reconhecido (ou seja, imediatamente) pelo paciente,clínico, ou outra pessoa de que o paciente tenha sofrido DCT ouDME. Em uma outra configuração, o agente é administrado noprimeiro sinal de desenvolvimento de um sintoma de dano cerebralou neural que possa estar associado com o DCT ou DME, epreferencialmente, dentro de ao menos 2 horas do desenvolvimentodo(s) sintoma(s), e mais preferencialmente, dentro ao menos 1hora, e mais preferencialmente dentro ao menos 30 minutos, e maispreferencialmente dentro ao menos 10 minutos, e maispreferencialmente dentro ao menos 5 minutos do desenvolvimentodo(s) sintoma(s). Os sintomas do dano fisiológico associado comDCT ou DME e os métodos para medição ou detecção destessintomas foram descritos em detalhes acima. Preferencialmente,estas administrações são dadas até que os sinais de redução dodano fisiológico ou redução dos sintomas do potencial para osurgimento do dano fisiológico, e então como necessário até que ossintomas tenham acabado ou interrompidos.

O método da presente invenção pode serusado em qualquer animal e, particularmente, em qualquer animalda classe Vertebrada, Mamífera, (ou seja,mamíferos), incluindo,sem limitações, primatas, roedores, animais de criação, e animaisdomésticos. Os mamíferos preferidos para tratar do uso do métododa presente invenção são humanos.

Os exemplos a seguir são apresentados paraos fins de ilustração e não têm a intenção de limitar o escopo dapresente invenção.

Exemplos

Exemplo 1

O exemplo a seguir descreve o efeitoterapêutico da administração do inibidor complementar, Crry-Ig1 nas25 funções fisiológicas após dano cerebral traumático (DCT).

Crry-Ig é uma fusão entre proteína-yrelacionada ao receptor complementar (Crry) e uma molécula Fc deimunoglobulina. O Crry é um homólogo funcional do fator deaceleração do definhamento humano (CD55) e proteína co-fator damembrana (CD46) e inibe C3 convertase complementar. Portanto,Crry é um inibidor das vias clássicas e alternativas complementares.

Em um modelo padronizado do danocraniano fechado dos camundongos (Chen et al e outros., J.

Neurotrauma 1996), a administração sistêmica após a lesão de 1mg de Crry-lg, que corresponde "janela de tempo da oportunidade"terapêutica devido à barreira de sangue cerebral irrompida de 1-24hapós o trauma neste sistema modelo, lidera uma recuperaçãoneurológica significantemente melhorada após o DCT dentro de 24h, em oposição ao controle dos camundongos injetados somentecom veículo (Fig. 6). Nesta experiência, a extensão da deficiêncianeurológica pós-traumática foi avaliada por uma Pontuação daSeveridade Neurológica (PSN) de 10 pontos padronizados de ummodo cego por dois investigadores independentes. Além disso, oscamundongos com lesões cranianas injetados com 1 mg Crry-Ig i.p.uma hora após o trauma mostraram uma perda de pesosignificantemente reduzida comparada com os controles injetadospor veículos (Fig. 7), indicando que o estado catabólico pós-traumático induzido por inflamação é protegido nos camundongoscom inibição complementar por Crry-lg.

Estes resultados demonstram que a inibiçãode uma via complementar no nível da convertase complementar C3inibe o dano fisiológico associado com o DCT.

Exemplo 2

O exemplo a seguir demonstra que oanticorpo monoclonal do Fator B reduziu o dano cerebral associadocom o dano cerebral traumático (DCT).

Estudos preliminares de titulação revelaramque in vivo, a injeção intraperitoneal (i.p.) de 2 mg mAb1379(anticorpo monoclonal do fator B, ou anti-fB) em camundongosC57BL/6 pesando 25-35 g resultaram na inibição completa daatividade complementar da via alternativa, durando 48 horas.Estudos de inibição anti-fB após lesão craniana fechadaexperimental em camundongos C57BL/6 (Chen et al e outros., J.Neurotrauma 1996) foram realizadas através do uso de dois gruposexperimentais: um recebendo 2 mg mAb1379, injetado i.p. em t=1h,24h, ou 72h; e o segundo recebendo somente o meio veículo,injetado nos pontos de tempo idênticos. Os resultados revelaramum efeito neuroprotetor significante da inibição complementar da viaalternativa no grupo anti-fB (mAb1379), como comparado aosanimais de controle injetados por veículo, com base em umaPontuação da Severidade Neurológica (PSN) de 10 pontossignificantemente reduzida dentro de 24 h após trauma (Tabela 3;Fig. 8). Este resultado demonstra que a inibição seletiva da viacomplementar alternativa reduz o dano fisiológico resultante doDCT.

Tabela 3

Pontuação da Severidade Neurológica (PSN) 0 (melhor) -10 (pior)

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*valores médios

Exemplo 3

O exemplo a seguir mostra que o anticorpomonoclonal Fator B reduziu o dano cerebral associado com o danoda medula espinhal (DME).

Os camundongos do tipo Wild C57BL/6(Charles River, MD Méd.) e os camundongos fB-/- fêmeas, 6-8-wsemanas de idade e 16-20g de peso (para todos os camundongos)foram usados neste estudo. Os animais receberam água e comidaad libitum e foram colocados em gaiolas ventiladas Plexiglas (quatrocamundongos por gaiola) em um ciclo de 12/12-h luz - ciclo escurocom uma instalação de barreira livre de patogênio e mantida deacordo com o NIH Guide Guia para os Cuidados e Uso de Animaisem Laboratório do Departamento de Saúde e Serviços Humanosdos Estados Unidos - Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD(Care and Use of Laboratory Animais of the United StatesDepartment of Health and Human Services - National Institutes ofHealth, Bethesda, MD). Camundongos foram aclimatados por aomenos uma semana antes da experiência.

