ES2371748T3 - Anticuerpos anti-ngf para el tratamiento de diversos trastornos. - Google Patents

Anticuerpos anti-ngf para el tratamiento de diversos trastornos. Download PDF

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Abstract

Una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano (antihNGF) capaz de unir el hNGF, e inhibir la unión de hNGF al TrkA humano (hTrkA) in vivo para uso en un método para controlar una afección relacionada con NGF en un paciente humano, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hNGF reconoce un epítopo NGF seleccionado del grupo que consiste de: a) un epítopo que comprende la sobreposición de la región de unión p75 y NGF-TrkA, giro ß A'-A" (V - 1) y la región de unión TrkA dominante en la lámina C ß; y b) un epítopo que comprende i) residuos K32, K34 y E35 de hNGF; ii) residuos Y79 y T81 de hNGF; iii) residuos H84 y K88 de hNGF; iv) residuo R103 de hNGF; v) residuo E11 de hNGF; vi) residuo Y52 de hNGF; y vii) residuos L112 y S113 de hNGF; y en donde la afección relacionada con NGF es dolor crónico.

Description

Anticuerpos Anti-NGF para el Tratamiento de Diversos Trastornos
Antecedente de la Invención
Campo de la Invención
La presente invención se relaciona de manera general con métodos para utilizar los anticuerpos anti-NGF como se define en las reivindicaciones en el tratamiento de dolor crónico. Los métodos son efectivos en el tratamiento de este trastorno en un paciente sin tener un efecto adverso significativo en el sistema inmune del paciente.
Descripción de la Técnica Relacionada
Factor de Crecimiento Nervioso (NGF)
El Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) es la primera neurotrofina que se va a identificar, y se ha caracterizado bien su función en el desarrollo y la supervivencia de las neuronas periféricas y centrales. Se ha mostrado que el NGF tiene un factor de mantenimiento y supervivencia crítica en el desarrollo de las neuronas sensoriales embriónicas y simpáticas periféricas y de neuronas colinérgicas prosencefálicas basales (Smeyne et al., Nature 368:246-249 (1994); Crowley et al., Cell 76:1001-1011 (1994)). El NGF regula por aumento la expresión de neuropéptidos en las neuronas sensoriales (Lindsay and Harmer, Nature 337:362-364 (1989)) y su actividad está mediada a través de dos receptores de unión de membrana diferentes. El receptor de tirosina quinasa TrkA media la unión de alta afinidad y el receptor p75, que se relaciona estructuralmente con otros miembros de la familia del receptor de factor de necrosis de tumor, media la unión de baja afinidad (Chao et al., Science 232:518-521 (1986)).
Además de sus efectos en el sistema nervioso, el NGF ha estado implicado gradualmente en los procesos por fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha mostrado que el NGF mejora la permeabilidad vascular (Otten et al., Eur. J. Pharmacol. 106:199-201 (1984)), mejora las respuestas inmunes de célula T- y B (Otten et al., Proc. Natl. Acad Sci.
U.S.A.
86:10059-10063 (1989)), inducen la diferenciación de linfocito y la proliferación de mastocitos y provocan la liberación de las señales biológicas solubles de los mastocitos (Matsuda at al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:65086512 (1988); Pearce et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)).
Se produce NGF mediante un número de tipos celulares que incluyen mastocitos (Leon et al., Proc. Natl. Acad Sci.
U.S.A.
91:3739-3743 (1994)), linfocitos B (Torcia at al., Cell 85:345-356 (1996), queratinocitos (Di Marco et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)) y células de músculo liso (Ueyama et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)). Se han encontrado los receptores NGF en una variedad de tipos celulares por fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha encontrado el TrkA en monocitos humanos, linfocitos T- y B y mastocitos.
Consistente con una función no neuronal para el NGF, se ha observado una asociación aumentada entre los niveles NGF y una variedad de afecciones inflamatorias en pacientes humanos así como también en diversos modelos de animal. Estos incluyen lupus eritematoso sistémico (Bracci- Laudiero et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), esclerosis múltiple (Bracci-Laudiero et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), soriasis (Raychaudhuri et al., Acta Derm.Venereol. 78:84-86 (1998)), artritis (Falcini at al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)) y asma (Braun et al., Eur. J. Immunol. 28:3240-3251 (1998)). Las afecciones inflamatorias crónicas tales como estas son un problema de salud pública significativo. Por ejemplo, se estima que la artritis afecta 37.9 millones de personas solo en los Estados Unidos. Las terapias actuales para tratar estas afecciones se limitan severamente. La comprensión de la función del NGF en estas enfermedades puede proporcionar nuevos métodos para tratarlas.
Se ha observado una correlación entre tensión y soriasis. Con base en esta correlación y la simetría de las lesiones cutáneas que acompañan la enfermedad, se ha propuesto una relación con el sistema nervioso (Raychaudhuri et al., Acta Derm. Venercol. 78: 84-86 (1998)). En particular, se ha sugerido que los neuropéptidos cumplen una función en la patogenia de la soriasis. Los investigadores han reportado un número creciente de nervios cutáneos terminales junto con la regulación por aumento de uno o más de los neuropéptidos, tales como la sustancia P (SP), el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) y CGRP. El NGF cumple una función en la regulación de la inervación en la piel y también se sabe que regula por aumento los neuropéptidos, lo que sugiere que los niveles de NGF aumentados pueden ser responsables de la regulación por aumento de los neuropéptidos y la inervación cutánea aumentada vista con la soriasis. De hecho, se ha observado una expresión aumentada de NGF en queratinocitos soriáticos (Raychaudhuri et al., Acta Derm. Venercol. 78:84-86 (1998)). Se ha sugerido que aunque el NGF sirve normalmente como un factor de supervivencia para los queratinocitos, la sobreexpresión del NGF evita la muerte celular normal, que conduce a soriasis (Pincelli et al., J. Derm. Sci. 22:71-79 (2000)).
E02774103 15-11-2011
Un número de estudios han indicado que los neuropéptidos tales como la sustancia P (SP) y los compuestos biológicamente activos liberados de los mastocitos, tales como histamina, también cumplen una función en la artritis que ocurre de forma natural en los humanos y la artritis inducida experimentalmente en modelos de animal (ver por ejemplo Levine, J., Science 226:547-549 (1984)). Se ha mostrado que el NGF afecta la degranulación de los mastocitos (Bruni et al., FEBS Lett. 138:190-193 (1982)) y sustancia P liberada (Donnerer et al., Neurosci. 49: 693698 (1992)), que se implica en la patogenia de la artritis.
De manera consistente, un nivel elevado del NGF en los tejidos periféricos se asocia con hiperalgesia e inflamación y se ha observado en un número de formas de artritis. El sinovio de los pacientes afectados por artritis reumatoide expresa altos niveles de NGF aunque se ha reportado que el NGF del sinovio no inflamado es indetectable (Aloe et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Se ven resultados similares en ratas con artritis reumatoide reducida experimentalmente (Aloe al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Se han reportado niveles elevados de NGF en ratones artríticos transgénicos junto con un aumento en el número de los mastocitos. (Aloe et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)). Sin embargo, el NGF purificado inyectado en el sinovio de la articulación de ratas normales no induce la inflamación de la articulación rodilla, lo que sugiere que el NGF no cumple una función causativa en la artritis (Aloe et al., Growth Factors 9:149-155 (1993)).
Los altos niveles de NGF se han asociado con inflamación alérgica y se ha sugerido que esta esto se relaciona con degranulación de mastocitos (Bonini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10955-10960 (1996)).
También se observan niveles de NGF elevados en el asma alérgica o no alérgica (Bonini et al., supra). Se han propuesto que los mastocitos, eosinófilos y linfocitos T cumplen una función en esta enfermedad inflamatoria y la correlación entre los niveles de suero NGF y los títulos de anticuerpo IgE sugieren que el NGF contribuye a la respuesta inmune inflamatoria. La inflamación de las vías respiratorias inducida por alérgenos se ha asociado con producción aumentada local de NGF en ratones y humanos (Braun et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 118:163-165 (1999)).
Se ha mostrado que el NGF regula el desarrollo aumentado de la respuesta hiperactiva de las vías respiratorias, una característica del asma bronquial (Braun et al., Eur. J. Immunol. 28:3240-3251 (1998)). De hecho, en un estudio, el tratamiento de los ratones sensibilizados con el alérgeno con el anticuerpo anti-NGF evita el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias luego de exposición local a alérgenos (Braun et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 118:163-165 (1999)).
A pesar de los resultados promisorios obtenidos en los ratones, se reportan efectos adversos para neutralizar anticuerpos anti-NGF en el sistema inmune han surgido de cuestiones serias acerca de la factibilidad para utilizar anticuerpos anti-NGF como un terapéutico en la prevención o el tratamiento de asma u otras enfermedades o trastornos en pacientes humanos. En particular, Torcia et al., Cell 85:345-356 (1996) identifica el NGF como un factor de supervivencia autocrino para la memoria de linfocitos B, y demuestra que la administración in vivo de la neutralización de anticuerpos anti-NGF provoca un agotamiento de las células B de memoria y elimina las respuestas inmunes específicas a antígeno secundarias en los ratones. Garaci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14013-14018 (1999) reporta que el NGF es un factor de supervivencia autocrino que rescata los monocitos/macrófagos humanos del efecto citopático provocado por infección por VIH. Este informe, junto con los hallazgos de Torcia et al., supra sugerirán que los anticuerpos anti-NGF tienen el potencial de comprometer el sistema inmune del sujeto tratado.
La WO 01/78698 A2 describe el uso de anticuerpos anti-NGF en el tratamiento de dolor visceral crónico. En particular, la WO 01/78698 describe el uso de un antisuero anti-2.5S-NGF policlonal comercializado por la compañía Sigma Chemicals (USA) bajo la referencia N-6655.
Braun et al. (Eur. J. Immunol. (1998) 28: 3240-3251) describe el uso del mismo suero de anticuerpo policlonal en un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias por alergia y asma.
Ro et al. (Pain (1999) 79: 265-274) describe el uso del suero de anticuerpo policlonal en ratas en el tratamiento de dolor neuropático.
Ninguno de los documentos anteriores describe el anticuerpo como se define en las reivindicaciones, o su ventaja de no tener efecto adverso significativo en el sistema inmune.
Resumen de la Invención.
