CN109679110B - 一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于菌绿素的纳米金属‑有机框架光敏剂及制备方法，涉及光敏剂技术领域，该光敏剂易制备，易提纯，能够用于制备治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物，配合光照治疗效果好、毒性小；该光敏剂的晶体为立方晶系，其空间组群为Fm

Mr＝5263.82，晶体学参数：

α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°，

z＝4。本发明提供的技术方案适用于制备光动力治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物的过程中。

Description

一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂及制备方法

【技术领域】

本发明涉及光敏剂技术领域，尤其涉及一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂及制备方法。

【背景技术】

光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是近几十年来发展起来的一种新兴癌症治疗技术。该技术利用光激发癌细胞内部的光敏剂分子(Photosensitizer，PS)产生高细胞毒性的单线态氧，从细胞内部选择性杀死癌细胞，而使正常组织免受伤害。其原理是通过病灶局部的选择性光敏化作用来破坏肿瘤和其他病理性组织，即给予吸收了光敏剂的病变部位适当波长的光照，通过光敏剂介导的和氧分子参与的能量或电子转移，在病变组织内产生具有细胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，通过氧化损伤作用破坏靶部位细胞器的结构和功能，引起靶细胞的凋亡和坏死。与常规放疗和化疗相比，光动力治疗具有更好的可控性，可以在保留正常组织的同时选择性杀伤恶性细胞。因此，PDT越来越多地用作治疗各种癌症的药物，包括膀胱癌，脑癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌，食管癌，支气管癌和一些皮肤病。光动力治疗的生物作用机制大体可分为：细胞性损伤、血管性损伤、诱发和调节免疫反应等。光敏剂、光和分子氧是光动力疗法的三大要素。

光敏剂作为治疗的载体，对光动力治疗的效果起着决定性作用，一个好的光敏剂一般具有一下特点：(1)易合成，易制备，稳定性好；(2)良好的水溶性和生物相容性；(3)选择性靶向肿瘤；(4)光疗窗口在650-750nm，有利于增强活性氧物质的穿透深度和组织成像；(5)暗毒性低，皮肤敏感性小。

第一代光敏剂有血卟啉衍生物、二血卟啉醚和Photofrin等,已获多国政府的药监部门批准应用于临床，但是在体内的滞留时间过长，避光时间需4周以上才能排出体外，此外第一代敏剂的光穿透组织的深度在0.5cm以下，限制了PDT在深度肿瘤的应用；第二代光敏剂有：间-四羟基苯基二氢卟酚、苯卟啉衍生物、酞菁类、得克萨卟啉、n-天门冬酰基二氢卟酚等卟啉类衍生物，他们部分地克服了第一代光敏剂的缺点，更加符合理想光敏剂的特点，表现为光敏周期短，光的波长位于红外或者近红外区且吸收强，组织穿透深度较第一代光敏剂有较大提高，单线态氧产率和生物相容性也明显提高，目前处于临床研究阶段。第三代光敏剂一般与纳米科技和生物技术相结合，通过与多肽、蛋白、抗原抗体等分子结合，由细胞膜、二氧化硅等物质包覆，或者与金属离子相络合，实现对肿瘤微环境响应的控制释放、多重治疗(光动力、光热、化疗)、多模式成像(荧光、磁共振成像、光声成像、光热成像)一体化的纳米诊疗平台，是现在的研究热点。

菌绿素是卟啉的一种衍生物，由卟啉通过还原反应，在对称的两个吡咯环上加成四个H原子得到的大环共轭芳香族有机物，具有特殊的结构和性能。相比于卟啉，菌绿素具有更好的光物理和光化学性能，在近红外区的较大吸光度使其有潜力作为新一代光敏剂应用于光动力治疗。

金属有机框架材料(Metal Organic Frameworks，MOFs)，是一类由金属离子或金属簇与有机配体通过配位键自组装形成的具有周期性网络结构的新型晶态多孔材料，是一类特殊的配位聚合物(Coordination Polymers，CPs)。配位键的键能比共价键弱，但远大于氢键。结晶性、多孔性和强金属配体相互作用是MOFs的三个重要特点，他们已经在广泛的应用领域显示了多功能性，包括气体储存、催化、传感、载药、治疗等等。