Os procedimentos cirúrgicos e pós-operatórios dos animais foram aprovados pelo Comitê de PesquisaMédica da Universidade de medicina da Carolina do Sul. Osprocedimentos cirúrgicos foram executados em condições deesterilização. As contusões da espinha dorsal foram realizadasatravés do uso de um dispositivo de queda de peso para a induçãodo dano da medula espinhal (DME) em camundongos (Pannu et ale outros. (2005) J. Neuroscience Research 79:340-350). Emresumo, os camundongos foram anestesiados com uma injeçãointraperitoneal (i.p.) de quetamine (75 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg).O aspecto dorsal das costas foi raspado e lavado com soluçãoiodada. A temperatura corporal foi mantida por toda a cirurgia poruma manta aquecida a 37°C colocada sob o animal. Uma incisão delinha mediana foi feita na pele dos níveis T9 ao T13. A Iaminectomiafoi realizada no nível T12, deixando a dura intacta. A espinha foiimobilizada com um dispositivo estereotático e a lesão foi induzidapela queda de um peso de 5g de uma altura de 3cm (15g-cm force)dura exposta. Os animais com operação simulada foramsubmetidos somente à laminectomia. Após a lesão, os músculosforam fechados em camadas e a incisão foi suturada. Oscamundongos foram mantidos em uma almofada aquecida.

Nenhum antibiótico profilático pré- ou pós-operatórios ouanalgésicos foram usados a fim de evitar suas possíveis interaçõescom a terapia experimental do DME. As bexigas forammanualmente expressadas duas vezes diariamente até que eeliminação espontânea adequada da urina retornasse.

Todos os animais foram incluídos no estudoda recuperação funcional. A função do membro posterior docamundongo experimental foi avaliada semanalmente porobservadores às cegas através do uso da pontuação de funçãomotora do membro posterior (Shuhei K J. of Neuropathology eExperimental Neurology (2004) 64-72). A escala variou de 0 a 5, eas pontuações foram as seguintes: 0: Nenhum movimento dosmembros posteriores; 1: Movimento quase não perceptível dasjuntas dos membros posteriores (quadril, joelho ou tornozelo); 2:Movimentos ligeiros em uma ou mais juntas do membro posterior(quadril, joelho ou tornozelo) em um ou ambos os membros, massem coordenação; 3: movimentos propulsivos e de passosalternados dos membros posteriores, mas sem suporte do peso; 4:Suporte do peso e pode caminhar com alguma deficiência; 5:Caminhar normal.

A Fig. 9 mostra os resultados de um estudoinvestigando o efeito da administração do anticorpo monoclonalfator B na recuperação funcional do dano da medula espinhal. Nomodelo murino para o DME acima descrito, os camundongosC57BL/6 receberam duas injeções intravenosas de 1 mg/1 Og doantifator B (mAb 1379) em 1 hora e 12 horas após a lesão (GrupoNúmero, n=8). A recuperação funcional foi avaliada como acimadescrito uma vez ao dia por 21 dias após a lesão. Os camundongostratados com o DME experimental e camundongos do fator B (-/-)com DME experimental também foram avaliados no decorrer doperíodo. Como mostrado na Fig. 9, os camundongos do fator B (-/-)e os camundongos que receberam o antifator B tinham umapontuação de recuperação funcional significantemente melhorada(p<0.01) em cada um dos pontos dos 21 dias, como comparadocom os camundongos não tratados com o dano experimental damedula espinhal. Estes resultados demonstram que a inibiçãoseletiva da via complementar alternativa é suficiente paraapresentar um benefício terapeuticamente significante em ummodelo de DME.

Exemplo 4

O exemplo a seguir demonstra que uma viaalternativa da ativação complementar tem um papel crucial role napatofisiologia do DCT.

Materiais e Métodos

Camundongos do Fator B-/-. Ocamundongo "knockout" deficiente no fator B (fB-/-) foramanteriormente caracterizado e mostraram ter complete completafalta de uma via complementar alternativa funcional [58], Eles foramoriginalmente criados com células troncos embriônicas Sv129 ecruzados com camundongos C57BL/6 antes da expansão dacolônia na F1. Eles foram então cruzados de volta por mais 10gerações contra um histórico puro C57BL/6 e descobriu serrudemente não distinguível dos camundongos C57BL/6 [34], Oscamundongos knockout e os filhotes do tipo wild (fB+/+) foramaclimatados várias semanas antes dos experimentos e mantiveramisolados das influências externas durante o curso total de tempo doestudo. Eles foram criados em um ambiente seletivo livre depatogênio (SPF) e condições padronizadas de temperatura (21oC),umidade (60%), ciclos de luz e escuridão (12:12h), com comida eágua sendo fornecidos ad libitum. Somente os camundongosmachos foram usados neste estudo a fim de evitar uma propensãono gênero com relação aos níveis de atividade complementar [59] eá suscetibilidade ao dano cerebral que parece ser significantementeinfluenciados por hormônios reprodutivos femininos [60,61]. Todosos experimentos foram realizados de acordo com os padrões daFederação da Associação Européia de Ciência de Animal deLaboratórios (FELASA) e foram aprovados pelo comitê institucionalde cuidados com animais (Landesamt für Arbeitsschutz,Gesundheitsschutz und technische Sicherheit, Berlin, Alemanha,No. G0099/03 e No. G0308/04).

