CN112409290B - 一种三苯胺衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三苯胺衍生物及包含该三苯胺衍生物的颗粒、光敏剂、药物组合物、试剂盒及其制备方法和用途等，所述三苯胺衍生物具有选自tTDCR、tTID和tTBCI的化学结构，所述三苯胺衍生物具有聚集诱导发光性能，所述三苯胺衍生物的AIE活性高、安全性好，在抗肿瘤、提高免疫力、成像等方面具有突出的效果。

Description

一种三苯胺衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明生物医药领域，具体涉及具有聚集诱导发光性质的三苯胺衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是指应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤细胞的生长。
在过去的几年中，由于癌症免疫疗法具有利用先天免疫系统攻击肿瘤细胞的能力，因此它已成为一种新兴的治疗技术。然而，在实践中，癌症免疫疗法的功效一直受到肿瘤复杂微环境固有免疫抑制性质的限制。免疫抑制肿瘤微环境的关键驱动因素之一是丰富的肿瘤相关巨噬细胞，它们通过展示免疫抑制(M2)表型和分泌具有抑制性T细胞的促肿瘤细胞因子来促进肿瘤血管生成和转移、激活。新型癌症免疫疗法提供了使用巨噬细胞作为丰富资源的策略，可以将巨噬细胞转换为免疫刺激(M1)表型以释放抗肿瘤细胞因子。因此，对能特异性指导巨噬细胞执行抗肿瘤功能，减轻巨噬细胞抑制并诱导抗肿瘤先天反应的治疗策略仍然有很高的需求。
光动力学治疗(Photodynamic Therapy，PDT)的原理是光敏剂或其代谢产物能选择性聚集于靶组织(肿瘤组织)，在适当波长光的激发下产生光动力反应破坏靶细胞的化学物质。光敏剂分子接受光照，吸收光子的能量，在靶细胞内发生光化学反应，并产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，在PDT中产生的ROS可以从未极化状态(M0表型)或促肿瘤状态(M2表型)重编程为抗肿瘤状态(M1表型)。但是，它也存在免疫抑制和免疫反应有限的问题，仅PDT治疗的最终结果非常不理想，需要与免疫检查点抑制剂或免疫佐剂联合使用以达到相对满意的肿瘤生长抑制能力，但这进一步增加了治疗剂的复杂性。此外，众所周知，光敏剂触发的PDT机制有两种主要类型，它们可产生各种ROS：生成自由基的I型机制和生成单线态氧的II型机制。然而，ROS产生的特征(例如效率和类型)与相应的抗肿瘤免疫应答激活功效之间的关系尚不明确。例如，尚不清楚由不同机制产生的ROS在重新极化巨噬细胞中起什么作用，以及细胞外ROS和细胞内ROS在此过程中的作用。
PDT依赖于在氧存在的情况下由光激活的光敏剂的使用，导致了有毒的单线态氧自由基的产生。因这些有毒的单线态氧自由基会引起的细胞凋亡、坏死和血管损伤导致的组织损害(见例如Noodt BB等人发表在英国期刊Cancer1996；74:22-29中的Apoptosis andnecrosis induced with light and5-aminolaevulinic acid-derived protoporphyrinIX)。说明现有技术中的光敏剂存在一定的毒性，安全性不高。
光动力治疗的关键之一是光敏剂的性能，其中光学性能和产生活性氧团簇(ROS)的性能是重中之重。但目前常用的传统的有机小分荧光光敏剂存在“聚集导致荧光淬灭(Aggregation-caused quenching；ACQ)”，即在溶液中小分子染料的发射荧光会在高浓度和聚集态下发生淬灭。由于荧光材料在纳米探针中通常处于聚集状态，这种ACQ效应限制有机小分子荧光染料在体内的使用浓度，导致它们的实际应用范围变得狭窄。近些年报道的一类具有聚集诱导发光(AIE)能力的光敏剂解决了这一问题，当AIE分子聚集时，分子的内旋运动受到阻碍，从而导致非辐射衰减受到抑制，激发态能量以辐射形式产生强荧光或ROS。然而由于人们对AIE的工作机理知之甚少，以及难处理的分子间π-π堆积使目前开发的具有ROS产生能力的AIE分子的种类有限，尤其是电子受体部分有待开发。
因此，仍然需要研发一种安全性高、抗肿瘤效力高的化合物及其产品。
发明内容
发明概述
本发明的第一个目的是提供一种三苯胺衍生物，其具有选自tTDCR、tTID和tTBCI的化学结构；所述三苯胺衍生物具有所述聚集诱导发光性能，所述三苯胺衍生物的聚集诱导发光活性高，安全性好，具有很强的产生ROS的能力，能显著上调巨噬细胞的TNF-α和IL-12p70的分泌，能显著诱导未极化状态(M0)或促肿瘤状态(M2)诱导为抗肿瘤状态(M1)，以及具有良好肿瘤显像性能和抑菌效果等优点；解决了现有技术中聚集诱导发光和光化学反应种类有限的问题，还解决了现有技术中AIE分子活性低、毒性大、产生ROS能力弱，抗肿瘤能力弱等问题。
本发明的第二个目的是提供一种包含上述三苯胺衍生物的纳米颗粒、光敏剂、药物组合物和试剂盒，它们除了具有所述三苯胺衍生物本身的优点外，还具有在体内的药物动力学好等优点。
本发明的第三个目的是提供制备所述的三苯胺衍生物的方法；所述方法具有操作简单，收率高，环境友好等优点。
本发明的第四个目的是提供制备所述纳米颗粒的方法，所述方法具有操作简单，收率高，环境友好等优点。
发明详述
第一方面，本发明提供一种三苯胺衍生物。
一种三苯胺衍生物，所述三苯胺衍生物具有选自以下tTDCR、tTID或tTBCI的化学结构或其药学上可接受的盐或对映异构体：
Figure GDA0003314872480000021
所述三苯胺衍生物具有聚集诱导发光性能，所述三苯胺衍生物的聚集诱导发光活性高、安全性好，具有很强的产生ROS的能力，同时可通过可以显著上调未极化的巨噬细胞(M0表型)和促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)的TNF-α和IL-12p70的分泌，还可以通过上调p-NF-κB的表达，增加细胞内和细胞外的ROS，和下调CD206的表达，将巨噬细胞从未极化状态(M0)或促肿瘤状态(M2)诱导为抗肿瘤状态(M1)，进而提高免疫力，达到抗肿瘤目的，其中tTDCR NPs的效果最优；另外，所述三苯胺衍生物还具有良好肿瘤显像性能和抑菌效果。在一些优选的实施例中，所述三苯胺衍生物具有选自tTDCR的化学结构。
第二方面，本发明提供一种纳米颗粒。
一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含第一方面所述的三苯胺衍生物。在一些实施例中，所述纳米颗粒包含tTID。在一些实施例中，所述纳米颗粒包含tTDCR。在一些实施例中，所述纳米颗粒包含tTBCI。
所述纳米颗粒的粒径可以为10-100nm，在此粒径范围内，有利于纳米颗粒在生物体内的吸收和分布。在一些实施例中，所述纳米颗粒的粒径为10-70nm。在一些优选的实施例中，所述纳米颗粒的粒径可以为20-50nm，在此范围内，纳米颗粒在生物体内的吸收和分布好。
第三方面，本发明提供一种光敏剂。
一种光敏剂，其包括第一方面所述三苯胺衍生物或第二方面所述的纳米颗粒。
第四方面，本发明提供一种药物组合物。
一种药物组合物，其包括第一方面所述三苯胺衍生物、第二方面所述的纳米颗粒或第三方面所述的光敏剂。
