CN102180950A

CN102180950A - 一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途

Info

Publication number: CN102180950A
Application number: CN201110044416XA
Authority: CN
Inventors: 刘坤; 杨晓芳; 杨勇; 王彦富; 王朝晖; 王敏; 连亦田; 李晓卫; 刘金平; 高翔; 廖玉华; 曾秋棠; 刘琳玲
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-02-24
Also published as: CN102180950B

Abstract

本发明提供了一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性电压门控钾通道1.3α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的13个氨基酸构成，肽段的氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp，通过免疫学的方法制备针对上述肽段的抗体可以作为人源性电压门控钾通道1.3新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性电压门控钾通道1.3功能的研究。基于上述肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于自身免疫性疾病或自身免疫相关性疾病的治疗。

Description

一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途。该通道英文全称为human voltage-gated potassium channel 1.3，以下简称为hKv1.3。应用hKv1.3通道胞外环肽段E314制备的抗体，以下简称为抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体，可以作为hKv1.3通道新的、特异性抑制剂。

背景技术

电压门控钾通道是一类能够允许钾离子透过细胞膜的跨膜蛋白。它们在神经元、肌细胞以及淋巴细胞等可兴奋及非可兴奋细胞的生物电信号传导中发挥作用。电压门控钾通道家族成员之一的Kv1.3通道已被证实大量分布于免疫细胞和大脑组织的某些特定区域。因此，近十年来，Kv1.3通道的研究受到广泛的关注。大量研究证实，Kv1.3对特定的淋巴细胞亚群发挥着关键性的调节作用。效应型记忆T细胞和/或Ig-class-switched记忆B细胞在多发性硬化、1型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、移植排斥、移植物抗宿主病、

综合征以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的炎症损伤过程中起着至关重要的作用。一系列有关Kv1.3通道对淋巴细胞亚群调节作用的研究显示，Kv1.3通道能够调节自身反应的效应型淋巴细胞的活化和增殖。伴随着淋巴细胞的激活，Kv1.3通道高表达于特定的淋巴细胞亚群。Kv1.3通道在活化的效应型记忆T细胞-T_EM和Ig-class-switched记忆B细胞上的表达量显著升高，约从250个通道/细胞增加至1500个通道/细胞。伴随着淋巴细胞的活化，Kv1.3通道大量开放，钾离子外流，使得膜电位负值加大，跨膜电势差增大。顺着电势差，钙离子流入细胞内，导致胞内钙离子浓度的增加。而钙离子是重要的第二信使，胞内钙离子浓度的增加能促进T_EM和Ig-class-switched记忆B细胞的活化。抑制Kv1.3通道能够显著减弱钙离子内流，减少胞内钙离子浓度的增加，从而抑制T_EM或Ig-class-switched记忆B细胞的活化。在体动物实验已证实，抑制Kv1.3通道能够明显缓解自身免疫性疾病的病理进程。研究表明Kv1.3成为自身免疫性疾病治疗新的靶点，前景令人瞩目。因此，寻求一种有效的、选择性的Kv1.3阻断剂将受到更多的关注。

目前所筛选出的选择性Kv1.3通道阻滞剂主要是小分子化合物或从海葵和蝎子毒液中提纯的毒肽类物质。然而研究发现，相当多的一部分小分子化合物及其衍生物和毒肽类物质在阻滞Kv1.3通道的同时亦能阻滞神经系统和心脏中的电压门控钠、钙等离子通道。由于电压门控钾通道具有较高的结构同源性，使得不同的电压门控钾通道具有高度一致的药物结合位点。研究发现，Kv1.3通道与心脏复极HERG和KCNQ1/KCNE1钾通道阻滞剂结合位点高度保守，因而使得现有的一些Kv1.3通道阻滞剂，在阻滞Kv1.3通道的同时，亦对HERG和KCNQ1/KCNE1通道产生阻滞作用，常常会导致药源性的心律失常的发生，阻碍了一些Kv1.3通道阻滞剂进一步开发成为临床药物。因此，美国食品和药品管理局要求新上市的药物应评估其对心脏复极电流的影响。

