CN112641943A - 一种载抗肿瘤药物的超声给药微泡复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载抗肿瘤药物的超声给药微泡复合物及其制备方法与应用。由阳离子微泡与抗肿瘤药物‑PLGA纳米粒通过正负电荷吸引连接制备得到。本发明利用超声乳化作用制备出GA‑PLGA纳米颗粒，由于阳离子微泡带正电荷，GA‑PLGA纳米颗粒带负电荷，进而CMB与GA‑PLGA纳米颗粒通过电荷吸引连接起来形成CMBS‑GA‑PLGA微泡复合物。微泡在超声的作用下产生膨胀、收缩、振荡、内爆等一系列交替变化，使细胞膜通透性增加，这种现象被称作“声孔效应”，利用微泡在超声作用下的“声孔效应”等使藤黄酸更好作用于胶质母细胞瘤细胞，期望为胶质瘤的治疗提供新的思路。

Description

一种载抗肿瘤药物的超声给药微泡复合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种载抗肿瘤药物的超声给药微泡复合物及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质母细胞瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，在儿童恶性肿瘤中排第二位。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，中老年人群尤为明显[Campos B,Olsen LR,Urup T,et al.A comprehensive profile of recurrentglioblastoma.Oncogene,2016,35(45):5819-5825]。中国脑胶质瘤年发病率为3-6人/10万人，年死亡人数达3万人，死亡率极高[Omuro A,DeAngelis LM.Glioblastoma and othermalignant gliomas:a clinical review.JAMA,2013,310(17):1842-50]。目前，脑胶质瘤的主要治疗方式为手术、放疗和化疗，然而这些治疗手段并不能完全消除肿瘤，且创伤大、副作用明显。手术切除的方式能够治愈小部分低级别脑胶质瘤患者，但大部分的脑胶质瘤患者在接受手术、辅以放化疗等综合治疗后仍易复发[Le Rhun E,Preusser M,Roth P,etal.Molecular targeted therapy of glioblastoma.Cancer Treat Rev,2019,80:101896]。脑胶质瘤的总体疗效有待进一步提高，寻找安全有效且毒副作用小的抗肿瘤方法迫在眉睫。
研究发现，藤黄酸对肺癌，肝癌，乳腺癌，宫颈癌，鼻咽癌和胃癌等多种肿瘤都具有很好的治疗效果。藤黄酸(gambogicacid,GA)是一种从中药藤黄中分离得到的具有较强抗肿瘤活性的天然产物。藤黄酸作为一种高效低毒的抗肿瘤药物，通过不同机制发挥抗肿瘤作用，包括诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，抑制端粒酶和拓扑异构酶活性，抗肿瘤血管生成和肿瘤转移，逆转多药耐药等。但藤黄酸水溶性差，生物利用度低[Banik K,Harsha C,Bordoloi D,et al.Therapeutic potential of gambogic acid,a caged xanthone,totarget cancer.Cancer Lett,2018,416:75-86；Xia G,Wang H,Song Z,et al.Gambogicacid sensitizes gemcitabine efficacy in pancreatic cancer by reducing theexpression of ribonucleotide reductase subunit-M2(RRM2).J Exp Clin CancerRes,2017,36(1):107；Retraction:Gambogic Acid Inhibits STAT3 Phosphorylationthrough Activation of Protein Tyrosine Phosphatase SHP-1:Potential Role inProliferation and Apoptosis.Cancer Prev Res(Phila),2018,11(9):593]。
聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)由两种单体一乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。
发明内容
本发明为了克服部分抗肿瘤药物水溶性差，生物利用度低的缺陷，提供了一种载抗肿瘤药物的微泡复合物。
