CN102539466A - 一种筛选治疗脑损伤药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种筛选治疗脑损伤药物的方法，本发明通过对PSD-95 PDZ2结构域的¹H，¹⁵N HSQC核磁共振指纹谱图的研究，提供一种可与PSD-95 PDZ2结构域相结合的小分子化合物的筛选方法，该方法筛选出的小分子化合物因与PSD-95的PDZ2结构域结合，从而可以破坏PSD-95与NMDAR或nNOS的相互结合；本发明还提供一种治疗缺血性中风潜力的小分子化合物筛选方法，筛选得到的有效剂量的黄芩苷，可用于治疗人类脑缺血缺氧导致的脑损伤。本发明筛选出的化合物还可治疗由PSD-95PDZ结构域介导的信号传导通路相关疾病，还可作为降低NMDA受体相关神经毒性损害的替代疗法。

Description

一种筛选治疗脑损伤药物的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种筛选脑损伤药物的方法，具体涉及一种用核磁共振技术筛选治疗脑损伤药物的方法。本发明还提供突触后致密物质-95(PSD-95)的PDZ2结构域的核磁共振指纹图谱。

背景技术

现有技术公开了N-methyl-D-aspartate受体(NMDAR)是一种离子型的谷氨酸受体，在中枢神经系统的发展过程中，对于神经元分化、迁移、突触的形成、以及轴突的生长形态起关键作用。但是，NMDAR的持续过激导致的细胞内一氧化氮(NO)的过量生产将引起缺血缺氧性神经损伤，其代表病例为通常称谓的中风。

现代医学研究发现，在经由NMDAR进入后突触神经元的钙流的过度刺激下，nNOS产生的过量NO是导致中风类神经损伤的一个主要原因。由于NMDAR及nNOS参与多种重要的细胞生理活动，用NMDAR或nNOS的直接抑制剂来治疗NO过量导致的神经损伤通常会引发细胞毒性等副作用，因而近年来医学研究一直在寻找其替代疗法。PSD-95蛋白由于其PDZ2结构域在NMDAR/nNOS通路中起到重要的支架作用[1，2]，而成为一类针对NO过量生产引发的神经损伤的极有潜力的药物靶标：可以通过小分子化合物阻断NMDAR/PSD-95/nNOS复合体的形成，进而切断NMDAR与nNOS的物理偶联来抑制中风。有关生化研究表明，阻断PSD-95PDZ结构域上nNOS的结合位点在理论上是可行的[3-5]。研究还表明，神经细胞中PSD-95的缺失将减少NO的生成并抑制兴奋性中毒，而NMDAR的正常生理活性不受影响[6，7]。Aarts等的体内及体外实验还证实，小肽可以通过阻碍NMDAR NR2B与PSD-95的相互结合而具有神经保护作用[6]。这些研究结果表明，破坏PSD-95与NMDAR或nNOS之间的相互作用可能代表一种治疗NMDAR介导的神经毒性的极具潜力的替代疗法。

与本发明相关的现有技术有下述参考文献：

1.Kornau，H.C.，et al.，Domain interaction between NMDA receptor subunits and thepostsynaptic density protein PSD-95.Science，1995.269(5231)：p.1737-40.

2.Brenman，J.E.，et al.，Interaction of nitric oxide synthase with thepostsynaptic density protein PSD-95 and alphal-syntrophin mediated by PDZdomains.Cell，1996.84(5)：p.757-67.

3.Tochio，H.，et al.，Solution structure and backbone dynamics of the second PDZdomain of postsynaptic density-95.J Mol Biol，2000.295(2)：p.225-37.

4.Tochio，H.，et al.，Formation of nNOS/PSD-95PDZ dimer requires a preformedbeta-finger structure from the nNOS PDZ domain.J Mol Biol，2000.303(3)：p.359-70.

5.Tochio，H.，et al.，Solution structure of the extended neuronal nitric oxidesynthase PDZ domain complexed with an associated peptide.Nat Struct Biol，1999.6(5)：p.417-21.

6.Aarts，M.，et al.，Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDAreceptor-PSD-95 protein interactions.Science，2002.298(5594)：p.846-50.

7.Sattler，R.，et al.，Specific coupling of NMDA receptor activation to nitricoxide neurotoxicity by PSD-95 protein.Science，1999.284(5421)：p.1845-8.