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado que la administración in vivo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-NGF (anticuerpo 911) no tiene efecto adverso en el sistema inmune en un modelo de alergia experimental en ratón. De acuerdo con lo anterior, esto y los anticuerpos
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relacionados son promisorios en el tratamiento de trastornos asociados con NGF, que incluyen asma, en pacientes humanos.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método para controlar un trastorno relacionado con NGF en un paciente humano al administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano (anti-hNGF) que es capaz de unir hNGF con una afinidad en el rango nanomolar, e inhibir la unión de hNGF al TrkA humano (hTrkA) in vivo, en donde el anticuerpo no tiene efectos adversos significativos en el sistema inmune del paciente, como se define en las reivindicaciones
En una realización la afinidad de unión del anticuerpo a hNGF es preferiblemente aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.80 nM, más preferiblemente aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.75 nM y aún más preferiblemente aproximadamente 0.18 a aproximadamente 0.72 nM.
En otra realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo hNGF como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de MAb 911, MAb 912 y MAb 938, más preferiblemente el mismo epítopo como MAb 911.
En todavía otra realización el anticuerpo es capaz de reaccionar en forma cruzada con el NGF de murino (muNGF).
El anticuerpo también puede ser un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo, y más preferiblemente una molécula Fv de cadena sencilla (scFv).
En otra realización el anticuerpo es quimérico. También puede ser humanizado o humano.
En todavía otra realización el anticuerpo es biespecífico. El anticuerpo biespecífico puede tener una especificidad anti-IgE.
El trastorno relacionado con NGF que se controla no se asocia preferiblemente con el efecto NGF en el sistema neuronal.
En una realización el trastorno relacionado con NGF es una afección inflamatoria, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste de asma, artritis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso y soriasis.
En una realización preferida la afección es asma. En otra realización la afección es artritis, preferiblemente artritis reumatoide. En todavía otra realización la afección es soriasis.
En aúna una realización adicional, el anticuerpo se administra en combinación con otro agente terapéutico para el tratamiento de una afección inflamatoria. Así el anticuerpo se puede administrar en combinación con otro agente terapéutico para el tratamiento de asma. En una realización el anticuerpo se administra con un corticosteroide, preferiblemente diproprionato beclometsona (BDP). En otra realización el anticuerpo se administra con un anticuerpo anti-IgE, tal como rhuMAb-E25 o rhuMAb-E26. Para el tratamiento de artritis reumatoide, el anticuerpo se puede administrar en combinación con un anticuerpo anti-TNF o un anticuerpo o inmunoadhesina unida específicamente al receptor TNF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano quimérico, humanizado o humano capaz de unir hNGF con una afinidad en el rango nanomolar e inhibir la unión de hNGF al TrkA humano in vivo, en donde el anticuerpo no tiene efectos adversos significativos en el sistema inmune de un paciente, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo en la composición farmacéutica puede ser un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, molécula de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
En una realización el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico puede ser capaz de unión específica a IgE humano natural o TNF humano natural o un receptor TNF humano natural
En otra realización la composición farmacéutica comprende adicionalmente otro ingrediente farmacéuticamente activo, tal como un ingrediente adecuado para el tratamiento de una afección inflamatoria. La afección inflamatoria es preferiblemente una seleccionada del grupo que consiste de asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis. En una realización la afección inflamatoria es asma. En otra realización la afección inflamatoria es artritis, preferiblemente artritis reumatoide. En todavía otra realización la afección inflamatoria es soriasis.
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En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un artículo de fabricación que comprende un contenedor, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano quimérico, humanizado
o humano capaz de unir hNGF con una afinidad en el rango nanomolar e inhibir la unión de hNGF al TrkA humano in vivo, en donde el anticuerpo no tiene efectos adversos significativos en el sistema inmune de un paciente, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, e instrucciones para utilizar la composición de la materia objeto para controlar un trastorno relacionado con NGF en un paciente humano, como se define en las reivindicaciones.
En una realización el artículo de fabricación comprende un ingrediente farmacéuticamente activo adicional, preferiblemente adecuado para el tratamiento de una afección inflamatoria. La afección inflamatoria preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 resume la capacidad de seis MAb anti-NGF para unirse a los mutantes quiméricos NGF/NT-3. La unión relativa de cada MAb a los mutantes NGF/NT3 se compara con la unión de hNGF tipo natural: (-), <10%; (+), 10-30 %; (++), 30-60 %; (+++), 60-100 %. El EC50 de cada MAb para unión a hNGF es: MAb 908,1.8 x 10-10 M; MAb 911,
3.7 x 10-10 M; MAb 912, 1.8 x 10-10 M; MAb 938, 7.4 x 10-10 M; MAb 14.14, 5.9 x 10-10 M.
La Figura 2A-F muestra la unión de los MAb al hNGF mutante y tipo natural. Los valores EC50 promedio para cada mutante obtenido en 2 a 5 series ELISA independientes se comparan con los valores EC50 obtenidos para la unión NGF tipo natural. Se determinan los valores EC50 mediante análisis de regresión lineal (no ponderado) utilizando el programa de software Kaleidagraph (Software Abelbeck). Los mutantes que resultan en por lo menos una reducción de dos veces en la unión MAb se designan por barras rayadas, y se marcan los residuos que contribuyen.
La Figura 2A muestra la unión de MAb 908 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 2B muestra la unión de MAb 909 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 2C muestra la unión de MAb 911 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 2D muestra la unión de MAb 912 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 2E muestra la unión de MAb 938 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 2F muestra la unión de MAb 14.14 al NGF mutante o tipo natural.
La Figura 3A-F presenta modelos moleculares de los epítopos MAb en NGF para los MAb anti-NGF 908, 909, 911, 912, 938 y 14.14, respectivamente. Las designaciones gris medio y gris claro diferencian cada monómero de NGF, y los residuos identificados mediante ELISA que afectan la unión de MAb se muestran en negro. Cada una de las regiones variables se marca en la Figura 3A.
La Figura 4A y B muestra análisis de inmunotransferencia de la unión MAb anti- NGF al hNGF no reducido (A) y hNGF reducido (B). Los marcadores de peso molecular son visibles en la primera línea. El regulador y un anticuerpo de control negativo se muestran en las líneas 2 y 3, respectivamente. Bajo condiciones de no reducción, el hNGF purificado corre como un conjunto triple de bandas, que parece corresponden al hNGF monomérico, dimérico y parcialmente procesado.
La Figura 5 resume los resultados de mapeo del epítopo MAb.
La Figura 6 muestra que los MAb anti-NGF inhiben la unión de hNGF a una inmunoadhesina del receptor TrkA-IgG.
La Figura 7 muestra la capacidad de los MAb anti-NGF para inhibir la unión de hNGF a una inmunoadhesina p75-IgG.
La Figura 8 muestra la capacidad de los MAb anti-NGF para inhibir la unión de hNGF al dominio extracelular TrkA expresado en células CHO transfectadas. Se mide la fosforilación de la tirosina mediante ELISA utilizando un MAb antifosfotirosina.
La Figura 9 muestra la capacidad de los MAb anti-NGF para inhibir los efectos de supervivencia de hNGF en neuronas de ganglio de raíz dorsal embrionaria de rata. La supervivencia máxima se basa en la señal obtenida solo con NGF, y la inhibición máxima determinada mediante la señal obtenida con la adición de concentraciones de saturación de TrkAIgG soluble.
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La Figura 10 demuestra que el tratamiento con MAb anti- NGF 911 no aumenta significativamente la respuesta inmune a ovalbúmina.
La Figura 11 muestra que luego de inmunización con gama-globulina de pollo, el tratamiento con MAb anti-NGF 911 no reduce significativamente la respuesta inmune.
La Figura 12 muestra que el tratamiento con MAb anti-NGF 911 bloquea el NGF que induce hiperalgesia térmica.
La Figura 13 muestra que en ratones C57/BL6 sensibilizados (SN), el tratamiento con MAb 911 anti-NGF inhibe la hiperreactividad de las vías respiratorias luego de la inoculación con antígeno de ácaro de polvo inhalado.
La Figura 14 muestra que en ratones C57/BL6 sensibilizados (SN), el tratamiento con MAb anti-NGF reduce la infiltración de glóbulos blancos, linfocitos y eosinófilos en BAL luego de inoculación con antígeno de ácaro de polvo inhalado.
La Figura 15 muestra que aunque la infiltración celular en BAL se reduce en MAb anti-NGF de ratones sensibilizados tratados, la proporción de eosinófilos permanece alta.
La Figura 16 muestra que el tratamiento con MAb 911 anti-NGF atenúa el incremento de IL-13 en BAL luego de exposición al antígeno.
La Figura 17 demuestra que a pesar de su capacidad para reducir la respuesta inflamatoria al alérgeno, el tratamiento con MAb anti-NGF no reduce la respuesta inmune humoral cuando se mide con título de inmunoglobulina de suero total en ácaros de polvo.
La Figura 18 muestra que el tratamiento con MAb anti-NGF tampoco reduce el nivel de suero total de IgE.
La Figura 19 muestra que el tratamiento con NGF aumenta los niveles de CGRP en el ganglio trigeminal, mientras que el tratamiento con MAb anti-NGF produce una reducción en los niveles de CGRP.
Descripción Detallada de la Realización Preferida
A. Definiciones
A menos que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado como lo entiende comúnmente por una persona medianamente versada en la técnica a la que pertenece esta invención. Ver, por ejemplo Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed, J. Wiley &amp; Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, que se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no está en forma limitada por los métodos y materiales descritos. Para los propósitos de la presente invención, se definen adelante los siguientes términos.
Como se utiliza aquí, los términos &quot;Factor de Crecimiento Nervioso&quot; y &quot;NGF&quot; se definen como todas las especies de mamífero de la secuencia NGF natural, que incluye humano.
&quot;Receptor NGF&quot; se refiere a un polipéptido que se une por o se activa por NGF. Los receptores NGF incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, que incluye humanos.
El término &quot;secuencia natural&quot; en relación con NGF o cualquier otro polipéptido se refiere a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como un polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza, independiente de su modo de preparación. Tal secuencia de polipéptido natural se puede aislar de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes y/o sintéticos o cualesquier combinaciones de los mismos. El término &quot;secuencia natural&quot; abarca específicamente formas secretadas o truncadas que ocurren en la naturaleza (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que ocurren en la naturaleza (por ejemplo, formas alternativamente divididas) y variantes alélicas que ocurren en la naturaleza de los polipéptidos de longitud completa.