第五方面，本发明提供一种试剂盒。
一种试剂盒，其包括第一方面所述三苯胺衍生物、第二方面所述的纳米颗粒、第三方面所述的光敏剂或第四方面所述的药物组合物。
第六方面，本发明提供上述三苯胺衍生物、颗粒、光敏剂或药物组合物的用途
一种第一方面所述三苯胺衍生物、第二方面所述的纳米颗粒、第三方面所述的光敏剂、第四方面所述的药物组合物或第五方面所述的试剂盒在制备用于以下任一应用的产品上的用途：
(1)将巨噬细胞从未极化状态或促肿瘤状态诱导为抗肿瘤状态；
(2)在细胞内和/或细胞外产生活性氧；
(3)提高促炎细胞因子分泌；
(4)治疗和/或抑制肿瘤；
(5)肿瘤成像；
(6)抑菌。
所述促炎细胞因子可以包括TNF-α或IL-12p70。
所述肿瘤成像是通过实体瘤的高通透性和滞留效应使所述三苯胺衍生物、第二方面所述的纳米颗粒、第三方面所述的光敏剂或第四方面所述的药物组合物在肿瘤部位富集，再通过成像扫描技术检测出富集所述三苯胺衍生物、第二方面所述的纳米颗粒、第三方面所述的光敏剂或第四方面所述的药物组合物的肿瘤。
第七方面，本发明提供一种制备第一方面所述的三苯胺衍生物的方法。
一种制备第一方面所述的三苯胺衍生物的方法，其包括：2-(4-氧代-3-苯基噻唑烷-2-亚甲基)丙二腈、丙二腈茚酮或茚二酮在催化剂和惰性气体存在的条件下，在溶剂中与4-(双(4-(叔丁基)苯基)氨基)苯甲醛发生反应，经后处理，得到所述三苯胺衍生物。
所述溶剂可以包括酸。在一些实施例中，所述溶剂包括选自甲酸、乙酸、丙酸或丁酸中的至少一种。在一些优选的实施例中，所述溶剂为乙酸。
所述催化剂可以包括选自甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵或丁酸铵中的至少一种。在一些优选的实施例中，所述催化剂为乙酸铵。
所述惰性气体可以包括选自氮气或氩气中的至少一种
所述溶剂可以为酸。在一些实施例中，所述溶剂为乙酸。
所述反应的反应温度可以为80℃-150℃。在一些实施例中，所述反应的反应温度为100℃-130℃。在优选的实施例中，所述反应的反应温度为120℃。
所述反应的反应时间可以为5-30小时。在一些实施例中，所述反应的反应时间为8-15小时。在一些优选的实施例中，所述反应的反应时间为12小时。
所述后处理可以包括：冷却至室温，用水淬灭，过滤并洗涤，纯化。
根据本发明的一些实施例，一种制备第一方面所述的三苯胺衍生物的方法，其包括：
Figure GDA0003314872480000041
2-(4-氧代-3-苯基噻唑烷-2-亚甲基)丙二腈在催化剂和惰性气体存在的条件下，在溶剂中与4-(双(4-(叔丁基)苯基)氨基)苯甲醛发生反应，经后处理，得到所述三苯胺衍生物，所述三苯胺衍生物为tTDCR。
根据本发明的一些实施例，一种制备第一方面所述的三苯胺衍生物的方法，其包括：
Figure GDA0003314872480000042
丙二腈茚酮在催化剂和惰性气体存在的条件下，在溶剂中与4-(双(4-(叔丁基)苯基)氨基)苯甲醛发生反应，经后处理，得到所述三苯胺衍生物，所述三苯胺衍生物为tTBCI。
根据本发明的一些实施例，一种制备第一方面所述的三苯胺衍生物的方法，其包括：
Figure GDA0003314872480000051
2-(4-氧代-3-苯基噻唑烷-2-亚甲基)丙二腈、丙二腈茚酮或茚二酮在催化剂和惰性气体存在的条件下，在溶剂中与4-(双(4-(叔丁基)苯基)氨基)苯甲醛发生反应，经后处理，得到所述三苯胺衍生物，所述三苯胺衍生物为tTID。
第八方面，本发明提供一种纳米颗粒的制备方法。
将第一方面所述三苯胺衍生物和辅料与溶剂混合，得到混合物，然后将混合物加入水中，超声，透析，浓缩，得到所述纳米颗粒。所制备得到的纳米颗粒的粒径小，均小于100nm，分布均匀，有利于体内的吸收和分布。
所述溶剂包括选自四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的至少一种。
所述辅料包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-胺、磷脂-聚乙二醇-羧基、磷脂-聚乙二醇-靶向穿膜肽TAT、磷脂-聚乙二醇-环肽或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。
所述水可以为纯化水或超纯水。
根据本发明的一些实施例，将第一方面所述三苯胺衍生物和辅料与溶剂混合，超声，得到混合物，然后将混合物加入水中，超声，用半透膜或透析袋透析1-120小时，再用水透析1-120小时，浓缩，得到所述纳米颗粒；采用本方案所制备得到的纳米颗粒的粒径小，均小于100nm，分布均匀，有利于体内的吸收和分布。
所述半透膜或透析袋的截留分子量可以为10KDa。
根据本发明的一些实施例，一种纳米颗粒的制备方法，将第一方面所述三苯胺衍生物和辅料与溶剂混合，超声，得到混合物，然后将混合物加入水中，超声，用截留分子量为10KDa的半透膜或透析袋透析48小时，再用水透析24小时，浓缩，得到所述纳米颗粒；采用本方案所制备得到的纳米颗粒的粒径小，均小于100nm，分布均匀，有利于体内的吸收和分布。
有益效果
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述tTDCR、tTID和tTBCI均具有很强的活性氧生成能力和AIE效应，其中tTDCR的活性氧生成能力和AIE效应最强，tTID次之，tTBCI较弱，但都比现有技术的光敏剂(如RB和Ce6)要优。
(2)本发明所述tTDCR、tTID和tTBCI在光照和不光照的条件下对正常细胞毒性低，均具有很好的细胞安全性。
(3)本发明所述tTDCR NPs和tTID NPs均可以显著上调未极化的巨噬细胞(M0表型)和促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)的TNF-α和IL-12p70的分泌，进而提高免疫力以及达到抗肿瘤目的；tTDCR NPs和tTID NPs的上调未极化的巨噬细胞(M0表型)和促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)的TNF-α和IL-12p70的分泌的效果均明显优于Ce6和RB。
(4)本发明所述tTDCR NPs上调未极化的巨噬细胞(M0表型)和促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)的TNF-α和IL-12p70的分泌的效果明显优于tTID NPs。
(5)本发明所述tTDCR NPs、tTID NPs和tTBCI NPs均可通过上调NF-κB的磷酸化，诱导未极化的巨噬细胞(M0)和促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)极化为抑肿瘤状态的巨噬细胞(M1表型)，进而提高免疫力以及达到抗肿瘤目的，其中tTDCR NPs的效果最优。
(6)经本发明所述三苯胺衍生物、所述纳米颗粒、所述光敏剂、所述药物组合物或所述试剂盒，和白光照射的治疗，可有效抑制肿瘤的生长，能对杀害肿瘤细胞，增加抑肿瘤状态的巨噬细胞(M1表型)，减少促肿瘤状态的巨噬细胞(M2表型)，提高免疫力，且具有良好的生物安全性，其中包含tTDCR的纳米颗粒、光敏剂、药物组合物或试剂盒的治疗效果最优。
