CN101652126B - 活性试剂的多级递送 - Google Patents
活性试剂的多级递送 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101652126B CN101652126B CN2007800374243A CN200780037424A CN101652126B CN 101652126 B CN101652126 B CN 101652126B CN 2007800374243 A CN2007800374243 A CN 2007800374243A CN 200780037424 A CN200780037424 A CN 200780037424A CN 101652126 B CN101652126 B CN 101652126B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- particle
- level
- compositions
- silicon
- secondary particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
公开了包括一级粒子和二级粒子的多级递送载体。所述一级粒子是含二级粒子的微米粒子或纳米粒子。所述二级粒子包括活性试剂,例如治疗剂或成像剂。多级递送载体允许生物屏障的连续的克服或绕过。将多级递送载体作为包括多个所述载体的组合物的一部分进行施用。也提供了制备所述多级递送载体的方法。
Description
关于联邦政府资助的研究和发展的声明
美国政府在本发明中拥有完全付清的特许权和在有限情况下要求本专利所有人以合理条件许可他人的权利,如DOD拨款No.W81XWH-04-2-0035项目16、NASA拨款No.NNJ06HE06A、和NIH拨款No.NC11R21CA122864-01的条款所提供。
发明背景
技术领域
本发明总体上涉及纳米技术领域,具体地说,涉及利用微米粒子和/或纳米粒子递送活性试剂(例如治疗剂和成像剂)的组合物,以及制备所述组合物的方法和使用所述组合物的方法。
相关领域描述
过去25年对健康和疾病的基本理解的进展还未转化为临床医学的同等进步。不能施用治疗部分而使其选择性到达期望的靶标而仅具有边际的或无间接损害很大程度上是导致了上述矛盾,例如参考Langer,R.Nature 392,5-10(1998)、和Duncan,R.Nature Rev.DrugDiscov.2,347-360(2003)。
理想地,活性试剂,例如治疗剂或成像剂,应穿过血管,以完全浓度到达目的靶标,然后仅选择性作用于患病细胞和组织而不产生不希望的副作用。遗憾的是,即使目前最好的治疗也不能大幅度达到此理想性能。
纳米级和微米级药物递送系统,也称为“纳米载体”,是为优化治疗的治疗指数的问题,即功效最大化而减少不利健康的副作用提供解决方案的有希望的候选物。即使朝向这一目标的不多的进展也在历史上产生了跨越多个医学领域的实质利益,具有例如,从肿瘤学的子域 到远至传染性疾病的治疗的领域的可转化性,这是因为该进展在潜在科技平台具有单一的共同特征这一事实。例如脂质体,这个超过10年前用于治疗卡波氏肉瘤的第一个达到保健成就的纳米载体疗法,也使乳腺癌和卵巢癌以及真菌感染的治疗产生了进步。
如今,成百上千的不同的纳米载体科技平台已加入脂质体,各自具有不同特性、长处和缺点。不同的纳米载体平台包括基于聚合物的平台、树状聚体、金纳米壳、半导体纳米晶体、富勒烯、生物来源的纳米结构物、基于硅和二氧化硅的纳米系统和超顺磁纳米粒子在文献 49-75中有描述。
发明概述
某些实施方案中提供包含至少一种一级粒子的组合物,所述一级粒子为微米粒子或纳米粒子,并且具有(i)主体、(ii)至少一个表面、以及(iii)至少一个位于主体内的贮存器,所述贮存器含至少一种包含至少一种活性试剂的二级粒子。
某些实施方案中提供包含将组合物施用于受试者的方法,所述组合物包含:至少一种为微米粒子或纳米粒子并且其具有(i)主体、(ii)至少一个表面、以及(iii)至少一个位于主体内的贮存器,所述贮存器含至少一种包含至少一种活性试剂的二级粒子。
另一个实施方案中还提供制备多级递送系统的方法。所述方法包含(A)提供至少一种为微米粒子或纳米粒子并且其具有(i)主体、(ii)至少一个表面、以及(iii)至少一个位于主体内的贮存器;(B)提供至少一种二级粒子以及(C)将所述至少一种二级粒子装载入所述一级粒子的贮存器内。参考如下说明书和附图,显示这些以及其他实施方案、特点和优势。
附图说明
图1显示根据本发明的一个实施方案的多级递送载体。一级粒子内部含二级粒子。所述二级粒子含至少一种活性试剂,例如治疗剂或成像剂。所述一级粒子内部也含另外的试剂,例如渗透增强剂或可以为成像剂或治疗剂的另外的活性试剂。任选地,所述二级粒子含三级粒子。靶向部分,例如抗体、适体或配体,连接至一级粒子表面,促进定位于选定的身体位点。
图2A-B显示根据一个实施方案,血管内施用多级递送载体的操作的原理。一级粒子定位于靶向的血管位置。一旦定位,所述粒子释放渗透增强剂,在血管上生成窗口。二级粒子携带靶向部分,例如抗体。二级粒子通过窗口渗透并使用抗体靶向携带表面标志物抗原的特定细胞。
图3,A区描述氨基和羧基修饰量子点(q-点)在APTES修饰的“大孔”LP和“小孔”纳米多孔硅一级粒子中的时间依赖性。图3,B区展示二级PEG-FITC-SWNT纳米粒子浓度对其装载入纳米多孔硅一级粒子的影响。在A区和B区,Y轴读数为平均荧光。
图4A-B(A区-D区)展示二级纳米粒子装载入纳米多孔硅一级粒子的时间动态。A区为“大孔”(LP)氧化的硅一级粒子;B区为LP APTES修饰的硅一级粒子;C区为“小孔”(SP)氧化的硅一级粒子;D区为SP APTES修饰硅一级粒子。A-D区中,Y轴读数为平均荧光。
图5展示从LP氧化的纳米多孔硅一级粒子(A区)和LP APTES修饰的纳米多孔硅一级粒子(B区)释放二级纳米粒子的时间动态。A区和B区中,Y轴读数为释放的有效载荷。
图6A,A区呈现装载羟基修饰的量子点和FITC-缀合的单壁碳纳米管(SWNT)的浓度效应。A区中Y轴读数为平均荧光(%)。图6A,B区展示异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的单壁碳纳米管(SWNT)的荧光淬灭。
图6B-C涉及将二级粒子装载入纳米多孔硅粒子的化学条件的最优化。将纳米多孔硅粒子在浓度渐增的TRIS的存在下与二级纳米粒子混合(图6B,C区和D区中Q-点、图6C E区和F区中PEG-FITC-SWNT)。高浓度TRIS有利于增加装载入一级硅粒子的Q-点的量(图6B C区和D区)。与此相反,PEG-FITC-SWNT的装载效率在20Mm TRIS达到峰值然后在更图6高的TRIS浓度下降, 图6C E区和F区。B-F区中Y轴读数为平均荧光。
图7展示分别向LP纳米多孔硅一级粒子装载和释放FITC缀合的SWNT二级粒子的数据。A区呈现装载柱,对应于在暴露于FITC-SWNT溶液之后洗涤之前最初装载入纳米多孔硅一级粒子的FITC-SWNT的量。A区中洗涤柱对应于洗涤一级粒子后FITC-SWNT的量。一级粒子中FITC-SWNT的实际装载量为洗涤后保留于一级粒子中的FITC-SWNT的量,即装载柱和洗涤柱中相应数值间的差额。B区显示随着时间从一级粒子释放FITC-SWNT的数据。随着时间从一级粒子释放的FITC-SWNT的总量,即B区中所有柱的总和,实质上与A区中相应装载柱和洗涤柱的差额吻合。A和B区中Y轴读数为FITC-SWNT的量(ng)。
图8A-C呈现基于脂质的二级粒子装载入纳米多孔硅一级粒子的数据。图8A-B中,A-C区显示装载入1微米纳米多孔硅一级粒子的阳离子和中性脂质体的数据。A区显示中性脂质体(左)和阳离子脂质体(右)的共聚焦显微图像。B和C区分别呈现中性和阳离子脂质体装载入1微米纳米多孔硅一级粒子的FACS分析和Excel定量。B区中Y轴读数为粒子数,C区中Y轴读数为绿色荧光(对数值)。图8C中,D区显示将含Alexa 555标记的SiRNA的脂质体装载入3.5微米纳米多孔氧化的硅一级粒子的时间动态。D区中Y轴读数为荧光。E区和F区呈现荧光显微图像,显示与装载入3.5微米纳米多孔硅一级粒子的含有Alexa 555标记的SiRNA的脂质体所关联的荧光。
图9A-B,A-D区展示“大孔”(LP)纳米多孔硅一级粒子的扫描电镜(SEM)图像。
图10A-B,A-D区展示“小孔”(SP)纳米多孔硅一级粒子的扫描电镜(SEM)图像。
图11A-B,A-D区展示用Z2 粒子计数器测量的纳米多孔硅粒子的降解。图11A A和B区中Y轴读数为粒子数。图11B C和D区中Y轴读数为粒子的体积。
图12A-B展示使用电感耦合等离子体发射光谱(Inductive Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry)测量的纳米多孔硅粒子的降解。图12A,A区为LP氧化的硅粒子;B区为SP氧化的硅粒子;图12B,C区为LP APTES修饰的硅粒子。D区为APTES修饰的SP硅粒子。图12A-12B中Y轴读数为硅的浓度(ng/mL)。
图13通过呈现选定的纳米多孔硅粒子和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的明场显微图像展示纳米多孔硅一级粒子的生物相容性。具体地说,A区展示小孔氧化的硅纳米粒子的图像;B区展示小孔APTES修饰的硅纳米粒子的图像;C区展示大孔氧化的硅纳米粒子的图像;D区展示大孔APTES修饰的硅纳米粒子的图像。在A-D区每一个中,从左至右:第一张图像第0天(粒子加入后2hrs)、第二张图像第1天、第三张图像第2天、第四张图像第3天。
图14A-C通过呈现对与纳米多孔硅粒子一起孵育的HUVEC细胞的乳酸脱氢酶(LDH)毒性分析的数据展示纳米多孔硅粒子的生物相容性。A-F区中Y轴读数为490nm处吸光度。
图15A-C呈现与纳米多孔硅粒子一起孵育的HUVEC细胞的MTT增殖分析的数据。图15A,A-B区和图15B-C,C-F区中Y轴读数为570nm处吸光度。
图16A-C呈现与纳米多孔硅粒子一起孵育的HUVEC细胞并分析了它们的尺寸和形状的FACS 3D图谱。
图17A-I呈现与纳米多孔硅一级粒子一起孵育的HUVEC细胞并用碘化丙啶染色以研究细胞周期的FACS 3D图谱。
图18A-E呈现暴露于纳米多孔硅一级粒子的细胞的细胞周期的不同阶段的统计分析。图18A,A-C区、图18B,D-E区、和图18C-E,H-K区中Y轴读数为总细胞群的百分比。
图19,a和b区展示多孔硅粒子的SEM图像。“大孔”(LP,图19a)和“小孔”(SP,b区)粒子图像显示(从左至右)背面、正面、截面、背面上的孔和截面中的孔的更近距离观察。LP和SP粒子的尺寸和形状相同,孔的尺寸和结构显著不同。
图20呈现荧光标记的Q-点和PEG-FITC-SWNT装载入纳米多孔 硅粒子的流式细胞仪和荧光显微镜分析的结果。装载液中纳米粒子的数量的增加导致通过流式细胞术测量的硅粒子的平均荧光的增加(A区和B区)(◆LP APTES+羧基q-点●LP氧化的+氨基Q-点■SPAPTES+羧基q-点▲SP氧化的+氨基Q-点)。荧光显微镜检查(C和D区)证实了当使用的纳米粒子的量更低时与一级粒子关联的荧光更弱。A和B区中Y轴读数为平均荧光。
图21A-B呈现纳米多孔硅一级粒子中二级粒子的时间依赖的装载和释放。以不同的二级纳米粒子(●羧基q-点,■氨基q-点,▲PEG-FITC-SWNT)装载四种不同类型的纳米多孔硅一级粒子(LP氧化的(a区)、LP APTES(b区)、SP氧化的(c区)、和SP APTES(d区)并用流式细胞术测量它们的荧光。图21B e-h区中柱状图表示随着时间的推移从一级硅粒子释放的二级粒子的比例。
图22呈现展示Q-点集中装载于硅粒子的背面的高度多孔区域的共聚焦显微图像。a区显示在一系列3维投影中重建的共聚焦显微图像,显示旋转单个多孔硅粒子以展示不同的观察点。b区显示计算机生成的3维模型,图解说明如a区中所示的粒子的旋转。
图23A-23C显示纳米多孔硅一级粒子中Q-点和PEG-FITC-SWNT二级粒子的同步装载和释放。流式细胞术分析显示LP APTES粒子的背景绿色和红色荧光(未装载;分别为图23A,A区和B区)以及在与PEG-FITC-SWNT(+SWNT)、Q-点(+Q-点)和两者(+Q-dots+SWNT)一起孵育后荧光信号的变化。流式细胞术分析显示PEG-FITC-SWNT装载快且稳定,而Q-点逐渐装载直到达到一个平台,见图23B,C区。在另一类纳米粒子的存在下Q-点和PEG-FITC-SWNT的释放图谱都未改变并且都随着时间保持不变,图23B,D区。共聚焦显微图像显示Q-点(红色)和PEG-FITC-SWNT(绿色)在单个多孔硅粒子中的定位。图23C,E区、F区和G区分别显示明场、绿色和红色荧光,而h区显示3个通道的叠加。黄色显示表示绿色和红色荧光信号的共定位。图23B,D区中Y轴读数为平均荧光;D区中Y轴读数为释放的有效载荷。
图24,a-m区显示涉及将装载二级粒子的纳米多孔硅粒子与HUVEC细胞在37℃一起孵育1h的荧光光谱图像。图24,a-d区中,所述二级粒子是Q-点;e-h区中,所述二级粒子是PEG-FITC-SWNT;j-m区中,所述二级粒子是Q-点和PEG-FITC-SWNT。图24,d、h和m区是显示粒子具体形状的明场图像。
图25,A-C区呈现表现负责一级硅载体中二级纳米粒子的装载和释放的物理、化学和静电三个主要机制的计算机模型。(A区)尺寸依赖性:孔的尺寸决定优选装载入硅粒子的纳米粒子的类型。(B区)剂量依赖性:装载液中更大量的纳米粒子导致装载入孔的粒子的数量的增加。(B区)电荷依赖性:电荷相容的纳米粒子将被吸引入孔,然而不相容的电荷将部分地抵制纳米粒子并因而阻止它们进入孔内。
图26,A-B区,呈现装载入纳米多孔硅一级粒子的含SiRNA的脂质体的数据。A区:将Alexa 555荧光标记的siRNA包封于纳米-脂质体再装载入1级纳米-载体。所述数据显示与多孔硅载体关联的荧光随着纳米脂质体的量增加。A区中Y轴读数为平均荧光。图26,B区呈现显示从一级纳米多孔硅粒子释放的脂质体的相对量的曲线图。Y轴读数为释放的脂质体的总量的百分比。为了测试纳米-脂质体从1级载体的释放,将装配好的多级粒子与10%胎牛血清(pH7.4)一起孵育,采用荧光法随时间跟踪纳米脂质体从一级粒子的释放。约36h达到完全卸载。
图27展示装载量子点和PEG-FITC-SWNT的物理条件的最优化。a区和b区中Y轴读数为平均荧光。将多孔硅粒子在干燥器中干燥过夜,然后与含有二级纳米粒子的装载液混合。干燥条件下的装载效率与湿环境中的装载效率无显著差别(p值>0.5)。
定义
除非另外说明,“一”或“一个”表示一种或多种。
“靶身体位点的生化环境”指靶位点的一个或多个内在生理条件,例如pH、盐条件、温度、或有效发起并促进粒子内容物的释放的靶特异部分的存在。
“生物可降解”指在生理介质中溶解或降解的材料或在生理条件下由生理的酶和/或化学条件降解的生物相容性聚合材料。
“粘膜附着”指粒子能够附着于内衬在小肠和大肠的整个表面的粘膜层。附着由嫁接到粒子表面的配体介导,所述配体结合存在于粘液素中或肠内皮细胞表面的化学受体。
“靶向部分”是促进粒子靶向特定位点的任何因素。例如,靶向部分可以是化学靶向部分、物理靶向部分、几何学靶向部分或其组合。化学靶向部分是粒子表面上的化学部分或分子;物理靶向部分是粒子的特定物理性质,例如疏水表面;几何学靶向部分包括粒子的尺寸和形状。
“微米粒子”意为具有从1微米到1000微米、或从1微米到100微米的最大特征尺寸的粒子。“纳米粒子”意为具有不到1微米的最大特征尺寸的粒子。
“生物相容的”指当暴露于活细胞时,支持细胞的适当细胞活性而不在细胞内产生不希望的作用,例如所述细胞的生命周期的改变、所述细胞的增殖率的改变以及细胞毒性作用的材料。
发明详述
本发明的实施方案中,包含两级或更多级粒子的组合物,例如后级的粒子(较小尺寸的粒子)包含于前级的粒子中(较大的粒子),将潜在地为治疗、预防和/成像受试者中的生理状态,例如疾病提供一种或多种益处,所述受试者为任何具有血液系统的动物(例如,所述受试者为温血动物,例如包括人类的哺乳动物)。所述多级组合物的实施方案提供一种或多种以下特点或益处:(1)将活性试剂,例如治疗剂或成像剂,优先递送到和/或定位于受试者体内的特定的靶位点。优先递送和/或定位意为递送到或定位于靶位点的活性试剂的数量或浓度高于递送到或定位于受试者体内的其他位点的活性试剂的数量或浓度;(2)连续克服受试者体内的多重生物屏障的多级组合物;和(3)允许同步递送和定位于多个活性试剂的相同或不同靶位点的多级组合物。
生物屏障
施用后,以传统方法或于纳米载体中配制的活性试剂,例如治疗或成像剂,遭遇对所述试剂以期望的浓度到达预期靶标的能力造成不利影响的多种生物屏障。所述生物屏障位,例如,表皮或内皮屏障,例如基于紧密连接、阻止或限制活性试剂的细胞旁路转运的血-脑屏障或肠腔内皮。每个内皮/表皮屏障包括多个连续亚屏障,例如其分子辨别归功于一种或多种紧密连接蛋白的紧密连接屏障、以及一种或多种其他的生物膜,例如血管内皮基底膜或肠内皮的粘膜层。网状内皮系统(reticulo-endothelial system)的细胞也针对包封于纳米粒子的活性试剂起生物屏障的作用,因为这些细胞捕获/摄取纳米粒子。生物屏障也表现为活性试剂必须通过的细胞膜或细胞内的核膜。
多级递送载体
因为生物屏障是连续的,克服或绕过这类屏障也必须为连续的。因此,开发了一种递送载体,在实施方案中,其以多级形式发挥作用。所述载体的每一级由具有单独预期功能的粒子定义,所述功能不同于其他级的粒子的预期功能。例如,设计某一级的粒子使其靶向不同于由其他级的粒子靶向的位点的特定身体位点,因而克服或绕过不同于其他级的粒子克服或绕过的生物屏障的特定生物屏障。每个随后级的粒子包含于紧临于其前的级的粒子中。任何特定级的粒子包含旨在用于此特定级的活性试剂,例如治疗剂或成像剂。
一个优选实施方案中,最后一级的粒子是配制为纳米粒子的活性试剂或者备选地,最后一级的粒子内部含所述活性试剂,然而任何之前的级的粒子本身可能包含或可能不包含活性试剂。一些实施方案中,除靶向特定的身体位点以外,以某种方式设计每一级的粒子使其能够进行其内容物的靶向释放。在实施方案中,多级递送载体中级的数量和类型取决于几个参数,包括施用途径和活性试剂的最终预期靶标。多级递送载体的一个实施方案在图1中显示。
一级粒子
一些实施方案中,一级粒子为微米粒子或纳米粒子。一些实施方 案中,一级粒子具有至少500微米或至少1mm的特征尺寸。配置所述粒子使其内部含至少一种微米粒子或纳米粒子,后者反过来内部含至少一种更小尺寸的粒子。一级粒子是能够在内部含更小尺寸的粒子的任何粒子。
一些实施方案中,一级粒子为自顶向下制作的粒子,即通过自顶向下微米加工或纳米制作方法,例如光刻(photolithography)、电子束光刻、X-射线光刻、深度紫外光刻或纳米压印光刻制备的粒子。使用所述自顶向下制作法的潜在优势是这些方法提供尺寸一致的粒子的放大的生产。
配置一级的粒子以克服至少一种以下生物屏障:血液流变学屏障、网状内皮系统屏障、内皮屏障、血脑屏障、肿瘤相关的渗透性间质压力屏障、离子和分子泵屏障、细胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其组合。
一级粒子具有由所述粒子的尺寸和形状以及体内的一种或多种贮存器定义的主体。所述贮存器内部包含一种或多种二级粒子。
一级粒子的主体包含任何适当的材料。优选地,一级粒子的主体的材料是生物相容的。一些实施方案中,一级粒子的主体包含氧化物材料例如氧化硅、氧化铝、氧化钛或氧化铁;半导体材料,例如硅;聚合物或氧化聚合物材料;或陶瓷材料。一些实施方案中,一级粒子的主体包含生物可降解的材料,例如,纳米多孔硅。所述生物可降解的材料为一种当暴露于生理介质例如硅酸时其发生降解的材料。
一些实施方案中,一级粒子的主体的材料在主体的不同区域实质上相同。一级粒子的形状取决于施用途径。例如,配置所述形状使一级粒子和靶位点的表面之间的接触最大化,例如血管内施用时的内皮表面或口服施用时的肠上皮。因此,对于口服和血管内施用,将一级粒子配置成具有使所述粒子和内皮表面之间的接触最大化的选定的非球形的形状。适当的形状的实例包括,但不限于,扁球形或圆盘形。对于肺部施用,即向受试者的肺施用,也将一级粒子配置成具有使所述粒子和肺内一种表皮组织之间的接触最大化的选定的非球形的形 状。
对于肺部施用,即一种涉及粒子通过受试者的肺的施用途径,一级粒子也具有针状的形状,其促进粒子不一定通过血循环而从肺进入身体组织。
尽管自顶向下加工允许制作具有范围大到从50nm多至几厘米的尺寸的粒子,对于一些施用途径优选特定的粒子尺寸。例如,对于血管内施用,粒子的最大特征尺寸,例如,圆盘形粒子的直径,优选足够小于最小的毛细血管的半径。在人中,所述半径约为4或5微米。因此,在一些实施方案中,粒子的最大特征尺寸为小于约3微米、小于约2微米或小于约1微米。