8.Zhang，M.and W.Wang，Organization of signaling complexes by PDZ-domainscaffold proteins.Acc Chem Res，2003.36：p.530-538。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种筛选脑损伤药物的方法，具体涉及一种用核磁共振技术筛选治疗脑损伤药物的方法。

本发明还提供突触后致密物质-95(PSD-95)的PDZ2结构域的核磁共振指纹图谱。

本发明通过破坏N-methyl-D-aspartate受体(NMDAR)/神经元一氧化氮合成酶(nNOS)与突触后致密物质-95(PSD-95)的PDZ2(PSD-95；Disc Large和Zonula occludens-1)结构域的相互作用，提供筛选治疗缺血性中风潜力的小分子化合物。

具体而言，本发明通过对PSD-95PDZ2结构域的¹H，¹⁵N HSQC核磁共振指纹谱图的研究，提供一种可与PSD-95 PDZ2结构域相结合的小分子化合物的筛选方法，该方法筛选出的小分子化合物因与PSD-95的PDZ2结构域结合，从而可以破坏PSD-95与NMDAR或nNOS的相互结合；

上述的化合物也可用于进一步完善基于其他PDZ结构域的疾病治疗策略。

本发明的快速筛选脑损伤药物方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)获得自由态的PSD-95 PDZ2结构域蛋白样品；

(2)采取上述自由态PSD-95 PDZ2结构域的第一次核磁共振谱图；

(3)在该PDZ2样品中加入一种待测化合物，制得一个测试样本；

(4)培育混合后的PDZ2样品，使待测化合物与PDZ2结构域完全、充分反应；

(5)采取培育后PDZ2结构域的第二次核磁共振谱图；

(6)比较第一和第二次核磁共振谱图以确定反应情况；

(7)确认上述待测化合物的结合使PSD-95 PDZ2的βB折叠和αB螺旋上的氨基酸发生化学位移变化。

本发明步骤(7)中，所述的氨基酸至少包含PSD-95 PDZ2由甘氨酸169-丙氨酸175所组成的βB折叠，以及组氨酸225-赖氨酸233所组成的αB螺旋中各一个氨基酸。

本发明中，所述的PSD-95蛋白PDZ2结构域的氨基酸序列(单字母表示，氨基酸155-249)为：序列1。

本发明采用核磁共振光谱法提供的快速筛选方法，可用于高速高效地筛选与PSD-95的PDZ2结构域相互作用的化合物。

本发明中，所述的测试样本中含有天然中药成分黄芩苷(baicalin)。

所述的的黄芩苷的有效剂量，可用于治疗人类脑缺血缺氧导致的脑损伤。

本发明利用核磁共振光谱技术(化学位移)的精湛灵敏度来探测靶标蛋白与其潜在配体的结合，为目标蛋白PSD-95与小分子化合物之间直接结合提供一个灵敏的检测方法，该方法不需要知道待筛选化合物以及目标蛋白的任何生物活性；而且，由于该筛选方法仅仅依赖于化合物与靶标蛋白的直接相互作用，因此也不存在任何错误。

本发明研究结果显示，PSD-95蛋白可通过¹⁵N(或¹³C)进行同位素标记，¹⁵N(或¹³C)标记后的PSD-95可通过采集¹H，¹⁵N(或¹H，¹³C)HSQC(异核单量子相干)谱，识别所述的与PSD-95蛋白相结合化合物的高灵敏度和高效；自由态PDZ2的¹H，¹⁵N HSQC谱图中的共振峰可用于确定待测化合物是否有能力部分或全部破坏PSD-95 PDZ2结构域与NMDAR或nNOS的结合。

本发明研究结果还显示，由于每个氨基酸都具有特异的化学位移，即在谱图中的位置都已被归属，因此通过比较二张谱图，还可确定化合物特异地结合在PDZ结构域的部分。由于PDZ结构域典型的靶物结合位点是由第二个β-折叠以及第二个α-螺旋之间形成的凹槽，根据在加入化合物后PDZ2的靶物结合凹槽上的氨基酸是否发生化学位移变化，判断上述化合物与PDZ2之间是否为典型的结合模式。例如，PSD-95 PDZ2的异亮氨酸174(位于PDZ2的第二个β-折叠，其化学位移为¹H 8.47ppm，¹⁵N 114.6ppm，标记为I174，如图1所示)及亮氨酸232(位于PDZ2的第二个α-螺旋，其化学位移为¹H 7.46ppm，¹⁵N 115.5ppm，标记为L232，如图1所示)在结合化合物时都会发生化学位移的变化(这一方法也被称为化学位移微扰法)，如果PSD-95 PDZ2上与某配体化合物的结合区域与NMDAR/nNOS的结合区域重叠[4]，则说明上述配体阻碍PDZ2与NMDAR或nNOS的结合。