Modelo de Lesão Cerebral. A lesão cranianafechada foi realizada em camundongos knockout (fB-/-) e filhotes dotipo wild (fB+/+) do subgrupo C57BL/6 (n=6 por grupo e ponto notempo) através de um dispositivo padrão de queda de peso, comoanteriormente descrito [13,38,62-64], Em resumo, após a induçãoda anestesia de isoflurano, o crânio foi exposto por incisãolongitudinal de linha mediana do escalpo. Um peso de 333 g foiderrubado no crânio fixo de uma altura de 2 cm, resultando em umalesão focai sem corte no hemisfério esquerdo. Após o trauma, oscamundongos receberam oxigenação de suporte com 100% 02 atéestarem totalmente despertos e foram então trazidos de volta àssuas jaulas. Nos pontos de tempo definidos (t=4h, 24h, e 7 dias), foipraticada a eutanásia nos camundongos e os hemisférios cerebraisforam extraídos para análise por imunohistoquímica, histoquímicaTUNEL e análise do exame SDS-PAGE/Western blot. Além disso,as amostras de soro foram coletadas para a determinação dosníveis de anafilatoxina complementar C5a pela análise dos examesELISA e Western blot para Bcl-2 (ver veja abaixo).

Os camundongos operados por simulaçãoforam mantidos sob condições idênticas ao grupo de trauma eforam submetidos aos mesmos procedimentos (anestesia e incisãono escalpo) exceto que nenhum dano craniano foi aplicado.

ELISA for mouse C5a. Para determinaçãodos níveis de anafilatoxina complementar C5a em amostras de sorode camundongos de controle de crânio Iesionado e normalC57BL/6, foi utilizado um exame ELISA desenvolvido no laboratóriodo Dr. P.A. Ward (Ann Arbor1 Ml1 EUA). Em resumo, as lâminas ELISA (Immulon 4HBX, Thermo Labsystems, Milford, MA1 EUA)foram cobertas como anti-camundongo monoclonal purificado C5aIgG (5 pg/ml, BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA). Após bloquearos locais de ligação não específicos com 1% leite (Roth, Karlsruhe,Alemanha) em PBS (Gibco-lnvitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 0.05% TWEEN 20 (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, EUA), alâmina foi coberta com 100 ml de soro diluído 1:20 (em 0.1% leiteem PBS contendo 0.05% TWEEN) e camundongo recombinantemurino C5a em concentrações definidas para estabelecer a curvapadrão. Após a incubação e subseqüentes etapas de lavagem, o anticorpo anti-camundongo biotinilado monoclonal C5a foiadicionado a 500 ng/ml (BD Pharmingen) seguido pelas etapas delavagem e incubação com estreptavidina-peroxidase a 400 ng/ml(Sigma). Para a reação colorimétrica, o substrato (0.4 mg/ml OPDcom 0,4mg/ml peróxido de hidrogênio e uréia em 0.05M tampãocitrato-fosfato; Sigma) foi adicionado e a reação de cor forinterrompida com ácido sulfúrico 3M. A absorvência foi lida a 490nm (leitor "SpectraMax 190", Molecular Devices, Sunnyvale1 CA,EUA. Todas as amostras foram analisadas em lâminas wellsduplicatas e os resultados foram calculados a partir da média daanálise da amostra duplicata. A curva padrão foi linear de 50 ng/mla 0.1 ng/ml, o que representa o limite inferior da detecção destaanálise.

Western blot. Todos camundongosusados neste estudo foram classificados pela análise com Westernblot para a presença da fator B no soro, como um controle dequalidade interno. Os níveis de proteína do mediador antiapoptóticomitocondrial Bcl-2 e do receptor Fas pró-apoptótico foramdeterminadas em cérebros de camundongos homogeneizados eamostras compatíveis de soro a 4h, 24h e 7 dias após a lesãocraniana ou operação simulada em camundongos fB-/- e fB+/+. Atécnica Western blot foi anteriormente descrita [32]. Em resumo, oscérebros do camundongo foram extraídos sob anestesia, separadosem hemisférios esquerdo e direito e, imediatamente,homogeneizado em tampão Iise (Sigma) contendo 100 mM TRIS-HCI (pH 7.5), 150 mM NaCI, 0.5% dodecil sulfato de sódio (SDS),0.5% Nonidet P-40, 10 mg/ml aprotinina, 10 mg/ml leupeptina, 5mg/ml pepstatina, 1 mM fenil-metil-sulfonil fluoreto em águadeionizada, através de um Ultra Turrax Homogenizer® (IKA Werke,Staufen, Alemanha). Após 15 min centrifugação a 13,000 χ g, oconteúdo de proteína dos flutuantes foi determinado pelo exame deproteína colorimétrico comercialmente disponível ("BCA ProteinAssay", Pierce/Perbio Science, Bonn, Alemanha). Uma amostra de60 μg da proteína total foi desnaturada em Ioading buffer eseparada sob as condições de redução em 12% de géis SDS-poliacrilamida em paralelo com um padrão de proteína SDS-PAGEpré-colorida de ampla abrangência (Bio-Rad, Munich, Alemanha).As proteínas foram, então, transferidas às membranas denitrocelulose Protran BA 83 (Schleicher & Schuell, Dassel,Alemanha) por electroblotting (Bio-Rad). Os blots foram bloqueadospela noite e, então, incubados com anti-camundongo Bcl-2monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha),diluído a 1:500, Fas anti-camundongo de coelho policlonal (clone A-20, Santa Cruz), diluído a 1:200, antifator B anti-camundongo defrango policlonal, diluído a 1:8,000 (gentilmente fornecido por Dr.Scott R. Barnum, University of Alabama em Birmingham, AL, EUA)como anticorpos primários e com um anticorpo monocloncal anti-β-actina (clone AC-15, Sigma) diluído 1:10,000, como controle internopara verificar a carga igual das bandas. Após a incubação comanticorpos secundários com rótulos peroxidase (Dako, Hamburg,Alemanha, e Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha),diluídos a 1:5,000, o anticorpo ligação foi visualizado por umatécnica quimiluminiscente não-radiativa através de um kit ECL®Western blotting comercialmente disponível (Amersham PharmaciaBiotech, Freiburg, Alemanha). Transferência igual de proteínas àmembrana blotting foi confirmada por coradas com vermelho dePonceau (Sigma).