&quot;Anticuerpos&quot; (Abs) y &quot;inmunoglobulinas&quot; (Igs) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen anticuerpos y otras moléculas similares a anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo, por ejemplo, se producen en bajos niveles por el sistema linfático y en niveles aumentados mediante mielomas.
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&quot;Anticuerpos e inmunoglobulinas naturales&quot; son usualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena ligera y pesada también se separa regularmente intracadena en puentes disulfuro. Cada cadena pesada tiene un extremo de dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena pesada y ligera (Chothia et al. J. Mol. Biol. 186: 651 [1985]; Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 [1985]; Chothia et al., Nature 342: 877-883 [1989]).
El término &quot;variable&quot; se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Esto se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o las regiones hipervariables en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la estructura principal (FR). Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada natural cada una comprende cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina �, conectada por tres CDR, que forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina �. Los CDR en cada cadena se mantienen juntos en proximidad cercana por las regiones FR y, con los CDR de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al. (1991) supra). Los dominios constantes no se involucran directamente en la unión de anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos &quot;Fab&quot;, cada uno con un sitio de unión a antígeno único, y un fragmento residual &quot;Fc&quot;, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y es aún capaz de entrecruzar el antígeno.
&quot;Fv&quot; es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y de reconocimiento de antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en asociación no covalente estrecha. En una especie Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena libera y de cadena pesada se pude ligar covalentemente mediante un ligador de péptido flexible de tal manera que las cadenas ligera y pesada se pueden asociar en una estructura &quot;dimérica&quot; a aquella en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, los seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno para el anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque en una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab mediante la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxi del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El Fab’- SH es la designación aquí para Fab’ en la que los residuos cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab’)2 de anticuerpo originalmente se producen como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo.
Las &quot;cadenas ligeras&quot; de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especies vertebradas se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados K y A, con base en las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, E, y, y 1 respectivamente. Son bien conocidas estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
El término &quot;anticuerpo&quot; cubre específicamente anticuerpos monoclonales, que incluyen clones de fragmento de anticuerpo.
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&quot;Fragmentos de anticuerpo&quot; comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de manera general la región variable
o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, que incluyen moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); y anticuerpos multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos, formados de fragmentos de anticuerpo.
El término &quot;anticuerpo monoclonal &quot; como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones que ocurren posiblemente en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un único sitio antigénico. Adicionalmente, en contraste a preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonal) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que ellos se sintetizan mediante el cultivo de hibridoma, y no se contaminan mediante otras inmunoglobulinas. El modificador &quot;monoclonal&quot; indica el carácter del anticuerpo cuando se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se constituye como la producción requerida del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden hacer mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se puede hacer mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,816,567). Los &quot;anticuerpos monoclonales&quot; también incluyen clones de reconocimiento de antígeno y de sitio de unión que contienen fragmentos de anticuerpo (clones Fv) aislados de colecciones de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales incluyen aquí específicamente anticuerpos &quot;quiméricos&quot; (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico a o homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, mientras estos exhiben actividad biológica deseada (Patente Estadounidense No. 4,816,567 a Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).
Las formas &quot;humanizadas&quot; de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulina (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan mediante residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura principal Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender los residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de estructura principal o CDR importado. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar adicionalmente y optimizar el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); y Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized™ en donde la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido al inmunizar monos macacos con el antígeno de interés.
Los fragmentos de anticuerpo &quot;Fv de cadena sencilla&quot; o &quot;scFv&quot; comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. De manera general, el polipéptido scFv comprende adicionalmente un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL, que le permite al scFv formar la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv ver Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Dall’Acqua and Carter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 443-450 (1998), y Hudson, Curr. Opin. Immunol 11: 548-557 (1999).
El término &quot;diacuerpos&quot; se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL). Al utilizar un ligador que es muy corto permite la formación de pares entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios
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complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos más completamente a, por ejemplo, EP 404,097; W0 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:64446448 (1993).
Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso del anticuerpo cuando se determina mediante el método Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de terminal N o la secuencia de aminoácidos interna mediante el uso de un secuenciador de copa de giro, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción
o de no reducción utilizando azul Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, por lo general, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
&quot;Neutralizar el anticuerpo&quot; significa una molécula de anticuerpo que es capaz de bloquear o reducir significativamente una función efectora de un antígeno objetivo al que éste se une. De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo anti-NGF &quot;neutralizante&quot; es capaz de bloquear o reducir significativamente una función efectora, tal como unión al receptor y/o provocación de una respuesta celular, de NGF. Reducción &quot;significativa&quot; significa por lo menos aproximadamente 60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 70%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%; todavía más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de reducción de una función efectora del antígeno objetivo (por ejemplo NGF).
Un anticuerpo es capaz de &quot;inhibir la unión&quot; de un ligando a un receptor cuando es capaz de producir una reducción medible objetivamente en la capacidad del ligando para unir al receptor.
El término &quot;epítopo&quot; se utiliza para referirse a sitios de unión para anticuerpos (monoclonal o policlonal) en antígenos de proteína.
Los anticuerpos que se unen a un epítopo particular se pueden identificar por &quot;mapeo de epítopo.&quot; Existen muchos métodos conocidos en la técnica para mapear y caracterizar la ubicación de los epítopos en las proteínas, que incluyen resolver la estructura de cristal de un complejo de anticuerpo-antígeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmento de gen, y ensayos basados en péptido sintético, como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Se discuten adelante ensayos de competición. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmento de gen, la estructura de lectura abierta que codifica la proteína se fragmenta aleatoriamente
o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de la proteína con el anticuerpo que se va a aprobar. Los fragmentos de gen, por ejemplo, se pueden producir mediante PCR y luego se transcriben y se traducen dentro de la proteína in vitro, en la presencia de aminoácidos radioactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos de proteína marcados radioactivamente luego se determina mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También se pueden identificar ciertos epítopos al utilizar grandes colecciones de secuencias de péptidos aleatorias que se exhiben sobre la superficie de las partículas de fago (colecciones de fago). Alternativamente, se puede probar una colección definida de fragmentos de péptido sobrepuestos para unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simple. El último método es adecuado para definir epítopos lineales de aproximadamente 5 a 15 aminoácidos.
Un anticuerpo une &quot;esencialmente el mismo epítopo&quot; como un anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o estéricamente sobrepuestos. Los métodos rápidos y más ampliamente utilizados para determinar si dos epítopos se unen a epítopos estéricamente sobrepuestos o idénticos son ensayos de competición, que se pueden configurar en todo número de formatos diferentes, utilizando antígeno marcado o anticuerpo marcado. Usualmente, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pozos, y la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados se mide utilizando marcas radioactivas o de enzimas.
El término aminoácido o residuo de aminoácido, como se utiliza aquí, se refiere a aminoácidos L que ocurren en la naturaleza o a aminoácidos D como se describe adicionalmente adelante con respecto a variantes. Se utilizan aquí las abreviaturas de una y tres letras comúnmente utilizadas para los aminoácidos (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3d ed. 1994)).
Las &quot;variantes&quot; son anticuerpos que difieren en algún aspecto de los anticuerpos naturales mientras que retiene la misma actividad biológica. Las variantes pueden tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del anticuerpo natural como resultado de una inserción, eliminación, modificación y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia natural. Las variantes pueden tener un patrón de glucosilación diferente de
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anticuerpos naturales. Adicionalmente, las variantes pueden ser anticuerpos naturales que se han modificado covalentemente.
Un &quot;trastorno&quot; es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento de acuerdo con la presente invención. &quot;Trastorno&quot; y &quot;afección&quot; se utilizan intercambiablemente aquí e incluyen trastornos o enfermedades crónicas y agudas, que incluye aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos que no limitan los trastornos que se van a tratar aquí incluyen lupus eritematoso, dermatitis por contacto, eczema, herpes, neuralgia postherpética, hiperalgesia, dolor crónico, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Crohn, colitis, cistitis de la vejiga, esclerosis múltiple, asma, soriasis, y artritis, que incluye artritis crónica y artritis reumatoide. Un trastorno preferido que se va a tratar de acuerdo con la presente invención es una afección inflamatoria, tal como asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis.
Una &quot;afección inflamatoria&quot; es una afección caracterizada por uno o más de dolor, calor, enrojecimiento, inflamación y pérdida de la función, y se asocia con lesión de tejido, infección, irritación o daño.
El término &quot;estado de la enfermedad&quot; se refiere a un estado fisiológico de una célula o de un mamífero completo en el que ha ocurrido una introducción, cesación, o trastorno de sistemas de funciones corporales o celulares, u órganos.
El término &quot;cantidad efectiva&quot; o &quot;cantidad terapéuticamente efectiva&quot; se refiere a una cantidad de un fármaco efectivo para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o afección fisiológica inesperada en un mamífero. En la presente invención, una &quot;cantidad efectiva&quot; de un anticuerpo anti-NGF puede evitar, reducir, disminuir o retrasar el inicio de un trastorno tal como lupus, esclerosis múltiple, asma, soriasis o artritis; reducir, prevenir o inhibir (es decir, disminuir en algún grado y preferiblemente detener) el desarrollo de un trastorno tal como lupus, esclerosis múltiple, asma, soriasis o artritis; y/o aliviar, en algún grado, uno o más de los síntomas asociados con tal trastorno.
En los métodos de la presente invención, el término &quot;control&quot; y variantes gramaticales del mismo, se utilizan para referirse a la prevención, inhibición parcial o completa, reducción, retraso o disminución de un evento inesperado, por ejemplo afección fisiológica, tal como la respuesta inflamatoria asociada con un trastorno tal como asma.
&quot;Tratamiento&quot; o &quot;tratar&quot; se refieren al tratamiento terapéutico y las medidas preventivas o profilácticas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como también aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se ha evitado el trastorno. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos o beneficiosos deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o disminución de la progresión de la enfermedad, alivio o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (si es parcial o total), si es detectable o indetectable. &quot;Tratamiento&quot; también puede significar prolongar la supervivencia cuando se compara con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la afección o trastorno así como también aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se ha evitado la afección o trastorno.
Un &quot;efecto adverso significativo&quot; en el sistema inmune es un efecto que compromete el sistema inmune y/o inhibe una respuesta inmune normal a la exposición al antígeno. Un ejemplo de un efecto adverso significativo en el sistema inmune sería una respuesta inmune humoral reducida.