抗体与抗原的结合具有亲和力高，特异性强的特点，理论上开发出针对hKv1.3、具有阻滞效应的抗体可以作为hKv1.3通道特异性的阻滞剂。本研究以hKv1.3通道胞外环的一段肽段为免疫原性肽段，通过免疫学的方法制备针对该肽段的特异性抗体，观察其对亲本蛋白hKv1.3通道以及心脏电压门控钠、钙通道以及复极钾通道的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源性电压门控钾通道hKv1.3免疫原性肽段，基于该肽段制备的抗体-抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体，可以作为hKv1.3通道新的、特异性抑制剂。

实现本发明的具体技术方案：

(1)hKv1.3胞外环肽段E314序列的选择和描述：hKv1.3通道基因位于人1号染色体短臂第1区第3条带的第三个亚带，英文简写为1p13.3，该通道蛋白是一种重要的电压门控钾离子通道，由四个结构相同的α亚基聚合成，每个α亚基由6个跨膜蛋白分子片段S1～S6以及N末端和C末端组成，并具有3个胞外环，分别为E1、E2和E3，构成通道的主体。其中S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。本发明的设计人根据hKv1.3通道α亚基跨膜片段S5和S6之间的胞外环肽段氨基酸的亲水性、表露性和柔韧性等，采用Jameson-Wolf算法，通过计算机，选择抗原指数高的包含连续14个氨基酸的一段肽段-hKv1.3胞外环肽段E314，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp，并应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体；

该抗体可作为人源性电压门控钾通道1.3新的、特异性抑制剂，用于对人源性电压门控钾通道1.3功能的药学应用。

(2)hKv1.3胞外环肽段E314的合成：根据E314肽段氨基酸序列采用多肽自动合成仪，固相法合成hKv1.3通道胞外环肽段E314。

(3)抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体的制备：采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰大白兔，制备抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫5次后，取血，亲合层析法提纯该抗体。

(4)抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对hKv1.3通道电流的抑制作用：通过膜片钳技术，观察抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于人胚胎肾293细胞系上的hKv1.3通道电流的抑制作用。该细胞系英文简称为HEK293细胞系。

(5)抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体特异性鉴定：

5-1，通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，观察抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3通道蛋白的结合；

5-2，通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，观察抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达HERG、hKCNQ1/hKCNE1通道基因的HEK293细胞系和人心肌细胞上HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道、电压门控钠通道、L型钙通道蛋白的结合；

5-3，通过膜片钳技术，观察抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对上述细胞系和人心房肌细胞通道电流的影响，明确抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体的特异性。

发明提供的肽段的有益效果：hKv1.3通道免疫原性肽段E314可作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hKv1.3通道蛋白具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。基于hKv1.3通道胞外环肽段E314制备的抗体-抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体可作为hKv1.3通道新的、特异性抑制剂，用于对hKv1.3通道功能的研究。基于E314肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于自身免疫性疾病或自身免疫相关性疾病的治疗。该抗体可用于文献报道的以hKv1.3通道为干预靶点的多发性硬化、1型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、移植排斥、移植物抗宿主病、

综合征以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病以及自身免疫相关性疾病，如动脉粥样硬化等的治疗性应用。

附图说明

图1hKv1.3通道胞外环肽段抗原决定簇预测图。A：A1根据氨基酸的亲水性预测的hKv1.3通道结构图；A2hKv1.3通道胞外环肽段氨基酸抗原性预测图.黑线表示所选取的肽段，E314：14个氨基酸；B：根据Jameson-Wolf法筛选出的跨膜片段S5和S6之间胞外环肽段14个氨基酸的抗原指数。

图2抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体滴度。

图3抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3通道电流的抑制作用。A对照组：稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3通道电流；B～D：不同浓度抗体组：300nmol/L、75nmol/L和37.5nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对hKv1.3通道电流的抑制作用；E：不同浓度抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对hKv1.3通道电流-电压曲线的影响；F：去极化脉冲为+60mV时各组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果不同浓度抗体组与对照组相比有统计学意义^*P＜0.001。

