CN114395126A

CN114395126A - 一种聚乙烯亚胺衍生物及其在制备免疫佐剂中的应用

Info

Publication number: CN114395126A
Application number: CN202210064749.7A
Authority: CN
Inventors: 孙敏捷; 杨若熙; 周占威
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2042-01-20
Also published as: CN114395126B

Abstract

本发明公开了一种聚乙烯亚胺衍生物及其在制备免疫佐剂中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过Schiff碱反应将芳基醛修饰在聚乙烯亚胺上制成聚乙烯亚胺衍生物，并进一步将该聚乙烯亚胺衍生物制成具有功能性的纳米佐剂。该纳米佐剂可通过促进DC细胞的成熟和对抗原的吞噬，有效的促进细胞毒性T细胞的激活；在与化药联用后，还可在增强化药免疫效力的同时减轻其系统性毒性，有效实现肿瘤杀伤。

Description

一种聚乙烯亚胺衍生物及其在制备免疫佐剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种聚乙烯亚胺衍生物及其在制备免疫佐剂中的应用。

背景技术

随着免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）和嵌合抗原受体T 细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR-T）在临床试验中取得成功，肿瘤免疫疗法这种新兴的癌症治疗方式随即成为研究的热点。肿瘤免疫治疗是通过激活机体自身免疫系统，从而抑制肿瘤生长并消除肿瘤的一种治疗方法。目前，肿瘤免疫疗法的受众多为肿瘤抗原表位较为确定的患者，而对于肿瘤突变率高、抗原难以获取的患者群体，免疫治疗仍然存在一定困难。在免疫治疗方法中，通常可通过治疗原位肿瘤从而激活全身的免疫反应，对远端肿瘤产生治疗效应。与传统的静脉注射免疫检查点抑制剂的治疗方式不同，这种局部的免疫治疗方式通过原位激活免疫系统，从而避免产生全身性的不良反应。

产生有效的局部免疫治疗需包括以下几个关键环节：1）原位产生肿瘤相关抗原（Tumor Associated Antigens, TAA）；2）募集并激活抗原递呈细胞（Antigen PresentingCell, APC）；3）抗原递呈细胞迁移至淋巴结并将相关抗原递呈给免疫细胞；4）免疫细胞激活并浸润肿瘤微环境、杀伤肿瘤细胞。近些年来许多研究指出，化疗药物如阿霉素、紫杉醇和奥沙利铂等能够诱导产生免疫原性细胞死亡（Immunological Cell Death, ICD），这种特殊的细胞死亡途径通过释放损伤相关模式分子（Damage Associated MolecularPatens, DAMPs）和肿瘤相关抗原来促进树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）的成熟和抗原递呈能力，从而启动机体的抗肿瘤免疫应答。然而在大多数情况下，仅通过诱导ICD不能引起机体产生强烈的免疫应答，其结果往往导致肿瘤不能完全清除而产生复发和转移。因此开发一种增强化疗的免疫效力同时减少其系统性毒性的免疫佐剂，为肿瘤免疫治疗提供了一种新思路。通过在肿瘤周围局部注射免疫佐剂的方式，在肿瘤细胞中促进其表面钙网蛋白（Calreticulin, CRT）的暴露来增强DC细胞的吞噬，在DC细胞中促进其成熟来刺激细胞毒性T细胞，从而产生强烈的机体免疫应答。

聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）是一种常用的高分子材料，由于其伯氨基侧链易于带正电，能和带负电的基因、蛋白质形成稳定的纳米粒从而保护其在血液循环中不被降解，因此常作为基因和蛋白质的胞内递送载体。在被摄取入胞后，溶酶体的酸性环境使得PEI的氨基侧链大量捕获质子，导致大量的氯离子内流，溶酶体因渗透压升高而胀破，促使纳米粒的溶酶体逃逸。

发明内容

本发明的目的是提供一种疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物，通过Schiff碱反应将芳基醛修饰在PEI链上，制备得到具有免疫佐剂效力的聚乙烯亚胺衍生物纳米佐剂。该纳米佐剂与化药联用后，可在增强化药免疫效力的同时减轻其系统性毒性，可有效实现肿瘤杀伤。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种聚乙烯亚胺衍生物，其结构式如式（Ⅰ）所示：