Portadores, excipientes o estabilizantes &quot;farmacéuticamente aceptables&quot; son aquellos que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a ellos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente, el portador fisiológicamente aceptable es una solución regulada de pH acuoso. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen reguladores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) polipéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como povidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS.
Una &quot;liposoma&quot; es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que son útiles para el suministro a un fármaco (tal como los anticuerpos anti- NGF descritos aquí y, opcionalmente, un quimioagente terapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar a la disposición de lípido de las membranas biológicas.
El término &quot;inserto de empaque&quot; se utiliza para referirse a instrucciones incluidas habitualmente en empaques comerciales de los productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias que se relacionan con el uso de tales productos terapéuticos.
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&quot;Mamífero&quot; para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye humanos, animales de granja y domésticos, y de zoológico, de deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.
B. Métodos para llevar a cabo la invención
Como se describe en más detalle adelante, la administración del anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 en un modelo de ratón de asma que reduce las medidas de hiperreactividad de las vías respiratorias e inflamación pero no reduce la respuesta inmune humoral al antígeno inhalado cuando se mide por los niveles de inmunoglobulina de suero total y el nivel de suero de IgE.
Se conocen en la técnica anticuerpos anti-NGF. Los anticuerpos anti-NGF útiles en la presente invención incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, y fragmentos de anticuerpo, así como también anticuerpos modificados, que incluyen variantes de glucosilación de anticuerpos, las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y los anticuerpos covalentemente modificados. Los anticuerpos se pueden hacer mediante cualquier método conocido en la técnica.
Así, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer utilizando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o mediante métodos de ADN recombinante (Patente Estadounidense No. 4,816,567).
En resumen, en el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza para provocar linfocitos que se producen o son capaces de producir los anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos in vitro. Los linfocitos que se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59103, [Academic Press, 1986]). Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de transferasa fosforibosil guanina hipoxantina de enzima (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes de HGPRT. Las estirpes celulares de mieloma preferidas son estirpes de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOP-21 y MC.-11 disponibles de the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. El mieloma humano y las estirpes celulares de heteromieloma de ratónhumano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibodie Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, [1987]). El medio de cultivo en el que células de hibridoma que se hacen crecer se evalúa para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, se puede determinar por the Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, las células se pueden subclonar al limitar los procedimientos de dilución y se hacen crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
La producción recombinante de los anticuerpos requiere el aislamiento de ADN que codifica el anticuerpo o las cadenas de anticuerpo. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unir específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar dentro de vectores de expresión, que luego se transfectan en células anfitrionas tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra forma la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias de murino homólogas, Morrison, at al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido sin inmunoglobulina. De esta forma, se preparan anticuerpos &quot;quiméricos&quot; o &quot;híbridos&quot; que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-NGF aquí.
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Típicamente los polipéptidos sin inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que se combina con antígeno tiene especificidad para el polipéptido NGF natural y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un objetivo diferente, tal como un receptor IgE de alta afinidad, o un receptor TNF. Los anticuerpos híbridos o quiméricos también se pueden preparar in vitro utilizando los métodos conocidos en la química de la proteína sintética, que incluyen aquellos que involucran agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.
Se pueden humanizar los anticuerpos no humanos, tales como anticuerpos de murino. De manera general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en este de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos &quot;importados&quot;, que se toman típicamente de un dominio variable &quot;importado&quot;. La humanización se realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir los CDR de roedores o las secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano.
Es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y parentales. Los modelos de inmunoglobulina tridimensional están disponibles comúnmente y son familiares a aquellos expertos en la técnica. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y exhiben las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del papel similar de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para la unión a su antígeno. En esta forma, se pueden seleccionar residuos FR y combinar la secuencia consensus y de importación ya que la característica del anticuerpo deseada, tal como se logra afinidad incrementada para el antígeno objetivo. En general, los residuos CDR se involucran directamente y más sustancialmente en la unión influenciada por antígeno. Para detalles adicionales, ver patente Estadounidense No. 5,821,337.
La invención también incluye anticuerpos anti-NGF humanos. Como se notó anteriormente, se pueden hacer tales anticuerpos humanos mediante el método de hibridoma, utilizando mieloma humana o estirpes celulares de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (ver, por ejemplo Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), y Brodeur, et al., Monoclonal Antibodie Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)). Adicionalmente, es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, luego de inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homozigota del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición de gen de inmunoglobulina línea germinal humana en tales ratones mutantes línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos luego de la exposición al antígeno. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993). Para una versión mejorada de esta tecnología, ver también Mendez et al. (Nature Genetics 15: 146-156 (1997)).
Alternativamente, la tecnología de exhibición de fago (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de los repertorios de gen de dominio de inmunoglobulina variable (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio de anticuerpo V se clonan en marco en un gen de proteína recubierta mayor o menos de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se exhibe como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de única hebra del genoma de fago, las selecciones con base en las propiedades funcionales del anticuerpo también resulta en la selección del gen que codifica el anticuerpo exhibe aquellas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de célula B. Se puede realizar exhibición de fago en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden utilizar diversas fuentes de segmentos de gen V para exhibición de fago. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aísla una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolono de una colección combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados se puede construir y los anticuerpos en una disposición diversa de antígenos (que incluyen autoantígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffiths et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones en un alto índice (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán mayor afinidad, y las células B que exhiben inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican preferiblemente y se diferencian durante exposición de antígeno posterior. Este proceso natural se puede imitar al emplear la técnica conocida como &quot;mezcla
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de cadena&quot; (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos &quot;primarios&quot; obtenidos mediante exhibición de fago se puede mejorar al reemplazar secuencialmente los genes de la región V de cadena ligera y pesada con repertorios de variantes que ocurren en la naturaleza (repertorios) de los genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades en el rango de nM. Se ha descrito una estrategia para elaborara repertorios de anticuerpo de fago muy grandes (también conocidos como &quot;la madre de todas las colecciones&quot;) por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993), y el aislamiento del anticuerpo humano de alta afinidad directamente de tal colección de fago grande se reporta por Griffiths et al., EMBO J. 13: 3245-3260 (1994).
También se puede utilizar Mezcla génica para derivar los anticuerpos humanos de anticuerpos de roedores, en donde el anticuerpo humano tiene afinidades similares y especificidades para el anticuerpo de partida de roedor. De acuerdo con este método, que también se denomina como &quot;impresión de epítopo&quot;, el gen de dominio V de cadena ligera o pesada de anticuerpos de roedores obtenidos mediante la técnica de exhibición de fago se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humano, creando quimeras de roedor-humano. La selección en antígeno resulta en el aislamiento de variables de dominio humano capaces de restablecer un sitio de unión a antígeno funcional, es decir la elección del patrón de los gobiernos de epítopo (impresiones). Cuando se repite el proceso con el fin de reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver solicitud de patente PCT W0 93/06213, publicada el 1 de Abril 1993). A menos que la humanización tradicional de los anticuerpos de roedor mediante injerto CDR, esta técnica proporcionar anticuerpos completamente humanos, que no tienen la estructura principal o los residuos CDR de origen de roedor.
La presente invención incluye específicamente anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera y de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). De acuerdo con un método diferente y más preferido, las variables de dominio de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se inserta dentro de vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo anfitrión adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan producciones óptimas. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales resulta en altos rendimientos o cuando las relaciones no son de significancia particular. Para detalles adicionales de generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para objetivar células del sistema inmune a células inesperadas (Patente Estadounidense No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por VIH (publicación de solicitud PCT Nos. WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando cualesquier métodos de entrecruzamiento. Se conocen bien en la técnica los agentes de entrecruzamiento adecuados, y se describen en la Patente Estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas entrecruzadas.
Los fragmentos de anticuerpo se han derivado tradicionalmente por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Métodos 24: 107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células anfitrionas recombinantes. Por ejemplo, se pueden recuperar directamente los fragmentos Fab’-SH de E. coli y se acoplan químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab’)2 se forma utilizando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamble de la molécula F(ab’)2. De acuerdo con otro método, se pueden aislar fragmentos Fv, Fab o F(ab’)2 directamente de cultivo de célula anfitriona recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto.
Puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su vida útil del suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de recuperación dentro del fragmento de anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o al incorporar el epítopo dentro de una etiqueta de péptido que luego se fusiona al fragmento de anticuerpo al extremo o en la mitad, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptido). Ver la WO 96/32478 publicada en Octubre 17, 1996.
El epítopo de unión al receptor de recuperación de manera general constituye una región en donde uno o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles del dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de
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anticuerpo. Aún más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Aún más preferido, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de un IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3, o VH, o más de una tal región, del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o la región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.
Las variantes de la secuencia de aminoácido, que incluyen variantes de sustitución, inserción y/o eliminación, de los anticuerpos anti- NGF descritos específicamente se preparan al introducir cambios de nucleótido apropiados en el ADN codificado, o mediante síntesis de péptido. Los métodos para elaborar tales variantes son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, &quot;mutagenia de barrido de alanina,&quot; como se describe por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Un tipo particular de variante de aminoácido de un anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Alterar significa la eliminación de una o más unidades estructurales de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo.
Detección de anticuerpos con las propiedades deseadas
Los anticuerpos útiles son aquellos que neutralizan la actividad de NGF. Así, por ejemplo, los anticuerpos anti- NGF neutralizantes de la presente invención se pueden identificar al incubar un anticuerpo candidato con NGF y supervisar la unión y neutralización de una actividad biológica de NGF. El ensayo de unión se puede realizar con polipéptidos NGF purificados, o con células que se expresan de forma natural, o se transfectan para expresar, los polipéptidos NGF. En una realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitivo, en donde se evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo anti-NGF conocido para la unión de NGF. El ensayo se puede realizar en diversos formatos, que incluyen el formato ELISA.
La capacidad de un anticuerpo candidato para neutralizar la actividad biológica de NGF, por ejemplo, se puede llevar a cabo al supervisar la capacidad del anticuerpo candidato para inhibir el NGF que media la supervivencia en el bioensayo de supervivencia de ganglio de raíz dorsal embrionaria de rata como se describe en Hongo et al. (Hybridoma 19:215-227 (2000)).