Imunohistoquímica. Para avaliação damorfologia neuronal, integridade, e apoptose, cérebros extraídos decamundongos foram congelados em nitrogênio líquido, embebidono composto OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA) e armazenado a-80°C até o uso para análise. As seções de tecido coronal de seis aoito micrômetros de espessura foram cortadas com um criostato a -20°C. Para imunohistoquímica, os slides foram fixados em acetonae, então, analisados por uma técnica padrãobiotina/avidina/peroxidase com DAB-tetrahidrocloreto comocromogênio (Vector, Burlingame, CA), como anteriormente descritos[13,32]. Os anticorpos primários a seguir foram usados comomarcadores de células: anti-NeuN monoclonal, a uma diluição detitulação de 1:2,000 (Chemicon, Hampshire, UK) para neurônios;anti-GFAP coelho policlonal, 1:100 (Shandon Immunon1 Pittsburgh,PA, EUA) para astrócitos; anti-CD11b rato monoclonal, 1:100,(Accurate Chemical, Westbury, NY, EUA) para microglia; anti-cabraCD144 policlonal, 1:200 (Santa Cruz) para células endoteliais. IgG(Vector) não imunizado foi utilizado como controle negativo emdiluições iguais ao anticorpo específico omitido.

Para determinar a extensão da morte celularintracerebral neuronal, uma histoquímica TUNEL foi realizada com ouso do Kit de Detecção de Morte Celular "Fluorescein In Situ CellDeath Detection Kit" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante, comoanteriormente descrito [38], Em resumo, os slides foram secadospor 30 min seguidos pela fixação em uma solução formalina a 10%em RT. Após a lavagem em PBS (três vezes por 3 min), as seçõesforam incubadas em uma solução gelada de ácido acético/etanol(2:1) por 5 min a -20°C. Depois, eles foram lavados em PBS eincubados em uma solução permeabilizante com 3% Triton X-100em PBS for 60 min a RT, então incubado com a enzima TdT emuma reação buffer contendo fluorescina-dUTP por 90 min a 37°C. Ocontrole negativo foi realizado com o uso somente da reação buffersem a enzima TdT. Os controles positivos foram realizados pelaassimilação por igual das seções cerebrais com solução de grau IDNase (500U/ml; Roche) por 20min a RT e sempre mantida emseparado das outras amostras desde então. Após a rotulação, asseções foram lavadas novamente em PBS e para visualizar ascélulas descoloradas (TUNEL-negativo), as seções foram cobertascom meio de montagem VectashieldÒ para fluorescência com DAPI(Vector). Todas as amostras foram avaliadas imediatamente após acoloração com o uso de um microscópio de fluorescência Axioskop40 (Zeiss, Alemanha) a 460 nm para DAPI e 520 nm parafluorescência TUNEL e analisado pelo software Alpha digi doe 1201(Alpha lnnotech, San Leandro, CA1 EUA).

Análise estatística. A análise estatísticafoi realizada com o uso de um software comercialmente disponível(SPSS 9.0 para Windows®). As diferenças em níveis C5acomplementares em soro de camundongos fB-/- e fB+/+ foramdeterminados pelo t-teste do aluno não emparelhado. Um valor P <0.05 foi considerado estatisticamente significante.

Resultados

A ativação complementar é atenuada emcamundongo com lesões cerebrais fB-/-.

A classificação das amostras de soro detodos os camundongos fB-/- e filhotes do tipo wild (fB+/+) usados nopresente estudo revelaram que o fator B era somente detectável emsoro de animais fB+/+, mas não em camundongos fB-/-. Estesexperimentos de controle foram realizados para verificar quecamundongos knockout são completamente destituídos de fator Bno soro (dados não mostrados).