图4抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与hKv1.3通道蛋白的结合。A：免疫荧光结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKv1.3通道蛋白结合。a绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合，b无绿色荧光显示细胞核；B：免疫荧光结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与HEK293细胞膜无结合；C：免疫荧光结果显示，经E314肽段孵育后的抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体，与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKv1.3通道蛋白无结合；D：免疫印迹结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3通道蛋白特异性结合；经E314肽段孵育后的抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3通道蛋白无结合；抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与HEK293细胞蛋白无结合。

图5抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道蛋白的结合。A：免疫荧光结果显示，HEK293细胞无绿色荧光，表明抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道蛋白无结合；B：免疫印迹结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道蛋白无结合。

图6抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白的结合。A：免疫荧光结果显示，HEK293细胞无绿色荧光，表明抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白无结合；B：免疫印迹结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白无结合。

图7抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与人心房肌细胞膜上的离子通道的结合。A：免疫荧光结果显示，人心房肌细胞无绿色荧光，表明抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与表达于人心房肌细胞膜上的HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道、Nav1.5通道、Cav1.2通道蛋白无结合；B1：免疫印迹结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于人心房肌的HERG通道1α亚基、hKCNQ1通道、Nav1.5通道α亚基、Cav1.2通道α1C亚基蛋白无结合；B2：免疫印迹结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于人心室肌的HERG通道1α亚基、hKCNQ1通道、Nav1.5通道α亚基、Cav1.2通道α_1C亚基蛋白无结合。

图8抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的抑制作用。A：对照组：人心房肌细胞电压门控钠通道电流；B：抗体组：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的影响；C：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为-35mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

图9抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的抑制作用。A：对照组：人心房肌细胞L型钙通道电流；B：抗体组：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的影响；C：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+10mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

图10抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的HERG电流的抑制作用。A：对照组：稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道电流；B：抗体组：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对HERG通道电流的影响；C：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对HERG通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+50mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

图11抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道电流的抑制作用。A：对照组：稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道电流；B：抗体组：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对hKCNQ1/hKCNE1通道电流的影响；C：300nmol/L抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对KCNQ1/KCNE1通道电流电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+40mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

具体实施方式

抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体抑制稳定表达于HEK293细胞系上的hKv1.3电流的研究——一种新的、特异性hKv1.3通道抑制剂

材料与方法

1.1实验对象

雄性新西兰大白兔，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，清洁级，体重2～3kg，随机分成免疫组和假性免疫组。人心房肌和心室乳头肌标本取自心脏外科行先天性心脏病和瓣膜病变手术的患者，男32例，女38例，年龄(66.3±1.4)岁。实验方案符合《赫尔辛基宣言》所申明的原则和条款(2008年修订)，得到华中科技大学伦理委员会的批准。人胚肾细胞(HEK293)购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

1.2主要实验试剂和仪器

hKv1.3/pCI-neo，HERG/pcDNA3和hKCNQ1/pCEP4质粒分别由美国默克实验室Dr.GarciaMaria，美国威斯康星大学麦迪逊分校医学院Dr.Robertson Gail和香港大学李贵荣教授馈赠。hKCNE1cDNA由广州复能基因有限公司合成，经由本室构建成hKCNE1/pcDNA3质粒。DMEM培养基(Invitrogen公司，美国)，胎牛血清(Invitrogen公司，美国)，G418(Invitrogen公司，美国)，潮霉素(Roche公司，瑞士)，

HD转染试剂盒(Roche公司，瑞士)，Attractene转染试剂盒(QIAGEN公司，美国)，完全/不完全弗氏佐剂(Sigma，美国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(武汉大风生物技术有限公司)，驴血清和异硫氰碳酸荧光素(FITC)标记的驴抗兔IgG(Millipore公司，美国)，II型胶原酶(Worthington公司，美国)，XXIV型蛋白酶(SIGMA公司，美国)，牛血清白蛋白(SIGMA公司，美国)，DAPI(江苏碧云天生物技术研究所)，穿孔素Escin(SIGMA公司，美国)，微电极玻璃毛细管(武汉微探科学仪器有限公司)，PSSM8型多肽自动合成仪(Shimadzu公司，日本)，ELX800型酶标(Bio-tek公司，美国)，DEM一11型自动洗板机(Bio-tek公司，美国)，水浴箱(宁波新芝科技生物有限公司)，37℃恒温箱(上海博讯实业有限公司)，高压蒸汽灭菌器(SANYO，日本)，Barnstead超纯水系统(Thermo公司，美国)，涡漩混匀器(中外合资深圳天南海北有限公司)，PH仪(上海梅特勒-托利多有限公司)，电子天平(Sartorius，德国)，台式高速离心机(TGL-16G，上海精密仪器仪表有限公司)，低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)，-70℃冰箱(Thermo公司，美国)，-20℃冰箱(海尔公司，中国)，二氧化碳培养箱(Thermo公司，美国)，生物安全柜(Heal Force公司，中国)，电泳仪(Bio-Rad公司，美国)，PCR仪(Applied biosysterms公司，美国)，普通光学显微镜(Olympus公司，日本)，激光共聚焦显微镜(Olympus FluoView^TM FV1000，日本)，Axopatch200B放大器(Molecular Devices公司，美国)。