Para detectar los anticuerpos que se unen a un epítopo en el NGF unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, o adicionalmente, se puede realizar mapeo de epítopo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar el epítopo NGF unido por un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante análisis de unión competitiva como se describe en Fendly et al. Cancer Research 50:1550 -1558 (1990). Se pueden hacer estudios de bloqueo cruzado mediante fluorescencia directa en células intactas utilizando la Máquina de Detección PANDEX™ para cuantificar la fluorescencia. En este método el anticuerpo monoclonal se conjuga con isotiocianato fluoresceína (FITC), utilizando procedimientos establecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Las células que expresan NGF en suspensión y anticuerpos monoclonales purificados se agregan a los pozos de placa PANDEX™ y se incuban, y se cuantifica la fluorescencia mediante PANDEX™. Se considera que los anticuerpos monoclonales para compartir un epítopo si cada uno bloquea la unión del otro en 50% o más en comparación con un control de anticuerpo monoclonal irrelevante.
Los anticuerpos anti-NGF útiles en la presente invención también se pueden identificar utilizando colecciones combinatorias para detectar los clones de anticuerpo sintético con la actividad o actividades deseadas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. En resumen, se seleccionan clones de anticuerpo sintético al detectar colecciones de fago que contienen el fago que exhibe diversos fragmentos (por ejemplo Fab, F(ab’)-, etc. ...) de la región de anticuerpo variable (Fv) fusionado a proteínas de cubrimiento de fago. Tales colecciones de fago se filtraron mediante cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los fragmentos Fv que expresan los clones capaces de unir al antígeno deseado se adsorben en el antígeno y así se separa de los clones sin unión en la colección. Los clones de unión luego se eluyen del antígeno y se pueden enriquecer adicionalmente mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígeno. Los anticuerpos anti-NGF adecuados para uso en la presente invención se pueden obtener al designar un procedimiento de detección de antígeno adecuado para seleccionar el clon de fago de interés, seguido por construcción de un clon de anticuerpo anti-NGF de longitud completa al utilizar las secuencias Fv del clon de fago de interés y una secuencia de región constante (Fc) adecuada.
Los resultados obtenidos en los ensayos biológicos basados en célula se puede realizar al probar en modelos de animal, por ejemplo murino, y ensayos clínicos humanos. Si se desea, los anticuerpos monoclonales de murino identificados por tener las propiedades deseadas se pueden convertir en anticuerpos quiméricos, o humanizados mediante técnicas bien conocidas en el arte, que incluye la estrategia de &quot;mutagenia de conversión de gen&quot;, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,821,337.
C. Formulaciones Farmacéuticas
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Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo utilizado de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,
A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos como receptores en las dosificaciones y concentraciones empleados, y puede comprender reguladores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro octadecildimetilbencil amonio; cloruro hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro benzetonio; fenol, alcohol butilo o bencilo; parabenos alquilo tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) polipéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como povidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina,
o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de proteína Zn); y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN , PLURONICS o polietilenglicol (PEG).
Los anticuerpos anti-NGF neutralizantes útiles en los métodos de la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y Patente Estadounidense Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente Estadounidense No. 5,013,556.
Particularmente se pueden generar liposomas útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con las liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina) está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19):1484 (1989).
Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilacturos (Patente Estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilenovinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
La formulación aquí también puede contener más de un compuesto activo cuando sea necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferiblemente compuestos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se unen a un epítopo diferente de NGF o a un receptor NGF en una formulación. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender adicional otro compuesto biológicamente activo, tal como un agente antiinflamatorio. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
Las formulaciones que se van a utilizar para administración in vivo pueden ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las composiciones de anticuerpo anti-NGF terapéuticas se colocan de manera general en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco que tiene un tapón que se puede perforar mediante una aguja de inyección hipodérmica.
D. Tratamiento con anticuerpos anti-NGF
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Se contempla que, de acuerdo con la presente invención, el anti-NGF como se define en los anticuerpos reivindicados para tratar dolor crónico como se define en las reivindicaciones. Se pueden utilizar anticuerpos anti-NGF para evitar el inicio del estado de enfermedad activo, para tratar síntomas que se experimentan actualmente y para tratar la enfermedad subyacente.
A pesar de los avances en el entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares que controlan las respuestas alérgicas y mejoran las terapias, la incidencia de enfermedades alérgicas, especialmente asma, se ha aumentado dramáticamente en años recientes (Beasley et al., J. Allergy Clin. Immunol 105: 466-472 (2000); Peat and Li, J. Allergy Clin. Immunol. 103:1-10 (1999)). Se pueden tratar enfermedades alérgicas, por ejemplo, mediante vacunación basada en alérgeno, en la que las dosis aumentadas de alérgeno se dan mediante inyección durante años. El asma leve se puede controlar usualmente en la mayoría de pacientes mediante dosis relativamente bajas de corticosteroides inhalados, mientras que el asma moderada usualmente se maneja mediante la administración tradicional de antagonistas de larga duración inhalados o inhibidores leucotrieno. Sin embargo, el tratamiento de asma severa es aún un problema médico grave. Aunque un anticuerpo anti-IgE espera actualmente la aprobación de la FDA (rhuMAb-E25, Xolair™, desarrollado en colaboración de Genentech, Inc., Tanox, Inc. y Novartis Pharmaceuticals Corporation) muestra los resultados promisorios para la intervención temprana en el tratamiento de afecciones que conducen a síntomas de asma alérgica y rinitis alérgica primaveral, que se necesita para el desarrollo de estrategias terapéuticas adicionales y agentes para controlar enfermedades alérgicas, tales como asma.
Los anticuerpos anti-NGF también son útiles en el manejo de otras afecciones inflamatorias, tales como esclerosis múltiple, colitis, enfermedad de intestino inflamado, cistitis de vejiga, eczema, dermatitis por contacto, artritis, que incluye artritis crónica y artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, y soriasis.
Adicionalmente, los anticuerpos anti-NGF también son útiles en el tratamiento de otras enfermedades que se pueden asociar con niveles aumentados de NGF que incluye, por ejemplo, lupus eritematoso, herpes, neuralgia post-herpética, hiperalgesia, y dolor crónico.
Los anticuerpos anti-NGF se administran a un mamífero, preferiblemente a un paciente humano, de acuerdo con los métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo, mediante las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, o tópica. El anticuerpo anti-NGF también se puede administrar mediante inhalación. Son útiles para administración los nebulizadores comercialmente disponibles para las formulaciones líquidas, incluyen nebulizadores de chorro y nebulizadores ultrasónicos. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo anti-NGF se puede aerosolizar utilizando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis calibrado, o inhalado como un polvo liofilizado y molido. Para el tratamiento de asma y otras afecciones caracterizadas por hiperreactividad de las vías respiratorias, una ruta preferida de administración es mediante inhalación.
Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración del anticuerpo anti-NGF. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva, en cualquier orden, en donde preferiblemente existe un periodo mientras que los agentes activos (o todos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Para el tratamiento de asma, puede ser particularmente ventajoso utilizar los anticuerpos aquí en combinación con anticuerpos anti-IgE, en particular rhuMAb- E25 (Xolair™), o con la molécula rhuMAb-E26 de anticuerpo de segunda generación (Genentech, Inc.). El anticuerpo rhuMAb-E25 es un anticuerpo monoclonal anti-IgE humanizado recombinante que se desarrolla para interferir temprano en el proceso alérgico. El uso de la combinación también incluye la posibilidad de administrar los dos anticuerpos en una formulación farmacéutica única, o utilizando un anticuerpo biespecífico, con especificidades anti-NGF y anti-IgE. En otra realización preferida, los anticuerpos anti-NGF aquí se administran en combinación con corticosteroides inhalados, tales como tratamiento con diproprionato de beclometasona (BDP). Para el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar en combinación con otros regímenes de tratamiento conocidos para el tratamiento de estas afecciones. Por ejemplo, los anticuerpos anti-NGF aquí se pueden administrar en combinación con Remicade® (Infliximab, Centocor), o Enbrel® (Etanercept, Wyeth-Ayerst). La presente invención también incluye anticuerpos biespecíficos dirigidos a estas enfermedades. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede incluir una especificidad anti-TNF combinada con la capacidad de unión a NGF de los anticuerpos allí.
Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente son aquellos utilizados actualmente y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo anti-NGF.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo anti-NGF dependerá del anticuerpo anti-NGF empleado, el tipo de enfermedad que se va a tratar, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico tratante. Típicamente el médico administrará el anticuerpo anti-NGF hasta que se alcanza una dosificación que logra el resultado deseado.
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El anticuerpo anti-NGF se administra en forma adecuada al paciente en un tiempo o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 2 mg/kg de anticuerpo es una dosificación de candidato inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante dosificación continua o repetida. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un régimen de dosificación preferido comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo anti- NGF. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de desgaste farmacocinético que el médico espera lograr. El progreso de esta terapia es supervisar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
E. Artículos de fabricación
En otra realización de la Invención, se proporciona un artículo de fabricación como se define en las reivindicaciones que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una marca o insertos de empaque en o asociados con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición que es afectiva para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón que se puede perforar mediante una aguja para inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-NGF. El contenedor puede comprender adicionalmente un segundo agente farmacéuticamente activo. Preferiblemente el segundo agente es adecuado para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria tal como asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis.
La marca o el inserto de empaque indican que se utiliza la composición para tratar la afección de elección, tal como una afección inflamatoria. En una realización, la marca o insertos de empaque indican que la composición que comprende el anticuerpo que une NGF se puede utilizar para tratar una afección inflamatoria seleccionada del grupo que consiste de asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis. Adicionalmente, la marca o inserto de empaque puede indicar que el paciente que se va a tratar es una que tiene asma, soriasis, artritis u otra enfermedad
o trastorno. Más aún, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer contenedor con una composición contenida allí, en donde la composición comprende un primer anticuerpo que une a NGF e inhibe su actividad biológica; y (b) un segundo contenedor con una composición contenida allí, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que une un receptor NGF y bloquea la activación del ligando. El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un inserto de empaque que indica que la primera y segunda composiciones se puede utilizar para tratar asma, soriasis, artritis u otra enfermedad o trastorno. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo (o tercero) contenedor que comprende un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Esto puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde el punto de vista comercial o de usuario, que incluye otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.