本发明所提供的载抗肿瘤药物的微泡复合物，由阳离子微泡(CMBs)与抗肿瘤药物-PLGA纳米粒通过正负电荷吸引连接制备得到；其中，浓度OD500为1.4634的阳离子微泡(CMBs)液体中加抗肿瘤药物-PLGA纳米粒5-90μg，具体可为80μg。
所述阳离子微泡(CMBs)可由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、聚乙烯亚胺(PEI600)为原料通过薄膜水化法制备得到；
其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱与聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺的的摩尔比可为18:0.5-1.5:0.5-1.5，具体可为18:1:1；
所述抗肿瘤药物-PLGA纳米粒中，所述抗肿瘤药物为水溶性差，生物利用度低的抗肿瘤药物，具体可为藤黄酸；
所述抗肿瘤药物与PLGA的质量比可为：1-8mg：50mg。
所述抗肿瘤药物为藤黄酸，藤黄酸与PLGA的质量比可为：4mg：50mg。
上述载抗肿瘤药物的微泡复合物通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)载抗肿瘤药物-PLGA纳米粒的制备；
2)CMBs的制备：以二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、聚乙烯亚胺(PEI600)为原料通过薄膜水化法制备得到CMBs；
3)CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物的制备：采用正负电荷吸引法制备CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物。
上述方法步骤1)中，所述载抗肿瘤药物-PLGA纳米粒采用超声乳化法和低温真空干燥技术制备得到；
所得载抗肿瘤药物-PLGA纳米粒的平均粒径可为80.00～200.00nm、平均电位可为-20.00～-10.00mv；
上述方法步骤2)中，二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺的摩尔可比为18:0.5-1.5:0.5-1.5，具体可为18:1:1；
CMBs制备的操作具体可为：将DSPC、DSPE-PEG2000、PEI600置于试管中，在氮气流作用下至管壁上形成磷脂薄膜，抽真空2h，加入Tris液至试管55～60℃超声振荡后将所得磷脂悬浮液分装入西林瓶中，进行气体交换，使西林瓶中充入全氟丙烷，得到阳离子脂质微泡，即CMBs；
所得阳离子微泡(CMBs)的平均粒径可为1.00～1.50μm，平均电位可为+20.00～80.00mv；
上述方法步骤3)中，CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物的制备的操作为：①阳离子微泡(CMBs)原液1mL，于1.5mL EP管中；②离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)，用5mL注射器抽出下沉液体(含杂质，阳离子泡在上面漂浮),加1mLDDW，混匀；③重复步骤②三遍；④称取抗肿瘤药物-PLGA纳米粒1mg于2mLDDW中制成悬液；⑤抽取“④”抗肿瘤药物PLGA纳米粒悬液160μL和500μL浓度OD500为1.4634的阳离子微泡(CMBs)液体中混匀，离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)；⑥用5mL注射器抽出下沉液体(含杂质，阳离子泡在上面漂浮),加1mLDDW，混匀，离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)三次；
所得CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物的平均粒径可为：306.20±51.03nm、平均电位可为：+4.00～8.00mv。
上述载抗肿瘤药物的微泡复合物在制备用于治疗肿瘤的超声给药系统中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种超声给药系统，所述超声给药系统含有上述载抗肿瘤药物的微泡复合物。
所述抗肿瘤药物为藤黄酸，所得载藤黄酸的微泡复合物，即CMBS–GA-PLGA微泡复合物在制备用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、胃癌或脑胶质母细胞瘤的超声给药系统中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、胃癌或脑胶质母细胞瘤的超声给药系统，所述超声给药系统含有载藤黄酸的微泡复合物，即CMBS–GA-PLGA微泡复合物。
上述超声给药系统在超声辅助下给药，超声参数为：Freq：949khz、phase 0.00、cycle：10.000k、offset 0mv、interval：1.000s、Amp：100mvpp、time：1min。