(7)本发明所述三苯胺衍生物、所述纳米颗粒、所述光敏剂、所述药物组合物或所述试剂盒在静脉注射入体内后，可随着时间增加在肿瘤部位富集，在1-72小时内可对对肿瘤部位进行荧光成像，在8-24小时有较优的荧光成像，在12小时时富集量最大，同时荧光信号最强，能够对肿瘤部位进行最好的荧光成像，优选使用包含tTDCR的纳米颗粒、光敏剂、药物组合物或试剂盒。
(8)本发明所提供的制备所述的三苯胺衍生物的方法具有操作简单，收率高，环境友好等优点。
(9)本发明所提供的制备所述纳米颗粒的方法具有操作简单，收率高，环境友好等优点。
附图说明
图1为实施例4中的tTID，tTDCR和tTBCI在四氢呋喃中的归一化紫外可见光谱(UV/Vis，左侧的三条光谱)和光致发光光谱(PL，右侧的三条光谱)。
图2为实施例4中通过TD-DFT，基于四氢呋喃的溶剂化计算的tTID，tTDCR和tTBCI的HOMO-LUMO分布。
图3为实施例6中通过在40mW/cm2的白光照射下，溶解于含99％PBS和1％四氢呋喃混合溶剂的tTID，tTDCR或tTBCI的聚集体在DCFH指示剂的指示下在525nm处的相对发射强度(I/I0-1)随时间变化曲线图。
图4为实施例4中tTID，tTDCR和tTBCI在不同溶剂中的Stokes位移，斜率越大Stokes位移越大。
图5为实施例6中10μM的tTID，tTDCR或tTBCI在不同PBS含量(体积％)的四氢呋喃溶液中，在523nm处的相对发射强度(I/I0-1)随PBS含量(体积％)变化曲线图。
图6为实施例4中tTID，tTDCR和tTBCI在气态状态下检测到的几何结构。
图7为实施例4中在四氢呋喃溶剂中基于TD-DFT计算的tTDCR、tTID和tTBCI的相对能级；其中a图为tTDCR的相对能级计算结果，其中b图为tTID的相对能级计算结果，c图为tTBCI的相对能级计算结果。
图8为实施例4中tTID，tTDCR和tTBCI在水中的荧光衰减测量；其中a图为tTID的荧光衰减测量结果，b图为tTDCR的荧光衰减测量结果；c图为tTBCI的荧光衰减测量结果。
图9为实施例5所制备得到的tTDCR NPs、tTID NPs和tTBCI NPs在水中的粒径分布；其中a图为tTID NPs在水中的粒径分布；b图为tTDCR NPs在水中的粒径分布；c图为tTBCI NPs在水中的粒径分布。
图10为实施例6中含tTID，tTDCR或tTBCI的DCFH在含不同磷酸盐缓冲液含量的四氢呋喃溶剂中，在523nm处的相对发射强度(I/I0-1)随照射时间变化曲线图；其中，图a为tTID的结果，图b为tTDCR的结果，图c为tTBCI的结果。
图11为实施例6和实施例7的测试结果；其中a图为实施例6中含tTDCR NPs、tTIDNPs、tTBCI NPs或Ce6的DCFH在523nm处的相对发射强度(I/I0-1)随时间变化曲线图；b图为实施例7中tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCI NPs或RB的ABDA在379nm处的吸收强度(A/A0)随时间变化曲线图。
图12为实施例8中暗细胞毒性检测组的细胞活力检测结果；其中横轴为tTDCRNPs、tTID NPs、tTBCI NPs、Ce6或RB的加入浓度，单位为μM；纵轴为细胞活力检测结果，为暗细胞毒性检测组的吸光度与正常组的吸光度的比值百分比，control表示正常组。
图13为实施例8中光细胞毒性检测组的细胞活力检测结果；其中横轴为tTDCRNPs、tTID NPs、tTBCI NPs、Ce6或RB的加入浓度，单位为μM；纵轴为细胞活力检测结果，为光细胞毒性检测组的吸光度与正常组的吸光度的比值百分比，control表示正常组。
图14为实施例9中未极化的RAW264.7细胞(M0)经不同浓度(单位为μM)的tTDCRNPs、tTID NPs、tTBCI NPs、Ce6或RB和白光照射处理后所分泌的TNF-α的检测结果；其中，与未极化的RAW264.7细胞的结果相比，*表示p<0.05，***表示p<0.001。
图15为实施例9中M2表型的RAW264.7细胞经50μM的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCINPs、Ce6或RB和白光照射处理后所分泌的TNF-α的检测结果；其中，与M2表型的RAW264.7细胞的结果相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
图16为实施例9中M2表型的RAW264.7细胞经50μM的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCINPs、Ce6或RB和白光照射处理后所分泌的TGF-β1的检测结果；其中，与M2表型的RAW264.7细胞的结果相比，**表示p<0.01，***表示p<0.001，ns表示无显著性区别。
图17为实施例9中未极化的RAW264.7细胞(M0)经不同浓度(单位为μM)的tTDCRNPs、tTID NPs、tTBCI NPs、Ce6或RB，和白光照射处理后所分泌的IL-12p70的检测结果；其中，与未极化的RAW264.7细胞的结果相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
图18为实施例9中M2表型的RAW264.7细胞经50μM的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCINPs、Ce6或RB，和白光照射处理后所分泌的IL-12p70的检测结果；其中，与M2表型的RAW264.7细胞的结果相比，*表示p<0.05，***表示p<0.001，ns表示无显著性区别。
图19为实施例10中未极化的RAW264.7细胞(M0)、M1表型的RAW264.7细胞和用不同纳米颗粒处理后的RAW264.7细胞的NF-κB p65蛋白向细胞核内转移的荧光检测图。
图20为实施例11中未极化的RAW264.7细胞(M0)、M1或M2表型的RAW264.7细胞和用不同纳米颗粒处理后的RAW264.7细胞所分泌p-NF-κB和CD206蛋白表达的检测结果；a图为p-NF-κB的检测结果；b为CD206的检测结果；其中，相对于未极化的RAW264.7细胞(M0)的结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图21为实施例12中各组不同天数的肿瘤大小，其中，***表示第iv组相比第i组、第ii组、第iii组，p＜0.001。
图22为实施例12中各组第2天的肿瘤组织的代表性H&E染色结果，图中比例尺均为100μm。
图23为实施例12中处理后的肿瘤细胞的CD11c或CD206相对F4/80的相对荧光强度；其中a图为CD11c相对F4/80的相对荧光强度结果；b图为CD206相对F4/80的相对荧光强度结果，其中，***表示第iv组相比第i组、第ii组和第iii组，p＜0.001。
图24为实施例12中各组不同天数的小鼠体重检测结果。
图25为实施例13中各组不同天数的肿瘤大小，其中，***表示第iv组相比第i组、第ii组，p＜0.001；**表示第iv组相比第iii组，p<0.01。