Los detalles adicionales de la Invención se ilustra en los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Los reactivos comercialmente disponibles que se refieren en los ejemplos se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique otra cosa. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a través de la especificación, mediante los números de acceso ATCC es el American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EJEMPLO 1
Producción y Caracterización de Anticuerpos monoclonales Anti-NGF
A. Producción de Anticuerpos monoclonales anti-NGF
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente el NGF humano (hNGF). Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son bien conocidas en el arte y se describen, por ejemplo, en Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Los experimentos descritos en los Ejemplos 1 y 2 se describen adicionalmente en Hongo et al., Hybridoma 19: 215-227.
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Un panel de 23 anticuerpos monoclonales de murino a hNGF se desarrolla mediante un método análogo a aquel descrito en Hongo et al., Hybridoma 14:253-260. En resumen, los ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) se inmunizan con NGF humano en adyuvante Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, M0). Los esplenocitos de ratón que demuestra el título mayor del anticuerpo al NGF inmovilizado se fusionan con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Rockville, MD). Después de 10-14 días, los sobrenadantes se cosechan y se detectan para la producción de anticuerpo mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Los clones muestran la mayor inmunorreactividad después de la segunda ronda de clonación se inyectan en ratones cebados Pristane (Hoogenraad et al, J. Immunol Métodos 6:317320 (1983)) para producción in vivo de MAb. Los fluidos ascíticos se agrupan y se purifican mediante cromatografía de afinidad (Pharmacia fast protein liquid chromatography; Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando un procedimiento establecido (Moks et al., Eur. J. Biochem. 85:1205-1210 (1986)) en la proteína A estafilococos (Pharmacia). Las preparaciones de anticuerpo purificadas se filtran estériles y se almacenan a 4° C en solución salina regulada con fosfato (PBS).
B. Mapeo de Epítopos Utilizando Mutantes de Intercambio de Dominio
La especificidad del epítopo de los MAb anti-NGF se determina inicialmente al evaluar la unión de los MAb a las proteínas de NGF quimérico/neurotrofina-3 (NT-3) generadas a través de la mutagenia de barrido homólogo. El uso de tales mutantes de intercambio de dominio tiene una ventaja distinta sobre los mutantes de eliminación. La eliminación de un dominio puede interrumpir la estructura secundaria de la proteína mientras que la sustitución de un dominio con un dominio correspondiente, de tamaño similar y secuencia de aminoácidos sustancialmente similar, de una proteína relacionada en los mutantes de intercambio de dominio probablemente retienen la estructura secundaria.
Se producen ocho mutantes quiméricos hNGF/hNT-3, que contienen tres a siete sustituciones de residuo de la secuencia NT- 3 humana (hNT-3) en las regiones variables correspondientes de hNGF (Figura 1) mediante mutagenia dirigida a oligonucleótido. Los mutantes quiméricos se expresan transitoriamente en células 293 de humano, y la unión de los MAb anti-hNGF al NGF mutante se evalúa mediante ensayo inmunonabsorbente ligado a enzima (ELISA), como se describe adelante, utilizando el MAb purificado como el anticuerpo de captura y un anticuerpo policlonal anti- hNGF de conejo purificado de afinidad conjugado con HRP para detección. La unión de los MAb antihNGF a cada mutante NGF se determina de dos a cuatro series ELISA cuantitativas independientes y se compara con la unión a NGF tipo natural.
En resumen, se cubren placas de microtítulo (Nunc Maxisorb, VWR Scientific, San Francisco, CA) con 100 µL por pozo de 1 µg/ml de IgG anti-ratón de cabra (Boehringer- Mannheim, Indianapolis, IN) durante la noche a 4° C, se lava, y el exceso de los sitios de unión z se bloquea con PBS que contiene 0.0596 Tween 20 con 0.596 de albúmina de suero bovino (BSA, lntergen, San Diego, CA; PBS/BSA/T20). Se agregan MAb (diluidos a 1 µg/ml en PBS/BSA/T20) a los pozos apropiados y se incuba durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan, y se agregan 100 µL de hNGF mutante o tipo natural (diluido en PBS/BSA/T20 a 60 ng/ml - 7.8 ng/ml), se incuban durante 1-2 horas a temperatura ambiente, y se lavan de nuevo. El anticuerpo policlonal anti-hNGF de conejo purificado conjugado con peroxidasa de rábano (HRP; 1:10,000 en PBS/BSA/T20) se agrega 100 µL pozo) y se incuba durante 1 hora. Las placas se desarrollan y se leen en longitud de onda dual. La unión de los MAba los mutantes hNGF se compara con la unión hNGF tipo natural (fijado en 100%) analizado bajo las mismas condiciones.
Se seleccionan seis anticuerpos monoclonales anti-NGF humanos (MAb 908, 909, 911, 912, 938 y 14.14) que demuestran altas afinidades para hNGF (EC50= 0.18 nM para MAb 908, 0.18 nM para MAb 909, 0.37 nM para MAb 911, 0.18 para MAb 912, 0.74 para MAb 938 y 0.59 para MAb 14.14) y un mayor de 60-90% de reducción en la unión a diversos mutantes quiméricos (Figura 1) para análisis adicional. Como se muestra en la Figura 1, tres de los MAb (908, 909 y 14.14) exhiben especificidad de unión regional clara, se caracteriza por la pérdida de 60-9596 de unión máxima a una única región variable (Figura 1). Los efectos menos dramáticos de los mutantes de región variable se observan para los MAb 911, 912 y 938, con múltiples regiones variables NGF que contribuyen a los epítopos de unión de estos anticuerpos. Sin embargo, las regiones variables que comprenden estos epítopos son cercanos dentro de la estructura tridimensional (Figura 3A).
C. Mapeo de Epítopo que Utiliza Mutagenia Dirigida a Sitio
Para definir adicionalmente la especificidad del epítopo de cada uno de los seis MAb anti-NGF seleccionados, se generan mutantes NGF que representan de punto de aminoácido únicas, dobles o triples, se expresan y se caracterizan, con un foco particular en los residuos dentro de las regiones previamente reportadas para cumplir una papel en la función biológica y de unión TrkA y p75 (Shih et al, J. Diol Chem., 269(44): 27679-27686 (1994)). Los efectos de las mutaciones en la unión de MAb anti-NGF se caracterizan por ELISA como se describió anteriormente. Se calculan los valores EC50 promedio para la unión de los MAb anti-NGF a cada mutante a partir de curvas de unión a ELISA y se compara con valores EC50 obtenidos para unión NGF tipo natural (Figura 2A-F).
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Con todos los seis MAb, la especificidad de unión de los mutantes de punto hNGF se correlacionan de manera general con las regiones previamente identificadas mediante la pérdida de unión a los mutantes quiméricos NGF específicos. Sin embargo, los efectos de las mutaciones de punto NGF en la unión de los MAb 911 y 938 son menos prominentes con relación a los efectos observados en los otros MAb (Figura 2A-F). La especificidad regional de los efectos mutacionales correlacionados con los residuos dentro o cerca a las regiones variables intercambiadas en los mutantes quiméricos NGF, y que resulta en la pérdida de más de 50-60 % de la unión máxima de los MAb 911 o
938. Para MAb 911, estas mutaciones incluyen K32A+K34A+E35A, Y79A+T81K, H84A+K88A, y R103A. Se observa pérdida adicional de unión con las mutaciones E11A, Y52A y L112A+S113A (Figura 2C). Esto indica que el epítopo para MAb 911 se extiende en cuatro de las siete regiones variables hNGF (Fig. 3C).
D. Dependencia Estructural de los Epítopos Para la Unión Mediante MAb
Para determinar si la unión de los MAb anti-NGF a hNGF depende de la conformación estructural de los epítopos en hNGF, se evalúa la unión de los MAb anti-NGF en las formas reducida y no reducida de hNGF. El hNGF, no tratado
o reducido mediante tratamiento con mercaptoetanol, se somete a electroforesis en gel y se transfieren a transferencias de nitrocelulosa para inmunotransferencia. Para la detección de hNGF, se lavan las transferencia de nitrocelulosa, se incuban con los anticuerpos primario y secundario, se exponen al sustrato luminol (Amersham International, Amersham, U.K.) durante 1 minuto a temperatura ambiente con agitación, y se exponen a película de rayos x (Eastman Kodak, Rochester, NY) durante 10-45 segundos. En la Figura 4 se puede ver que diversos anticuerpos monoclonales anti-NGF exhiben unión mínima a formas reducidas de hNGF. Estas incluyen MAb 938, 908, 911 y 912, que indica que los epítopos en hNGF a los que ellos se unen se afectan estructuralmente mediante alteración y reducción de la carga.
E.
Modelamiento molecular de epítopos en anticuerpos monoclonales anti-NGF
Las representaciones de modelamiento molecular de los epítopos MAb anti-NGF modificados (Figura 3A-F) se producen utilizando el programa MidasPlus (University of California at San Francisco, San Francisco, CA) y se basan en coordenadas de la estructura tridimensional de NGF de murino como se describió previamente (Mc- Donald et at., Nature, 354:411-414 (1991)).
Un resumen de los resultados de mapeo de epítopo MAb se presenta en la Figura 5.
EJEMPLO 2
Determinación de la Actividad Neutralizante de los Anticuerpos Monoclonales Anti-NGF
La observación que algunos epítopos mapean en las regiones previamente mostradas por ser significativas en la interacción de NGF con TrkA y/o p75 sugiere que los MAb correspondientes también pueden bloquear una o ambas de estas interacciones.
A. Ensayo de Unión 125I-hNGF.
Para evaluar la posibilidad que uno o más de los MAb anti-NGF puede bloquear la unión de NGF a TrkA y/o p75, la unión de 125I-hNGF al receptor inmunoadhesina TrkA-IgG se mide en la presencia de anticuerpos monoclonales anti-NGF.
En resumen, se prepara 125I-hNGF utilizando una modificación del método de lactoperoxidasa soluble originalmente descrito por Marchalonis (Marchalonis, Biochem J., 113:299-305 (1969)). La mezcla de reacción final se fracciona sobre una columna de exclusión por tamaño pD-10 Sefadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se almacena a 4°
C. Las placas de microtítulo (Nunc, Maxisorb) se recubren durante la noche a 4° C con IgG-Fc anti-huma no de conejo purificado específico de anticuerpo policlonal (diluido a 2 µg/ml en regulador de carbonato), se lava con PBS, y se bloquea con 150 µL de PBS/0.5% de BSA (PBS/BSA). Las inmunoadhesinas TrkA-IgG o p75-IgG humanas (amablemente proporcionado por Robert Pitti) (20 ng/mL) en PBS/BSA se agregan (100 µL) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. El hNGF diluido en PBS/BSA (150 pM final) luego se agrega (100 µL) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. El hNGF (150 pM final) se preincuba durante la noche a 4° C con anticuerpos monoclonales anti-NGF (667 nM - 0.58 nM) o un monoclonal anticuerpo irrelevante no dirigido a NGF se agrega en paralelo y se incuba como se describe. Las placas se lavan con PBS que contienen 0.05% de T20, y se cuentan los pozos individuales durante 1 minuto en un contador gama (Packard Cobra Modelo 5010, Downers Grove, IL).