【发明内容】

有鉴于此，本发明提供了一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂及制备方法，该光敏剂易制备，易提纯，能够用于制备治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物，配合光照治疗效果好、毒性小。

一方面，本发明提供一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂，其特征在于，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架由金属离子Hf⁴⁺和菌绿素通过配位键形成。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架为立方晶系，且平均粒径在250nm以下。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架的晶体空间组群为

Mr＝5263.82，晶体学参数：

α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°，

z＝4。

另一方面，本发明提供一种如上任一所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，制备方法的步骤包括：

S1、将金属离子Hf⁴⁺溶于溶剂中，得到Hf⁴⁺溶液；将对苯甲酸菌绿素溶于溶剂中，得到对苯甲酸菌绿素溶液；

S2、将S1中得到的Hf⁴⁺溶液、对苯甲酸菌绿素溶液和乙酸混合，得到待反应混合液；

S3、对所述待反应混合液进行水热反应；

S4、对水热反应后的混合液进行离心洗涤，收集沉淀物，得到基于菌绿素的纳米金属-有机框架。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述Hf⁴⁺溶液和所述对苯甲酸菌绿素溶液的浓度均为0.001-0.1mol/L。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述待反应混合液中Hf⁴⁺和对苯甲酸菌绿素的摩尔比为1:1。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述Hf⁴⁺溶液和/或所述对苯甲酸菌绿素溶液的溶剂为DMF。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述水热反应的条件为：温度范围是85-105℃，反应时间是2-5天。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S4的具体步骤为：分别用DMF、三乙胺/乙醇以及乙醇对水热反应后的混合液进行多次离心洗涤，直至上清液没有颜色，再收集沉淀物并干燥，得到基于菌绿素的纳米金属-有机框架。

再一方面，本发明提供一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的应用，其特征在于，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂由上述任一所述的制备方法制备，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂用于制备光动力治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：将金属离子与菌绿素配位得到一种二维金属有机框架，不仅防止了菌绿素在体内的聚集淬灭，同时可以促进单线态氧在细胞内的扩散，提高光动力治疗效率；该制剂包含的对苯甲酸菌绿素为疏水的菌绿素光敏剂，结构简单，容易合成；在制备过程中，无需添加催化剂，通过水热反应即可得到，仅需离心即可得到纯的纳米药物制剂，易制备，易提纯；该制剂在在近红外区有很强吸收，在浅表层至较深组织均能有效的吸收利用激发光源；将菌绿素与金属配位得到的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架能够有效分散于水中进行血液循环，有效提高在肿瘤部位的药物积累量，在光照下能高效杀死癌细胞，非光照下，近乎无毒性。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明一个实施例提供的对苯甲酸菌绿素和基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的紫外吸收光谱(UV-vis)；

图2是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的透射电子显微镜(TEM)图；

图3是本发明一个实施例提供的基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架的沿[1,1,0]方向的晶体结构示意图；

图4是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的氮气吸脱附曲线；

图5是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的孔径大小分布图；

图6是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架中加入1，3-二苯基异苯并呋喃在650nm光照下426nm处吸光度随时间的变化情况；

图7是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架与Ce6随光照时间延长的吸光度下降比率(单线态氧产率)；

图8是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架对人乳腺癌细胞的体外光动力疗效实验；

图9是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架对小鼠肿瘤的体内光动力实验中肿瘤大小随时间的变化；

图10是本发明一个实施例提供的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架对小鼠肿瘤的体内光动力实验中小鼠体重随时间的变化。

其中，图8，9，10中，MOF指的是基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架，NIR指的是波长740nm，功率40mW/cm²的红光，PBS指的是磷酸缓冲液。

【具体实施方式】

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。

应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本发明利用菌绿素和MOFs结构的优点，提供了一种基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的材料及其制备方法和用途，克服现有卟啉分子作为光敏剂的难溶于水、易聚集淬灭、稳定性差等问题，同时利用MOFs的高的比表面积和孔隙率的特点，提高治疗效率。

一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其步骤包括：

S1、将金属离子Hf⁴⁺对应的盐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中形成Hf⁴⁺溶液，将对苯甲酸菌绿素溶于DMF中，得到对苯甲酸菌绿素溶液；