1.3主要溶液配制

(1)I_Kv1.3细胞外液(mmol/L)：NaCl 120，KCl 5.4，CaCl₂ 2，MgCl₂ 1，HEPES 10，葡萄糖10，PH值用NaOH调至7.4。

(2)I_Kv1.3电极内液(mmol/L)：KCl 20，K-asperate 110，MgCl₂ 1.0，Mg₂-ATP 5，Na₂-Phosphocreatine 5，GTP 0.1，EGTA 5，HEPES 10，用KOH调pH至7.20。

(3)台氏液(mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.8，NaH₂PO4 0.33，HEPES 5.0，葡萄糖10.0，PH值用NaOH调至7.4。

(4)无钙液(mmol/L)：KCl 5.4，NaCl 135，MgCl₂ 1.0，NaH₂PO₄ 0.33，HEPES 5.0，葡萄糖10.0，PH值用NaOH调至7.4。

(5)KB液(mmol/L)：L-谷氨酸50，KCl 40，EGTA 0.5，MgSO₄ 1.8，KH₂PO₄ 20，HEPES10，葡萄糖10，牛磺酸20，KOH 70，PH值用KOH调至7.4。

(6)转运液(mmol/L)：KH₂PO₄50，MgSO₄ 8，adenosine 5，HEPES 10，mannitol 100，牛磺酸10，葡萄糖140，PH值用KOH调至7.4

(7)I_Na细胞外液(mmol/L)：NaCl 5，MgCl₂ 1.0，CsCl 132，CaCl₂ 1，Glucose 10，HEPES10，用CsOH调pH至7.4。

(8)I_Na电极内液(mmol/L)：CsF 135，NaCl 5，EGTA 10，HEPES 5，Mg₂-ATP 5用CsOH调pH至7.2。

(9)Ica_L细胞外液(mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.8，NaH₂PO4 0.33，HEPES 5.0，葡萄糖10.0，PH值用NaOH调至7.4。

(10)Ica_L电极内液(mmol/L)：L-Aspartate acid 110，CsCl 20，MgCl₂ 1，Na₂-ATP 5，Na₂-phosphocreatire 5，Na₂GTP 0.1，cAMP0.05，EGTA 5，HEPES 5用CsOH调pH至7.20。

(11)I_HERG细胞外液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 4.0，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.8，HEPES 10，Glucose 10，用NaOH调pH至7.35。

(12)I_HERG电极内液(mmol/L)：KCl 20，K-asperate 110，MgCl₂ 1.0，Mg₂-ATP 5，Na₂-Phosphocreatine 5，GTP 0.1，EGTA 5，HEPES 10，用KOH调pH至7.20。

(13)I_KCNQ1/KCNE1细胞外液(mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.8，HEPES10.0，KH₂PO4 0.33，Glucose 10，NaOH调p H至7.40。

(14)I_KCNQ1/KCNE1电极内液(mmol/L)：KCl 20，K-aspartate 110，MgCl₂ 1.0，Mg₂-ATP5，Na₂-phosphocreatine 5，GTP 0.1，HEPES 10，EGTA 5，用KOH调pH至7.20。