图26为实施例14中注射PBS或tTDCR-NPs小鼠切片组织(心、肝、脾、肺、肾)的苏木精和曙红(H&E)染色，图中比例尺为100μm。
图27为实施例14中用PBS和tTDCR-NPs处理小鼠的血清生化数据；其中，a图为ALT检测结果；b图为肌酐检测结果；c图为血尿素氮检测结果；d图为总蛋白检测结果；e图为AST检测结果。
图28为实施例14中用PBS和tTDCR-NPs处理小鼠的血常规数据；其中，a图为HCT检测结果；b图为HGB检测结果；c图为Lym检测结果；d图为MCH检测结果；e图为MCHC检测结果；f图为MCV检测结果；g图为MPV检测结果；h图为PLT检测结果；i图为RBC检测结果；j图为WBC检测结果。
图29为实施例15中显像图；其中，a图为静脉注射tTDCR-NPs(200μg)后代表性小鼠的时间依赖性4T1肿瘤近红外成像；b图为静脉注射tTDCR-NPs(200μg)后代表性小鼠的近红外成像强度随时间变化关系；c图为静脉给药后器官和肿瘤不同时间的体外荧光显像；d图为静脉给药后器官和肿瘤的体外荧光显像强度随时间变化关系。
术语说明
本发明中，stokes位移的中文名称为斯托克斯位移，是指荧光光谱较相应的吸收光谱红移。
本发明中，室温表示环境温度，在10℃-30℃，或者20℃-28℃。
本发明中，PBS表示磷酸缓冲盐溶液；ns表示纳秒；min表示分钟；μM表示微摩尔每升；μg表示微克；μL表示微升；nm表示纳米；ROS表示活性氧；AIE表示聚集诱导发光；TNF-α表示肿瘤坏死因子；IL-12p70表示白介素-12p70；KDa为分子量单位，千道尔顿；PL表示光致发光光谱；TD-DFT表示基于时间的密度泛函理论；mW/cm2表示毫瓦每平方厘米；DCFH表示2',7'-二氯二氢荧光素；NPs表示纳米颗粒；Ce为二氢卟吩e6，是一种光敏剂；RB表示孟加拉玫瑰红，是一种光敏剂；NF-κB表示核因子κB；RAW264.7细胞表示小鼠单核巨噬细胞白血病细胞；p-NF-κB表示磷酸化核因子κB；CD206为M2表型巨噬细胞的标志物，可用于标志M2表型巨噬细胞数；CD11c为M1表型巨噬细胞的标志物，可用于标志M1表型巨噬细胞数；H&E染色表示苏木精和曙红染色；F4/80为一种巨噬细胞标志物，可用于标志巨噬细胞总数；“Group i”表示第i组，其他组别以此类推；4T1表示小鼠乳腺癌细胞；λab表示最大吸收峰波长；λem表示最大发射峰波长；Δab-em表示斯托克斯位移；Φ(％)表示荧光量子产率；kr表示辐射衰减率；knr表示非辐射衰减率；AIE效应值表示聚集诱导发光能力；eV表示电子伏特；CCK-8溶液为一种细胞计数试剂；FITC表示异硫氰酸荧光素；DAPI表示4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PVDF膜表示聚偏二氟乙烯膜；OD450nm表示在450nm处的吸光度；Cell vability表示细胞活力；Irradiation time表示白光照射时间；Normalized absorbance表示归一化吸光度；a.u.或au表示任意单位；Normalized PL intensity表示归一化光致发光强度；wavelength表示波长；relative energy level表示相对能级；intensity表示强度；Time表示时间；number表示数量，size表示尺寸大小；relative protein densitometry表示相对蛋白质密度测定法；merge表示合并；tumor volume表示肿瘤体积；fluorescence intensity表示荧光强度；body weight表示体重；Relative NIR-I fluorescence intensity表示相对近红外荧光强度；heart表示心脏；liver表示肝脏；spleen表示脾；lung表示肺；kidney表示肾；tumor表示肿瘤；exvivo tumor NIR-I fluorescence intensity表示体外肿瘤近红外荧光强度。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明实施例中所用的试剂、仪器和方法：
化学品购自J&K，Sigma-Aldrich和TCI，无需进一步纯化即可直接使用。其他溶剂无需进一步纯化即可直接使用。
DSPE-PEG2000购自Nanocs。
磷酸盐缓冲液(PBS，1倍)，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，青霉素-链霉素溶液和胰蛋白酶-EDTA(0.5％胰蛋白酶和5.3mM乙二胺四乙酸四钠盐)购自Transgen BiotechCo.,Ltd。
ELISA试剂盒购自4ABiotech Co.,Ltd.
NF-κB抗体，p-NF-κB抗体，F4/80抗体和CD11c抗体购自Cell SignalingTechnology,Inc。
CD206抗体，山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG来自Abcam。
使用Triton X-100和Cell Counting Kit-8的免疫染色通透缓冲液购自BeyotimeBiotechnology。
使用CDCl3作为溶剂，在Bruker AV400光谱仪上记录了氢谱和碳谱。
使用Dionex Ultimate 3000在Q-Exactive上进行高分辨率质谱分析。
在具有FluoTime 300的PicoQuant上测量时间分辨荧光光谱。
在Shimadzu UV-2600光谱仪上记录紫外可见吸收光谱。
在日立F-4600荧光光谱仪上记录光致发光光谱(PL)。
在室温下使用Zetasizer Nano系统(Malvern仪器)测定流体力学直径。
所有动物实验均获得南方科技大学动物保护和使用委员会的批准(SUSTC-2018-115)
实施例1：tTDCR的合成
Figure GDA0003314872480000101
将式(A)化合物(77mg，0.20mmol)和式(E)化合物(48mg，0.20mmol)加入乙酸(2mL)中，再加入乙酸铵，并在氩气下，于120℃回流反应12小时，冷却至室温后，用水淬灭反应，过滤并洗涤3次，得到粗产物，粗产物采用快速柱色谱法(硅胶色谱柱，二氯甲烷:乙醇体积比为15:1的混合液作为洗脱剂)进行纯化，得到68.2mg的tTDCR，产率为56％；检测tTDCR的氢谱、碳谱和质谱，氢谱结果：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)7.88(s,1H),7.66-7.57(m,3H),7.40-7.31(m,8H),7.15-7.11(m,4H),7.03-7.00(m,2H),1.34(s,18H)；碳谱结果：13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)166.29,151.67,148.65,142.76,137.48,132.67,131.64,130.12,128.78,126.68,126.02,123.10,118.84,109.74,99.97,34.55,31.37；质谱结果：HRMS(ESI):Calcd for:C39H37N4S+([M+H]+):609.26826.Found:609.26978.