实施方案中,一级粒子的最大特征尺寸为从500nm到3微米、或从700nm到2微米。然而在关于肿瘤学应用中血管内施用的一些实施方案中,一级粒子的最大特征尺寸为能使其定位于靶血管位点而不穿过癌症血管内皮上的窗口。对于上述应用,一级粒子的最大特征尺寸为大于约100nm、或大于约150nm、或大于约200nm。
然而在关于血管内施用的一些实施方案中,一级粒子的尺寸使其可穿过所述窗口。因此,在上述应用中最大特征尺寸优选为小于约200nm、或小于约150nm、或小于约200nm。一些实施方案中,为了靶向已开窗的血管,可选择一级粒子的尺寸,选定为正常的未开窗的血管的临界半径,如属于Paolo Decuzzi和Mauro Ferrari于2006年9月27日提交的PCT专利申请号PCT/US2006/038916“Methods andCompositions for Targeting Fenestrated Vasculature”中详细描述。
对于口服施用,优选使用最大特征尺寸为大于约2微米、或大于约5微米或大于约10微米的一级粒子。采用上述尺寸的一级粒子用于口服施用的优势是这样的粒子太大而不能被肠表皮细胞吞噬。肠表皮细胞吞噬至少有两个潜在缺点:1)在到达期望的靶标之前由内皮细胞处理时,一级粒子的内容物可能失活;2)特定载体的潜在毒性,例如粒子的材料的毒性,如果其被吞噬比如果其被清除出胃肠道更加备受关注。
一些实施方案中,对于口服施用,一级粒子具有从500微米到几厘米、或从1mm到2cm范围的尺寸。
对于肺部施用,如果靶位点位于肺的气道,一级粒子的最大特征尺寸优选为小于约20微米但大于约5微米。为靶向肺泡内位点,最大特征尺寸为小于约5微米。
一些实施方案中,对于皮下施用,一级粒子的最大特征尺寸为从约50微米到1mm;或从100微米到1mm。
实施方案中,一级粒子的一项功能是定位于特定的靶位点。对于血管内施用,所述靶位点为特定的血管位点。例如,在抗癌应用中,所述靶向的血管位点是肿瘤血管,例如新生血管、共择的(coopted)血管或再正常化的(renormalized)血管。一级粒子对靶位点的定位受到几何学因素的促进,例如粒子的尺寸和形状。
对于血管内施用,一级粒子的表面上的一种或多种识别因子促进对靶位点的定位。所述识别因子为化学靶向部分,例如树状聚体、抗体、适体(例如硫醇适体(thioaptamer))、结合靶向的位点上特定受体的配体或生物分子。对于口腔递送,如U.S.专利号6,355,270的表1中所描述,所述化学部分包含一种或多种粘膜附着配体。
通过改变粒子的表面的化学部分调节靶向的选择性。例如,使用血管生成素2(angiopoietin 2)的抗体特定地靶向共择的血管;使用血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGFb)或内皮标志物(例如v 3整合素)的抗体识别新生血管,而使用癌胚抗原相关细胞附着分子1(CEACAM1)、内皮素-B受体(ET-B)、血管内皮生长因子抑试剂gravin/AKAP12、蛋白激酶A和蛋白激酶C的脚手架蛋白识别再正常化的血管,参考例如Robert S.Korbel″Antiangiogenic Therapy:A Universal Chemosensitization Strategyfor Cancer?″,Science 26 May 2006,vol 312,no.5777,1171-1175。
为靶向非循环的血管细胞,一级粒子和靶向的血管位点的分子标志物之间的结合应足够坚固以克服由流动的血液施加的阻力。通过拥有对于特定结合的相对大的平面表面积和在毛细血管的血流空间内相 对小的外形,即拥有选定的非球形,例如扁球形或圆盘形的粒子实现此目标。
识别因子也可为物理识别部分,例如表面电荷。在粒子的制作期间使用化学处理例如特定的洗涤引入所述电荷。例如,将多孔二氧化硅或氧化的硅表面浸入水中导致表面上获得负电荷,参考例如Behrens和Grier,J.Chem.Phys.115(14),(2001).P.6716-6761。也可由粒子的表面上的附加层或化学链,例如聚合物链提供表面电荷。例如,聚乙二醇链是表面上负电荷的来源。将聚乙二醇链包被或共价结合于表面,如P.K.Jal,S.Patel,B.K.Mishra,Talanta 62(2004)P1005-1028、S.W.Metzger and M.Natesan,J.Vac.Sci.Technol.A17(5),(1999)P2623-2628、以及M.Zhang,T.A.Desai and M.Ferrari,Biomaterials,19,(1998),p 953中所描述。通过例如,以碱性聚合物例如多聚赖氨酸包被表面,或通过将含氨基的分子例如3-氨丙基三乙氧基硅烷共价结合到表面上引入正电荷。
一些实施方案中,基于选定的靶位点的一种或多种性质,将建模方法应用于选择几何学因素,例如粒子的尺寸和形状,以及/或表面修饰,例如化学修饰和静电修饰。所述建模方法公开于,例如,1)属于Paolo Decuzzi和Mauro Ferrari于2006年10月11日提交的U.S.临时专利申请号60/829,075“Particles for Cell Targeting”;2)属于PaoloDecuzzi和Mauro Ferrari于2007年2月26日提交的U.S.临时专利申请号60/891,584“Endocytotic particle”;3)Decuzzi,P.,Causa,F.,Ferrari,M.&Netti,P.A.The effective dispersion of nanovectorswithin the tumor microvasculature.Ann Biomed Eng 34,633-41(2006);4)Decuzzi,P.&Ferrari,M.The adhesive strength ofnon-spherical particles mediated by specific interactions.Biomaterials27,5307-14(2006);5)Decuzzi,P.&Ferrari,M.The role of specificand non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis ofnanoparticles.Biomaterials 28,2915-22(2007);6)Decuzzi,P.,Lee,S.,Bhushan,B.&Ferrari,M.A theoretical model for the margination of particles within blood vessels.Ann Biomed Eng 33,179-90(2005);Decuzzi,P.,Lee,S.,Decuzzi,M.&Ferrari,M.Adhesion ofmicrofabricated particles on vascular endothelium:a parametricanalysis.Ann Biomed Eng 32,793-802(2004)。
一些实施方案中,配置一级粒子使其在靶位点从其贮存器释放二级粒子。二级粒子的释放根据多种机制进行,包括,但不限于,二级粒子通过连接贮存器和一级粒子的表面的通道扩散以及一级粒子的主体的降解和侵蚀。为了上述目的,配置一级粒子使其特征释放时间长于当施于受试者时一级粒子到达其靶位点的特征递送时间。
一些实施方案中,配置一级粒子使其执行从其贮存器释放二级粒子,其持续时间长于当施于受试者时一级粒子到达其靶位点的特征递送时间。一些实施方案中,配置一级粒子使其在长于至少0.5hr、或长于至少1hr、或长于至少2hr、或长于至少8hr、或长于至少15hr、或长于30hr的时间段释放二级粒子。
一些实施方案中,由靶位点的一种或多种内在生理条件例如pH、盐浓度或温度触发一级粒子的物理定位和/或靶向的释放。一些实施方案中,由外源刺激触发一级粒子的物理定位和/或靶向的释放。外源刺激的实例包括机械性激活,例如由超声激活;电磁激活,例如由可见光、紫外光、近红外或红外光、射频或X-射线辐射、电磁辐射激活。例如,一级粒子包含智能聚合物,即响应特定刺激,例如光、温度或pH收缩或膨胀的聚合物。智能聚合物在例如″In Situ Activation ofMicroencapsulated Drugs(MSC-22866),″NASA Tech Briefs,Vol.24,No.9(September 2000),第64页、“Externally TriggeredMicrocapsules Release Drugs In Situ(MSC-22939),NASA Tech Briefs,(April 2002),第50页、以及于2000年8月8日属于Morrison和Mosier的U.S.专利号6,099,864中描述。在一些情况下,联合使用超过一个外源刺激以激活释放。
为提高定位/靶向效率,一级粒子利用多个,即超过一个优选彼此互不干扰的识别/定位/靶向因子。例如,一级粒子拥有如上论述的选 定的非球形形状,同时在其表面上携带肿瘤-靶向抗体。
一些实施方案中,以聚合物链部分地或全部地包被一级粒子的表面。在制作血管内级粒子后添加聚合物链。聚合物链可为亲水链,例如聚乙二醇(PEG)链或合成的glycocalix链,用于克服网状内皮系统的细胞对粒子的摄取,从而延长血管内级粒子的血循环。亲水基团也用作增强多级递送器的溶解度。
以聚合物链衍生出多种材料。例如,当粒子的表面材料包含聚合物时,通过连接聚合物的羧基和聚合物链中的氨基或羟基附上聚合物链;如果粒子的表面材料包含金属例如金,经由硫醇化学将聚合物链连接于表面;当粒子的表面材料包含氧化物,例如氧化硅、氧化钛或氧化铝,使用硅烷化学附上聚合物链。
除一种或多种二级粒子外,一级粒子的贮存器含一种或多种另外的试剂。所述另外的试剂包括另外的活性试剂,例如治疗剂或成像剂,靶向剂,一种或多种渗透增强剂或其任意组合。所述渗透增强剂包括一种或多种表1中所列化合物。
表1
对于血管内施用,渗透增强剂包括作用于基底膜的基底膜渗透增强剂,和/或一种或多种作用于紧密连接蛋白(TJP)的渗透增强剂。所述基底膜促进剂的实例是金属蛋白酶,例如胶原酶IV、MMP-2、以及MMP-9。所述抗-TJP渗透增强剂的实例是封闭带毒素。抗-TJP 渗透增强剂和调节紧密连接渗透性的策略在,例如Gonzalez-Mariscal,L.,Nava,P.and Hernandez,S.J.Membr.Biol.,2005.207(2):p.55-68中详细描述。
图2A-B显示根据一个实施方案,当一级粒子定位于靶向的血管位点时渗透增强剂的作用。一级粒子释放渗透增强剂,在靶向的血管上生成一种或多种窗口,二级粒子通过此窗口穿入血管。
一些实施方案中,一级粒子拥有一种或多种将贮存器与接触内皮或表皮细胞的表面液态连接的通道。对于血管内施用,所述一级粒子为微米制作或纳米制作的粒子,例如在U.S.专利申请公布号2003/0114366和U.S.专利号6,107,102中详细描述的那些,对于口服施用,所述一级粒子为微米或制作的粒子,例如在U.S.专利号6,355,270中公布的那些。
一些实施方案中,贮存器和通道是一级粒子的主体内的孔。在所述情况下,一级粒子含有多孔或纳米多孔材料。优选地,控制多孔或纳米多孔材料的孔以获得下一级粒子的期望的装载量和期望的释放率。具有可控制的孔尺寸的纳米多孔材料为氧化物材料,例如氧化硅、氧化铝、氧化钛或氧化铁。纳米多孔氧化物粒子(也称为溶胶凝胶粒子)的制作,在例如Paik J.A.et.al.J.Mater.Res.,Vol.17,Aug 2002.The nanoporous material with controllable pore size may be alsonanoporous silicon中详细描述。具有可控制的孔尺寸的纳米多孔材料也可为纳米多孔硅。关于纳米多孔硅粒子的制作的细节,参考CohenM.H.et.al.Biomedical Microdevices 5:3,253-259,2003。通过在从无孔硅形成纳米多孔硅的过程中改变电流和蚀刻时间实现孔密度、尺寸、形状和/或定位的控制。也可通过改变用作形成纳米多孔硅的无孔硅中的掺杂物实现孔密度、尺寸、形状和/或定位的控制。因而,可配置纳米多孔的孔尺寸、密度、尺寸、形状和/或定位使其有效装载二级粒子。
一些实施方案中,纳米多孔一级粒子的孔尺寸为,例如,从约1nm到约200nm;或从约2nm到约100nm。一些情况下,纳米多孔一级粒子的孔尺寸为从约3到约10nm或从约5到约7nm。然而在一些情 况下,纳米多孔一级粒子的孔尺寸为从约10到约60nm、或从约20到约40nm。
一些实施方案中,为了促进二级粒子装载入多孔或纳米多孔的孔中,将所述材料进行化学和/或静电修饰使其与二级粒子的化学和/或静电表面特性相容。例如,为装载带负电的二级粒子,优选使用带正电的孔表面。通过,例如,在孔表面安置含氨基的分子,例如3-氨丙基三乙氧基硅烷实现正电荷。为装载带正电的二级粒子,优选使用带负电的孔表面。通过,例如,用水氧化孔表面实现孔表面的负电荷。
一些实施方案中,一级粒子完全没有通道。所述粒子含有,例如,生物可降解的材料。对于口服施用,将材料设计为在胃肠道中消蚀。例如,一级粒子由金属组成,例如铁、钛、金、银、铂、铜、及其合金和氧化物。所述生物可降解的材料也是生物可降解的聚合物,例如聚原酸酯、聚酸酐、聚酰胺、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚磷腈、以及聚酯。生物可降解的聚合物的实例在,例如,U.S.Pat.Nos.4,933,185,4,888,176和5,010,167中详细描述。所述生物可降解的聚合物的特定实例包括聚(乳酸)、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚羟基丁酸、聚(N-棕榈酰-反式-4-羟基-L-脯氨酸酯)和聚(DTH碳酸盐)。
一些实施方案中,一级粒子的主体包括两个或更多配置成含二级粒子的不同群体的区域。例如,一级粒子的主体具有配置成含二级粒子的第一群体的第一区域和配置成含二级粒子的第二群体的第二区域。例如,由多孔的纳米多孔材料组成的一级粒子为其体具有两个或更多彼此互不相同的多孔区域。纳米多孔一级粒子的主体包括至少在一个特性例如孔密度、孔几何学、孔电荷、孔表面化学、孔定向或其任意组合上彼此互不相同的第一多孔区域和第二多孔区域。将所述第一和第二区域分别配置成含二级粒子的第一和第二群体。
一些实施方案中,二级粒子的第一和第二群体在至少一个特性例如尺寸、形状、表面化学修饰、表面电荷或其组合上不同。
一些实施方案中,二级粒子的第一和第二群体含相同的活性试剂。然而,一些实施方案中,二级粒子的第一和第二群体分别含彼此 互不相同的第一活性试剂和第二活性试剂。
配置二级粒子的第一和第二群体使其执行不同功能。例如,一些实施方案中,配置第一和第二群体使其分别靶向彼此互不相同的第一和第二靶位点。
一些实施方案中,配置第一群体使其靶向受试者体内的特定位点,而配置第二群体使其在受试者的血液系统中自由循环。
一些实施方案中,第一和第二群体靶向受试者体内的相同靶位点但在所述体位点执行不同功能。例如,第一群体含待递送至靶位点的治疗剂,而第二群体含待递送至靶位点以使靶位点成像或显现的成像剂。
一级粒子的主体的第一和第二区域为至少它们中的一个是生物可降解的区域。优选地,一级粒子的主体的第一和第二区域均为生物可降解。
一级粒子的主体的第一和第二区域具有释放二级粒子的第一和第二群体的不同的特征时间。一些实施方案中,从第一区域释放二级粒子的第一群体的特征时间和从第二区域释放二级粒子的第二群体的特征时间均大于当施用于受试者时一级粒子到达靶位点的递送和/或定位的特征时间。
一些实施方案中,配置一级粒子使其在暴露于生理介质,例如存在于一级粒子的靶位点的介质时分成包含第一区域的第一组分和包含第二区域的第二组分。所述暴露在,例如,将粒子施于受试者时发生。
一些实施方案中,配置一级粒子的主体的第一和第二区域使其在将粒子施于受试者时执行不同的功能。例如,配置一级粒子的主体的第一和第二区域使其分别克服彼此互不相同的第一和第二生物屏障。所述生物屏障每一个选自,例如,血液流变学屏障、网状内皮系统屏障、内皮屏障、血脑屏障、肿瘤相关的渗透性间质压力屏障、离子和分子泵屏障、细胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其组合。
二级粒子
二级粒子为任何适合装入一级粒子的贮存器的微米粒子或纳米 粒子。例如,某些实施方案中,对于口服和肺部施用,二级粒子与用于血管内施用的一级粒子一样。
配置二级粒子使其克服至少一个选自血液流变学屏障、网状内皮系统屏障、内皮屏障、血脑屏障、肿瘤相关的渗透性间质压力屏障、离子和分子泵屏障、细胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其联合的屏障。
二级粒子的组成、尺寸和形状无特别限制。例如,对于多种施用途径,二级粒子为基于脂质的粒子,例如脂质体、胶束或脂质包封的全氟化碳乳剂;醇质体(ethosome);碳纳米管,例如单壁碳纳米管;富勒烯纳米粒子;金属纳米粒子,例如金纳米壳或三角形银纳米粒子;半导体纳米粒子,例如量子点或掺硼硅纳米线;聚合物纳米粒子,例如由生物可降解的聚合物制成的粒子和掺离子的聚丙烯酰胺粒子;氧化物纳米粒子,例如氧化铁粒子、聚合物包被的氧化铁纳米粒子或氧化硅粒子;病毒粒子,例如工程病毒粒子或工程病毒-聚合物粒子;聚离子粒子,例如受束leashed聚阳离子;陶瓷粒子,例如基于二氧化硅的陶瓷纳米粒子;或其组合。
一些实施方案中,设置二级粒子使其靶向受试者体内的特定靶位点。所述靶位点与一级粒子靶向的靶位点相同或不同。
例如,二级粒子的表面具有一种或多种与某些类型细胞的表面标志物抗原缀合的抗体。因而,二级粒子选择性靶向携带所述标志物抗原的细胞。携带标志物抗原的细胞的实例包括干细胞或成克隆细胞和肿瘤细胞。CD33抗体靶向干细胞或成克隆细胞上的表面标志物抗原。有许多针对肿瘤特异抗原的单克隆抗体可用,参考,例如《癌症》,第3版,De Vita等人编辑,pp.301-323、Janeway等人《免疫学》第5版,Garland出版社,New York,2001、A.N.Nagappa,D.Mukherjee&K.Anusha “治疗用单克隆抗体”,PharmaBiz.com,星期三,9月22,2004。表2呈现FDA批准的用于癌症的治疗的单克隆抗体。
表2
一些实施方案中,配置二级粒子使其在从一级粒子释放时在受试者的血液系统中自由循环。在一些情况下,所述二级粒子具有无靶标部分(例如抗体)的表面。自由循环的二级粒子用于,例如,报告与一级粒子本身关联的治疗剂的治疗作用。
一些实施方案中,二级粒子的表面没有亲水聚合物链,例如安置于其上的聚乙二醇(PEG)。在某些情况下,这是多级递送载体的一个优点,因为PEG链通常连接于脂质体和其他纳米粒子以延迟网状内皮系统的巨噬细胞的识别和捕获。遗憾的是,PEG链也掩盖纳米粒子表面的抗体因而抑制抗体的靶向/定位能力。多级递送载体中,连接于一级粒子的PEG执行对RES巨噬细胞的屏蔽。尽管PEG掩盖一级粒子上的抗体,一级粒子的识别/定位能力不限于抗体,因为其他因素例如粒子的尺寸和形状也有助于所述能力。一些实施方案中,二级粒子的表面具有亲水聚合物链,例如安置于其上的PEG链。
一些实施方案中,修饰二级粒子的表面,例如,以增强二级粒子装载入一级粒子的贮存器的能力和/或增强二级粒子到达其靶位点的能力。所述表面修饰包括二级粒子的表面的化学修饰和/或二级粒子的表面的静电修饰。例如,为促进二级粒子装载入多孔或纳米多孔一级粒子中,修饰二级粒子的表面以使其特性与多孔或纳米多孔一级粒子的孔的表面特性相容。例如,当多孔或纳米多孔一级粒子的孔带正电时,优选修饰二级粒子的表面以使其为静电中性或带负的表面电荷;而当多孔或纳米多孔一级粒子的孔带负电时,优选修饰二级粒子的表面以使其为静电中性或带正的表面电荷。采用上文详述的与一级粒子相同的方法进行二级粒子的化学和/或静电表面修饰。
对于含脂质的二级粒子,例如脂质体或胶束,通过在它们的脂质层内合并入影响脂质体的静电电荷的脂质进行静电修饰。例如,为形成含带正电的阳离子脂质的粒子,使用阳离子脂质,例如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP);为形成含带负电的阴离子脂质的粒子,使用阴离子脂质,例如二油酰磷脂酰甘油(DOPG);为形成含中性脂质的粒子,使用中性脂质,例如DOPC。
一些实施方案中,一旦结合于靶向的一个细胞或多个细胞,二级粒子即将其内容物释放到细胞的细胞质中。一些实施方案中,所述释放由外源因子激活,例如电磁辐射。对于富勒烯纳米粒子和碳纳米管,所述辐射为射频辐射,而对于金壳纳米粒子,所述辐射为近红外辐射。外源辐射对纳米粒子的激活在,例如,Hirsch,L.R.,Halas,N.J.&West,J.L.Anal.Chem.75,2377-2381(2003)、Hirsch,L.R.,Halas,N.J.&West,J.L.Proc.Natl Acad.Sci.USA 100,13549-13554(2003)、以及O’Neal,D.P.,Halas,N.J.&West,J.L.Cancer Lett.209,171-176(2004)中详细描述。