；

其中：n为5~60中的任一自然数，x为小于n的正整数，R为芳基醛。

进一步地，n为10~50中的任一自然数，R为烃链含有1~7个碳原子的芳基醛。

上述聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将聚乙烯亚胺溶解于无水干燥的有机溶剂中；

具体地：聚乙烯亚胺的浓度为1~250mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；优选地：聚乙烯亚胺的溶度为80~120mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇或乙醇；

步骤2，将含有2~3个碳原子烃链的芳基醛溶解于有机溶剂中；

具体地：含有2~3个碳原子烃链的芳基醛的浓度为1~250mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；优选地：含有2~3个碳原子的芳基醛的浓度为80~120mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇或乙醇；

步骤3，将步骤2的溶液加至步骤1的溶液中，于20~50℃下反应4~24h，减压蒸馏除去有机溶剂，干燥后即可得到所述聚乙烯亚胺衍生物；

具体地：聚乙烯亚胺和含有2~3个碳原子烃链的芳基醛的质量比为20~200:20~150；反应时间为4~12h；优选地：聚乙烯亚胺和含有2~3个碳原子烃链的芳基醛的质量比为：100~150:50~10，反应时间为6~10h。

上述聚乙烯亚胺衍生物在制备免疫佐剂中的应用。

具体地：所述免疫佐剂，通过以下步骤制备得到：

步骤1，将上述聚乙烯亚胺衍生物溶解于无水乙醇中；

步骤2，将步骤1得到的溶液滴加入水相中，并在滴加的过程中不断搅拌，全部滴完后继续搅拌，制备得到聚乙烯亚胺衍生物纳米粒的粗品溶液；

步骤3，将步骤2得到的粗品溶液进行透析，得到芳基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒溶液，即为所述免疫佐剂。

具体地，步骤2中的水相为水、PBS、HEPES、生理盐水的任一种；最优选：HEPES缓冲液浓度为15~25mM，pH为6.0~9.0；PBS缓冲液pH为6.0~9.0。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明制备的聚乙烯亚胺衍生物结构简单、易于合成；

(2)本发明制备的聚乙烯亚胺衍生物作为免疫佐剂对于正常细胞具有较低细胞毒性，显示出其良好的生物安全性；且与化药联用后，可减少化药的给药剂量，从而降低化疗的全身毒性。

(3)本发明制备的聚乙烯亚胺衍生物作为免疫佐剂能在高效促进树突状细胞成熟的同时，显著提高肿瘤细胞表面钙网蛋白的表达水平，有助于提高免疫治疗效果。说明是一种优良的纳米佐剂，具有潜在医用前景。

附图说明

图1为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物的制备示意图。

图2为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物的核磁共振氢谱图。

图3为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒的粒径分布（A）及透射电镜（B）。

图4为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒的粒径稳定性图。

图5为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒对不同细胞的细胞毒性图。

图6为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒促进树突状细胞成熟的流式图。

图7为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒促进肿瘤细胞表面钙网蛋白暴露的流式图。

图8为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒与化药联用后的肿瘤细胞与树突状细胞共孵育的流式图。

图9为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒与不同化药联用后的细胞毒性图。

图10为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物制备示意图。

图11为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物的核磁共振氢谱图。

图12为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒的粒径分布图。

图13为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒对树突状细胞的细胞毒性图。

图14为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒促进树突状细胞成熟的流式图。

图15为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒培养后的肿瘤细胞与树突状细胞共孵育的流式图。

图16为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒与化药联用后的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

（1）取100mg分子量为1.8k的聚乙烯亚胺和100mg肉桂醛分别加入装有2 mL无水乙醇的10 mL西林瓶中，分别得到聚乙烯亚胺乙醇溶液和肉桂醛乙醇溶液。

（2）将步骤（1）获得的肉桂醛乙醇溶液缓慢滴入装有聚乙烯亚胺乙醇溶液的西林瓶中，室温下磁力搅拌反应8小时，得到反应液。

（3）将步骤（2）获得的反应液加入到100毫升单口圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，无水乙醇洗涤两遍，然后在真空干燥箱中干燥过夜，得到淡黄色固体即肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物。

（4）将步骤（3）获得的肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶解于2 mL 无水乙醇中，得到肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶液。

（5）将步骤（4）获得的肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物的有机溶液逐滴加入4 mL水溶液中，并在滴加的过程中不断搅拌，全部滴完后再搅拌15~30分钟，制备得到肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒粗品溶液。