本发明利用超声乳化作用制备出GA-PLGA纳米颗粒，由于阳离子微泡(Cationicmicrobubbles，CMBs)带正电荷，GA-PLGA纳米颗粒带负电荷，进而CMB与GA-PLGA纳米颗粒通过电荷吸引连接起来形成CMBS-GA-PLGA微泡复合物。微泡在超声的作用下产生膨胀、收缩、振荡、内爆等一系列交替变化，使细胞膜通透性增加，这种现象被称作“声孔效应”，利用微泡在超声作用下的“声孔效应”等使藤黄酸更好作用于胶质母细胞瘤细胞，期望为胶质瘤的治疗提供新的思路。
附图说明
图1为实施例1中制得的GA-PLGA的表征；a.藤黄酸-PLGA纳米颗粒大体观；b.藤黄酸-PLGA纳米颗粒扫描电镜；c.藤黄酸-PLGA纳米颗粒透射电镜；d.藤黄酸对应的浓度OD值线性关系；e.藤黄酸-PLGA纳米颗粒的包封率；f.藤黄酸-PLGA纳米颗粒的载药量；g.藤黄酸-PLGA纳米颗粒电位分布图；h.藤黄酸-PLGA纳米颗粒粒径分布图。
图2为实施例1中制得的CMBs的表征；a.阳离子微气泡大体观；b.阳离子微气泡光学镜下取像200X；c.阳离子微气泡透射电镜取像；d.阳离子微气泡粒径浓度随时间的变化；e.阳离子微气泡粒径分布图；f.阳离子微气泡电位分布图。
图3为实施例1中制得的CMBS-GA-PLGA微泡复合物的表征；与“0μg”组比较具有统计学差异，***p<0.001；与“70μg”组比较具有统计学差异，#p<0.05。a.一定比例藤黄酸-PLGA与CMBs混合，离心；b.图a中继续加入CMBs混合，离心；c.CMBs-GA-PLGA透射电镜下取像；d.藤黄酸-PLGA与CMBs最适比例探索；e.CMBs-GA-PLGA的粒径分布图；f.CMBs-GA-PLGA的电位分布图。
图4表明CMBs产生“声孔效应”；与“0mvpp”组比较具有统计学差异，*p<0.05；与“100mvpp”组比较具有统计学差异，#p<0.05。a.不同超声强度作用后阳离子微气泡的浓度(OD500)；b.不同超声强度作用24h后胶质瘤细胞的细胞活力；c.不同超声强度作用后阳离子微气泡镜下观察取像。标尺：bar＝5μm。
图5为实施例1制备的CMBS-GA-PLGA微泡复合物抗胶质瘤细胞效果评价；组间具有统计学差异，*P<0.05；与control、GA、GA-PLGA组比较具有统计学差异，#P<0.05。a.不同处理因素作用24h后各组胶质瘤细胞的细胞活力；b.不同处理因素作用24h后各组胶质瘤细胞的生存状态；标尺：bar＝200μm。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用主要试剂和仪器如下：
二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC,Avanti)；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000,Avanti)；生物素－聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Biotins,Avanti)；聚乙烯亚胺(PEI600,Avanti)；藤黄酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，上海，中国)；PLGA(广州创赛生物医用材料有限公司广州，中国)；射频功率放大器(泰克科技有限公司，上海，中国)；AFG3000C系列发生器(泰克科技有限公司，上海，中国)；1PΦ30探头(上海高精密仪器有限公司，上海，中国)；超声波清洗机(深圳市华策科技有限公司，深圳，中国)；超声波细胞粉碎机(南京舜玛仪器设备有限公司，南京，中国)。
下面以藤黄酸为抗肿瘤药物为例制备CMBS-GA-PLGA。
下述实施例中U251细胞来源于河南省医用组织再生重点实验室。
实施例1、CMBS-GA-PLGA的制备
1)GA-PLGA纳米粒的制备及其一般性质的检测
采用超声乳化法和低温真空干燥技术制备载藤黄酸纳米粒，具体操作如下：①称取2g PVA溶于50mL DDW中，提前配置好4％PVA溶液(室温保存)；②准备冰盒一个，称取0.05g PLGA溶于1mL二氯甲烷中，使用小西林瓶装盛，待其溶解完全后，加入0.0025g DSPC(DSPC:PLGA＝1:20)，再加入4mg的藤黄酸；西林瓶盖上橡胶盖并用封口膜封口，放通风橱中使其自然溶解；③称取0.06g NH4HCO3，用1mL DDW溶解，使用2mL EP管装盛，放入上述冰盒中，来回晃动使其溶解，用移液枪转移200微升至上述“②”溶液中；④使用超声细胞粉碎仪将上述溶液乳化，(使用前用清水和酒精清洗超声细胞粉碎仪探头，参数为Time：2min，Pulse：3，Amp：40％-50％)，因超声容易产生热量，故西林瓶周围用冰填充；后将其转移到装有5mL PVA溶液的大西林瓶中，用均质机搅拌约3min(5档)；⑤在50mL离心管内先装约8mLDDW，将“④”中溶液倒进其中，再用约2mL DDW将大西林瓶内的残液冲洗倒至离心管中，再次用均质机混匀溶液；⑥在通风橱内架好磁力搅拌器，其上放置装有转子的50mL烧杯，确保打开风机后，将“⑤”中溶液倒至烧杯中，用DDW洗去离心管内的残液，裹上锡纸防灰避光；搅拌3h，可从气味判断是否将二氯甲烷挥发干净；⑦将上述搅拌完全的溶液转移至50mL离心管内，放入离心机离心(4500转，5min，3次)，倒去上清液，1mL DDW重悬，用移液枪转移至中西林瓶内，封口膜当成盖子封口，并用注射器针头扎成小孔透气，放于-80℃冰箱内冷冻3-4h，或者过夜。