本发明的快速筛选治疗脑损伤药物的方法，具有核磁共振光谱法快速、容易、可重复性、以及不需要有高纯度分析标的物作为标准品的特殊优点，所述的化学位移微扰法还可应用于同时筛选多种化合物的混合物(例如，化合物库)或复杂的提取物。如：某个复杂测试样本中包含一个积极的结果，可将该样本提取出来，通过粗分再细分的方法，逐步简化测试样本成分，最终把该样本中的单一有效化合物鉴定出来。

根据本发明所述的化学位移微扰法，本发明的一个实施例中，发现传统中草药黄芩水溶性提取物中的成分黄芩苷(baicalin)可结合PSD-95的PDZ2结构域，并特异地结合到PDZ2的NMDAR/nNOS结合口袋里。依据结合位点的分析，本发明进一步合成与PSD-95结合的天然化合物的衍生物，获得比天然化合物更高的结合能力。

本发明的方法根据PSD-95 PDZ2因靶物结合引起化学位移变化的高灵敏性，可运用化学位移微扰法很容易地识别与PSD-95结合的化合物；同时，本发明也为分析水溶性草药提取物中可与PDZ结合的活性成分提供一个有效手段。

本发明的方法筛选出的小分子化合物可用于治疗中风，同时也可为干扰其他PDZ结构域介导的信号传导通路的小分子药物的优化与筛选提供指导依据。

本发明中提供的化合物可作为治疗由PSD-95PDZ结构域介导的信号传导通路相关疾病的潜在药物，还是一种降低NMDA受体相关神经毒性损害的替代疗法。

为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本发明范围之内。

附图说明

图1显示自由态PSD-95 PDZ2的¹H，¹⁵N HSQC谱图。每个主链共振峰都标记上其代表的氨基酸名称(单字母表示)及序列号。

图2显示在加入NMDAR NR2B肽段后的束缚态PSD-95 PDZ2的¹H，¹⁵N HSQC谱图。

图3是图1及2的重叠谱图，图中自由态PDZ2的谱峰为深色，束缚态PDZ2的谱峰为浅色。

图4是黄芩苷的化学结构。

图5是用增量的黄芩苷滴定自由态PDZ2(谱峰为黑色)的¹H，¹⁵N HSQC重叠谱图；图中显示加入黄芩苷的量越多，谱峰的灰阶颜色越淡，箭头标示选定氨基酸随加入黄芩苷而发生的化学位移变化。

图6显示PDZ2的I174及L232随加入黄芩苷的增加而发生化学位移变化的剂量-反应曲线。

具体实施方式

实施例1.PSD-95重组蛋白的表达与同位素标记

为了提高筛选的特异性和灵敏度，PSD-95蛋白的PDZ2结构域使用重组蛋白的方法用¹⁵N均一标记。PDZ结构域蛋白的表达方法参见文献[3]。

首先将包含PSD-95 PDZ2的pET14b质粒通过电穿孔转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。挑取单菌落接种于LB培养基中并于37℃摇床中生长过夜。细菌的饱和溶液再以1∶100的比例接种于大剂量的LB培养基中，在37℃摇床中培养至OD600达到～0.6，再用终浓度为0.2mM的异丙基-β三维-半乳糖苷(IPTG)诱导，接着在30℃摇床中中速培养4-5小时即可。

为了获得¹⁵N均一标记的PDZ2，蛋白表达需采用M9培养基并使用¹⁵NH₄Cl(1克/升)作为唯一氮源，并加入终浓度为0.4mM的IPTG以诱导蛋白表达。将1升细菌培养液低速离心得到的细胞沉淀加入40毫升冰冻处理的Ni²⁺-NTA亲和柱结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH 7.9)以悬浮细胞，然后使用细胞破碎仪进行一到两次简短的超声破碎以裂解细胞。细胞裂解液在39,000xg的转速下离心20分钟以除去细胞碎片，上清通过0.22m滤膜过滤后加载到Ni²⁺-NTA柱上，再用100毫升的结合缓冲液冲洗。最后，His-标签的PDZ2蛋白用15毫升洗脱缓冲液(1M咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH 7.9)洗脱。

洗脱蛋白在包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，2mM乙二胺四乙酸，2mM DTT的缓冲液中进行透析。N末端的His-标签通过凝血酶蛋白进行酶切(1毫克的His-PDZ2加入一单位的酶，在室温下酶切4小时)。酶切后的蛋白通过Sephacryl-100凝胶过滤柱去除His-标签，凝血酶及其他污染物。包含PDZ2的组分收集后在碳酸氢铵溶液中梯度透析(由5克/4升下降到0.5克/4升)，最后在双重蒸馏水中透析。蛋白样品冷冻干燥后于-20℃保存。