Com referência à Fig. 10, as amostras desoro de camundongos com lesão cerebral fB+/+ e fB-/- do subgrupoC57BL/6 (n=6 por gripo e ponto de tempo) e de camundongosnormal C57BL/6 (controle; n=4) foram analisados pelo exameELISA específico para camundongo C5a (os dados na Fig. 10 sãomostrados como níveis médios ±SD; *P<0.05, fB+/+ vs. controle ecamundongos fB+/+ vs. fB-/-. DCT1 dano cerebral traumático). Alesão craniana experimental fechada em camundongos do tipo wildC57BL/6 resultaram em uma ativação sistêmica da cascatacomplementar, como determinado por níveis significantementeelevados de soro do produto de ativação complementar C5a emtodos os pontos de tempo avaliados de 4 horas a 7 dias (P<0.05 vs.soro de camundongo normal mouse, t-teste do aluno nãoemparelhado; Fig. 10). Em contraste, os níveis de soro C5aanafilatoxina foram dramaticamente reduzidos em camundongos fB-/- em todos os pontos de tempo correspondentes após traumacraniano, abaixo dos níveis de base em camundongos normais(P<0.05 vs. camundongos com lesão cerebral fB+/+, t-teste doaluno não emparelhado; Fig. 10). Estes dados implicam que umavia alternativa é a fonte para ativação complementar após o danocerebral, uma noção de que foi apenas anteriormente substanciadapara doenças além da SNC1 como artrite reumatóide, nefrite auto-imune, e lesões por isquemia/reperfusão [33,37].

A falta do fator B leva à redução da mortecelular após lesão craniana.

Como anteriormente descrito, a morte dacélula neuronal foi observada em cérebros Iesionados decamundongos do tipo wild C57BL/6 por até 7 dias após a lesãocraniana fechada [38]. Com referência as Figs. 12-14, ascriosecções coronárias do hemisfério esquerdo (Iesionado) do tipowild (fB+/+, painéis A-E em cada figura) e fator B de camundongosknockout (fB-/-, painéis F-J em cada figura) foram analisados porimunohistoquímica com um anticorpo específico ao marcadorneuronal NeuN (A1B1F1G em cada figura) ou por histoquímicaTÚNEL das seções adjacentes (D,E1I1J em cada figura). Amorfologia celular geral das seções TUNEL é revelada porcoloração nuclear DAPI (C1H em cada figura). Os painéis B1E1G1Jem cada figura representam uma magnificência de 4-fold dosrespectivos painéis A1D1F1I em cada figura (Magnificências originais:100x (A1C1D1F1H1I)1 400x (B1E1G1J)). Um aumento nas célulaspositivas TUNEL foi detectado nos hemisférios Iesionados doscamundongos fB+/+ dentro de 4 a 24 horas após trauma (Figs. 12 e13, respectivamente), persistindo por até 7 dias (Fig. 14). Acoloração nuclear com 4',6'-diamino-2-fenilindol (DAPI; painéis C eH das Figs. 12-14) mostraram que a morfologia celular em seçõesadjacentes àquelas avaliadas pela histoquímica TÚNEL. Osneurônios foram determinados como o principal tipo celular TUNELpositivo por coloração imunohistoquímico das seções adjacentescom o marcador celular NeuN (painéis A, B1 F e G of Figs. 12-14).Em contraste, a coloração dos astrócitos (anti-GFAP), microglia(anti-CD11b), e células endoteliais (anti-CD144) revelaram queestas células residentes no cérebro não exibem uma coloraçãoTUNEL relevante no presente modelo da lesão craniana (dados nãomostrados). Ainda, os neurônios foram confirmados como tipocelular de TÚNEL positivo predominante por seu tamanho celulartípico e morfologia (como oposto às células gliais) e as camadastípicas de neurônios das células de TUNEL positiva no córtexlesionado. Estes achados corroboram os dados anteriormentepublicados no apoptose neuronal nos modelos DCT experimentaisatuais e outros assim como em pacientes com lesão craniana [38-42], Em contraste à extensão da morte cerebral em camundongoscom lesão cerebral fB+/+, os animais fB-/- mostraram uma clararedução nos neurônios TUNEL positivos em cérebros lesionados de4 horas a 7 dias após o trauma (Painéis D, Ε, I e J das Figs. 12-14).Estes resultados suportam o conceito recentemente estabelecido daregulação dependente complementar do apoptose neuronal[7,10,15,43] e promovem a significância in vivo da via alternativa(dependente do fator B) da ativação complementar em regular aextensão da neurodegeneração secundária após DCT.

Este é o primeiro estudo, no melhorconhecimento dos presentes inventores, que investigaramexclusivamente o papel da via alternativa na contribuição àneuropatologia após o dano cerebral. Os camundongos fB-/-revelaram-se anteriormente como protegidos da demielinaçãoexperimental em um modelo animal da esclerose múltipla [44], Osestudos por Nataf e colegas apoiam os presentes resultados dospresentes inventores em que a deficiência genética do fator B, queprovoca a completa falta de uma via ativação complementaralternativa funcional, possui um papel essencial para neuroproteçãoem modelos de lesão auto-imune e SNC traumático.

Regulação positiva de Bcl-2 e regulaçãonegativa de Fas em cérebros lesionados fB-/-

Um apoptose neuronal pós-traumáticorevelou-se ser promovido pela via extrínseca mediada pela Fas epela supressão do mediador antiapoptótico mitocôndrial Bcl-2 da viaintrínseca do apoptose [45-51]. Com referência à Fig. 11, osespécimes homogeneizados dos hemisférios lesionados deoperação simulada e dano cerebral dos camundongos fB+/+ e fB-/-foram executados em SDS-PAGE, transferidos das membranas denitrocelulose analisadas com anticorpos monoclonais ao Bcl-2 edetecção por exame de quimiluminescência (ECL® system,Amersham). A banda visualizada 26 kDa correspondendo aocamundongo Bcl-2 é intensificado nos camundongos knockout em24 horas, comparado aos filhotes do tipo wild com lesões cranianas.Ainda, uma regulação positiva na intensidade da coloração doreceptor Fas era óbvia, em camundongos knockout com lesãocerebral em todos os pontos de tempo avaliados, comparado aoscamundongos fB+/+ (dados não mostrados). O blot exemplar érepresentante de três experiências diferentes.