Se puede ver de la Figura 6, los anticuerpos monoclonales anti-NGF inhiben la unión de hNGF al receptor inmunoadhesina TrkA.IgG cuando se mide por el nivel de hNGF marcado 125I unido a TrkA-IgG. Todos los MAb muestran capacidad de bloque en la concentración más alta ensayada (667 nM) pero muestra claramente diferente
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capacidad de bloqueo en concentraciones bajas. Los MAb 911, 912 y 938 exhiben la misma potencia de bloqueo (IC50 ~ 0.5-2 nM), con 80-90% de inhibición vista a 10nM MAb o más.
La capacidad de los MAb para inhibir la unión de hNGF al receptor p75 de baja afinidad se evalúa utilizando p75-IgG en el ensayo de unión descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 7, los MAb anti·hNGF inhiben la unión de hNGF a la inmunoadhesina de receptor p75-IgG utilizando hNGF marcado 125I. Los MAb 911, 912 y 938 muestran la actividad inhibidora mayor con 75-90% de reducción en la unión observada en la presencia de menos de 1 nM de MAb. El MAb 909 también muestra capacidad potente de bloqueo (> 90% de inhibición con 10 nM MAb), mientras que los MAb 908 y 14.14 son significativamente menos potentes (Figura 7).
B. Ensayo de activación de receptor inducido por quinasa (KIRA).
Se utiliza un ensayo de activación de receptor inducido por quinasa (KIRA) para medir la autofosforilación TrkA dependiente de NGF en células transfectadas en respuesta a estimulación con un ligando, tal como hNGF, y/o anticuerpos monoclonales agonistas (Sadick et al, Exp. Cell Res. 234: 354-361 (1997)). Los MAb anti-NGF se evalúan por su capacidad de inhibir la unión de hNGF al dominio extracelular TrkA expresado en células transfectadas CHO y la fosforilación posterior de los residuos tirosina en TrkA (Figura 8). La fosforilación de los residuos tirosina se mide mediante ELISA utilizando un MAb antifosfotirosina.
Se recubren placas de microtítulo (Costar, Cambridge, MA) con 1 X 105 células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan el dominio extra-celular del receptor TrkA con un fragmento D de glucoproteína del virus de herpes simplex (gD), un polipéptido de aminoácido 26 sirve como una etiqueta del epítopo. Las muestras de hNGF solo (150 pM) (como un control positivo) o hNGF (150 pM final) se preincuba durante la noche a 4° C con los MAb individuales anti-NGF (667nM - 0.31nM final) luego se agregan a los pozos que contienen las células CHO que expresan TrkA (50 µL por pozo) y se incuban a 37° C durante 25 minutos. Un anticuerpo monoclonal irrelevante que no está dirigido contra NGF se utiliza como un control negativo. Las células estimuladas por hNGF luego se tratan con regulador de lisis, y los lisados se procesan en placas de microtítulo recubiertas con gDMAb para la detección de ELISA de fosfotirosina que contiene TrkA similar al procedimiento descrito por Sadick et al (Sadick et al., Anal. Biochem., 235:207.214 (1996)). Se agrega 100 µl de 4G10 biotinilado (anti-fosfotirosina monoclonal de Upstate Biologicals, Inc. (UBI, Lake Placid, NY)) diluido a 0.2 mg/ml en regulador de dilución (PBS que contiene 0.5% de BSA, 0.05% de Tween 20, 5 mM de EDTA, y 0.01% de timerosol) a cada pozo. Después de incubación durante 2 horas a temperatura ambiente la placa se lava y se agrega a cada pozo 100 µl de estreptavidina conjugada con HRP (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) diluido 1:50000 en regulador de dilución. La placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación gentil. El conjugado de avidina libre se lava y se agrega a cada pozo 100 µl de solución de sustrato frescamente preparada (tetrametil benzidina, TMB, equipo de sustrato de dos componentes, Kirkegard y Perry, Gaitehersbug, MD). La reacción se deja proceder durante 10 minutos, después de lo cual se detiene el desarrollo del color mediante la adición de P 100 l/pozo de 1.0 M de H3PO4. La absorbancia a 450 nm se lee con una longitud de onda de referencia de 650 nm (A450/650), utilizando un lector de placa Vmax (Molecular Devices, Palo Alto, CA) controlado con un software Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) y DeltaSoft (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ).
Como se muestra en la Figura 8, todos los anticuerpos monoclonales anti-NGF seleccionados pueden inhibir la unión de hNGF al dominio extracelular TrkA expresado en células CHO transfectadas y la fosforilación de los residuos tirosina del receptor TrkA. La preincubación de hNGF con los MAb 911, 912 y 938 en la concentración más baja probada (0.3 nM) resulta en aproximadamente 60-80% de inhibición máxima de la fosforilación de tirosina con relación al MAb de control. Los MAb 908, 909 y 14.14 son menos potentes.
C. Bioensayo de supervivencia de ganglio de raíz dorsal embrionaria de rata.
Otro ensayo utilizado para determinar los efectos de los anticuerpos monoclonales anti-NGF en los procesos dependientes de NGF es el bioensayo de supervivencia de ganglio de raíz dorsal E14 de rata embriónica (DRG). Se evalúan anticuerpos monoclonales anti-NGF por su capacidad de inhibir los efectos de supervivencia de hNGF en neuronas de ganglio de raíz dorsal E14 de rata embriónica (DRG) (Figura 9).
Se cultivan neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRG) obtenidas de ratas E15 (seis a ocho embriones) en medio F12 con aditivos (McMahon et al., Nat. Med. 8: 774-780 (1995)) y 3 ng/ml de hNGF con o sin anticuerpos monoclonales anti-NGF. Después de 72 horas de incubación a 37° C , las células se fijan con formaldehído y se cuentan las neuronas viables.
La Figura 9 muestra la inhibición de la supervivencia neuronal DRG mediante los anticuerpos monoclonales anti-NGF. Mientras que los MAb 908, 909 y 14.14 reducen la supervivencia mediante solo 20-30% en la concentración mayor (67 nM; 10 µg/ml), los MAb 911 y 912 inhiben más de 90% de supervivencia en concentraciones bajas de aproximadamente 30-80 veces (0.8-2.4 nM; 0.12-0.37 µg/ml). El MAb 938 es capaz de inhibir la actividad de supervivencia mediante 90%, pero es 10-30 veces menos potentes que los MAb 911 y 912.
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El MAb 911 es el bloqueador más potente de la interacción NGF/TrkA. El MAb 911 reconoce un epítopo que contiene la sobreposición de NGF-TrkA y la región de unión p75, giro A’-A&quot; (V-1) y la región de unión TrkA dominante en la lámina (Figura 3C). El MAb 912, el segundo inhibidor NGF/TrkA más fuerte, reconoce los residuos K32, K34 y E35 de una región previamente mostrada por ser crucial para la interacción NGF/p75. El MAb 938, otro potente bloqueador de TrkA y la unión p75 también reconoce regiones críticas para TrkA o la unión p75, los terminales N y C.
Las diferencias observadas en la especificidad de bloqueo de anticuerpo no es debido a las afinidades relativas del MAb hacia el hNGF debido a que dos a tres de los anticuerpos de bloqueo más potentes (911 y 938) tienen bajas afinidades para NGF que los MAb de bloqueo más débiles.
Las regiones NGF críticas para la unión a los MAb 911 y 912 se sobrepone con las regiones identificadas como regiones críticas para la unión TrkA y p75. Los MAb 911 y 912 son capaces de bloqueadores de las actividades inducidas por NGF, que indica que estos serían antagonistas específicos de las actividades in vivo tales como hiperalgesia inflamatoria.
EJEMPLO 3
El Efecto de anti-NGF en la Respuesta Inmune
Se inmunizan ratones subcutáneamente con 10 µg de ovalbúmina en el día 0 y se le permite recuperar. En el día 40 luego de inmunización los animales se inyectan IP con 10 mg/kg de anticuerpo 911 anti-NGF o un anticuerpo de control, emparejado de isotipo. Dos días después los animales se refuerzan con ovalbúmina. Se mide la respuesta inmune mediante ELISA en muestras de suero tomadas en el día 47. Como se puede ver en la Figura 10, no existe diferencia (p > 0.05) en la respuesta inmune entre los animales que reciben el anticuerpo 911 anti-NGF y los animales que reciben el anticuerpo de control. Sin embargo, no existe intento significativo hacia un aumento en la respuesta inmune en animales tratados con el anticuerpo monoclonal anti-NGF.
En contraste, la Figura 11 muestra que luego de la inmunización con gama-globulina de pollo, el tratamiento con anti-NGF produce un intento no significativo hacia una reducción en la respuesta inmune. Se inmunizan animales con 10 µg de gama-globulina de pollo en el día 0 y se trata con anticuerpo 911 anti-NGF o un control, anticuerpo emparejado con isotipo (10 mg/kg IP) en el día 40. En el día 42 los animales se refuerzan con gama-globulina y en el día se toman 47 muestras de suero y se analizan mediante ELISA. No existe diferencia significativa (p > 0.05) en la respuesta inmune entre los dos grupos. Sin embargo existe un intento hacia una reducción en la respuesta inmune luego de tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-NGF 911.
EJEMPLO 4
Efecto de Anticuerpos monoclonales Anti-NGF en Hiperalgesia
Se investiga el efecto de los anticuerpos anti-NGF en NGF que induce hiperalgesia térmica. En resumen, ratas macho Fischer adultas se entrenan durante dos secciones al día con la prueba de Hargreaves durante por lo menos dos días antes de tratamiento. Después de familiarización con el aparato y el protocolo, los animales se asignan aleatoriamente al grupo de control o experimental. Se prueban ambos grupos para respuesta a valores iniciales y luego se les da inyecciones intraplantares en una pata en un volumen de 50 µl bajo anestesia con isofluorano. Las inyecciones en cada grupo contienen 1.25% de carragenano, en combinación con 90 µg de anticuerpo anti-NGF o un anticuerpo de control emparejado de isotipo, indiferente.