(15)凝胶储液(g/L)：丙烯酞胺292g，N，N-亚甲叉双丙烯酞胺8g，(避光保存)。

(16)浓缩胶缓冲液(g/L)：Tris-HCl 60.55，SDS 4，HCl调pH至6.8。

(17)分离胶缓冲液(g/L)：Tris-HCl 181.65，SDS 4，HCl调pH至6.8。

(18)10％过硫酸胺：过硫酸胺(Ap)100mg加双蒸水溶至1ml，宜新鲜配制。

(19)电泳缓冲液(g/L)：Tris碱3，甘氨酸14.4，SDS 1，HCl调pH至8.3。

(20)转膜缓冲液(g/L)：Tris碱1.93，甘氨酸9，甲醇200ml加双蒸水至1L，HCl调pH至8.1-8.4。

(15)TBST(g/L)：NaCl 8.775，Tris-Base 1.211，Tween-203ml，HCl调pH至7.5。

1.4方法

1.4.1抗原的合成从hkv1.3通道胞外环筛选出一段短肽E314，其氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp。根据其氨基酸序列采用PSSM8型多肽自动合成仪，固相法合成多肽。采用戊二醛偶联法，以BSA作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。抗原合成完毕后，置于-70℃冰箱中备用。

1.4.2动物免疫免疫组：初次免疫每只兔取抗原800μg，后继免疫每只兔取抗原400μg，均加等体积弗氏佐剂，初次免疫用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多点注射。每两周加强免疫一次，共5次。假性免疫组：用生理盐水加弗氏佐剂假性免疫，剂量与方法同免疫组。

1.4.3血清标本的留取从初次免疫开始，每次免疫前从兔耳缘静脉抽血1ml，动态观察血清抗体效价，第9周处死，留取血清制备抗体。

1.4.4抗体的制备提纯抗体采用亲合层析法制备提纯，提纯完毕后分装，置于-20℃冰箱中备用(以下称一抗)。

1.4.5ELISA检测抗体效价以未接受过免疫的健康新西兰大白兔血清为阴性对照，将不同时段兔血清进行检测。参照本实验室建立的方法²⁹将合成的多肽，以每孔1μg包被于酶联板，方阵滴定法先后加入制备的一抗及HRP标记的羊抗兔IgG，TMB/H₂O₂显色，稀H₂SO₄终止反应。在酶标仪450mm波长处测吸收度OD值，以(待测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)≥2.1为阳性，＜2.1为阴性。每次试验均设3个复孔阴性对照。取1份阳性样品，进行同一板内及不同板间的重复试验。

1.4.6稳定表达hKv1.3通道、HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系的建立

(1)HEK293细胞培养转染前1d，采用0.25％胰酶消化，将处于对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，以约3～6×10⁵细胞接种于培养板，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃5％CO2饱和湿度培养箱中，细胞生长至铺满培养板。

(2)G418和潮霉素浓度筛选于hKv1.3/pCI-neo，HERG/pcDNA3，hKCNQ1/pCEP4和hKCNE1/pcDNA3质粒转染前两周，确定G418和潮霉素杀死HEK293细胞的最低浓度。

(3)转染分别按照

HD、Attractene转染试剂盒的说明书进行操作。于含10％胎牛血清的DMEM培养基中缓缓加入脂质体/DNA复合物，摇匀，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

(4)克隆筛选转染72h后，更换含10％胎牛血清的DMEM培养基，并开始在DMEM培养基中加入合适浓度的G418和潮霉素。待单克隆长出后，用克隆柱挑选单克隆，扩增后应用全细胞膜片钳技术检测细胞克隆I_Kv13、I_HERG和I_KCNQ1/KCNE1的表达，所应用膜片钳记录方法见后。挑选稳定表达I_Kv1.3、I_HERG和I_KCNQ1/KCNE1的细胞克隆。

1.4.7单个人心房肌细胞的分离按文献采用二步酶解法分离人单个心房肌细胞。先将心肌组织块剪碎，用36℃100％氧饱和的无钙台式液反复冲洗三遍，共15min，然后将其置入含150-200U/ml II型胶原酶、1.2U/ml XXIV型蛋白酶和1mg/ml牛血清白蛋白的无钙台式液中。温孵约50min，再将剩余组织置入上述相同的含胶原酶无钙台式液中继续温孵，每隔10min显微镜下观察细胞状况，待镜下细胞数量和质量最佳时，停止温孵，离心获取心房肌细胞。分离好的心房肌细胞置于KB液中，室温下静置1h备用。