⑧冻干机(冷凝器温度-50℃、真空度80Pa)冻干48小时即成成品藤黄酸-PLGA纳米粒，-20℃保存；
扫描电镜观察纳米粒形态，马尔文粒径电位仪检测纳米粒粒径大小和分布，马尔文粒径电位仪检测纳米粒电位大小和分布，紫外分光光度计分析藤黄酸浓度，计算载药量和包封率，载药量计算公式LE(％)＝We/Wm×100％，式中，LE表示PLGA纳米粒中药物的载药量百分数；We表示包封于脂质体内的药量；Wm表示载药纳米粒的总重量；包封率计算公式EN％＝(1－Cf/Ct)×100％，式中Cf为游离药物的量；Ct为纳米粒中药物的总量。
制备的GA-PLGA纳米粒储存在4℃中(西林瓶中储存，图1a)。GA-PLGA纳米粒扫描电镜下呈球形，分散均匀，平均粒径为(102.06±48.68)nm(图1B、H)，平均电位为(-25.11±20.30)mv(图1g)。GA-PLGA纳米粒透射电镜下呈球形，表面有凹陷(图1c)；藤黄酸对应的浓度OD曲线(y＝0.0034x-0.0007,R2＝0.9985,图1d)；每50mgPLGA原材料中分别加入1、4、6、8mg藤黄酸，制作出对应的GA-PLGA纳米粒，分别计算对应包封率与载药量，与其他三组比较，当每50mg PLGA原材料中分别加入4mg藤黄酸时，对应包封率与载药量最高(*p<0.05,图1e、f)；进而我们了解了GA-PLGA纳米粒的形状、粒径、电位、包封率、载药量等表征(图1)。
2)CMBs的制备及其一般性质的检测
将DSPC二硬脂酰磷脂酰胆碱、DSPE-PEG2000聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、PEI600聚乙烯亚胺按二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺的摩尔比为18:1:1置于试管中，在氮气流作用下至管壁上形成磷脂薄膜，放入抽滤瓶中抽真空3h，加入5mLTris液至试管中，55～60℃超声振荡20min后将磷脂悬浮液以1mL/支分装入2.5mL西林瓶中，进行气体交换，使西林瓶中充入全氟丙烷，制得阳离子脂质微泡。
透射电镜观察阳离子微泡形态，马尔文粒径电位仪检测阳离子微泡粒径大小和分布，马尔文粒径电位仪检测阳离子微泡电位大小和分布，酶标仪检测阳离子微泡浓度。
制备的阳离子微泡4℃储存(西林瓶中，图2a)。阳离子微泡普通显微镜镜下观察为球形，分布均匀，平均粒径为(1.13±0.50)μm(图2b、e)。阳离子微泡的平均电位为(55.20±28.22)mv(图2f)。透射电镜下呈椭圆形，边缘规整(图2c)。阳离子微泡的浓度(OD500)随着时间的延长而下降，粒径随着时间的延长而增大。
3)CMBS-GA-PLGA微泡复合物的制备及其一般性质的检测
采用正负电荷吸引法制备微泡复合物，微泡复合物制备过程为：①阳离子微泡(CMBs)原液1mL，于1.5mL EP管中；②离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)，用5mL注射器抽出下沉液体(含杂质，阳离子泡在上面漂浮),加1mLDDW，混匀；③重复步骤②三遍；④称取藤黄酸-PLGA纳米粒1mg于2mLDDW中制成悬液；⑤抽取“④”藤黄酸PLGA-纳米粒悬液160μL和500μL浓度OD500为1.4634的阳离子微泡(CMBs)液体中混匀，离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)；⑥用5mL注射器抽出下沉液体(含杂质，阳离子泡在上面漂浮),加1mLDDW，混匀，离心(RCF105g，转速1050rpm，4℃，2min)三次。粒径分布仪检测CMBs与GA-PLGA连接比例，透射电镜观察微泡复合物形态，马尔文粒径电位仪检测微泡复合物粒径大小和分布，马尔文粒径电位仪检测微泡复合物电位大小和分布。
