MX2008008231A

MX2008008231A - Sustratos nanoporosos para metodos analiticos.

Info

Publication number: MX2008008231A
Application number: MX2008008231A
Authority: MX
Inventors: Mauro Ferrari; Mark Ming-Cheng; Giovanni Cuda; Marco Gaspari; David Geho; Lance Liotta; Emmanuel Petricoin; Fredika Robertson; Rosa Terracciano
Original assignee: Univ Ohio State Res Found
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2008-11-26
Also published as: US20140342466A1; NZ568934A; US8753897B2; US20080277578A1; CA2634395A1; WO2007120248A2; WO2007120248A3; EP1979746A2; KR20090007275A; AU2006342115A1; JP2009520989A

Abstract

Materiales nanoporosos pueden usarse para enriquecer muestras para análisis subsecuente de sustancias contenidas en la muestra. Se muestra que el método enriquece el rendimiento de especies en el proteoma de bajo peso molecular, que permite la detección de péptidos pequeños en el intervalo nanomolar bajo.

Description

SUSTRATOS NANOPOROSOS PARA METODOS ANALITICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se relaciona en general con dispositivos y sistemas analíticos y métodos de elaboración y uso de los mismos y, más particularmente, con dispositivos y sistemas analíticos que utilizan materiales nanoporosos y métodos de elaboración y uso dé los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Diversas técnicas para analizar sustancias en una muestra clínica se encuentran disponibles, pero las técnicas más comunes requieren soluciones costosas para resolver la interferencia de la sustancias altamente abundantes en la muestras, tales como albúmina en el caso de suero sanguíneo. Una solución a este problema implica el uso de anticuerpos para capturar el material altamente abundante y reducir su presencia en la muestra, de modo que no interfiera con el análisis de otras sustancias de interés. Existe una necesidad de mejores métodos y sistemas para analizar sustancias en una muestra.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención proporciona un método de fraccionamiento o separación que comprende (a) proporcionar una muestra que comprende un primer componente y un segundo componente; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; y (c) exponer el material nanoporoso a la muestra, en donde con la exposición del material nanoporoso se retiene el primer componente y no se retiene el segundo componente. En otra modalidad, la invención proporciona un método para analizar una muestra, que comprende (a) proporcionar la muestra; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; y (c) exponer el material nanoporoso a la muestra; y analizar una fracción de la muestra retenida por el material nanoporoso. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar un marcador de una condición fisiológica que comprende (a) proporcionar una muestra afectada por la condición fisiológica; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; (c) exponer el material nanoporoso a la muestra; (d) analizar una fracción de la muestra retenida por el material nanoporoso; y (e) comparar un resultado del análisis con un resultado del análisis de una muestra control para detectar el marcador de la condición fisiológica . Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un equipo que comprende medios para recolectar una muestra que comprende uno o ' más componentes; y un sustrato que comprende un material nanoporoso configurado para retener uno o más componentes. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un sistema analítico que comprende un instrumento analítico y un sustrato que comprende un material nanoporoso, en donde el sustrato se configura para intensificar una sensibilidad del instrumento analítico a uno o más analitos. Y todavía en otra modalidad, la invención proporciona una sonda que comprende un sustrato que comprende un material nanoporoso y se configura para insertarse en un espectrómetro de masas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 presenta imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de sílice A y B. Las Figuras 2 (A) -(C) presentan espectros de masas de Ionización Desorción por Láser Asistida por Matriz - Tiempo De Vuelo (MALDI-TOF) de una muestra diluida de Plasma Humano (Figura 2A) ; proteínas de Plasma Humano retenidas después de la exposición en partículas nanoporosas de sílice tipo A (Figura 2B) ; y proteínas de Plasma Humano retenidas después de la exposición en partículas nanoporosas de sílice tipo B (Figura 2C) .

Las Figuras 3 (A) - (C) presentan espectros de masas de MALDI-TOF de proteínas de Plasma Humano retenidas después de la exposición a partículas nanoporosas de sílice tipo A. A, B, C representan un conjunto de tres experimentos independientes. Las Figuras 4 (A) -(C) presentan espectros de masas de MALDI-TOF de proteínas de Plasma Humano retenidas después de la exposición en partículas nanoporosas de sílice tipo B. A, B, C representan un conjunto de tres experimentos independientes. Las Figuras 5 (a) -(d) presentan espectros de masas de experimentos de adición con insulina en cuatro concentraciones diferentes: a) 500 ng/mL; b) 200 ng/mL; c) 30 ng/mL; y 4) 15 ng/mL. La Figura 6 ilustra esquemáticamente una estrategia para el agotamiento parcial de suero usando obleas nanoporosas de silicio. Las obleas nanoporosas de silicio se generan e incuban con el suero. Después del periodo de incubación, las obleas se remueven y la muestra de suero restante se coloca en un chip de intercambio catiónico débil para análisis de espectrometría de masas (MS) por Ionización Desorción por Láser Aumentada en Superficie (SELDI) y se compara con espectros de MS de suero control no expuesto a la oblea nanoporosa. La Figura 7 presenta resultados de análisis de MS de suero parcialmente agotado usando una oblea nanoporosa de silicio. Como se describe en la Figura 6, el suero se incuba con una oblea nanoporosa de silicio recubierta con grupos aminopropilo . Después de la incubación, el suero se une a un chip de intercambio catiónico débil y entonces se somete a análisis de MS . Se obtienen huellas digitales de MS . El suero nativo (suero no expuesto a la oblea nanoporosa) se compara con suero después del agotamiento por obleas. Un pico dominante se presenta en el suero nativo (flecha roja/derecha) que ensombrece un pico más pequeño dentro de un intervalo similar de m/z (flecha azul/izquierda) . En el suero parcialmente agotado de su contenido proteómico por incubación con la oblea nanoporosa, un pico designado por la flecha azul/izquierda llega a ser dominante comparado con el pico marcado con la flecha roja/derecha. Cuando una relación de intensidad relativa de picos se compara entre los picos azul/izquerdo y ro o/derecho, se demuestra un cambio marcado entre el suero nativo y el suero después del agotamiento usando la oblea nanoporosa de silicio. La Figura 8 ilustra esquemáticamente una estrategia para recolectar moléculas a partir del suero usando obleas nanoporosas de vidrio. Cuentecillas de vidrio recubiertas con grupos aminopropilo se incuban con el suero. Después del periodo de incubación, las cuentecillas se remueven, se lavan, y las moléculas unidas se eluyen y colocan en un chip de intercambio catiónico débil para análisis de SELDI y se comparan con MS espectros de suero control no expuesto a las cuentecillas nanoporosas. La Figura 9 presenta resultados de análisis de MS de moléculas recolectadas por cuentecillas nanoporosas de vidrio. Como se describe en la Figura 8, el suero se incuba con cuentecillas de vidrio recubiertas con grupos aminopropilo . Después de la incubación, el suero se une primero a un chip de intercambio catiónico débil y entonces se somete a análisis de MS. El suero nativo (no expuesto a las cuentecillas nanoporosas) se compara con moléculas recolectadas usando cuentecillas de 17 nm. En el suero nativo, un pico dominante (flecha roja/derecha) ensombrece un pico más pequeño (flecha azul/izquierda) dentro de un intervalo similar de m/z. En la muestra eluida, es decir, la muestra expuesta a las cuentecillas nanoporosas de vidrio, el pico designado por la flecha azul/izquierda llega a ser dominante comparado con el pico marcado con la flecha roja/derecha. Una relación de intensidades relativas de picos entre los picos azul/izquierdo y rojo/derecho demuestra un cambio marcado entre el suero nativo y las moléculas recolectadas y subsecuentemente eluidas de las cuentecillas nanoporosas. La Figura 10 presenta resultados de análisis de MS para moléculas recolectadas por cuentecillas porosas de 70 nm. Como se describe en la Figura 8, el suero se incuba con cuentecillas de vidrio que tienen poros de 70 nm y recubiertas con grupos aminopropilo . Después de la incubación, el suero se une a un chip de intercambio catiónico débil y entonces se somete a análisis de MS . El suero nativo (no expuesto a las cuentecillas nanoporosas) se compara con moléculas recolectadas usando cuentecillas de 70 nm. Un pico dominante (flecha roja/derecha) ensombrece en el suero a un pico más pequeño (flecha azul/izquierda) dentro de un intervalo similar de m/z. En la muestra eluida, el pico designado por la flecha azul asume un perfil dominante cuando se compara con el pico marcado con la flecha roja. Una relación, de intensidades relativas de picos entre los picos azul/izquierdo y rojo/derecho demuestra un cambio marcado entre el suero nativo y las moléculas recolectadas y subsecuentemente eluidas de las cuentecillas. La Figura 11 demuestra resultados de análisis de Dodecilsulfato de Sodio - Electroforesis en Geles de PoliacrilAmida (SDS-PAGE) para suero nativo no expuesto a un material nanoporoso y moléculas eluidas de cuentecillas de vidrio de tamaño de poro de 17 nm y cuentecillas de vidrio de tamaño de poro de 70 nm. Las Figuras 12 (A) - (C) comparan un fraccionamiento serológico e intensificación de la purificación usando materiales nanoporosos (A) con técnicas histoquimicas clásicas (B,C) para poner al descubierto discriminadores patológicos. La Figura 12(A) demuestra que la exposición del suero a una superficie nanoporosa aumenta la detección de ciertos picos de proteínas. Figura 12(B): la tinción tricrómica de asson (panel derecho) demuestra deposición de colágena, información necesaria para establecer las fases de la fibrosis hepática del paciente relacionada con infección crónica por hepatitis C (panel izquierdo, tinción de H&E de rutina) . Figura 12 (C) : La impregnación de plata de Bielchowsky pone al descubierto placas neuríticas en tejido de neocorteza de cerebro con enfermedad de Alzheimer (panel derecho) , un signo patológico cardinal que se opone a la detección por tinción de H&E (panel izquierdo) . La Figura 13 muestra una morfología de la película nanoporosa de óxido de silicio usando Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) , véanse detalles en el Ejemplo 3 en lo siguiente. Las Figuras 14 (i)-(ii) muestran perfiles de MALDI-TOF de plasma humano después de la incubación en superficies específicas, (i) plasma incubado con chip nanoporoso de óxido de silicio; (ii) plasma incubado con chip sólido de óxido de silicio. La muestra analizada fue una alícuota de 5 microlitros de plasma humano adicionado con calcitonina a una concentración de 1 microgramo/mL . El pico de calcitonina se marca con un asterisco (*) . La Figura 15 muestra la repetibilidad de perfiles peptídicos de MALDI-TOF obtenidos al usar recolección con chip nanoporoso de óxido de silicio. Las Figuras 16 (i)-(iv) muestran la recolección de bajo peso molecular (LMW) de plasma adicionado con calcitonina humana. Se muestran cuatro experimentos en plasma adicionado con una concentración decreciente de calcitonina (ampliación-reducción en la ventana de m/z alrededor del pico de calcitonina) : (i) 1000 ng/mL, (ii) 200 ng/mL, (iii) 50 ng/mL, (iv) 20 ng/mL. La incubación y condiciones de MS son como se describe en la sección experimental del Ejemplo 3 en lo siguiente. La Figura 17 ilustra esquemáticamente una estrategia para diseñar un envío para intensificar una sensibilidad de proteoma de bajo peso molecular (LMWP) discutido en detalle en el Ejemplo 4 en lo siguiente. La Figura 18 muestra espectros de masas de MALDI- TOF para tres diferentes preparaciones de MALDI de muestra/matriz . La Figura 19 muestra espectros de masas de MALDI-TOF de suero control de ratón. La Figura 20 muestra espectros de masas de MALDI-TOF de suero control de ratón para cuatro diferentes cuentecillas nanoporosas. Panel izquierdo superior: cuentecillas nanoporosas de sílice con un tamaño de poro pequeño; panel derecho superior: cuentecillas nanoporosas de sílice con un tamaño de poro grande; panel izquierdo inferior: cuentecillas nanoporosas de sílice de tamaño de poro pequeño modificadas con 3-mercaptopropiltrimetoxisilano ( PT S) ; panel derecho inferior: cuentecillas nanoporosas de sílice de tamaño de poro pequeño modificadas con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) . La Figura 21 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro pequeño. Gel de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de sílice de poro pequeño. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, y 67 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 en lo siguiente para una clave para la identificación de muestras) . La Figura 22 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro grande. Gel de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de sílice de poro grande. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, y 70 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 en lo siguiente para una clave para la identificación de muestras) . La Figura 23 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro pequeño modificadas con APTES. Gel. de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de poro pequeño modificadas con APTES. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, y 68 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 para una clave para la identificación de muestras) . La Figura 24 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro grande modificadas con APTES. Gel de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de poro grande modificadas con APTES. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, y 71 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 para una clave para la identificación de muestras) . La Figura 25 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro pequeño modificadas con PTMS. Gel de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de poro pequeño modificadas con MPTMS. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, y 69 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 para una clave para la identificación de muestras) . La Figura 26 presenta resultados de electroforesis en gel ID para muestras de eluatos de cuentecillas de sílice de poro grande modificadas con MPTMS. Gel de gradientes de tris-glicina (8-16% de acrilamida) de eluatos de cuentecillas obtenidos a partir de incubación de sueros combinados con las cuentecillas de poro grande modificadas con MPTMS. El carril de extrema izquierda corresponde a los estándares de peso molecular y los carriles restantes de izquierda a derecha corresponden en secuencia a las muestras de eluatos de cuentecillas 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, y 72 (véase la Tabla 4 en el Ejemplo 5 para la clave para la identificación de muestras). La Figura 27 presenta el perfil de escisión de bandas de proteínas del gel en la Figura 26. La imagen del gel es una copia del gel en la Figura 26 con una superposición del patrón de escisión de bandas usado para obtener muestras para espectroscopia de masas en tándem. Las bandas de bajo peso molecular se escindieron de cada carril, y todas las bandas de proteínas se escindieron del carril 8. La clave de numeración e identificación de bandas es como sigue. Las bandas se cortaron de arriba a abajo en cada carril iniciando desde la izquierda (el carril 1 corresponde a los marcadores de peso molecular) en el carril 2, y procediendo al carril 7. El carril 8 se saltó, y el corte de bandas continuó con el carril 9 hasta el carril 13. Cuatro bandas se escindieron de cada uno de estos carriles. Iniciando con el carril 2, la banda superior corresponde al pozo Al, hasta la banda inferior, la cual corresponde al pozo Di. Las bandas se cortaron entonces desde el carril 8, iniciando con la banda superior, pozo E6, hasta la banda inferior G8. Carril 2, pozos de muestras Al- DI; carril 3, pozos de muestras El-Hl; carril 4, pozos de muestras A2-D2; carril 5, pozos de muestras E2-H2; carril 6, pozos de muestras A3-D3; carril 7, pozos de muestras E3-H3, carril 9, pozos de muestras A4-D4 ; carril 10, pozos de muestras E4-H4; carril 11, pozos de muestras A5-D5; carril 12, pozos de muestras E5-H5; carril 13, pozos de muestras A6-D6; carril 7, pozos de muestras E6-G8. La Figura 28 presenta el perfil de escisión de bandas de proteínas en la Figura 24. La imagen del gel es una copia de la región de bajo peso molecular del gel en la Figura 24, carriles 10 hasta 13, con una superposición del patrón de escisión de bandas usado para obtener muestras para espectroscopia de masas en tándem de los carriles 12 y 13. Bandas de bajo peso molecular se escindieron del carril 12 y 13. La clave de numeración e identificación de bandas es como sigue. Las bandas se cortaron de arriba a abajo en cada carril iniciando desde la izquierda y procediendo al carril 13. Cinco bandas se escindieron de cada uno de estos carriles. Iniciando con el carril 12, la banda superior corresponde al pozo de muestra H8, hasta la banda inferior, la cual corresponde al pozo D9. Las bandas se cortaron entonces desde el carril 13, iniciando con la banda superior, pozo E9, hasta la banda inferior A10. La Figura 29 presenta el perfil de escisión de bandas de proteínas del gel en la Figura 25. La imagen del gel es una copia del gel en la Figura 25 con una superposición del patrón de escisión de bandas usado para obtener muestras para espectroscopia de masas en tándem. Todas las bandas de proteínas se escindieron desde el carril 6 solamente. La clave de numeración e identificación de bandas es como sigue. Las bandas se cortaron de arriba a abajo desde el carril 6. Un total de diecisiete bandas se escindieron de este carril. Iniciando en la banda superior, la muestra corresponde al pozo B10, hasta la banda inferior, la cual corresponde al pozo B12. Las bandas de la parte superior del gel corresponden a los pozos de muestra B10, CIO, DIO, E10, FIO, G10, H10, All, BU, CU, Dll, Ell, FU, Gil, Hll, A12, y finalmente B12. La Figura 30 presenta espectros de masas de SELDI de sueros combinados. Se presentan espectros de SELDI obtenidos de chips WCX2 de los sueros combinados y en bruto diluidos. Cada muestra se representa en espectros duplicados. Desde la parte superior: espectros 1 y 2, sueros de clon 8 de 28 días; espectros 3 y 4, clon 10 de 28 días; espectros 5 y 6, clon 8 de 42 días; y espectros 7 y 8, clon 10 de 42 días. La Figura 31 presenta espectros de masas de SELDI de sueros combinados. Se presentan espectros de SELDI obtenidos de chips WCX2 de los sueros combinados y en bruto diluidos. Cada muestra se representa en espectros duplicados. Desde la parte superior: espectros 1 y 2, sueros control matrigel de 60 días; espectros 3 y 4, control de BT474 de 60 días; espectros 5 y 6, línea celular control CF7 de ¦ 60 días; y espectros 7 y 8, clon 8 de 60 días . La Figura 32 presenta espectros de masas de SELDI de sueros combinados. Se presentan espectros de SELDI obtenidos de chips CX2 de los sueros combinados y en bruto diluidos. Cada muestra se representa en espectros duplicados. Desde la parte superior: espectros 1 y 2, sueros de clon 10 de 60 días; espectros 3 y 4, combinación de control A; espectros 5 y 6, combinación de control B; y espectros 7 y 8, combinación de control C. Las Figuras 33 (A) - (C) presentan espectros de SELDI de eluatos de cuentecillas . Las Figuras 34 (A) - (C) presentan espectros de SELDI de eluatos de cuentecillas. Las Figuras 35 (A) -(C) presentan espectros de SELDI de eluatos de cuentecillas . Las Figuras 36 (A) -(C) presentan espectros SELDI de eluatos de cuentecillas. Las Figuras 37 (A) -(C) presentan espectros de SELDI de eluatos de cuentecillas. Las Figuras 38 (A) -(C) presentan espectros de SELDI de eluatos de cuentecillas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se especifique de otra manera, las palabras "un" o "una" como se usan en la presente significan "uno o más". En una modalidad, la invención proporciona un método que implica proporcionar una muestra que comprende un primer componente y un segundo componente, proporcionando un sustrato que comprende un material nanoporoso y exponer el material nanoporoso a la muestra. Con la exposición, el material nanoporoso retiene el primer componente y no retiene el segundo componente. De preferencia, la muestra es una muestra biológica, es decir, una muestra que contiene biomoléculas , tales como proteínas, péptidos, antígenos, anticuerpos, fragmentos de proteínas, ARN o ADN . La muestra biológica puede ser una muestra de una planta, un animal, incluyendo un mamífero, de preferencia un humano, o un cultivo celular. La muestra biológica puede ser una muestra de un fluido biológico tales como sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, fluido seminal, plasma seminal, fluido pleural, ascitis, aspirado de pezón, heces o saliva. El material nanoporoso puede ser cualquier material que tenga una distribución de tamaño de poro centrada en menos de 1000 nm, de preferencia menos de 100 nm. En algunas modalidades, el material nanoporoso puede ser un silicio nanoporoso. Todavía en algunas modalidades, el material nanoporoso puede ser un material nanoporoso de óxido tal como una sílice nanoporosa o una alúmina nanoporosa . El material nanoporoso puede separar el primer y el segundo componente por peso molecular, es decir, el primer componente retenido por el material nanoporoso puede tener un peso molecular promedio menor al segundo componente . El componente retenido por el material nanoporoso puede adsorberse a un material nanoporoso, es decir, es un componente que puede lavarse con agua por lavado moderado, tal como lavar con agua dionizada. El primer componente retenido por el material nanoporoso puede ser un componente de bajo peso molecular, es decir, un componente en el cual todas de sustancialmente todas las moléculas tienen un peso molecular no mayor a 20 kDa, o no mayor a 15 kDa, o no mayor a 10 kDa, o no mayor a 5 kDa o no mayor a 4 kDa. El material nanoporoso puede actuar como un separador molecular, es decir, el material nanoporoso puede retener todas o sustancialmente todas las moléculas que tienen un peso molecular igual o por debajo de un peso de separación molecular y no retiene todas o sustancialmente todas las moléculas que tienen un peso molecular por arriba del peso de separación molecular. El peso de separación molecular del material nanoporoso puede variarse al ajustar un tamaño de poro del material nanoporoso. Una superficie del material nanoporoso puede modificarse, por ejemplo, con carga eléctrica o grupos funcionales depositados en la superficie. Tal modificación puede usarse para retener componentes particulares de la muestra. Por ejemplo, una carga positiva puede proporcionarse al modificar la superficie con moléculas que contienen amino tales como aminosilanos . Una carga negativa puede proporcionarse al modificar la superficie con moléculas que contienen grupos mercapto, tales como mercaptosilanos . La superficie también puede modificarse con grupos hidrofóbicos al depositar moléculas que contienen un alquilo de cadena larga (más larga que 10 átomos de carbono), tales como alquilsilanos . La superficie del material nanoporoso también puede modificarse con metales, tales como cobre o hierro, los cuales, por ejemplo, pueden incrementar una afinidad del material nanoporoso para un componente particular de la muestra, tales como proteínas fosforiladas . Para modificar una superficie de un óxido nanoporoso, tal como una sílice nanoporosa, una sal del metal puede agregarse durante la síntesis del óxido nanoporoso. Por ejemplo, para sílice nanoporosa, una cantidad diferente de Cu (MeC02 ) 2H20 puede agregarse en CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) y TEOS (tetraetilortosilicato) y Na20 y H20. Después de eso, un tratamiento a alta temperatura puede realizarse a alrededor de 200 grados C y a alrededor de 540 grados C. Una superficie de silicio nanoporoso puede modificarse con un metal al usar revestimiento anelectrolítico . El sustrato que comprende el material nanoporoso puede proporcionarse en una diversidad de formas, las cuales incluyen, pero no se limitan a, una película, una oblea, una partícula o un microchip. En algunas modalidades, el sustrato puede fabricarse usando una técnica descendente tales como fotolitografía, litografía por haz de electrones, litografía de rayos X, litografía de UV profunda y litografía de nanoimpresion. En alguna modalidad, el componente de la muestra retenido por el material nanoporoso puede extraerse de la muestra, por ejemplo, para análisis o visualización posterior . Todavía en algunas modalidades, el análisis o visualización posterior puede realizarse en el componente de la muestra retenido por el material nanoporoso sin extraer el primer componente. El análisis posterior del primer componente puede realizarse por ejemplo por electroforesis en gel tales como SDS-PADE, por cromatografía, por una técnica de bioensayo o por espectrometría de masas tales como espectrometría de masas MALDI-TOF, espectrometría de masas LC/MS, espectrometría de masas de ionización por electroaspersion, espectrometría de masas en tándem o espectrometría de masas SELDI . Exponer la muestra al material nanoporoso antes del análisis puede intensificar un nivel de detección del análisis. Por ejemplo, al exponer la muestra al material nanoporoso, la espectrometría de masas puede detectar moléculas de bajo peso molecular presentes en una concentración no más alta de 1000 ng/ml, o no más alta de 200 ng/ml, no más alta de 100 ng/ml, o no más alta de 20 ng/ml, o no más alta de 10 ng/ml, o no más alta de 5 ng/ml o no más alta de 1 ng/ml. Los sustratos que comprenden el material nanoporoso también pueden usarse para detectar y/o identificar un biomarcador de una condición fisiológica, tal como una enfermedad o una fase de enfermedad. Una enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer, tal como cáncer de mama . Para detectar y/o identificar un biomarcador de un fisiológico, se puede exponer una muestra afectada por la condición fisiológica a un sustrato que comprende un material nanoporoso, analizar una fracción de la muestra retenida por el material nanoporoso y comparar un resultado del análisis, tales como espectros de masas, con un resultado de un análisis similar de una muestra control, es decir, una muestra no afectada por la condición fisiológica . El sustrato que comprende el material nanoporoso también puede usarse para recolección y/o almacenamiento de la muestra biológica. Por ejemplo, en alguna modalidad, un sustrato que comprende un material nanoporoso puede ser una parte de un equipo que también incluye cualquier herramienta aplicable para recolectar una muestra biológica. La muestra recolectada puede exponerse al material nanoporoso y entonces almacenarse para análisis o visualización subsecuente. En una modalidad, un sustrato que comprende el material nanoporoso puede ser una parte de un sistema analítico con base en un instrumento analítico específico.

En tal caso, el sustrato puede configurarse específicamente para intensificar una sensibilidad de los instrumentos analíticos para uno o más analitos, tales como biomoléculas de bajo peso molecular. Para tal aplicación, el sustrato puede tener una o más áreas que comprenden el material nanoporoso. Cada una de tales áreas se rodea por una región que es resistente a adsorber los analitos de interés. La región circundante de preferencia es una región no nanoporosa, es decir, no comprende un material nanoporoso. La región circundante puede pasivarse con grupos funcionales resistentes a adsorber los analitos de interés. En caso de péptidos y proteínas, el área circundante puede modificarse con grupos funcionales hidrofílieos , tales como polímeros que contienen PEG. En algunas modalidades, el sustrato puede enfocar o concentrar una muestra que se analizará hacia una o más áreas que comprenden el material nanoporoso. Tal enfoque o concentración puede reducir una cantidad de muestra expuesta al análisis, lo cual a su vez puede intensificar una sensibilidad a los analitos de interés. En algunas modalidades, un tamaño del área que comprende el material nanoporoso puede elaborarse de tal manera que coincida con un tamaño de un área activa de una fuente de ionización del instrumento analítico. Por ejemplo, cuando el instrumento analítico analiza un láser para ionización, el tamaño del área que comprende el material nanoporoso puede coincidir con un tamaño (un diámetro) de un haz del láser. Tal sustrato puede ser particularmente útil para instrumentos analíticos espectrométricos de masas usando rayos láser para ionización, tales como espectrómetro de masas de MALDI o espectrómetro de masas de SELDI. En algunas modalidades, un sustrato que comprende un material nanoporoso puede configurarse como una sonda para insertarse en un espectrómetro de masas tales como espectrómetro de masas de MALDI o espectrómetro de masas de SELDI . La invención además se ilustra, aunque de ninguna manera se limita, por los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Las citas en los corchetes en este ejemplo se refieren a la Lista de Referencias al final del Ejemplo 1. 1. Introducción. El análisis proteómico de plasma/suero humano para la detección temprana de cáncer, así como otras enfermedades, es un área creciente de interés para muchos grupos de investigación [1, 2 y referencias en ello] .

