CN114191550A - 一种自携氧纳米光敏制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自携氧纳米光敏制剂及其制备方法和应用，属于医药技术领域。所述制剂由两亲性光敏聚合物包载具有载氧能力的氟碳类化合物制成；所述两亲性光敏聚合物为光敏剂改性的二嵌段共聚物，所述光敏剂选自吲哚菁绿、二氢卟吩衍生物、叶绿素或血红素；所述具有载氧能力的氟碳类化合物选自全氟己烷、全氟戊烷、全氟萘烷、全氟癸烷或全氟溴辛烷。本发明的自携氧纳米光敏制剂可以通过自身输送氧气至肿瘤部位显著改善肿瘤的氧气水平，增强光动力的杀伤作用；同时将该制剂与细胞线粒体呼吸抑制剂联合应用，可进一步改善肿瘤乏氧水平，显著提高光动力在乏氧区域的治疗效果。

Description

一种自携氧纳米光敏制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种自携氧纳米光敏制剂及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法作为临床方法已被证明是治疗多种局部和浅表性癌症的有效选择。其基本原理是利用特定波长的光照射特定部位的光敏剂使其吸收光能跃迁至激发态，再从激发态返回至基态的过程中将能量传递给周围的分子氧，从而产生大量具有杀伤作用的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），从而杀伤肿瘤细胞。与传统的治疗方式相比，光动力疗法具有选择性高、毒副作用小的特点，在近几十年中的研究中受到广泛关注。
光动力的治疗效果强烈依赖于氧气，只有当氧气充足的情况下才能产生足够的活性氧发挥杀伤作用。但是实体肿瘤通常具有乏氧区域，最初由于无血管原发性肿瘤或转移中的氧扩散限制引起，之后由于肿瘤混乱的血管网络、不稳定的血流等原因造成持续性乏氧。同时光动力治疗过程中也会大量消耗氧气，进一步加剧乏氧。因此，通过自携氧的设计，主动运输氧气至乏氧部位，可以有效缓解肿瘤乏氧，增强光动力治疗效果。同时与细胞线粒体呼吸抑制剂进行联合应用，从主动供应和减少内耗两方面解决乏氧问题，进一步增强光动力治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强光动力治疗效果的自携氧纳米光敏制剂，利用两亲性光敏聚合物载体材料和具有溶解氧能力的氟碳类化合物简便快捷的制备该制剂，主动运载氧气，并与细胞线粒体呼吸抑制剂联合应用，缓解肿瘤乏氧，增强乏氧肿瘤光动力治疗效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种自携氧纳米光敏制剂，所述制剂由两亲性光敏聚合物包载具有载氧能力的氟碳类化合物制成；所述两亲性光敏聚合物为光敏剂改性的二嵌段共聚物，所述光敏剂选自吲哚菁绿、二氢卟吩衍生物、叶绿素或血红素。
进一步地，所述两亲性光敏聚合物的结构式如下式所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
其中m=9-35，n=1-10。
进一步地，所述具有载氧能力的氟碳类化合物选自全氟己烷、全氟戊烷、全氟萘烷、全氟癸烷或全氟溴辛烷。
上述自携氧纳米光敏制剂的制备方法，是将两亲性光敏聚合物溶于有机溶剂后加入水中，之后加入具有载氧能力的氟碳类化合物，通过超声乳化即可得到自携氧纳米光敏制剂。
上述自携氧纳米光敏制剂在制备用于缓解乏氧的光动力治疗药物中的应用。
上述自携氧纳米光敏制剂与细胞线粒体呼吸抑制剂联用在制备用于缓解乏氧的光动力治疗药物中的应用。
进一步地，所述细胞线粒体呼吸抑制剂选自双胍类药物、阿托伐醌、吡唑醚菌酯、小檗碱、伊利替康或氨茶碱。
上述自携氧纳米光敏制剂在使用前需鼓吹氧气以充分携带氧气。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明创新性的设计了自携氧纳米光敏制剂，构建两亲性光敏聚合物，通过超声乳化法包载具有溶解氧能力的氟碳类化合物，主动运输氧气至肿瘤部乏氧位，并进一步与细胞线粒体呼吸抑制剂联合应用，共缓解乏氧，增强乏氧肿瘤光动力治疗效果。该制剂的制备过程简易，稳定性和生物相容性良好，通过与临床用药相结合的方式，更安全有效的增强治疗效果。由前期结果可见，该制剂及其与细胞线粒体呼吸抑制剂的联合应用能够显著改善光动力治疗的效果，可用于多种乏氧性实体肿瘤和缺氧相关疾病的治疗，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明中两亲性光敏聚合物材料PEG-Poly(Ser-Ce6)的合成路线。