将100μLOD500为0.72的阳离子微泡液加入100μg GA-PLGA纳米粒，混匀，离心(RCF＝105g，转速1050rpm，4℃，2min)，EP管底部有残余GA-PLGA纳米粒(图3a),继续向其中加入100μL OD500为0.72的阳离子微泡液，混匀，离心(RCF＝105g，转速1050rpm，4℃，2min)，EP管底部残余GA-PLGA纳米粒消失，证明CMBS与GA-PLGA纳米粒进行了连接，形成了CMBS-GA-PLGA微泡复合物(图3b)。透射电镜下可观察到CMBS与GA-PLGA纳米粒连接在一起，形成了CMBS-GA-PLGA微泡复合物(图3c)。通过检测电位变化，探索出每100μL OD500为0.72的阳离子微泡液加入80μg GA-PLGA纳米粒时，二者按此比例连接形成CMBS-GA-PLGA微泡复合物(图3d)。CMBS-GA-PLGA微泡复合物的平均粒径为(306.20±51.03)nm，平均电位为(6.25±2.12)mv(图3e、f)。
4)CMB产生“声孔效应”的最适超声参数的选择
控制超声参数：Freq：949khz、phase0.00、cycle：10.000k、offset 0mv、interval：1.000s不变，超声持续作用时间为1min；改变超声强度Amp：80mvpp、100mvpp、120mvpp、140mvpp；镜下观察超声前后阳离子微泡状态(200x)；酶标仪检测超声前后阳离子微泡的浓度；超声24h后，CCK-8检测细胞活力。
分别将OD500为1.43的阳离子微泡液分成5组，镜下观察超声前后状态(图4c)。检测超声前后5组阳离子微泡的浓度变化，当超声强度≥100mvpp时，可发生”声孔效应”(图4a)。U251细胞被超声强度为0、80、100、120、140mvpp(超声时间为60s)超声作用24h后，检测细胞活力，发现当超声强度≥120mvpp时，对实验产生影响，故，CMBs产生”声孔效应”的最适超声参数为：Freq：949khz、phase0.00、cycle：10.000k、offset 0mv、interval：1.000s、Amp：100mvpp、time：1min(图4b)。
实施例2、CMBS-GA-PLGA的性能考察
实验分六组：control组、GA组、GA-PLGA组、FUS+GA-PLGA组、CMBs-GA-PLGA组、FUS+CMBs-GA-PLGA组；施加不同处理因素24h后，镜下观察各组细胞生存状态，CCK-8检测各组细胞活力。其中，FUS的参数为：Freq：949khz、phase0.00、cycle：10.000k、offset0mv、interval：1.000s、Amp：100mvpp、time：1min。
活力计算:细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]x100
A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
统计学方法
数据采用spss25软件进行统计学分析，结果用(
Figure BDA0002864482480000071
)表示，多组间比较采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)。以P<0.05视为差异具有统计学意义。
超声联合CMBs-GA-PLGA微泡复合物对胶质瘤细胞的作用效果
在96孔板中配置100μL的50000Cell/mL细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24h(37℃，5％CO2)。将培养板分成六组：control组、GA组、GA-PLGA组、FUS+GA-PLGA组、CMBs-GA-PLGA组、FUS+CMBs-GA-PLGA组(控制实验组藤黄酸终药浓度为1.5μmol/L)。每种处理设6个复孔，并设不加细胞液的调零孔和只加细胞液、不加药物的空白对照孔。将培养板在培养箱孵育24h后，观察各组的生长状态(图5b)。向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。计算每组细胞活力，FUS+CMBs-GA-PLGA组所对应的U251细胞活力最低(图5a)。
本实验使用超声波细胞粉碎机对GA和PLGA作为原材料在超声乳化效应的作用下制备出载GA的纳米粒，通过薄膜水化法制备出阳离子微泡，通过正负电荷吸引制备出CMBs-GA-PLGA微泡复合物。0.05g的PLGA原材料中，分别加入不同量的GA，通过计算载药量与包封率，选出最适比例。我们在制作普通微泡(microbubbles，MBs)基础上进行改进，在原材料中混入PEI600，制备出带有正电荷的阳离子微泡，通过检测CMBs 5天内的粒径浓度变化进而判断CMBs的稳定性。通过粒度仪检测它们的粒径与电位，在普通显微镜下观察CMBs和CMBs-GA-PLGA微泡复合物，在电镜下观察三者的形状。通过检测电位变化，我们探索出CMBs与GA-PLGA的最适比例。控制同等浓度的CMBs，控制其他超声参数不变，在不同超声强度下，我们通过镜下观察超声前后CMBs的状态和检测CMBs超声前后的浓度变化进而判断是否发生“声孔效应”。我们探索了超声对细胞活力的影响，在不同超声强度作用24h后，检测不同组所对应的细胞活力变化，我们发现当超声强度为120mvpp、140mvpp时虽然可以产生超声“声孔效应”，但对U251细胞的细胞细胞活力影响较大，故我们最终选择的超声参数为：Freq：949khz、phase0.00、cycle：10.000k、offset：0mv、interval：1.000s、Amp：100mvpp、time：60s。将U251细胞进行铺板，选择96孔板，5000个/孔，常规培养24h后施加不同处理进而分为六组：control组、GA组、GA-PLGA组、FUS+GA-PLGA组、CMBs-GA-PLGA组、FUS+CMBs-GA-PLGA组；常规培养24h后，镜下观察各组细胞的生存状况，CCK-8检测每孔对应细胞活力，统计分析各组之间的差异。