Incluso se enfoca más atención particularmente en las moléculas de bajo peso molecular unidas a proteínas portadoras que se considera generan y constituyen la mayor parte de los iones que comprenden perfiles distintivos de MS usados para el descubrimiento de biomarcadores [3-5]. El diseño y el desarrollo de partículas diseñadas para imitar la unión a proteínas portadoras (por ejemplo albúmina) y realizar la recolección de proteomas de bajo peso molecular (LMWP) , por lo tanto puede ser de alto impacto en el descubrimiento de biomarcadores [6-8]. El ProteinChip Array System de Ciphergen, con base en espectrometría de masas SELDI-TOF, puede ser la plataforma más extensamente usada para el descubrimiento de "firmas moleculares" [9, 10]. Entre los avances tecnológicos recientes en este campo, las metodologías emergentes promisorias incluyen: una nueva plataforma en peptidómica que acopla la extracción en fase sólida automatizada, basada en magnetismo, de péptidos pequeños con lecturas espectrométricas de masas de MALDI-TOF [11, 12], superficies modificadas por Desorción/Ionización en Silicio (DIOS) [13] y Desorción/Ionización en Nanoalambres de Silicio (SiN s) [14] . Para el descubrimiento de biomarcadores basado en proteómica, la nanotecnología puede ofrecer oportunidades y desafíos [15] . Para traducir un potencial de la nanotecnología a la proteómica, se ha estudiado una aplicación de sílice nanoporosa para tamizar proteínas plasmáticas con la meta de recolectar, de manera más efectiva y eficiente, LMWP del plasma. Se ha realizado un análisis de espectrometría de masas de ionización desorción por láser asistida por matriz—tiempo de vuelo (MALDI-TOF) de proteínas plasmáticas extraídas de dos superficies diferentes de sílice nanoporosa. Los espectros de masas obtenidos demuestran la capacidad de las partículas nano-dimensionadas de sílice de retener cientos de péptidos y proteínas de bajo peso molecular . 2. Materiales y Métodos. 2.1 Materiales e instrumentos. Los reactivos para síntesis en gel incluyeron solución de silicato de sodio (Sigma, St. Louis, MO, USA), sílice ahumada (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA ), polioxietilen ( 10 ) isononilfeniléter (NonfixlO, Condea, Houston, TX, USA ) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTABr, Aldrich, St. Louis, MO, USA) . El ácido a-ciano-4-hidroxicinnámico de matriz de MALDI (CHCA) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, USA). El combinado de inhibidores de proteasas (PIC: heparina de litio, EDTA, AEBSF, bestatina, E-64, leupeptina y aprotinina) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, USA) . La insulina de Páncreas Bovino se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, USA). Todas las muestras se analizaron con un espectrómetro de masas Applied Biosystems Voyager-DE™ STR (Framingham, MA, USA) usando luz de 337-nm de un láser de nitrógeno Los análisis se realizaron en modo lineal. 2.2 Procedimiento de síntesis. Las muestras de sílice A y B se obtuvieron de acuerdo con dos procedimientos distintos de síntesis descritos, por ejemplo, en [16, 17]. Brevemente, las muestras de sílice A y B se obtuvieron al iniciar a partir de geles con las siguientes composiciones molares: Sílice A Si02: 0.064NonfixlO: 0.6NaOH: 0.8HC1: 58H20; Sílice B: Si02: 0.2CTABr: 0.2NaOH: 0.04A1(OH)3: 40H2O. Para sílice A, 14.6 g de silicato de sodio se agregaron después de terminar la disolución de la solución de tensioactivo (2.9 g de Nonfix 10 y 4.05 g de NaOH en 57.4 g de H20) . Finalmente, se agregaron 5.33 g de 37 % en peso de HC1 y el gel se dejó madurar durante 24 h a temperatura ambiente, y entonces se calentó en horno durante 24 h a 100 °C. La sílice B se obtuvo al agregar 10 g de sílice ahumada a una solución que consiste de 0.52 g de Al(OH)3 y 1.35 g de NaOH en 130 g de H20. El gel se dejó madurar durante 2 h a temperatura ambiente y entonces se calentó en horno durante 24 h a 140 °C. El gel de síntesis se filtró, se lavó con agua desionizada y se secó a 80 °C durante 12 h. Las isotermas volumétricas de adsorción desorción de nitrógeno a -196.15 °C (77 K) se midieron en un aparato .icrometritics Asap 2010. Las muestras se hornearon a 300 °C en vacío durante la noche, y las muestras benciladas se trataron a 230 °C a la misma presión residual. El área de superficie de las muestras se obtuvo por linealización de Brunauer-Emmet y Teller (BET) en el intervalo de presiones 0.005 a 0.2p/P0 [16] . 2.3 Recolección de plasma. El plasma humano se obtuvo de acuerdo con los lineamientos sugeridos en [18]. Brevemente, se recolectó sangre en tubos de separación de plasma con heparina de litio de 8.0 mL (PST™ Vacutainer© 367965, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) precargados con 300 L de PIC y centrifugados a 2500 g durante 15 min a 4°C dentro de los 15 min de la extracción. Se hicieron alícuotas de la capa de plasma dentro de los 30 min de la centrifugación en volúmenes de 1.0 mL y se congelaron inmediatamente usando un baño de hielo seco/ alcohol. 2.4 Procedimiento experimental. Alícuotas (5 mg) de partículas de sílice se mezclaron con 500 µ?, de una muestra diluida de plasma humano (1:5) y se agitaron a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se centrifugó a 2000xg, durante dos minutos, entonces las partículas de sílice se separaron del sobrenadante y se lavaron con agua desionizada (4x100 pL) . Las proteínas plasmáticas retenidas en la superficie de la sílice se extrajeron como sigue: las partículas de sílice se suspendieron en 100 pL de una solución (4.95:4.95:0.1 agua / metanol / 0.1% de TFA) y se centrifugaron inmediatamente a 2000xg, durante cinco minutos. La solución del sobrenadante con proteínas extraídas se analizó por MALDI-TOF- S . 1 pL de sobrenadante se combinó con 4 pL de matriz CHCA, entonces 1 \i de la solución obtenida se colocó en la placa de MALDI y se secó al aire. 2.5 Experimentos de adición. Las muestras de plasma se adicionaron con insulina a cuatro concentraciones diferentes: 500 ng/mL, 200 ng/mL, 30 ng/mL y 15 ng/mL. Las muestras se expusieron después a sílice A como se describe en la sección 2.3. Finalmente 5 pL de proteínas extraídas del plasma se eluyeron en 3 pL de matriz CHCA, entonces 1 L de la solución obtenida se colocó en la placa de MALDI y se secó al aire. 3-4 Resultados y Discusión En este estudio, se estudió una capacidad de las partículas nanoporosas de sílice novedosas de capturar y enriquecer péptidos y proteínas de bajo peso molecular a partir de plasma humano. Se postula ahora que este archivo contiene un depósito desaprovechado para biomarcadores potenciales específicos de enfermedades [3-5]. Una forma eficiente de secuestrar y enriquecer rápidamente este archivo de información puede tener un impacto dramático sobre el descubrimiento de biomarcadores. La Figura 1 muestra una morfología de la sílice A y B. Una isoterma de adsorción-desorción de nitrógeno sugiere que el área de superficie de la sílice A es 406 m2/g y el volumen de poro es 0.3 cm3/g. El modelo de Barret-Joyner-Halenda (BJH) aplicado a la rama de desorción de las isotermas demuestra una bimodalidad del sistema poroso que indica una distribución de tamaño de poro centrada en 26,8 y 38 Á. Para sílice B, el área de superficie es 848m2/g y el volumen de poro es 1.21 cm3/g. La distribución de tamaño de poro de BJH se centra en 25 y 390 Á. Experimentos exploratorios se diseñaron con el fin de evaluar la capacidad de captura de sílice nanoporosa hacia proteínas plasmáticas y particularmente hacia proteínas de proteoma de bajo peso molecular. Se desarrolló un procedimiento rápido y fácil para la preconcentración de muestras antes del análisis basado en MS, lo cual permitió minimizar la degradación potencial de la muestra biológica. Comparados con una muestra sin tratar, los espectros de masas de muestras de plasma humano tratado con partículas de sílice, muestran un enriquecimiento claramente visible en las L WP, lo cual depende del sustrato particular de sílice nanoporosa usado, véase la Figura 2. Los espectros de MALDI-TOF de ambas muestras tratadas con sílice nanoporosa ponen al descubierto cientos de picos, especialmente en el intervalo de LM entre 800 y 5000 Daltones. Para cada lote de sílice, los experimentos se realizaron por triplicado para valorar la reproducibilidad del ensayo. Los datos indican que el método genera retratos espectrales globales reproducibles de señales de alta intensidad (véase la Figura 3 A-B-C y Figura 4 A-B-C) . Una alta calidad de los espectros puede ser un producto del procedimiento de limpieza. Lavar el sustrato de sílice (antes de la extracción de las proteínas capturadas) puede remover sales, contaminantes no volátiles e hidrofílicos que pueden provocar potencialmente una severa depresión de señales. Una capacidad de generar efectivamente un perfil reproducible de las moléculas retenidas por las partículas de sílice (Figuras 3 y 4), también puede surgir de una estabilidad química inherente de los sustratos de sílice [16,17]. La adición de las muestras de plasma con insulina (masa molecular 5733.5 Da) en diferente concentración se realizó para establecer un límite de detección (LOD) del método descrito aquí. Se detectó una señal de MALDI-TOF de la insulina en plasma humano con concentraciones tan bajas como 15 ng/mL (Figura 5) . La presente metodología, acoplada con la tecnología MALDI-TOF, es suficientemente sensible para detectar péptidos de plasma en el intervalo bajo de nanogramos por mililitro. Considerando que a la fecha la concentración más baja para un biomarcador, tal como Haptoglobina-subunidad , identificada por MS es 1000 nmol/L [22, 23], la presente metodología de enriquecimiento de plasma de LM P disminuyó el LOD de 400 veces a grandes rasgos . Con base en los perfiles de MS, cada uno de los dos sustratos de sílice con diferente tamaño de poro retiene un repertorio diferente de péptido/proteinas con la incubación con la misma muestra de plasma (véase la Figura 2). Aunque la presente invención no se limita por su teoría de operación, puede hipotetizarse que las diferencias observadas se apuntalan por la propiedad de superficie del sustrato y la propensión para la adsorción de las proteínas sobre la superficie hidrofílica a través de interacciones electrostáticas. La unión a LMWP puede mejorarse al hacer a la medida las propiedades de superficie del sustrato de sílice a través de modificaciones químicas y estructurales adicionales .

. Observaciones finales. Se demostró que las partículas nanoporosas de sílice pueden emplearse con éxito para actuar como una entidad tipo proteína portadora y enriquecer las moléculas de bajo peso molecular dentro de plasma/suero u otros fluidos biológicos. Los resultados demuestran una selectividad potencial de las moléculas y las propiedades discriminatorias moleculares de las partículas nanoporosas de sílice que se unen de manera selectiva a LMWP. Por lo tanto, estos sustratos novedosos acoplados con superficie de espectrometría de masas pueden proporcionar tanto un medio para secuenciar rápidamente el componente biomarcador en sí, así como una plataforma potencial para medicina predictiva basada en LMWP. 6. Lista de Referencias. Anderson, N. L., Mol. Cell. Proteomics 2005, Oct 2005; 4: 1441 - 1444. [2] Xiao, Z., Prieto D . , Conrads, T. P. , Veenstra, T . D . , Issaq, H. J., Mol. Cell. Endocrinol. 2005, 230, 95-106. [3] Liotta, L. A., Ferrari, M . , Petricoin, E . , Nature 2003, 425, 905. [4] Mehta, A . L, Ross, S., Lowenthal, M. , Fusaro et al., Dis. Markers 2003, 19, 1. [5] Tirumalai, R. S., Chan, K. C, Prieto, D. A . , Issaq, H . J. et al., Mol. Cell. Proteomics 2003, 2, 1096-1 103. [6] Geho, D. H . , Lahar, N . , Ferrari, . , Petricoin, E. F., Liotta, L. A. , Biomed. Microdevices 2004, 6, 231-239. [7] Desai, T., Hansford, D. , Kulinsky, L., Nashat, A . H. et al., Biomed. Microdevices 1999, 2, 11-40. [8] Desai, T., Hansford, D., Leoni, L., Essenpreis, M., Ferrari, M., Biosensors and Bioelectronics 2000, 15, 453-462. [9] Hutchens, T. . , Yip, T. T., Rapid Commun.

Mass. Spectrom. 1993, 7, 576-580. [10] Reddy G., Dalmasso, E. A., J. Biomed. Biotechnol. 2003, 4, 237-241. [11] Villanueva, J. , Philip, J. , Entenberg, D., Chaparro, C. A. et al., Anal. Chem. 2004, 76, 1560-1570.

[12] Villanueva, J. , Philip, J. , Chaparro, C. A., Li, Y. et al., J. Proteome Res. 2005, 4(4); 1060-1072. [13] Trauger, S. A., Go, E. P., Shen, Z., Apon, J. V. et al.5 Anal. Chem. 2004, 76, 4484- 4489 . [14] Go, E. P., Apon, J. V., Luo, G., Saghatelian, A. et al., Anal. Chem., 2005, 77, 1641- 1646. [15] Ferrari, M. , Nat . Rew. Cáncer 2005, 5, 161- 171. [16] Pasqua, L., Testa, F. , Aiello, R. , Nagy, J. B., Madeo, G., Phys . Chem. Chem. Phys 2003, 5, 640-645. [17] Pasqua, L., Testa, F. , Aiello, R. , Stud. Surf. Sci. Catal. 2003, 146, 497. [18] Hulmes, J. D. , Bethea,,D., Ho, K. , Huang, S. P. et al, Clinical Proteomics Journal, 2004, 1 , 17-31. [19] Diamandis E. P., J. Nati. Cáncer Inst. 2004; 96: 353-6. [20] Diamandis, E. P., Mol. Cell. Proteomics 2004, 3, 367-78. [21] Diamandis, E. P., Clin. Cáncer Res. 2005, 11, 963-965. [22] Koomen, J. M . , Shih, L. N . , Coombes, K. R. , Li, D. et al., Clin Cáncer Res. 2005, 11, 11 10-11 18. [23] Ye, B., Cramer, D. W., Skates, S. J., Gygi S. P. et al, Clin. Cáncer Res. 2003, 9, 2904- 2911. EJEMPLO 2 Fraccionamiento de Componentes del Suero Usando Sustratos Nanoporosos Numerosas moléculas previamente no caracterizadas que residen dentro de un proteoma circulatorio de bajo peso molecular pueden proporcionar una representación en curso de la patofisiologia en curso de un organismo. Recientemente, firmas proteómicas que comprenden moléculas de bajo peso molecular se han identificado usando espectrometría de masas combinada con algoritmos de bioinformática . Estas demostraciones han apuntado a una existencia de un archivo de información que puede contener una fuente rica de información diagnóstica. Los intentos para secuenciar e identificar las moléculas que apuntalan las huellas digitales están actualmente en marcha. Un hallazgo de que muchas de tales moléculas de bajo peso molecular pueden existir unidas a proteínas portadoras circulantes puede ofrecer una nueva oportunidad para técnicas de fraccionamiento y separación antes del análisis basado en espectrometría de masas. Los sustratos nanoporosos representan una nueva metodología para el fraccionamiento fácil y reproducible y la unión selectiva del material biomarcador de bajo peso molecular. El silicio nanoporoso recubierto con aminopropilo, cuando se expone al suero, puede agotar el suero de proteínas y rendir un suero con un perfil de MS alterado distinto. Adicionalmente, las cuentecillas nanoporosas de vidrio recubiertas con aminopropilo con tamaño de poro controlado son capaces de unirse a un subconjunto de proteínas séricas y liberarlas con una elución astringente. Las proteínas eluidas tienen distintos perfiles de MS, perfiles de electroforesis en gel e identidades de secuencia peptídica diferencial, lo cual varía con base en un tamaño de nanoporos. Dos biomarcadores potenciales para cáncer ovárico, transtiretina y apolipoproteína A-l, se secuestraron de manera diferencial con base en el tamaño de poro de las cuentecillas. El uso sistemático de esta estrategia novedosa de fraccionamiento sérico, cuando se acopla con análisis bioinformático, puede incrementar el acceso a una información diagnóstica, análoga al uso de los patólogos de un gran número de tinciones histoquímicas durante la evaluación de tejidos enfermos. Las superficies de material nanoporoso pueden emplearse en una recolección y conservación de moléculas lábiles y unidas a proteínas portadoras en la sangre. Más aún, el conocimiento ganado de tales estudios con sustratos nanoporosos puede contribuir a usar agentes infundibles de nano-recolección que pueden monitorear una circulación para firmas relacionadas con enfermedades en fase temprana.

Introducción En su centro, la patología es una especialidad médica construida sobre la observación sistemática cuidadosa de signos de enfermedad, descubiertos a través de meticulosas comparaciones de las variantes de tejido normal y enfermo. El estado ancestral de la técnica del diagnóstico patológico, conocido por cada estudiante médico, fue un reconocimiento con el examen físico de los cuatro signos cardinales de la patología de los tejidos subyacentes: tumor, dolor, calor y rubor. Asimismo, el examen inicial de los tejidos puede ser con la observación visual y táctil. Sin embargo, este es sólo un inicio de una valoración moderna de tejidos para una evaluación patológica completa. Dado que una introducción de un microscopio y métodos de laboratorio dio a luz a la práctica de la patología médica moderna, el avance tecnológico ha revelado vistas cada vez más sensibles e intuitivas de los procesos de enfermedad. A través de pruebas modernas de laboratorio clínico y procesamiento de tejidos, una vasta variedad de pruebas dota a un patólogo contemporáneo de herramientas para proporcionar diagnósticos significativos para médicos que lo han consultado. Con todas estas pruebas, una capacidad de apreciar e interpretar signos y patrones de signos está en el centro de la destreza del patólogo. Una correlación de ciertos patrones histológicos, tales como una asimilación diferencial de hematoxilina y eosina (H&E) de un tejido dado, con estados de enfermedad y consecuencias pronosticadas poco particulares es un proceso que evoluciona continuamente que subyace una consulta patológica. Pueden considerarse métodos histoquimicos en tejidos como métodos de fraccionamiento de tejidos para diferentes tintes, anticuerpos, sondas, etc. Sin embargo, los métodos histoquimicos en tejidos sólo ponen al descubierto subcomponentes selectivos de los tejidos, que permite a otros subcomponentes escapar a la detección. Siguiendo una rica tradición de la integración constante a la patología de nuevas tecnologías en su práctica, la patología moderna está evaluando una aplicabilidad de plataformas de prueba novedosas en el diagnóstico basado en pacientes. Para una, nuevos instrumentos de espectrometría de masas de más sensibles se usan para minar el fluido corporal y muestras de tejido del paciente para firmas potenciales de diagnóstico (Rosenblatt et al., 2004, véase la lista de referencias al final del Ejemplo 2) . Tales esfuerzos son parte de una nueva disciplina, es decir proteómica de tejidos, en donde las mediciones de una combinación variada de moléculas dentro de los tejidos del paciente se generan y correlacionan con estados de enfermedad y consecuencias. A causa de un incremento potencial en especificidad y sensibilidad usando una metodología de marcadores de combinación, puede ser posible detectar y atrapar una enfermedad letal temprano, antes de se manifieste en sí como un tumor, dolor, calor o rubor. Los métodos de obtención de huellas digitales proteómicas que utilizan espectrometría de masas acoplada a análisis de bioinformática, han dado pistas acerca de una existencia de contenido potencial de información diagnóstica dentro del intervalo de bajo peso molecular del proteoma de sangre y tejido (Chaurand y Caprioli, 2002; Hingorani et al., 2003; Paweletz et al., 2000; Petricoin et al., 2002a; Petricoin et al., 2002b; Schwartz et al., 2004; Stoeckli et al., 2001; Yanagisawa et al., 2003). Ahora que tal archivo de información se ha implicado por estos estudios, los esfuerzos están en marcha a secuenciar y caracterizar componentes subyacentes de huellas digitales relacionadas con enfermedades. Las moléculas que coalescen para formar un retrato diagnóstico pueden ser diversas proteínas pequeñas, y fragmentos de proteínas, arrojadas por numerosos tejidos en un fluido intersticial con un equilibrio establecido con un compartimiento intravascular . Una síntesis y degradación constante de proteínas por las células dentro de un cuerpo puede reflejar un estado global de salud. El proteoma expresado dentro de un huésped puede representar una interacción compleja entre todas las células (células normal y enfermas) y, de esta manera, los fluidos corporales, tal como suero, pueden ser una fuente rica de información para un descubrimiento de biomarcadores de enfermedad y un desarrollo de pruebas diagnósticas. Trabajo reciente indica que las moléculas de bajo peso molecular que llevan huellas digitales de enfermedad se unen a moléculas portadoras más grandes (Mehta et al., 2003). De esta manera, un aislamiento de tales moléculas de bajo peso molecular asi como de las proteínas portadoras residentes que las albergan y las protegen de una depuración renal es un objeto en la proteómica de tejidos basada en MS para el descubrimiento y secuenciación de nuevos biomarcadores. Un análisis más comprensivo y expansivo del proteoma de bajo peso molecular unido a proteínas portadoras puede requerir un desarrollo de métodos novedosos de fraccionamiento, lo cual puede poner al descubierto información diagnóstica potencialmente útil no disponible usando las modalidades actuales. La fabricación de superficies de material nanoporoso puede ser una estrategia para analizar metódicamente los diversos subconjuntos de proteínas y fragmentos de proteínas presentes dentro de la circulación. Los materiales nanoporosos tienen una capacidad de modificarse y manipularse funcionalmente a través de una derivación química específica de tal manera que pueda suceder la unión y fraccionamiento selectivo y de costumbre. Más aún, la nanoporosidad incrementa dramáticamente un área de superficie de tal manera que un fraccionamiento y unión selectiva puedan presentarse con una eficiencia y velocidad potencialmente más altas. Los métodos y materiales de fraccionamiento selectivo pueden contribuir a un campo de proteómica de tejidos en una forma semejante a las innovaciones hechas por los químicos clínicos en crear arsenales de reactivos fijadores e histoquímicos de tejidos usados diariamente por los laboratorios de patología alrededor del mundo. En este Ejemplo, se demuestra el uso de superficies de material nanoporoso como una herramienta de fraccionamiento para análisis basado en suero y descubrimiento de biomarcadores . En un experimento, una oblea nanoporosa de silicio se usa para agotar de manera selectiva el suero de proteínas de alta abundancia. Otro método usa cuentecillas nanoporosas de vidrio de poro controlado para recolectar distintos perfiles proteómicos del suero para su elución y evaluación subsecuente.

Material y Métodos. Muestras de suero.

La muestra de suero es una combinación única de donadores normales que se almacenó a -80 grados C.

Químicos . Químicos: acetonitrilo (ACN) (grado HPLC) , bicarbonato de amonio (NH4HC03) , yodoacetamida (97%), metanol (99+%) y ditiotreitol (DTT) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, O) . Ácido fórmico (88%), ácido acético (glacial) adquiridos de Mallinckrodt Baker ( Phillipsburg, NJ) . El H20 se destiló por duplicado en forma interna con el Kontes High Purity Water System. La tripsina porcina modificada de grado de secuenciación se adquirió de Promega (Madison, WI). Otros materiales: Albúmina sérica bovina adquirida de Sigma-Aldrich Co, St . Louis, MO . Tinción de geles de proteínas SYPRO® Ruby adquirida de Molecular Probes-Eugene , OR. Geles ID pre-vaciados de 4-12% de Bis-tris, muestra de LDS y amortiguadores de operación, antioxidante y escalera de proteínas preteñidas Benchmark se adquirieron de Invitrogen Co. La sílice fusionada es de Polymicro Technologies Phoenix, AZ .

Fabricación de obleas nanoporosas de silicio. Obleas de silicio orientadas (100) mezcladas con boro, de Silicon Quest, Inc. con resistividad < 0.005ohm-cm se usaron como sustratos. Las obleas se limpiaron en una solución piraña (H2SO4 : H20=1 : 1 ) a 120° durante 30 minutos, seguido por remoción de óxido en HF:H2O=l:10 y enjuague en agua desionizada. Las superficies porosas de silicio se prepararon por grabado electroquímico en una celda de Teflón de elaboración casera. Las obleas se asentaron en la base de la celda de Teflón con papel aluminio (0.1 mm de espesor) debajo para proporcionar un contacto eléctrico. Una malla de platino se colocó en la cavidad de la celda como un contra electrodo. Un electrolito fue una mezcla 1:1 en volumen de 49% de HF y etanol . Una densidad de corriente constante de 72 mA/cm2 se aplicó durante 65 sec. Inmediatamente después de la formación de silicio poroso, la muestra se enjuagó en agua desionizada y se colocó bajo vacío para remover la humedad. El silicio poroso se trató con silano en 10% de APTES (aminopropiltrietoxisilano) en tolueno. Para remover burbujas de aire de los nanoporos, el silicio poroso se colocó bajo vacío durante 3 minutos. La solución de reacción se sometió a reflujo durante 3 horas a una temperatura ambiente en una caja sellada. El silicio poroso se enjuagó varias veces con tolueno, acetona y se secó en flujo de N2. El modelo de Barret-Joyner-Halenda (BJH) aplicado a la rama de desorción de nitrógeno de las isotermas indicó una distribución de tamaño de poro centrada en 2-20nm.

Agotamiento parcial de suero usando una oblea nanoporosa de silicio . Las obleas nanoporosas de silicio recubiertas con aminopropilo se colocaron en tubos de 1.5 mi y se lavaron 4 veces en agua desionizada. 500 µ? de muestras combinadas de suero, diluidas 1:5 en agua desionizada, se aplicaron entonces a las obleas y las mezclas se incubaron a una temperatura ambiente durante 1.5 hr . Después de la incubación, los sobrenadantes de suero diluido se removieron y almacenaron para análisis de S posterior a — 80 grados C. Para controles, se congelaron también muestras diluidas de suero. Como control adicional, las obleas también se incubaron con agua desionizada en lugar de suero diluido .