实施例2：tTID的合成
Figure GDA0003314872480000102
将式(A)化合物(77mg，0.20mmol)和式(F)化合物(29mg，0.20mmol)加入乙酸(2mL)中，再加入乙酸铵，并在氩气下，于120℃回流反应12小时，冷却至室温后，用水淬灭反应，过滤并洗涤3次，得到粗产物，粗产物采用快速柱色谱法(硅胶色谱柱，二氯甲烷:乙醇体积比为15:1的混合液作为洗脱剂)进行纯化，得到77.0mg的tTID，产率为75％；检测tTID的氢谱、碳谱和质谱，氢谱结果：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.40(d,J＝8.8Hz,2H),7.93(dd,J＝4.8,3.6Hz,2H),7.77-7.73(m,3H),7.37(d,J＝8.8Hz,4H),7.14(d,J＝8.4Hz,4H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),1.34(s,18H)；碳谱结果：13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)191.48,189.67,153.19,148.68,146.76,142.33,139.93,136.94,134.64,134.38,126.60,126.20,125.04,124.64,122.74,122.70,117.93,34.55,31.38；质谱结果：HRMS(ESI):Calcd for:C36H36O2N+([M+H]+):514.27406.Found:514.27519.
实施例3：tTBCI的合成
Figure GDA0003314872480000111
将式(A)化合物(77mg，0.20mmol)和式(D)化合物(48mg，0.20mmol)加入乙酸(2mL)中，再加入乙酸铵，并在氩气下，于120℃回流反应12小时，冷却至室温后，用水淬灭反应，过滤并洗涤3次，得到粗产物，粗产物采用快速柱色谱法(硅胶色谱柱，二氯甲烷:乙醇体积比为15:1的混合液作为洗脱剂)进行纯化，得到88.8mg的tTBCI，产率为79％；检测tTBCI的氢谱、碳谱和质谱，氢谱结果：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.64(d,J＝7.2Hz,1H),8.45(s,1H),8.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.85(dd,J＝6.4,1.2Hz,1H),7.74-7.67(m,2H),7.39-7.35(m,4H),7.16-7.14(m,4H),6.92(d,J＝8.8Hz,2H),1.34(s,18H)；碳谱结果：13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)187.02,163.12,153.97,149.29,147.57,142.27,139.62,137.90,137.34,134.70,134.15,126.72,126.35,124.86,124.54,124.35,123.68,117.44,114.86,34.60,31.35；质谱结果：HRMS(ESI):Calcd for:C39H36ON3 +([M+H]+):562.28529.Found:562.28599.
实施例4：光学性质研究
取实施例1-3所制备的tTDCR、tTID和tTBCI，检测其紫外可见光谱、光致发光光谱、HOMO-LUMO(最高占据分子轨道-最低未占分子轨道)分布、相对能级、荧光衰减测量等光学性质。
紫外可见光谱检测：tTDCR、tTID或tTBCI溶解于THF中，制得浓度为10μM的供试品溶液，再加20μL的2,2'-(蒽-9,10-二基双(亚甲基))二丙二酸(ABDA，10mM在二甲基亚砜中)，采用紫外可见分光光谱仪检测其不同波长下的紫外可见光谱。
光致发光光谱：将tTDCR、tTID或tTBCI溶解于四氢呋喃的混合溶剂中，制得浓度为10μM的供试品溶液，加入2',7'-二氯二氢荧光素指示剂(DCFH，终浓度为1μM)；再分别在480nm、460nm、560nm的光激发下，采用荧光光谱仪检测检测在不同波长下的发射强度光谱。
HOMO-LUMO(最高占据分子轨道-最低未占分子轨道)分布：通过TD-DFT，基于四氢呋喃的溶剂化计算的tTID，tTDCR和tTBCI的HOMO-LUMO分布。
相对能级：通过TD-DFT，基于四氢呋喃的溶剂计算的tTDCR、tTID和tTBCI的相对能级。
荧光衰减测量：制备成纳米颗粒的tTDCR、tTID和tTBCI溶于蒸馏水中，用532nm激光照射后，在具有FluoTime 300的PicoQuant上测量时间分辨荧光光谱。
结果：结果见表1、图1-图2、图4及图6-图8。
表1：tTID、tTDCR和tTBCI的光物理性质
化合物 λ<sub>ab</sub>(nm) λ<sub>em</sub>(nm) Δ<sub>ab-em</sub>(nm) Φ(％) τ(ns) k<sub>r</sub>(ns<sup>-1</sup>) k<sub>nr</sub>(ns<sup>-1</sup>)
tTID 460 609 149 35 2.22 0.157 0.604
tTDCR 488 627 139 19 1.34 0.142 1.34
tTBCI 562 726 164 1 0.74 0.08 0.842
结果分析：
(1)见图1，tTID，tTDCR和tTBCI在四氢呋喃中在473、487和558nm处显示主要吸收峰，而它们的发射峰分别在618、637和701nm处，此外，tTBCI表现出最明显的溶剂化效应(图4)，其中斜率越大代表Stokes越大，其溶剂化效应越强，tTID斜率最小(6588)，tTDCR斜率为(6768)，tTBCI斜率最大(8035)这可以归因于这三种荧光团中tTBCI最强的分子内电荷转移效应。
(2)我们使用基于时间的密度泛函理论(TD-DFT)，在四氢呋喃溶剂中，以MPW1PW91/6-31G(d)水平上，从理论计算中获得了对这些tTDCR、tTID和tTBCI的光物理性质。对于tTID，tTDCR和tTBCI，在S0(基态)下计算的最低未占据分子轨道(LUMO)与最高占据分子轨道(HOMO)之间的能隙分别为3.21eV、3.15eV和2.79eV，并且在S1(激发态)下相应的能隙分别为2.27eV、2.2eV和1.83eV，实验结果与理论计算吻合良好。
(3)三种荧光团均具有AIE活性，在90％的水含量下，tTDCR的AIE效应值为6.2，tTID的AIE效应值为4.5，tTBCI的AIE效应值为1.1，tTDCR的AIE活性比tTID和tTBCI更好。
(4)由于内在的电荷转移效应，当水含量低于50％时，它表现出明显的荧光猝灭现象。由于逐渐聚集状态下分子旋转的限制增加，当水含量进一步增加到90％时，AIE效应占主导地位，使得荧光逐渐增强；而且，tTDCR的荧光增强速度比tTID和tTBCI更快。