我们首次合成了CMBs-GA-PLGA微泡复合物，并且在超声联合CMBs-GA-PLGA微泡复合物作用下，CMBs-GA-PLGA微泡复合物可以更好的使GA-PLGA透过胶质瘤细胞细胞膜，使GA对脑胶质瘤的杀伤效果更强。因此，此联合方法有望应用于脑胶质瘤。

Claims (10)

1.一种载抗肿瘤药物的微泡复合物，由阳离子微泡与抗肿瘤药物-PLGA纳米粒通过正负电荷吸引连接制备得到；其中，浓度OD500为1.4634的阳离子微泡液体中加抗肿瘤药物-PLGA纳米粒5-90μg。
2.根据权利要求1所述的微泡复合物，其特征在于：所述阳离子微泡由二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺为原料通过薄膜水化法制备得到；
其中，二硬脂酰磷脂酰胆碱、与聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺的摩尔比为：18:0.5-1.5:0.5-1.5。
3.根据权利要求1或2所述的微泡复合物，其特征在于：所述抗肿瘤药物-PLGA纳米粒中，所述抗肿瘤药物为水溶性差，生物利用度低的抗肿瘤药物；
所述抗肿瘤药物与PLGA的质量比为：1-8mg：50mg。
4.制备权利要求1-3中任一项所述载抗肿瘤药物的微泡复合物的方法，包括如下步骤：
1)载抗肿瘤药物-PLGA纳米粒的制备；
2)CMBs的制备：以二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺为原料通过薄膜水化法制备得到CMBs；
3)CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物的制备：采用正负电荷吸引法制备CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述载抗肿瘤药物纳米粒采用超声乳化法和低温真空干燥技术制备得到；
所得载抗肿瘤药物纳米粒的平均粒径为80.00～200.00nm、平均电位为-20.00～-10.00mv。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，二硬脂酰磷脂酰胆碱与聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙烯亚胺的摩尔比为18:0.5-1.5:0.5-1.5；
CMBs制备的操作为：将DSPC、DSPE-PEG2000、PEI600置于试管中，在氮气流作用下至管壁上形成磷脂薄膜，抽真空2～3h，加入Tris液至试管55～60℃超声振荡后将所得磷脂悬浮液分装入西林瓶中，进行气体交换，使西林瓶中充入全氟丙烷，得到阳离子脂质微泡，即CMBs；
所得阳离子微泡的平均粒径为1.00～1.50μm，平均电位为+20.00～80.00mv；
步骤3)中，所得CMBS-抗肿瘤药物-PLGA微泡复合物的平均粒径为：306.20±51.03nm、平均电位为：+4.00～8.00mv。
7.权利要求1-3中任一项所述载抗肿瘤药物的微泡复合物在制备用于治疗肿瘤的超声给药系统中的应用。
8.一种超声给药系统，所述超声给药系统含有权利要求1-3中任一项所述载抗肿瘤药物的微泡复合物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为藤黄酸，载藤黄酸的微泡复合物，即CMBS–GA-PLGA微泡复合物在制备用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、胃癌或脑胶质母细胞瘤的超声给药系统中的应用。
10.一种用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、胃癌或脑胶质母细胞瘤的超声给药系统，所述超声给药系统含有载藤黄酸的微泡复合物，即CMBS–GA-PLGA微泡复合物，
所述超声给药系统在超声辅助下给药，超声参数为：Freq：949khz、phase0.00、cycle：10.000k、offset 0mv、interval：1.000s、Amp：100mvpp、time：1min。
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