CN105012957A - 一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原疫苗载体的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原疫苗载体的用途。克服了蛋白抗原进入体内后易被酶降解导致疫苗免疫原性交差的问题。在水溶液中，这种聚合物高分子材料能够和抗原形成复合物纳米粒子，从而实现肿瘤蛋白抗原的负载。本发明采用以RF33.70为靶细胞模型，OVA作为模型抗原，以C57BL/6小鼠骨髓源性树突状细胞为抗原交叉提呈细胞，检测了可降解PEI作为抗原载体与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈作用、细胞毒性以及体内抗肿瘤效果。

Description

一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原疫苗载体的用途

技术领域

本发明涉及分子药剂学技术领域中的肿瘤免疫治疗方向，具体涉及一种交联型聚乙烯亚胺作为蛋白抗原疫苗载体的用途。

背景技术

肿瘤疫苗是目前肿瘤免疫治疗的重要手段。肿瘤疫苗是通过激活自身免疫系统，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，从而阻止肿瘤的生长、扩散和复发，最终清除或控制肿瘤。研究开发出安全性好且能够有效刺激机体细胞免疫和体液免疫的疫苗及其载体和佐剂是绝大多数疫苗研发中的关键问题。

肿瘤抗原疫苗的作用机理是采用肿瘤的抗原激活免疫系统，产生特异性细胞免疫，实现抗肿瘤效果。目前，肿瘤抗原疫苗研究的重点是控制抗原在抗原提呈细胞内部的处理过程和其通过MHCI途径进行抗原提呈激活细胞毒性T淋巴细胞，从而产生强大的抗肿瘤效果。

聚合物纳米材料由于其良好的生物安全性和生物可降解性且可保护抗原免受降解等优势而在疫苗载体的研究过程中备受关注。PEI是其重的研究热点，大量的报道证明PEI25KDa是良好的基因载体，但是由于毒性大，限制了它的应用。

利用抗原蛋白在一定条件下带负电的特点，陈剑等人设计了疏水修饰型PEI的新型抗原载体输送系统，带负电的蛋白质和带正电的疏水修饰型PEI以静电作用结合形成纳米粒(参见中国专利CN103059295A)，研究表明，疏水修饰型PEI为基础制备的纳米粒子可以有效提高抗原交叉提呈反应并降低细胞毒性，具有成为治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统的潜力。但疏水性的PEI在体内无法降解，对其进一步的应用具有一定的限制。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原载体的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原载体的应用。本发明所使用的可降解聚乙烯亚胺的合成参照文献(M.A.Gosselin,W.Guo,and R.J.Lee,“Efficientgene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine,”Bioconjugate Chemistry,vol.12,no.6,pp.989–994,2001.)。所使用的交联剂DTBP中含有二硫键，因此形成的可降解PEI中含有氧化还原敏感型的二硫键。谷胱甘肽是体内重要的还原剂，细胞质中谷胱甘肽的含量为(0.5-10)mM，远远高于细胞外的的含量(2-20)μM，因而，含有二硫键的可降解PEI在细胞质中容易被降解从而降低PEI的毒性。

可降解的聚合物高分子作为抗原疫苗载体的另一个优点是复合物纳米粒子制备简单，并且本发明中的采用的聚合物高分子和蛋白抗原具有较强的结合力，可以携带抗原蛋白被抗原提呈细胞识别；最后，本发明中采用的聚合物高分子能够显著降低细胞毒性，是一种优良的载体材料。

作为优选方案，所述肿瘤蛋白为带负电荷的蛋白质。

作为优选方案，是将所述交联型聚乙烯亚胺与肿瘤蛋白抗原制备成复合纳米粒子。

作为优选方案，所述复合纳米粒子的制备方法具体包括如下步骤：

将交联型聚乙烯亚胺和肿瘤蛋白抗原分别配制成交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液；

将所述聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液混合后，通过漩涡、搅拌或振荡的方法混合均匀后，得到复合纳米粒子。