（6）将步骤（5）获得的肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒溶液用分子量为3500的透析袋透析5小时，每隔2小时换一次去离子水，得到肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒溶液。

图1为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物制备及结构的示意图。

由图2可知聚乙烯亚胺（PEI）的¹H NMR谱图显示在δ=2.2-2.9的峰归属为聚乙烯亚胺长链上的亚甲基峰；肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺（PEI-Cin）的¹H NMR谱图显示在δ=7.0-7.5处出现一个新的质子峰，归属于肉桂醛苯环上的氢。结果证明本实例制备合成的产物为肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物。

由图3可看出所述制备的纳米粒是平均粒径为175nm左右，多分散系数PdI为0.112±0.032的球形粒子。通过透射电镜可直接观察到其为粒径均一的类球型结构。

由图4可以看出，通过动态光散射测出纳米粒在水、PBS、RPMI-1640培养基（1640）和5mM葡萄糖溶液（GLU）中粒径不会发生明显变化，说明制得的纳米粒具有良好的稳定性。

通过MTT法评价了纳米粒对于不同细胞的细胞毒性。由图5可看出所述制备的纳米粒对小鼠乳腺癌细胞4T1的毒性最强，其IC₅₀值为16.00 μg/mL。对正常细胞小鼠上皮样成纤维细胞L929和人脐静脉内皮细胞HUVEC的毒性次之，其IC₅₀值分别为25.37 μg/mL和26.41 μg/mL。对小鼠骨髓来源树突状细胞DC的毒性最弱，其IC₅₀值为35.19 μg/mL。可看出肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒对肿瘤细胞会产生一定的特异性杀伤。

通过流式细胞仪检测，经过纳米粒处理后的树突状细胞表面标志物表达情况，采用CD80和CD86两种抗体作为评价DC细胞成熟的标志物，对CD80⁺和CD86⁺双阳性DC细胞进行定量分析。由图6可看出与对照组相比，游离的聚乙烯亚胺（PEI）和肉桂醛（Cin）并不能促进DC细胞成熟，而所述制备的纳米粒（PC）能够高效促进DC细胞成熟，其成熟百分比为78.3%。且所述纳米粒促进DC细胞成熟具有一定的浓度依赖性。

通过流式细胞仪分析了不同给药组处理后的4T1小鼠乳腺癌细胞，其中阳性门内细胞数目越多表示其表面CRT暴露越显著。由图7可看出所述制备的纳米粒（PC）可诱导产生76.6%的CRT阳性细胞，表现出明显促CRT暴露效果。与化疗阿霉素DOX联用后，CRT阳性细胞增多至91.5%。可见，所述制备的纳米粒能够很好地与化疗联用，发挥更优异的治疗效果。

在4T1细胞经过不同处理12h后，将其与DC细胞进行共孵育。通过流式细胞仪检测DC细胞的成熟情况。由图中可看出与各对照组相比，纳米粒（PC）与化药（DOX）联用组能够有效诱导DC细胞成熟，其成熟百分比为60.7%。进一步证实肉桂醛修饰的聚乙烯亚胺是促进DC细胞成熟的优良佐剂。

通过MTT法评价了与化疗药物联用后，不同浓度的纳米粒对于肿瘤细胞的细胞毒性。由图9中A可看出，阿霉素（DOX）在浓度为2.5 μg/mL时细胞毒性约为79.5%，而与10 μg/mL纳米粒（PEI-Cin）联用后，显著增强了阿霉素的杀伤效果，细胞毒性降低至34.5%。由图9中B可看出，紫杉醇（PTX）在浓度为10 μM时细胞毒性约为71.6%，而与5 μg/mL纳米粒（PEI-Cin）联用后显著增效其杀伤能力，细胞毒性降低至33.6%。可见，纳米粒与化疗具有协同作用，联用后能显著增强其杀伤肿瘤细胞的能力。

实施例2

（1）取100mg分子量为1.8k的聚乙烯亚胺和100 mg 3-苯基丙醛分别加入装有2 mL无水乙醇的10 mL西林瓶中，分别得到聚乙烯亚胺乙醇溶液和3-苯基丙醛乙醇溶液。

（2）将步骤（1）获得的3-苯基丙醛乙醇溶液缓慢滴入装有聚乙烯亚胺乙醇溶液的西林瓶中，室温下磁力搅拌反应6小时，得到反应液。

（3）将步骤（2）获得的反应液加入到100毫升单口圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，无水乙醇洗涤两遍，然后在真空干燥箱中干燥过夜，得到白色固体即3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物。

