CN110294806A - 一种磷酸化抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磷酸化抗体，磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸磷酸化，还提供了应用，用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异，用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平和反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，具备较好的临床应用性和现实的治疗意义。

Description

一种磷酸化抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及提供一种磷酸化抗体及其应用。
背景技术
层粘连蛋白是一种细胞外基质糖蛋白，可为基底膜提供细胞粘附。层粘连蛋白受体(67LR)是编码295个氨基酸的mRNA翻译的37kDa前体蛋白质的更高分子量形式，作为层粘连蛋白受体，67LR控制着关键的细胞过程，包括细胞生长，细胞存活，细胞迁移，蛋白质合成及分化等，另外，其还有助于促进层黏连蛋白结合，核糖体生物新生，细胞骨架组织形成及核功能完善等。
局部血管严重痉挛、阻塞时，相应组织器官缺血后，即使血管再通，重新恢复血流，但缺血区并不能得到充分的血液灌注，即无复流现象。无复流现象可发生于心肌、脑、肾、骨骼肌等处。引起无复流的主要原因是微血管内皮细胞的肿胀、微血管外间质中由渗出液引起的组织间压增高和血小板聚集与/或白细胞嵌塞引起的微血管堵塞。因此，及时检测缺血发生时血管内皮细胞粘附连接的损伤程度，是防治无复流的关键因素。
67LR在增殖活化的内皮细胞高表达，在稳定的血管和内皮细胞低表达；67LR磷酸化可引起内皮细胞伪足形成，细胞迁移能力增加，RakshaKhusal等研究报道缺氧时67LR可磷酸化，但磷酸化位点未知，在缺氧环境下，内皮细胞67LR磷酸化会显著上调血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)磷酸化水平，引起微血管内皮细胞的肿胀，微血管外间质渗出液增加。因此，检测缺氧时67LR具体位点的磷酸化水平，对评价血管内皮细胞粘附连接的损伤程度具有重要意义。然而，目前市场上尚未有相应的抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种磷酸化抗体及其应用，该磷酸化抗体是蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化，用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异，用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平和反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，具备较好的临床应用性和现实的治疗意义。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种磷酸化抗体，所述磷酸化抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化。
优选地，所述磷酸化抗体的制备方法为：
S1、将修饰肽的N末端与载体蛋白钥孔血蓝蛋白进行偶联反应，免疫动物后，采血收集，得到抗血清；所述修饰肽的蛋白质序列为C-RLLVVTDPRAD-N，所述修饰肽的C端的第6位苏氨酸发生了磷酸化；
所述修饰肽先后经过结构域分析，序列特异性分析，d线性表位预测，跨膜结构域预测，信号肽预测，亲水性分析，免疫原性及表位暴露性分析而得，所述修饰肽的结构域含有血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化的目的位点，序列特异性高，能有效识别抗原的线性表位，且亲水性好，免疫原性及表位暴露性高；
S2、将S1中得到的抗血清进行纯化，得到磷酸化抗体。
优选地，S1中所述动物为实验级日本大耳白兔。
本发明还提供了上述的磷酸化抗体的应用，所述磷酸化抗体用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异。
本发明还提供了上述的磷酸化抗体的应用，所述磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平。
本发明还提供了上述的磷酸化抗体的应用，所述磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明提供的磷酸化抗体是蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化，用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异，用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平和反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，具备较好的临床应用性和现实的治疗意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的血管内皮细胞67LR缺氧时磷酸化位点的质谱分析图。
图2是本发明实施例2的磷酸化抗体的酶联免疫吸附剂测定图。
图3是本发明实施例3的T125A病毒转染的血管内皮细胞的荧光图。
图4是本发明实施例3的用磷酸化抗体检测正常血管内皮细胞、模拟缺氧血管内皮细胞及干预后血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的免疫印迹图。
图5是本发明实施例4的67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞钙粘蛋白分布的荧光图。