(5)三种荧光团的荧光强度与白光照射时间成正比，相同条件下，tTDCR荧光强度最强，tTID次之，tTBCI较弱。
结论：我们制备了三种具有AIE性质的荧光分子tTID，tTDCR和tTBCI，三种分子均具有良好的AIE活性，其中tTDCR最强，tTID次之，tTBCI较弱。
实施例5：AIEgens NPs(具有聚集诱导发光性质的化合物的纳米颗粒)的制备
AIEgens NPs的制备方法：通过超声将1.0mg的AIEgens和3mg的DSPE-PEG2000与四氢呋喃(1mL)混合，得到均匀的混合物，然后将均匀的混合物快速加入超纯水(9mL)中，使用20％的输出功率的超声波探头(VCX150，Sonics)进行2分钟的超声波处理，透析(截留分子量为10KDa)2天，以除去四氢呋喃，用超纯水进一步透析24小时后，收集纳米颗粒，并通过离心过滤器浓缩，得到AIEgens NPs。
以tTDCR、tTID或tTBCI为AIEgens，按照上述制备方法操作，分别得到tTDCR NPs(tTDCR纳米颗粒)、tTID NPs(tTID纳米颗粒)或tTBCI NPs(tTBCI纳米颗粒)，收率皆为98％以上，检测各纳米颗粒的粒径(结果见图9)。
结论：所制备得到的tTDCR NPs、tTID NPs和tTBCI NPs的粒径小，均小于100nm，分布均匀，有利于体内的吸收和分布。
实施例6：ROS生成能力测试
AIEgens选自tTDCR、tTID、tTBCI和Ce6，按照下列操作制备实验组和对照组。
不同照射时间的未制成纳米颗粒的tTDCR、tTID、tTBCI的ROS生成能力检测：将tTDCR、tTID或tTBCI溶解于含99％PBS和1％四氢呋喃的混合溶剂中，制得浓度为10μM的供试品溶液，加入2',7'-二氯二氢荧光素指示剂(DCFH，终浓度为1μM)，40mW/cm2的白光照射下照射0-120秒，在480nm的光激发下，采用荧光光谱仪检测不同照射时间下523nm处的的相对发射强度(I/I0-1)。
不同PBS含量的四氢呋喃溶液中的未制成纳米颗粒的tTDCR、tTID、tTBCI的ROS生成能力检测：将tTDCR、tTID或tTBCI溶解于含不同PBS含量(PBS的体积占混合溶剂总体积百分比为0-99％)的四氢呋喃混合溶剂中，制得浓度为10μM的供试品溶液，加入2',7'-二氯二氢荧光素指示剂(DCFH，终浓度为1μM)，40mW/cm2的白光照射下照射20-120秒，在480nm的光激发下，采用荧光光谱仪检测不同照射时间下523nm处的的相对发射强度(I/I0-1)。
不同照射时间的制成纳米颗粒的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCI NPs的ROS生成能力检测：将制备成纳米颗粒的tTDCR NPs、tTID NPs或tTBCI NPs溶解于含99％PBS和1％四氢呋喃的混合溶剂中，制得浓度为10μM的供试品溶液，加入2',7'-二氯二氢荧光素指示剂(DCFH，终浓度为1μM)，40mW/cm2的白光照射下照射0-120秒，在480nm的光激发下，采用荧光光谱仪检测不同照射时间下523nm处的的相对发射强度(I/I0-1)。
结果：tTDCR、tTID、tTBCI随着PBS比例增加，在523nm处的相对发射强度增强，表明ROS产生能力增强，在PBS比例为99％时达到最大(图10)，且三种材料制备成纳米颗粒前和制备成纳米颗粒后，在相同浓度和条件下其ROS产生均比商业化探针Ce6强(图3，图11a)。
结果分析：
(1)tTDCR、tTID和tTBCI几乎都不会在含0％PBS的四氢呋喃中产生ROS，但由于材料的疏水性，随着PBS组分的增加逐渐形成聚集体，ROS的生成得以促进。
(2)tTDCR相比tTID和tTBCI，表现出最快的ROS生成速率，表明其作为有效光敏剂的良好潜力。
(3)tTDCR、tTID和tTBCI的ROS生成速率比Ce6更快，具有ROS生成速率快的优异技术效果。
结论：结果表明，tTDCR、tTID和tTBCI均具有产生ROS的能力，具有作为有效光敏剂的良好潜力，其中ROS生成速率tTDCR＞tTID＞tTBCI，tTDCR表现出最快的ROS生成速率，为优选的光敏剂。
实施例7：单线态氧气生成能力测试
AIEgens选自tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCI NPs和RB，按照下列操作制备实验组、对照组1和2。
实验组：将作为单线态氧指示剂的2,2'-(蒽-9,10-二基双(亚甲基))二丙二酸(ABDA；20μL，10mM在二甲基亚砜中)添加到1mL含10μM的AIEgens磷酸盐缓冲溶液(1×PBS溶液)中，用白光(40mW cm-2)照射不同的时间后，测量其吸收光谱，检测在379nm处的相对吸收强度(A/A0)与辐照时间的关系。
对照组1：将作为单线态氧指示剂的2,2'-(蒽-9,10-二基双(亚甲基))二丙二酸(ABDA；20μL，10mM在二甲基亚砜中)添加到1mL磷酸盐缓冲溶液(1×PBS溶液)中，用白光(40mW cm-2)照射不同的时间后，测量其吸收光谱，检测在379nm处的相对吸收强度(A/A0)与辐照时间的关系。
对照组2：取1mL含10μM的AIEgens磷酸盐缓冲溶液(1×PBS溶液)中，用白光(40mWcm-2)照射不同的时间后，测量其吸收光谱，检测在379nm处的相对吸收强度(A/A0)与辐照时间的关系。
结果：见图11的b图。
结果分析：相比RB，tTDCR、tTID和tTBCI的单线态氧气生成能力较差，结合实施例6的结果，说明tTDCR、tTID和tTBCI主要产生ROS，而非单线态氧气。
实施例8：细胞毒性测试
光细胞毒性检测组：将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到含培养基的96孔板中培养12h，再往不同孔中分别加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM或100μM)的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCI NPs、Ce6或RB，然后立即用白光照射细胞3分钟，弃去悬浮液，将新鲜的培养基添加到每个孔中，孵育24小时，将CCK-8溶液添加到培养基中再孵育1小时，然后测量CCK-8在450nm处的吸光度。
暗细胞毒性检测组：将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到含培养基的96孔板中培养12h，再往不同孔中分别加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM或100μM)的tTDCR、tTID、tTBCI、Ce6或RB，孵育24小时，将CCK-8溶液添加到培养基中再孵育1小时，然后测量CCK-8在450nm处的吸光度。
正常组：将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到含培养基的96孔板中培养36h，将CCK-8溶液添加到培养基中再孵育1小时，然后测量CCK-8在450nm处的吸光度。