图2为本发明中两亲性光敏聚合物材料PEG-Poly(Ser-Ce6)的核磁共振氢谱图。
图3为本发明中纳米制剂（PSCe6-PFH）的制备示意图。
图4为本发明中所制备的纳米制剂（PSCe6-PFH）的透射电镜图。
图5为本发明中所制备的纳米制剂（PSCe6-PFH）的粒径分布图。
图6为本发明中所制备的纳米制剂（PSCe6-PFH）的紫外吸收效果图。
图7为本发明中所制备的纳米制剂在脱氧的情况下溶解氧的含量变化。
图8为本发明中所制备的纳米制剂在常氧和模拟肿瘤缺氧条件下的ROS产生情况。
图9为本发明中所制备的纳米制剂在常氧（21% O2）和模拟肿瘤缺氧（1% O2）条件下的细胞毒性检测。
图10为本发明中所制备的纳米制剂以及与细胞线粒体呼吸抑制剂的联合应用调节细胞乏氧诱导因子HIF-1α的表达效果图。
图11为本发明中所制备的纳米制剂以及与细胞线粒体呼吸抑制剂的联合应用的药效学评价结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
两亲性光敏聚合物材料PEG-Poly(Ser-Ce6)的合成
步骤1，O-乙酰-L-丝氨酸-N-羧基酐的合成：将5 g O-乙酰-L-丝氨酸-盐酸盐分散在200 mL无水四氢呋喃中。将3.92 g三光气溶解于少量无水四氢呋喃中，然后加入到搅拌的O-乙酰-L-丝氨酸-盐酸盐溶液中，在48 ℃油浴中搅拌2小时。待反应澄清后，关闭温度控制，使反应冷却至室温。通过抽真空旋转蒸发除去溶剂，然后利用硅胶柱进行产物纯化。硅胶提前在140 ℃下真空干燥12小时备用，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯（体积比为2：1然后为1：1），旋蒸后得到淡黄色油状产物O-乙酰-L-丝氨酸-N-羧基酐。
步骤2，将0.389 g PEG2000-NH2溶于30 mL无水二甲基亚砜中，然后把得到的O-乙酰-L-丝氨酸-N-羧基酐加入搅拌的PEG2000-NH2溶液中，在35℃氮气保护下搅拌48小时，每隔4-6小时用油泵抽去反应产生的副产物CO2。反应完毕后进行乙醚沉淀，离心后弃去上层乙醚，将下层油状沉淀物缓慢滴加到35 mL水中，通过旋蒸除去残留乙醚。
步骤3，PEG-PolySerine的合成：将1.3 g氢氧化锂加入到上一步反应获得的淡黄色油状沉淀物水溶液中，室温下搅拌1.5小时。待溶液反应至澄清后，调节溶液pH为中性，将反应混合物在透析袋（MWCO 1000 Da）中用蒸馏水透析48小时，冻干后获得PEG-PolySerine。
步骤4，PEG-Poly(Ser-Ce6)的合成：将125 mg二氢卟吩e6（Ce6），48.3 mg EDCI，30.8 mg DMAP溶于10 mL无水二甲基亚砜中，在氮气保护下避光搅拌30分钟。将250 mgPEG-PolySerine溶于10mL 无水二甲基亚砜中并快速加入上述的混合溶液中，继续避光室温下搅拌24小时。将反应混合物在透析袋（MWCO 3500 Da）中用蒸馏水透析3天，冻干后获得PEG-Poly(Ser-Ce6)。
图1为本实施例中两亲性光敏聚合物材料PEG-Poly(Ser-Ce6)的合成路线。
图2为聚合物材料的核磁共振氢谱图。图2A为PEG-PolySerine的1H-NMR谱图，特征峰的归属如图所示，其中峰（4.50 ppm，br）和（3.88 ppm，s）表征了-NHCO-CHCH2-，证明丝氨酸在氨基PEG上的成功聚合；图2B为PEG-Poly(Ser-Ce6)的1H-NMR谱图，其中低场峰5-9都是Ce6的特征峰，并且未接Ce6的聚合物水溶性很好，而修饰Ce6后，材料变成两亲性，证明PEG-PolySerine主链的Ce6修饰成功，合成PEG-Poly(Ser-Ce6)。
实施例2
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）的制备和性质表征
利用超声乳化法制备纳米颗粒。称取一定量的PSCe6即PEG-Poly(Ser-Ce6)溶于四氢呋喃中，制备成1mg/mL的溶液，离心（5000 rpm, 10 min）后取上清液备用。将1mL PSCe6溶液缓慢加入到搅拌的4 mL去离子水中。然后加入20 µL全氟己烷（PFH）并超声乳化，超声功率为30%，时间为40分钟，每超声1 s暂停2 s。超声后的溶液用蒸馏水透析（MWCO 3500Da）24小时，获得PSCe6-PFH，在4℃条件下保存。由于PFH具有携氧能力，因此使用前通过导管连接氧气瓶，对PSCe6-PFH溶液鼓吹氧气15分钟，制备成自携氧纳米光敏制剂PSCe6-PFH。
制备过程中不加入PFH，制备方法与PSCe6-PFH 相同，制得PSCe6。