图6是本发明实施例4的用磷酸化抗体检测67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞的磷酸化水平的免疫印迹图。
图7是本发明实施例5的右旋糖酐灌注方法检测SD大鼠心脏血管渗漏性的荧光图。
图8是本发明实施例5的SD大鼠心肌组织67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的免疫印迹图。
具体实施方式
实施例1
本实施例为缺氧时血管内皮细胞中67LR蛋白磷酸化位点的确定方法：该方法为：
取人冠脉微血管内皮细胞(HCMECs)，当细胞密度融合至百分之八十以上时，更换至含有浓度为0.1％胎牛血清的内皮细胞培养基中培养24h，然后置于缺氧培养箱中4h(37℃，5％CO2，1％O2)，模拟缺氧过程，收获细胞，加入1mL的免疫共沉淀细胞裂解缓冲液(IP细胞裂解缓冲液，市购)，在温度为4℃的条件下裂解30min后，在转速为14000rpm的条件下离心15min，得到上层的裂解液和下层的沉淀物；
在1mL的裂解液中加入1μg的67LR抗体(市购)和50μl的proteinA/G免疫沉淀磁珠(市购)，然后在温度为4℃的条件下摇晃孵育反应12h，然后在温度为4℃、转速为1000rpm的条件下离心5min，去除上清液，然后加入1mL的免疫共沉淀细胞裂解缓冲液进行冲洗，共冲洗3～4次，去除免疫共沉淀细胞裂解缓冲液，加入15μL的2×SDS(十二烷基硫酸钠)凝胶加样缓冲液，在温度为100℃的条件下处理10min后，得到缺氧的血管内皮细胞中67LR蛋白。
将得到的缺氧的血管内皮细胞中67LR蛋白进行质谱分析：通过MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析鉴定缺氧的血管内皮细胞中67LR蛋白中的磷酸化位点，质谱鉴定结果，如图1所示，结果所示：缺氧时血管内皮细胞中67LR蛋白磷酸化的位点分别为:T125(第125位苏氨酸)。
实施例2
本实施例的磷酸化抗体，所述磷酸化抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述磷酸化抗体的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化；
所述磷酸化抗体的制备方法为：
S1、将修饰肽溶解在浓度为8mol/L的尿素磷酸盐缓冲溶液中，得到修饰肽溶液，与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联反应，得到抗原，用抗原免疫实验级日本大耳白兔，共免疫5次，于第一次免疫后66天采血收集，得到抗血清；所述修饰肽的蛋白质序列为C-RLLVVTDPRAD-N，所述修饰肽的C端的第6位苏氨酸发生了磷酸化；所述尿素磷酸盐缓冲溶液中尿素和磷酸盐的摩尔比为40：1；所述修饰肽溶液和载体蛋白钥孔血蓝蛋白的摩尔比为2：1；
所述修饰肽先后经过结构域分析，序列特异性分析，d线性表位预测，跨膜结构域预测，信号肽预测，亲水性分析，免疫原性及表位暴露性分析而得，所述修饰肽的结构域含有血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化的目的位点，序列特异性高，能有效识别抗原的线性表位，且亲水性好，免疫原性及表位暴露性高；
同时用对照肽做对照处理，将对照肽溶解在浓度为8mol/L的尿素磷酸盐缓冲溶液中，得对照肽溶液，与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联反应，得到对照抗原，用对照抗原免疫实验级日本大耳白兔，共免疫5次，于第一次免疫后66天采血收集，得到对照抗血清；所述对照肽的蛋白质序列为C-RLLVVTDPRAD-N，所述对照肽的C端的第6位苏氨酸未发生磷酸化；所述尿素磷酸盐缓冲溶液中尿素和磷酸盐的摩尔比为40：1；所述对照肽溶液和载体蛋白钥孔血蓝蛋白的摩尔比为2：1；
所述抗原免疫实验级日本大耳白兔的免疫流程如表1所示：
表1实验级日本大耳白兔的免疫流程
免疫次数 免疫周期 免疫剂量 免疫动物状态
第一次免疫 1天 0.7mg 良好
第二次免疫 12天 0.35ng 良好
第三次免疫 26天 0.35ng 良好
第四次免疫 40天 0.35ng 良好
第五次免疫 54天 0.35ng 良好
S2、将S1中得到的抗血清进行纯化，得到磷酸化抗体；
同时将用对照肽做对照处理得到的对照抗血清进行纯化，得到对照抗体；
得到的磷酸化抗体的浓度为1.36mg/mL，得到的对照抗体的浓度为2.36mg/mL；
然后将得到的磷酸化抗体、得到的对照抗体，用一抗稀释液(市购)分别进行1:1000，1:5000，1:10000，1:50000，1:100000，1:200000的稀释，然后进行ELISA测定(酶联免疫吸附剂测定)，测定结果如图2所示，图中2A为对照抗体，2B为磷酸化抗体，磷酸化抗体与对照抗体相比，磷酸化抗体在稀释比例1:1000-1:10000之间，均有较好的效价性和特异性，说明本实施例的磷酸化抗体能够有效用于检测67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平。
实施例3
本实施例为实施例2所述的磷酸化抗体的应用，所述磷酸化抗体用于免疫印迹试验(Westernblot)检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异。
细胞模型的建立：
(1)模拟缺氧血管内皮细胞：人冠脉微血管内皮细胞(HCMECs)种植在内皮细胞培养基中，当生长至80％融合后，更换至含有浓度为0.1％胎牛血清的内皮细胞培养基中培养24h，然后置于缺氧培养箱中4h(37℃，5％CO2，1％O2)，模拟心梗时血管内皮细胞缺氧环境。
(2)模拟干预后再缺氧血管内皮细胞：利用基因定点突变技术构建血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸持续失活T125A病毒，模拟用药干预后的血管内皮细胞，模拟方法为：将0.8×106个人冠脉微血管内皮细胞(HCMECs)种植在内皮细胞培养基中，待其生长至30％-35％融合度时，更换至含有T125A病毒的内皮细胞培养基继续培养8h，再更换至不含T125A病毒的内皮细胞培养基中继续培养72h后，得到T125A病毒转染的血管内皮细胞，然后置于缺氧培养箱中