Se mide el retiro de las latencias térmicas a 0, 2, 4, 6 y 24 horas post inyección mediante la prueba de Hargreaves. Como se muestra en la Figura 12, a 4 y 6 horas después de tratamiento la hiperalgesia térmica que permite la inyección de caragenano se reduce significativamente en animales tratados con el anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 comparado con los animales de control.
EJEMPLO 5
Efecto de los Anticuerpos monoclonales Anti-NGF en Respuesta a los Alérgenos
Se tratan ratones C57/BL6 macho (Jackson Laboratories) con el anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 (n=16) o un anticuerpo de control anti-gD emparejado de isotipo (clon 1766; n=16). En el día -1, los animales se tratan con 20 mg/kg de anticuerpo y en los días 6, 13, 20 y 22 se tratan con 10 mg/kg de anticuerpo. Todos los tratamientos de anticuerpo se inyectan subcutáneamente en la piel de la nuca.
En los días 0 y 14 la mitad de los ratones en cada grupo se sensibilizan (SN) mediante inyección intraperitoneal de 30 AU de antígeno de ácaro de polvo (DMA; diluido con PBS de Dulbecco y luego 1:2 con ALUM, como un
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adyuvante, durante una concentración final de 300 AU/ml). Los ratones no sensibilizados (NS) reciben un volumen igual de PBS de Dulbecco diluido 1:2 con ALUM como un control.
Los ratones luego se exponen con antígeno de ácaro de polvo inhalado (DMA) en los días 21 y 22. Se diluye ácaro de polvo a 6000 AU/ml utilizando PBS de Dulbecco más 0.01% de Tween-20 para aerosolización. Se administran todas las exposiciones de inhalación en una cámara de exposición Plexiglas. Se aeroliza DMA utilizando un nebulizador PARI IS-2 conducida a 22 PSI. El nebulizador se llena con 3 ml y corrida para terminación (30 min.). La dosis/exposición depositada total en el pulmón es ~ 6.5 AU DMA.
Los ratones se evalúan para hiperreactividad de las vías respiratorias, infiltración celular en el fluido de lavado bronqueolar (BAL), niveles de citoquina en BAL, y el título de suero contra ácaros de polvo así como también los niveles de IgE en suero. En resumen, en el día 24, 48 horas después de la última exposición, los ratones se anestesian, se cateterizan en la vena yugular y se traqueotomizan. Luego se paralizan los ratones con 0.28 mg/kg de pancuronio y se cargan en un pletismógrafo de flujo Plexiglas para la medición de la expansión torácica y la presión de las vías respiratorias. Los ratones se ventilan utilizando 100% de oxígeno en una frecuencia de 170 bpm y Vt igual a 9 l/g. Los mecanismos de respiración (resistencia del pulmón y cumplimiento dinámico) se monitorean continuamente utilizando el programa de adquisición de datos Buxco XA. Los ratones tienen anamnesis de volumen (5 respiraciones a 2.5x Vt), se le permite estabilizar durante 2 min antes de medición de valores iniciales, y luego da una segunda dosis de un tiempo de 5 del agonista en un peso corporal que ajusta el índice de flujo utilizando una bomba de jeringa Harvard y software de aplicación de jeringa.
Se recolectan la sangre (suero), BAL y los pulmones. El suero se evalúa para IgE e IgG específico y total. Se obtiene BAL al inyectar la misma alícuota de NaCl 3 veces y se evalúa para IgE total mediante ELISA. Los glóbulos blancos totales y los diferenciales celulares se obtienen de células BAL.
El tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-NGF provoca una caída significativa en hiperreactividad de las vías respiratorias (Fig. 13), así como también en inflamación cuando se mide por infiltración celular en el BAL (Fig. 14). Sin embargo, aún existe una muy alta proporción de eosinófilos en BAL de animales tratados con anti- NGF (Fig. 15). El tratamiento del anticuerpo anti-NGF también reduce el nivel de la citoquina Th2 IL-13 en el BAL (Fig. 16).
A pesar de su capacidad de reducir la respuesta inflamatoria al alérgeno, el tratamiento del anticuerpo anti-NGF no reduce la respuesta inmune humoral en ácaros de polvo, cuando se mide por el título de inmunoglobulina de suero total para ácaros de polvo (Fig. 17) o mediante el nivel de suero de IgE (Fig. 18). Esto indica que el anticuerpo no bloquea el efecto biológico de NGF, pero no afecta la supervivencia o función de los linfocitos B.
Para confirmar que el anticuerpo anti-NGF 911 tiene un efecto funcionalmente significativo en el NGF, se lleva a cabo un experimento paralelo en el que los ratones se inyectan subcutáneamente en la piel de la nuca con 0.1, 1 o 10 mg/kg de anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 en los días 1 y 8, o con NGF a 0.1, 1 o 10 mg/kg en los días 1, 3, 6 y 8. Se sacrifican los animales en el día 9 y se examinan para el nivel del neuropéptido CGRP en el ganglio trigeminal. El tratamiento con 1 o 10 mg/kg de NGF provoca un aumento en CGRP, verificando que este péptido se regule por los niveles de NGF (Fig. 19). El tratamiento con 1 o 10 mg/kg del anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 provoca una reducción en el contenido de CGRP del ganglio (Fig. 19), verificando que esta dosis produzca un bloqueo funcionalmente significativo del NGF endógeno al momento en que estaba ocurriendo la respuesta inmune en el experimento descrito anteriormente.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano (antihNGF) capaz de unir el hNGF, e inhibir la unión de hNGF al TrkA humano (hTrkA) in vivo para uso en un método para controlar una afección relacionada con NGF en un paciente humano, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hNGF reconoce un epítopo NGF seleccionado del grupo que consiste de:
    a) un epítopo que comprende la sobreposición de la región de unión p75 y NGF-TrkA, giro A’-A&quot; (V - 1) y la región de unión TrkA dominante en la lámina C ; y b) un epítopo que comprende i) residuos K32, K34 y E35 de hNGF; ii) residuos Y79 y T81 de hNGF; iii) residuos H84 y K88 de hNGF; iv) residuo R103 de hNGF; v) residuo E11 de hNGF; vi) residuo Y52 de hNGF; y vii) residuos L112 y S113 de hNGF; y en donde la afección relacionada con NGF es dolor crónico.
  2. 2.
    Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano (anti-hNGF) para la preparación de un medicamento que se va a administrar a un paciente humano para controlar una afección relacionada con NGF en dicho paciente y, en donde el anticuerpo monoclonal anti-hNGF reconoce un epítopo hNGF que se selecciona del grupo que consiste de:
    a) un epítopo que comprende el NGF-TrkA sobrepuesto y la región de unión p75 giro A’-A&quot; (V-1) y la región de unión TrkA dominante en la lámina C ; y b) un epítopo que comprende i) residuos K32, K34 y E35 de hNGF; ii) residuos Y79 y T81 de hNGF; iii) residuos T-184 y K88 de hNGF; iv) residuo R103 de hNGF; v) residuo E11 de hNGF; vi) residuo Y52 de hNGF; y vii) residuos L112 y S113 de hNGF.; y en donde la afección relacionada con NGF es dolor crónico.
  3. 3.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en donde el anticuerpo une al hNGF con una afinidad en el rango nanomolar, en particular en donde la afinidad de unión de dicho anticuerpo a hNGF es aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.80 nM.; en particular en donde la afinidad de unión de dicho anticuerpo a hNGF es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.75 nM; más particularmente en donde la afinidad de unión de dicho anticuerpo a hNGF es aproximadamente 0.18 a aproximadamente 0.72 nM.
  4. 4.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en donde dicho anticuerpo también es capaz de unir al NGF de murino (muNGF).
  5. 5.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; en particular en donde dicho fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste de los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo; más particularmente en donde dicha molécula de anticuerpo de cadena sencilla es una molécula Fv de cadena sencilla (scFv).
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  6. 6.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en donde dicho anticuerpo es quimérico; en donde dicho anticuerpo es humanizado; en donde dicho anticuerpo es humano; o en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, en particular en donde dicho anticuerpo biespecífico tiene una especificidad anti-IgE.
  7. 7.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho anticuerpo no tiene efecto adverso significativo en el sistema inmune de dicho paciente, en particular en donde dicho anticuerpo no tiene efecto adverso significativo en la respuesta inmune humoral.
  8. 8.
    El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho anticuerpo reconoce un epítopo hNGF que comprende los residuos K32, K34, E35, Y79, T81, H84, K88, y R103 de hNGF.
  9. 9.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho anticuerpo reconoce un epítopo que comprende los residuos K32, K34, E35, Y79, T81, H84, K88, R103, E11, Y52, L112 y S113 de hNGF.
  10. 10.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal NGF anti-humano quimérico, humanizado o humano (antihNGF) como se define en la reivindicación 1 o 2, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
  11. 11.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; en particular en donde dicho fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste de los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, y anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpo.
  12. 12.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, en particular en donde dicho anticuerpo biespecífico es capaz de unión específica al IgE humano natural; en particular en donde dicho anticuerpo biespecífico es capaz de unión específica al TNF humano natural o a un receptor TNF humano natural
  13. 13.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 10 que comprende adicionalmente otro ingrediente farmacéuticamente activo; en particular en donde dicho otro ingrediente farmacéuticamente activo es adecuado para el tratamiento de una afección inflamatoria; más particularmente en donde dicha afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de dolor, asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis; aún más particularmente en donde dicha artritis es artritis reumatoide.
  14. 14.
    Un artículo de fabricación que comprende:
    un contenedor;
    una composición farmacéutica de la reivindicación 10; e instrucciones para utilizar la composición de la materia objeto para controlar una afección relacionada con NGF en un paciente humano.
  15. 15.
    El artículo de fabricación de la reivindicación 14 que comprende adicionalmente un segundo ingrediente farmacéuticamente activo; en particular en donde dicho segundo ingrediente farmacéuticamente activo es adecuado para uso en el tratamiento de una afección inflamatoria; más particularmente en donde dicha afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de dolor, asma, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso y soriasis.
  16. 16.
    El artículo de fabricación de la reivindicación 14 que comprende adicionalmente un segundo contenedor con una composición contenida allí, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se une a un receptor NGF y bloquea la activación del ligando.
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