一些实施方案中,二级粒子的内容物为一种或多种活性试剂本身。一些实施方案中,二级粒子内部含三级粒子,其自身内部含一种或多种活性试剂。所述三级粒子为,例如,小到足以能够通过靶向的细胞的核膜的粒子。因而,三级粒子用于向细胞的核递送活性试剂, 所述活性试剂为作用于核酸的试剂或基因治疗剂。为能通过核膜,三级粒子范围从约3nm到约10nm。在3nm到10nm尺寸范围内递送纳米粒子的能力是多级递送载体的优点之一,因为所述粒子经由注射的传统施用通常导致它们的立即完全清除。
一些实施方案中,多级载体包括第三级。第三级为任何适合装入二级粒子的纳米粒子。和二级粒子一样,三级粒子为基于脂质的粒子,例如脂质体、胶束或脂质包封的全氟化碳乳剂;醇质体;碳纳米管,例如单壁碳纳米管;富勒烯纳米粒子;金属纳米粒子,例如金纳米壳或三角形银纳米粒子;半导体纳米粒子,例如量子点或掺硼硅纳米线;聚合物纳米粒子,例如以生物可降解的聚合物制成的粒子和掺离子的聚丙烯酰胺粒子;氧化物纳米粒子,例如氧化铁粒子、聚合物包被的氧化铁纳米粒子或氧化硅粒子;病毒粒子,例如工程病毒粒子或工程病毒-聚合物粒子;聚离子粒子,例如受束聚阳离子;陶瓷粒子,例如基于二氧化硅的陶瓷纳米粒子;或其组合。一些实施方案中,三级粒子为核酸纳米粒子,例如小干扰RNA(siRNA)粒子。
将后级粒子装载入前级粒子的贮存器中
通过任何适当的技术将后级粒子引入前级的前级粒子中。一些实施方案中,将制作的纳米多孔前级粒子浸泡在含携载液和后级粒子的溶液中,后级粒子通过毛细管作用和/或扩散进入前级粒子的孔。所述携载液为生物无害的并相对于前级粒子的材料为中性的液体。携载液(carrying fluid)的实例为磷酸缓冲盐水(PBS)或去离子水。所述溶液也含一种或多种期望引入一级粒子中的另外的试剂,例如一种或多种另外的治疗剂和一种或多种适当的渗透增强剂。为最大化装载入后级粒子,使用具有后级粒子的饱和浓度的溶液。
以悬浮液的形式将前级粒子引入所述溶液。多孔粒子悬浮液的制备在,例如,美国专利申请号2003/0114366中详细描述。在浸入含后级粒子的溶液之前将纳米多孔粒子的孔干燥。
一些实施方案中,在引入前级粒子之前将含后级粒子孔的溶液脱气。然后,在密封室内将前级粒子浸入脱气的溶液中。将前级粒子置 于降低的压力下以保证将留存的空气从粒子中的孔驱逐出来。然后将前级粒子完全浸没于溶液中并将密封室中的压力提高至稍高于大气压以保证溶液进入前级粒子的孔。然后用滤网截获前级粒子并使用下述三种方法中的一种干燥。
一些实施方案中,为除去留存于浸泡的前期粒子的贮存器中的空气,将容器中的压力降低然后提高至稍高于大气压。
一些实施方案中,在把溶液灌入前级粒子的孔中之后,通过以下三种方法中的一种或更多实现干燥。在真空室中于降低的压力下通过蒸发、或通过将一股暖空气或惰性气体例如氮气吹过收集于滤网上的表面粒子、或通过冷冻干燥将水除去。在冷冻干燥的情况下,将平的换热器放置于收集有前级粒子的滤网的良好热接触位置,例如直接置于其下。将温度范围为-20℃到-60℃的制冷液,例如氟利昂,或冷的液体,例如液氮,通过换热器的流入口和排出口以使保留于孔内的任何水冻结。然后将压力降低直到所有水升华。
一些实施方案中,为了将后级粒子装载入纳米多孔前级粒子中,配置含前级纳米多孔粒子、后级粒子和载体液(carrier liquid)的溶液。所述载体液为生理缓冲液,例如Tris-HCl。通过使用标准技术选择载体液的浓度以将后级粒子最大化地装载入纳米多孔前级粒子。例如,一些实施方案中,对于Tris-HCl,最佳浓度选自从1到500mM。
选择后级粒子的几何学特性,例如尺寸和形状,使其与纳米多孔前级粒子的孔特性,例如孔密度、孔尺寸、和孔定向相容。
一些实施方案中,通过搅动含后级粒子和前级粒子两者的溶液促进后级粒子对纳米多孔前级粒子的装载入。通过在转轮内旋转溶液进行所述搅动。使用标准技术使搅动条件,例如转轮的旋转速度最优化,以获得期望的装载程度和/或装载时间。
一些实施方案中,通过改变溶液中后级粒子的浓度控制后级粒子对纳米多孔前级粒子的装载入。一些实施方案中,通过采用后级粒子在溶液中的更高浓度获得更高的装载量。然而,一些实施方案中,通过采用低于后级粒子在溶液中的最高的可能浓度的后级粒子的浓度, 获得更高的后级粒子的装载量。使用标准方法测定使后级粒子对纳米多孔前级粒子的装载入最大化的浓度。
一些实施方案中,通过修饰纳米多孔前级粒子的孔表面和/或后级粒子的表面以使它们更加相容来控制后级粒子对纳米多孔前级粒子的装载入。通过修饰两者中任一个表面上的表面化学基团和/或修饰两者中任一个表面上的电荷进行所述修饰。例如,一些实施方案中,为获得后级粒子的更高的装载量,使用后级粒子的带负电的表面和前级纳米多孔粒子的带正电的多孔表面或后级粒子的带正电的表面和前级纳米多孔粒子的带负电的多孔表面。一些实施方案中,以彼此相容的化学部分修饰纳米多孔前级粒子的孔表面和后级粒子的表面。例如,以羧基修饰纳米多孔前级粒子的孔表面和后级粒子的表面中的一个,而以氨基修饰另一个。
活性试剂
活性试剂为治疗剂、成像剂或其组合。活性试剂为任何从含其的粒子释放的适当试剂。活性试剂的选择取决于应用。
当活性试剂不是任何级的粒子本身时,使用任何适当的技术将其引入粒子。例如,当所述活性试剂为多柔比星时,使用工作实施例4中详细描述的方法将其引入脂质体粒子。
当活性试剂为多级递送载体的某一级的粒子时,使用上述方法中的一种将所述活性试剂引入。
治疗剂
治疗剂为任何在动物,例如哺乳动物或人类中的靶向的位点引起期望的生物效应的生理上或药理上的活性物质。治疗剂为无限制的任何无机或有机化合物,包括任何已鉴定或未鉴定的肽、蛋白质、核酸、和小分子。治疗剂以多种形式存在,例如未改变的分子、分子复合物、药学可接受的盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐、以及类似的物质。对于酸性治疗剂,使用金属的盐,胺或有机阳离子,例如,季铵。药物的衍生物,例如碱、 酯和酰胺也用作治疗剂。以其水溶性衍生物、或其碱衍生物的形式使用非水溶性的治疗剂,在两者之中任一种情况下,其或通过其递送,由酶转化、由身体pH水解、或通过其他代谢过程使其达到最初的治疗上的活性形式。
治疗剂为化疗试剂、免疫抑试剂、细胞因子、细胞毒性试剂、溶核化合物、放射性同位素、受体、以及天然的或通过合成或重组方法制备的药物前体活化酶、或其任何组合。
受典型的多药耐药影响的药物,例如长春花生物碱类(例如,长春碱和长春新碱)、蒽环类(例如,多柔比星和柔红霉素)、RNA转录抑试剂(例如,放线菌素-D)以及微管稳定药物(例如,紫杉醇)作为治疗剂具有特定用途。
癌症化疗试剂为优选的治疗剂。可用的癌症化疗药物包括氮芥、亚硝基脲、次乙亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢药、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷类、长春花生物碱类、拓扑异构酶抑试剂和激素试剂。化疗药物的实例是放线菌素-D、爱克兰、阿糖胞苷、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡鲁胺、博莱霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、碳铂(Carboplatinum)、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)、环磷酰胺、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、DTIC、表阿霉素、次乙亚胺、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟脲嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、赫赛汀、六甲铵、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、甲氨喋呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、类固醇、链佐星、STI-571、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、塞替派、拓优得、拓扑替康、曲奥舒凡、三甲曲沙、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达。
可用的癌症化疗药物也包括烷基化试剂,例如塞替派和环磷酰 胺;烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶例如苯佐替哌(Benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(Meturedopa)和乌瑞替哌(Uredopa);次乙亚胺和methylamelamines,包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺,三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥;硝基脲例如Cannustine、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素例如阿克拉霉素、放线菌素、Authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、加利车霉素、Carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、Chromoinycins、放线菌素C、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素(Potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌本美司、净司他丁和佐柔比星;抗代谢药例如甲氨喋呤和5-氟脲嘧啶(5-FU);叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤和三甲曲沙;嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤;嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎胞苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷和5-FU;雄激素例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、Rnepitiostane和睾内酯;抗肾上腺药物例如氨鲁米特、米托担和曲洛司坦;叶酸补充物例如亚叶酸;醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基酮戊酸;安吖啶;Bestrabucil;比生群;依达曲沙;Defofamine;秋水仙胺;地吖醌;Elfornithine;依利醋铵;依托格鲁;硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝氨丙吖啶;喷司他丁;蛋氨氮芥;吡柔比星;鬼臼酸;2-乙基酰肼;丙卡巴肼; 雷佐生;西佐喃(Sizofrran);锗螺胺;替奴佐酸;三亚胺醌;2,2’,2”-三氯三乙胺;乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露醇氮芥、二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;Gacytosine;阿拉伯糖苷 (“Ara-C”);环磷酰胺;噻替哌;紫杉烷,例如紫杉醇( Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和多西紫杉醇( Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨喋呤;铂类似物例如顺铂和卡铂;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺维本;Novantrone;替尼泊甙;柔红霉素;氨基喋呤;希罗达;伊班膦酸;CPT-11;拓扑异构酶抑试剂RFS 2000;氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸;Esperamicins、卡培他滨和以上任何一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。也包括作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素试剂,例如抗雌激素药物包括例如他莫昔芬、雷洛西芬、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、奥那司酮、和托瑞米芬(法乐通);和抗雄激素药物例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、和戈舍瑞林;和以上任何一种上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。
细胞因子也作为治疗剂使用。所述细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子、以及传统的多肽激素。细胞因子中包括的有生长激素例如人类生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素以及牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;松驰素原;糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝细胞生长因子;成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳素;肿瘤坏死因子-α和-β;缪勒管抑制物质;鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整合素;血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);成骨因子;干扰素例如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);以及粒细胞-CSF(GCSF);白细胞介素(ILs)例如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β;以及其他多肽因 子包括LIF和kit配体(KL)。如此处所用,术语细胞因子包括源于天然或来自重组细胞培养和天然序列细胞因子的生物活性等同物的蛋白质。
成像剂
成像剂为提供关于动物例如哺乳动物或人的体内靶向的位点的成像信息的任何物质。成像剂包含磁性材料,例如氧化铁用以磁共振成像。对于光学成像,活性试剂为,例如,半导体纳米晶体或量子点。对于光学相干断层扫描成像,成像剂为金属,例如,金或银、纳米笼状粒子。成像剂也可为超声造影剂,例如微米气泡或纳米气泡或氧化铁微米粒子或纳米粒子。
施用
为了治疗、预防和/或监测生理状态,例如疾病,将多级递送载体作为包括多个所述载体的组合物的一部分通过任何合适的施用方法施用于受试者,例如人类。用于特定应用的具体方法由主治医师决定。一般来说,组合物通过以下途径中的一种施用:局部、胃肠外、吸入/肺部、口服、阴道或直肠。
多级递送载体的实施方案对肿瘤学应用,即对治疗和/或监测癌症或状态,例如与癌症相关的肿瘤尤其有用。例如,通过局部施用,优选粘性悬浮液,治疗和/或监测皮肤癌;通过吸入雾化水相微装置悬浮液治疗和/或监测肺癌;通过微装置悬浮液的阴道施用治疗和/或监测宫颈癌;以及通过所述悬浮液的直肠施用治疗和/或监测直肠癌。治疗应用的多数涉及胃肠外施用的一些类型,包括静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)和皮下(s.c.)注射。
多级递送载体为全身或局部施用。上述非胃肠外施用的实例,以及i.m.和s.c.注射,为局部施用的实例。血管内施用为局部或全身。通过使用导管系统,例如CAT-扫描导管,采用局部施用将治疗物质送达已知病灶的附近。常规注射,例如推注i.v.注射或连续/滴流补给的i.v.输液一般为全身的。
对于静脉施用,将多级递送载体配置为含多个所述载体的悬浮 液。优选地,所述载体在它们的尺寸和它们的内容上是统一的。将上述载体悬浮于任何合适的水相携载载体中以形成悬浮液。合适的药物载体为在所用的剂量和浓度下对接受者无毒的并与配方中其他成分相容的载体。微米制作的粒子的悬浮液的制备公开于,例如,US专利申请公开号20030114366。
对于口服施用,将多级递送载体以由多个载体组成的口服组合物施用。优选地,组合物中的载体在尺寸上是统一的,即每个载体的一级粒子具有相同的或基本相同的尺寸;每个载体的二级粒子具有相同的或基本相同的尺寸。通过将载体与合适的非水相载体例如油或微粉化的粉末混合,以单位剂量的量填入标准的肠溶胶囊或,备选地,压制成片并以肠溶包衣材料包被以制备所述组合物。肠溶包衣确保载体以干的形式在胃的低(酸性)pH环境中转运并在小肠或大肠的预先选定的区域释放。
以保护性的聚合物包被所述组合物。通过薄膜包衣工艺将此材料应用于片剂或胶囊以保护产品不受胃环境的作用或防止药物在胃环境中释放。所述包衣为那些在胃中保持完整,但一旦其到达小肠就溶解并释放剂型的内容物的物质。肠溶包衣的目的是延迟一级粒子的内容物的释放。
使用最广泛的一种肠溶聚合物是邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)。另外一种有用的聚合物是聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP),它比CAP更不易渗透水分、更不易水解以及能在更低的pH电离。这些特性允许在十二指肠更多可靠的释放。目前使用的聚合物的另外一个实例是那些基于带酸性可电离部分的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物的物质。这些中的代表是可从Rohm Pharma购得的商品名为Eudragit的聚合物。通常,以片剂或胶囊的从约0.5%重量到约10%重量应用肠溶包衣。
一些实施方案中,使用水溶性较小的聚合物,例如甲基纤维素,以延迟粒子于十二指肠释放之后药物从小室的释放。采用由ALZA公司(Mt.View,Calif.)开发的ChronSetRTM技术在经过胃进入小肠 之后于指定时间在靶向的位点释放一团多级递送载体。在此情况下,将载体的悬浮液装载入ChronSet胶囊。吞服以后,胶囊通过胃而保持完整。设计外壳以调控系统的渗透性可渗透部分的水吸收的比率。渗透机制扩张推动并使胶囊的两半分离。将胶囊一半设计为特定的长度以在预先选定的时间产生分离。在施用后2到20小时每个胶囊的内容物被排出至肠腔内。在15分钟时间范围内超过80%的内容物(在此情况下为药物填充的微米制作的粒子的悬浮液)被排出。此方法提供在小肠或大肠的预先选定的区域释放载体的悬浮液的手段。使用所述系统在小肠或大肠中最适于结合的位点,例如,含针对嫁接于粒子上的粘膜附着配体的受体的区域,和/或最适于吸收的位点,例如对一级粒子中所含的渗透增强剂敏感的肠上皮的区域释放多级递送载体。
此处所述实施方案通过,但绝不限于,以下工作实施例进一步阐明。
工作实施例1
进行了以下实验研究选定的二级粒子对纳米多孔硅一级微米粒子的装载入和从其释放。也研究了纳米多孔硅一级粒子的生物降解和生物相容性。
材料和方法
Z2分析
将粒子于Z2 粒子计数器和尺寸分析仪(BeckmanCoulter)中计数。用于粒子分析的孔尺寸为50μm。将分析的尺寸下限和上限设定在1.8和1.6μm。为了分析,将粒子悬浮于仪器( II Diluent)的平衡的电解质溶液中并计数。粒子的初始悬浮液的总体积不超过最终分析体积的0.3%。
硅微米粒子的氧化
将IPA中的硅微米粒子在保持于热台(80-90℃)上的玻璃烧杯中干燥。将硅粒子在piranha(1体积H2O2和2体积H2SO4)中氧化。加入H2O2后将粒子超声处理然后加入酸。将悬浮液加热至100-110℃ 并维持2小时,间断超声处理以使粒子分散。然后将悬浮液在DI水中洗涤直至悬浮液的pH为~5.5-6。然后将粒子转移至适当的缓冲液、IPA或保存于水中并冷冻直到进一步使用。
硅粒子的APTES表面修饰
在硅烷化过程之前,将氧化的粒子在1.5M硝酸中羟化大约1.5小时(室温)。将粒子在DI水中洗涤3-5次(洗涤包括悬浮于水中和离心,之后去除上清以及所述步骤的重复)。