84h(37℃，5％CO2，1％O2)，模拟干预后再缺氧血管内皮细胞；
图3为T125A病毒转染的血管内皮细胞的荧光图，图中3A为正常血管内皮细胞，3B为T125A病毒空载体(市购)，3C为T125A病毒转染的血管内皮细胞，T125A病毒转染的血管内皮细胞中高度表达绿色荧光，表明携带荧光蛋白的T125A病毒成功转染进人冠脉微血管内皮细胞(HCMECs)中。
在免疫印迹试验(Westernblot)中，使用实施例2中所述磷酸化抗体检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异。
图4是用磷酸化抗体检测正常血管内皮细胞、模拟缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的免疫印迹图，图中pT125-67LR为第125位苏氨酸发生磷酸化的67LR蛋白，β-Actin为上样对照肌动蛋白，结果如图所示，图中4A列为正常血管内皮细胞，4B列为缺氧血管内皮细胞，4C列为干预后再缺氧血管内皮细胞(即T125A病毒转染的血管内皮细胞)，正常血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平低，缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平高，而干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白磷酸化水平接近正常血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，表明磷酸化抗体能准确反映正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，且特异性高。
实施例4
本实施例为实施例2所述的磷酸化抗体的应用，所述的磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平。
细胞模型的建立：
模拟67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞：利用基因定点突变技术构建血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸持续活化的T125D病毒，方法为：将0.8×106个人冠脉微血管内皮细胞(HCMECs)种植在内皮细胞培养基中，待其生长至30％-35％融合度时，更换至含有T125D病毒的内皮细胞培养基继续培养8h，再更换至不含T125D病毒的内皮细胞培养基中继续培养72h后，得到T125D病毒转染的血管内皮细胞，模拟67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞；
图5为67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞钙粘蛋白分布的荧光图，5A为正常血管内皮细胞，5B为T125D病毒空载体(市购)，5C为T125D病毒转染的血管内皮细胞(即67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞)，结果表明，正常血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)呈膜上线性分布，转染T125D病毒空载体的血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)未见异常，而转染T125D病毒的血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)则呈胞质内弥漫分布，即血管内皮细胞附连接发生破坏。
在免疫印迹试验(Western blot)中，使用实施例2中所述磷酸化抗体检测T125D病毒转染的血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平。
图6为用磷酸化抗体检测67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞的磷酸化水平的免疫印迹图，图中pVE-cadherin为磷酸化的钙粘连蛋白，β-Actin为上样对照肌动蛋白，图中6A列为正常血管内皮细胞，6B列为T125D病毒空载体，6C列为T125D病毒转染的血管内皮细胞(即67LR蛋白第125位苏氨酸持续磷酸化的血管内皮细胞)，结果表明，T125D病毒转染的血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)磷酸化水平明显增高。
综上，血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化是引起血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)内吞和血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)磷酸化的关键因素。因此，通过磷酸化抗体检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，可反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平。
实施例5
本实施例为实施例2所述的磷酸化抗体的应用，所述磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度。
将体重为(250g±15g)的SD大鼠分为四组：
第一组为正常未处理的SD大鼠；
第二组为模拟心肌梗死的SD大鼠，梗死4h；
第三组为注射20μL(滴度为1×109TU/mL)T125D病毒，进行大鼠目的基因的转染，然后模拟心肌梗死的SD大鼠，梗死4h；
第四组为注射20μL(滴度为1×109TU/mL)T125A病毒，进行大鼠目的基因的转染，然后模拟心肌梗死的SD大鼠,梗死4h；