1.4.8免疫荧光组织化学法观察抗体与稳定表达hKv1.3通道、HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系和人心房肌细胞的结合HEK293细胞用0.25％胰酶消化成单细胞后，以合适浓度接种在载玻片上贴壁过夜，而人心房肌细胞滴加在载玻片上，4℃静止30分钟，然后4％多聚甲醛固定30分钟，PBS振洗3次，每次10min；10％驴血清和1％牛血清白蛋白湿盒封闭2小时；滴加用封闭液稀释的一抗在4℃冰箱过夜，PBS振洗3次，每次10min；加FITC标记的1∶100驴抗兔IgG室温孵育2小时，PBS振洗3次，每次10min；滴加DAPI，室温孵育5分钟，振洗三次，每次5分钟；抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并照相记录结果。

1.4.9免疫印迹法观察抗体与稳定表达hKv1.3通道、HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系和人心房肌及心室乳头肌蛋白的结合细胞膜蛋白的提取参考Barry DM等的方法，提取的蛋白用BCA法测蛋白浓度。每孔取35μg蛋白上样于7.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至硝酸纤维素膜上。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST中室温摇动封闭2.5小时，加以1∶1000一抗4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次15min，加入1∶10000HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2小时，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增强化学发光试剂，条带显色后暗室X线压片曝光30秒，洗片，烘干。

1.4.10全细胞膜片钳记录通过Axopatch200B放大器采用全细胞(I_Kv1.3、I_Na、I_HERG)或穿孔膜片钳技术(I_CaL、I _KCNQ1/KCNE1)，记录抗体孵育前后人心房肌细胞和HEK293细胞离子电流。

(1)I_Kv1.3程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先维持电位(HP)-80mV，给予脉宽245ms、阶跃10mV、-60～+60mV的去极化脉冲，然后维持电位(HP)-50mV，持续50ms，分别记录I_Kv1.3刺激电流和尾电流，刺激频率＝0.1Hz。I_Kv1.3电流强度的计算：由基线零电流与测试脉冲末端稳态电流间的差值求出。I_Kv1.3电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的I_Kv1.3电流密度对相应测试电压绘成电流-电压(I-V)曲线。

(2)I_Na程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，HP＝-120mV、脉宽100ms、阶跃5mV、-70～+30mV的系列去极化脉冲刺激记录I_Na，刺激频率＝1Hz。I_Na的电流强度的计算：测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。I_Na电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的I_Na电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

(3)IHERG程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先给予HP＝-80mV，继而给予脉宽4000ms、阶跃10mV、-40～+50mV的去极化脉冲，然后HP＝-50mV，持续5000ms，分别记录I_HERG刺激电流和尾电流(I_tail)，刺激频率＝0.05Hz。I_tail的电流强度的计算：测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(pA)。I_tail电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的I_HERG的I_tail电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

(4)I_CaL程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，HP＝-40mV、脉宽300ms、阶跃10mV、-40～+60mV的系列去极化脉冲刺激记录I_CaL，刺激频率＝0.2Hz。I_CaL的电流强度的计算：测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。I_CaL电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的I_CaL电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

(5)I_KCNQ1/KCNE1程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先维持电位(HP)-80mV，给予脉宽3000ms、阶跃20mV、-60～+60mV的去极化脉冲，然后维持电位(HP)-40mV，持续3000ms，分别记录I_KCNQ1/KCNE1刺激电流和尾电流，刺激频率＝0.1Hz。I_ks的刺激电流强度的计算：测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(pA)。I_ks电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的I_KCNQ1/KCNE1的刺激电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

实验数据经pCLAMP9.0软件采集，Digidata1322A模-数/数-模转换器转换，存盘于计算机。实验在室温(20℃～25℃)下进行。

1.5统计学方法

数据以均数±标准误表示。采用SPSS12.0统计软件包，进行t检验和单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。