其中，Hf⁴⁺对应的盐为氯化物或硝酸盐。

对苯甲酸菌绿素的结构式为

S2、将配置好的Hf⁴⁺溶液和对苯甲酸菌绿素溶液以及乙酸水溶液混合，加热反应得到金属-有机框架材料；

其中，Hf⁴⁺和对苯甲酸菌绿素的摩尔比为1:1。

金属离子Hf⁴⁺和对苯甲酸菌绿素溶液的浓度为0.001-0.1mol/L；优选的为0.006mol/L。

乙酸使用量为大量，优选的，乙酸的量为金属离子或对苯甲酸菌绿素的物质的量的25-30倍。

反应时，将反应混合物放在约85-105℃的烘箱中反应2-5天；优选85-95℃；最优选的是在90℃的烘箱中反应3天。

S3、反应结束后，多次离心洗涤，收集沉淀物；

离心洗涤时，溶剂为DMF或者三乙胺/乙醇(1:20体积/体积)或者乙醇；转速在4000-40000转/分之间，优选6000-10000转/分钟。

具体的制备实施例1：

将HfCl₄溶于DMF中，形成2毫克/毫升的HfCl₄的溶液，将对苯甲酸菌绿素溶解于DMF中，形成3.5毫克/毫升的对苯甲酸菌绿素溶液；

将配制好的HfCl₄的溶液和对苯甲酸菌绿素溶液混合，并加入0.45ml乙酸；

将上述混合溶液放入烘箱中，90℃条件下反应3天；

冷却至室温后，离心(6000转/分钟)反应后的混合溶液，倒出上清液，收集沉淀物；

将上述沉淀物分别用DMF、三乙胺/乙醇(1:20的体积比)和乙醇多次离心(6000转/分钟)洗涤，直至上清液没有颜色，收集沉淀物干燥得到基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架。

X射线衍射结果表明，该基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架晶体属于立方晶系，图3是基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架的沿[1,1,0]方向的晶体结构示意图，如图3所示。其空间组群为

Mr＝5263.82，晶体学参数：

α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°，

z＝4；其中，a、b、c为晶胞的3组棱长(即晶体的轴长)，α、β、γ分别为三组棱相互间的夹角(即晶体的轴角)，v是晶胞的体积，z是每个晶胞中含有的分子个数。

图1为本发明实施例1提供的对苯甲酸菌绿素和基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的紫外吸收光谱(UV-vis)；其中，H₂DBBC代表菌绿素，MOF代表基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架。由图1可知道对苯甲酸菌绿素和基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架在近红外处(740nm-750nm)有很强的吸收。

图2是基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架的TEM图，从中可以看出它的平均粒径大小在150nm-200nm之间，厚度为4nm左右，是一种二维材料。平均粒径是指例如通过TEM、DLS等仪器设备手段来表征纳米颗粒，并进行统计计算得到的粒径平均值，并非指所有纳米药物的粒径均小于200nm。

图4是基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的在77K下氮气吸脱附曲线，由测试结果可知道，氮气的吸脱附都是可逆的，内部结构稳定。

图5是基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架的孔径大小分布图，其孔径分布均匀，主要分布在3.045nm。

对获得的基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架进行试验的情况如下：

1、单线态氧产生的测试：

在体外单线态氧测试中，以DMF为溶剂，1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕捉剂，取浓度为1x10^-5的DPBF加入比色皿中，用波长650nm，功率40mW/cm²激光光照每10秒测一次在426纳米处的吸光度，作为参比；随后在另一只比色皿中加入1x10^-5的DPBF和低浓度的对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架，用波长650nm，功率40mW/cm²激光光照每10秒测一次在426纳米处的吸光度，并用常见光敏剂Ce6在相同条件下吸光度的变化作为参照。由图6，7可以看出，单独DPBF的光稳定性很好，而相同条件下基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架会在光激发下产生单线态氧，导致吸光度下降，且单线态氧产率约为Ce6的两倍。