图3为本发明中所制备的纳米制剂（PSCe6-PFH）的示意图。
图4为本实施例中所制备的纳米粒PSCe6-PFH的透射电镜图（比例尺=100 nm），显示为规整的球形核-壳结构。
图5为本实施例中所制备的纳米粒的粒径分布图。PSCe6-PFH的平均粒径粒径为171.6 nm，与透射电镜结果一致，未包载PFH的PSCe6的平均粒径为122.7 nm，说明包载PFH后，纳米颗粒的尺寸略微增大。
图6为本实施例中所制备的纳米粒的紫外吸收效果图。PSCe6-PFH与PSCe6分别在405 nm和660 nm处出现特征吸收，与Ce6的特征吸收峰基本重叠，表明制剂的成功制备和可被近红外光激活产生ROS的性质。
实施例3
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）在脱氧溶液中溶解氧的含量变化
用笔式溶解氧检测仪检测溶解氧（Dissolve Oxygen, DO）含量。首先用氮气鼓吹西林瓶中的蒸馏水30分钟制得脱氧水，用溶解氧检测仪检测溶液中溶解氧的含量，每5 s记录一次，共记录600 s，整个过程中将瓶口其余部分进行密封，创造无氧条件，作为空白对照组。通过导管连接氧气瓶对PSCe6-PFH、PSCe6和蒸馏水分别鼓吹氧气15分钟后，各取1mL注入上述西林瓶中，以相同的方法用溶解氧检测仪检测溶液中溶解氧的含量。
图7为所制备的纳米粒在脱氧的情况下溶解氧的含量变化。可以看出PSCe6-PFH组具有更高的溶解氧能力且可以维持较长时间。
实施例4
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）在常氧和模拟肿瘤缺氧条件下的ROS产生情况
利用DPBF作为ROS检测剂，模拟常氧和乏氧两种条件下制剂的产生ROS能力。常氧条件下，将DPBF的乙醇溶液（6 μL, 5 mM）分别与水以及游离Ce6、PSCe6和PSCe6-PFH的水溶液（3 mL，5 μM Ce6）混合，置于敞开的比色皿中，用650nm的激光（15 mW/cm2）在60 s内每隔5 s照射一次，检测混合溶液在410 nm处的紫外吸收。为了模拟乏氧条件，利用氮气对比色皿中的水进行鼓吹排氧并进行封口，分别将游离Ce6、PSCe6和PSCe6-PFH注入比色皿中，控制Ce6浓度为5 μM，然后注入DPBF的乙醇溶液（6 μL, 5 mM）。之后以相同的激光照射方法和检测方法进行检测。
图8为常氧和乏氧条件下不同制剂的ROS产生情况，可以看出PSCe6-PFH在常氧和乏氧条件下均表现出最高的ROS水平，且在乏氧条件下，游离的Ce6和PSCe6几乎无法产生ROS，表明ROS的生成依赖于氧气，而PSCe6-PFH通过自携氧的方式可以显著提高ROS的产生量。
实施例5
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）的体外毒性检测
将4T1细胞以4×104个/孔的密度接种于96孔细胞板中，分别置于37℃和5%CO2的普通二氧化碳培养箱和控制氧气浓度为1%的三气培养箱中进行常氧和缺氧培养24h后，弃去原来的培养基，用不完全RPMI-1640培养基配置不同浓度梯度的PSCe6-PFH与PSCe6，与4T1细胞孵育12小时，然后弃去含药培养基，换成新鲜的不完全培养基，光照组使用650 nm激光（2.5 mW/cm2）照射细胞5分钟。光照后再培养4小时，加入MTT，孵育4小时后，加入二甲基亚砜溶解结晶，使用酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算细胞活力%。
图9为制备的纳米粒在常氧（21% O2）和模拟肿瘤缺氧（1% O2）条件下的细胞毒性检测结果。黑暗组各组的毒性都较小，说明制备的纳米制剂具有较好的生物相容性。光照组中，可以发现，常氧情况下，PSCe6和PSCe6-PFH的细胞杀伤效果几乎没有显著差异，而在缺氧条件下，PSCe6的杀伤性被大幅度削弱，但PSCe6-PFH仍然呈现出较好的细胞杀伤能力，主要原因归于自携氧的性质极大的增强了光动力的治疗效果。
实施例6
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）以及与细胞线粒体呼吸抑制剂二甲双胍（Met）的联合应用以调节细胞乏氧诱导因子HIF-1α的表达