（4）将步骤（3）获得的3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶解于2 mL 无水乙醇中，得到3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶液。

（5）将步骤（4）获得的3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物的有机溶液逐滴加入4mL水溶液中，并在滴加的过程中不断搅拌，全部滴完后再搅拌15~30分钟，制备得到3-苯基丙醛饰的聚乙烯亚胺纳米粒粗品溶液。

（6）将步骤（5）获得的3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒溶液用分子量为3500的透析袋透析5小时，每隔2小时换一次去离子水，得到3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒溶液。

图10为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物制备的示意图。

由图11可看出聚乙烯亚胺（PEI）的¹H NMR谱图显示在δ=2.0-3.0的峰归属为聚乙烯亚胺长链上的亚甲基峰。3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺（PEI-HCin）的¹H NMR谱图显示在δ=7.0-8.0 处出现一个新的质子峰，归属于3-苯基醛苯环上的氢。结果证明本实例制备合成的产物为3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺衍生物。

由图12可看出所述制备的纳米粒平均粒径为175nm左右，多分散系数PdI为0.112±0.032的球形粒子。

通过MTT法评价了3-苯基丙醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒对于树突状细胞的细胞毒性。由图13中可看出所述制备的纳米粒对小鼠骨髓来源树突状细胞的毒性，在纳米粒浓度为15μg/ml时，仍有59.5%的细胞活力。说明3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒在给药剂量下对于DC细胞的安全性良好。

通过流式细胞仪检测，经过纳米粒处理后的DC细胞表面标志物表达情况。本实验采用CD80和CD86两种抗体作为评价DC细胞成熟的标志物。对CD80⁺和CD86⁺双阳性DC细胞进行定量分析。由图14中可看出与对照组相比，游离的聚乙烯亚胺（PEI）和3-苯基醛（HCin）并不能促进DC细胞成熟，CD80⁺和CD86⁺双阳性DC细胞仅占3.86%和4.05%。而所述制备的纳米粒（PEI-HCin）能够促进DC细胞成熟，其成熟百分比为27%。

在4T1细胞经过处理12h后，将其与DC细胞进行共孵育，通过流式细胞仪检测DC细胞的成熟情况。由15图可看出与各对照组相比，纳米粒（PHC）与化药（DOX）联用组能够有效诱导DC细胞成熟，其成熟百分比可达30.9%。进一步证实3-苯基醛修饰的聚乙烯亚胺纳米粒是促进DC细胞成熟的优良佐剂。

通过MTT法评价了与化药联用后，不同浓度的纳米粒对于肿瘤细胞的细胞毒性，选择临床常见的阿霉素作为模型化药进行给药。由图16可看出，阿霉素（DOX）在浓度为2.5 μg/mL时细胞毒性约为87.7%，而与20 μg/mL纳米粒（PEI-HCin）联用后，显著增强了阿霉素的杀伤效果，细胞毒性降低至35.8%。可见，纳米粒与化疗药物具有协同作用，联用后能显著增强其杀伤肿瘤细胞的能力。

Claims

1.一种聚乙烯亚胺衍生物，其结构式如式（Ⅰ）所示：

2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于：n为10~50中的任一自然数，R为烃链含有1~7个碳原子的芳基醛。

3.权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，将聚乙烯亚胺溶解于无水干燥的有机溶剂中，聚乙烯亚胺的浓度为1~250mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；

步骤2，将含有2~3个碳原子烃链的芳基醛溶解于有机溶剂中，含有2~3个碳原子烃链的芳基醛的浓度为1~250mg/mL，有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；

步骤3，将步骤2的溶液加至步骤1的溶液中，于20~50℃下反应4~24h，减压蒸馏除去有机溶剂，干燥后即可得到所述聚乙烯亚胺衍生物，聚乙烯亚胺和含有2~3个碳原子烃链的芳基醛的质量比为20~200:20~150。

4.权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺衍生物在制备免疫佐剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述免疫佐剂通过以下步骤制备得到：

步骤1，将权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺衍生物溶解于无水乙醇中；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤2中的水相为水、PBS、HEPES或生理盐水的任一种。

7.一种肿瘤治疗药物，其特征在于：原料包括权利要求1或2所述的聚乙烯亚胺衍生物。