作为优选方案，所述交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液的重量比为(0.1～3)：5。

作为优选方案，所述交联型聚乙烯亚胺溶液是将交联型聚乙烯亚胺溶解于水中得到。

作为优选方案，所述肿瘤蛋白抗原溶液是将肿瘤蛋白抗原溶解于缓冲液中得到。

作为优选方案，所述缓冲液选自PBS、HEPES、生理盐水、Tris、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液中的任一种。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明将其应用在肿瘤抗原疫苗载体方面，以小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)为抗原提呈细胞模型，以RF33.70为靶细胞模型，以OVA作为模型抗原，考查可降解PEI制备复合物纳米粒的抗原交叉提呈效果和细胞毒性以及小鼠体内的抗肿瘤效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1：复合物纳米粒子的原子力显微镜形貌观察图；

图2：放大后的复合物纳米粒子的原子力显微镜形貌观察图；

图3：实施例1中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；

图4：实施例1中可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；

图5：实施例1中肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；

图6：实施例1中小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；

图7：实施例2中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；

图8：实施例2中可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；

图9：实施例2中肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；

图10：实施例2中小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；

图11：实施例3中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；

图12：实施例3可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；

图13：实施例3肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；

图14：实施例3小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中使用小分子量的PEI和DTBP合成的含有亚胺键的可降解PEI作为抗原载体材料，合成方法参见文献(M.A.Gosselin,W.Guo,and R.J.Lee,“Efficientgene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine,”Bioconjugate Chemistry,vol.12,no.6,pp.989–994,2001.)。

本实施例的复合物纳米粒子的制备具体步骤如下：

1、将PEI和DTBP交联形成含有二硫键的可降解PEI的分子量为1000Da的聚合物高分子(以下称PEI-DS)溶解于ddH₂O中，配成0.2mg/mL的储备液；将OVA用pH7.4的10mM HEPES的缓冲液配成5mg/mL的储备液；

2、涡旋条件下将同等体积的5mg/mL的OVA溶液加入到0.2mg/mL的PEI-DS溶液中，使其混合均匀，得到复合物纳米粒子。

本实施例的实施效果如下：

1、复合物纳米粒子的粒径和电位检测

吸取制备所得的复合物纳米粒子，稀释后加入到粒径检测池中，检测粒径结果为301nm。将激光粒度仪用Zata电位标准样品校准，用ddH₂O将检测池冲洗干净后，将稀释好的复合物纳米粒子分散液注入电位检测池进行电位检测检测结果为-13.7mv。

2、用AFM观察PEI-DS/OVA复合物纳米粒子的形貌

将新鲜制备聚合物/OVA复合物纳米粒，用超纯水稀释；将云母片剥离开，取少量稀释后的样品滴加到云母片新剥离的面上，静置自然晾干后，将云母片放入AFM进行观察形貌。图1显示为复合物纳米粒子的形貌，图2为放大以后观察到的复合物纳米粒子的形貌。

3、可降解PEI的细胞毒性实验的操作

将培养6天的DC细胞收集，离心；采用RPMI1640重悬细胞后，

计数铺96孔板，阴性组：RPMI1640，OVA组：0.5mg/mL的OVA溶液，实验组：PEI-DS/OVA＝0.2/5，按照30μL/well加入到相应的孔中，每组5个复孔，37℃细胞培养箱中孵育4h后每孔中加入15μLFBS，继续培养；12h后向各孔分别加入10μL的CCK8，37℃孵育1h，450nm波长处检测。结果：所选用的蛋白抗原载体和蛋白OVA制备的纳米粒子较经典的PEI25KDa能够明显提升细胞的存活率，即本发明使用的可降解PEI聚合物高分子材料能够明显降低PEI的细胞毒性。图3为复合物纳米粒的毒性检测结果，可知，活细胞比例较PEI25KDa提高了44％。

4、可降解PEI和OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果

将培养6天的雄性C57/BL6小鼠骨髓源性DC细胞收集，离心，RPMI1640重悬后加入到96孔板中，每孔中加入30μL相应的样品，

培养过夜后向各孔中分别加入RF33.70细胞，培养24h后，用MouseIL-2试剂盒采用酶联免疫吸附法检测IL-2浓度，IL-2浓度越高说明其抗原交叉提呈效果越好。