Recolección proteómica usando cuentecillas nanoporosas de vidrio de poro controlado. Las cuentecillas de vidrio de poro controlado recubiertas de aminopropilo, con tamaños de poro de 70 nm o 17 nm, se adquirieron de Sigma, St . Louis, MO . Los datos de isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno indican que un área de superficie para cuentecillas de 17nm es 30.8 m2/g y un volumen de poro es 0.032 cm3/g. Para cuentecillas de 70nm, un área de superficie es 130.5m2/g y un volumen de poro es 0.93 cm3/g.

Para cada experimento, 10 mg de cuentecillas se midieron en tubos de 1.5 mi. Las cuentecillas se lavaron 4 veces en un agua desionizada. El suero combinado, diluido 1:5 en un agua desionizada, se aplicó entonces a las muestras de cuentecillas y las mezclas se incubaron a una temperatura ambiente durante 1.5 hr. Después de la incubación, los sobrenadantes de suero diluido se removieron y guardaron. Las cuentecillas se lavaron entonces dos veces usando 1 mi de agua desionizada. Después del lavado, 500 µ? de amortiguador de elución (5 mi de acetonitrilo, 5 mi de agua, 10 µ? de ácido trifluoroacético) se aplicó a las muestras, las cuales entonces se giraron durante ½ hr a una temperatura ambiente. El eluante entonces se recolectó y almacenó para análisis de MS posterior a — 80 grados C.

Espectrometría de masas. Los perfiles espectrales generados por espectrometría de masas de baja resolución se usaron como una lectura sin desvío generalizada para valorar el rendimiento del fraccionamiento. Los chips de intercambio catiónico débil de Ionización Desorción por Láser Aumentada en Superficie (SELDI) se procesaron usando un bioprocesador Biomek 2000 ( CX2 ProteinChip®, Ciphergen Biosystems, Inc.) . 100 µ? de 10 mM de HC1 se aplicaron al chip seguido por una incubación de 5 minutos. El HC1 se removió entonces mediante aspiración y se siguió por una incubación de 1 minuto con 100 µ? de agua. El agua se aspiró y se aplicó agua fresca durante un minuto adicional. Esto se siguió por una adición de 100 µ? de lOmM de acetato de amonio con 0.1% de Tritón X, aplicado al chip durante una incubación de 5 minutos. La mezcla de acetato de amonio entonces se aspiró y descartó seguida por otra aplicación de la mezcla de acetato de amonio durante una incubación adicional de 5 minutos. Después de estas etapas preparativas, los chips se secaron usando vacio. 5 µ? de una muestra, tal como suero, se aplicaron entonces a los puntos del chip y se incubaron durante 55 minutos. Los chips se lavaron 3 veces con 150 µ? de solución salina amortiguada de fosfatos seguida por 150 µ? de agua. Los chips entonces se secaron al vacio y 1.0 µ? de una solución al 30% de ácido cinnaminico en 50% (v/v) de acetonitrilo, 0.5% de ácido trifluoroacético se aplicó a cada punto de proteina, dos veces con secado entre las aplicaciones. Los chips entonces se examinaron usando un espectrómetro de masas PBS-II (Ciphergen Biosystems, Inc.). Un espectro para cada punto se recolectó usando los siguientes ajustes: el voltaje del detector fue 1,800 V; la masa focal fue 6,000 Da; el limite de masa superior fue 20,000 Da; la ganancia de sensibilidad se ajustó a 5; la intensidad del láser fue 145; 15 disparos de láser se tomaron por posición; el número de posiciones varió de 20 a 80 incrementando cada 5 posiciones. Se creó un protocolo para procesar todas las muestras en forma idéntica.

Estudios de Secuenciación de Proteínas. Ensayo de Proteínas: Muestras fraccionadas de cuentecillas de cuentecillas de poro de 17 nm y 70 nm se examinaron por un ensayo tradicional de Bradford usando un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) que varía de 200 pg/mL a 1 mg/mL monitoreado a 595 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Spectramax® Plus 384, Molecular Devices) . Separación en gel de ID y digestión: 15 g de cada muestra fraccionada por cuentecillas y 3 L de suero sin purificar se diluyeron en 30 pL de amortiguador de muestra LDS y se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. Las fracciones se corrieron en un gel de ID pre-vaciado (4-12% de Bis-tris) para aislar regiones deseadas de peso molecular de la mezcla compleja de proteínas. El gel se lavó completamente con ddH20, se fijó en una solución de 50% metanol/ 10 % ácido acético durante 30 minutos, se tiñó con tinción rubí Sypro® durante la noche, y se destiñó en ddH20 durante 3 horas antes de excitación con UV y visuali zación . El gel se rebanó en regiones de gel de 1 mm2 y las bandas del gel se destiñeron en 50% de metanol. Las bandas del gel se redujeron y alquilaron con 10 mM de ditiotreitol (DTT) y 55 mM de yodoacetamida, se incubaron a 4°C durante 1 hora en tripsina (20 ng/ iL) y se dejaron digerir durante la noche (16 horas) a 37°C en 25 mM de NH4HC03. La mañana siguiente, las proteínas se extrajeron del gel con incubaciones repetidas de solución de 70% de ACN/ 5% de ácido fórmico. Análisis µ?,0/?3/ 3: Las muestras se liofilizaron casi a sequedad y se reconstituyeron en 6.5 µL de amortiguador de HPLC A (95% de H20, 5% de ACN, 0.1% de FA) para análisis de espec. de masas. El análisis de LC/MS/MS de fase inversa microcapilar se realizó con el sistema de cromatografía líquida LC Packings de Dionex acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa de iones ThermoFinnigan LCQ Classic (San José, CA) con una fuente modificada de nanoaspersión . Las separaciones en fase inversa se realizaron con una columna capilar empacada en suspensión de uso interno. La columna unida a sílice de 18 átomos de carbono es de 75 pm de d.i., 360 µta de d.e., 10 cm de longitud, sílice fusionada empacada con cuentecillas de 5 pm con poros de 300 Angstroms (Vydac, Hesperia, CA) . Una µ-precolumna PepMap, 5 mm, cartucho de 18 átomos de carbono (Dionex) actúa como una columna de desalado. La muestra se inyecta en modo de captación µL y se lava con Tampón A durante cinco minutos antes de una elución lineal de gradientes con Tampón B (95% de ACN/ 5% de H20/ 0.1% de ácido fórmico) hasta 85% durante 95 minutos a una tasa de flujo de 200 nL/ minuto. Exploraciones de MS completas se siguen por cuatro exploraciones de MS/MS de los iones peptidicos más abundantes (en un modo dependiente de datos) y la disociación inducida por colisión (CID) se realiza en una energía de colisión de 38% con el voltaje de aspersión de iones ajustado a 2.00 kV, voltaje capilar y temperatura a 22.80 V y 180°C, respectivamente. Análisis de datos: El análisis de datos se realizó al buscar espectros de MS/MS contra el Instituto Europeo de Bioinformática del conjunto de proteomas no redundantes de las entradas de Swiss-Prot, TrEMBL y Ensembl a través del Sequest Bioworks Browser (ThermoFinnigan) . Los péptidos se consideraron aciertos legítimos después de filtrar los puntajes de correlación (Tabla 1) y la inspección manual de los datos de MS/MS. Los criterios usados para filtrar datos son por lo menos tan astringentes como la mayor parte de las citas de la literatura.

Tabla 1 Carga corr DeltaCN Iones +1 >1.9 >0.1 >50% +2 >2.5 >0.1 >50% +3 >3.5 >0.1 >50% Los aciertos aceptados de péptidos se requieren para tener una categoría de XCOrr = 1 con respecto a todos los otros péptidos en la base de datos.

Resultados . Agotamiento de Suero Usando Silicio Nanoporoso. Una estrategia para fraccionar suero es agotar el suero de una porción de su contenido de proteína, seguido por análisis de las especies de proteínas restantes, véase la Figura 6. Con el fin de probar esta metodología, se produjo un sustrato nanoporoso de silicio. Obleas nanoporosas de silicio que poseen una superficie asimétrica se incubaron con muestras de suero combinado. Después de una incubación de 1.5 hr, las obleas se removieron y las proteínas restantes dentro del suero se sometieron a evaluación de MS, véase la Figura 7. Una emergencia de un nuevo patrón de picos de iones de la espectrometría de masas de ionización desorción por láser aumentada en superficie (SELDI) resultó de la técnica de fraccionamiento. Los espectros completos parecieron dramáticamente diferentes comparados con suero solo sin fraccionar. En el caso del experimento de agotamiento, dos picos dentro de los espectros de MS cambiaron marcadamente. Un pico en 8122 m/z se intensificó de manera significativa en la muestra agotada, cuando se comparó con la muestra de suero nativo, es decir, muestra de suero sin fraccionar. Por otro lado, el pico de 8927 m/z disminuyó marcadamente dentro de la muestra agotada, cuando se comparó con su predominio en suero nativo. De esta manera, la incubación seguida por la remoción de las partículas nanoporosas alteró las cualidades espectrales del suero, intensificando el perfil de un pico previamente secundario en el área dominante de intensidad.

Recolección Molecular Usando Vidrio Nanoporoso de Poro Controlado . Como alternativa a medir suero agotado para firmas proteómicas, se desarrolló una estrategia de recolección de cuentecillas para aislar especies moleculares para elución y perfilado subsecuente, véase la figura 8. Cuentecillas de vidrio recubiertas con aminopropilo con distintos tamaños de poro (17 nm versus 70 nm) se incubaron con suero para aislamiento y liberación molecular selectiva. Después de la incubación con suero, las cuentecillas se lavaron suavemente con agua y entonces las moléculas unidas se eluyeron usando una solución áspera. Las especies eluidas se analizaron entonces mediante SELDI MS y se compararon con espectros de suero sin fraccionar, véase la figura 9. La inspección visual del eluato de cuentecillas de 17 nm puso al descubierto un retrato espectral único de MS cuando se comparó con suero sin procesar. Nuevamente, la inspección visual fue suficiente para detectar una marcada diferencia en el m/z de 7762 cuando se compara la muestra recolectada y el suero nativo (sin procesar) . Mientras el pico de 8927 m/z domina el panorama espectral en el suero normal, es el pico de 7762 m/z el que asume el papel dominante en el subconjunto recolectado . Con el fin de valorar un efecto que el tamaño del nanoporo jugó en la generación de firmas espectrales únicas, una cuentecilla de vidrio de poro controlado de tamaño de poro de 70 nm se usó en un experimento idéntico. Notablemente, un espectro de SELDI MS marcadamente diferente resultó usando cuentecillas de vidrio de poro controlado de poro más grande, véase la figura 10. En 6629 m/z, un nuevo pico principal dominó el patrón espectral eluido de las cuentecillas. El pico de suero normal en el mismo m/z apenas fue discernible. En contraste, el pico en 8927 en el suero normal asumió un status secundario dentro del conjunto de proteínas eluidas de las cuentecillas de poro más grande. Para caracterizar además los componentes moleculares eluidos ya sea de las cuentecillas de tamaño de poro de 17 nm o cuentecillas de tamaño de poro de 70 nm, 15 pg de proteina de cada muestra se corrieron en un gel de SDS-PAGE de 4-12% de Bis-Tris seguido por tinción con Sypro® Ruby Red, véase la figura 11. A lo largo del espectro de peso molecular, diferencias distintivas se observaron entre los eluatos de los dos tipos de cuentecillas . Este hallazgo fue consistente con las marcadas diferencias observadas en el análisis basado en SELDI . El análisis del contenido molecular de los eluantes mediante electroforesis de una dimensión proporcionó la confirmación adicional de que las cuentecillas fraccionaron de manera diferencial el contenido molecular del suero. Con el fin de caracterizar además las diferencias entre los eluantes de las cuentecillas de tamaño de poro de 17 nm y las cuentecillas de tamaño de poro de 70 nm, las bandas de un gel de SDS-PAGE se escindieron y el contenido de proteina de los cortes de gel se digirieron usando tripsina. Los fragmentos de péptidos resultantes se analizaron usando espectrometría de masas de ionización por electroaspersion. Después del cuestionamiento de los datos espectrales, las identidades de los péptidos se asignaron el contenido proteómico del gel, véase la tabla 8. Veinticinco especies de péptidos se identificaron dentro del eluante de las cuentecillas de tamaño de poro de 70 nm, mientras trece especies de péptidos se identificaron dentro del eluante de las cuentecillas de tamaño de poro de 17 nm. Mientras hubo algún traslape de las especies de péptidos identificadas (seis péptidos compartidos), se observaron diferencias, indicando que había ocurrido un fraccionamiento significativo. De esta manera, tres análisis distintos indican que las cuentecillas de vidrio con diferentes tamaños de poro ofrecen un medio para fraccionar componentes del suero.

Discusión . El perfilado proteómico usando espectrometría de masas acoplada con metodologías que minan datos de bioinformática , ha puesto al descubierto un archivo de información complejo y excitante, contenido dentro del intervalo de bajo peso molecular del proteoma circulatorio, el cual puede contener información diagnóstica importante. Las superficies de material nanoporoso, tal como una oblea de silicio y cuentecillas de vidrio de un poro controlado, proporcionan un medio estratégico y nuevo para fraccionar y manipular la información biológica de bajo peso molecular contenida dentro de fluidos corporales tal como suero. Una evaluación sistemática de superficies de material nanoporoso que combina análisis de MS con cuestionamiento bioinformático puede poner al descubierto ciertos esquemas de fraccionamiento con propiedades intensificadas de detección de enfermedades, identificar un conjunto extenso de moléculas para desarrollar y proporcionar un medio más fácil y robusto para purificación, fraccionamiento y secuenciación de péptidos/proteinas de las moléculas por si mismas . Para ese fin, en este fraccionamiento de estudio de suero usando superficies de material con nanoporos, puede resultar en perfiles espectrales significativamente alterados, perfiles electroforáticos 1-D alterados e identidades diferenciales de secuencia. Cada uno de estos parámetros sugiere que un fraccionamiento único, significativo, ha ocurrido usando ya sea las cuentecillas con tamaño de poro de 17 nm o las cuentecillas con tamaño de poro de 70 nm. Mientras seis de las especies de péptidos identificadas por ESI MS se recolectaron usando cualquiera de los tipos de cuentecillas, hubo péptidos distintos que sólo se aislaron usando sólo un tipo de las cuentecillas. Los péptidos secuenciados incluyeron proteínas plasmáticas altamente abundantes así como especies de menor abundancia. Por ejemplo, en las cuentecillas con tamaño de poro de 70 nm, se aisló la proteína llamada mediador del homólogo de la subunidad de transcripción 8 de ARN polimerasa II. En la fracción de cuentecillas con tamaño de poro de 17 nm, se recolectaron histona 4 y autoantígeno de golgi . La presencia de estas especies moleculares no consideradas tradicionalmente como proteínas séricas, puede soportar una hipótesis de que los fragmentos de proteínas de organismos se mueven hacia el suero y proporcionan un retrato potencial del estado global del organismo. Una proteina aislada usando las cuentecillas de tamaño de poro de 70 nm, apolipoproteina A-1, se ha reportado recientemente como un marcador potencial para cáncer ovárico (Zhang et al., 2004). Además, la transtiretina, también reportada como un marcador potencial de cáncer ovárico en el estudio apenas mencionado, se recolectó usando las cuentecillas de tamaño de poro de 17 nm. El uso de técnicas especiales para intensificar la recuperación de información de biomarcadores de la sangre puede ser similar al uso de estudios histoquimicos especiales en diagnóstico de patología anatómica. La patología anatómica es una semiología, cuyos discriminadores se generan por análisis de diferencias entre especímenes de tejido enfermo y normal. Los indicadores de enfermedad se descubren después de laboriosas comparaciones visuales de secciones de tejido teñido de manera rutinaria, y después de la aplicación de técnicas histoquímicas novedosas. La última metodología para el minado investigativo de información en patología/tejido ha sido ocasionalmente tan fructífera como para incitar la reclasificación recursiva de muchas enfermedades y padecimientos; por consiguiente, el diagnóstico de muchas condiciones patológicas ha venido a depender de información esencialmente puesta al descubierto después de estudios histoquimicos especiales, véase la Figura 12. Mientras el análisis especializado de tejidos más allá de estudios de rutina, tal como una laminilla de H&E, no incrementa el contenido de información del tejido, puede incrementar de manera significativa la información recuperable, lo que conduce a refinamientos novedosos en la clasificación y pronóstico de enfermedades asi como proporciona pistas adicionales para los orígenes y biología básica de la enfermedad. El suero y proteoma circulatorio pueden ser una mezcla de moléculas de alta y baja abundancia, con la mayor parte de los biomarcadores que llevan información diagnóstica importante pudiendo residir en la región inferior de abundancia del intervalo de concentraciones. Un desafío para la proteómica clínica es desarrollar herramientas para identificar rápidamente estas moléculas de baja abundancia en muestras biológicas complejas. Una metodología es desarrollar flujo a través de superficies o arquitecturas de agotamiento para un fraccionamiento rápido, robusto y fácil y purificación selectiva. Los materiales nanoporosos sensibles a la fisicomodificación, por lo cual distintos tamaños de poro y características de carga pueden agregarse a la superficie porosa. Estas propiedades discriminatorias pueden permitir la puesta a punto del fraccionamiento de proteínas dentro del suero. Adicionalmente , proteínas de afinidad pueden agregarse a la superficie del material con el fin de refinar además las propiedades de fraccionamiento del sustrato. Los experimentos anteriores indican que el fraccionamiento de suero usando superficies de material con nanoporos puede resultar en perfiles espectrales alterados de manera significativa, lo cual indica un efecto de la metodología de fraccionamiento. Un uso para los materiales nanoporosos puede ser un dispositivo de recolección para muestras de suero. A causa de las moléculas lábiles en el suero se vuelven cada vez más interesantes como biomarcadores , pueden iniciarse procedimientos estandarizados de recolección. Los sustratos nanoporosos pueden ofrecer un medio para secuestrar pequeñas moléculas lábiles en un formato fácilmente adaptable a los procedimientos de recolección de suero. En este tipo de aplicación, el sustrato nanoporoso especializado puede llegar a ser semejante a fijadores especializados de tejido, los cuales se eligen en casos selectos para preservar las propiedades específicas del tejido para análisis y/o visualización subsecuente. Puesto que el silicio puede amoldarse en partículas microdimensionadas, los sustratos nanoporosos pueden desarrollarse en un intervalo de tamaños de las células sanguíneas. Tales partículas pueden diseñarse con un intervalo de tamaños de poro y otras propiedades fisicoquímicas para fraccionamiento de proteínas séricas abundantes y la carga de bajo peso molecular que llevan. Como una característica agregada, las partículas microdimensionadas pueden codificarse con una etiqueta discriminante, tales como etiquetas metálicas o puntos cuánticos. Tal estrategia puede permitir que la sangre se recolecte y las partículas aisladas de las células sanguíneas a través de una clasificación o proceso de enriquecimiento, similar al proceso descrito en Bruchez et al., 1998; Han et al., 2001; Nicewarner-Pena et al., 2001. El presente estudio demuestra una factibilidad de separación y fraccionamiento, basados en nanoporos, de moléculas de bajo peso molecular como un medio para fraccionar, purificar y analizar de manera selectiva el proteoma circulatorio. REFERENCIAS Bruchez, ., Jr . , Moronne, M. , Gin, P., Weiss, S., y Alivisatos, A. P. (1998). Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science 281, 2013-2016. Chaurand, P., y Caprioli, R. M . (2002). Direct profiling and imaging of peptides and proteins from mammalian cells and tissue sections by mass spectrometry . Electrophoresis 23, 3125-3135.

Geho, D. H., Lahar, N., Ferrari, M., Petricoin, E. F. , y Liotta, L. A . (2004) . Opportunities for nanotechnology-based innovation in tissue proteomics. Biomed Microdevices 6, 231-239. Han, M . , Gao, X., Su, J., y Nie, S. (2001).

Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomoleculs. Nature Biotechnology 19, 631-635. Hingorani, S. R. , Petricoin, E. F., Maitra, A. , Rajapakse, V., King, C, Jacobetz, M. A. , Ross, S., Conrads, T. P., Veenstra, T. D . , Hitt, B. A. , et al. (2003). Preinvasive and invasive ductal pancreatic cáncer and its early detection in the mouse. Cáncer Cell 4, 437-450. Howorka, S., Cheley, S., y Bayley, H. (2001). Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores. Nat Biotechnol 19, 636-639. Liotta, L. A., Ferrari, M., y Petricoin, E. (2003). Clinical proteomics: written in blood. Nature 425, 905. ehta, A . I., Ross, S., Lowenthal, M . , Fusaro, V. A. , Fishman, D. A. , Petricoin, E . , y Liotta, L. (2003). Biomarker amplification by serum carrier protein binding. Disease Markers 19, 1-10. Meller, A. , Nivon, L., Brandin, E., Golovchenko, J. , y Branton, D. (2000). Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules. Proc Nati Acad Sci U S A 97, 1079-1084. Nicewarner-Pena, S. R. , Freeman, R. G., Reiss, B. D . , He, L . , Pena, D. J. , Walton, I. D. , Cromer, R. , Keating, C. D . , y Natán, . J. (2001). Submicrometer metallic barcodes. Science 294, 137-141. Paweletz, C. P., Gillespie, J. . , Ornstein, D. K. , y al., e. (2000) . Rapid protein display profiling of cáncer progression directly from human tissue using a protein biochip. Drug Develop Res 49, 34-42. Petricoin, E. F. , 3rd, Ornstein, D. K., Paweletz, C. P., Ardekani, A., Hackett, P. S., Hitt, B. A., Velassco, A. , Trueco, C, Wiegand, L., Wood, K. , et al. (2002a). Serum proteomic patterns for detection of prostate cáncer. J Nati Cáncer Inst 94, 1576-1578. Petricoin, E. F. , Ardekani, A. ' M . , Hitt, B. A., Levine, P. J. , Fusaro, V. A., Steinberg, S. M. , Mills, G.

B. , Simone, C, Fishman, D. A., Kohn, E. C, y Liotta, L. A. (2002b) . Use of proteomic patterns in serum to identify ovarían cáncer. Lancet 359, 572-577. Rosenblatt, K. P., Bryant-Greenwood, P., Killian, J. K., Menta, A., Geho, D. , Espina, V., Petricoin, E. F. , 3rd, y Liotta, L. A. (2004). Serum proteomics in cáncer diagnosis and management. Annu Rev Med 55, 97-112. Schwartz, S. A., Weil, R. J. , Johnson, M. D. , Toms, S. A., y Caprioli, R. M. (2004). Protein profiling in brain tumors vising mass spectrometry : feasibility of a new technique for the analysis of protein expression. Clin Cáncer Res 10, 981-987. Stoeckli, M., Chaurand, P., Hallahan, D. E . , y Caprioli, R. . (2001). Imaging mass spectrometry: a new technology for the analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat ed 7, 493-496. ang, H., y Branton, D. (2001). Nanopores with a spark for single-molecule detection. Nat Biotechnol 19, 622-623. Yanagisawa, K., Shyr, Y., Xu, B. J. , assion, P. P., Larsen, P. H., White, B. C, Roberts, J. R. , Edgerton, . , González, A., Nadaf, S., et al. (2003) . Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cáncer. Lancet 362, 433-439. Zhang, Z., Bast, R. C, Jr . , Yu5 Y., Li, J. , Sokoll, L. J., Rai, A. J., Rosenzweig, J. M. , Cameron, B., Wang, Y. Y., Meng, X. Y., et al. (2004). Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarían cáncer. Cáncer Res 64, 5882-5890.