实施例2.自由态PDZ2蛋白的核磁共振谱图分析

如上所述，¹⁵N均一标记的PSD-95PDZ2结构域将用于核磁共振实验。温度30℃时，使用瓦里安VNMRS 600MHz核磁共振谱仪采集谱图。冻干的¹⁵N标记的PDZ2蛋白溶解于100mM的磷酸钾盐缓冲液(pH 6.0)，蛋白浓度～0.1-0.2mM(通常体积为0.5毫升)。

如图1所示的PSD-95PDZ2结构域的¹H，¹⁵N HSQC(异核单量子相干)频谱，由于蛋白质中每个氨基酸残基(且只有氨基酸残基)都用¹⁵N标记，可在采集的¹H，¹⁵N HSQC谱图中观察记录该蛋白的每个氨基酸残基的单一共振峰；每个共振峰的归属在早先的实验中已被阐明[3]，而PSD-95PDZ2蛋白上直接参与NMDAR或nNOS结合的氨基酸也已被确定[3，4]。

实施例3.束缚态PDZ2蛋白的核磁共振谱图分析

使用PSD-95结合蛋白NMDAR NR2B羧基端的9个氨基端小肽(NR2B肽段)检测采用核磁共振作为灵敏筛选方法的效果。已有报道NR2B蛋白可以结合PDZ2[1]。

由于PSD-95PDZ2结构域的¹H-¹⁵N HSQC谱图中每个共振吸收峰的归属已知，并可直接联系到PDZ2结构域的三维空间结构，PDZ2每个氨基酸残基由于靶物结合诱导的化学位移变化值可以用公式计算：

Δ_ππμ＝[(Δδ_HN)²+(Δδ_N·α_N)²]^1/2

其中用于归一化¹H和¹⁵N的比例因子α_N为0.17，Δδ_HN为某一共振峰与¹⁵N相连的H原子的化学位移变化，而Δδ_N为该共振峰¹⁵N的化学位移变化。

如图2所示的PSD-95 PDZ2在结合NR2B肽段之后的¹H，¹⁵N HSQC谱图，该谱图显示PSD-95PDZ2每个氨基酸残基的化学位移变化值可以进一步映射到其三维结构上，并以此判断化合物与蛋白质的具体结合情况。

如图3所示，谱图重叠更清晰地显示了PSD-95在结合NR2B肽段之后化学位移的变化。对于粗略确定是否有任何化合物与PDZ2结构域结合，可以用计算机设置氨基酸残基检查点，如图1中丝氨酸173(117.1ppm，8.60ppm)，异亮氨酸174(114.6ppm，8.47ppm)，丙氨酸175(123.2ppm，9.11ppm)，组氨酸225(125.1ppm，9.81ppm)，谷氨酸226(115.1ppm，9.64ppm)，丙氨酸228(1.253ppm，7.57ppm)，丙氨酸231(1.203ppm，7.78ppm)，和亮氨酸232(115.5ppm，7.46ppm)。图3清楚地表明，NR2B肽段的结合导致PSD-95 PDZ2结构域中直接参与配体结合的第二个β-折叠及第二个α-螺旋上的氨基酸(包括上面提到的氨基酸残基)发生了化学位移变化。

解析PSD-95 PDZ2结构域的高分辨率溶液结构，并通过¹⁵N弛豫实验及无模型(model-free)的方法详细研究PDZ2结构域的主链动力学。PSD-95 PDZ2在βB和βC折叠间有一条长环，而这条独特的长环直接参与靶物结合[3]。可将配体结合诱导的每个氨基酸残基的化学位移变化值定量计算后绘制到蛋白的三维结构上(参见[3])。配体结合诱导的化学位移变化仅限于PSD-95PDZ2结构域的第二个β-折叠及第二个α-螺旋之间的凹槽。

实施例4.筛选与PDZ2结合的天然化合物

由上述实施例3中的数据证明，本发明中的化学位移微扰法可以有效地筛选出与PDZ2相结合的肽段。

在本发明的方法中，PSD-95 PDZ2结构域由上述实施例1所述重组表达并用¹⁵N标记。¹⁵N标记的PSD-95 PDZ2结构域在大肠杆菌中表达并纯化。浓度为0.1-0.2mM纯化的重组蛋白(0.5毫升，溶于100mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0)将与天然小分子化合物混合(得到束缚态PDZ2)。