将4T1细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，在乏氧（1% O2）条件下培养24小时，使用不完全RPMI-1640培养基配制Ce6浓度为1 µg/mL、Met浓度为10 mM的PSCe6、PSCe6-PFH、Met、PSCe6-PFH和Met的混合溶液，设置PBS组为空白对照，使用上述稀释后的纳米颗粒与4T1细胞孵育24小时后，将含药培养基吸去，PBS洗涤细胞两遍，每孔加入120 µL RIPA细胞裂解液，在冰上研磨，研磨后收集每孔细胞样品12000 rpm离心15 min，收集上清，利用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测每组样品的蛋白浓度，以最低浓度的蛋白样品为标准，将各组样品配制为同一浓度。在每组样品中加入1/5体积的5×上样缓冲液（loading buffer），将蛋白样品在水浴中煮沸6分钟使蛋白变性。根据HIF-1α目标蛋白分子量，制备分离胶浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，按每孔40 µg蛋白量进行上样，连接电源，在80 V恒压条件下电泳至染料从浓缩胶进入分离胶，时间约为30分钟，进一步调节电压，在120 V恒压条件下电泳至染料到达底部为止。电泳后取出凝胶，将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，在0.35 A恒流条件下转膜1小时。将PVDF膜用5% 脱脂牛奶封闭1.5小时，TBST缓冲液洗膜3次；一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次；加入二抗，在室温条件下平缓摇动，孵育1.5h，TBST缓冲液洗膜3次。将洗涤后的PVDF膜转移入浅口托盘中，滴加显影液，通过天能化学发光成像分析仪进行蛋白条带的采集和拍摄。
图10为PSCe6-PFH与细胞线粒体呼吸抑制剂二甲双胍联合应用对HIF-1α的调节效果图。从中可以看出，PSCe6-PFH和Met的联合治疗组中的HIF-1α表达水平最弱，因此这种方法可以显著缓解细胞的氧气水平。
实施例7
自携氧纳米光敏制剂（PSCe6-PFH）及其与细胞线粒体呼吸抑制剂二甲双胍联合应用的药效学评价
取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1，消化后用无菌PBS稀释成浓度为1×107个/mL的细胞悬液，接种于雌性BALB/c小鼠（5-6周龄、体重18-22g）靠近左腿部的乳房垫中，每只注射100 μL。选取肿瘤长至120 mm3的小鼠随机分为10组，每组5只：生理盐水组、PSCe6组、PSCe6-PFH组、PSCe6+Met组、PSCe6-PFH+ Met组（各组又分为光照组和黑暗组）。Ce6剂量为5 mg/kg，每隔一天注射一次，光照组在静脉注射后的12 h时使用650 nm激光（100 mW/cm2）照射小鼠的肿瘤部位5分钟。Met通过灌胃给药，Met剂量为200 mg/kg，在光照12 h后给药。共治疗15天，通过测定小鼠的肿瘤体积以评价其抗肿瘤的效果。第15天，将小鼠安乐死并收集肿瘤，固定在4%多聚甲醛中。
图11为按照上述方法进行给药后小鼠的肿瘤体积变化情况，可以看出，自携氧纳米光敏制剂与细胞线粒体呼吸抑制剂二甲双胍的联合应用体现出良好的抗肿瘤效果。

Claims (7)

1.一种自携氧纳米光敏制剂，其特征在于：所述制剂由两亲性光敏聚合物包载具有载氧能力的氟碳类化合物制成；
所述两亲性光敏聚合物为光敏剂改性的二嵌段共聚物，所述光敏剂选自吲哚菁绿、二氢卟吩衍生物、叶绿素或血红素。
2.根据权利要求1所述的自携氧纳米光敏制剂，其特征在于：所述两亲性光敏聚合物的结构式如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中m=9-35，n=1-10。
3.根据权利要求1所述的自携氧纳米光敏制剂，其特征在于：所述具有载氧能力的氟碳类化合物选自全氟己烷、全氟戊烷、全氟萘烷、全氟癸烷或全氟溴辛烷。
4.权利要求1所述的自携氧纳米光敏制剂的制备方法，其特征在于：将两亲性光敏聚合物溶于有机溶剂后再加入水中，之后加入具有载氧能力的氟碳类化合物，通过超声乳化即可得到自携氧纳米光敏制剂。
5.权利要求1所述的自携氧纳米光敏制剂在制备用于缓解乏氧的光动力治疗药物中的应用。
6.权利要求1所述的自携氧纳米光敏制剂与细胞线粒体呼吸抑制剂联用在制备用于缓解乏氧的光动力治疗药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述细胞线粒体呼吸抑制剂选自双胍类药物、阿托伐醌、吡唑醚菌酯、小檗碱、伊利替康或氨茶碱。
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