通过在IPA中将它们洗涤两次将粒子悬浮于IPA(异丙醇)中。然后在室温下将它们悬浮于含0.5%(v/v)的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的IPA中维持45分钟。然后通过离心将粒子用IPA洗涤4-6次并保存于IPA中并冷冻。备选地,将它们等分成小份,干燥并在真空和干燥剂下保存直至进一步使用。
将PEG连接于APTES修饰的粒子
将PEG连接于微米粒子,为进一步与抗-VEGFR2抗体缀合提供间隔子。使用Fmoc-PEG-NHS,其为快速缀合于胺基提供NHS酯以及Fmoc基团以保护PEG上的胺。将106-109个粒子/ml的APTES修饰的微米粒子重悬于PBS(pH~7.2)中,并以1-10mM的浓度将PEG-NHS加到粒子中。
缀合于室温下进行30min到1h,然后通过在PBS中离心3-5次洗涤未反应的Fmoc-PEG-NHS部分。用哌啶将缀合于硅微米粒子的PEG的远端上的Fmoc基团脱保护(20%v/v,30min),为进一步与抗体缀合提供PEG上的自由胺。
抗-VEGFR2的荧光标记
使用来自Invitrogen Corp.的抗体标记试剂盒将VEGFR2的抗体与Alexa 488缀合。通过依照该试剂盒的手册中提供的步骤将荧光标签缀合于抗体。使用1mg/ml的抗体进行标记。通过采用 730UV/Vis分光光度计(Beckman Coulter Inc.,CA,USA)在280和494nm分析抗体测定缀合于荧光标签上的抗体的量。测定缀合的抗体的量为407μg/ml。
将抗-VEGFR2缀合于PEG修饰的粒子
将重悬于PBS的硅粒子用异质双功能的交联剂ANB-NOS(溶于DMF并加至10mM的最终浓度)处理30min到1h。反应在黑暗中进行以防止交联剂上的苯硝基叠氮部分的光解。然后用PBS将粒子洗涤以除去未反应的交联剂并与荧光标记的抗-VEGFR2混合。每个实验点使用4.6x106个粒子。使用的不同的抗体的量为0.814、0.407和0.163μg,分别相当于2.7、1.35和0.54μg/ml,暴露于UV光10-15分钟将抗体上存在的胺基缀合于附着的交联剂。
测定将氨基-PEG量子-点(Q-点)装载入多孔硅微米粒子的缓冲液浓度
在低结合的微量离心管中,将3.0x105个大孔(LP)和小孔(SP)氧化的硅(300x106个粒子/ml的浓度保存)或APTES修饰的微米粒子(200x106个粒子/ml的浓度保存)和2μM氨基-PEG Q-点或羧基q-点在含10、20、50、100或200mM的TRIS-HCl pH 7.3的溶液中进行组合。以每个实验点20μl的终体积将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。图3,A区呈现将羧基修饰的量子点和氨基修饰的量子点装载入APTES修饰的LP和SP硅粒子的时间动态的结果。图4A-B,A-D区呈现将羧基修饰的量子点和氨基修饰的量子点装载入LP氧化的硅粒子(A区)、LP APTES修饰的硅粒子(B区)、SP氧化的硅粒子(C区)、APTES修饰的SP硅粒子(D区)的时间动态的结果。A-D区的每一个也呈现装载PEG-FITC单壁碳纳米管的时间动态,如下所述。
在低结合的微量离心管中,将3.0×105个大孔(LP)和小孔(SP)氧化的硅(300×106个粒子/ml的浓度保存)或APTES修饰的微米粒子(200×106个粒子/ml的浓度保存)和2μM氨基-PEG Q-点或羧基q-点在含10、20、50、100或200mM的TRIS-HCl pH 7.3的溶液中进行组合。以每个实验点20μl的终体积将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。图3,A区呈现将羧基修饰的量子点和氨基修饰的量子点装载入APTES修饰的LP和SP硅粒子的时间动态的结果。图4,A-D区呈现将羧基修饰的量子点和氨基修饰的量子点装载入LP氧化的硅粒子(A区)、LPAPTES修饰的硅粒子(B区)、SP氧化的硅粒子(C区)、APTES修饰的SP硅粒子(D区)的时间动态的结果。A-D区的每一个也呈现装载PEG-FITC单壁碳纳米管的时间动态,如下所述。
测定用于多孔硅微米粒子装载的氨基-PEG和羧基Q-点的浓度
在低结合的微量离心管中,将3.0x105个LP和SP氧化的硅或APTES修饰的微米粒子分别与0.01、0.1、1、10、100、1000和2000nM氨基-PEG或羧基Q-点在200mM的TRIS-HCl pH 7.3中进行组合。以每个实验点20μl的终体积将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
测定将氨基-PEG和羧基Q-点装载入多孔硅微米粒子的时间
在低结合的微量离心管中,以80μl终体积将1.2×106个LP和SP氧化的硅或APTES修饰的微米粒子与2μM氨基-PEG Q-点或羧基Q-点在200mM TRIS-HCl pH 7.3中进行组合。将粒子和Q-点在转轮(20rpm)内于25℃孵育并在15、30、45、和60分钟从瓶中采样。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
将氨基-PEG和羧基Q-点装载入氧化的和APTES修饰的多孔硅微米粒子
将2.1×106个氧化的或LP APTES修饰的硅微米粒子分别与2μM氨基-PEG Q-点或羧基Q-点在TRIS-HCl 200mM pH7.3溶液中进行组合。最终孵育体积为140μl。将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。然后在1.4mL去离子水(10倍稀释)中洗涤微米粒子,并在Beckman Coulter Allegra X-22离心机中以4200RPM离心5分钟。将粒子团块重悬于70μl的去离子水中并从瓶中取出10μl,用TRIS20mM,pH 7.3溶液稀释至150μl终体积。立即用Becton DickinsonFACScalibur流式细胞仪读取样品的荧光并记录为时间0或装载荧光。
从氧化的和APTES修饰的多孔硅微米粒子释放氨基-PEG和羧基Q-点
将剩余的60μl稀释10倍至600μL的TRIS-HCL 20mM NaCl0.9%释放缓冲液中。从此溶液中取出100μl并通过将样品等分到预先装有400μL TRIS-HCL 20mM NaCl 0.9%释放缓冲液的管中再稀释5倍。在该点最终稀释为500倍。将样品置于转轮(20rpm)中于37℃转动一定量的时间(15、45、90、180、360和1200分钟)。在每一个时间点将等分在Beckman Coulter Allegra X-22离心机中4200RPM离心5分钟。将每个团块重悬于150μl的TRIS 20mM中并立即用Becton Dickinson FACScalibur流式细胞仪读取荧光。图5A呈现从LP氧化的硅粒子释放氨基-修饰的量子点的时间动态。图5B呈现 从LP APTES修饰的硅粒子释放羧基-修饰的量子点的时间动态。
测定用于将聚(乙二醇)(PEG)硫氰酸荧光素(FITC)缀合的单壁碳纳米管(SWNT)装载入多孔硅微米粒子的缓冲液浓度
在低结合的微量离心管中,将3.0×105个大孔氧化的硅或APTES修饰的微米粒子与20ng/μl PEG-FITC-SWNT在含不同摩尔浓度(20、100、200mM)的TRIS-HCl pH 7.3的溶液中进行组合。每个实验点的终体积为20μl。将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。孵育后,将样品重悬于150μl Tris 20mM中并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
测定将PEG-FITC-SWNT装载入多孔硅微米粒子的时间
在低结合的微量离心管中,以80μl终体积将1.2×106个大孔氧化的硅或APTES修饰的微米粒子与20ng/μl PEG-FITC-SWNT在20mM TRIS-HCl pH 7.3中进行组合。将粒子和SWNT在转轮(20rpm)内于25℃孵育并在15、30、45和60分钟从瓶中采样。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
测定用于多孔硅微米粒子装载的PEG-FITC-SWNT的浓度
在低结合的微量离心管中,以每个实验点20μl终体积将3.0×105个LP或SP氧化的硅或APTES修饰的微米粒子与1、10、20和50ng/μlPEG-FITC-SWNT在20mM TRIS-HCl pH 7.3中进行组合。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
使用荧光计测定PEG-FITC-SWNT的荧光强度和淬灭效应
使用SPECTRAmaxA荧光计测定PEG-FITC SWNT在20mMTRIS-HCL pH 7.3中的浓度曲线。进行连续稀释,以35ng/μl起始以1∶2的系数向下进行到最小可检测到的量107pg/μl。将等分试样置于96孔板中并使用在485激发和在520发射读取荧光。如通过它们的较弱的荧光所显示,在SWNT的较高浓度观察到荧光淬灭。
将PEG-FITC-SWNT装载入氧化的和APTES修饰的多孔硅微米粒子
将1.8×106个“大孔”(LP,大约30nm)硅微米粒子与20ng/μlPEG-FITC-SWNT在20mM TRIS-HCl pH7.3溶液中进行组合。最终孵育体积为120μl。将样品在转轮(20rpm)内于25℃孵育15分钟。然后在1.2mL去离子水(10倍稀释)中洗涤微米粒子,并在BeckmanCoulter Allegra X-22离心机中以4200RPM离心5分钟。孵育后,将上清取出并置于96孔板中用SPECTRAmax板读数器读取荧光。
将粒子团块重悬于60μl的去离子水中并从瓶中取出10μl,用TRIS 20mM,pH 7.3溶液稀释至150μl终体积。立即用BectonDickinson FACScalibur流式细胞仪读取样品的荧光并记录为时间0或装载荧光。
从氧化的和APTES修饰的多孔硅微米粒子释放PEG-FITC-SWNT
将剩余的50μl稀释10倍至500μL的TRIS-HCL 20mM NaCl0.9%释放缓冲液中。从此溶液中取出100μl并通过将样品等分到预先装有400μL TRIS-HCL 20mM NaCl 0.9%释放缓冲液的管中再稀释5倍。在该点最终稀释为500倍。将样品置于转轮(20rpm)中于37℃转动一定量的时间(15、45、120、240和1200分钟)。在每一个时间点将等分试样在Beckman Coulter Allegra X-22离心机中4200RPM离心5分钟。将上清取出并置于96孔板中用SPECTRAmax板读数器读取荧光。然后将每个团块重悬于150μl的TRIS 20mM中并立即用Becton Dickinson FACScalibur流式细胞仪读取荧光。图5A呈现从LP氧化的硅粒子释放PEG-FITC-SWNT的时间动态。图5B呈现从APTES修饰的LP硅粒子释放PEG-FITC-SWNT的时间动态。
将纳米脂质体装载入氧化的和APTES修饰的多孔硅微米粒子
将1.5×106个LP和SP氧化的硅微米粒子与10ng/μl含Alexa fluo555缀合的siRNA的脂质体在20mM TRIS-HCl pH7.3溶液中进行组合。将粒子和纳米脂质体在转轮(20rpm)内于25℃孵育并于15、30和60分钟后从瓶中采样。孵育后,用Tris 20mM,pH 7.3将样品稀释至150μl并迅速在FACScalibur流式细胞仪上读取荧光强度。
降解
将5×106个LP和SP氧化的硅微米粒子在含2.5mM TRIS和0.9%NaCl pH 7.3(盐水)的溶液或补充了10%FBS(CCM)的细胞培养基中混合。将混合物在转轮(8rpm)内于37℃孵育并在时间0和6、18和24小时之后取SEM、Z2和ICP的样。
如此设计该实验是为了有足够的材料以在同时平行地进行降解研究的三种分析,从而避免由未受控或忽视的变化引起的差异。因此该方法应用于获得的SEM、Z2和ICP样品。
进行了另外的降解实验,为HUVEC细胞的毒性实验提供材料。对于每一个实验点,我们将3×106个LP氧化的或APTES修饰的、或SP氧化的或Aptes修饰的硅粒子置于CCM中在转轮(8rpm)内于37℃孵育24。
ICP
为了解多孔硅粒子是否从溶液中消失,将它们孵育于,将多孔硅粒子溶解于硅酸中并通过名为电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)的技术进行研究。
该方法学允许对存在于溶液中的任何给定元素的绝对数量进行定量。在同一时间点收回样品,Z2和SEM分析并将它们离心以使还未降解的粒子沉降下来。用ICP对通过0.450μm过滤单元过滤的上清进行分析。
细胞培养
将50万个新鲜分离的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(CloneticsTMCambrex Bio Science Walkersville,Inc)铺植于称为完全培养基的补充了10%胎牛血清(FCS,Gibco)、含100IU/ml青霉素(Sigma)、100g/ml链霉素(Sigma)、7.5IU/ml肝素(Sigma)、2ng/ml表皮生长因子(EGF)(R&D system)和250pg/ml内皮细胞生长因子(-ECGF)(BioSource,USA)的M199培养基(Gibco/Life TechnologiesInc.)中。用胰蛋白酶(Sigma)将汇合细胞分开用于传代培养。将细胞扩大培养直至第6代并用于生物相容性研究。
显微镜检查
用带有40X放大镜头的Olympus CKX41显微镜在明场对比分析细胞。用SP-350 Olympus True-Pic TURBO图像处理器相机采集图像。
LDH毒性分析
为了毒性分析的校准,将不同数量的细胞(125、250、500、1000、2000)接种于三个96孔板中。12、24和48小时后,将细胞培养基用含1%Triton的新鲜培养基置换。将细胞在室温(RT)孵育10分钟然后以1200rpm旋转3分钟使细胞沉降,将细胞培养基转移到放置于冰上的复制板中。将100μl含重组催化剂和染料(Biovision LDH细胞毒性分析试剂盒)的溶液加到每个孔中,将板转移到轨道震荡器上,以箔片覆盖并在RT震荡20分钟。然后将板转移到SPECTRAmax荧光计中并读取490nm处的吸光度。所有实验都进行三次重复,结果以平均值和标准偏差表示。
就该实验,将1000个细胞接种,在细胞附着于表面后(约6小时),向培养基中加入重悬于20μl灭菌的去离子H2O中的不同量的LP氧化的、SP氧化的、LP APTES和SP APTES硅粒子(1000、5000和10000,相当于1∶1、1∶5、1∶10的细胞∶粒子比)。作为阳性对照,向细胞中加入20μl灭菌的去离子H2O而作为阴性对照我们向细胞培养基中加入50μg/ml的顺铂。
将板于37℃孵育,在12、24、48和72小时的时间点,除不加Triton以外,如校准分析中所述进行毒性分析。所有实验都进行三次重复,结果以平均值和标准偏差表示。
MTT分析
为了MTT分析的校准,将不同数量的细胞(125、250、500、1000、2000)接种于三个96孔板中。12、24和48小时后,将细胞培养基用含50μl的MTT染料的新鲜培养基置换。将细胞在37℃孵育4小时然后除去培养基和MTT,向每个孔中加入200μl的DMSO和25μl的0.1M甘氨酸、0.1M NaCl,pH 10.5溶液,将板在RT孵育10分钟。然后将板转移到SPECTRAmax荧光计中并读取570nm处的吸光度。 所有实验都进行三次重复,结果以平均值和标准偏差表示。
就该实验,将1000个细胞接种,在细胞连接于表面并生成50%汇合的细胞床后(约6小时),向培养基中加入重悬于20μl灭菌的去离子H2O中的不同量的LP氧化的、SP氧化的、LP APTES和SPAPTES硅粒子(1000、5000和10000,相当于1∶1、1∶5、1∶10的细胞:粒子比)。作为阳性对照,向细胞中加入20μl灭菌的去离子H2O而作为阴性对照我们向细胞培养基中加入50μg/ml的顺铂。
将板于37℃孵育,在12、24、48和72小时的时间点,从孔中移出培养基并用灭菌的PBS将细胞广泛洗涤以除去硅粒子。然后如校准分析中所述进行增殖分析。所有实验都进行三次重复,结果以平均值和标准偏差表示。
碘化丙啶染色
将0.6×106个细胞接种于25cm2的烧瓶中,当细胞连接(约6小时后,当细胞生成60%汇合的细胞床),向每个烧瓶的培养基中加入重悬于20μl灭菌的去离子H2O中的3×106个LP氧化的、SP氧化的、LP APTES或SP APTES硅粒子(1∶5比)。作为阳性对照,向细胞中加入20μl灭菌的去离子H2O,而作为阴性对照我们向细胞培养基中加入50μg/ml的顺铂。作为额外的对照,将同样数量的HUVEC细胞接种于75cm2的烧瓶中以允许它们自由生长,在此实验期间不达到汇合。
12、24、48和72小时后,用5ml的灭菌的PBS将细胞洗涤3次,然后用胰蛋白酶处理、收集并离心。在进行额外的PBS洗涤步骤后,将每个细胞团块重悬于250μl的PBS中,在轻轻旋转中向细胞悬浮液中加入750μl的冰冷的甲醇。继续进行固定20分钟然后将细胞离心使其沉降下来,用PBS洗涤两次。然后向细胞团块加入含(溶于10mM Tris的50μg/ml碘化丙啶、5mM MgCl2,pH 7.3和75μg/mlRNAse)的溶液,将悬浮液在转轮(5rpm)上于黑暗中孵育60分钟。然后将样品转移到FACs管中并立即用Becton Dickinson流式细胞仪读数。
流式细胞仪设置
使用FACS Calibur(Becton Dickinson)评价粒子的荧光。使用二元点-图定义的log SSC对log FSC来评估所用硅粒子(直径3微米,高度1.5微米)的尺寸和形状并将非-特异的事件从分析中排除。将对照彩虹BD CalibriteTM珠(尺寸为3.5微米)作为标准进行分析。
围绕群体的中心定义一个多边形区域(R1),排除离仪器的噪声信号太近的事件。对于每个样品,在R1区域检测到的粒子的数量超过80%。
对于平均荧光强度(MFI)测定,通过控制落入定义的区域(R1)的事件产生log FL1和FL2对log FSC点-图。在相应的荧光柱状图中分析由每个样品生成的峰并记录几何学的平均值。
对于粒子检测,使用的检测仪为电压设置在474V的前向散射(FSC)E-1和侧向散射(SSC)。荧光检测仪FL1设置在800V。
使用FL1,530/30nm带通滤波器检测绿色荧光(FITC和Q-点525)。使用FL2检测橙色和红色荧光(Q-点D565和碘化丙啶)。当只分析单色检测时将补偿设置在零。使用彩虹BD CalibriteTM珠在每一系列的获取之前、之间和之后进行仪器校准。
对于细胞检测,使用的检测仪为有4.59的放大增益的线性前向散射(FSC)E00和有1.07的放大增益的电压设置在474V的线性侧向散射(SSC)。将荧光检测仪FL2设置在449V,其具有1.32的放大增益。
基于散射特性,细胞和粒子碎片被电子地排除于分析之外。在所有实验中,至少分析了20,000个粒子或细胞。所有实验都进行三次重复。结果以完整粒子或仅活细胞的平均荧光强度给出。用CellQuestsoftware(BD Biosciences)进行数据分析。
荧光显微镜检查
使用带有保持在-30.1℃的DQC-FS Nikon CCD相机的NikonEclipse TE2000-E进行粒子的荧光成像。在紧接分析之前所将有样品固定,用63X油浸物镜获取图像。所有实验过程中显微镜设置保持不 变。将数值孔径设置在1.4,折射率设置在1.515,曝光时间设置在500ms,读取速度设置在10MHz以及将转换增益设置在1/6x。用NISElements AR 2.3软件分析和测量图像。
结果
抗体缀合
用于将APTES修饰的粒子与抗-VEGFR2缀合的粒子的总数为~7.03×106。如下面的表3所列,为此缀合使用了两个不同量的抗-VEGFR2。
表3.
向粒子加入的抗-VEGFR2的量
粒子ID | 加入的抗-VEGFR2(μg) | 每106个粒子的抗-VEGFR2 (μg) |
APTES1 | 2.04 | 0.29 |
APTES2 | 0.407 | 0.058 |
在一个不同的实验中,缀合后,将粒子在含0.5%Triton X-100的磷酸缓冲液中洗涤和离心6次,之后在普通的磷酸缓冲液中洗涤4次,然后在平板读数器上读数。如下面的表4所列,为此缀合使用了两个不同量的抗-VEGFR2。
表4.
基于抗-VEGFR2的荧光分析由平板读数器检测的缀合于粒子的抗-VEGFR2的量
粒子ID | 粒子的 数量 | 抗-VEGFR2 的量(μg) | 每106粒子的抗 -VE GFR2(μg) |
APTES1 | 7.42×105 | 0.065 | 0.088 |
APTES2 | 7.42×105 | 0.022 | 0.03 |
如图4所示,在缀合期间在所有情况下都存在粒子的数量的显著降低。这可能是由于在涉及将未结合的抗体从溶液中去除的许多洗涤步骤期间遭受的损失。
表5.