细胞活力检测：将光细胞毒性检测组或暗细胞毒性检测组的吸光度与正常组的吸光度之比来确定细胞活力。
结果：见图12和图13。
结果分析：不同浓度的(12.5μM、25μM、50μM或100μM)的tTDCR、tTID和tTBCI不管是不经白光照射还是经白光照射后进行孵育的细胞活力相比正常组，均无明显变化，且均比Ce6和RB的细胞活力要好，证明tTDCR、tTID和tTBCI对正常细胞毒性低，有优良的细胞安全性。
结论：tTDCR、tTID和tTBCI对正常细胞毒性低，均具有良好的细胞安全性。
实施例9：TNF-α，IL-12p70和TGF-β1的测定
用IL-4(40ng mL-1)和IL-13(20ng mL-1)将RAW264.7细胞处理48小时，将RAW264.7细胞预诱导为M2表型；用LPS预处理RAW264.7细胞使其极化为M1表型的RAW264.7细胞。
正常对照组：将M1表型的的RAW264.7细胞(M1)、未极化的RAW264.7细胞(M0)和M2表型的RAW264.7细胞(M2)分别接种到6孔培养板中(每孔8×106个细胞)。
实验组：将不同浓度(12.5μM、25μM、50μM和100μM)的tTDCR NPs、tTID NPs、tTBCINPs、Ce6或RB分别添加到含有未极化的RAW264.7细胞(M0)或M2表型的RAW264.7细胞的不同孔中，然后用白光(11mW/cm2)照射3分钟后，孵育24小时，收集培养基，得到光敏剂处理后的RAW264.7细胞；并根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定各种分泌的细胞因子的水平。
结果：见图14-图18。
结果分析：
(1)tTDCR NPs和tTID NPs均可以显著上调未极化的RAW264.7细胞(M0)和诱导成M2表型的RAW264.7细胞的TNF-α和IL-12p70的分泌，且均明显优于Ce6和RB。
(2)tTDCR NPs上调未极化的RAW264.7细胞(M0)和诱导成M2表型的RAW264.7细胞的TNF-α和IL-12p70的分泌的效果明显优于tTID NPs。
实施例10：免疫荧光测定
分别取未极化的RAW264.7细胞(M0)、M2表型的RAW264.7细胞和实施例9中所得光敏剂处理后的RAW264.7细胞，分别在4％多聚甲醛溶液中固定30min，再与抗NF-κB p65抗体以1:400的体积比混合，并在4℃孵育12h，用1×PBS缓冲液洗涤巨噬细胞3次后，与FITC标记的山羊抗小鼠IgG以1:1000的体积比混合，并在室温下孵育1h，室温下用DAPI染色2min，最后用Lecia SP8共聚焦荧光显微镜检测NF-κB p65的位置。
结果：见图19。
结果分析：NF-κB对于调节多种细胞基因至关重要，尤其是那些参与免疫和炎症反应的基因。在未极化的RAW264.7细胞(M0)中，无活性的NF-κB以潜伏形式存在于细胞质中。但是，在刺激后，它被磷酸化并转移到细胞核，以与其启动子元件相互作用并介导靶基因的转录。因此，我们通过免疫荧光染色研究了NF-κB的核易位。结果表明，未极化的RAW264.7细胞(M0)在经tTDCR NPs、tTID NPs或tTBCI NPs和经白光照射后，大多数细胞质中的NF-κB从细胞质转移到细胞核。同时，tTDCR NPs、tTID NPs和tTBCI NPs均可以通过上调NF-κB的磷酸化(即p-NF-κB，用于标记M1表型的RAW264.7细胞)和下调CD206(CD206用于标记M2表型的RAW264.7细胞)来诱导未极化的RAW264.7细胞(M0)和M2表型的RAW264.7细胞极化为M1表型的RAW264.7细胞(见图19)，且tTDCR NPs的效果最优。
结论：tTDCR NPs、tTID NPs和tTBCI NPs均可通过上调NF-κB的磷酸化，诱导未极化的RAW264.7细胞(M0)和M2表型的RAW264.7细胞极化为M1表型的RAW264.7细胞，进而提高免疫力，其中tTDCR NPs的效果最优。
实施例11：蛋白质表达的检测
分别取实施例8中所述未极化的RAW264.7细胞(M0)、诱导成M2表型的RAW264.7细胞和光敏剂处理后RAW264.7细胞，用细胞裂解液处理细胞后，收集细胞裂解物的总蛋白质，并将25μg总蛋白质上样至SDS-PAGE上并转移至PVDF膜上，然后将所述PVDF膜与不同的一抗(p-NF-κB抗体或CD206抗体)和相应的IgG二抗(山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG)起孵育；最后，通过Tanon 5200Multi化学发光成像系统观察PVDF膜，检测p-NF-κB和CD206的表达。
结果：见图20。
结果分析：p-NF-κB的表达增多代表M1表型的RAW264.7细胞的增多，CD206的表达减少代表M2表型的RAW264.7细胞的减少；tTDCR NPs和tTID NPs均可以上调p-NF-κB的表达和下调CD206的表达，从而来诱导未极化的RAW264.7细胞(M0)和M2表型的RAW264.7细胞极化为M1表型的RAW264.7细胞。
结论：tTDCR NPs和tTID NPs均可通过上调p-NF-κB的表达和下调CD206的表达，诱导未极化的RAW264.7细胞(M0)和M2表型的RAW264.7细胞极化为M1表型的RAW264.7细胞，进而提高免疫力，其中tTDCR NPs的效果最优。
实施例12：体内抗肿瘤评估
取20只雌性Balb/c小鼠，右腿上方皮下接种2×106个4T1细胞，当肿瘤体积达到40mm3，将小鼠随机分为四组(每组5只)，分别为第i组、第ii组、第iii组和第iv组；其中，第i组和第iii组静脉注射1×PBS缓冲液(200μL)；第iii组和第iv组静脉注射tTDCR NPs(200μL,1mg/mL)；在静脉内注射tTDCR NPs或PBS后，利用IVIS Lumina体内成像系统(PerkinElmer)对各组的进行荧光信号成像；静脉内注射tTDCR NPs或PBS后12小时后，仅将第ii组和第iv组的肿瘤暴露于白光(300mW/cm2)下照射5分钟；然后每隔一天测量一次小鼠体重和肿瘤大小，以静脉内注射tTDCR NPs或PBS的时间为第0天，测量20天。在第20天，收集所有小鼠的肿瘤组织拍照；再进行苏木精和曙红染色(H&E染色)处理、F4/80、CD11c或CD206免疫荧光染色处理，处理后24小时收集肿瘤样品，分析处理后肿瘤组织中的巨噬细胞表型。
结果：见图21-图24。
结果分析：
(1)经tTDCR NPs和白光照射的治疗可有效抑制小鼠中4T1肿瘤的生长(见图21的group iv)，且在20天之内不会复发。
(2)苏木和曙红(H&E)染色结果(见图22的group iv)表明，经过tTDCR NPs和白光照射处理的肿瘤细胞受到最大程度的损害。