2、基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架对人乳腺癌细胞的体外光动力实验：

将实施例1中制备的基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架药物的磷酸盐缓冲液(PBS,PH＝7.4)溶液(20μg/mL,1mL)加入提前24小时铺种的人乳腺癌细胞的96孔板中，24小时后，使用波长740nm，功率40mW/cm²激光光照10分钟(MOF+NIR)。同时设置三组对照组，分别是磷酸盐缓冲液无光照(PBS)、磷酸盐缓冲液+光照(PBS+NIR)和对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架药物溶液无光照(MOF)(均与前述参数一致)。24小时后，用MTT法检测细胞活力。实验结果见图8。结果显示这种基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架在光的激发下能够高效杀死人乳腺癌细胞。

3、基于菌绿素的二维纳米金属-有机框架对小鼠肿瘤的体内光动力实验：

将用于试验的雌性裸鼠随机分成四组，将基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架药物的磷酸盐缓冲液(PBS,PH＝7.4)溶液(20μg/mL,2mL)尾端静脉注射荷瘤小鼠，4小时后再用波长740nm，功率40mW/cm²激光光照。同时设置三组对照组，分别是磷酸盐缓冲液无光照、磷酸盐缓冲液+光照和对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架药物溶液无光照(均与前述参数一致)。测量15天内，小鼠肿瘤的尺寸大小和小鼠体重变化。实验结果见图9，10。结果显示这种基于对苯甲酸菌绿素的二维纳米金属-有机框架在光的激发下能够明显抑制小鼠体内肿瘤的生长增殖，十五天后，治疗小鼠的肿瘤消失。并且对小鼠体重影响不大，说明药物的毒副作用很小。

上述试验结果以及实际使用情况表明，该基于菌绿素的金属-有机框架材料所包含的菌绿素光敏剂在近红外区有很强吸收，该纳米药物可用作光动力治疗，在合适波长照射下，可以用于治疗的肿瘤包括其他浅表层皮肤病和深层肿瘤(例如乳腺癌、肝癌等)。该制剂可以通过静脉注射或者肌肉注射使用。

通过体外对人乳腺癌细胞的光动力实验发现，该制剂在光照下能有效杀死癌细胞，在没有光照下，几乎没有毒性；通过对小鼠肿瘤的光动力实验发现，该制剂能够富集于肿瘤组织，光照后能明显抑制肿瘤生长，且对其他器官没有损失，有良好的生物相容性。因此基于菌绿素的金属-有机框架材料或其晶体可用于制备治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物。肿瘤包括乳腺肿瘤、肝脏肿瘤和其他常见肿瘤。

以上对本申请实施例所提供的一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂及制备方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂，其特征在于，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架由金属离子Hf⁴⁺和菌绿素通过配位键形成；

所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架为立方晶系，且平均粒径在250nm以下；

所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架的晶体空间组群为

Mr＝5263.82，晶体学参数：

α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°，

z＝4。

2.一种如权利要求1所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，制备方法的步骤包括：

S1、将金属离子Hf⁴⁺溶于溶剂中，得到Hf⁴⁺溶液；将对苯甲酸菌绿素溶于溶剂中，得到对苯甲酸菌绿素溶液；

S2、将S1中得到的Hf⁴⁺溶液、对苯甲酸菌绿素溶液和乙酸混合，得到待反应混合液；

S3、对所述待反应混合液进行水热反应；

S4、对水热反应后的混合液进行离心洗涤，收集沉淀物，得到基于菌绿素的纳米金属-有机框架。

3.根据权利要求2所述的基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，所述Hf⁴⁺溶液和所述对苯甲酸菌绿素溶液的浓度均为0.001-0.1mol/L。

4.根据权利要求2所述的基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，所述待反应混合液中Hf⁴⁺和对苯甲酸菌绿素的摩尔比为1：1。

5.根据权利要求2所述的基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，所述Hf⁴⁺溶液和/或所述对苯甲酸菌绿素溶液的溶剂为DMF。

6.根据权利要求2所述的基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，所述水热反应的条件为：温度范围是85-105℃，反应时间是2-5天。

7.根据权利要求2所述的基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的制备方法，其特征在于，所述S4的具体步骤为：分别用DMF、三乙胺/乙醇以及乙醇对水热反应后的混合液进行多次离心洗涤，直至上清液没有颜色，再收集沉淀物并干燥，得到基于菌绿素的纳米金属-有机框架。

8.一种如权利要求1所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂的应用，其特征在于，所述基于菌绿素的纳米金属-有机框架光敏剂用于制备光动力治疗肿瘤或浅表层皮肤病的药物。

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