装载实验中使用的微米粒子和纳米粒子的Zeta电位
粒子 纳米孔的 Zeta电位 在pH~7.3时的
尺寸(nm) (mV) 缓冲液条件
LP氧化的硅 20-40 -10.1 20mM Tris
1.31 200mM Tris
LP APTES修饰的硅 20-40 6.52 20mM Tris
5.19 200mM Tris
LP MPTMS修饰的硅 20-40 -16.9 20mM Tris
-6.17 200mM Tris
SP氧化的硅 5-7 -11.15 20mM Tris
-13 200mM Tris
SP APTES修饰的硅 5-7 6.42 20mM Tris
-7.42 200mM Tris
SP MPTMS修饰的硅 5-7 -18.3 20mM Tris
-8.21 200mM Tris
氨基q点 NA -1.21 20mM Tris
1.3 200mM Tris
羧基q点 NA -32.8 20mM Tris
-10.1 200mM Tris
SWNT NA -9.21 20mM Tris
装载和释放
因它们的独特的和优秀的特性,量子点(Q点)和单壁碳纳米管(SWNT)用作二级纳米载体。Q-点是发光半导体纳米晶体(CdSe或CdTe),由于它们的高亮度、光稳定性和多元颜色编码的能力,在体外和体内分子的和细胞的成像进行了很多研究。以亲水的聚乙二醇(PEG)包被Q-点以增加生物相容性。20mM Trs缓冲液中氨基-PEGQ点的zeta电位是-1mV,羧基PEG Q-点的为-32.8mV。使用散射光动态光散射技术通过胶体在溶液中的扩散系数测量流体力学尺寸。氨基和羧基Q-点显示相似的流体力学尺寸(分别为13和17nm)。
SWNT是井然有序的中空“卷起”结构,具有高长宽比、高表面积、高机械强度、超轻重量、优秀的化学/热稳定性。研究了很多以肽、蛋白质和药物功能化SWNT表面的方法。本研究中,SWNT为直径2-4nm长度介于30和100nm之间,以PEG-胺功能化表面,提供在水中和生理盐水中的溶解性并进一步连接到FITC用于荧光成像。Zeta电位测量表明在20nM TRIS缓冲液中为-9.2mV。
首次研究了Tris浓度对量子点装载入大孔粒子的影响。选择Tris作为缓冲剂,因为与其它缓冲剂相比其给予量子点(Q-点)最高的稳定性。以Tris浓度的功能研究Q-点装载的粒子的平均荧光。当Tris浓度增加时粒子上的荧光信号增加。就装载而言200mM浓度的Tris产生了最好效果,因此选择其用于所有后面的实验。
使用“小孔”硅粒子作为对照评估“大孔”硅粒子的装载能力。Q-点的流体力学尺寸是13-15nm,不能进入小孔(<5nm)而是留在它们的表面上。通过将Q-点的量从10皮摩变为2毫摩并将所有反应孵育于相同的终体积(20μl)进行Q-点对装载的浓度作用。在FACS上分析样品的装载,2μM浓度的量子点导致最高水平的装载,因此用于所有后面的实验。
通过不同的孵育时间(15分钟、30分钟和60分钟)研究了粒子装载Q-点的时间/动态。Q-点对粒子的装载是一个非常快的过程,在15分钟内达到其最大值。之后,如图21A-B,a-d区所示,荧光信号随时间慢慢下降。
证明粒子的表面特性也在装载动力学中有重要作用。如图21A-B,a-d区所示,羧基PEG Q-点表现出对氧化的粒子很少的装载。这归结于静电力因为两种粒子都带负电。当以氨基(APTES)修饰硅粒子的表面时,如图5所示zeta电位变为正(+5~+6mV)。羧基Q-点对APTES处理的粒子的装载显著增加。氨基PEG Q-点的电荷几乎为中性(zeta电位-1~+1mV),硅粒子的APTES处理对装载仅有轻微影响(zeta电位从-11mV变为+6mV)。
氨基量子点从LP氧化的粒子的释放的动力学是指数式的,20分 钟后装载的粒子的量降低33%,45分钟后降低67.5%。20小时后发现仅有剩余的初始荧光的1%与粒子关联,说明从纳米多孔硅粒子释放所有量子点。
荧光淬灭
测量含35μg/ml的FITC缀合的单壁碳纳米管(FITC-SWNT)的溶液以及它们的一系列milliq超纯水稀释液(范围从1∶2到1∶2048)的荧光(图6A,A区)。前3个和浓度更高的样品(分别为35、17.5和8.725μg/ml)的荧光值低于浓度较低的溶液的值。这是称为荧光淬灭的现象。作为对照对一系列范围从8μM到4nM的羧基聚乙二醇化的量子点的溶液进行同样的读取,其显示荧光值随着稀释线性降低。评估APTES修饰的LP粒子装载FITC-SWNT的荧光淬灭动态。如上所述进行此实验。曲线的外形提示较高量的FITC-SWNT的装载引起荧光淬灭因而导致硅粒子的荧光减少。选择20μg/ml的浓度用于所有后面的实验(图6A,B区和图20,B区)。
也研究了Tris浓度对大孔粒子装载PEG-FITC-SWNT和q-点的影响,见图6B-C,C-F区。E区和F区以Tris浓度的函数显示LPAPTES修饰的和LP氧化的硅粒子中PEG-FITC-SWNT装载的粒子的平均荧光。粒子上的荧光信号随着Tris浓度增加而减少。就装载而言20mM浓度的Tris产生了最好效果,因此选择其用于所有后面的实验。
碳纳米管装载
评估以FITC-SWNT装载氧化的和APTES修饰的LP和SP粒子的动态。使用20μg/ml的荧光纳米粒子如上所述进行此实验(见图4A-B,A-D区)。在此实验设置下,LP APTES粒子的装载时间动态快,其在后面的时间点显示相似的减少(图4A,B区、和图21A-B)。观察到LP氧化的粒子装载的不同的动力学,其在整个实验期间增加并在60分钟时间点达到其最大值(图4A,A区、和图21A-B)。
在小孔粒子(SP)的装载期间发生相同的装载模式。APTES修饰的粒子装载的非常快然后随着时间丢失一些它们的关联的荧光(图 4B,D区、和图21A-B),然而如发生在LP粒子上的一样,氧化的SP装载随着时间增加,提示APTES修饰在装载过程中起关键作用(图4B,C区、和图21A-B)。
PEG-FITC-SWNT从LP氧化的粒子的释放的动力学在第一时间点是指数式的。在后面的时间点释放变慢下来。20小时后发现仅有剩余的初始荧光的20%与粒子关联,提示有效载荷的一些保留于纳米多孔硅粒子中(图7B和图21A-B)。
纳米脂质体也以与上述相同的动态装载入LP粒子。通过荧光显微镜检查的方法观察与硅粒子关联的荧光(图8A-B,A和B区、图8C,E和F区)。
降解
公知多孔硅(Psi)为可完全生物降解(Mayne 2000;Low,Williamset al.2006)和生物相容(Canham 1995)。根据已述的针对硅片的方法(Canham 1997)进行的氧化过程,在暴露的硅表面引入羟基(OH),这些基团在水的存在下易于水解从而将固体硅转化为高度可溶的硅酸。
SEM
通过扫描电镜(SEM)进行粒子的尺寸、形状和总体外观的修饰的研究(图9A-B和10A-B)。图像显示粒子随着时间降解,从具有高度多孔性的区域开始,然后降解扩散至多孔性较低且孔的尺寸较小的粒子边缘。意外地注意到粒子的总体形状几乎保持完好直到降解过程的结束。尽管本发明不受限于它们的操作的理论,通过以下事实解释该意外发现:氧化的硅表面的侵蚀逐渐消耗介于孔之间的壁因而在粒子的中心形成缺陷和洞。相同的过程需要更长时间来溶解孔的数量较少且孔之间的壁较厚的粒子的侧面。
Z2 Coulter
通过几种技术进行纳米多孔硅粒子降解的鉴定。以Z2 粒子计数器和尺寸分析仪(Beckman Coulter)进行粒子的数量和它们的体积的减少的测量。将粒子置于两种不同的溶液中:TRIS 2.5mM, 0.9%NaCl pH7.3(盐水)和具有10%FBS(CCM)的细胞培养基,在转轮(8rpm)中于37℃保持24小时。为了解孔的尺寸是否在降解动力学中起作用,使用具有7-10(SP)纳米的小孔的硅粒子和具有20-30纳米(LP)的大孔的硅粒子。
在LP或SP的情况下,孵育于盐水中的粒子,没有在它们的中值尺寸分布显示任何显著的减少。与此相反,它们的数量随着时间逐渐下降(图11A,A区)。这些结果结合在一起意味着对于LP和SP粒子在24hrs,50%或更高的硅粒子量的总体损失,如图11B,C区中所示。
在以孵育于CCM中的粒子进行的实验中,它们的中值尺寸和数量都减少(图11A,B区)。这些结果结合在一起显示对于LP粒子60%的粒子量的损失以及对于SP粒子超过90%的损失。
ICP
在ICP上的读数显示降解后存在的硅的量的线性增加。这些数据证实ICP-AES方法用于验证降解的能力。所述数据规整,标准偏差低,并且与测试期间的粒子计数和尺寸的Z2读数具有强相关性。增加的降解发生在细胞培养基中而不是TRIS缓冲液中,提示在细胞培养条件中这些粒子的高的生物可降解性(图12A,A-B区和图12B,C-D区)。
生物相容性
通过乳糖脱氢酶(LDH)毒性分析(Biovision Inc.)的方法检测硅纳米多孔粒子诱导的细胞毒性,通过MTT分析(Promega)的方法检测细胞增殖以及通过碘化丙啶染色检测调亡和细胞周期。
明场显微镜检查
在多孔硅粒子的存在下生长的细胞未随时间表现出任何显著的或异常类型的形态变化(图13,A-D区)。细胞在12小时后为50%汇合,24小时后它们几乎达到100%汇合。在48小时可见一些调亡,或一般地说,细胞死亡的迹象,在72小时可见更多(亮的、圆的、反光的细胞或具有大的、多叶的核或细胞体高度收缩的细胞),如图13, A-D区中白色箭头所示。这主要是由于细胞已经达到汇合不能找到任何空间进一步生长因而遭受细胞降解的一些过程这一事实。
LDH毒性分析
LDH是一种细胞裂解时释放到细胞质中的胞质酶。因此,所述LDH分析是膜完整性的测量。LDH分析的基础是由LDH将乳糖氧化成丙酮酸,丙酮酸与四唑盐反应形成甲 以及水溶性甲 的分光光度法检测。(Decker,T.& Lohmann Matthes,M.L.(1988)J.ImmunolMethods 15:61-69;Korzeniewski,C.& Callewaert,D.M.(1983)J.Immunol Methods 64:313-320)。
作出一条毒性校准曲线(图14A,A区)将在荧光计上读取的吸光度值与通过1%Triton孵育裂解的细胞的数量关联。从所述校准曲线得到粒子孵育期间释放LDH酶的细胞的数量。在12和24小时,毒性信号非常低,主要归结于未从胰蛋白酶处理和接种恢复过来的未结合细胞(背景毒性)。通过比较来自实验板的毒性值和在对照板中测量的值对此进行证实(图14A,B区)。在无任何粒子的96孔板中生长的HUVEC细胞的毒性(阳性对照)在72小时显示470nm处0.496的平均吸光度。那几乎是与来自以1∶1比孵育的细胞的值相同的值(0.507)。在更高的细胞∶粒子比(1∶5和1∶10),毒性的平均值分别为0.55和0.57(图14A,B区和图14B-C,C-F区)。在所有实验条件中观察到相同的毒性模式,从而说明多孔性和表面化学既不增加也不减少细胞毒性。这些结果在一起未提示任何由于将细胞暴露于粒子而产生的大规模毒性。
MTT增殖分析
MTT是一种黄色的水溶性四唑染料,由活细胞还原为不溶于水的紫色甲 通过将甲 溶解于DMSO并以分光光度计对其测量来测定甲 的量。在处理的和未处理的细胞的光谱之间比较会给出毒性的相对估算。(Alley et al.(1988)Cancer Res.48:589-601)。毒性校准曲线(图15A,A区)将在荧光计上读取的吸光度值与生长细胞的数量关联。从此校准曲线得到活性代谢的细胞的量。
在12、24和48小时,与粒子一起孵育的细胞的增殖与对照板的完全相同(图15A,B区)。在72小时未与任何粒子一起培养的HUVEC细胞(阳性对照)在570nm处的平均吸光度是1.635,而来自以1∶1比孵育的细胞的这一数值为1.623。在更高的细胞∶粒子比(1∶5和1∶10),HUVEC分别给出相当于1.46和1.41的吸光度值(图15A-C,B-F区)。这些较低的值与当在大量粒子的存在下培养细胞时细胞增殖的轻度减少相关。这与在72小时以LDH分析测量的毒性的少许增加一致(图14A,B区和图14B-C,C-F区)。
在所有实验条件中观察到相同的增殖模式,因此说明多孔性和表面化学既不增加也不减少细胞生长。这些结果在一起未提示任何由于将细胞暴露于粒子而产生的细胞活力的显著变化。
细胞周期和调亡
对1∶5比的粒子(氧化的或APTES修饰的LP和SP)暴露12、24、48和72小时的HUVEC细胞在固定和碘化丙啶染色之后于FACS上进行分析。首先分析点图和等值线图中的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)(图16A-C)。FSC参数提供细胞的尺寸的信息而SSC提供细胞的形状的信息。位于每个区的底部的3D图在Z-轴上显示计数或事件并且提供在FACS上分析的细胞的总体分布的信息。
以红色箭头表示坏死的/调亡的细胞的峰,其特征为较小且均一性较低的形状。图16,A-C区中报告的数据涉及与盐水(对照)和与LP和SP氧化的硅粒子一起孵育的HUVEC细胞。细胞分布随着时间显著改变,在48和72小时主要积聚于低SSC、低FSC区域。在3组之间未发现细胞的分布的显著差异,从LP和SP APTES修饰的粒子处理的细胞获得相同的结果。尽管本发明不受它们的操作的理论束缚,在后面的时间点的细胞死亡的诱导可归结于过分汇合。这可以预料到,因为为了将该实验尽可能地与生理溶液保持接近(后者中粒子接触毛细血管的内皮壁),接种的细胞在第0天是60%汇合。
也定量地测量了处理的HUVEC细胞在细胞周期的不同阶段的分布(图17A-I)。通过将来自对照细胞的数据(图16A,HUVEC+盐 水)与来自LP和SP处理的细胞的数据进行比较,证实了暴露于纳米多孔硅粒子是无毒的并且不诱导任何细胞死亡的量的显著增加。也证明了在处理的和未处理的细胞之间无细胞周期的阶段的改变。
为了证明不仅完整的粒子,而且它们的降解产物也不诱导任何毒性,将HUVEC细胞与含所有粒子类型的降解产物的CCM一起孵育,并证实了到目前为止所描述的结果(图17H-I)。当把细胞与SP氧化的以及SP和LP APTES修饰的粒子的降解产物一起孵育72小时,在调亡区域检测到细胞的量的少许增加。可能是在降解过程期间产生的较小的硅碎片诱导了某种毒性45-48。
工作实施例2
开发了一种基于含特定尺寸的纳米孔的生物可降解的硅粒子作为以精确的控制向细胞中装载、携带、释放和递送多种类型的纳米粒子的一级载体的多级递送系统。向所述一级硅纳米多孔粒子同时装载随时间以持续不变的方式释放的不同类型的二级纳米粒子。阐述了控制二级纳米粒子的装载和释放的主要的物理、化学和静电机制。最后,显示多孔硅载体能够局部地向细胞质中递送二级纳米粒子。合起来考虑,这些研究提供可将硅纳米多孔粒子用作向细胞中同时递送不同类型的纳米载体的载货的证据。该系统提供前所未有的方法实现多种治疗和成像剂的胞内递送。
介绍
自其在过去十年的发展,纳米技术已在针对疾病检测、诊断和治疗的生物医学研究中的广泛多样的应用中得以采用1-3。许多涉及纳米粒子的开发和优化的研究的目标聚焦于它们作为向器官、组织和细胞递送治疗或成像分子的试剂的使用4,5。已评估了许多治疗用途的不同的纳米载体,包括多种尺寸和组合的脂质体6,7、量子点(Q-点)8,9、氧化铁10、单壁碳纳米管(SWNT)11、金纳米壳12,13、以及几种其他类型的纳米粒子14。该发展迄今已经促成了定义为“分子靶向的疗法”的领域15-18,然而最初的目标的完成,即采用基于纳米载体的递送系统选择性递送治疗剂,还未得到充分实现19,20。
将纳米载体整合于纳米多孔硅粒子中允许纳米载体规避通常阻碍它们的治疗效果的天然的生物屏障。所述方法为治疗剂提供不受周围的液体和分子通常过早地将它们降解和不被网状内皮系统(RES)摄取的保护。这导致活性试剂的更高的稳定性,同时向靶向的组织提供治疗剂的增加的递送和浓缩的剂量。
实现了将多样的二级纳米粒子同时装载入一级硅纳米多孔粒子。在足够一级粒子到达特定的生物靶位点的整个时间周期缓慢释放二级粒子(Q-点和SWNT)。掌控装载和释放过程的主要的物理、化学和静电机制。所述纳米递送系统能够将其有效负载局部地释放到细胞中。
结果
一级和二级粒子
通过Z2 粒子计数器和尺寸分析仪鉴定硅微米粒子以测量它们的体积、尺寸和浓度,通过扫描电镜(SEM)详细地评估它们的形态。图19,a和b区分别显示“大孔”(LP)和“小孔”(LP)硅粒子的背面和正面以及截面的代表性的SEM图像。这些粒子为高度多孔,形状上为半球形。LP粒子的直径约为3.5μm,带有直廓的具有范围从20到30nm的孔尺寸的孔,垂直穿过粒子到达它们的外表面(图19,a区)。SP硅粒子具有3.2μm的平均直径,由于为使它们的孔尺寸小于10nm而使用的阳极氧化和电解抛光过程的结果具有比LP硅粒子更扁平的形状(图19,b区)。LP和SP硅粒子都具有0.5-0.6μm的厚度。根据BET分析,LP粒子的表面积为156m2g-1,SP粒子的表面积为294m2g-1。LP粒子的孔体积为0.542cm3g-1,SP粒子的孔体积为0.383cm3g-1。通过改变批次之间可重复的电流、蚀刻时间和掺杂,精细地调节孔密度、尺寸、形状和轮廓。未氧化的硅是疏水材料,但是有多种稳定基于硅的材料并用寡核苷酸27、生物分子 28、抗体29,30和聚乙二醇(PEG)链使其功能化的表面处理方法31。由于粒子的表面上羟基的存在,氧化的硅粒子具有负的zeta电位值(LP为-10.1、SP为-11-25)32。由于在它们的表面引入氨基的结果,以APTES修饰的粒子具有正的zeta电位值(LP为6.52、SP为6.45)。使用动 态光散射技术通过胶体在溶液中的扩散系数测量Q-点的流体力学尺寸。氨基-PEG Q-点的直径是13nm,羧基Q-点的直径是16nm。通过AFM显微镜检查评估PEG-FITC-SWNT的尺寸。未PEG化的SWNT的直径为1nm左右,但由于纳米管周围的PEG,用于本研究的PEG-FITC-SWNT具有4nm的平均直径和30nm的平均长度。使用PEG-胺通过经由SWNT剪切过程获得的羧酸将SWNT功能化并缀合于FITC使它们能够荧光成像。选择具荧光特性的二级纳米粒子使用已建立的技术,例如流式细胞术、荧光测定法、以及荧光和共聚焦显微镜检查量化硅纳米多孔粒子的装载入和从其释放。一级和二级粒子的物理和化学总结于表6中。
表6.