EJEMPLO 3 Las citas en superíndices en este ejemplo se refieren a la Lista de Referencias al final del Ejemplo 3. RESUMEN La región de bajo peso molecular del proteoma de suero/plasma (LMWP) está ganando interés como una fuente potencial de marcadores de diagnóstico para las enfermedades 1_3. El perfilado de proteínas séricas de LMW por espectrometría de masas (MS) ha dependido generalmente de desorción/ionización por láser de superficie aumentada-tiempo de vuelo (SELDI-TOF) 5, lo cual implica el perfilado de MS de los analitos previamente adsorbidos en superficies específicas de chips 6'9. La interferencia de proteínas abundantes, de alto peso molecular, presentes en los biofluidos, no obstante, puede limitar la sensibilidad y podría influenciar la reproducibilidad del análisis 10. Mejorar la selectividad del perfilado basado en MS, al usar dispositivos que permiten el entrampe específico de polipéptidos de LMW antes del análisis de MS, puede minimizar tal interferencia. En este reporte, se usaron superficies nanoporosas para capturar de manera selectiva péptidos de LMW (< 15,000 Da) a partir de plasma humano. Se realizó análisis de espectrometría de masas (MS) de péptidos recolectados usando ionización/desorción por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) como un medio para detectar y valorar las moléculas unidas. Debido a la selectividad intensificada del análisis, se logró una detección de péptidos pequeños (<4,000 Da) en plasma humano a niveles de concentración de ng/mL.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La meta de este trabajo fue desarrollar una metodología para aislar péptidos de L W contenidos en fluidos corporales con base en un principio de exclusión de tamaños. Para lograr este fin, se usaron superficies nanoporosas que tienen la porosidad correcta para operar un separador molecular. Se fabricó un dispositivo al recubrir chips de silicio con una película nanoporosa de 500 nm de espesor de óxido de silicio. Usando el modelo Lorentz-Lorenz, se midió un índice refractivo para determinar una porosidad de la película por elipsometría . Una porosidad estimada fue 57%. El área de superficie Brunauer-Emmett-Teller (BET) de la película, determinada usando mediciones de isotermas de adsorción-adsorción de nitrógeno, fue 670m2/g. Un tamaño de poro promedio fue de alrededor de 7nm. La Figura 13 muestra una morfología de la película nanoporosa de óxido de silicio usando Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) . Los chips fabricados se usaron para recolectar péptidos de LMW a partir de plasma humano. Después de humedecer la superficie nanoporosa con lavados secuenciales de isopropanol y agua desionizada, una gota (5 \iL) de plasma humano se aplicó directamente sobre la superficie del chip y subsecuentemente se incubó para la captura de las especies de péptido/proteína . Después de una serie de lavados secuenciales de agua desionizada, las especies unidas se liberaron de la superficie por la adición de una solución ácida de matriz de MALDI (ácido a-ciano-4-hidroxicinámico, CHCA) que contiene un alto porcentaje de solvente orgánico (50% v/v) . Una alícuota de 1 µ?^ de la solución de extracción se depositó en una placa de MALDI y se usó para análisis de MS . En la Figura 14, se hace una comparación entre espectros de MALDI-TOF obtenidos usando una superficie de sílice nanoporosa y una superficie control de sílice sólida no nanoporosa. En la primera, se detectan aproximadamente 70 péptidos de bajo Mw, incluyendo calcitonina humana, la cual se ha adicionado en el plasma incubado a una concentración de 1 pg/mL. En contraste, no se detectaron péptidos en un espectro de MS obtenido del análisis de la superficie control. Un análisis complementario de MALDI-TOF también se realizó en la misma muestra nanoporosa usando ácido sinapínico, una matriz más específica para proteínas grandes. En este caso, aunque se detectaron las trazas del extracto de albúmina y algunas otras proteínas plasmáticas abundantes, las cuales de otra manera podrían dominar el espectro de MALDI-TOF, casi toda la señal de MS se concentró en una región por debajo de 15, 000 m/z. De esta manera, 15 kDa puede ser un valor aproximado de masa de separación logrado por las condiciones experimentales reales y la nanoporosidad de la superficie empleada. Aunque la presente invención no se limita por una teoría, el aislamiento y detección de péptidos de LMW a partir de plasma, como se muestra en la Figura 14, se debe probablemente a una porosidad especifica dimensionada en nanómetros de la superficie del chip. Sólo los analitos suficientemente pequeños para penetrar fácilmente los poros pueden adsorberse en forma cuantitativa sobre la superficie del chip. De esta manera, esta metodología puede emplearse de manera selectiva para el enriquecimiento y análisis del LMW. La adsorción de analitos en la superficie del chip debe ser suficientemente fuerte para resistir lavados extensos del chip después de la captura durante la etapa de incubación. En este caso particular, las interacciones iónicas de los analitos de LMW con los grupos silanol presentes en la capa nanoporosa de sílice pueden contribuir a la unión del analito. Para valorar la repetibilidad del perfil generado, cinco análisis en réplica se realizaron en la misma muestra de plasma. Los espectros de MALDI-TOF obtenidos se reportan en la Figura 15, donde puede apreciarse la repetibilidad del perfil de LMW. Un limite de detección (DL) del método puede estimarse al agregar un péptido comercialmente disponible, calcitonina, al plasma humano en concentraciones diferentes. Se adicionó calcitonina humana en el plasma antes del análisis para imitar las condiciones in vivo. El análisis se realizó al incubar el plasma adicionado en la superficie nanoporosa de sílice seguido por perfilado subsecuente de MALDI-TOF. La Figura 16 muestra la intensidad del pico correspondiente a la molécula protonada de calcitonina (m/z teórico = 3421.0) en cuatro diferentes niveles de concentraciones, hasta 20 ng/mL. Este DL de concentración representa una mejora dramática con respecto a datos recientes reportados en la literatura 11 usando metodologías similares. Una gota del plasma adicionado que tiene la concentración más baja de calcitonina, 20 ng/mL, contenía una cantidad absoluta de 100 pg de calcitonina (5 L aplicados a la superficie nanoporosa) . Considerando que 1/3 de la solución de extracción se depositó en la placa de ALDI para análisis, un máximo de 33 pg de calcitonina estaba disponible para detección por MALDI-TOF. Tal cantidad corresponde al DL real para calcitonina analizada por MALDI-TOF en condiciones estándar (solución estándar de péptidos mezclada con matriz CHCA, 1 L depositado en objetivo MALDI para análisis) . Esto indica que una porción significativa de la calcitonina adicionada se recolectó de manera eficiente de plasma por la superficie nanoporosa, incluso en la concentración más baja analizada, y se hizo disponible para la detección por S después de la extracción de péptidos de LMW. Las superficies nanoporosas basadas en silicio también fueron capaces de crear tal separador molecular. El silicio nanoporoso se fabricó por grabado electroquímico, creando una topografía mesoscópica (película de poros nanodimensionados , similar a sílice nanoporosa, que cubre cavernas microdimensionadas de silicio) . El silicio nanoporoso se ha usado como un agente de recolección en el protocolo descrito en lo anterior en lugar de un chip recubierto de sílice. Un secuestro de dos péptidos estándar de bajo MW en presencia de un fuerte exceso de la proteína grande albúmina se observó por espectrometría de masas.

MÉTODOS FABRICACIÓN DE SUPERFICIES NANOPOROSAS La película nanoporosa de óxido se preparó como sigue. 8.71 g de tensioactivos EOio 6 P07oEOiO S (Pluronic F127, BASF) se agregaron en 23g de Etanol. Una mezcla de 10 g de tetraetilortosilicato ( TEOS , Aldrich) , 0.1006g de clorhidrato (20%), lOg de Etanol y 10.629 g de agua se agregaron entonces bajo agitación vigorosa . Después de dejar reposar durante 3-6 h a temperatura ambiente, una solución precursora se depositó por centrifugado sobre la oblea de silicio a 1900 rpm durante 30 s. Después del revestimiento por centrifugado, la película se horneó a 100° C durante 12h, seguido por 400° C durante 2h en un incinerador.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS La superficie del chip se humedeció usando isopropanol. Después de un lavado con agua, 5 µ?, de plasma humano (recolectado de acuerdo con los lineamientos publicados 19) de voluntarios saludables bajo consentimiento y protección del monitoreo para sujetos humanos del Consejo de Revisión Institucional, se aplicaron a la superficie del chip y se dejaron incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en 100 % de humedad. La muestra se removió usando una pipeta. La superficie se lavó entonces por 5 alícuotas secuenciales de 5 \i de agua, permitiendo a las gotillas descansar sobre la superficie durante 1 minuto cada vez. Después del último lavado, 3 L de una solución de matriz MALDI que consiste de 3 mg/mL de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA, Sigma) en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y 0.1 % de ácido trifluoroacético (TFA) (v/v) se usó para extraer los analitos unidos a la superficie del chip. 1 L del extracto se depositó en una placa de muestra MALDI y se dejó secar antes del análisis espectrométrico de masas.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS La MALDI-TOF se realizó en un espectrómetro de masas Voyager-DE™ STR MALDI-TOF (Applied Biosystems) equipado con un láser de nitrógeno que emite a 337 nm. Los espectros se adquirieron en un modo positivo lineal usando un tiempo de extracción retardado de 700 nanosegundos y un voltaje de aceleración de 20 kV. 500-600 disparos de láser se promediaron típicamente para producir el espectro final de las muestras. REFERENCIAS 1. Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. Written in blood. Nature 425, 905 (2003) . 2. Villanueva, J., Tempst, P. OvaCheck: let's not dismiss the concept. Nature 430, 61 1 (2004) . 3. Villanueva, J. et al. Corretting common errors in identifying cancer-specific serum peptide signatures. J. Proteome Res. 4, 1060-1062 (2005). 4. Petricoin, E. F. et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarían cáncer. Lancet 359, 572-577 (2002) . 5. Issaq, H. J. , Conrads, T. P., Prieto, D. A., Tirumalai, R., Veenstra, T. D. SELDI- TOF MS for diagnostic proteomics. Anal. Chem. 75, 148A-155A (2003). 6. Ebert, . P., et al. Identification of gastric cáncer patients by serum protein profiling. J. Proteome Res. 3, 1261-1266 (2004) . 7. Zhang, Z. et al. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarían cáncer. Cáncer Res. 64, 5882-5890 (2004). 8. Chen, Y. D., Zheng, S., Yu, J. K. , Hu, X. Artificial neural networks analysis of surface-enhanced láser desorption/ionization mass spectra of serum protein pattern distinguishes colorectal cáncer from healthy population. Clin. Cáncer Res.10, 8380-8385 (2004) . 9. Carrette, O. et al. A panel of cerebrospinal fluid potential biomarkers for the diagnosis of Alzheimer' s disease. Proteomics 3, 1486-1494 (2003) . 10. Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cáncer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Mol. Cell. Proteomics 3, 367-378 (2004). 11. Diamandis, E. P., van der Merwe, D. E. Plasma protein profiling by mass spectrometry for cáncer diagnosis: opportunities and limitations. Clin Cáncer Res. 1 1, 963-965 (2005) . 12. Geho, D. H., Lahar, . , Ferrari, M. , Petricoin, E. F. , Liotta, L. A. Opportunities for nanotechnology-based innovation in tissue proteomics.

Biomed. Microdevices 6, 231-239 (2004). 13. Trauger, S. A. et al . High sensitivity and analyte capture with desorption/ionization mass spectrometry on silylated porous silicon. Anal. Chem. 76, 4484-4489 (2004) . 14. Go, E. P. et al. Desorption/ionization on silicon nanowires. Anal. Chem. 77, 1641-1646 (2005). 15. ehta, A. I. et al. Biomarker amplification by serum carrier protein binding. Dis. Markers 19, 1-10 (2003-2004) . 16. Liotta, L. A. et al. Importance of communication between producers and consumers of publicly available experimental data. J. Nati. Cáncer Inst. 97, 310-314 (2005) . 17. Lowenthal, M. S., et al. Clin. Chem. Oct 2005; 51 : 1933 - 1945. 18. Cohén, . H., Melink, K.s Boiarski A. A. , Ferrari M., Martin, F. J. Microfabrication of silicon-based nanoporous particulates for medical applications . Biomed. Microdevices 5, 253-259 (2003) . 19. Hulmes, J. D., et al. An Investigation of Plasma Collection, Stabilization, and Storage Procedures for Proteomic Analysis of Clinical Samples. Clin. Proteomics 1, 17-32 (2004).

EJEMPLO 4 Nanochips Proteomicos para Recolectar y Dirigir Proteínas Angiogénicas Las citas en los paréntesis en este ejemplo se refieren a la Lista de Referencias al final del Ejemplo 4. La espectrometría de masas (MS) es una tecnología poderosa para la caracterización cualitativa y cuantitativa de péptidos con pesos moleculares de menos de 20 kDa . En términos de sensibilidad, se demostró recientemente que la MS de desorción por láser es capaz de detectar péptidos dentro del nivel de sensibilidad attamolar bajo (7). De esta manera, en principio, la MS permite el acceso analítico a péptidos presentes en solución en niveles de pg/mL usando sólo unos cuantos microlitros de muestra disponible. Detectar especies de péptidos en tales niveles bajos en suero y tejido humano representa una herramienta extremadamente poderosa para el descubrimiento de biomarcadores . No obstante, tal nivel de sensibilidad todavía no se ha alcanzado por el análisis de MS de rutina de suero o tejidos humanos. Esto se debe principalmente a un intervalo dinámico limitado del análisis de MS, el cual, en el mejor caso, es capaz de una detección de analitos peptídicos en presencia de un máximo de 10,000 veces de exceso de especies interferentes tales como otras proteínas/péptidos . La interferencia de proteínas portadoras de alto peso molecular, presentes en niveles de mg/mL, permite la detección de péptidos presentes en concentraciones de un máximo de 3-4 órdenes de magnitud inferior, es decir, dentro del intervalo bajo de µg/mL. La atención reciente se ha enfocado en el proteoma de bajo peso molecular (LMWP) dentro del suero humano como una fuente potencial de marcadores de diagnóstico (3, 8-11) . El uso de S para análisis de LMWP que are presentan en suero y tejidos en niveles muy bajos implica que un fraccionamiento extenso de muestras pueda ser necesario para intensificar la capacidad de detectar esta importante fuente de información. Un método, por el cual la complejidad de los péptidos que se analizan puede reducirse, es un aislamiento de una fracción del proteoma completo que tiene características físico-químicas específicas, por ejemplo, fraccionamiento de péptidos con base en tamaño. Las superficies basadas en sílice/silicio nanoporoso con tamaños de poro y porosidad específicos permiten la adsorción de péptidos de bajo peso molecular en muestras de suero. El uso de tales superficies con características definidas genera un separador o criba molecular. Unos cuantos microlitros de suero pueden aplicarse de esta manera directamente sobre una superficie nanoporosa para la recolección de LMWP. Después de lavar la superficie nanoporosa, los analitos unidos entonces pueden recolectarse y perfilarse por MS de ionización desorción por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) . La mejora en sensibilidad de la detección de proteínas de tamaños específicos usando una superficie nanoporosa proporcionada por esta metodología permite la exploración de LMWP presente en concentraciones de ng/mL en suero y tej idos . Además de desarrollar partículas nanoporosas como un medio para intensificar la sensibilidad de captura e identificación de péptidos presentes en suero y tejido tumoral, este ejemplo se enfoca en un desarrollo y refinamiento de un chip de sílice/silicio integrado para mejorar la sensibilidad. La superficie del chip se construye con varios puntos nanoporoso "activos" estampados, los cuales se distribuyen sobre una superficie inerte, no porosa, no adsorbente del chip. La modificación de las propiedades de superficie del chip de sílice/silicio puede permitir que se adsorban los péptidos de LM contenidos en una muestra de suero o extracto de tejido de 5-10 yL que se depositan sobre el chip, concentrados y confinados en la región del "punto". La extracción de los analitos unidos en un volumen mínimo (100-200 nL) antes del análisis de MS puede intensificar la sensibilidad. Adicionalmente, la ionización directa por MS del chip con la superficie nanoporosa de puntos puede evitar la dilución posterior de la muestra. Al combinar una metodología en-chip sobre-concentración con la ionización directa de "punto", la mejora en sensibilidad puede rebasar el intervalo de pg/mL de los límites del análisis que existen actualmente . En condiciones estándar (por ejemplo, 1 yL de muestra/solución de matriz aplicada al objetivo), sólo una fracción diminuta de los cristales generados se bombardean realmente por el láser y se usan para adquirir datos de MS (típicamente 0.1-1%). La mejora en sensibilidad puede lograrse para una en-superficie pre-concentración de analitos peptídicos de interés al ajustar las propiedades de superficie del chip. Las superficies de silicio del chip pueden construirse con el fin de presentar varios puntos nanoporosos estampados "activos" y una superficie no porosa, inerte (de esta manera no adsorbente) del chip para ionización por láser. Tal metodología puede permitir que los péptidos de LM contenidos en 5-10 uL de muestra de suero depositada sobre el chip se adsorban y concentren en una región confinada (es decir, el "punto" nanoporoso) , con la condición de que la gota de muestra inicial se centre sobre un solo "punto" nanoporoso rodeado por la superficie inerte. La extracción de los analitos unidos en un volumen mínimo (100-200 nL) antes del análisis de MS también puede ser beneficiosa para intensificar la sensibilidad de la detección de analitos. Adicionalmente, la ionización directa por MS de la superficie nanoporosa de puntos puede evitar el procesamiento/diluciones posterior de la muestra con la matriz. El diámetro del punto nanoporoso puede limitarse ya sea por i) un volumen mínimo que puede manejarse por una micropipeta, en caso de que los péptidos unidos se extraigan de la superficie nanoporosa y depositen sobre la plataforma de muestra de MALDI; ii) un diámetro del punto de láser, en el caso de que se intente ionización directa desde el chip. En la primera opción, los puntos nanoporosos en el intervalo 0.5-1 mm de diámetro pueden probarse, lo cual puede requerir volúmenes de solución de extracción en el intervalo de cientos de nanolitros. En el segundo caso, pueden probarse diámetros de puntos hasta 0.1-0.2 mm. Combinar en-chip sobre-concentración y ionización directa del "punto" puede proporcionar mejoras en órdenes de magnitud en sensibilidad de la detección de analitos con respecto al análisis de LM P en muestras de suero o tejido, y puede empujar los límites de análisis de MS de tales analitos por debajo del intervalo de ng/mL.

Métodos Experimentales. Fabricación de Superficie Nanoporosa: La película nanoporosa de óxido se preparó como sigue. 8.71 g de tensioactivos EOio6P070EOio6 (Pluronic® F127) se agregaron en 23 g de etanol. Una mezcla de 10 g de tetraetilortosilicato (TEOS), 0.1006g de clorhidrato (20%), lOg de Etanol y 10.629 g de agua se agregaron entonces bajo agitación vigorosa. Después de haberse dejado reposar durante 3-6 h a temperatura ambiente, la solución precursora se depositó por centrifugado sobre una oblea de silicio a 1900 rpm durante 30 s. Después del revestimiento por centrifugado, la película se consolidó a 100° C durante 12h, seguido por 400° C durante 2h en un incinerador. El espesor de la película es aproximadamente 500 nm. Una porosidad se estimó de 57% y el tamaño de poro promedio fue 7nm. El área de superficie Brunauer-Emmett-Teller (BET) se estimó de 670m2/g usando mediciones de isotermas de adsorción-adsorción de nitrógeno.

Fabricación de Chips Proteómicos: El proceso para fabricación de chips de silicio puede incluir 4 etapas de fotolitografía y 1 tratamiento de superficie usando contacto suave. Después de las etapas de limpieza estándar, el área de colocación de láser se estampó y grabó usando Grabado Reactivo de Iones (RIE, Lam Cl2: He=180 : 00sccm 100W 300mT) . Una capa delgada de Titanio/ Oro de 10nm/50nm se depositó usando un evaporador de rayos e (Dentón Vacuum, corriente 100mA, tasa de deposición O.lnm/min), y estampó por despegue del fotoresistor . La superficie nanoporosa se recubrió por centrifugado usando el protocolo descrito en la sección previa y se templó a 400°C. La superficie nanoporosa se definió por litografía, y se grabó usando ácido para grabar de óxido amortiguado. El pozo del chip para colocar muestras se fabricó usando un resistor fotosensitivo grueso negativo SU-8 (de MicroChem Inc) . Después de la exposición, horneado, horneado pos-exposición y desarrollo usando el protocolo sugerido por el fabricante, se formaron microestructuras SU-8 de 25 ]s . El plasma de oxígeno (MicroRIE 100W, 02 100 sscm) se usó para limpiar antes del tratamiento de polietilenglicol (PEG). El PEG se usó para reducir una adsorción de proteínas en una superficie no porosa de silicio en una etapa de pre-concentración. La oblea se mojó en 1% de PEG (M„1000Da, en tolueno) con aditivos de Trietilamina y tetracloruro de silicio para formar un enlace covalente en la superficie de sílice. Poli (dimetilsiloxano) (PDMS, Dow Corning) se vació como una estampa elastométrica contra un modelo que tenía un relieve grabado. La estampa se mojó en una solución de un 5% de cloro (dimetil ) octadecilsilano en tolueno, se secó y puso en contacto con el sustrato. Calentar a 50°C durante la noche, y remover la estampa. Las cadenas lineales de hidrocarburo de octadecilo (18 átomos de carbono) ofrecen excelentes capacidades de unión para el área de colocación de láser.

Modificación de superficie: El chip puede componerse de pozos separados, cada uno teniendo dos áreas distintas con una composición especifica de superficie. La superficie se hydroxiló en plasma de oxigeno (02 lOOsccm, 50W) . Carga positiva, grupos amina se introdujeron en la superficie por silanización con 0.5% v/v de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) en isopropanol (IPA) durante 30 min a temperatura ambiente. Carga negativa, grupos tiol se recubrieron en la superficie usando 0.5% v/v de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS) y 0.5% v/v de H20 en IPA. Hidrofilico, el grupo hidroxilo se trató con 1% de polietilenglicol (PEG) con aditivos de trietilamina y tetracloruro de silicio. La superficie hidrofóbica se derivó por 5% de cloro (dimetil ) octadecilsilano (18 átomos de carbono) . Después de la silanización, las partículas pueden lavarse 5 veces en solvente, y secarse durante 2 hr a 110°C. El grupo físico (carga) y funcional puede medirse. Por ejemplo, la cantidad de carga en la superficie tratada con APTES puede medirse por la medición de potencial zeta, mientras la densidad del grupo funcional amino puede determinarse por el método de Fmoc, usando, por ejemplo, 0.4 mi de peperidina, 0.4 mi de DCM, y 1.6 mi de MeOH. La superficie nanoporosa no tratada e hidrofóbica puede usarse como control para estudiar una contribución del grupo funcional al LMWP de enriquecimiento.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES : Dado que estos experimentos fueron la primera identificación de la expresión diferencial de transcritos de VEGF en un sistema de ratón, las secuencias de VEGFi4 y VEG F205 * se clonaron y confirmaron. Se produjeron proteínas recombinantes para analizar las actividades funcionales de las variantes de empalme VEGFi44 y VEGF205 * recién identificadas. FRACCIONAMIENTO de PROTEÍNAS de BAJO PESO MOLECULAR : La superficie del chip puede humedecerse usando isopropanol. Después de un lavado con agua, 5 \i~L de muestra de suero/tumor pueden aplicarse a la superficie del chip y dejarse incubar durante 30 min a temperatura ambiente en 100% de humedad. Las muestras en exceso pueden removerse usando una micropipeta. La superficie entonces puede lavarse por la adición de 5 alícuotas secuenciales de 5 µL de agua de grado HPLC sin tensioactivos, desionizada, estéril, permitiendo a una gotilla descansar sobre la superficie durante 1 minuto cada vez. Después del último lavado, 3 L de una solución de matriz MALDI de 3 mg/mL de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y 0.1 % de ácido trifluoroacético (TFA) (v/v) pueden usarse para extraer los analitos unidos a la superficie del chip. 1 pL del extracto puede depositarse sobre una placa de muestra MALDI y dejarse secar antes del análisis espectrométrico de masas. ESPECTROMETRÍA DE MASAS La MALDI-TOF puede realizarse usando un Espectrómetro de Masas Voyager-DE™ STR MALDI-TOF (Applied Biosystems) equipado con un láser de nitrógeno que emite a 337 nm. Los espectros se adquieren en modo positivo lineal usando un tiempo de extracción retardado de 700 nanosegundos y un voltaje de aceleración de 20 kV. 500-600 disparos de láser se promedian típicamente para producir el espectro final de las muestras . ESTUDIOS de SECUENCIACIÓN de PROTEÍNAS. Ensayo de Proteínas: muestras fraccionadas se examinaron por un ensayo tradicional de Bradford usando un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) que varía de 200 pg/mL a 1 mg/mL monitoreado a 595 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Spectramax® Plus 384, Molecular Devices) . Separación en gel de ID y digestión: 15 g de cada muestra fraccionada por cuentecillas y 3 pL de suero pueden diluirse en 30 pL de amortiguador de muestra LDS y hervirse durante 5 minutos a 95 °C. Las fracciones pueden correrse en un gel de ID pre-vaciado (4-12% de Bis-tris) para aislar regiones deseadas de peso molecular de la mezcla compleja de proteínas. Los geles entonces pueden lavarse completamente con ddH20, fijarse en una solución de 50% metanol/ 10 % ácido acético durante 30 minutos, teñirse con tinción rubí Sypro© durante la noche, y desteñirse en ddH20 durante 3 horas antes de excitación con UV y visualización . El gel entonces puede rebanarse en regiones de gel de 1 mm2 y las bandas del gel desteñirse en 50% de metanol. Las bandas del gel pueden reducirse y alquilarse con 10 mM de DTT y 55 mM de yodoacetamida , incubarse a 4°C durante 1 hora en tripsina (20 ng/ i ) y dejarse digerir durante la noche (16 horas) a 37°C en 25 mM de NH4HCO3. La mañana siguiente, las proteínas pueden extraerse del gel con incubaciones repetidas de solución de 70% de ACN/ 5% de ácido fórmico. Análisis LC/MS/MS: Las muestras pueden liofilizarse casi a sequedad y reconstituirse en 6.5 i de amortiguador de HPLC A (95% de H20, 5% de ACN, 0.1% de FA) para análisis de Espectrometría de Masas. El análisis de LC/MS/MS de fase inversa microcapilar puede realizarse con el sistema de cromatografía líquida LC Packings de Dionex acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa de iones ThermoFinnigan LCQ Classic (San José, CA) con una fuente modificada de nanoaspersión . Las separaciones en fase inversa se realizaron con una columna capilar empacada en suspensión de uso interno. La columna unida a sílice de 18 átomos de carbono es de 75 µp? de d.i., 360 µp? de d.e., 10 cm de longitud, sílice fusionada empacada con cuentecillas de 5 µp? con poros de 300 Angstroms (Vydac, Hesperia, CA) . Una µ-precolumna PepMap, 5 mm, cartucho de 18 átomos de carbono (Dionex) actúa como una columna de desalado. La muestra se inyecta en modo de captación µL y se lava con Tampón A durante cinco minutos antes de una elución lineal de gradientes con Tampón B (95% de ACN/ 5% de H20/ 0.1% de ácido fórmico) hasta 85% durante 95 minutos a una tasa de flujo de 200 nL/ minuto. Exploraciones de MS completas se siguen por cuatro exploraciones de MS/MS de los iones peptídicos más abundantes (en un modo dependiente de datos) y la disociación inducida por colisión (CID) se realiza en una energía de colisión de 38% con el voltaje de aspersión de iones ajustado a 2.00 kV, voltaje capilar y temperatura a 22.80 V y 180°C, respectivamente. Análisis de datos: El análisis de datos se realizó al buscar espectros de MS/MS contra el Instituto Europeo de Bioinformática del conjunto de proteomas no redundantes de las entradas de Swiss-Prot, TrEMBL y Ensembl a través del Sequest Bioworks Browser (ThermoFinnigan) . Los péptidos se consideraron aciertos legítimos después de filtrar los puntajes de correlación (véase la Tabla 2) y la inspección manual de los datos de MS/MS. Los criterios usados para filtrar datos son por lo menos tan astringentes como la mayor parte de las citas de la literatura.

Tabla 2 Los aciertos aceptados de péptidos se requieren para tener una categoría de XCOrr = 1 con respecto a todos los otros péptidos en la base de datos. REFERENCIAS 1. Folkman, J . Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 2003 Nov; 3 ( 7 ) : 643-51. 2. Affara NI, Robertson FM. Vascular endothelial growth factor as a survival factor in tumor-associated angiogenesis . In Vivo. 2004 Sep-Oct ; 18 ( 5 ): 525-42. 3. L. A. Liotta, M. Ferrari, E. Petricoin. "Clinical Proteomics : ritten in Blood", Nature 425, 301, octubre 30, 2003. 4. Terracciano R., Gaspari M. , Testa F., Pasqua L., Cuda G., Tagliaferri P., Cheng M.C., Petricoin E.F., Liotta L.A., Ferrari M. , Venuta S., "Selective Binding and Enrichment for Low Molecular Weight Biomarker Molecules in Human Plasma after Exposure to Nanoporous Silica Particles", Proteomics, Volumen 6, Tomo 11, Fecha: No. 11 junio 2006. Páginas: 3243-3250.