所述SD大鼠目的基因的转染方法：采用心肌直接注射方法，在SD大鼠心肌缺血边缘区分0、3、6、9四点分别缓慢注射目的基因，注射后轻按压60s，以防液体漏出，用型号为5-0的无损伤缝线于注射点旁心室壁表面打结标记；所述目的基因为T125D病毒或T125A病毒；
所述T125D病毒能够使血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸持续活化，所述T125A病毒能够使血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸持续失活；
SD大鼠模拟心肌梗死的方法为：将SD大鼠用2％戊巴比妥钠(2mL/kg体重)腹腔麻醉，麻醉后将其固定在实验动物操作台上，接三导联心电图及动物用呼吸机装置，监测术中心电图的变化，常规备皮，消毒、铺无菌洞巾；用剪刀从胸骨正中偏左约0.5cm，第3、4肋间隙进胸，剪开心包，充分暴露心脏，用型号为6-0的无损伤缝合针缝扎、阻断冠状动脉左前降支。心电图显示，结扎后心,电图ST段弓背向上抬高，表明血管结扎确切，心肌梗死模型(AMI)建立成功，模拟心肌梗死模型。
(1)SD大鼠急性心肌梗死血管渗透性实验
通过血管右旋糖酐灌注的方法，对四组SD大鼠的血管渗透性进行检测，图7为右旋糖酐灌注方法检测SD大鼠心脏血管渗漏性的荧光图，图中上图为下图的局部放大图，箭头所指代表渗漏的右旋糖酐，图中7A列为正常未处理的SD大鼠，7B列为只进行模拟心肌梗死的SD大鼠，7C列为转染T125D病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠，7D列为转染T125A病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠，结果表明，如图所示，与正常未处理的SD大鼠相比，模拟心肌梗死的SD大鼠血管渗透性增加，血管内皮屏障的损伤程度；与正常未处理的SD大鼠相比，转染T125A病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠的血管渗漏显著减少，血管内皮屏障的损伤程度显著减少；与正常未处理的SD大鼠相比，转染T125D病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠血管渗漏最为明显，血管内皮屏障的损伤程度显著增加。
(2)使用实施例2所述磷酸化抗体通过免疫印迹试验(Westernblot)，检测四组SD大鼠的心肌组织的血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平；
图8为SD大鼠心肌组织免疫印迹试验，图中pT125-67LR为第125位苏氨酸发生磷酸化的67LR蛋白，β-Actin为上样对照肌动蛋白，图中8A列为正常未处理的SD大鼠，8B列为只进行模拟心肌梗死的SD大鼠，8C列为转染T125D病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠，8D列为转染T125A病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠，第一行的图为第二行对应列的图的局部放大图，结果表明，与正常未处理的SD大鼠相比，模拟心肌梗死的SD大鼠心肌组织血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平明显增高；与正常未处理的SD大鼠相比，转染T125A病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠心肌组织血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平轻度增高；与正常未处理的SD大鼠相比，转染T125D病毒后模拟心肌梗死的SD大鼠心肌组织血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平最高，与SD大鼠急性心肌梗死血管渗透性实验实验结果变化一致。
综上，通过所述磷酸化抗体检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，可以反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度。
检测67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，可反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，对探讨67LR蛋白磷酸化修饰在急性心肌梗死相关疾病具有重要意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种磷酸化抗体及其应用
<130> 2019.5.20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 1
atgtccggag gccttgacgt cctgcagatg aaggaggagg atgtcctcaa attccttgct 60
gcaggaaccc acttaggtgg caccaacctt gactttcaga tggagcagta catctacaaa 120
aggaaaagtg acggtatcta catcatcaac ctgaagagga cttgggagaa gctgttgtta 180
gccgctcgag ctattgttgc cattgagaac cctgctgatg tcagcgtcat ctcctccagg 240
aacactggcc agcgagctgt gctgaagttt gccgctgcca caggagccac tccaattgct 300
ggccgcttca cacctgggac cttcactaac cagatccaag cagccttcag ggagccccgg 360
cttctagtgg tgactgatcc ccgggctgac caccagcccc tcacagaggc ctcttacgtc 420
aacctgccca ccattgctct ttgtaacaca gattctcccc tgcgctatgt ggacattgcc 480