一级粒子 化学修饰 孔尺寸,nm Zeta电位,mV
“大孔”(LP) 氧化的 20-40 -10.1
LP APTES 20-40 6.52
“小孔”(SP) 氧化的 5-7 -11.15
SP APTES 5-7 6.42
二级粒子 尺寸,nm
Q-点 氨基PEG 13 -1.21
Q-点 羧基PEG 16 -32.8
SWNT PEG-FITC 直径4 -9.21
长度30
将二级纳米粒子装载入一级硅粒子
开发了有效地将纳米粒子装载入一级硅粒子的孔中的方法。影响装载过程的一个因素是培养基中粒子周围的二级粒子的量。分析了以渐增量的Q-点(图20,A区)和PEG-FITC-SWNT(图20,B区)装载的硅粒子的荧光强度并证明粒子装载与二级粒子浓度直接相关。通过逐渐地提高二级粒子的浓度,实现了如通过流式细胞术(图20,A和B区)和通过以荧光显微镜检查直接观察(图20,C和D区)评价的逐渐更高水平的装载。
这些研究也证明一级硅粒子和二级粒子两者的表面化学特性影响装载效率和装配的多级纳米粒子载体系统的稳定性。通过图21A-B,a区和c区中所示的结果证实了所述观察,图中将具有负的表面电荷(zeta电位-32.8mV)的羧基Q-点、以及带负的表面电荷(zeta电位-9.21mV)的PEG-FITC-SWNT装载入LP APTES修饰的硅粒子比装载入具有负的表面电荷的LP氧化的硅粒子的效率高。鉴于许多各种不同的方法可用于修饰多孔硅27,29-35,通过开发一级和二级表面化学有效地装载任何种类的二级粒子是可能的。
二级纳米粒子的装载是一个非常快的过程。图21A,a和c区显示当把LP氧化的硅粒子和LP APTES修饰的硅粒子与固定量的氨基和羧基Q-点和PEG-FITC-SWNT两者一起孵育时获得的结果。如果多孔硅粒子和二级粒子的组合符合上述静电标准,一级多孔硅粒子的完全装载在15分钟内发生。也评估了二级纳米粒子对SP氧化的硅粒子和SP APTES修饰的硅粒子的装载(图21A,分别为c和d区)。Q-点尺寸介于13和16nm所以它们不能装载入SP硅粒子的孔(5-7nm)中。与此相反,LP硅粒子的孔(20-40nm)大的足以允许Q-点装载入。因此,SP粒子平均荧光仅为LP粒子的6%。相反地,PEG-FITC-SWNT的较小的尺寸与SP粒子孔相容,导致装载增加(25%的PEG-FITC-SWNT装载入LP硅粒子)。
从一级硅粒子释放二级纳米粒子
为了将多级递送系统作为药物递送的工具进行评估,研究了二级粒子从纳米多孔一级粒子释放的动力学。为了模拟生理条件,所有实验都在缓冲盐水中于37℃下进行,并且在每个时间点更换释放溶液。图21B,e-h区展示两种类型的二级粒子都随着时间从一级硅粒子释放。意外地,释放过程一直持续,20小时后达到完全释放。另外,Q-点和PEG-FITC-SWNT的释放动力学显著不同,Q-点释放显著快于SWNT。
以SP氧化的硅粒子(图21B,f区)和SP APTES修饰的硅粒子 (图21B,h区)进行的对照实验证实了Q-点未装载入孔中。Q-点从SP硅粒子表面的解离是大规模的和快速的(15分钟内>80%),暗示它们与硅粒子表面松散地相互作用。相比之下,PEG-FITC-SWNT二级纳米载体从LP和SP硅粒子的释放的动力学是相当的,证实PEG-FITC-SWNT装载入了一级SP粒子的孔中。
使用共聚焦显微镜检查进一步鉴定二级纳米粒子对硅载体的孔的装载。图22,a-b区显示装载了羧基Q-点的LP APTES硅粒子的一系列3维投影和旋转。在较大的孔所在的硅粒子的背面的中心区域检测到更强的荧光信号,见图19,a区。来自周围区域的强度较小的信号是由于对较小的孔的部分装载或通过Q-点与硅粒子的表面的相互作用。
多重装载
将红色荧光的Q-点(发射565nm)和绿色荧光的PEG-FITC-SWNT(发射510nm)两者同时装载入相同的纳米多孔硅粒子中(图23A,A和B区)。这些研究证明两种类型的二级粒子都能装载入相同的纳米多孔硅粒子载体中。多重装载的动态不同于所述的单一装载的动态,其在60分钟后达到稳定的平台。可能由于它们的较小的尺寸的结果,PEG-FITC-SWNT是首先进入孔中的,而较大的Q-点用了更长的时间但达到更高水平的装载(图23B,C区)。与图21A B区中显示的释放的观察相比,两种类型的二级粒子从硅载体的释放图谱几乎保持不变(图23B,D区)。图23C,E-H区中显示的共聚焦显微图像展示两种不同的二级纳米载体优先定位于硅粒子的不同区域。鉴于它们的更大的尺寸,仅在与较大的孔关联的中心区域发现Q-点。在整个粒子的四周都发现了PEG-FITC-SWNT,其主要沿着与较小的孔关联的粒子的边界积聚。
当把已装载的硅粒子与HUVEC细胞在37℃一同孵育1h,二级粒子被局部地释放并由一级粒子到达的细胞选择性地内化。Q-点(图24,a-d区)和PEG-FITC-SWNT(图24,e-h区)进入细胞的细胞质并导致在细胞质的囊泡中的显著积聚。紧接着尝试在将两种纳米粒子都装载入一级硅粒子中后递送它们。两种纳米粒子的内化都如荧光信号的共定位(图24,j-m区)暗示的以相似的动力学和通过相同的机制发生。在所有情况下,在1h期间内3.5μm硅粒子没有独立地被细胞内化。图24,d、h和m区中的明场图像显示粒子形态的具体情况暗示它们是与细胞外表面关联而不是由细胞内化,这也通过共聚焦成像得以核实。
讨论
硅在微电子工业广泛使用,并且展示了其用于微芯片的大规模生产以及生物传感器、植入装置和药物递送系统的开发的能力36-39。尽管体硅(bulk silicon)在生理缓冲液中保持惰性,多孔硅具有高度的生物可降解性,其降解动力学可根据孔尺寸密度40,41在几小时到几天之间精细地调节。多孔硅粒子降解为对身体无害的硅酸,而且我们已发现整个完整的硅粒子或它们的降解产物对细胞都无细胞毒性。制作方法允许制造任何期望的形状、尺寸(尺寸从100nm到上百μm)、孔尺寸(5-100nm)和/或孔密度的硅微米粒子。
另外,已开发化学地修饰粒子例如为了减少血浆蛋白吸附、RES摄取和为了增加粒子作为药物递送系统的循环时间将PEG连接于硅粒子的表面的方法42(文稿准备中)。将硅粒子成功缀合于针对具治疗的重要意义的配体的特定抗体,所述配体例如血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和表皮生长因子受体(EGFR),并如上面的工作实施例1中所述使用原代HUVEC的体外细胞培养模型评估了它们的靶向和选择性细胞毒性。
本研究提供向纳米多孔硅粒子有效装载不同性质、尺寸和形状的二级纳米粒子的能力的证据。通过调节纳米粒子的浓度和/或通过利用一级和二级粒子之一或两者的表面化学特性调控装载过程。本研究中已显示纳米粒子释放的动态和探索纳米多孔硅粒子同时装载多种类型的纳米粒子的能力。这些研究清楚地证明用作二级粒子的Q-点和PEG-FITC-SWNT根据二级粒子的尺寸和化学特性定位于一级硅纳米多孔粒子载体的不同的室。此外,对负责装载和释放过程的关键机 制和驱动力进行鉴定了和分级。硅粒子的孔的和二级粒子的相对尺寸共同决定一级和二级粒子的组合的最成功的配置(图25,A区)。二级纳米载体的浓度影响装载过程的效率,后者受二级粒子对硅粒子的纳米孔的被动扩散和毛细管对流两者调控。二级纳米载体与硅粒子的纳米孔的流体力学的相互作用和布朗运动影响组装的系统的稳定性以及二级纳米载体保持装载在一级硅粒子的纳米孔中的时间(图25,B区)。最后,需考虑的第三个机制是一级硅粒子载体和二级纳米载体之间的静电的相互作用(图25,C区)。合起来考虑,这些特点的每一个允许装载入一级纳米多孔硅粒子的二级纳米载体的量的精细调节,从而符合在药物递送的未来的应用中特定的药理学的需要。
多级纳米载体系统的新颖的和独特的性质允许递送多种治疗剂、渗透增强剂或成像造影剂用于肿瘤的同步检测和随后破坏或者其他病理状态的成像和随后的治疗。
方法
多孔硅粒子的制作
使用电阻率为0.005ohm cm-1的重度掺杂p++型Si(100)片(Silicon Quest International,Santa Clara,CA,USA)作为底物。通过低压化学气相沉积(LPCVD)系统沉积出200nm的氮化硅层。使用接触校准器(contact aligner,EVG 620校准器)运用标准光刻制模。通过闪光压印光刻(lithograph)获得小直径(100-500nm)的硅粒子。然后通过反应离子刻蚀(RIE)选择性去除氮化物。用piranha(H2SO4∶H2O2=3∶1(v/v))去除光刻胶(photoresist)。然后将硅片置于自制的特氟隆小室内进行电化学刻蚀。通过施加25s的80mA cm-2的电流密度在氢氟酸(49%HF)和乙醇(3∶7v/v)的混合液中形成具大孔(LP)的硅粒子。通过施加6s的320mA em-2的电流密度形成高度多孔层。对于具小孔的硅粒子的制作,使用比例为1∶1(v/v)的HF和乙醇的溶液,施加1.75min的6mAcm-2的电流密度。通过在比例为2∶5(v/v)的HF∶乙醇的混合液中施加6s的320mA cm-2的电流密度形成高度多孔层。在以HF去除氮化物层后,通过在异丙醇(IPA) 中超声处理1min释放粒子。收集含多孔硅粒子的IPA溶液并保存于4℃。
BET测量
在Quantachrome Autosorb-3b BET表面分析仪上测量在77K获得的氮吸附解吸体积等温线。将样品在真空中于150℃烘烤过夜。通过在压力范围0.05到1P/P0中BET线性化获得粒子表面积。对于LP粒子,使用氮吸附解吸体积等温线测量,BET表面积是156m2g-1,孔体积是0.54cm3g-1。估计平均孔尺寸约为24.2nm。对于SP粒子,测出的BET表面积是294m2g-1;孔体积是0.38cm3g-1,平均孔尺寸是7.4nm。
分析溶液中的粒子尺寸和浓度
用Z2 粒子计数器和尺寸分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)对粒子进行计数,孔径尺寸为50μm。将分析的尺寸上限和下限设置在1.8和3.6μm。为了分析,将粒子悬浮于平衡的电解质溶液( II Diluent,Beckman Coulter Fullerton,CA,USA)中并计数。粒子的初始悬浮液的总体积不超过最终分析体积的0.3%。粒子计数器显示溶液中粒子的浓度以及粒子尺寸分布的分析。
硅微米粒子的氧化
通过加热(80-90℃)将IPA中的硅微米粒子在玻璃烧杯中干燥然后将它们在piranha溶液(1∶2 H2O2∶浓缩的H2SO4(v/v))中氧化。将粒子加入H2O2(30%)的溶液中,在5510R-MT超声洗涤机(BRANSONIC,Danbury,CT,USA))中超声处理30s然后加入H2SO4(95-98%),将悬浮液加热至100-110℃并维持2h,间断超声处理以使粒子分散。然后用去离子(DI)水洗涤粒子。粒子在DI水中的洗涤包括将微米粒子悬浮液在4,200rpm离心5min,随后去除上清,将粒子重悬于DI水中。将氧化的粒子置于水中在4℃保存直到进一步使用。
硅粒子的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)表面修饰
在硅烷化过程之前,将氧化的硅粒子在1.5M HNO3中羟化大约 1.5h。然后用DI水中将粒子洗涤3-5次,随后用IPA洗涤2次。然后在室温下将硅粒子悬浮于含0.5%(v/v)APTES的IPA中维持45min。然后用IPA将粒子洗涤(4,200g离心5min,5次),并置于IPA中在4℃保存。
Q-点和水荧光标记的水溶性SWNT
Q-点购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。本研究中,我们使用发射波长为525nm和565nm的氨基-PEG(货号分别为Q21541MP和Q21531MP)和发射波长为525nm和565nm的羧基Q-点(货号分别为Q21341MP和Q21331MP)。为了生成侧壁高度羧化的超短(US)-SWNT 43,在氮气下向圆底烧瓶中的纯化的HiPco SWNT(0.100g)加入发烟硫酸(20%游离SO3,25mL),将该混合物搅动过夜以使SWNT分散(HiPco SWNT从Rice大学HiPco实验室获取。对于纯化遵循了已建立的步骤。44在另一个烧瓶中,向浓缩的硝酸(18mL)缓慢地加入发烟硫酸(25mL,20%游离SO3)。立即将该混合物加入SWNT并将SWNT加热至60℃维持2h。然后将此溶液在冰上缓慢地倒出并通过0.22μm聚碳酸酯膜过滤。用水将滤饼充分洗涤。撤销真空,将饼溶解于最小量的甲醇中,之后加入乙醚,导致US-SWNT的絮凝,再次施加真空。不断地加入乙醚直到洗涤液达到中性pH。将US-SWNT饼在真空下干燥。为获得PEG化的SWNT,使用超声处理(水浴或振荡槽、和Model)30min在圆底烧瓶中将US-SWNT(0.034g,3.1meq C)分散于干DMF(30mL)中。向该溶液加入二环己基碳二亚胺(DCC)(0.32g,1.5mmol)和分子量为5,200的羟乙基邻苯二甲酰亚胺末端化的PEG(0.32g),将混合物在氮气下搅动24h。将此溶液转移到透析袋(CelluSep H1,50,000MWCO,Part#:1-5050-34,Membrane Filtration Products)中透析5d,将产物通过玻璃棉过滤以除去透析袋中形成的任何粒子。将透析袋的内容物进行邻苯二甲酰亚胺部分的去除,展示出PEG-末端化的胺(H2H-PEG-US-SWNT)。加入一水合肼(10mL),将所述溶液在氮气下加热至回流并维持12h以在PEG化的US-SWNT的末端上提 供末端伯胺。通过在DI水中透析5天纯化该产物。将所述溶液转移到以箔片包裹的圆底烧瓶中,向H2H-PEG-US-SWNT溶液加入预先溶解于少量DMF中的FITC(0.12g)。将该反应在室温下搅动12h。将所述溶液转移至透析袋中并维持于黑暗中以DI水连续透析5天,随后通过玻璃棉过滤以除去未溶解的粒子。终产物FITC-PEG-US-SWNT含一些物理吸附于而不是共价结合到PEG-US-SWNT的FITC。在水中透析数月之后大部分物理吸附的FITC仍然保持与SWNT关联。
硅粒子、Q-点和SWNT的Zeta电位的测量
使用Zetasizer nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,Southborough,MA,USA)分析硅粒子、Q-点和FITC-PEG-US-SWNT的zeta电位。将粒子悬浮于20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷(TRIS-HCL)缓冲液(pH~7.3)中进行所述分析。
将Q-点和SWNT装载入一级硅粒子
在多级纳米装置的开发中使用的硅纳米多孔粒子包括LP氧化的多孔硅、SP氧化的多孔硅和APTES修饰的LP和SP粒子。二级粒子包括氨基-PEG Q-点、羧基Q-点和PEG-FITC-SWNT。进行初始实验滴定二级粒子对一级硅粒子的装载。对于滴定实验的每一个实验点,使用3.0×105个硅粒子,将其重悬于含3μl DI水的低结合聚丙烯微量离心管(VWR International,West Chester,PA,USA)中。对于每一个实验,在pH 7.3调节给定摩尔浓度的TRIS-HCl。向TRIS-HCl溶液加入2μM Q-点(5μl)或20ng/μl PEG-FITC-SWNT(9μl),以20μl作为装载实验的终体积。通过将样品置于转轮(20rpm)上将其于25℃孵育15min。孵育后,用20mM TRIS-HCl,pH 7.3将样品稀释至150μl的体积并迅速用FACScalibur(Becton Dickinson)流式细胞仪检测荧光强度。为了评估Q-点和PEG-FITC-SWNT对硅粒子的浓度依赖的装载入,我们使用3.0×105个硅粒子和15min的孵育时间,配以0.01、0.1、1、10、100、1,000和2,000nM Q-点或0.05、0,1、2.5、10和20ng/μl的PEG-FITC-SWNT。为了评估时间依赖的装载, 使用3.0×105个一级粒子、2,000nM Q-点或20ng/μl的PEG-FITC-SWNT,配以15、30、45和60分钟的孵育时间。对于以Q-点和PEG-FITC-SWNT两者装载硅粒子的评估,以相同的孵育的终浓度使用3.0×105个硅粒子、1,000nM Q-点、和10ng/μl的PEG-FITC-SWNT。
Q-点和SWNT从一级硅粒子的释放的研究
将氧化的或APTES修饰的LP硅粒子(2.1×106)与2μM氨基-PEGQ-点或羧基Q-点在pH7.3的200mM TRIS-HCl溶液中,或与20ng/μlPEG-FITC-SWNT在pH 7.3的20mM TRIS-HCl溶液中,或与1μMQ-点和10ng/μl PEG-FITC-SWNT两者在pH 7.3的50mM TRIS-HCl溶液中进行组合。所有研究的最终孵育体积为140μl。使用转轮(20rpm)将一级硅粒子载体和二级粒子的样品在25℃孵育15min。然后将含一级硅粒子和二级粒子的溶液在1.4mL DI H2O中洗涤,然后在Beckman Coulter Allegra X-22离心机中于4,200rpm离心5min。然后将离心后存在的团块重悬于70μl的DI H2O中,从每瓶中取出10μl用流式细胞术评价样品的荧光。在时间0和之后包括30、60、90、180、360、和1,200min的6个时间点记录荧光。将每瓶中留下的剩余60μl稀释于20mM TRIS-HCl 0.9%NaCl释放液中至3ml,随后用转轮(20rpm)在37℃孵育给定量的时间(30、60、90、180、360和1,200min)。在每个时间点,将样品在4,200rpm离心5min并使用流式细胞术评估荧光。
流式细胞仪设置
使用FACScalibur(Becton Dickinson)评价粒子的荧光。使用二元点-图定义的对数侧向散射(SSC)对对数前向散射(FSC)评估硅粒子的尺寸和形状(直径3μm,高度1.5μm)并将非特异的事件从分析中排除。使用对照彩虹BD CalibriteTM珠(尺寸为3.5μm)校准仪器。围绕主要目的群体的中心定义一个多边形区域(R1)作为电子门,其排除离细胞仪的信噪比极限太近的事件。对于每个样品,在R1区域检测到的粒子的数量超过90%。对于几何学的平均荧光强度 (GMFI)的分析,将荧光通道1(FL1)和FL2对log FSC与落入定义为R1的门控区域的事件的分析进行比较,产生点-图。在相应的荧光柱状图中分析每个样品中鉴定出的峰并记录几何学的平均值。对于粒子检测,使用的检测仪为电压设置在474伏特(V)的FSC E-1和SSC。荧光检测仪FL1设置在800V。使用530/30nm带通滤波器以FL1检测绿色荧光(FITC和Q-点525)。使用FL2检测红色荧光(Q-点565)。当只分析单色检测时将颜色补偿设置在零,当进行红-绿双重荧光检测时,将FL1补偿设置在FL2的25%,FL2补偿设置在FL1的35%。对于数据获取,使用BD CalibriteTM珠在每一系列实验的之前、之间和之后进行仪器校准。
扫描电镜检查
使用扫描电镜(SEM,型号LEO1530)获取硅粒子的形态。将粒子直接置于SEM样品台上并干燥。对于在高盐缓冲液中测试的粒子,置于台上之前进行DI水中的温和的洗涤步骤。加速电压为10kV。
轻敲模式原子力显微镜检查
通过从DMF沉积到新鲜裂开的云母表面制备AFM样品。将样品旋转涂布,使用截面分析测定每个样品的高度。使用轻敲模式获得AFM样品。
明场显微镜检查
用带有40X放大镜头的Olympus CKX41显微镜在明场对比中分析粒子。用SP-350 Olympus True-Pic TURBO图像处理器相机采集图像。
荧光显微镜检查
使用带有保持在-30.1℃的DQC-FS Nikon CCD相机的NikonEclipse TE2000-E进行粒子的荧光成像。在紧接分析之前所将有样品固定,用63X油浸物镜获取图像。所有实验过程中显微镜设置保持不变。将数值孔径设置在1.4,折射率设置在1.515,曝光时间设置在500ms,读取速度设置在10MHz以及将转换增益设置在1/6x。
用NIS Elements AR 2.3软件分析和测量图像。
共聚焦显微镜检查
用LEICA DM6000显微镜进行粒子的共聚焦成像。在紧接分析之前所将有样品固定,用HCX PL APO CS 63X油浸物镜以1.4的数值孔径和1.52的折射率获取图像。对于所有获取,将针孔设置在95.6μm(1艾里(Airy)单位),488nm氩灯和561nm激光都设置在它们的能力的15%;将扫描速度设置在400Hz。将单绿色荧光成像光电倍增器电压设置在750V。对于双重颜色成像,将红色通道的PMT设置在600V而将绿色通道的PMT设置在1000V。为了提高图像质量,在获取期间进行了2-帧积聚、2-线积聚和4-帧平均。最终的体素宽度和高度为19.8nm。将所述图像数码放大(10x),在采用LASAF 1.6.2软件后期处理期间使用中值调节(3像素,2轮)。
工作实施例3
3.5微米硅粒子中的脂质体
如C.N.Landen Jr.,et al.Cancer Res.2005,65(15),6910-6918和J.Clin.Cancer Res.2006;12(16),4916-4924中详述制备荧光标记的siRNA装载的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酯酰胆碱(DOPC)脂质体。
将荧光标记的siRNA装载的DOPC脂质体(初始siRNA浓度:100ng/μl)作为二级粒子与一级大孔“LP”氧化的硅粒子(3.5微米)混合。在20mM Tris pH 7.3中于室温下进行30min孵育。将溶液在室温下以4,200rpm离心1min使其沉降下来。回收上清,通过荧光计使用544nm/590nm(激发/发射)设置测量样品的荧光。将含已经合并了荧光脂质体的一级粒子的粒子团块重悬于100μl的去离子水中,获取荧光计读数。图8C,D区中显示荧光标记的siRNA装载的DOPC脂质体对3.5微米LP和SP粒子的的装载时间动态。图8B中,E和F区分别显示在白色视野和红色视野中含Alexa 555标记的SiRNA的二级脂质体装载入3.5微米纳米多孔硅一级粒子LP的荧光显微图像。
将Alexa 555荧光标记的SiRNA包封于脂质体中并装载入一级多孔硅粒子。图26,A区中数据显示与多孔硅载体关联的荧光随着纳米脂质体的量增加。
为了测试脂质体从一级粒子的释放,将组装的多级系统与10%胎牛血清(pH 7.4)一起孵育,使用荧光计追踪纳米脂质体随时间从一级粒子的释放。在约36h内达到完全卸载,见图26,B区。
工作实施例4
硅粒子中的脂质体
脂质体的制备
通过如下挤压过程制备脂质组成分别为58∶40∶2(Mol%)DPPC∶胆固醇∶DSPE-甲氧基PEG(2000)的脂质体∶简要地说,将脂质在55℃溶解于乙醇中。然后用300mM硫酸铵溶液水合已溶解的脂质(15-30分钟)以促进多柔比星的活性装载,参考Li,et al.Biochim etBiophys Acta 1415(1998)。将脂质体通过一系列孔尺寸逐渐变小的核孔径迹蚀刻聚碳酸酯膜挤压。然后将脂质体通过0.2μm膜挤压5次。然后通过0.1μm膜挤压5次,再通过0.05μm膜5次。最后的挤压是通过0.03μm膜10次。挤压在55℃进行。
生成的荧光标记的脂质体含30%的二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)脂质、30%的胆固醇、10%的荧光标记的脂质N-[7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基]二棕榈酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(NBD-PE)脂质,与30%1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)(对于阳离子脂质体)、或30%二油酰磷脂酰甘油(DOPG)(对于阴离子脂质体)、或30%二油酰基磷酯酰胆碱DOPC(对于中性脂质体)混合。
通过动态光散射(DLS)测量,中性脂质体具有47.4nm的初始平均直径,3天后平均直径为78.2nm。中性脂质体的zeta电位为-13.04±0.77mV。
通过DLS测量,阳离子脂质体具有49.6nm的初始平均直径,3天后平均直径为58.2nm。阳离子脂质体的zeta电位为30.30±2.55mV。
将中性和阳离子脂质体装载入氧化的1微米“大孔”(LP)氧化的纳米多孔硅粒子以及1微米“大孔”(XLP)氧化的和APTES修饰的硅粒子。图8A,A区显示中性(左)和阳离子(右)荧光标记的脂质体装载入1微米XLP APTES修饰的硅粒子的共聚焦显微图像。图8B,B区显示中性和阳离子荧光标记的脂质体装载入1微米XLP氧化的和APTES修饰的硅粒子和1微米LP氧化的粒子的FACS分析。图8B,C区显示荧光标记的脂质体装载的Excel定量。
多柔比星作为活性试剂的装载
将脂质体对150mM NaCl透析过夜除去未包封的硫酸铵,从而制造一个跨膜质子梯度。在60℃向脂质体加入多柔比星(~10mg/ml)维持1hr。药物∶脂质比为0.2∶1.0,最终的脂质浓度为~25mM。将所得的脂质体制剂在冰上保持15分钟以停止微弱的装载过程。将脂质体对150mM NaCl透析过夜除去未包封的多柔比星。通过以甲醇(30%的最终体积)裂解并在480nm测量UV吸光度测定最终的包封的多柔比星浓度。
参考文献
上文中引用了以下参考文献:
1.Cheng,M.M.et al.Nanotechnologies for biomoleculardetection and medical diagnostics.Curr Opin Chem Biol 10,11-9(2006).