. Gaspari M, Cheng MC, Terraccianol R, Liu X, Nijdam AJ, di Fabrizio E, Petricoin EF, Liotta LA, Cuda G, Ferrari M, Venutal S, "Nanoporous surfaces as harvesting agents for mass spectrometric analysis of peptides in human plasma" J. Proteome Res. 2006 May;5(5): 1261-6. 6. Ferrara N, Hillan KJ, Novotny W. Bevacizumab (Avastin) , a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cáncer therapy. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jul 29;333 (2) : 328-35. 7. Sunia A. Trauger, Edén P. Go, Z Shen, Junefredo V. Apon, Bruce J. Compton, Edouard S. P. Bouvier, . G. Finn, y Gary Siuzdak, High Sensitivity and Analyte Capture with Desorption/Ionization Mass Spectrometry on Silylated Porous Silicon" Analytical Chemistry, 76, 4484-4489 (2004) . 8. E. F. Petricoin III et, al "Use of proteomic patterns in serum to identify ovarían cáncer" Lancet 359 572-77 (2002). 9. D. Geho, N. Lanar, M. Ferrari, E. Petricoin, L. Liotta, "Opportunities for Nanotechnology-Based Innovation in Tissue Proteomics", Biomedical Microdevices , Vol. 6, No. ,3, septiembre, 2004, 231-240. 10. M. Ferrari, Cáncer Nanotechnology ; Opportunities and Challenges, Nature Reviews, Cáncer, Vol. 5, n.3, pp.161-171, 2005. 11. M. Ferrari, therapeutic microdevices and methods for making and using sames, Patente Norteamericana 6, 107, 102. 12. Geho D, Cheng MC5 Killian K, Lowenthal M3 Ross S, Frogale K, Nijdam AJ, Lahar N, Herrmann P, Johann D, hiteley G, Ferrari M, Petricoin E, Liotta L, "Fractionation of Serum Components Using Nanoporous Substrates" Bioconjug. Chem. 2006 May- Jun; 17 (3) : 654-61. 13. alczak, et al., en preparación. 14. Martin FJ, Melnik K, West T, Shapiro J3 Cohen M3 Boiarski AA, Ferrari M. Acute toxicity of intravenously administered microfabricated silicon dioxide drug delivery partióles in mice: preliminary findings. Drugs R D. 2005;6(2) :71-81. 15. Ferrari M. Nanovector Therapeutics , Current Opinions in Chemical Biology, Vol. 9, No. 4, 343-346, 2005. 16. Cohen MH, Melnik K, Boiarski AA, Ferrari M, Martin FJ. Microfabrication of Silicon- Based Nanoporous Particulates for Medical Applications, Biomedical Microdevices, Vol. 5, No. 3, septiembre, 2003. 17. M. Ferrari, therapeutic microdevices and methods for making and using sames, Patente Norteamericana 6, 107, 102. 18. Decuzzi P, Lee S, Bhushan B, Ferrari M. A Theoretical Model for the Margination of Nanoparticles within Blood Vessels. Annals of Biomedical Engineering, Vol. 33, No. 2, febrero 2005, pp. 179-190. 19. Nashat AH, oronne , Ferrari M. Detection of Functional Groups and Antibodies on Microfabricated Surfaces by Confocal Microscopy. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 60 No. 2 pp . 137-146, 1998. 20. M. Zhang, T. Desai, y M. Ferrari, "Proteins and Cells on PEG Immobilized Silicon Surfaces," Biomaterials, Vol. 19, 1998, 953-960. 21. J.K. Tu, T. Huen, R. Szema, y M. Ferrari, "Filtration of Sub-lOOnm Particles Using a Bulk- icromachined, Direct-Bonded Silicon Filter", Biomedical Microdevices, Vol. 1, No. 2, 113-120, 1999. 22. Nijdam AJ, Cheng MC, Geho DH, Fedele R, Herrmann P, Killian K, Espina V, Petricoin EP, Liotta LA, Ferrari , " Physicochemically Modified Silicon as Candidate Substrate for Protein Microarrays" , Biomaterials. 2007 Ene;28 (3) : 550-8. Epub 2006 Sep 20. 23. Crouch MF, Davy DA, Willard FS, Berven LA Insulin induces epidermal growth factor (EGF) receptor clustering and potentiates EGF-stimulated DNA synthesis in Swiss 3T3 cells: a mechanism for costimulation in mitogenic synergy. Immunol Cell Biol. 2000. 78 (4 ): 408-414. 24. Kute TE y Quadri Y. Measurement of proliferation nuclear and membrane markers in tumor cells by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 1991. 39 (8) : 1125-1130.

EJEMPLO 5 Partículas nanoporosas para recolección de fragmentos proteolíticos El desarrollo de metodologías usando la combinación de nanotecnología y Espectrometría de Masas (MS) conserva la promesa de identificar rápidamente proteínas conocidas y novedosas dentro del proteoma de bajo peso molecular (LM P; < 20 kDa o < 15 kDa) presente en el suero de pacientes con cáncer de mama. Los desafíos de semejante tarea pueden ser disminuir los efectos de enmascaramiento de las proteínas portadoras más grandes del suero, tales como albúmina, mientras se incrementa la concentración de proteínas de peso molecular inferior, de menor abundancia, las cuales pueden ser útiles para la detección y diagnóstico de una enfermedad tal como un cáncer de mama, como predictores del pronóstico o evaluación de una respuesta individual del paciente a diferentes tipos de terapia. En estos estudios, se han desarrollado chips basados en sílice/silicio nanotexturizado, los cuales tienen tamaños específicos de poro y tienen características específicas de superficie, tal como carga ya sea positiva o negativa o características hidrofóbicas , que pueden intensificar de manera diferencial la adsorción de proteínas dentro de diferentes intervalos de peso molecular que se presentan en el suero aislado de ratones desnudos que llevan xenoinjertos de tumor de mama humano. Se aisló suero de xenoinjertos de tumor de mama humano MCF-7/Ciclooxigenasa-2 (MCF-7 /Cox-2 ) los cuales producen niveles 50 veces mayores de prostaglandina E2 (PGE2) y niveles 5 veces incrementados de estradiol comparados con células control MCF-7 /vector . Las células de tumor de mama humano MCF-7 /Cox-2 se inyectaron en el depósito mamario de grasa de ratones desnudos hembra de 8-10 semanas de edad ovariectomizados, implantados con gránulos de liberación continua de beta-estradiol . En los días 15, 28, 42 y 60 después de la inyección de células tumorales, se aisló sangre por punción cardiaca y se procesó para aislar muestras de suero, se eluyó sobre nanochips, los cuales entonces se combinaron con análisis proteómico de Ionización/desorción por láser asistida por matriz-Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) y Espectrometría de Masas/Microsecuenciación (MS/MS) . En los mismos puntos en el tiempo, se midieron y aislaron xenoinjertos de tumor de mama para análisis proteómico y para evaluación histológica. Estos estudios demuestran una utilidad de los nanochips de sílice/silicio con características específicas de superficie en combinación con metodologías de MS para proporcionar retratos espectrales reproducibles y sensibles de proteínas de bajo peso molecular en suero de ratones que llevan xenoinjertos de tumor de mama humano así como para la detección sensible de proteínas producidas por los tumores de mama durante sus fases tempranas de desarrollo, invasión y metástasis. Hasta ahora, 79 proteínas únicas se han identificado dentro del LMWP de suero aislado de ratones que llevan xenoinjertos de tumor humano.

Diseño de Experimentos y Método ANIMALES DE PRUEBA La sangre puede recolectarse de ratones de acuerdo con el siguiente programa establecido para el desarrollo de tumores. Las muestras incluyen: 15 ratones control - 0.8-1.5 mi de sangre (0.4- 0.75 mi de suero) 15 ratones que llevan xenoinjertos de tumor de mama humano durante 28 días - 0.8-1.5 mi de sangre (0.4-0.74 mi de suero) 15 ratones que llevan xenoinjertos de tumor de mama humano durante 42 días - 0.8-1.5 mi de sangre (0.4-0.74 mi de suero) 15 ratones que llevan xenoinjertos de tumor de mama humano durante 60 días - 0.8-1.5 mi de sangre (0.4-0.74 mi de suero) Todos los análisis pueden llevarse a cabo en suero obtenido de las muestras de sangre.

RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE SUERO La sangre puede obtenerse por punción cardiaca y recolectarse en tubos de tapa roja, dejarse coagular a 4°C durante 2 horas y el coágulo removerse. El suero de cada ratón puede recolectarse después de una centrifugación y distribuirse en alícuotas en frascos de crioconservación para almacenamiento a -80°C como sigue. Los ratones de cada punto en el tiempo pueden dividirse en tres grupos al azar A, B y C, que contienen cada uno 5 ratones. Después de la recolección de suero, un volumen igual de suero recolectado de cada ratón en el grupo A (Al, A2 , A3, A4 y A5 ) puede combinarse y almacenarse en alícuotas de 100 µ?. Un conjunto similar de muestras puede recolectarse de los animales en los grupos B y C. Los sueros combinados de los grupos A, B y C pueden usarse para análisis e incubación con las nanocuentecillas . Todo el análisis puede llevarse a cabo en muestras descongeladas directamente de reservas congeladas, y las muestras que se someten un segundo o ciclos repetidos de congelación-descongelación no pueden considerarse como parte de estos estudios.

DISTRIBUCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS. 400 µ? del suero combinado recolectado pueden usarse para los experimentos. El suero combinado restante puede almacenarse a -80°C y utilizarse para análisis subsecuente.

ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS. El suero de cada ratón puede recolectarse después de una centrifugación y distribuirse en alícuotas en frascos de crioconservación para almacenamiento a -80°C como sigue. Todo el análisis puede llevarse a cabo en muestras descongeladas directamente de reservas congeladas. Las muestras de suero designadas para procesamiento y análisis pueden enviarse en hielo seco.

INCUBACIÓN CON CUENTECILLAS NANOPOROSAS (seapración de MW de 16 kDa) Las alícuotas de suero sin purificar (20 µ?) pueden descongelarse y diluirse (1:5) por la adición de 80 µ? de agua desionizada (volumen total de muestra 100 µ?) . El suero diluido puede incubarse con 1 mg de nanocuentecillas , las cuales se prelavaron 4 x con agua desionizada, a TA durante 1 hora (las muestras pueden monitorearse durante la incubación para la suspensión de cuentecillas , y según sea necesario las nanocuentecillas pueden resuspenderse en el suero diluido cada 15 minutos durante la incubación) . Después de la incubación, las cuentecillas pueden separarse del suero por centrifugación en microcentrifuga (30 sec, 10,000 rpm) , el suero diluido agotado con cuentecillas puede removerse para análisis y/o almacenamiento a -80°C, y las cuentecillas pueden lavarse 3 veces con 100 µ? de 0.1% de TFA en agua desionizada (5 minutos cada una a TA) . Después del lavado final, las cuentecillas pueden incubarse con 80 µ? de acetonitrilo/0.1% de TFA (75:25) durante 30 min a TA, y el eluato removerse, distribuirse en alícuotas y almacenarse a -80°C. Este procedimiento puede seguirse para cada una de las diferentes nanocuentecillas que se examinarán. Cada una de las muestras de suero recolectadas puede incubarse con un total de 12 diferentes preparaciones de nanocuentecillas incluyendo: partículas con tamaños de poro de 7 nm o 20 nm; partículas con diferente óxido químico, NH2, PEG-NHS; y partículas con diámetros de 5 µta o 20 µp?. El análisis completo de una sola muestra de suero con la serie completa de nanocuentecillas puede requerir aproximadamente 300 µ? de suero (12 cuentecillas x 25 µ? de suero/incubación) .

ANÁLISIS SELDI DE MUESTRAS Espectros de masas SELDI-TOF pueden obtenerse para cada una de las muestras de suero combinado y compararse con espectros del suero agotado con nanocuentecillas y el eluato de las nanocuentecillas . Chips de intercambio catiónico débil (WCX2 ProteinChips, Ciphergen Biosystems, Inc.) pueden usarse para obtener perfiles de proteínas unidas. Los chips pueden procesarse como sigue. Los chips colocados en un bioreactor pueden incubarse con 100 µ? de 10 mM de HC1 durante 5 min a temperatura ambiente (RT) . Después de la aspiración del HCL, el punto del chip puede lavarse 2 x en 100 µ? de agua desionizada 1 min cada una a RT . El chip entonces se incuba 2 x en 100 µ? de 10 mM de acetato de amonio que contiene 0.1% de Tritón X-100 durante 5 min cada una. El enjuague final de acetato de amonio se aspira y los chips se dejan secar. 5 µ? de la muestra se aplican entonces a los puntos del chip y se incuban durante 55 min en una cámara humidificada a RT. Los chips se lavan con 3 cambios de solución salina amortiguada de fosfatos (150 µ? cada uno), seguido por un solo enjuague en 150 µ? de agua desionizada. Después de secar, dos aplicaciones de 1.0 µ? de una solución al 30% de ácido cinnamínico en 50% (v/v) de acetonitrilo, 0.5% de ácido trifluoroacético se aplican a cada punto con secado entre las aplicaciones. Después de secar los chips se examinan usando un espectrómetro de masas PBS-II (Ciphergen Biosystems, Inc.) . Los espectros pueden adquirirse bajo condiciones idénticas para propósitos comparativos. Los espectros pueden recolectarse usando los siguientes ajustes del instrumento: usar un voltaje de detector de 1,800 V, masa de enfoque de 6,000 Da, con un limite alto de 20,000 Da, ganancia de sensibilidad ajustada a 5, e intensidad de láser de 145. 15 disparos de láser pueden adquirirse por posición (que varían de 20 a 80), en incrementos de 5 posiciones. Los espectros SELDI también pueden recolectarse después de colocar 5 µ? de suero sin purificar diluido (1:5 con agua desionizada) análogo a suero antes de la incubación con nanocuentecillas, y de 5 µ? de suero diluido después de la incubación con cada nanocuentecilla (suero agotado por nanocuentecillas) para comparar directamente la intensidad y perfil de los picos de proteínas séricas antes y después de la incubación con cuentecillas . Estos espectros pueden compararse con espectros SELDI obtenidos de un volumen equivalente de cada eluato de nanocuentecillas (4 µ? en total) .

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE ELUATO DE CUENTECILLAS La concentración de proteínas en el eluato de nanocuentecillas puede determinarse usando ensayos estándar de microproteínas (ensayo de Bradford o BCA) usando albúmina sérica bovina (BSA) como el estándar de proteína.

SEPARACIÓN EN GEL DE ID Después de la determinación de proteínas, las muestras pueden analizarse por separación en gel de ID. 15 µ? de cada fracción de eluato de nanocuentecillas pueden incubarse en 30 µ? de amortiguador de muestra de SDS y hervirse durante 5 min a 95°C. Las fracciones entonces pueden separarse por electroforesis de ID usando geles prevaciados (4-12% de Bis-Tris). Después de la electroforesis , los geles pueden lavarse en agua desionizada, fijarse en solución de 50% de metanol/10% de ácido acético durante 30 min y teñirse con tinción rubí Sypro® durante la noche. Los geles pueden desteñirse durante 3 horas en agua desionizada antes de la formación de imágenes usando un sistema de análisis de imágenes Versadoc 3000. Las regiones del gel por debajo de 20 kDa pueden examinarse y las bandas seleccionarse para extraer el centro usando un cortador de punto para geles BioRad. Las piezas escindidas del gel se colocan en una multiplaca de 96 pozos. Las piezas del gel pueden transferirse al CCC Proteomics Core para procesamiento y análisis por LC/MS/MS.

LC/MS/MS Las piezas del gel pueden lavarse en 50% de metanol/5% de ácido acético durante una hora. La etapa de lavado puede realizarse de nuevo una vez antes de que las piezas de gel se deshidraten en acetonitrilo . Las piezas de gel pueden rehidratarse en 10 mM de ditiotreitol (DTT) en 0.1 M de bicarbonato de amonio y reducirse a temperatura ambiente durante 0.5 h. La solución de DTT puede removerse y la muestra puede alquilarse con 50 mM de yodoacetamida en 0.1 M de bicarbonato de amonio a temperatura ambiente durante 0.5 h. El reactivo de yodoacetamida puede removerse y las piezas de gel se lavan con 100 mM de bicarbonato de amonio antes de secarse en acetonitrilo en incrementos de 5 minutos. Los geles pueden lavarse nuevamente en 100 mM de bicarbonato de amonio durante 5 min. antes de la deshidratación con acetonitrilo durante 5 min. La proteasa puede conducirse hacia las piezas de gel al rehidratarlas en 25 µ? de tripsina modificada de grado secuenciación a 20 yg/mL en 50 mM de bicarbonato de amonio durante 10 min antes de la adición de 20 de 50 mM de bicarbonato de amonio. La muestra se incuba a 40°C durante 6 h. Los péptidos que se forman se extraen de la poliacrilamida con dos lavados de 20 min de 50% de acetonitrilo/5% de ácido fórmico. Estos extractos se combinan en una multiplaca limpia de 96 pozos y se secan durante 90 min. La espectrometría de masas en tándem por nanoaspersión-cromatografía líquida capilar (Nano-LC/MS/MS ) puede realizarse en un espectrómetro de masas Thermo Finnigan LTQ equipado con una fuente de nanoaspersión operada en modo de ión positivo. El sistema LC puede ser un sistema UltiMate™ Plus de LC-Packings A Dionex Co (Sunnyvale, CA) con un muestreador automático Famous y conmutador de columna Switchos. El solvente A puede ser agua que contiene 50mM de ácido acético y el solvente B puede ser acetonitrilo . 5 microlitros de cada muestra pueden inyectarse primero en la columna de entrampe (LC-Packings A Dionex Co, Sunnyvale, CA) , y lavarse con 50 mM de ácido acético. La lumbrera del inyector puede conmutarse para inyectar y los péptidos pueden eluirse de la trampa sobre la columna. Una columna de 5 cm 75 mm ID ProteoPep II C18 (New Objective, Inc. oburn, MA) empacada directamente en al punta de nanoaspersión puede usarse para separaciones cromatográficas . Los péptidos pueden eluirse directamente de la columna hacia el sistema LTQ usando un gradiente de 2- 80%B durante 30 minutos, con una tasa de flujo de 300 nl/min. Un tiempo total de operación puede ser 58 minutos. La secuencia de exploración del espectrómetro de masas puede programarse para una exploración completa, una exploración de ampliación-reducción para determinar la carga del péptido y una exploración MS/MS del pico más abundante en el espectro. Puede usarse exclusión dinámica para excluir múltiples MS/MS del mismo péptido. La información de secuencias de los datos de MS/MS puede procesarse usando Mascot Distiller para formar una lista de picos y al usar el algoritmo Turbo SEQUEST en el Software Bio Works 3.1. El procesamiento de datos puede realizarse siguiendo los lineamientos en Molec. Cell. Proteomics. Los picos asignados tienen un mínimo de 10 conteos (S/N de 3) . La precisión de masa de los iones precursores puede ajustarse a 1.5 Da para acomodar la selección accidental del ión C13 y la precisión de masa de fragmento puede ajustarse a 0.5 Da. Las modificaciones consideradas (variables) fueron oxidación de metionina y carbamidometilcisteína .

Resultados Experimentales I ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF Los nanoporosos fueron cuentecillas usadas para estos experimentos. 4 X 12 alícuotas de cuentecillas de sílice estaban disponibles (4 diferentes químicas de superficie: poro pequeño y grande de sílice, poro pequeño de APTES y MPTMS) Protocolo de análisis de MALDI-TOF Los péptidos extraídos se mezclaron con una solución de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) , 4 mg/mL en 50% (v/v) de acetonitrilo, 0.1% de TFA. La relación matriz/muestra se especifica para cada experimento único. 1 µ? de la muestra/solución de matriz se colocó en una placa objetivo MALDI de acero inoxidable y se secó al aire. Se adquirieron espectros de MALDI-TOF en un espectrómetro de masas Voyager-DE® STR (Applied Biosystems, Framingham, MA) en modo de ión positivo lineal, de extracción retardada, usando los siguientes ajustes: voltaje de aceleración 20,000 V, voltaje de rejilla 91.5%, tiempo de retardo de extracción 200 nsec, intervalo de masa de adquisición 800-20,000 m/z, intervalo de intensidad de láser 2100-2300. Cada espectro fue el promedio de 400-1000 disparos individuales de láser adquiridos en series de 100 disparos consecutivos. La calibración externa del instrumento se realizó diariamente usando una mezcla de péptidos estándar (Applied Biosystems calmix 2 + calmix 3) . S usó una calibración lineal de 6 puntos (aproximadamente Mw: 1300, 2090, 3600, 5700, 8100, 11000 Da) . Optimización del protocolo para colocación MS MALDI Tres diferentes relaciones muestra/matriz se probaron: (i) 1:8; (ii) 1 : 4 ; y (iii) 5:3. Se analizó suero control de ratón adicionado con 200 ng/mL de dos péptidos estándar, renina y calcitonina. Los tres espectros en la Figura 18 indican que la relación 5:3 puede ser el mejor ajuste experimental en vista de los siguientes factores: (i) número de picos detectables en el espectro de suero de ratón; (ii) intensidad absoluta global de picos; y (iii) relación señal a ruido de los péptidos adicionados (calcitonina y renina) . Un protocolo alternativo que apunta a una mejora de la sensibilidad también se probó. Se usaron cuentecillas de sílice de poro pequeño. Después del último lavado, 4 pL de solución de matriz MALDI se agregaron a las cuentecillas, y 1.5 \iL de la suspensión resultante se colocó sobre la placa objetivo de MALDI. Los espectros de MALDI-TOF resultantes dieron una intensidad de señal superior con respecto a una preparación de gotitas secas estándar. Como (i) la presencia de cuentecillas en la suspensión de matriz puede afectar la uniformidad de la cristalización de matriz y puede empeorar la precisión de masa de la medición; (ii) introducir partículas de sílice en el espectrómetro de masas puede provocar alguna pérdida de rendimiento con el tiempo debido a la deposición de estas partículas en el interior del espectrómetro de masas (rejillas de voltaje, etc.), se decidió adoptar condiciones estándar de extracción y una relación 5:3 muestra/matriz para análisis subsecuentes de sueros de ratón. Aquí en lo siguiente, se reportan espectros de MALDI-TOF de suero control de ratón obtenido con el método descrito. Dos diferentes adiciones de péptidos se realizaron con el fin de tener un pico de referencia adicional para comparación con otras preparaciones de MALDI, véase, por ejemplo, la Figura 19. La intensidad de señal de la calcitonina (100 ng/mL adicionada en el suero de ratón) es más alta que con el método estándar de preparación . Incubación de muestras de suero control con cuentecillas nanoporosas El siguiente protocolo se adoptó para análisis de suero de ratón. Prelavado de cuentecillas: 4 x 100 µ?^ de H20. Incubación: 100 yL de suero diluido con 1 mg de cuentecillas, 1 hora a R . Lavados de cuentecillas: 2 x 100 L de ¾0, seguido por un solo lavado de 100 en 0.1% de TFA. Extracción: 80 L de 75/25 CH3CN/0.1% de TFA, incubación de 30 minutos a RT . Preparación de MALDI: relación muestra/matriz de :3. Análisis de MALDI-TOF como se describe antes en este ejemplo. Los espectros mostrados en la Figura 20 se adquirieron en suero control de ratón usando cuatro diferentes cuentecillas (poro pequeño y grande de sílice, poro pequeño de APTES y poro pequeño de MPTMS) . Experimentos en reproducibilidad. Para valorar una reproducibilidad de la preparación de cuentecillas, se emprendieron cinco incubaciones en réplica de suero control de ratón usando 5 x equipos de cuentecillas de sílice de poro grande. El análisis por duplicado de MALDI-TOF para cada incubación rindió 10 espectros. Los 28 picos de intensidad más altos automáticamente detectado por el software peak picking (Applied Biosystems) , los cuales fueron comunes para los 10 espectros, se usaron para análisis estadístico. Después de la normalización en la intensidad de señal total (altura de pico) , se calcularon coeficientes de variación para las intensidades normalizadas (28 picos, 10 réplicas). Los resultados se reportan en la Tabla 3, junto con un espectro típico de MS obtenido. CV promedio en la determinación m/z fue 0.02 %. CV promedio en la altura del pico fue 21.8. Tabla 3. Altura de pico para diez experimentos en réplica (5 incubaciones en réplica, análisis de MALDI-TOF duplicados) de recolección de LM P con cuentecillas de sílice y análisis de MS.