(3)CD11c用于标示M1表型巨噬细胞，CD206用于标示M2表型巨噬细胞，F4/80用于标示巨噬细胞总数；从图21可看出tTDCR NPs和白光照射的治疗可提高CD11c的含量，降低CD206的含量(见图23的group iv)，即增加M1表型巨噬细胞，减少M2表型巨噬细胞。
(4)所有四个组中的小鼠体重均未观察到明显变化，证明tTDCR NPs和白光照射的治疗具有良好的生物安全性(图24)。
实施例13：巨噬细胞耗竭的4T1荷瘤小鼠的体内抗肿瘤评估
取20只雌性Balb/c小鼠，右腹皮下接种2×106个4T1细胞，当肿瘤体积达到40mm3，将小鼠随机分为四组(每组5只)，分别为第i组、第ii组、第iii组和第iv组，在第i组和第iii组的肿瘤内注射氯膦酸盐脂质体(PBS中5mg/mL，50μL)，通过免疫荧光染色确认巨噬细胞的成功消耗后，1天后，第i组和第iii组静脉注射1×PBS缓冲液(200μL)，第iii组和第iv组静脉注射tTDCR纳米颗粒(200μL,1mg mL-1)；静脉内注射tTDCR NPs或PBS后12小时后，仅将第ii组和第iv组的肿瘤暴露于白光(300mW/cm)下照射5分钟；然后每隔一天测量一次肿瘤大小以计算体积，以静脉内注射tTDCR NPs或PBS的时间为第0天，测量20天。在第20天，收集所有小鼠的肿瘤组织拍照。
结果：见图25。
结果分析：在没有光照射的情况下，肿瘤生长迅速(第i组和第ii组)，而在第iii组中，受光照射后巨噬细胞耗竭的小鼠仅观察到了轻度的肿瘤生长抑制能力。相反，在具有正常巨噬细胞表达的第iv组中可以观察到优异的肿瘤消融，这说明经tTDCR NPs和白光照射的治疗可以显著抑制肿瘤细胞，且抑制机制包括通过巨噬细胞的免疫作用。
实施例14：体内生物安全性评估
取健康的Balb/c小鼠(总共6只)，随机分为两组(每组3只)，分别静脉注射1x PBS(200μL)或tTDCR NPs(200μL，1mg mL-1)；在第7天采血，并通过自动生化分析仪MS-480(梅康盛德生物技术有限公司，中国)测定血清的生化数据；血清的生化数据包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白、肌酐(CREA)和血尿素氮(BUN)；通过自动动物五分类血细胞分析仪DF-52Vet(Dymind Biotechnology Co.，Ltd，中国)测量血常规数据，包括白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、淋巴细胞(Lym)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)和平均血小板体积(MPV)；注射后第7天收集器官进行苏木精和曙红染色。
结果：见图26-图28。
结果分析：
(1)静脉注射tTDCR NPs后小鼠与静脉注射1x PBS后小鼠的血清的生化数据和血常规数据均无明显差异(见图27-图28)，说明tTDCR NPs的体内安全性好。
(2)静脉注射tTDCR NPs后小鼠与静脉注射1x PBS后小鼠的各器官苏木精和曙红染色结果均均未观察到异常的细胞形态或组织损伤，说明tTDCR NPs的体内安全性好(图26)。
实施例15：肿瘤成像
操作：取3只雌性Balb/c小鼠，右腹皮下接种2×106个4T1细胞，当肿瘤体积达到40mm3，静脉注射tTDCR NPs(1mg/mL，200μL)，利用IVIS Lumina体内成像系统(PerkinElmer)对小鼠肿瘤部位进行荧光信号成像。
结果：见图29。
结果分析：随着时间的增强，肿瘤部位的荧光信号先增强后减弱，在12小时时荧光信号最强。
结论：tTDCR NPs在静脉注射到小鼠体内，可随着时间增加在肿瘤部位富集，在1-72小时内可对对肿瘤部位进行荧光成像，在8-24小时有较优的荧光成像，在12小时时富集量最大，同时荧光信号最强，能够对肿瘤部位进行最好的荧光成像。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种三苯胺衍生物，其特征在于，所述三苯胺衍生物选自tTDCR的化学结构或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003905886300000011
2.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含权利要求1所述三苯胺衍生物。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为20-50nm。
4.一种光敏剂，其特征在于，其包括根据权利要求1所述三苯胺衍生物或根据权利要求2-3任一项所述的纳米颗粒。
5.一种药物组合物，其特征在于，其包括根据权利要求1所述三苯胺衍生物、根据权利要求2-3任一项所述的纳米颗粒或根据权利要求4所述的光敏剂。
6.一种试剂盒，其特征在于，其包括根据权利要求1所述三苯胺衍生物、根据权利要求2-3任一项所述的纳米颗粒、根据权利要求4所述的光敏剂或根据权利要求5所述的药物组合物。
7.一种根据权利要求1所述三苯胺衍生物、根据权利要求2-3任一项所述的纳米颗粒、根据权利要求4所述的光敏剂、根据权利要求5所述的药物组合物或根据权利要求6所述的试剂盒在制备用于以下任一应用的产品上的用途：
(1)将巨噬细胞从未极化状态或促肿瘤状态诱导为抗肿瘤状态；
(2)在细胞内和/或细胞外产生活性氧；
(3)提高促炎细胞因子分泌；
(4)治疗和/或抑制致病机理为巨噬细胞的免疫作用的肿瘤；
(5)肿瘤成像。
8.一种制备权利要求1所述三苯胺衍生物的方法，其包括：2-(4-氧代-3-苯基噻唑烷-2-亚甲基)丙二腈在催化剂和惰性气体存在的条件下，在溶剂中与4-(双(4-(叔丁基)苯基)氨基)苯甲醛发生反应，经后处理，得到所述三苯胺衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，所述溶剂选自甲酸、乙酸、丙酸或丁酸中的至少一种；所述催化剂选自甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵或丁酸铵中的至少一种；所述惰性气体选自氩气；所述反应的反应温度为80℃-150℃；所述反应的反应时间为5-30小时；所述后处理包括：冷却至室温，用水淬灭，过滤并洗涤，纯化。
10.一种制备权利要求3所述的纳米颗粒的方法，将权利要求1所述三苯胺衍生物和辅料与溶剂混合，得到混合物，然后将混合物加入水中，超声，透析，浓缩，得到所述纳米颗粒；所述溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的至少一种；所述辅料选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-胺、磷脂-聚乙二醇-羧基、磷脂-聚乙二醇-靶向穿膜肽TAT、磷脂-聚乙二醇-环肽或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。
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