抗原交叉提呈实验分为四个组，阴性组中加入RPMI1640，OVA组的浓度为0.5mg/mL，PEI/OVA组和PEI-DS/OVA组。结果如图4所示，可知，可降解PEI较经典的PEI25KDa的抗原交叉提呈效果高2倍左右。

5、可降解PEI和OVA形成的复合物纳米粒子的抗肿瘤效果

将6-8W的C57/BL6小鼠皮下种入E.G7-OVA细胞，分为3组：生理盐水组、OVA组合和蛋白疫苗组。各组种入肿瘤7天和14天后分别相应的皮下注入0.9％NaCl、OVA和PEI-DS/OVA0.2/5复合物纳米粒子。向各组分别分别观察7d、14d、21d、28d中肿瘤的体积大小和小鼠的存活数量。

复合物纳米粒子的抗肿瘤效果如图5和图6所示，7天后肿瘤越小效果越好，小鼠存活率越高效果越好。图5中三组结果比较可知，由可降解PEI作为载体材料的复合物纳米粒组的肿瘤体积为300，明显小于OVA组的1700，图6中复合物纳米粒组的小鼠存活率明显高于OVA组，也说明复合物纳米粒具有很好的抗肿瘤效果。

实施例2

本实施例中使用的合成方法同实施例1，不同的是本实施例所用小分子量的PEI的重均分子量为1000Da，所合成的聚合物高分子的重均分子量为50000Da。

按照实施例1同样的方法制备PEI-DS/OVA复合物纳米粒子，测定粒径为280nm，电势为-16mv。细胞毒性实验如图7所示，抗原交叉提呈实验如图8所示。由图可知，所制备的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果是PEI25KDa的3倍相应的活细胞比例提高了51％。

复合物纳米粒子的抗肿瘤效果如图9和图10所示，7天后肿瘤越小效果越好，小鼠存活率越高效果越好。图9中三组结果比较可知，由可降解PEI作为载体材料的复合物纳米粒组的肿瘤体积在第七天后逐渐减小，在第28天是肿瘤体积为550mm³，明显小于OVA组的1000mm³和生理盐水组的1700mm³，图10中复合物纳米粒组的小鼠在第30天仍然具有20％的存活率，也说明复合物纳米粒具有很好的抗肿瘤效果。

实施例3

本实施例中使用的合成方法同实施例1，不同的是本实施例所用小分子量的PEI的重均分子量为2000Da，所合成的聚合物高分子的重均分子量为100000Da。

按照实施例1同样的方法制备PEI-DS/OVA复合物纳米粒子，测定粒径为280nm，电势为-16mv。细胞毒性实验如图11所示，抗原交叉提呈实验如图12所示。由图可知，所制备的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果较PEI25KDa提高了3.7倍，相应的活细胞比例提高了54％。

复合物纳米粒子的抗肿瘤效果如图13和图14所示，7天后肿瘤越小效果越好，小鼠存活率越高效果越好。图13中三组结果比较可知，由可降解PEI作为载体材料的复合物纳米粒组的抗肿瘤效果显著，图14中复合物纳米粒组的小鼠存活率明显高于其他两组，也说明复合物纳米粒具有很好的抗肿瘤效果。

Claims (8)

1.一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原疫苗载体的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤蛋白为带负电荷的蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，是将所述交联型聚乙烯亚胺与肿瘤蛋白抗原制备成复合纳米粒子。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述复合纳米粒子的制备方法具体包括如下步骤：

将交联型聚乙烯亚胺和肿瘤蛋白抗原分别配制成交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液；

将所述聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液混合后，通过漩涡、搅拌或振荡的方法混合均匀后，得到复合纳米粒子。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液的重量比为(0.1～3)：5。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述交联型聚乙烯亚胺溶液是将交联型聚乙烯亚胺溶解于水中得到。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肿瘤蛋白抗原溶液是将肿瘤蛋白抗原溶解于缓冲液中得到。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述缓冲液选自PBS、HEPES、生理盐水、Tris、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液中的任一种。