Mura di pico Altura de pico ico Altura de pico Pico mi: .n Altura de pico Altura de pico Altura da p Altura de pico Altura de pico Altura de pico Altura de pico Altura de pico valor p?? en exp tu eip I en exp ? en exp 4 en exp S en exp en exp en exp B en exp 3 en exp promedio Valor CV 905.4 0,05 491 641 528 470 398 393 475 S02 462 47T 473 10.2 1061.8 0.04 2623 2883 2768 2696 2844 2738 2635 3123 21B8 2571 270S 9.1 1823.2 0.02 277 269 353 320 383 304 411 373 519 533 304 22.5 1978.5 0.02 2230 1887 2495 2829 3290 3293 2972 2740 2805 2655 2703 16.0 2082.4 0.02 373 473 308 9 644 605 474 E95 300 332 440 31.1 24*2.5 0.02 51 44 72 T1 74 79 es 67 66 69 B7 18.S 2640.2 o.oi 40 33 51 47 31 33 42 36 41 37 40 ,4 2707.9 0.02 62 51 59 68 52 44 59 48 46 40 53 17.0 2736.5 0.02 160 153 167 69 118 134 1 2 12T 147 32 1 8 12.1 2822.9 0.01 31 29 45 38 37 40 42 36 46 40 38 14.4 3413.6 0,01 31B 322 273 275 172 1 5 212 167 346 304 258 26.7 3497.9 0.01 137 141 118 121 74 es 63 76 1 2 116 109 24.9 3581.1 0.02 S5 49 81 72 48 48 68 60 71 59 61 18.8 3907.3 0.02 41 39 49 42 70 69 55 46 84 76 S7 28.9 404D.6 0.02 89 76 71 87 51 49 59 55 66 50 63 20.3 4061.8 0.02 600 615 511 641 410 418 544 44T 480 402 513 20.3 4069.1 0.02 268 250 231 273 134 145 197 189 178 1 4 201 25.a 4104.S 0.02 1 5 160 127 133 107 120 72 106 120 104 122 24.0 4283.8 0.02 30 30 34 30 27 26 31 25 28 29 29 8.0 4380.9 0.02 24 30 40 20 23 28 36 29 41 37 31 21.2 4533.2 0.02 91 81 54 55 44 45 47 47 47 45 56 30.0 6785.5 0.03 36 36 64 3T 26 28 31 2S 69 66 40 34.7 6327.ß 0.02 400 487 359 364 223 276 301 22ß 579 563 360 33.T 6998.3 0.02 148 174 165 134 79 87 96 80 218 199 138 37.0 6125.5 0.03 T77 666 707 749 48S 47 654 603 723 680 663 20.0 8212.2 0.02 180 105 164 127 103 108 67 110 158 158 136 2T.1 8571.1 0.03 32 31 40 __22_ 24 26 26 29 36 36 31 15.8 S069.S 0.03 54 60 48 39 30 31 H . 33 40 41 41 2S.4 II ESPECT ROMETRIA DE MASAS SELDI Procesamiento de Suero de Animales que Llevan Tumores : Las muestras de suero combinado se proporcionaron a partir de 12 conjuntos de animales como sigue: 1. Combinación de suero control A 2. Combinación de suero control B 3. Combinación de suero control C 4. Suero que lleva tumores día 28 (tumores derivados de células MCF7 clon 8) 5. Suero que lleva tumores dia 28 'tumores derivados de células MCF7 clon 10) 6. Suero que lleva tumores dia 42 [tumores derivados de células MCF7 clon 8) 7. Suero que lleva tumores dia 42 (tumores derivados de células MCF7 clon 10) 8. Control negativo de suero día 60 (animales inyectados con matrigel) 9. Control 1 de suero que lleva tumores día 60 (tumores derivados de la línea celular BT-474) 10. Control 2 de suero que lleva tumores día 60 (tumores derivados de la línea celular MCF7 de línea base) 11. Suero que lleva tumores día 60 (tumores derivados de células MCF7 clon 8) 12. Suero que lleva tumores día 60 (tumores derivados de células MCF7 clon 10) 6 conjuntos de cuentecillas se usaron para incubación con las muestras de sueros combinados. Cada conjunto de cuentecillas contenía 12 equipos de cuentecillas individuales, un equipo para cada una de las 12 combinaciones de sueros. Los conjuntos de cuentecillas usados fueron como sigue: Conjunto A. 10 µp? de diámetro, poro pequeño, sílice Conjunto B. 10 pm de diámetro, poro pequeño, derivadas con APTES, cargadas (+) Conjunto C. 10 µp? de diámetro, poro pequeño, derivadas con MPT S, cargadas (-) Conjunto D. 10 µ?t? de diámetro, poro grande, sílice Conjunto E. 10 µ?? de diámetro, poro grande, derivadas con APTES, cargadas (+) Conjunto F. 10 µp? de diámetro, poro grande, derivadas con MPTMS, cargadas (-) Las muestras de suero se incubaron con los equipos de cuentecillas como sigue. Todos los equipos de cuentecillas se lavaron primero 4 veces en agua grado HPLC antes de la incubación con el suero. Las muestras de suero se descongelaron y diluyeron 1:5 con agua grado HPLC, y 100 µ? del suero diluido se incubaron con el equipo de cuentecillas durante 1 hora a temperatura ambiente. Por ejemplo, 100 µ? de la muestra de suero diluido 1 en lo anterior (suero control combinado A) se incubaron con cada uno de los seis tipos de cuentecillas A hasta F, dando las muestras 1 hasta 6 respectivamente (véase la Tabla 4) . De manera similar, cada uno de las 12 muestras de suero restantes también se incubaron con cada uno de los conjuntos separados de cuentecillas, rindiendo un total de 72 muestras (véase la Tabla 4). Después de la incubación con el suero, las cuentecillas se centrifugaron y el suero agotado se removió. Las cuentecillas entonces se lavaron en agua grado HPLC 2x, y 0.1% de TFA lx, antes de la elución durante 30 minutos en 0.1 % de TFA/acetonitrilo (25:75) a temperatura ambiente. Los eluatos finales (-80 µ?) se recolectaron (72 muestras totales, véase la Tabla 4) y se almacenaron a - 80°C hasta que se procesaron posteriormente. Tabla 4. Clave para muestras de cuentecillas y eluatos (número de muestra) Los eluatos se descongelaron 5 días después de la incubación y 60 µ? del eluato se removieron y concentraron en el SpeedVav a -25 µ? de volumen total para análisis en gel de ID. Tanto el eluato concentrado como las muestras de eluato originales restantes se almacenaron a -8O0C hasta que se procesaron posteriormente para análisis en gel ID y SELDI respectivamente. Todos los eluatos concentrados de cuentecillas se mezclaron con amortiguador de muestra SDS-PAGE, y se separaron en un gel de gradientes de 8-16% de Tris-glicina y se tiñeron con rubí Sypro. Después de desteñir, los geles se fotografiaron usando un sistema BioRad Versadoc. Los resultados de los geles se presentan en las Figuras 21 hasta 29.

Escisión de Bandas de Proteínas de Geles de Eluato para Espectroscopia de Masas en Tándem. Los geles de ID SDS-PAGE de los eluatos de cuentecillas mostraron patrones similares de bandas de proteínas, véanse las Figuras 21-26. El análisis de los geles no puso al descubierto ningún patrón nuevo de bandas de proteínas que pudiera atribuirse a sueros de los animales que llevan tumores en comparación con los sueros combinados de las tres muestras de animales control. También se observó que la carga de proteína varió de muestra a muestra con algunos carriles individuales conteniendo una cantidad significativamente más alta de proteína (véase el Gel 6, carril 8 (muestra 42 en la Tabla 4). Con base en estos resultados, 90 bandas se identificaron para escisión y sumisión para identificación por espectrometría de masas en tándem. El gel 6, el cual separó las muestras de eluatos obtenidas de las cuentecillas de MPTMS de poro grande se seleccionó para el análisis más completo. Cuatro bandas de bajo peso molecular se escindieron de cada carril para determinar si la composición de proteínas de la banda cambió con respecto a la cuentecilla, y todas las bandas principales presentes en el carril 8 (número de muestra 42 correspondiente a suero combinado recolectado de animales que llevan el tumor clon' 10 día 42) . Bandas adicionales de bajo peso molecular se escindieron del gel 4, cuentecillas de poro grande modificadas con APTES, carriles 12 y 13, las cuales correspondieron al suero combinado recolectado de animales que levan el tumor del día 60 del clon 8 y 10 respectivamente. Finalmente, bandas adicionales de la parte superior a al parte inferior del gel se escindieron del carril 6 del gel 5, las cuales correspondieron a los eluatos obtenidos de cuentecillas de poro pequeño de MPTMS, número de muestra 27 (suero recolectado de animales del clon 10 día 28). Las bandas se identificaron y escindieron usando un robot de corte BioRad Gel. Las muestras escindidas se depositaron en los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos y se suministraron al centro de proteómica del CCIC para espectroscopia de masas en tándem. Los patrones de la escisión de geles se muestran en las Figuras 27, 28 y 29 junto con la clave en la Tabla 4. Los resultados de identificación de proteínas que se obtuvieron del análisis espectroscópico de masas en tándem de estas muestras se reporta por el centro de proteómica del CCIC en otra parte en este Ejemplo.

Análisis SELDI de Suero Combinado. Las muestras de suero combinado se removieron del almacenamiento a -80 °C, se descongelaron, y una alícuota de 150 µ? de suero sin purificar se removió y diluyó por la adición de 600 µ? de agua grado HPLC para dar una muestra de suero diluida 1:5 de reserva. 25 µ? del suero sin purificar diluido se removieron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno liquido y se colocaron en almacenamiento a -80 °C hasta que se procesaron para análisis SELDI. Los chips CX2 se cargaron en el Bioreactor, y los puntos de muestras se lavaron con 100 µ? de 10 mM de HC1 durante 5 min a RT . La solución se aspiró, y los puntos se lavaron 2 x en 100 µ? de agua grado HPLC durante 1 min cada enjuague. Los puntos entonces se lavaron 2 x en 100 µ? de 10 mM de acetato de amonio + 0.1% de Tritón X-100 durante 5 minutos cada enjuague. Después de que el amortiguador final se aspiró, los chips WCX2 se removieron del Bioreactor y se dejaron secar al aire a RT . Los chips WCX2 secos se colocaron en el Bioreactor y 5 µ? de muestras diluidas de suero se agregaron a los puntos de muestras y los chips se incubaron durante 55 minutos a RT en una cámara humidificada . Los puntos de chips CX2 se lavaron con 150 µ? de PBS 3 x, después de la incubación de 55 minutos con las muestras de suero. Cada punto se enjuagó entonces con 150 µ? de agua grado HPLC, y el chip se removió del Bioreactor y se dejó secar al aire a RT. La matriz (1 µ? de alfa-CHCA en 50% de acetonitrilo y 0.5% de TFA) se aplicó a cada punto y se secó. La aplicación de la matriz se realizó nuevamente, y el chip se analizó en el espectrómetro de masas PBSII SELDI . Los espectros SELDI resultantes se presentan en las Figuras 30 hasta 32. Análisis SELDI de Eluatos de Cuentecillas . El material del eluato recuperado de cada una de las incubaciones de cuentecillas se examinaron usando un SELDI GoldChip. La muestra de eluato (1 µ?) se aplicó al punto de chip y se dejó secar al aire. La matriz se agregó como se describe en lo anterior y la muestra se analizó usando los siguientes parámetros del instrumento. Los parámetros de lecturas de chip de eluato AU en el intervalo LMW fueron los mismos como se indica en el protocolo para análisis de chips WCX2. Los conjuntos de muestras se analizaron en la misma secuencia que se aplica a los geles de gradientes ID SDS-PAGE en lo anterior. Las 72 muestras de eluato se han analizado, y se han obtenido espectros por duplicado . Clave para espectros SELDI de eluatos de cuentecillas. Los números de muestra, indicados a la derecha de los espectros, se refieren a los números de muestra correspondientes a aquellos presentados en la Tabla 4. Cada uno de los eluatos de cuentecillas se analizó por duplicado como se indica en los espectros por el número de muestra x-1 y número de muestra x-2. Cada conjunto de muestras aplicado a un gel ID individual (véanse las Figuras 21 hasta 26) se analizó en secuencia como se aplica al gel.

Por lo tanto las Figuras 35A, 35B, y 35C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel 1 (Figura 21) ; las Figuras 34A, 34B, y 34C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel número 2 (Figura 22) ; las Figuras 35A, 35B, y 35C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel número 3 (Figura 23); la Figura 36A, 37B, y 37C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel número 4 (Figura 24); la Figura 37 A, 38B, y 38C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel número 5 (Figura 25) ; y la Figura 38A, 39B, y 39C representan espectros SELDI de muestras de eluato aplicadas al gel número 6 (Figura 26) .

III ESPECTROMETRÍA DE MASAS LC/ S (OSU CCIC) Digestión en Gel e Identificación de Proteínas por nano LC/MS/MS. Un total de 100 bandas de ID SDS-PAGE se digirieron y analizaron por nano LC/MS/MS. Los resultados detallados se resumieron en la Tabla 5. 707 proteínas se identificaron a partir de las 100 bandas examinadas. Entre ellas, 225 queratinas o proteínas relacionadas con queratina se identificaron. Se usó tripsina para la digestión, por lo tanto la tripsina y proteínas relacionadas con tripsina también se identifican en las muestras con un total de 145 tripsinas o proteínas relacionadas con tripsina identificadas. Finalmente, se usó Lisozima como un estándar interno para garantizar el rendimiento del instrumento y se identificó 80 veces (Tabla 6) . Después de remover las coincidencias con queratina, lisozima y tripsina, el número total de proteínas significativas de las 100 bandas del gel identificadas es 257. Como se muestra en la Tabla 5, la mayor parte de las proteínas se identificaron múltiples veces dentro de diferentes carriles/bandas. Por ejemplo, la cadena beta-1 de hemoglobina se identifica varias veces en diferentes carriles/bandas. Después de contar cada ID de proteína sólo una vez, 154 proteínas únicas se identificaron (Véase la Tabla 6) . Entre ellas, 64 se identificaron como queratina o proteínas relacionadas con queratina, 5 se identificaron como tripsina o proteínas relacionadas con tripsina y 6 se identificaron como lisozima. Por lo tanto, 79 proteínas únicas de SUERO se identificaron de manera significativa (Tabla 8) . Los geles se digirieron con tripsina grado secuenciación de Promega (Madison WI) usando el Montage In-Gel Digestión Kit de Millipore (Bedford, MA) siguiendo los protocolos recomendados de fabricaciones. Brevemente, las bandas se recortaron tan cerca como fue posible para minimizar el material de fondo de poliacrilamida y se cortaron en piezas de 2mm*2mm. Las piezas del gel se lavan entonces en 50% de metanol/5% de ácido acético durante una hora. La etapa de lavado se realiza de nuevo una vez antes de que las piezas de gel se deshidraten en acetonitrilo . Las bandas del gel se rehidrataron e incubaron con solución de ditiotertol (DTT) (5mg/ml en 100 mM de bicarbonato de amonio) durante 30 minutos antes de la adición de 15mg/ml de Yodoacetamida en solución 100 mM de bicarbonato de amonio. La yodoacetamida se incubó con las bandas del gel en oscuridad durante 30 min antes de removerse. Las bandas del gel se lavaron nuevamente con ciclos de acetonitrilo y bicarbonato de amonio (lOOmM) en incrementos de 5 min. Después de que los geles se secaron en speed vac, la proteasa se dirige hacia las piezas de gel al rehidratarlas en 50 uL de tripsina modificada de grado secuenciación a 20 yg/mL en 50 mM de bicarbonato de amonio durante 10 min. 20 \x de 50 mM de bicarbonato de amonio se agregaron entonces a las bandas del gel y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante la noche. Los péptidos se extrajeron de las piezas de gel de poliacrilamida con 50% de acetonitrilo y 5% de ácido fórmico varias veces y se combinaron. Las combinaciones extraídas se concentraron en un speed vac a ~25 pL para análisis de nano LC/MS/MS. La espectrometría de masas en tándem por nanoaspersión-cromatografia líquida capilar (Nano-LC/MS/ S) se realizó en un espectrómetro de masas Thermo Finnigan LTQ equipado con una fuente de nanoaspersion operada en modo de ión positivo. El sistema LC fue un sistema Ulti ate™ Plus (LC-Packings A Dionex Co Sunnyvale, CA) con un muestreador automático Famous y conmutador de columna Switchos. 5 microlitros de cada muestra se inyectaron primero en la columna de entrampe (LC-Packings A Dionex Co, Sunnyvale, CA) , y se lavaron con 50 mM de ácido acético. La lumbrera del inyector se conmutó entonces a inyección y los péptidos pueden se eluyeron de la trampa sobre la columna. Una columna de 5 cm 75 µpa ID ProteoPep II C18 (New Objective, Inc. Woburn, MA) se usó para las separaciones cromatográficas . El solvente A era agua que contenía 50mM de ácido acético y el solvente B era acetonitrilo . Los péptidos se eluyeron directamente de la columna hacia el sistema LTQ con una tasa de flujo de 300 nl/min. El gradiente se inició con 2% de B y B se mantuvo a 2% durante los primeros 3 minutos. Entonces B se incrementó a 50% de 3-30 minutos y se incrementó además a 80% de 30-45 minutos. B se mantuvo a 80% durante otros 5 minutos antes de cambiar de nuevo a 2% en 0.1 minutos. La columna se lavó entonces con 98% de A durante 14.9 minutos antes de la siguiente inyección. El tiempo total de operación fue 65 minutos. La secuencia de exploración del espectrómetro de masas se programó para una exploración total y las exploraciones MS/MS de los 10 picos de péptidos más abundantes en el espectro. Se usó exclusión dinámica para excluir múltiples MS/MS del mismo péptido después de detectar y realizar MS/MS 3 veces. La información de secuencias de los datos de MS/MS se procesó usando Mascot Batch para formar una lista de picos (archivo .mgf) y al usar búsqueda MASCOT MS/MS. El procesamiento de datos se realizó siguiendo los lineamientos en Mole. Cell. Proteomics. Los picos asignados tienen un minimo de 10 conteos (S/N de 3) . La precisión de masa de los iones precursores se ajustó a 1.8 Da para acomodar la selección accidental del ión C13 y la precisión de masa de fragmento se ajustó a 0.5 Da. Las modificaciones consideradas (variables) fueron oxidación de metionina y carbamidometilcisteina .