Mais particularmente, pela análise porWestern blot, os inventores constataram uma regulação positivaevidente dos níveis de proteína defensora Bcl-2 em homogêneoscerebrais de camundongos com lesão craniana fB-/- em 24 horasapós o trauma, comparado aos filhotes fB+/+ (Fig. 11). Nenhumadiferença aparente na expressão Bcl-2 entre camundongosknockout e do tipo wild foram vistos em outros pontos de tempoapós o DCT (Fig. 11). Com relação à via extrínseca do apoptose,uma regulação negativa evidente na expressão do receptor Fas foivista dentro de 4 horas a 7 dias após o DCT em camundongos fB-/-,comparado a animais fB+/+ (Fig. 11). Apesar destes dados nãoserem quantitativos, as diferenças na intensidade da coloração dasbandas 26 kDa (Bcl-2; Fig. 11) e 48 kDa (Fas; dados nãomostrados) parecem mais intenso em camundongos knockout comlesão craniana do que nos filhotes do tipo wild nos pontos de tempoacima mencionados. Estes resultados indicam um envolvimento davia alternativa da ativação complementar em apoptoses neuronaisregulatórias após DCT pela supressão de Bcl-2 e indução daexpressão do receptor Fas no cérebro lesionado. Ambos aspectossão críticos na regulação do apoptose neuronal pós lesão, comoanteriormente determinado por outros investigadores em diferentesmodelos de sistemas [45-47], Um estudo experimental sobre ummodelo de dano cerebral de impacto cortical controlado demonstrouque o volume da lesão cortical foi significantemente reduzido nocamundongo transgênico com super expressão do gene Bcl-2 por 7dias após o trauma, comparado aos filhotes do tipo wild [52], Assim,o Bcl-2 recebeu um importante papel na regulação da viamitocôndrial (intrínseca) do apoptose após o DCT [4,50,52,53].

Os presentes inventores mostraram

anteriormente que a farmacologia "pan"-inibição da ativaçãocomplementar no nível do convertase C3 por Crry-lg, uma moléculade fusão quimérica recombinante de murino, leva a um gene Bcl-2intracerebral aprimorado e expressão de proteína e a umasobrevivência neuronal elevada no hipocampo do camundongo comlesão cerebral [32], Em um modelo de cerebrite autoimune emmurino, o bloqueio da ativação complementar por Crry-Ig resultouem uma atenuação significante do apoptose neuronal [15].

Os dados do presente estudo apoiam asignificância biológica da via alternativa da ativação complementarna contribuição à seqüela neuropatológica do DCT e apresenta abase para futuros estudos farmacológicos com inibidores de viaalternativa seletivo, por exemplo, como antagonistas do fator B[33,54],

Em resumo, os presentes dados apresentama primeira evidencia de um papel maior da via alternativa daativação complementar na contribuição de toda a extensão daativação complementar pós-traumática (geração de C5a) e à morteda célula neuronal após o dano cerebral (TÚNEL, Bcl-2, e dadosFas). Esta é uma nova e provocadora descoberta, já que todos osestudos anteriormente publicados em inibição complementarexperimental nos modelos do DCT concentraram-se na interferênciacom o complemento cascata no nível "junção comum" dosconvertases C3 [26,28-32] ou ainda abaixo na cascata, porexemplo, por bloqueio específico de anafilatoxina C5a ou seureceptor [30], A subestimação até aqui do papel patofisiológico davia complementar alternativa na neuropatologia do dano cerebralpode ser em parte devido ao papel predominante historicamenteestabelecido de uma via clássica em várias doenças neurológicas[55,56]. Entretanto, os resultados do presente estudo indicam queestas visões podem não necessariamente refletir a "verdadeira"significância in vivo da via complementar alternativa em umadoença neuroinflamatória multifatorial complexa, como naconfiguração da DCT [57]. O fato que os níveis de fator B elevadoestejam presentes no compartimento intratecal de pacientes comlesão craniana severa [36] ainda apóia aqui a reivindicação que afarmacologia almejando o fator B é razoável e previsível.

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Enquanto várias configurações da presenteinvenção foram descritas em detalhes, é visível que asmodificações e adaptações destas configurações ocorram aosespecialistas na técnica. É expressamente entendido, entretanto,que estas modificações e adaptações estejam dentro do escopo dapresente invenção, como determinado nas reivindicações a seguir.

Claims

1. "MÉTODO", para reduzir ou prevenir aomenos um sintoma de dano fisiológico resultante do dano cerebraltraumático (DCT) em um animal ou intensificar a recuperação deum DCT no animal, caracterizado por compreender de maneiraseletiva a inibição de uma via complementar alternativa em umanimal que experienciou DCT.

2. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sintoma éselecionado a partir do grupo consistindo de: vaso espasmoscerebrais, depressão cardiovascular, hepatotoxicidade,imunossupressão e infecção pulmonar.

3. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sintoma éselecionado a partir do grupo consistindo de: hipotensão,hipoxemia, hipercarbia e hipoglicemia.