使用上述制备技术，将束缚态与自由态(～0.1mM，同样缓冲溶液条件)PDZ2蛋白的¹H，¹⁵N HSQC谱图记录后进行对比。基于核磁共振的化学位移微扰法可用来检测¹⁵N标记的PSD-95 PDZ2与小分子化合物之间的结合情况。在与小分子化合物混合后，与自由态相比PDZ2的化学位移发生变化的将被认为该化合(混合)物中含有可与PSD-95 PDZ2相结合的活性成分。

本发明发现，使用这种方法，传统中草药黄芩的水溶性成分之一黄芩苷可诱导PSD-95PDZ2发生显著的化学位移变化。图5显示了PSD-95 PDZ2在混合入增量的黄芩苷之后的¹H，¹⁵NHSQC重叠谱图。在加入10倍于PDZ2剂量的过量黄芩苷后，60％的PDZ2结构发生扰动。

如图6所示，为了进一步确定黄芩苷与PSD-95 PDZ2的结合情况，本发明构建异亮氨酸174(I174)和亮氨酸232(L232)化学位移变化幅度随黄芩苷剂量改变的剂量-反应曲线。I174和L232分别处于蛋白的B折叠与B螺旋上，其滴定曲线都显示出对于黄芩苷剂量依赖性和饱和性的特点，证实了黄芩苷与PDZ2-95 PDZ2的特异性相互作用。同时，通过将PSD-95 PDZ2的I174与L232的酰胺基团的诱导化学位移变化与其最大化学位移变化作归一化处理，还可定量计算黄芩苷与PDZ2的解离常数(Kd～2mM)。由此，基于核磁共振技术的筛选结果表明，黄芩苷可以特异地结合于PDZ2的配体结合αB/βB凹槽，从而对其结构造成扰动。值得注意的是，黄芩苷与NMDAR/nNOS都结合在PSD-95 PDZ2结构域的同一位点[3]。

与多肽诱导的PDZ2化学位移变化[3]相比，由黄芩苷诱导的PDZ2化学位移变化在空间范围上更狭小。由黄芩苷诱导的PDZ2结构变化主要集中在αB/βB沟槽的中间部位，这表明，上述化合物与PSD-95 PDZ2的相互作用主要发生在配体结合凹槽的中心，而羧基结合环以及可容纳肽链羧基端氨基酸侧链的疏水口袋是空置的。因此，本发明为合成具有同PSD-95 PDZ2更高亲和力的黄酮类衍生物提供了参考依据。

黄酮类黄芩苷为天然中草药提取物，已被广泛认为可直接作用于NMDAR，本发明的实验结果进一步证实黄芩苷有可有效地用于治疗缺血性中风；同时，由于黄芩苷为天然中草药提取物，在其草药混合物状态已长期用于中风治疗，普遍认为在治疗剂量下无毒。因此，运用本发明所筛选出的与PDZ2相结合的天然化合物，以及以此为模板设计的改良型化合物，与完全人工设计合成的化合物相比可能具有副作用小的优势。

Claims (7)

1.一种筛选治疗脑损伤药物的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)获得自由态的PSD-95 PDZ2结构域蛋白样品；

(2)采取上述自由态PSD-95 PDZ2结构域的第一次核磁共振谱图；

(3)在该PDZ2样品中加入一种待测化合物，制得一个测试样本；

(4)培育混合后的PDZ2样品，使待测化合物与PDZ2结构域完全、充分反应；

(5)采取培育后PDZ2结构域的第二次核磁共振谱图；

(6)比较第一和第二次核磁共振谱图以确定反应情况；

(7)确认上述待测化合物的结合使PSD-95 PDZ2的βB折叠和αB螺旋上的氨基酸发生化学位移变化。

2.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(7)中的氨基酸至少包含PSD-95PDZ2由甘氨酸169-丙氨酸175所组成的βB折叠，以及组氨酸225-赖氨酸233所组成的αB螺旋中各一个氨基酸。

3.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的测试样本中含有天然中药成分黄芩苷。

4.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的PSD-95蛋白PDZ2结构域的氨基酸序列为：序列1。

5.一种权利要求1的方法筛选的化合物，其特征在于，确定为有效剂量的黄芩苷。

6.权利要求5所述的有效剂量的黄芩苷在制备治疗人类脑损伤药物中的用途。

7.按权利要求6的用途，其特征在于所述的脑损伤是脑缺血缺氧导致的脑损伤。

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