2.Ferrari,M.Cancer nanotechnology:opportunities andchallenges.Nat Rev Cancer 5,161-71(2005).
3.Moghimi,S.M.,Hunter,A.C.&Murray,J.C.Nanomedicine:current status and future prospects.Faseb J 19,311-30(2005).
4.Sullivan,D.C.&Ferrari,M.Nanotechnology and tumorimaging:seizing an opportunity.Mol Imaging 3,364-9(2004).
5.Wang,M.D.,Shin,D.M.,Simons,J.W.&Nie,S.Nanotechnology for targeted cancer therapy.Expert Rev AnticancerTher 7,833-7(2007).
6.Lasic,D.D.Doxorubicin in sterically stabilized liposomes.Nature 380,561-2(1996).
7.Uziely,B.et al.Liposomal doxorubicin:antitumor activityand unique toxicities during two complementary phase I studies.JClin Oncol 13,1777-85(1995).
8.Kim,S.et al.Near-infrared fluorescent type II quantum dotsfor sentinel lymph node mapping.Nat Biotechnol 22,93-7(2004).
9.So,M.K.,Xu,C.,Loening,A.M.,Gambhir,S.S.&Rao,J.Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.NatBiotechnol 24,339-43(2006).
10.Corot,C.,Robert,P.,Idee,J.M.&Port,M.Recentadvances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging.Adv Drug Deliv Rev 58,1471-504(2006).
11.Liu,Z.et al.In vivo biodistribution and highly efficient tumour targeting of carbon nanotubes in mice.Nature Nanotechnology2,47-52(2007).
12.Hirsch,L.R.et al.Nanoshell-mediated near-infraredthermal therapy of tumors under magnetic resonance guidance.ProcNatl Acad Sci U S A 100,13549-54(2003).
13.Bradbury,J.Nanoshell destruction of inoperable tumours.Lancet Oncol 4,711(2003).
14.Torchilin,V.P.Multifunctional nanocarriers.Adv DrugDeliv Rev 58,1532-55(2006).
15.Bianco,R.,Daniele,G.,Ciardiello,F.&Tortora,G.Monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.Curr Drug Targets 6,275-87(2005).
16.Ciardiello,F.&Tortora,G.A novel approach in thetreatment of cancer:targeting the epidermal growth factor receptor.Clin Cancer Res 7,2958-70(2001).
17.Hobday,T.J.&Perez,E.A.Molecularly targeted therapiesfor breast cancer.Cancer Control 12,73-81(2005).
18.Druker,B.J.Perspectives on the development of amolecularly targeted agent.Cancer Cell 1,31-6(2002).
19.Sakamoto,J.,Annapragada,A.,Decuzzi,P.&Ferrari,M.Anti-Biological Barrier Nanovector Technology for CancerApplications Expert Opin Drug Deliv(In Press:Accepted May 2007)(2007).
20.Ferrari,M.Nanovector therapeutics.Curr Opin Chem Biol 9,343-6(2005).
21.Decuzzi,P.&Ferrari,M.Fantastic voyages.MechanicalEngineering 128,24-27(2006).
22.Decuzzi,P.,Causa,F.,Ferrari,M.&Netti,P.A.Theeffective dispersion of nanovectors within the tumor microvasculature. Ann Biomed Eng 34,633-41(2006).
23.Decuzzi,P.&Ferrari,M.The adhesive strength ofnon-spherical particles mediated by specific interactions.Biomaterials27,5307-14(2006).
24.Decuzzi,P.&Ferrari,M.The role of specific andnon-specific interactions in receptor-mediated endocytosis ofnanoparticles.Biomaterials 28,2915-22(2007).
25.Decuzzi,P.,Lee,S.,Bhushan,B.&Ferrari,M.A theoreticalmodel for the margination of particles within blood vessels.AnnBiomed Eng 33,179-90(2005).
26.Decuzzi,P.,Lee,S.,Decuzzi,M.&Ferrari,M.Adhesion ofmicrofabricated particles on vascular endothelium:a parametricanalysis.Ann Biomed Eng 32,793-802(2004).
27.Corrie,S.R.,Lawrie,G.A.&Trau,M.Quantitativeanalysis and characterization of biofunctionalized fluorescent silicaparticles.Langmuir 22,2731-7(2006).
28.Mansur,H.S.,Orefice,R.L.,Vasconcelos,W.L.,Lobato,Z.P.&Machado,L.J.Biomaterial with chemically engineered surfacefor protein immobilization.J Mater Sci Mater Med 16,333-40(2005).
29.Shriver-Lake,L.C.et al.Antibody immobilization usingheterobifunctional crosslinkers.Biosens Bioelectron 12,1101-6(1997).
30.Starodub,N.F.,Pirogova,L.V.,Demchenko,A.&Nabok,A.V.Antibody immobilisation on the metal and silicon surfaces.The useof self-assembled layers and specific receptors.Bioelectrochemistry 66,111-5(2005).
31.Lan,S.,Veiseh,M.&Zhang,M.Surface modification ofsilicon and gold-patterned silicon surfaces for improvedbiocompatibility and cell patterning selectivity.Biosens Bioelectron 20,1697-708(2005).
32.Wang,Y.C.&Ferrari,M.Surface modification ofmicromachined silicon filters.Journal of Materials Science 35,4923-4930(2000).
33.Buriak,J.M.Organometallic chemistry on silicon andgermanium surfaces.Chem Rev 102,1271-308(2002).
34.Desai,T.A.et al.Microfabricated immunoisolatingbiocapsules.Biotechnol Bioeng 57,118-20(1998).
35.Schreiber,F.Structure and growth of self-assemblingmonolayers.Progress in Surface Science 65,151-256(2000).
36.Foraker,A.B.et al.Microfabricated porous silicon particlesenhance paracellular delivery of insulin across intestinal Caco-2 cellmonolayers.Pharm Res 20,110-6(2003).
37.Lin,V.S.,Motesharei,K.,Dancil,K.P.,Sailor,M.J.&Ghadiri,M.R.A porous silicon-based optical interferometricbiosensor.Science 278,840-3(1997).
38.Desai,T.A.,Hansford,D.J.,Leoni,L.,Essenpreis,M.&Ferrari,M.Nanoporous anti-fouling silicon membranes for biosensorapplications.Biosens Bioelectron 15,453-62(2000).
39.Gardner,P.Microfabricated nanochannel implantable drugdelivery devices:trends,limitations and possibilities.Expert OpinDrug Deliv 3,479-87(2006).
40.Prestidge,C.A.et al.Mesoporous silicon:a platform for thedelivery of therapeutics.Expert Opin Drug Deliv 4,101-10(2007).
41.Canham,L.T.Bioactive silicon structure fabricationthrough nanoetching techniques.Advanced Materials 7,1033-&(1995).
42.Zhang,M.,Desai,T.&Ferrari,M.Proteins and cells onPEG immobilized silicon surfaces.Biomaterials 19,953-60(1998).
43.Chen,Z.et al.Soluble ultra-short single-walled carbonnanotubes.J Am Chem Soc 128,10568-71(2006).
44.Saini,R.K.et al.Covalent sidewall functionalization ofsingle wall carbon nanotubes.J Am Chem Soc 125,3617-21(2003).
45.Canham,L.T.(1995).″Bioactive silicon structurefabrication through nanoetching techniques.″Advanced Materials7(12):1033-1037.
46.Canham,L.(1997).Properties of Porous Silicon.London,INSPEC -Institution of Electrical Engineers.
47.Mayne,A.H.,Bayliss,S.C.,Barr,P.,Tobin,M.,Buckberry,L.D.(2000).″Biologically Interfaced Porous Silicon Devices.″PhysicaStatus Solidi 182(1):505-513.
48.Low,S.P.,K.A.Williams,et al.(2006).″Evaluation ofmammalian cell adhesion on surface-modified porous silicon.″Biomaterials 27(26):4538-46.
49.Becker M.L.,et.al.Chem.Commun.(Camb)2003:180-181
50.Duncan R.Nat Rev Drug.Discov.2003,2:347-360.
51.La Van D.A.,et.al.Nat.Biotechnol.21,10:184-1191,2003.
52.Nakanishi T.,et.al.:J.Control.Release 2001,74:295-302.
53.Soppimath K.S.,et.al.J.Control.Release 2001,70:1-20.
54.Cloninger M.J.Curr.Opin.Chem.Biol.2002,6:742-748.
55.Gilles E.R.,et.al.J.Am.Chem.Soc 2002,124:14137-14146.
56.Quintana A,et.al.Pharm.Res.2002,19:1310-1316.
57.Charnay C,et.al.J.Phys.Chem.B 2003,107:7327-7333.
58.Hirsch L.R.,et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003,100:13549-13554.
59.Loo C,et.al.Technol.Cancer Res.Treat.2004,3:33-40.
60.O’Neal DP,et.al.Cancer Lett.2004,209:171-176.
61.Akerman M.E.,et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002,99:12617-12621.
62.Derfus A.M.,Nano Lett.2004,4:11-18.
63.Ishii D,et.al.Nature 2003,423:628-632.
64.Raja K.S.,et.al.Biomacromolecules 2003,4:472-476.
65.He X.X.,et.al.J.Am.Chem.Soc.2003,125:7168-7169.
66.Vijayanathan V.,et.al.Biochemistry 2002,41:14085-14094.
67.Cohen M.H.,et.al.Biomedical Microdevices 2003,5:253-259.
68.Ferrari M,US Patent No.6,107,102,issued August 22,2000.
69.Yan F.,et.al.Photoch.Photobiol.2003,78:587-591.
70.Yan F.,et.al.J.Nanosci.Nanotechnol.2004,4:72-76.
71.Oyewumi M.O.,et.al.Bioconjug.Chem.2002,13:1328-1335.
72.Ferrari M et.al.:US Patent No.6,355,270,issued March 12,2002.
73.Martin FJ,et.al.US Patent Application Publication No.2003/0114366,published June 19,2003.
74.Ferrari M.Current Opinion in Chemical Biology 2005,9:343-346.
75.Ferrari M.,Nat.Rev.Cancer.20055(3):161-71.
尽管上文指特别优选的实施方案,应了解本发明并不局限于此。在本发明公开的指导下,本领域普通技术人员会想到对该公开的实施方案做出多种改进并且将所述改进旨在在本发明的范围以内。本书面说明中引用的所有出版物、专利申请和专利此处以它们提供与本发明公开一致和对本发明公开进行补充的详细资料和描述的程度通过引用并入本文。
Claims (47)
1.包含至少一种一级粒子的组合物,其中所述一级粒子具有选定的非球形形状,所述一级粒子为尺寸500nm到3微米的多孔的微米粒子或纳米粒子,其中所述一级粒子是生物相容的,并且其中所述一级粒子还包含:(i)主体,(ii)至少一个具有表面电荷的表面;以及(iii)至少一个位于主体内部的贮存器,所述贮存器包含至少一种二级粒子
其中所述二级粒子包含:
主体,
包含在所述二级粒子内的至少一种活性试剂,和
表面,
其中所述一级粒子和所述二级粒子是电荷相容的,使得当所述一级粒子的表面带正电时,所述二级粒子的表面不带正电;而当所述一级粒子的表面带负电时,所述二级粒子的表面不带负电。
2.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子的主体包含生物可降解的材料。
3.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子的主体包含硅、无机氧化物材料、聚合物氧化物材料或陶瓷材料。
4.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子的主体包含纳米多孔材料。
5.权利要求4中的组合物,其中所述纳米多孔材料为纳米多孔硅。
6.权利要求4中的组合物,其中所述纳米多孔材料为纳米多孔的氧化物材料。
7.权利要求6中的组合物,其中所述纳米多孔的氧化物材料为纳米多孔的二氧化硅、纳米多孔的氧化铝、纳米多孔的氧化钛、纳米多孔的氧化铁或其组合。
8.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子的主体包含第一多孔区域和第二多孔区域,所述第二多孔区域与所述第一多孔区域在至少一个选自孔密度、孔几何学、孔电荷、孔表面化学和孔定向的特性上不同。
9.权利要求8中的组合物,其中配置所述第一多孔区域使其含二级粒子的第一群体,配置所述第二多孔区域使其含二级粒子的第二群体。
10.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子的主体包含含所述二级粒子的第一群体的第一区域和含所述二级粒子的第二群体的第二区域。
11.权利要求10中的组合物,其中所述第一和第二区域包含化学组合物,其中所述第一区域的化学组合物与所述第二区域的化学组合物相同。
12.权利要求10中的组合物,其中所述第一群体含第一活性试剂,所述第二群体含不同于所述第一活性试剂的第二活性试剂。
13.权利要求10中的组合物,其中所述第一和第二群体具有特征释放时间,其中所述第一群体从所述第一区域的特征释放时间不同于所述第二群体从所述第二区域的特征释放时间。
14.权利要求10中的组合物,其中所述第一区域和所述第二区域中的至少一个为生物可降解的区域。
15.权利要求9中的组合物,其中配置所述一级粒子使其在暴露于生理介质时分成包含第一区域的第一组分和包含第二区域的第二组分。
16.权利要求10中的组合物,其中配置所述第一区域使其绕过第一生物屏障,配置所述第二区域使其绕过不同于所述第一生物屏障的第二生物屏障。
17.权利要求16中的组合物,其中所述第一生物屏障和所述第二生物屏障各自独立地选自血液流变学屏障、网状内皮系统屏障、内皮屏障、血脑屏障、肿瘤相关的渗透性间质压力屏障、离子和分子泵屏障、细胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其任意组合的生物屏障。
18.权利要求1中的组合物,其中配置所述一级粒子使其绕过选自血液流变学屏障、网状内皮系统屏障、内皮屏障、血脑屏障、肿瘤相关的渗透性间质压力屏障、离子和分子泵屏障、细胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其组合的生物屏障。
19.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子包含(iv)至少一个连接所述贮存器和所述表面的通道。
20.权利要求1中的组合物,其中所述贮存器包含连接至表面的通道。
21.权利要求1中的组合物,其中所述一级粒子包含至少一种靶向部分。
22.权利要求21中的组合物,其中所述至少一种靶向部分选自化学靶向部分、物理靶向部分、几何学靶向部分和其任意组合。
23.权利要求21中的组合物,其中所述至少一种靶向部分包含安置于一级粒子的表面上的化学靶向部分,其中所述化学靶向部分包含至少一种选自树状聚体、适体、抗体、生物分子和其任意组合的部分。
24.权利要求1中的组合物,其中所述至少一个贮存器含至少一种另外的试剂。
25.权利要求24中的组合物,其中所述至少一种另外的试剂包括至少一种渗透增强剂、至少一种另外的活性试剂和至少一种靶向部分。
26.权利要求25中的组合物,其中所述至少一种渗透增强剂选自基底膜渗透增强剂、紧密连接蛋白(tjp)渗透增强剂和其任意组合。
27.权利要求1中的组合物,其中配置所述一级粒子使其响应外部刺激释放所述至少一种二级粒子。
28.权利要求1中的组合物,其中配置所述一级粒子使其响应一级粒子的环境的改变释放所述至少一种二级粒子。
29.权利要求1中的组合物,其中所述至少一种二级粒子包含至少一种选自脂质体、胶束、醇质体、碳纳米管、富勒烯纳米粒子、金属纳米粒子、半导体纳米粒子、聚合物纳米粒子、氧化物纳米粒子、病毒粒子、聚离子粒子和陶瓷粒子的成分。
30.权利要求1中的组合物,其中所述二级粒子含至少一种包含活性试剂的三级粒子。
31.权利要求1中的组合物,其中所述二级粒子具有主体和主体内的贮存器,使得所述二级粒子的贮存器含活性试剂。
32.权利要求1中的组合物,其中所述活性试剂包括治疗剂或成像剂或其组合。
33.权利要求1中的组合物,包含多个一级粒子和其中悬浮了所述多个一级粒子的载体。
34.制备多级递送组合物的方法,包括:
(a)提供至少一种一级粒子,其中所述一级粒子具有选定的非球形形状,所述一级粒子为尺寸500nm到3微米的微米粒子或纳米粒子,并且所述一级粒子还包含:(i)主体、(ii)至少一个具有表面电荷的表面和(iii)至少一个位于主体内部的贮存器;
(b)提供至少一种二级粒子,其中所述二级粒子包含:
主体,
包含在所述二级粒子内的至少一种活性试剂,和
表面,
其中所述一级粒子和所述二级粒子是电荷相容的,使得当所述一级粒子的表面带正电时,所述二级粒子的表面不带正电;而当所述一级粒子的表面带负电时,所述二级粒子的表面不带负电;以及
(c)将所述至少一种二级粒子装载入所述一级粒子的贮存器。
35.权利要求34中的方法,其中所述一级粒子的主体包含纳米多孔材料。
36.权利要求35中的方法,其中所述纳米多孔材料为纳米多孔硅或纳米多孔的氧化物材料。
37.权利要求34中的方法,其中提供所述至少一种一级粒子和提供所述至少一种二级粒子,包括提供含至少一种一级粒子、所述至少一种二级粒子和载体的溶液。
38.权利要求34中的方法,其中所述装载包含通过被动扩散或毛细管对流、或通过它们的组合的装载。
39.权利要求34中的方法,还包括修饰所述一级粒子的主体的孔表面或所述二级粒子的表面中的至少一个。
40.权利要求39中的方法,其中所述修饰包括化学地修饰一级粒子的主体的孔表面或二级粒子的表面中的至少一个。
41.权利要求39中的方法,其中所述修饰包括修饰一级粒子的主体的孔表面或二级粒子的表面中的至少一个上面的表面电荷。
42.权利要求37中的方法,其中所述装载包括改变溶液中所述至少一种二级粒子的浓度以达到二级粒子对所述一级粒子的至少一个贮存器中的期望的装载。
43.权利要求34中的方法,其中所述至少一种二级粒子包含二级粒子的第一群体和二级粒子的第二群体,其中所述装载包括将二级粒子的第一群体装载入所述一级粒子的主体的第一区域和将二级粒子的第二群体装载入所述一级粒子的主体的第二区域,其中所述第一区域不同于所述第二区域。
44.权利要求43中的方法,其中所述二级粒子的第一群体包含第一活性试剂,所述二级粒子的第二群体包含不同于所述第一活性试剂的第二活性试剂。
45.权利要求34中的方法,其中所述二级粒子包含至少一种选自脂质体、胶束、醇质体、碳纳米管、富勒烯纳米粒子、金属纳米粒子、半导体纳米粒子、聚合物纳米粒子、氧化物纳米粒子、病毒粒子、聚离子粒子和陶瓷粒子的成分。
46.权利要求34中的方法,还包括将至少一种另外的组分装载入所述一级粒子的贮存器。
47.权利要求46中的方法,其中所述至少一种另外的组分包括至少一种渗透增强剂或另外的活性试剂、或两者。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US82175006P | 2006-08-08 | 2006-08-08 | |
US60/821,750 | 2006-08-08 | ||
US91434807P | 2007-04-27 | 2007-04-27 | |
US60/914,348 | 2007-04-27 | ||
PCT/US2007/075516 WO2008021908A2 (en) | 2006-08-08 | 2007-08-08 | Multistage delivery of active agents |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101652126A CN101652126A (zh) | 2010-02-17 |
CN101652126B true CN101652126B (zh) | 2013-07-17 |
Family
ID=39082940
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2007800374243A Active CN101652126B (zh) | 2006-08-08 | 2007-08-08 | 活性试剂的多级递送 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20080311182A1 (zh) |
EP (1) | EP2056794A4 (zh) |
JP (1) | JP2010500375A (zh) |
CN (1) | CN101652126B (zh) |
AU (1) | AU2007286203B2 (zh) |
CA (1) | CA2664919A1 (zh) |
HK (1) | HK1140139A1 (zh) |
MX (1) | MX2009001461A (zh) |
WO (1) | WO2008021908A2 (zh) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1773303A2 (en) | 2004-05-25 | 2007-04-18 | Chimeracore, Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
US7854944B2 (en) * | 2004-12-17 | 2010-12-21 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Tissue regeneration |
JP2009533350A (ja) | 2006-04-07 | 2009-09-17 | キメロス, インコーポレイテッド | B細胞悪性疾患を処置するための組成物および方法 |
US8563022B2 (en) * | 2006-10-11 | 2013-10-22 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Particles for cell targeting |
US8361508B2 (en) * | 2007-02-26 | 2013-01-29 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Endocytotic particles |
US8920625B2 (en) * | 2007-04-27 | 2014-12-30 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Electrochemical method of making porous particles using a constant current density |
KR20110042152A (ko) * | 2008-04-25 | 2011-04-25 | 노쓰웨스턴유니버시티 | 콜레스테롤을 격리시키기에 적합한 나노구조 |
US8173115B2 (en) | 2008-07-29 | 2012-05-08 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Particle compositions with a pre-selected cell internalization mode |
KR20110039466A (ko) * | 2008-07-29 | 2011-04-18 | 보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 미리 선택된 세포 내재화 방식을 갖는 입자 조성물 |
WO2010025322A2 (en) * | 2008-08-28 | 2010-03-04 | The Florida International University Board Of Trustees | Magnetic nanodelivery of therapeutic agents across the blood brain barrier |
MX2011006766A (es) * | 2008-12-23 | 2011-10-19 | Univ Texas | Particulas dirigidas a la inflamacion. |
US20100233270A1 (en) | 2009-01-08 | 2010-09-16 | Northwestern University | Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles |
CA2749467A1 (en) * | 2009-01-15 | 2010-07-22 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Porous structures with modified biodegradation kinetics |
CA2752296C (en) * | 2009-02-18 | 2018-09-11 | Aradigm Corporation | Ph-modulated formulations for pulmonary delivery |
EP2413906B1 (en) | 2009-03-31 | 2017-03-15 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Method of controlled drug release from a liposome carrier |
WO2010120874A2 (en) | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Chimeros, Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
CA2760774A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Altermune Technologies, Llc | Chemically programmable immunity |
FR2948024B1 (fr) * | 2009-07-17 | 2020-01-10 | Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs - | Emulsion activable par ultrasons et son procede de fabrication. |
EP3561514A1 (en) * | 2009-09-23 | 2019-10-30 | Crystalplex Corporation | Passivated ii-vi semiconductor nanoparticles |
ES2367959B1 (es) * | 2009-12-22 | 2013-01-24 | Centro De Investigación Biomédica En Red En Bioingeniería, Biomateriales Y Nanomedicina | Particulas magnético-luminiscentes para aplicaciones biomédicas. |
JP5863670B2 (ja) | 2010-01-19 | 2016-02-17 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 核酸および/または他の構成要素を含有している合成ナノ構造体 |