结果

2.1抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体滴度变化

ELISA检测发现在0周，2周留取的血清抗体滴度为0，第4周留取的血清抗体滴度为1∶800，效价偏低，第6周留取的血清抗体滴度为1∶6400，效价有一次明显的飞跃。表明随着免疫时间及免疫次数的增加，抗体的滴度在上升，第8周抗体滴度达1∶12800、第9周抗体滴度也为1∶12800，说明抗体滴度已达到相对稳定较高的水平。见图2

2.2抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对I_Kv1.3的抑制作用。

图3为预孵300nmol/L、75nmol/L、37.5nmol/L三组浓度抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组与稳定表达hKv1.3通道基因对照组HEK293细胞系I_Kv1.3电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，不同浓度E314抗体对hKv1.3电流均有抑制作用，在去极化脉冲为+60mV条件下，300nmol/L E314抗体抑制该电流达94％，I_Kv1.3电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0.0202±0.00437nA/pF vs0.35224±0.07443nA/pF，P＜0.001)；75nmol/L E314抗体抑制该电流达84％，I_Kv1.3电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0.05657±0.0196nA/pF vs 0.35224±0.07443nA/pF，P＜0.001)；37.5nmol/L E314抗体抑制该电流达66％，I_Kv1.3电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0.12054±0.01692nA/pF vs 0.35224±0.07443nA/pF，P＜0.001)。

2.3抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体与hKv1.3通道蛋白特异性结合

2.3.1免疫荧光组织化学染色结果显示，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体特异性地结合于稳定表达于HEK293细胞膜的hKv1.3通道蛋白，而抗hKv1.3通道胞外环肽段E314抗体与人心房肌细胞膜上的HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道、Nav1.5通道、Cav1.2通道蛋白及稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白均不结合。见图4图5图6图7

2.3.2免疫印迹结果表明，抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体能特异识别稳定表达于HEK293细胞系上的63.8KD的hKv1.3通道蛋白。而抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体未识别人心肌和稳定表达于HEK293细胞系上145kDa/155KD的HERG通道蛋白、120KDd的hKCNQ1通道蛋白、190KD的Cav1.2通道蛋白α_1C亚基和220KD的Nav1.5通道蛋白α亚基。见图4图5图6图7

2.4抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体对I_Na、I_CaL、I_HERG和I_KCNQ1/KCNE1的影响

图8为预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314 300nmol/L抗体组和对照组人心房肌细胞I_Na电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为-35mV条件下预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组I_Na电流密度平均值无明显差异(0.03855±0.00673nA/pF vs 0.03733±0.00667nA/pF，P＞0.05)。

图9为预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314300nmol/L抗体组和对照组人心房肌细胞I_CaL电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+10mV条件下预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组I_CaL电流密度平均值无明显差异(0.01684±0.0018nA/pF vs 0.01603±0.00323nA/pF，P＞0.05)。

图10为预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314300nmol/L抗体组和对照组HEK293细胞I_HERG的电流图。I_HERG在-40mV时迅速激活，峰值电位在0mV，当膜电位大于0mV后，随着膜电位的增加，电流反而减小，呈现出明显的内向整流特性。当恢复到HP＝-50mV，记录到电流幅度更高的I_tail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。I_tail在+40mV时达到峰值，当膜电位再升高时尾电流饱和。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+40mV条件下预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组I_HERG的I_tail电流密度平均值无明显差异(0.03958±0.00513nA/pF vs 0.03838±0.00502nA/pF，P＞0.05)。

图11为预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314 300nmol/L抗体组和对照组HEK293细胞I_KCNQ1/KCNE1的电流图。I_KCNQ1/KCNE1在-40mV时缓慢激活，失活缓慢，当恢复到HP＝-40mV，记录到I_tail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+40mV条件下预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组I_KCNQ1/KCNE1电流密度平均值无明显差异(0.26768±0.01369nA/pF vs 0.24104±0.01804nA/pF，P＞0.05)。

Claims

1.一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段，该肽段由人源性电压门控钾通道1.3α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的14个氨基酸构成。其特征在于：所述肽段的氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp，应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体。

2.一种针对权利要求1所述肽段的抗体，其特征在于：该抗体可作为人源性电压门控钾通道1.3新的、特异性抑制剂，用于对人源性电压门控钾通道1.3功能的药学应用。