Tabla 5 Muest ID de Proteína Puntu Asenso ra ación Swiss-Prot Al Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 234 gi|2781269 con la Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas beta-hemoglobina 182 gi|229301 cadena beta 1 hemoglobina [Mus musculus] 176 gi 1 183932 alfa globina [Homo sapiens] 74 gi|28549 A2 queratina 1 [Homo sapiens] 545 gi| 17318569 queratina 10 [Homo sapiens] 534 gi|40354192 cadena beta 1 hemoglobina [Mus musculus] 499 gi 1 183932 cadena beta 2 hemoglobinas [Mus musculus] 297 gi 1 183933 alfa globina[Mus musculus] 279 gi 49900 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 235 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas PREVISTO: similar a 12 isofonnas de irs de queratina 6 209 gi|73996330 [Canis familiaris] Queratina 6B [Homo sapiens] 162 gi|21961227 cadena de beta globina [Homo sapiens] 141 66473265 factor de plaqueta 4 [Mus musculus] 87 gi 13560695 LytR de regulador de transcripción unido a la membrana 56 gi|42784428 [Bacillus cereus ATCC 10987] A3 cadena beta 1 hemoglobina [Mus musculus] 509 gi 1 183932 queratina 1 [Homo sapiens] 500 gi 17318569 cadena beta 2 hemoglobinas [Mus musculus] 348 gi| 1 183933 PREVISTO: similar a la queratina 1 ; Queratina- 1 ; 265 gi|55638031 citoqueratina 1 ; proteína alfa del cabello [Pan troglodytes] queratina 10 [Oryctolagus cuniculus] 258 gi 87045985 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 197 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas PREVISTO: similar a 12 isoíbrmas de queratina 6 [Canis 172 gi|73996330 familiaris] alfa globina[Mus musculus] 171 gi 49900 Precursor de tripsina 169 gi 136429 Sub unidad de beta-hemoglobina (cadena de beta- 165 gi| 122643 hemoglobina) (Globina Beta) Cadena de beta globina [Homo sapiens] 157 gi 66473265 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 71 gi 2358087 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 66 gi 435476 A4 Precursor de tripsina 21 1 gi 136429 queratina 1 , tipo IT, citoesqueletal - humano 1 12 gi 7428712 alfa globina [Homo sapiens] 98 gi 28549 lisozima 96 gi 229157 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 72 gi 435476 Subunidad beta de Hemoglobina (cadena beta de 58 gi| 122606 Hemoglobina) (Beta-globin) A5 Cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 515 gi 1 183932 Cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 351 gi 1 183933 Precursor de tripsina 265 gi| 136429 alfa globina [Homo sapiens] 147 gi|28549 citoqueratina epidérmica 2 [Homo sapiens] 75 gi 181402 lisozima 65 gi 229157 A6 Cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 399 gi 1 183932 queratina 1 [Homo sapiens] 370 gi|7331218 Precursor de tripsina 263 gi|l 36429 alfa globina[Mus musculus] 213 gi 49900 queratina 10 [Homo sapiens] 192 gi 40354192 lisozima 67 gi 229157 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi 2358087 A7 transferrina [Mus musculus] 304 gi| 17046471 queratina 1 [Homo sapiens] 244 gi|l 7318569 Inhibidor de ínter alfa tripsina, cadena pesada 4 [Mus 201 gi|9055252 musculus] Precursor de tripsina 162 gi|136429 gelsolina, citosólica - ratón 1 12 gi 90508 Glicoproteína rica en histidina [Mus musculus] 1 11 gi 1 1066003 tiorredoxina [Escherichia coli] 98 gi 148071 Precursor A-I de apolipoproteína - ratón 61 gi 109571 alfa-fetoproteína 53 gi 191765 A8 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 1282 gi 435476 queratina 1 [Homo sapiens] 1235 gi|7331218 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de la 294 gi|3318722 Sanguijuela COMPLEJO DE TRIPSINA PREVISTO: similar a 12 isofonnas de irs de queratina 6 288 gi|73996330 [Canis familiaris] queratina 10 [Homo sapiens] 219 gi 40354192 Subunidad II de queratina epidérmica 130 gi 293686 Precursor A-I de apolipoproteína - ratón 1 12 gi| 109571 lisozima 97 gi 229157 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 61 gi|2358072 Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta SDR 59 gi|77965219 [Burkholderia sp. 383] A9 Cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 469 gi 1 183932 Cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 448 gi|l 183933 queratina 1 [Homo sapiens] 293 gi 17318569 alfa globina[Mus musculus] 256 gi 49900 Precursor de tripsina 208 gi| 136429 PREVISTO: similar a 12 isofonnas de irs de queratina 6 168 gi|73996330 [Canis familiaris] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 103 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas queratina 10 [Homo sapiens 87 gi|40354192 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 59 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] AIO queratina 1 [Homo sapiens] 223 gi| 17318569 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 218 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 1 15 gi 136429 Lisozima C (1 ,4-beta-N-acetilmuramidasa C) 94 gi 471 17006 Al l queratina 16 tipo I; K16 [Homo sapiens] 1301 gi 1 195531 Queratina 14 [Homo sapiens] 1134 gi 17512236 queratina tipo II 492 gi|386849 Queratina 6B [Homo sapiens] 435 gi 21961227 queratina 1 [Homo sapiens] 367 gi 7331218 queratina 5 [Homo sapiens] 349 gi 4557890 PREVISTO: similar a 12 isofonnas de irs de queratina 6 257 gi|73996330 [Canis familiaris] PREVISTO: similar a la queratina 15 [Bos taurus] 209 gi 61813798 Precursor de tripsina 179 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 149 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas PREVISTO: similar a la queratina 8. tipo ? 90 gi|55638407 citoesqueletal - humano [Pan troglodytes] citoqueratina 9 [Homo sapiens] 88 gi 435476 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi 2358087 A12 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 204 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 178 gi 136429 Citoqueratina epidénnica 2 [Homo sapiens] 72 gi 181402 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 Bl Precursor de tripsina 180 gi 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 129 gi 15421856 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 1 1 1 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor del componente complemento C3 97 gi|192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 54 gi 2358087 B2 queratina 1 [Homo sapiens] 195 gi 17318569 Precursor de tripsina 176 gi| 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 124 gi 15421856 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 99 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor del componente complemento C3 72 gi 192392 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 67 gi|2358072 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi 2358087 B3 Precursor de tripsina 275 gi| 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 129 gi 15421856 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 123 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor del componente complemento C3 76 gi 192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 B4 Precursor de tripsina 265 gi 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 125 gi|15421856 lisozima 74 gi|229157 precursor del componente complemento C3 71 gi|192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 B5 Precursor de tripsina 212 gi 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 120 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 75 gi 192392 lisozima 72 gi 229157 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi 2358087 B6 Precursor de tripsina 176 gi 136429 queratina 1 , tipo II, citoesqueletal - humana 142 gi 7428712 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 122 gi 15421856 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 95 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor del componente complemento C3 88 gi| 192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi|2358087 B7 Albúmina 1 [Mus musculus] 1536 gi 29612571 queratina 1 [Homo sapiens] 1518 gi 17318569 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 649 gi 435476 Precursor de tripsina 272 gi 136429 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 259 gi|73996330 [Canis familiaris] Precursor C3 complemento (HSE-MSF) [Contiene: 99 gi| 1352102 cadena beta C3 complemento; cadena alfa de complemento C3 ; C queratina 19 [Homo sapiens] 71 gi 7594734 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi|2358087 Adenilato quinasa [Clonorchis sinensis] 59 gi 22652628 hemoglobina no simbiótica [Alnus firma] 58 gi 84993584 B10 queratina 1 [Homo sapiens] 1448 gi 17318569 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 1294 gi W35476 Queratina 6A [Homo sapiens] 653 gi 14250682 queratina 10 [Homo sapiens] 568 gi 40354192 PREVISTO: similar a Queratina, tipo I citoesqueletal 14 445 gi|76649703 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) 3 isoformas [Bos PREVISTO: similar a irs de queratina 6 [Pan 410 gi|55638029 troglodytes] PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 399 gi|73996330 [Canis familiaris] queratina 16 tipo I; K16 [Homo sapiens] 377 gi 1 195531 Subunidad II de queratina epidérmica 11 347 gi|293686 Complejo de queratina 1 , acídico, gen 14 [Mus 31 1 gi|21489935 musculus] Precursor de tripsina 1 18 gi 136429 PREVISTO: similar a isoforma 4 de tripsinógeno 7 108 gi|73978531 [Canis familiaris] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 94 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas alfa-queratina tipo II ?? [Gallus gallus] 89 gi 46399075 PREVISTO: similar a la queratina, tipo II citoesqueletal 87 gi|62657929 8 (Citoqueratina 8) (Citoqueratina endo A) [Rattus tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi 2358087 deshidrogenasa/reductasa de cadena corta SDR 66 gi|77965219 [Burkholderia sp. 383] B l l Precursor C3 complemento (HSE-MSF) [Contiene: 358 gi| 1352102 cadena beta de complemento C3 ; cadena alfa de complemento C3 ; C Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de la 291 gi|3318722 Sanguijuela COMPLEJO DE TRIPSINA Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 216 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas queratina 1 , tipo II, citoesqueletal - humana 175 gi 7428712 queratina 15 [Homo sapiens] 166 gi 30583361 tiorredoxina [Escherichia coli] 69 gi 148071 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi|2358087 B12 queratina 10 [Homo sapiens] 872 gi 40354192 queratina 1 [Homo sapiens] 827 gi 17318569 Queratina 6A [Homo sapiens] 632 gi 14250682 Queratina 17 [Homo sapiens] 516 gi|48735384 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 465 gi 435476 PREVISTO: similar a la queratina, tipo I citoesqueletal 444 gi|76649703 14 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) 3 isoformas [Bos queratina 437 gi 386848 queratina K5 390 gi 386850 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 310 gi|73996330 [Canis familiaris] queratina tipo 16 283 gi 186685 Precursor de tripsina 275 gi 136429 5 similar a la calmodulina [Homo sapiens] 195 gi 55859601 PREVISTO: similar a la queratina 17 [Pan troglodytes] 184 gi|55644941 queratina 10 tipo I [Protopterus aethiopicus] 84 gi|57335414 PREVISTO: similar a la queratina, tipo II citoesqueletal 80 gi|88988823 8 (Citoqueratina-8) (CK-8) (Keraton-8) (K8) [Homo gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa [Homo sapiens] 62 gi 31645 proteína hipotética FG03380.1 [Gibberella zeae PH-1 ] 57 gi 461 15076 Cl Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 193 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA Proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 156 gi 13560694 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 1 10 gi|73996330 [Canis familiaris] Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 99 gi 21618837 ubiquitina 85 gi 223061 C2 queratina 10 [Oryctolagus cuniculus] 288 gi 87045985 queratina 1 [Homo sapiens] 224 gi 17318569 Precursor de tripsina 179 gi| 136429 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 166 gi 13560694 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 162 gi 21618837 lisozima 99 gi|229157 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 75 gi|435476 ubiquitina 65 gi 223061 Apolipoproteína C-I (Apo-CI) (ApoC-I) 63 gi| l 14017 C3 Precursor de tripsina 241 gi 136429 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 160 gi 13560694 Apolipoproteína ?-? [Mus musculus] 105 gi 21618837 lisozima 67 gi 229157 ubiquitina 64 gi 223061 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] C4 Precursor de tripsina 172 gi 136429 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 126 gi 13560694 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi 2358087 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 61 gi|21618837 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 57 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas C5 Precursor de tripsina 167 gi| 136429 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 127 gi 13560694 queratina 1 [Homo sapiens] 125 gi|7331218 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 58 gi 2358087 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 56 gi 21618837 ubiquitina 64 gi|223061 adenilato quinasa [Clonorchis sinensis] 55 gi 22652628 CIO queratina 1 [Homo sapiens] 1055 gi 7331218 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 508 gi 435476 queratina 10 [Homo sapiens] 414 gi|40354192 Citoqueratina epidérmica 2 [Homo sapiens] 252 gi|181402 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 176 gi|73996330 [Canis familiaris] Precursor de tripsina 166 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 129 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Sub unidad II de queratina epidérmica 86 gi 293686 tiorredoxina [Escherichia coli] 73 gi 148071 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 69 gi|2358072 Cl l apolipoproteína E 374 gi| 192005 queratina 1 [Homo sapiens] 303 gi 7331218 Precursor de tripsina 266 gi| 136429 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 167 gi|73996330 [Canis familiaris] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 85 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas D I Precursor de tripsina 216 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 104 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas lisozima 83 gi 229157 tripsina pancreática 1 [Rattus norvegicus] 65 gi|6981420 Proteína hipotética LOC338797 [Homo sapiens] 55 gi 70673359 D2 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 139 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA citoqueratina epidérmica 2 [Homo sapiens] 93 gi 181402 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 64 gi|2358087 D3 Precursor de tripsina 279 gi 136429 D4 queratina 1 [Homo sapiens] 302 gi 7331218 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 300 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA Desconocido (proteína para MGC: 1 16262) [Rattus 190 gi|71051822 norvegicus] PREVISTO: similar a 12 isofoimas de irs de queratina 6 179 gi|73996330 [Canis familiaris] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 78 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Producto protéico sin nombrar [Oryza sativa (grupo 59 gi|34906342 japónica cultivar)] D5 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 256 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas queratina 1 [Homo sapiens] 230 gi 7331218 Precursor de tripsina 178 gi| 136429 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 121 gi|435476 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 68 gi|2358072 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] D6 Precursor de tripsina 21 1 gi| 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 178 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 7 [Mus musculus] 70 gi|2358072 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi|2358087 D7 Queratina 6A [Homo sapiens] 491 gi|14250682 Queratina 6B [Homo sapiens] 435 gi 21961227 PREVISTO: similar a Queratina, tipo I citoesqueletal 14 372 gi|76649703 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) 3 isoformas [Bos queratina K5 359 gi 386850 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 317 gi 435476 queratina 1 [Homo sapiens] 312 gi 7331218 Precursor de tripsina 259 gi 136429 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 251 gi|73996330 [Canis familiaris] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 144 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tiorredoxina [Escherichia coli] 79 gi| 148071 contratripina=inhibidor de tripsina tipo fetuina [ratones, 73 gi|407619 plasma, Péptido Parcial, 20 aa, segmento 4 de 4] contratripina=inliibido de tripsina tipo fetuina [ratones, 64 gi|407613 plasma, Péptido Parcial, 23 aa, segmento 1 de 4] tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi|2358087 Fetuina [Mus musculus] 60 gi|2546995 D8 hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 324 gi|31982300 musculus] Precursor de tripsina 260 gi| 136429 alfa globina [Mus musculus] 140 gi|49900 apolipoproteína C-TTT [Mus musculus] 129 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 102 gi| 192392 lisozima 66 gi 229157 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 64 gi|21618837 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 64 gi|2358087 hemoglobina no simbiótica [Alnus firma] 64 gi 84993584 D9 Precursor de tripsina 178 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 1 16 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 10 [Mus musculus] 69 gi 2358087 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 55 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] DIO queratina 1 [Homo sapiens] 500 gi| 17318569 Inhibidor ínter alfa tripsina, cadena pesada 4 [Mus 400 gi|9055252 musculus] Precursor de tripsina 261 gi 136429 PREVISTO: similar a 2 isofomias de queratina 4 [Bos 222 gi|76617900 taurus] queratina Kbl 8 tipo II [Rattus norvegicus] 182 gi|57012352 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 175 gi|73996330 [Canis familiaris] complejo de queratina 2, básico, gen 1 [Mus musculus] 165 gi 6678643 queratina Kbl tipo II [Rattus norvegicus] 165 gi|57012354 PREVISTO: similar a la queratina 25A [Canis familiaris] 163 gi 73965965 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 150 gi|435476 queratina larvaria XLK [Xenopus laevis] 141 gi 131 1 1394 tiorredoxina [Escherichia coli] 141 gi|148071 Queratina, tipo II citoesqueletal 4 (Citoqueratina-4) (CK- 135 gi|82654948 4) (Queratina-4) (K4) (Citoesqueletal 57 kDa queratina) Estructura Tridimensional de Escherichia Coli l J gi|230335 Tiorredoxina- S2 a Resolución de 2.8 Angstroms TPA: TPA_exp: queratina Kb40 [Mus musculus] 125 gi 46485130 cadena pesada H4 de inhibidor inter-alfa [Rattus 1 16 gi|9506819 norvegicus] PREVISTO: similar a 1 isoforma de queratina 24 [Bos 1 12 gi|76644680 taurus] producto proteico sin nombre [Mus musculus] 109 gi|26324736 TPA: TPA_exp: queratina Kb36 tipo II [Mus musculus] 103 gi 46485128 queratina 15 tipo I [Protopterus aethiopicus] 102 gi|57335394 tiorredoxina 1 (TR 1) (TRX) [Photorhabdus 100 gi|36787919 luminescens subsp. laumondii TTOl] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 100 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas LOC495267 proteína [Xenopus laevis] 98 gi 54261576 proteína hipotética LOC77055 [Mus musculus] 98 gi 85701680 queratina 6 irs3 [Homo sapiens] 96 gi 27901522 tiorredoxina [Vibrio fischeri ESI 14] 90 gi|59478765 Zgc:92061 [Danio rerio] 90 gi|49902693 queratina 9 [Canis familiaris] 79 gi|62122767 fosfoserina fosfatasa [Picrophilus torridus DSM 9790] 79 gi 48431085 tripsina pancreática 1 [Rattus norvegicus] 78 gi 6981420 Zgc:92035 [Danio rerio] 74 gi|49904349 PREVISTO: similar a la queratina, tipo I citoesqueletal 71 gi|76617986 18 (Citoqueratina 18) (K18) (CK 18) [Bos taurus] queratina 19 [Gallus gallus] 70 gi 45384356 complejo de queratina 2, básica, gen 8 [Mus musculus] 70 gi 13624315 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi|2358087 proteína hipotética LOC496627 [Xenopus tropicalis] 62 gi 58332100 Regulador de transcripción, familia de LytR [Bacillus 58 gi|75760497 thuringiensis serovar israelensis ATCC 35646] PREVISTO: similar a la queratina 5b [Canis familiaris] 57 gi 73996461 serina peptidasa (superfamilia de hidrolasa alfa y beta) 55 gi|72002395 fusionada al dominio no caracterizado N-terminal específico para la cianobacteria [Prochlorococcus marinus str. NATL2A] PREVISTO: similar a la otoqueratina, parcial [Gallus 54 gi|50795725 gallus] Dl l producto proteico sin nombre [Mus musculus] 369 gi 74146433 Precursor de tripsina 182 gi 136429 tiorredoxina [Escherichia coli] 69 gi 148071 lisozima 63 gi 229157 El hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 639 gi|31982300 musculus] cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 636 gi 1 183932 Cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 453 gi 1 183933 alfa globina[Mus musculus] 285 gi|49900 Precursor de tripsina 274 gi 136429 cadena de beta globina [Homo sapiens] 131 gi 66473265 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 101 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi 2358087 E2 cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 476 gi|l 183932 hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 475 gi|31982300 musculus] cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 334 gi| l 183933 Precursor de tripsina 186 gi 136429 alfa globina [Mus musculus] 184 gi|49900 Factor 4 de plaqueta recombinante 54 gi¡209286 E3 Cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 606 gi l 183932 hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 590 gi|31982300 musculus] cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 474 gi 1 183933 alfa globina [Mus musculus] 287 gi 49900 Precursor de tripsina 279 gi 136429 cadena de beta globina [Homo sapiens] 89 gi|66473265 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 66 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas E4 hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 440 gi|31982300 musculus] cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 396 gi| 1 183932 Precursor de tripsina 310 gi|l 36429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 249 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas alfa globina [Mus musculus] 106 gi 49900 Lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidasa C) 100 gi|471 17006 Citoqueratina epidémica 2 [Homo sapiens] 75 gi 181402 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 59 gi 21618837 EI O PREVISTO: similar a la queratina, tipo I citoesqueletal 31 1 gi|76649703 14 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) 3 isoformas [Bos gelsolina, citosólica - ratón 228 gi|90508 Precursor de tripsina 1 13 gi 136429 tiorredoxina [Escherichia coli] 81 gi 148071 El l Precursor de tripsina 180 gi 136429 lisozima 86 gi 229157 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 61 gi|2358087 Fl Precursor de tripsina 210 gi 136429 beta hemoglobina 136 gi 229255 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 129 gi 15421856 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 77 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor del componente complemento C3 72 gi 192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 64 gi 2358087 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 60 gi 21618837 F2 Precursor de tripsina 215 gi 136429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 120 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 83 gi 192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 60 gi|21618837 F3 queratina 1 [Homo sapiens] 264 gi 7331218 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 247 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 182 gi 136429 queratina 10 [Homo sapiens] 179 gi 40354192 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 1 19 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 79 gi|192392 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 62 gi|21618837 F4 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 336 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 236 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas apolipoproteína C-III [Mus musculus] 1 12 gi| 15421856 citoqueratina epidémica 2 [Homo sapiens] 72 gi 181402 precursor del componente complemento C3 69 gi| 192392 F5 Precursor de tripsina 258 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 148 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas apolipoproteína C-III [Mus musculus] 122 gi|15421856 queratina 1. tipo IT, citoesqueletal - humana 1 17 gi|7428712 precursor del componente complemento C3 104 gi| 192392 alfa globina [Mus musculus] 69 gi 49900 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 63 gi 21618837 F6 queratina 1 [Homo sapiens] 749 gi|17318569 queratina 5 [Rattus norvegicus] 469 gi 33519156 PREVISTO: similar a 2 isoformas de queratina 4 [Bos 428 gi|76617900 taurus] Citoqueratina epidémica 2 [Homo sapiens] 394 gi 181402 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 376 gi|73996330 [Canis familiaris] PREVISTO: similar a la queratina, tipo I citoesqueletal 307 gi|76649703 14 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) 3 isoformas [Bos Precursor de tripsina 264 gi 136429 Subunidad II de queratina epidérmica 222 gi|293686 lisozima 94 gi 229157 Albúmina 1 [Mus musculus] 87 gi 29612571 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi|2358087 Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta SDR 66 gi|77965219 [Burkholderia sp. 383] Fl l hemoglobina, cadena principal adulta beta [Mus 495 gi|31982300 musculus] cadena de beta 1 de hemoglobina [Mus musculus] 427 gi 1 183932 queratina 1 [Homo sapiens] 333 gi 7331218 Precursor de tripsina 268 gi 136429 cadena de beta 2 de hemoglobina [Mus musculus] 216 gi 1 183933 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 184 gi 435476 alfa globina[Mus musculus] 141 gi|49900 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 100 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] Gl Precursor de tripsina 267 gi 136429 queratina 1 [Homo sapiens] 198 gi 7331218 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 164 gi 21618837 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 134 gi|l 3560694 ubiquitina 121 gi|223061 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 93 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas G2 queratina 1 [Homo sapiens] 621 gi|17318569 queratina 10 [Homo sapiens] 344 gi 40354192 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 338 gi 435476 citoqueratina epidérmica2 [Homo sapiens] 293 gi 181402 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 270 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 261 gi 136429 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 179 gi|73996330 [Canis familiaris] pro teína básica de plaquetas [Mus musculus] 143 gi 13560694 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 130 gi 21618837 Lisozima C (1 ,4-beta-N-acetilmuramidasa C) 124 gi 471 17006 subunidad II de queratina epidérmica 92 gi 293686 ubiquitina 66 gi|223061 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 64 gi 2358087 alfa globina [Homo sapiens] 62 gi 28549 G3 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 197 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 173 gi|l 36429 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 147 gi 21618837 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 139 gi 13560694 ubiquitina 78 gi 223061 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi|2358087 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 55 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] G4 Precursor de tripsina 184 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 150 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas PREVISTO: similar a isoforma 2 de queratina 1 [Bos 139 gi|76617876 taurus] proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 128 gi| 13560694 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 96 gi|21618837 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 54 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] G5 Precursor de tripsina 172 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 147 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 127 gi 13560694 ubiquitina 63 gi 223061 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 60 gi 21618837 G6 Inhibidor de inter alfa-tripsina, cadena pesada 4 [Mus 1044 gi|16741341 musculus] queratina 1 [Homo sapiens] 736 gi 17318569 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 483 gi|435476 Precursor de tripsina 253 gi| 136429 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 177 gi|73996330 [Canis familiaris] tiorredoxina [Escherichia coli] 1 14 gi 148071 producto proteico sin nombre [Homo sapiens] 1 1 1 gi|28317 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 107 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas gelsolina, citosólica - ratón 74 gi 90508 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 G7 apolipoproteína E 814 gi|192005 Precursor de tripsina 245 gi| 136429 inhibidor inter alfa- tripsina, cadena pesada 4 [Mus 213 gi|9055252 musculus] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 149 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor A-I de apolipoproteína - ratón 86 gi 109571 G8 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 390 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 74 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 G9 Precursor de tripsina 271 gi 136429 apolipopro teína C-III [Mus musculus] 1 16 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 80 gi|192392 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi 2358087 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 57 gi 21618837 hemoglobina no simbiótica [Alnus firma] 55 gi|84993584 G10 Queratina 6A [Homo sapiens] 1409 gi 15559584 queratina 6C [Homo sapiens] 1346 gi 17505189 queratina 6B [Homo sapiens] 1295 gi|5031841 K6e isoformas de queratina 6 [Homo-sapiens] 1245 gi|27465517 Queratina 6B [Homo sapiens] 1240 gi 21961227 queratina 1 [Homo sapiens] 1 182 gi|17318569 queratina 10 [Homo sapiens] 938 gi 40354192 PREVISTO: similar a irs de queratina [Pan troglodytes] 765 gi 55638029 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 440 gi 435476 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 387 gi|73996330 [Canis familiaris] Precursor de tripsina 180 gi 136429 queratina 19 [Homo sapiens] 85 gi 7594734 proteína hipotética FG03380.1 [Gibberella zeae PH-1] 61 gi|461 15076 Gi l Precursor de tripsina 219 giH 36429 apolipoproteína C-III [Mus musculus] 1 19 gi 15421856 precursor del componente complemento C3 94 gi| 192392 Hl Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 232 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 183 gi| 136429 H2 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 214 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas Precursor de tripsina 188 gi 136429 H3 Precursor de tripsina 182 gi| 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 96 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas producto proteico sin nombre [Tetraodon nigroviridis] 63 gi 47227197 H4 Precursor de tripsina 161 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 100 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 10 [Mus musculus] 66 gi 2358087 H5 Precursor de tripsina 259 gi 136429 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 148 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas tripsinógeno 10 [Mus musculus] 62 gi 2358087 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] H6 Proteína Gsn [Mus musculus] 1 1 11 gi 18606238 queratina 1 [Homo sapiens] 404 gi 7331218 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 399 gi 435476 inhibidor ínter alfa-tripsina, cadena pesada 4 [Mus 399 gi|9055252 musculus] Precursor de tripsina 178 gi 136429 tiorredoxina [Escherichia coli] 103 gi|148071 lisozima 70 gi 229157 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 64 gi 2358087 H7 producto proteico sin nombre [Mus musculus] 856 gi 74146433 queratina 1 [Homo sapiens] 273 gi 17318569 citoqueratina epidérmica2 [Homo sapiens] 269 gi 181402 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 21 1 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA queratina 10 [Oryctolagus cuniculus] 156 gi|87045985 tiorredoxina [Escherichia coli] 84 gi 148071 tromboespondina 65 gi 554390 H8 Precursor de tripsina 305 gi| 136429 Factor II de coagulación [Mus musculus] 185 gi 15489100 PREVISTO: similar a isoforma 2 de queratina 1 [Bos 135 gi|76617876 taurus] Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina 127 gi|2781269 con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales Cargadas precursor A-I de apolipoproteína - ratón 107 gi 109571 PREVISTO: similar a isoforma 4 de tripsinógeno 7 96 gi|73978531 [Canis familiaris] tripsinógeno 10 [Mus musculus] 68 gi 2358087 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] H9 queratina 1 [Homo sapiens] 426 gi 7331218 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 280 gi|21618837 Precursor de tripsina 267 gi 136429 citoqueratina 9 [Homo sapiens] 156 gi|435476 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 103 gi|13560694 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 69 gi 2358087 H10 Queratina 6A [Homo sapiens] 1851 gi 15559584 queratina 6C [Homo sapiens] 1802 gi 17505189 TPA: TPA_exp: queratina tipo II K6h [Homo sapiens] 1665 gi|32964837 queratina 6 isoform K6e [Homo sapiens] 1650 gi 27465517 Queratina 6B [Homo sapiens] 1581 gi 21961227 queratina 10 [Homo sapiens] 1 196 gi 40354192 queratina 1 [Homo sapiens] 1 190 gi 17318569 Queratina 5 [Homo sapiens] 1076 gí| 18999435 proteína de subunidad queratina tipo II 871 gi 386854 subunidad II de queratina epidemial 603 gi 293686 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de queratina 6 601 gi|73996330 [Canis familiaris] citoqueratina 9 [Homo sapiens] 575 gi 435476 queratina 3 [Homo sapiens] 458 gi 42760012 tipo II alpha-queratina HA [Gallus gallus] 326 gi|46399073 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela 315 gi|3318722 COMPLEJO DE TRIPSINA Queratina tipo I de filamento intermediario K15 [Ovis 279 gi|3550539 aries] queratina 10 tipo I [Protopterus aethiopicus] 100 gi|57335414 PREVISTO: similar a isoforma 4 de tripsinógeno 7 97 gi|73978531 [Canis familiaris] queratina 19 [Homo sapiens] 91 gi 7594734 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 74 gi 2358072 proteína hipotética FG03380.1 [Gibberella zeae PH- 1] 61 gi 461 15076 LytR del regulador de transcripción enlazado a la 56 gi|42784428 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] Hl l Precursor de tripsina 85 gi 136429 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 80 gi 13560694 glicosiltransferasa posible [Synechococcus sp. WH 8102] 65 gi 33632163 queratina 10 [Homo sapiens] 57 gi 40354192 Apolipoproteína ?-? [Mus musculus] 56 gi 21618837 Tabla 6 Veces Puntuac Ascenso identifií Muestra Proteína ID ión Swiss-Prot adas B9 Adenilato quinasa [Clonorchis sinensis] 59 gi|22652628 2 B7 Albúmina 1 [Mus musculus] 1536 gi|296 12571 3 A5 alfa globina [Homo sapiens] 147 g¡|28549 4 C7 alfa-fetoproteína 61 gi| 1 1 765 2 C8 alfa globina[Mus musculus] 321 gi|49900 16 Análisis de la Estabilización de la Lisozima de Gallina con La Hélice Dipolo y Cadenas Laterales G2 Cargadas 270 gi|278 1269 59 E7 Proteína Apoa4 [Mus musculus] 475 g¡| 14789706 1 A8 precursor A-I de apolipoproteína - ratón 1 12 gi| 109571 5 H9 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 280 gi|2 1 61 8837 22 C9 Apolipoproteína C2 [Mus musculus] 67 gi|817943 1 E8 Apolipoproteína C-I (Apo-CI) (ApoC-I) 67 gi| l 1401 7 2 Fl Apolipoproteína C-III [Mus musculus] 129 gi| 1 542 1 856 15 G7 Apolipoproteína E 814 gi| 192005 2 apolipoproteína J; SGP-2; TRPM-2 [Mus F7 musculus] 94 gi|6273853 1 C8 beta globina [Callicebus torquatus] 124 gi|334 1 5435 1 C8 cadena de beta globina [Homo sapiens] 134 gi|66473265 6 C8 beta- 1 -globina [Mus musculus] 432 gi|4760586 1 B12 Proteína 5 similar a calmodulina [Homo sapiens] 195 gi|5585960 l 1 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de F4 Sanguijuela COMPLEJO DE TRIPSINA 336 gi|33 18722 10 H8 Factor II de Coagulación [Mus musculus] 185 gi| 15489100 2 Precursor de Complemento C3 (HSE-MSF) [Contiene: Cadena beta de complemento C3; F7 Cadena alfa de complemento C3; C 540 gi| l 352102 3 F5 precursor del componente complemento C3 104 gi| 192392 15 contratripina=inhibitor tripsina tipo fetuina [ratón, D7 plasma, Péptido Parcial, 20 aa, segmento 4 de 4] 73 gi|407619 2 B8 precursor de cistatina C [Mus musculus] 98 gi| 1 1762010 1 FI O citoqueratina 9 [Homo sapiens] 1608 gi|435476 27 B9 citoqueratina epidérmica 2 [Homo sapiens] 700 gi|181402 12 H10 subunidad II de queratina epidemial 603 gi|293686 6 D7 fetuina [Mus musculus] 60 g¡|2546995 1 Familia CpaB de proteína de ensamble pilus de Flp B8 [Burkholderia thailandensis E264] 57 gi|83719123 1 E10 gelsolina, citosólica - ratón 228 gi|90508 6 deshidrogenasa de gliceraldehído-3 -fosfato [Homo B12 sapiens] 62 gi|3 1645 1 H6 Proteína Gsn [Mus musculus] 1 1 1 1 gi|l 8606238 1 C8 cadena beta 2 hemoglobinas [Mus musculus] 493 gi| 1 183933 1 1 El cadena beta 1 hemoglobina [Mus musculus] 636 gi| l 183932 14 Subunidad de hemoglobina alfa (Cadena C8 hemoglobina alfa) (Alfa-globina) 96 g¡|122405 1 Subunidad de hemoglobina alfa (Cadena C8 hemoglobina alfa) (Alfa-globina) 172 gi| 122474 1 Fl hemoglobina beta 136 gi|229255 2 Al hemoglobina beta 182 gi|229301 1 SubunidadHemoglobina beta (Cadena de A4 Hemoglobina beta) (Beta-globina) 58 gi| 122606 1 SubunidadHemoglobina beta (Cadena de A3 Hemoglobina beta) (Beta-globina) 165 gi| 122643 2 hemoglobin, cadena principal adulta beta [Mus El musculus] 639 gi|3 1982300 10 A7 glicoproteína rica en histidina [Mus musculus] 1 1 1 gi| l 1066003 1 proteína hipotética FG03380.1 [Gibberella zeae H10 PH-1] 61 gi|461 15076 3 DI Proteína hipotética LOC338797 [Homo sapiens] 55 gi|70673359 1 proteína hipotética LOC496627 [Xenopus DIO tropicalis] 62 gi|58332100 1 DIO proteína hipotética LOC77055 [Mus musculus] 98 gi|85701680 1 proteína hipotética SAV6338 [Streptomyces B7 avermitilis MA-4680] 62 gi|29832880 1 Inhibidor Inter alfa-tripsina, cadena pesada 4 [Mus G6 musculus] 1044 gi| 16741341 1 Inhibidor Inter alfa-tripsina, cadena pesada 4 [Mus DI O musculus] 400 gi|9055252 6 Inhibidor H4 Inter-alfa, cadena pesada [Rattus D 10 norvegicus] 116 g¡|9506819 1 Queratina tipo I de filamento intermediario K15 H10 [Ovisaries] 279 gi|3550539 1 B12 queratina 437 gi|386848 1 B7 queratina 1 [Homo sapiens] 1518 g¡| 17318569 21 FIO queratina 1 [Homo sapiens] 2235 gi|73312l8 18 B6 queratina 1 , tipo ?, citoesqueletal - human 142 gi|74287!2 4 H10 queratina 10 [Homo sapiens] 1196 gi|40354192 18 C2 queratina 10 [Oryctolagus cuniculus] 288 gi|87045985 4 All Queratina 14 [Homo sapiens] 1134 gi| 17512236 2 BU queratina 15 [Homo sapiens] 166 gi|3058336l 1 B12 Queratina 17 [Homo sapiens] 516 gi|48735384 1 D 10 queratina 19 [Gallus gallus] 70 gi|45384356 1 H10 queratina 19 [Homo sapiens] 91 gi|7594734 4 H10 queratina 3 [Homo sapiens] 458 gi|427600l2 1 H10 Queratina 5 [Homo sapiens] 1076 gi| 18999435 1 Al 1 queratina 5 [Homo sapiens] 349 gi|4557890 1 FIO queratina 5 [Rattus norvegicus] 469 gi|33519!56 1 DIO queratina 6 irs3 [Homo sapiens] 96 gi|2790l522 1 H10 queratina 6 isoform 6e [Homo sapiens] 1650 gi|27465517 2 B10 Queratina 6A [Homo sapiens] 653 gi|14250682 3 H10 Queratina 6 A [Homo sapiens] 1851 gi|15559584 2 H10 Queratina 6B [Homo sapiens] 1581 si|21961227 5 G10 queratina 6B [Homo sapiens] 1295 g¡|5031841 H10 queratina 6C [Homo sapiens] 1802 gi| 17505 189 DI O queratina 9 [Canis familiaris] 79 g¡|62122767 complejo 1 de queratina, acídico, gen 14 [Mus B 10 musculus] 31 1 gi|21489935 complejo 2 de queratina, básico, gen 1 [Mus DI O musculus] 165 gi|6678643 complejo 2 de queratina, básico, gen 8 [Mus DIO musculus] 70 gi| 13624315 B12 queratina K5 390 gi|386850 B12 queratina tipo 16 283 gi| 186685 Al 1 queratina tipo II 492 gi|386849 Queratina, tipo II citoesqueletal 4 (Citoqueratina-4) (CK-4) (Queratina-4) (K4) (Citoesqueletal 57 kDa DI O queratina) 135 gi|82654948 DIO queratina XLK larval [Xenopus laevis] 141 gi| 13 1 1 1394 DIO Proteína LOC495267 [Xenopus lavéis] 98 gi|54261576 C2 Lisozima 99 gi|229157 B8 Lisozima 73 gi|8412 17 G2 Lisozima C (1 ,4-beta-N-acetilmuramidasa C) 124 gi|471 17006 3 E6 Lisozima C-3 (1 ,4-beta-N-acetilmuramidasa) 76 gi| 126595 2 glicoproteína de superficie principal [Pneumocystis E5 carinii f. sp. Hominis] 59 gi|3560519 1 LytR del regulador de transcripción enlazado a la H8 membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] 56 gi|42784428 13 E7 queratina 9 mutante [Homo sapiens] 102 gi| 1890020 1 D8 hemoglobina no simbiótica [Alnus firma] 64 gi|84993584 3 DI O tripsina 1 pancreática [Rattus norvegicus] 78 gi|6981420 2 B8 parvalbúmina [Mus musculus] 77 gi|509139 1 fosfoserina fosfatasa [Picrophilus torridus DSM DIO 9790] 79 gi|4843 1085 1 C2 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 166 gi| 13560694 15 A2 factor de plaqueta 4 [Mus musculus] 87 gi|13560695 1 glicosiltransferasa posible [Synechococcus sp. WH Hl l 8102] 65 gi|33632163 1 PREVISTO: similar a queratina 1 isoforma 2 [Bos B8 taurus] 243 gi|76617876 5 PREVISTO: similar a queratina 1 ; Queratina- 1 ; citoqueratina 1 ; alfa proteína de cabello [Pan FI O troglodytes] 697 gi|5563803 l 2 Al 1 PREVISTO: similar a queratina 15 [Bos taurus] 209 gi|61813798 1 PREVISTO: similar a queratina 17 [Pan B12 troglodytes] 184 gi|55644941 1 PREVISTO: similar a queratina 24 isoforma 1 DIO [Bos taurus] 1 12 gi|76644680 1 PREVISTO: similar a queratina 25A [Canis DIO familiaris] 163 gi|73965965 1 PREVISTO: similar a queratina 4 isoforma 2 [Bos FIO taurus] 428 gi|76 17900 2 PREVISTO: similar a queratina 5b [Canis DIO familiaris] 57 gi|7399646 l 1 PREVISTO: similar a queratina 6 irs [Pan G10 troglodytes] gi|55638029 PREVISTO: similar a 12 isoformas de irs de H10 queratina 6 [Canis familiaris] 601 gi|73996330 24 PREVISTO: similar a queratina 8, tipo II Al l citoesqueletal - humano [Pan troglodytes] gi|55638407 PREVISTO: similar a Queratina, tipo T citoesqueletal 14 (Citoqueratina 14) (K14) (CK 14) B 10 isoform 3 [Bos g¡|76649703 5 PREVISTO: similar a Queratina, tipo I citoesqueletal 18 (Citoqueratina 18) (K18) (CK 18) DIO [Bos taurus] 71 gi|76617986 1 PREVISTO: similar a Queratina, tipo II citoesqueletal 5 (Citoqueratina 5) (K5) (CK 5) (58 B8 kDa cytokerat 262 g¡|739963 l 2 1 PREVISTO: similar a Queratina, tipo II citoesqueletal 8 (Citoqueratina 8) (Citoqueratina B10 endo A) [Rattus gi|62657929 PREVISTO: similar a Queratina, tipo II citoesqueletal 8 (Citoqueratina-8) (CK-8) B12 (Keraton-8) (K8) [Homo 80 g¡|88988823 1 PREVISTO: similar a otoqueratina, parcial [Gallus DI O gallus] 54 g¡|50795725 1 PREVISTO: similar a isoforma 4 de tnpsinógeno 7 B 10 [Canis familiaris] 108 gi|73978531 4 B8 profilin 1 [Mus musculus] 1 1 1 gi|562()6029 1 E2 factor recombinante de plaqueta 4 54 gi|209286 1 serina peptidasa (superfamilia alfa/beta hidrolasa)fusionada a dominio específico no caracterizado N-terminal a cianobacteria DIO [Prochlorococcus marinus str. NATL2A] 55 gi|72002395 1 Deshidrogenasa de cadena corta/reductasa SDR FIO [Burkholderia sp. 383] 66 gi|77965219 3 DIO tiorredoxina [Escherichia coli] 141 gi| 148071 12 D 10 tiorredoxina [Vibrio fischeri ES 1 14] 90 gi|59478765 1 tiorredoxina 1 (TRX1) (TRX) [Photorhabdus DIO luminescens subsp. laumondii TTOl] 100 gi|36787919 1 Estructura Tri-dimensional de Escherichia Coli DIO Tiorredoxina- S2 a Resolución de 2.8 Angstroms 133 gi¡230335 1 H7 trombospondina 65 gi|554390 1 D 10 TPA: TPA_exp: queratina Kb40 [Mus musculus] 125 gi¡46485130 1 TPA: TPA_exp: queratina tipo II K6h [Homo H10 sapiens] 1665 gi|32964837 1 TPA: TPA_exp: queratina tipo II Kb36 [Mus DIO musculus] 103 gi|46485128 1 Regulador Transcripcional, Familia LytR [Bacillus DIO thuringiensis serovar israelensis ATCC 35646] 58 gi|75760497 1 A7 transferrina [Mus musculus] 304 gi| 17046471 1 B8 Transtiretina [Mus musculus 95 gi|56541070 1 C6 Precursor de tripsina (EC 3.4.21.4)- bovino 88 gi|67549 1 E4 Precursor de tripsina 310 gi| 136429 79 A3 tripsinógeno 10 [Mus musculus] 71 g¡|2358087 41 H10 tripsinógeno 7 [Mus musculus] 74 g¡|2358072 6 HIO queratina 10 tipo I [Protopterus aethiopicus] 100 gi|57335414 4 DI O queratina 15 tipo 1 [Protopterus aethiopicus] 102 gi|57335394 1 Al l queratina 16 tipo I; K16 [Homo sapiens] 1301 gi| 1 195531 4 HI O alfa-queratina HA tipo II [Gallus gallus] 326 gi|46399073 1 BIO alfa-queratina I1B tipo II [Gallus gallus] 89 gi|46399075 1 C7 queratina tipo II Kbl [Rattus norvegicus] 319 gi|57012354 2 DIO queratina tipo II Kbl 8 [Rattus norvegicus] 182 gi|57012352 1 FIO proteína de subunidad queratina tipo II 1400 gi|386854 2 Tirosil-tRNA sintetasa [LactobaciUus sakei subsp. F6 sakei 23K] 56 gi|81428383 1 Gl ubiquitina 121 gi|223061 8 Desconocido (proteína para MGC: 1 16262) [Rattus D4 norvegicus] 190 gi|7105 1822 1 E8 desconocido [Theileria lestoquardi] 207 gi|82622379 1 G6 producto proteico sin nombre [Homo sapiens] 1 1 1 gi|28317 1 C8 producto proteico sin nombre [Mus musculus] 352 gi| 12845853 1 DIO producto proteico sin nombre [Mus musculus] 109 gi|26324736 1 H7 producto proteico sin nombre [Mus musculus] 856 gi|74146433 2 producto proteico sin nombre [Oryza sativa (grupo D4 japónica cultivar)] 59 gi|34906342 1 producto proteico sin nombre [Tetraodon nigroviridis] 63 gi|47227197 1 Zgc:92035 [Danio rerio] 74 gi|49904349 1 Zgc:92061 [Danio rerio] 90 gi|49902693 1 Números Totales 707 queratina o proteínas relacionadas queratina 225 Tripsina o proteínas relacionadas a tripsina 145 Lisozima o proteínas relacionadas a lisozima 80 Números de proteína Totales sin queratina/tripsina/lisozima 257 Números de proteína única 154 queratina o proteínas relacionadas a queratina 64 tripsina o proteínas relacionadas a tripsina 7 lisozima o proteínas relacionadas a lisozima 6 Números de proteína única sin queratina/tripsina/lisozima 77 Tabla 7 Puntuac Ascenso Veces Muestra Pro teína ID ión Swiss-Prot Identificadas H9 Apolipoproteína A-II [Mus musculus] 280 gi|2 1 18837 22 C8 alfa globina[Mus musculus] 321 gi|49900 16 C2 proteína básica de plaquetas [Mus musculus] 166 gi| 13560694 15 Fl apolipoproteína C-TTT [Mus musculus] 129 g¡| 1 542 1 856 1 5 precursor del componente complemento C3 104 gi| 192392 cadena beta 1 hemoglobina [Mus musculus] 636 gi| i 183932 LytR del regulador de transcripción enlazado a la membrana [Bacillus cereus ATCC 10987] 56 gi|42784428 tiorredoxina [Escherichia coli] 141 gi| 148071 cadena beta 2 hemoglobinas [Mus musculus] 493 g¡| 1 183933 hemoglobin, cadena principal adulta beta [Mus musculus] 639 gi|31982300 Cadena E, Inhibidor de Triptasa Derivado de Sanguijuela COMPLEJO DE TRIPSINA 336 gi|33 18722 ubiquitina 121 gi|22306 l Inhibidor Inter alfa-tripsina, cadena pesada 4 [Mus musculus] 400 gi|9055252 gelsolina, citosólica - ratón 228 gi|90508 cadena de beta globina [Homo sapiens] 134 gi|66473265 precursor A-I de apolipoproteína - ratón 1 12 gi| 109571 alfa globina [Homo sapiens] 147 gi|28549 Albúmina 1 [Mus musculus] 1536 gi|29612571 Precursor de Complemento C3 (HSE-MSF) [Contiene: Cadena beta de complemento C3; Cadena alfa de complemento C3; C 540 gi| 1352 102 Deshidrogenasa de cadena corta/reductasa SDR [Burkholderia sp. 383] 66 gi|779652 l 9 hemoglobina no simbiótica [Alnus firma] 64 gi|84993584 proteína hipotética FG03380.1 [Gibberella zeae PH-1] 61 g¡|461 15076 H7 producto proteico sin nombre [Mus musculus] 856 gi|74146433 2 G7 apolipoproteína E 814 gi| 192005 2 H8 Factor II de Coagulación [Mus musculus] 185 gi| 15489100 2 Subunidad Hemoglobina beta (Cadena de A3 Hemoglobina beta) (Beta-globina) 165 gi| 122643 2 Fl hemoglobina beta 136 gi|229255 2 contratripina=inhibidor tripsina tipo fetuina [ratón, plasma, Péptido Parcial, 20 aa, D7 segmento 4 de 4] 73 gi|407619 E8 Apolipoproteína C-I (Apo-CI) (ApoC-I) 67 gi| 1 14017 C7 alfa-fetoproteína 61 gi|191765 B9 adenilato quinasa [Clonorchis sinensis] 59 gi|22652628 H6 Proteína Gsn [Mus musculus] 1 1 1 gi| 1 8606238 Inhibidor Inter alfa-tripsina, cadena pesada 4 G6 [Mus musculus] 1044 gi| 16741341 E7 Proteína Apoa4 [Mus musculus] 475 gi| 14789706 1 C8 beta-l -globina [Mus musculus] 432 gi|4760586 I Paite superior de Forma C8 producto proteico sin nombre [Mus musculus] 352 g¡| 12845853 1 A7 transferrina [Mus musculus] 304 gi| 17046471 1 E8 desconocido [Theileria lestoquardi] 207 g¡|82622379 1 proteína 5 similar a calmodulina [Homo B 12 sapiens] 195 gi|55859601 1 Desconocido (proteína para MGC: 1 16262) D4 [Rattus norvegicus] 190 gi|7105 1822 I Al hemoglobina beta 182 2ÍI229301 Subunidad de hemoglobina alfa (Cadena C8 hemoglobina alfa) (Alfa-globina) 172 gi| 122474 Estructura Tri-dimensional de Escherichia Coli Tiorredoxina- S2 a Resolución de 2.8 DI O Angstroms 133 gi|230335 C8 beta globina [Callicebus torquatus] 124 gi¡33415435 Inhibidor H4 Inter-alfa, cadena pesada [Rattus DI O norvegicus] 1 16 gi|9506819 A7 glicoproteína rica en histidina [Mus musculus] 1 1 1 gi| 1 1066003 B8 profilin 1 [Mus musculus] 1 1 1 gi|56206029 G6 producto proteico sin nombre [Homo sapiens] 1 1 1 gi|283 17 DI O producto proteico sin nombre [Mus musculus] 109 g¡|26324736 tiorredoxina 1 (TRX1) (TRX) [Photorhabdus DI O luminescens subsp. laumondii TTOl ] 100 gi|367879 l 9 B8 precursor de cistatina C [Mus musculus] 98 g¡| l 1762010 D IO proteína hipotética LOC77055 [Mus musculus] 98 gi|85701680 DIO Proteína LOC495267 [Xenopus laevis] 98 gi|54261576 Subunidad de hemoglobina alfa (Cadena C8 hemoglobina alfa) (Alfa-globina) 96 gi| 122405 B8 Transtiretina [Mus musculus 95 gi|56541070 apolipoproteína J; SGP-2; TRPM-2 [Mus F7 musculus] 94 gi|6273853 DIO tiorredoxina [Vibrio fischeri ES I 14] 90 g¡|59478765 DIO Zgc:92061 [Danio rerio] 90 gi|49902693 A2 factor de plaqueta 4 [Mus musculus] 87 gi| 13560695 1 fosfoserina fosfatasa [Picrophilus torridus DSM DI O 9790] 79 gi|4843 1085 1 B8 parvalbúmina [Mus musculus] 77 gi|509139 1 D IO Zgc:92035 [Danio rerio] 74 gi|49904349 1 C9 apolipoproteína C2 [Mus musculus] 67 gi|817943 1 glicosiltransferasa posible [Synechococcus sp. Hl l WH 8102] 65 gi|33632163 1 H7 trombospondina 65 gi|554390 1 producto proteico sin nombre [Tetraodon H3 nigroviridis] 63 gi|47227197 1 deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato B 12 [Homo sapiens] 62 gi|3 1645 1 proteína hipotética SAV6338 [Streptomyces B7 avermitilis MA-4680] 62 gi|29832880 1 proteína hipotética LOC496627 [Xenopus DI O tropicalis] 62 gi|58332100 1 D7 fetuina [Mus musculus] 60 gi|2546995 1 producto proteico sin nombre [Oryza sativa D4 (grupo japónica cultivar)] 59 g¡|34906342 1 glicoproteína de superficie principal E5 [Pneumocystis carinii f. sp. hominis] 59 gi|3560519 1 Subunidad Hemoglobina beta (Cadena de A4 Hemoglobina beta) (Beta-globina) 58 gi| 122606 1 Regulador Transcripcional, Familia LytR [Bacillus thuringiensis serovar israelensis DI O ATCC 35646] gi|75760497 Familia CpaB de proteína de ensamble pilus de B8 Flp [Burkholderia thailandensis E264] 2ÍI83719123 Tirosil-tRNA sintetasa [Lactobacillus sakei F6 subsp. sakei 23K] gi|81428383 Proteína hipotética LOC338797 [Homo D 1 sapiens] gi|70673359 1 serina peptidasa (superfamilia alfa/beta hidrolasa) fusionada a dominio específico no caracterizado N-terminal a cianobacteria DIO [Prochlorococcus marinus str. NATL2A] gi|72002395 1 E2 factor recombinante de plaqueta 4 gi|209286 1 Números Totales 257 Números de proteína Única 77 Tabla 8. Resultados de secuenciación de péptidos que muestran secuencias de proteínas obtenidas de eluyentes de cuentecillas de vidrio de tamaño de poro de 17 nm y cuentecillas de vidrio de tamaño de poro de 70 nm.