4. "MÉTODO", para reduzir ou prevenir aomenos um sintoma de dano fisiológico resultante do dano damedula espinhal (DME) em um animal ou intensificar a recuperaçãodo DME no animal, compreendendo de maneira seletiva a inibiçãode uma via complementar alternativa em um animal queexperienciou DME.

5. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sintoma é oinchaço da medula espinhal.

6. "MÉTODO", de acordo com asReivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapainibição compreende a administração para o animal um agente queinibe de maneira seletiva a expressão ou atividade de uma proteínana via complementar alternativa.

7. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína na viacomplementar alternativa é selecionada a partir do grupoconsistindo de Fator B, Fator D e properdina.

8. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína na viacomplementar alternativa é do Fator B.

9. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína na viacomplementar alternativa é do Fator D.

10. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína na viacomplementar alternativa é properdina.

11. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que oagente é um inibidor da expressão de uma proteína na viacomplementar alternativa.

12. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que oagente é um inibidor da atividade biológica de uma proteína na viacomplementar alternativa.

13. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que oagente é um antagonista de uma proteína na via complementaralternativa.

14. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que oagente é um anticorpo, um fragmento de ligação antígena deste, ouum polipetídeo de ligação antígena, que de maneira seletiva liga-see inibe a proteína na via complementar alternativa.

15. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo oufragmento de ligação antígena deste, se liga de maneira seletiva aofator B dentro do domínio da terceira repetição de curto consenso(RCC), onde o anticorpo evita a formação de um complexo C3bBb.

16. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo oufragmento de ligação antígena deste liga-se ao fator B e evita ouinibe a seqüência do fator B pelo fator D.

17. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a anticorpo oufragmento de ligação antígena liga-se ao domínio da terceirarepetição de curto consenso (RCC) do fator humano B.

18. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste de maneira seletiva liga-se aum epítopo no domínio da terceira RCC do fator B selecionado apartir do grupo consistindo de: um epítopo do fator B que inclui aomenos uma porção do fator humano B (SEQ ID NO:2)compreendendo da posição Tyr139 à posição Ser185, ou posiçõesequivalentes a este em uma seqüência de fator não fator humano B;um epítopo do fator B que inclui ao menos uma porção do fatorhumano B (SEQ ID NO:2) compreendendo da posição Tyr139 àposição Ser141, ou posições equivalentes a este em umaseqüência de fator não fator humano B; um epítopo do fator B queinclui ao menos uma porção do fator humano B (SEQ ID NO:2)compreendendo da posição Glu182 à posição Ser185, ou posiçõesequivalentes a este em uma seqüência de fator não fator humano B;e um epítopo do fator B que inclui ao menos uma porção do fatorhumano B (SEQ ID NO:2) compreendendo qualquer uma ou maisdas seguintes posições ou posições equivalentes a este em umaseqüência de fator não fator humano B: Tyr139, Cys 140, Ser141,Glu182, Gly184, ou Ser185.

19. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste, de maneira seletiva liga-se a um epítopo no domínio da terceira RCC do fator B (SEQ ID NO:2)compreendendo uma ou mais das seguintes posições ou suasposições equivalentes em uma seqüência de fator não fator humanoB: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, eSer192.

20. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste de maneira seletiva liga-se aum epítopo no domínio da terceira RCC do fator B (SEQ ID NO:2)compreendendo as seguintes posições ou suas posições equivalentes em uma seqüência de fator não fator humano B:Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, eSer192.

21. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação de anticorpo ou antígena deste, de maneira seletiva liga-sea um epítopo no domínio da terceira RCC do fator B (SEQ ID NO:2)consistindo das seguintes posições ou suas posições equivalentesem uma seqüência de fator não fator humano B: Ala137, Tyr139,Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190, e Ser192.

22. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste de maneira seletiva liga-se aum epítopo não linear dentro da estrutura tridimensional de umaporção do domínio da terceira RCC do fator B, onde a porção édefinida por ao menos as posições de aminoácidos Ala137-Ser192da SEQ ID NO:2 ou posições equivalentes em uma seqüência defator não fator humano B.

23. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste de maneira seletiva liga-se afator B a partir de espécies mamíferas e previne a formação de umcomplexo C3bBb.

24. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento deligação de anticorpo ou antígena deste de maneira seletiva liga-se afator B de humano e um animal selecionado a partir do grupoconsistindo de um primata não humano, camundongo, rato, porco,cavalo e coelho.

25. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um isótopo ativador não complementar ou subclasse.

26. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo monoclonal.

27. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que ofragmento de ligação antígena é um fragmento Fab.

28. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo humanizado.

29. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo bi-específico.

30. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo monovalente.

31. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é o anticorpo monoclonal 1379 (produzido por DepositoATCC No. PTA-6230).

32. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente éadministrado de maneira intravenosa ou ao cérebro do animal.

33. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente éadministrado de maneira intravenosa ou a uma medula espinhal ouespaço epidural da medula espinhal do animal.

34. "MÉTODO", de. acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-33, caracterizado pelo fato de que oagente é administrado ao animal em uma quantia eficaz de reduzirde maneira mensurável ao menos um sintoma do dano fisiológicoresultante DCT ou DME no animal como comparado na ausência daadministração do agente.

35. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente éadministrado em uma quantia eficaz para manter uma pressão deperfusão cerebral (PPC) de acima de 70-80 mmHg.

36. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente éadministrado em uma quantia eficaz para reduzir a pressãointracraniana (ICP).

37. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente éadministrado em uma quantia eficaz para reduzir o inchaço em umamedula espinhal.

38. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 6-37, caracterizado pelo fato de que oagente é administrado em um portador farmaceuticamenteaceitável.

39. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o portadorfarmaceuticamente aceitável é um composto ou composição queseja capaz de cruzar a barreira do sangue cerebral.

40. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o portadorfarmaceuticamente aceitável é um excipiente injetável.

41. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender aadministração ao animal de um outro composto para tratar de umsintoma do DCT selecionado a partir do grupo consistindo de: umdefeito físico, um defeito cognitivo e um defeito psicossocial-comportamental-emocional.

42. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o composto éselecionado a partir do grupo consistindo de: uma droga osmótica,um sedativo, um analgésico, um relaxante muscular, e umbarbitúrico.

43. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 4, caracterizado pelo fato de ainda compreender aadministração de um esteróide ao animal.

44. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender otratamento do animal com DCT por um protocolo selecionado apartir do grupo consistindo de: redução das lesões de massa porevacuação cirúrgica dos hematomas intracranianos; redução doinchaço do cérebro com drogas osmóticas; drenagem terapêuticado fluido cerebrospinal (FCS) através de intracateteres ventricular;mapeamento por tomografia computadorizada (TC); sedação;analgesia; relaxamento muscular; hiperventilação moderada;hipotermia moderada; e/ou coma por barbitúricos.

45. "MÉTODO", de acordo com aReivindicação 4, caracterizado pelo fato de ainda compreender otratamento do animal com DME: administração de esteróides;imobilização da espinha; cirurgia de descompressão; cirurgia paraestabilizar a vértebra; cirurgia para realinhar a vértebra; e/ou tração.

46. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 1-45, caracterizado pelo fato de que oanimal é um mamífero.

47. "MÉTODO", de acordo com qualqueruma das Reivindicações 1-45, caracterizado pelo fato de que oanimal é um humano.

48. "MÉTODO", para reduzir ou prevenir aomenos um sintoma do dano fisiológico resultante dano cerebraltraumático (DCT) em um animal que experienciou DCT,caracterizado pelo fato de compreender a administração ao animalde um agente que inibe fator B por ligação ou bloqueio do domínioda terceira repetição de curto consenso (RCC) do fator B.

49. "MÉTODO", para reduzir ou prevenir aomenos um sintoma do dano fisiológico resultante dano cerebraltraumático (DME) em um animal que experienciou DME1caracterizado pelo fato de compreender a administração ao animalde um agente que inibe fator B por ligação ou bloqueio do domínioda terceira repetição de curto consenso (RCC) do fator B.

50. "MÉTODO", de acordo com asReivindicações 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o agenteé um anticorpo ou um fragmento de ligação antígena deste, que demaneira seletiva liga-se a fator B.

51. "COMPOSIÇÃO", caracterizado pelofato de compreender: um primeiro agente selecionado a partir dogrupo consistindo de um anticorpo isolado, um fragmento de ligaçãoantígena deste, e um polipeptídeo de ligação antígena, onde oprimeiro agente inibe de maneira seletiva a expressão ou atividadebiológica de uma proteína na via complementar alternativa; e umsegundo agente para o tratamento de um sintoma de dano cerebraltraumático (DCT).

52. "COMPOSIÇÃO", caracterizado pelofato de compreender: um primeiro agente selecionado a partir dogrupo consistindo de um anticorpo isolado, um fragmento de ligaçãoantígena deste, e um polipeptídeo de ligação antígena, onde oprimeiro agente inibe de maneira seletiva a expressão ou atividadebiológica de uma proteína na via complementar alternativa; e umsegundo agente para o tratamento de um sintoma de dano damedula espinhal (DME).

53. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que o primeiroagente inibe a expressão ou atividade biológica de uma proteínaselecionada a partir do grupo consistindo do Fator B1 Fator D eproperdina.

54. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que o primeiroagente liga-se a fator B dentro do domínio da terceira repetição decurto consenso (RCC) e inibe ou previne a formação de umcomplexo C3bBb.

55. "COMPOSIÇÃO", de acordo comqualquer uma das reivindicações 51 a 54, caracterizado pelo fatode que o primeiro agente é um fragmento de ligação de anticorpoou antígena deste.

56. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é oanticorpo monoclonal 1379.

57. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o segundoagente é um composto para o tratamento de um sintoma do DCTselecionado a partir do grupo consistindo de: um defeito físico, umdefeito cognitivo e um defeito psicossocial-comportamental-emocional.

58. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o segundoagente é selecionado a partir a partir do grupo consistindo de: umadroga osmótica, um sedativo, um analgésico, um relaxantemuscular, e um barbitúrico.

59. "COMPOSIÇÃO", de acordo com aReivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o segundoagente é um esteróide.

60. "USO DE UM AGENTE", caracterizadopelo fato de que que inibe de maneira seletiva a via complementaralternativa em uma composição farmacêutica para o tratamento dodano cerebral traumático (DCT).

61. "USO DE UM AGENTE", caracterizadopelo fato de que inibe de maneira seletiva a via complementaralternativa em uma composição farmacêutica para o tratamento dodano da medula espinhal (DME).

62. "USO DE UM AGENTE", de acordo coma Reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que o agenteé um fragmento de ligação de anticorpo ou antígena deste que demaneira seletiva liga-se a fator B.