JP5835741B2 (ja) | 2010-02-26 | 2015-12-24 | 国立大学法人 長崎大学 | 抗原または薬物送達複合体 |
CN103081107B (zh) | 2010-03-09 | 2017-02-08 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 多孔和非多孔纳米结构 |
US20130071326A1 (en) * | 2010-03-17 | 2013-03-21 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Universal cell-directed theranostics |
EP2590605A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-05-15 | Board of Regents of the University of Texas System | Biodegradable scaffolds |
KR20190006576A (ko) * | 2010-08-16 | 2019-01-18 | 오스트레일리안 뉴클리어 사이언스 앤드 테크놀로지 오가니제이션 | 생체분자의 전달을 위한 세라믹 입자를 포함하는 미립자 물질 및 미립자 물질을 포함하는 약학적 조성물 |
US20130224282A1 (en) * | 2010-09-21 | 2013-08-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Multistage Nanoparticles |
RU2475233C2 (ru) * | 2010-12-01 | 2013-02-20 | Учреждение Российской академии наук Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН | Фармакологическая композиция, предназначенная для интраназального введения с целью доставки в мозг фармакологически активного компонента, и способ ее получения |
US9089498B2 (en) * | 2011-04-14 | 2015-07-28 | The Regents Of The University Of California | Multifunctional nanoparticle designs and applications |
WO2013003624A2 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Academia Sinica | The capture, purification and release of biological substance using a surface coating |
US9101547B2 (en) | 2011-08-04 | 2015-08-11 | Nano And Advanced Materials Institute Limited | Enteric-coated capsule containing cationic nanoparticles for oral insulin delivery |
US8859004B2 (en) | 2011-08-04 | 2014-10-14 | Nano And Advanced Materials Institute Limited | pH-sensitive nanoparticles for oral insulin delivery |
EP2747774A4 (en) | 2011-09-09 | 2015-02-11 | Biomed Realty L P | METHOD AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING VIRUS PROTECTION |
WO2013095736A2 (en) * | 2011-09-27 | 2013-06-27 | The Methodist Hospital Research Institute | Gold-in-silicon nanoassembly for thermal therapy and methods of use |
WO2013070872A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Methods and compositions for x-ray induced release from ph sensitive liposomes |
US8926994B2 (en) * | 2011-12-07 | 2015-01-06 | The Methodist Hospital Research Institute | Mesoporous silicon particles for the presentation of tumor antigens and adjuvant for anti-cancer immunity |
US20130304050A1 (en) * | 2012-05-10 | 2013-11-14 | Wake Forest University Health Sciences | Methods of treating cancerous tissue |
US10842749B2 (en) * | 2012-06-12 | 2020-11-24 | The Methodist Hospital Research Institute | Compositions and methods of treating therapy resistant cancer and uses thereof |
US8883216B2 (en) * | 2012-08-27 | 2014-11-11 | Red Lion Chem Tech, Llc | Methods and ceramic nanoparticle compositions for heavy metal removal and for oral delivery of desirable agents |
US20140120157A1 (en) * | 2012-09-19 | 2014-05-01 | Georgetown University | Targeted liposomes |
JP2015536319A (ja) * | 2012-10-16 | 2015-12-21 | ウィリアム・マーシュ・ライス・ユニバーシティ | 薬剤耐性を克服するための改善されたナノベクターベースの薬物送達システム |
WO2014110449A1 (en) * | 2013-01-10 | 2014-07-17 | Amrita Vishwa Vidyapeetham | Stannous doped micro and nano particles for augmented radiofrequency ablation |
JP2015007209A (ja) * | 2013-05-31 | 2015-01-15 | 株式会社リコー | コアシェル型粒子、及びその製造方法 |
US10894963B2 (en) | 2013-07-25 | 2021-01-19 | Exicure, Inc. | Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use |
US10568898B2 (en) | 2013-08-13 | 2020-02-25 | Northwestern University | Lipophilic nanoparticles for drug delivery |
WO2015066212A2 (en) * | 2013-10-31 | 2015-05-07 | University Of Hawaii | Calpain inhibitors for treatment of inflammatory bowel disease and colorectal cancer |
JP6527516B2 (ja) | 2013-12-03 | 2019-06-05 | ノースウェスタン ユニバーシティ | リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用 |
WO2015153816A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Academia Sinica | Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis |
WO2015176025A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | The Methodist Hospital | Discoidal polymeric nanoconstructs and methods of use in cancer theranostics |
EP3148712B1 (en) | 2014-05-29 | 2021-08-18 | Crystalplex Corporation | Dispersion system for quantum dots |
US10434064B2 (en) | 2014-06-04 | 2019-10-08 | Exicure, Inc. | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
WO2016013751A1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-01-28 | 주식회사 레모넥스 | 생리활성 물질 또는 단백질 전달용 조성물 및 이의 용도 |
CN105381824B (zh) | 2014-08-26 | 2019-04-23 | 中央研究院 | 收集器架构布局设计 |
EP3215176A4 (en) | 2014-10-03 | 2018-05-23 | Ntercept, LLC | Compositions and methods for inhibiting the biological activity of soluble biomolecules |
KR20170063949A (ko) | 2014-10-06 | 2017-06-08 | 엑시큐어, 인크. | 항-tnf 화합물 |
EP3220895B1 (en) | 2014-11-21 | 2022-08-31 | Northwestern University | The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates |
EP3265059A4 (en) | 2015-03-03 | 2018-08-29 | Cureport Inc. | Combination liposomal pharmaceutical formulations |
EP3265063A4 (en) | 2015-03-03 | 2018-11-07 | Cureport, Inc. | Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations |
US10078092B2 (en) | 2015-03-18 | 2018-09-18 | Northwestern University | Assays for measuring binding kinetics and binding capacity of acceptors for lipophilic or amphiphilic molecules |
JP6894423B2 (ja) * | 2015-07-09 | 2021-06-30 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California | 融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子 |
US20170056327A1 (en) * | 2015-08-25 | 2017-03-02 | The Methodist Hospital | Micro/nano composite drug delivery formulations and uses thereof |
ITUB20159209A1 (it) * | 2015-12-21 | 2017-06-21 | Fidia Farm Spa | Nanosistemi per il trasporto controllato di molecole attive a fini diagnostici, prognostici e terapeutici |
US10064855B2 (en) * | 2016-03-08 | 2018-09-04 | Los Gatos Pharmaceuticals, Inc. | Composite nanoparticles and uses thereof |
US10107726B2 (en) | 2016-03-16 | 2018-10-23 | Cellmax, Ltd. | Collection of suspended cells using a transferable membrane |
CA3023451A1 (en) | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Exicure, Inc. | Liposomal spherical nucleic acid (sna) constructs presenting antisense oligonucleotides (aso) for specific knockdown of interleukin 17 receptor mrna |
EP3458544A4 (en) | 2016-05-19 | 2020-04-08 | Crystalplex Corporation | CADMIUM-FREE QUANTUM BOXES, TUNABLE QUANTUM BOXES, POLYMER CONTAINING QUANTUM BOXES, ARTICLES, FILMS, 3D STRUCTURE CONTAINING THEM AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME |
US11364304B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-06-21 | Northwestern University | Crosslinked micellar spherical nucleic acids |
JP2020504177A (ja) * | 2017-01-04 | 2020-02-06 | ナノティックス,エルエルシー | 捕捉粒子をアセンブルするための方法 |
CA3052561C (en) | 2017-02-06 | 2023-02-14 | Lemonex Inc. | Physiologically active substance carrier |
WO2018201090A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Exicure, Inc. | Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties |
US11690920B2 (en) | 2017-07-13 | 2023-07-04 | Northwestern University | General and direct method for preparing oligonucleotide-functionalized metal-organic framework nanoparticles |
AU2018308332B2 (en) * | 2017-07-25 | 2021-11-18 | Lemonex Inc. | Composition for delivering physiologically active ingredients into blood vessel |
US11530132B2 (en) | 2017-09-05 | 2022-12-20 | Lemonex Inc. | Composition comprising porous silica particles carrying a cell fate modulating factor |
WO2019121748A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Nanobiotix | Nanoparticles for use for treating a neuronal disorder |
JP2021507903A (ja) | 2017-12-19 | 2021-02-25 | ナノビオティックスNanobiotix | 脳の能力の向上又はストレスの処置に使用するためのナノ粒子 |
US20210030467A1 (en) * | 2018-02-12 | 2021-02-04 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Devices and methods for delivering material into a biological tissue or cell |
CN112546406B (zh) * | 2020-11-20 | 2022-04-22 | 广东药科大学 | 一种微型机器人给药装置及给药系统 |
WO2024035784A1 (en) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | Auburn University | Shrinking nanomaterial for biomedical applications |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0855179A2 (en) * | 1997-01-16 | 1998-07-29 | Lipotec, S.A. | Pharmaceutical preparation comprising coated capsules or tablets containing a liposome powder encapsulating a drug |
US6355270B1 (en) * | 1999-01-11 | 2002-03-12 | The Regents Of The University Of California | Particles for oral delivery of peptides and proteins |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4888176A (en) | 1984-05-21 | 1989-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery high molecular weight polyanhydrides |
US4933185A (en) | 1986-09-24 | 1990-06-12 | Massachusetts Institute Of Technology | System for controlled release of biologically active compounds |
US5010167A (en) | 1989-03-31 | 1991-04-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Poly(amide-and imide-co-anhydride) for biological application |
US6099864A (en) * | 1994-12-02 | 2000-08-08 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | In situ activation of microcapsules |
US6107102A (en) | 1995-06-07 | 2000-08-22 | Regents Of The University Of California | Therapeutic microdevices and methods of making and using same |
US6395302B1 (en) * | 1996-11-19 | 2002-05-28 | Octoplus B.V. | Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems |
AU775879C (en) * | 1998-11-20 | 2005-03-10 | Freedom-2, Inc. | Permanent, removable tissue markings |
US20030114366A1 (en) * | 1999-01-11 | 2003-06-19 | Francis J. Martin | Microfabricated particles and method for treating solid tumors |
US6887493B2 (en) * | 2000-10-25 | 2005-05-03 | Adi Shefer | Multi component controlled release system for oral care, food products, nutraceutical, and beverages |
US6685927B2 (en) * | 2001-09-27 | 2004-02-03 | Ceramoptec Industries, Inc. | Topical application of chromophores for hair removal |
US7563451B2 (en) * | 2003-07-22 | 2009-07-21 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Capped mesoporous silicates |
JP2007526322A (ja) * | 2004-03-02 | 2007-09-13 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | ナノセル薬物送達系 |
JP2009520989A (ja) | 2005-12-20 | 2009-05-28 | ザ オハイオ ステイト ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション | 分析法のためのナノ多孔性基材 |
US20090311295A1 (en) * | 2006-05-12 | 2009-12-17 | Edith Mathiowitz | Particles with high uniform loading of nanoparticles and methods of preparation thereof |
US20100074958A1 (en) * | 2006-09-28 | 2010-03-25 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting fenestrated vasculature |
US8563022B2 (en) * | 2006-10-11 | 2013-10-22 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Particles for cell targeting |
US8920625B2 (en) * | 2007-04-27 | 2014-12-30 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Electrochemical method of making porous particles using a constant current density |
-
2007
- 2007-08-08 MX MX2009001461A patent/MX2009001461A/es active IP Right Grant
- 2007-08-08 AU AU2007286203A patent/AU2007286203B2/en active Active
- 2007-08-08 JP JP2009523983A patent/JP2010500375A/ja active Pending
- 2007-08-08 CN CN2007800374243A patent/CN101652126B/zh active Active
- 2007-08-08 US US11/836,004 patent/US20080311182A1/en not_active Abandoned
- 2007-08-08 EP EP07840796A patent/EP2056794A4/en not_active Withdrawn
- 2007-08-08 CA CA002664919A patent/CA2664919A1/en not_active Abandoned
- 2007-08-08 WO PCT/US2007/075516 patent/WO2008021908A2/en active Application Filing
-
2010
- 2010-06-30 HK HK10106383.0A patent/HK1140139A1/xx unknown
-
2015
- 2015-05-29 US US14/725,570 patent/US10143658B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-12 US US16/158,644 patent/US20190111000A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-07-06 US US17/368,401 patent/US20210338593A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0855179A2 (en) * | 1997-01-16 | 1998-07-29 | Lipotec, S.A. | Pharmaceutical preparation comprising coated capsules or tablets containing a liposome powder encapsulating a drug |
US6355270B1 (en) * | 1999-01-11 | 2002-03-12 | The Regents Of The University Of California | Particles for oral delivery of peptides and proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10143658B2 (en) | 2018-12-04 |
WO2008021908A2 (en) | 2008-02-21 |
US20160051481A1 (en) | 2016-02-25 |
CA2664919A1 (en) | 2008-02-21 |
AU2007286203A1 (en) | 2008-02-21 |
EP2056794A4 (en) | 2012-12-26 |
AU2007286203A2 (en) | 2009-03-19 |
EP2056794A2 (en) | 2009-05-13 |
CN101652126A (zh) | 2010-02-17 |
US20080311182A1 (en) | 2008-12-18 |
AU2007286203B2 (en) | 2013-05-02 |
US20210338593A1 (en) | 2021-11-04 |
HK1140139A1 (en) | 2010-10-08 |
JP2010500375A (ja) | 2010-01-07 |
MX2009001461A (es) | 2009-07-02 |
WO2008021908A3 (en) | 2008-08-14 |
US20190111000A1 (en) | 2019-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101652126B (zh) | 活性试剂的多级递送 | |
Kumeria et al. | Porous silicon for drug delivery applications and theranostics: recent advances, critical review and perspectives | |
A Santos et al. | Multifunctional porous silicon for therapeutic drug delivery and imaging | |
Kumar et al. | Covalently dye-linked, surface-controlled, and bioconjugated organically modified silica nanoparticles as targeted probes for optical imaging | |
Rastegari et al. | An update on mesoporous silica nanoparticle applications in nanomedicine | |
Lane et al. | Physical chemistry of nanomedicine: understanding the complex behaviors of nanoparticles in vivo | |
CN107715121B (zh) | 一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法 | |
Kesharwani et al. | Dendrimer as nanocarrier for drug delivery | |
Tekade et al. | Nanotechnology for the development of nanomedicine | |
Muazim et al. | Graphene oxide—A platform towards theranostics | |
Pawde et al. | Mannose receptor targeted bioadhesive chitosan nanoparticles of clofazimine for effective therapy of tuberculosis | |
Choi et al. | Smart nanomaterials for biomedics | |
Hu et al. | Redox-sensitive folate-conjugated polymeric nanoparticles for combined chemotherapy and photothermal therapy against breast cancer | |
CN101390826B (zh) | 一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡及其制备方法 | |
Wu et al. | Nano-sized albumin-copolymer micelles for efficient doxorubicin delivery | |
CN114259477B (zh) | 一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用 | |
Mahato | Multifunctional micro-and nanoparticles | |
CN100562341C (zh) | 细胞核靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的应用 | |
Chen et al. | A dual-targeting nanocarrier based on modified chitosan micelles for tumor imaging and therapy | |
Bobbala et al. | Just add water: hydratable, morphologically diverse nanocarrier powders for targeted delivery | |
Amjad et al. | Nano particles: An emerging tool in biomedicine | |
Faraji et al. | A review on application of novel solid nanostructures in drug delivery | |
Ferrari et al. | Multistage delivery of active agents | |
Rao et al. | NANOPHARMACEUTICS: A NOVEL DRUG DELIVERY TECHNOLOGY | |
Kotha et al. | Nanomaterials Mediated Diagnosis of Lung Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1140139 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1140139 Country of ref document: HK |