atcccatgca acaacaaggg agctcactca gtgggtctca tgtggtgggt gctggccagg 540
gaagtactcc gcatgcgagg aaccatctcc cgggagcacc catgggaggt tatgcctgat 600
ctttacttct acagggaccc agaggagatt gagaaggagg agcaggctgc cgctgagaag 660
gctgtgacca aggaggaatt ccagggtgaa tggacggcac cagcgcccga gttcactgct 720
gctcagcctg gggtggccga ctggtctgag ggtgtgcagg tgccctctgt gcccattcag 780
cagttcccca cagaagactg gagtgcacag ccggccactg aggactggtc agcagctccc 840
acagcacagg ctactgagtg ggttggagcc accactgagt ggtcctga 888
<210> 2
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 2
Met Ser Gly Gly Leu Asp Val Leu Gln Met Lys Glu Glu Asp Val Leu
1 5 10 15
Lys Phe Leu Ala Ala Gly Thr His Leu Gly Gly Thr Asn Leu Asp Phe
20 25 30
Gln Met Glu Gln Tyr Ile Tyr Lys Arg Lys Ser Asp Gly Ile Tyr Ile
35 40 45
Ile Asn Leu Lys Arg Thr Trp Glu Lys Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala
50 55 60
Ile Val Ala Ile Glu Asn Pro Ala Asp Val Ser Val Ile Ser Ser Arg
65 70 75 80
Asn Thr Gly Gln Arg Ala Val Leu Lys Phe Ala Ala Ala Thr Gly Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Ala Gly Arg Phe Thr Pro Gly Thr Phe Thr Asn Gln Ile
100 105 110
Gln Ala Ala Phe Arg Glu Pro Arg Leu Leu Val Val Thr Asp Pro Arg
115 120 125
Ala Asp His Gln Pro Leu Thr Glu Ala Ser Tyr Val Asn Leu Pro Thr
130 135 140
Ile Ala Leu Cys Asn Thr Asp Ser Pro Leu Arg Tyr Val Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ile Pro Cys Asn Asn Lys Gly Ala His Ser Val Gly Leu Met Trp Trp
165 170 175
Val Leu Ala Arg Glu Val Leu Arg Met Arg Gly Thr Ile Ser Arg Glu
180 185 190
His Pro Trp Glu Val Met Pro Asp Leu Tyr Phe Tyr Arg Asp Pro Glu
195 200 205
Glu Ile Glu Lys Glu Glu Gln Ala Ala Ala Glu Lys Ala Val Thr Lys
210 215 220
Glu Glu Phe Gln Gly Glu Trp Thr Ala Pro Ala Pro Glu Phe Thr Ala
225 230 235 240
Ala Gln Pro Gly Val Ala Asp Trp Ser Glu Gly Val Gln Val Pro Ser
245 250 255
Val Pro Ile Gln Gln Phe Pro Thr Glu Asp Trp Ser Ala Gln Pro Ala
260 265 270
Thr Glu Asp Trp Ser Ala Ala Pro Thr Ala Gln Ala Thr Glu Trp Val
275 280 285
Gly Ala Thr Thr Glu Trp Ser
290 295

Claims (6)

1.一种磷酸化抗体，其特征在于，所述磷酸化抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化抗体，其特征在于，所述磷酸化抗体的制备方法为：
S1、将修饰肽的N末端与载体蛋白钥孔血蓝蛋白进行偶联反应，免疫动物后，采血收集，得到抗血清；所述修饰肽的蛋白质序列为C-RLLVVTDPRAD-N，所述修饰肽的C端的第6位苏氨酸发生了磷酸化；
S2、将S1中得到的抗血清进行纯化，得到磷酸化抗体。
3.根据权利要求2所述的一种磷酸化抗体，其特征在于，S1中所述动物为实验级日本大耳白兔。
4.一种如权利要求1-3任一权利要求所述的磷酸化抗体的应用，其特征在于，所述磷酸化抗体用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异。
5.一种如权利要求1-3任一权利要求所述的磷酸化抗体的应用，其特征在于，所述磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平。
6.一种如权利要求1-3任一权利要求所述的磷酸化抗体的应用，其特征在于，所述磷酸化抗体用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度。
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