Péptidos eluidos de cuentecillas de poro de 70 mu Nombre de Proteína Intervalo kDa • Precursor de complemento C4 0- 10 • Precursor de apolipoproteína A-Il 0- 10 O Región de cadena C de Ig gamma- 1 0- 10, 10-25 • Precursor de antitrombina-IIl < 14 • Precursor de apolipoproteína C-I < 14 • Precursor de apolipoproteína C-ÍI <14 O Precursor de proteína básica de plaquetas < I 4 • Precursor de proteína A-4 amiloide del suero < 14 • Precursor de cadena alfa de proteína de unión a C4b < 14 • Precursor de gelsolina, plasma <14 • Precursor de lisozima C 10-25 • Mediador del homólogo 8 de la subunidad de transcripción de ARN 10-25 polimerasa II O Región de cadena C de Ig kappa Precursor de apolipoproteína D • Precursor de selenoproteína P O Precursor de albúmina sérica O Precursor de beta-2-glicoproteína I Precursor del factor H del complemento Precursor de apolipoproteína A-l Precursor de glicoproteína rica en histidina Precursor de apolipoproteína A-I Precursor de apolipoproteína C-I Aldosa reductasa Precursor del complemento C3 Precursor de apolipoproteína ?-? Precursor de apolipoproteína A-IV Precursor del factor B del complemento Región de cadena C de Ig-gamma 3 Péptidos eluidos de cuentecillas de poro de 17 Nombre de proteína Histina H4 Precursor de tetranectina Precursor de proteína de unión a vitamina D • Precursor de transitiretina O Precursor de proteína básica de plaquetas O Región de cadena C de Ig gamma- 1 O Región de cadena C de Ig kappa O Precursor de albúmina sérica 50- 100 • Miembro 4 de la subfamilia golgi A del autoantígeno de golgi 50- 100 O Precursor de beta-2 glicoproteína I 50- 100 O Precursor del factor H del complemento 100+ • Proteína 2 tipo cinesina ISD Precursor de serotransfemina ISD

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones.
REIVINDICACIONES 1. Un método para fraccionar o separar, caracterizado porque comprende (a) proporcionar una muestra que comprende un primer componente y un segundo componente; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; y (c) exponer el material nanoporoso a la muestra, en donde, con la exposición, el material nanoporoso retiene el primer componente y no retiene el segundo componente. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es una muestra de un fluido biológico.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el fluido biológico es suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, fluido seminal, plasma seminal, fluido pleural, ascitis, aspirado de pezón, heces o saliva.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer componente y el segundo componente comprenden péptidos, antígenos, anticuerpos, proteínas, fragmentos de proteínas, ARN o ADN.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un peso molecular del primer componente es inferior a un peso molecular del segundo componente .
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material nanoporoso es un silicio nanoporoso.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material nanoporoso es un material de óxido nanoporoso.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el material de óxido nanoporoso es una sílice nanoporosa.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material nanoporoso es un separador molecular.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material nanoporoso tiene una superficie modificada.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el material nanoporoso tiene una superficie eléctricamente cargada.
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el material nanoporoso tiene una superficie modificada con grupos funcionales .
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato es una película, una oblea, una partícula o un microchip.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque proporcionar el sustrato comprende fabricar el sustrato por una técnica descendente .
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la técnica descendente se selecciona de fotolitografía, litografía por haz de electrones, litografía de rayos X, litografía de UV profunda y litografía de nanoimpresion.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende extraer el primer componente del material nanoporoso.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende lavar el material nanoporoso con la exposición.
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material nanoporoso adsorbe el primer componente.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende analizar el primer componente.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el análisis es analizar por espectrometría de masas, electroforesis en gel, cromatografía, bioensayo o una combinación de los mismos .
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la espectrometría de masas es espectrometría de masas de MALDI-TOF, espectrometría de masas de LC/MS, espectrometría de masas de ESI- S, espectrometría de masas en tándem o espectrometría de masas de SELDI .
22. Un método para analizar una muestra, caracterizado porque comprende (a) proporcionar la muestra; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; y (c) exponer el material nanoporoso a la muestra; y analizar una fracción de la muestra retenida por el material nanoporoso.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la muestra es una muestra de un fluido biológico.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el fluido biológico es suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, fluido seminal, plasma seminal, fluido pleural, ascitis, aspirado de pezón, heces o saliva.
25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fracción retenida comprende péptidos, antígenos, anticuerpos, proteínas, fragmentos de proteínas, ARN o ADN o una combinación de los mismos.
26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fracción retenida es una fracción adsorbida al material nanoporoso.
27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fracción retenida es una fracción de peso molecular inferior del material .
28. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el material nanoporoso es un silicio nanoporoso.
29. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el material nanoporoso es un material de óxido nanoporoso.
30. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque una superficie del material nanoporoso es una superficie modificada.
31. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el sustrato es una película, una oblea, una partícula o un microchip.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque proporcionar el sustrato comprende fabricar el sustrato por una técnica descendente .
33. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el sustrato comprende una primera área y una segunda área que rodea la primera área, en donde la primera área comprende el material nanoporoso y la segunda área no comprende el material nanoporoso.
34. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fracción retenida tiene un peso molecular de no más de 20 kDa.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la fracción retenida tiene un peso molecular de no más de 15 kDa.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la fracción retenida tiene un peso molecular de no más de 10 kDa.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la fracción retenida tiene un peso molecular de no más de 5 kDa.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la fracción retenida tiene un peso molecular de no más de 4 kDa.
39. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el análisis comprende extraer la fracción retenida del material nanoporoso .
40. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el análisis es analizar por espectrometría de masas, electroforesis en gel, cromatografía, bioensayo o una combinación de los mismos .
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la espectrometría de masas es espectrometría de masas de MALDI-TOF, espectrometría de masas de LC/ S, espectrometría de masas de ESI-MS, espectrometría de masas en tándem o espectrometría de masas de SELDI.
42. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el análisis tiene un límite de detección de bajo peso molecular de por lo menos 20 ng/ml.
43. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el análisis tiene un limite de detección de bajo peso molecular de por lo menos 5 ng/ml.
44. Un método para detectar un marcador de una condición fisiológica, caracterizado porque comprende (a) proporcionar una muestra afectada por la condición fisiológica; (b) proporcionar un sustrato que comprende un material nanoporoso; (c) exponer el material nanoporoso a la muestra; (d) analizar una fracción de la muestra retenida por el material nanoporoso; y (e) comparar un resultado del análisis con un resultado de analizar una muestra control para detectar el marcador de la condición fisiológica.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la condición fisiológica es una enfermedad o una fase de enfermedad.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad es cáncer .
47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra es una muestra de un fluido biológico.
48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra es una muestra de un mamífero.
49. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra es una muestra de un humano.
50. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el sustrato es una película, una oblea, una partícula o un microchip.
51. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el material nanoporoso es un óxido nanoporoso o un silicio nanoporoso.
52. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el análisis comprende analizar por espectrometría de masas, electroforesis en gel, cromatografía, bioensayo o una combinación de los mismos.
53. Un equipo que comprende medios para recolectar una muestra, caracterizado porque comprende uno o más componentes; y un sustrato que comprende un material nanoporoso configurado para retener uno o más componentes.
54. El equipo de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la muestra es una muestra del fluido biológico.
55. El equipo de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el material nanoporoso es un silicio nanoporoso o un material de óxido nanoporoso .
56. El equipo de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque uno o los componentes son una fracción de bajo peso molecular de la muestra .
57. Un sistema analítico, caracterizado porque comprende un instrumento analítico y un sustrato que comprende un material nanoporoso, en donde el sustrato se configura para intensificar una sensibilidad del instrumento analítico para uno o más analitos .
58. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el sustrato comprende una primera área que comprende el material nanoporoso, la primera área es capaz de adsorber uno o más analitos, la primera área se rodea por una segunda área que es resistente a adsorber uno o más analitos.
59. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la segunda área es un área no nanoporosa.
60. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque una superficie de la segunda área se modifica con grupos hidrofílicos funcionales .
61. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque una superficie de la primera área se carga eléctricamente.
62. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque una superficie de la primera área se modifica con grupos funcionales.
63. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el instrumento analítico comprende una fuente de ionización y un tamaño de la primera área coincide con un tamaño de un área activa de la fuente de ionización.
64. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la fuente de ionización es un láser y en donde el tamaño de la primera área coincide con un tamaño de un haz del láser.
65. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el instrumento analítico es un espectrómetro de masas.
66. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de desorción/ionización por láser.
67. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el material nanoporoso es un silicio nanoporoso.
68. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el material nanoporoso es un material de óxido nanoporoso.
69. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque uno o más analitos se seleccionan de péptidos, antígenos, anticuerpos, proteínas, fragmentos de proteínas, ARN y ADN .
70. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 20 kDa .
71. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 15 kDa.
72. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 10 kDa.
73. El sistema analítico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 4 kDa.
74. Una sonda, caracterizado porque comprende un sustrato que comprende un material nanoporoso y se configura para insertarse en un espectrómetro de masas .
75. La sonda de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el sustrato comprende una primera área y una segunda área que rodea la primera área y en donde la primera área comprende material nanoporoso y es capaz de retener uno o más analitos y la segunda área es resistente a una adsorción de uno o más analitos.
76. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque la segunda área es un área no nanoporosa .
77. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque una superficie de la segunda área se modifica con grupos hidrofilicos funcionales.
78. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque una superficie de la primera área se carga eléctricamente.
79. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque una superficie de la primera área se modifica con grupos funcionales para retener uno o más analitos .
80. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque el espectrómetro de masas comprende una fuente de ionización y un tamaño de la primera área coincide con un tamaño de un área activa de la fuente de ionización.
81. La sonda de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la fuente de ionización es un láser y el tamaño de la primera área coincide con un tamaño de un haz del láser.
82. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque uno o más analitos se seleccionan de péptidos, antigenos, anticuerpos, proteínas, fragmentos de proteínas, ARN y ADN .
83. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 20 kDa.
84. La sonda de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque uno o más analitos tienen un peso molecular de no más de 5 kDa.
85. La sonda de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque el material nanoporoso es un silicio nanoporoso o un material de óxido nanoporoso.
86. La sonda de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de desorción-ionización por láser asistida por matriz.