KR20090007275A - 분석방법용 나노다공성 기판 - Google Patents

분석방법용 나노다공성 기판 Download PDF

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마크 밍-청 청
지오반니 쿠다
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랜스 리오타
엠마누엘 페트리코인
프레디카 로버트슨
로사 테라치아노
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Abstract

시료에 포함된 물질의 추후 분석을 위한 시료를 농축(enrich)하기 위해 나노다공성 물질이 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 저 분자량 프로테옴에 있는 종(species)의 수율을 증가시켜, 낮은 나노몰 범위의 소형 펩티드를 검출할 수 있는 것으로 입증되었다.
나노다공성 기판, 분리, MALDI-TOF, MS, SELDI, 프로테옴

Description

분석방법용 나노다공성 기판{Nanoporous substrates for analytical methods}
우선권 주장
본 출원은 2005년 12월 20일에 출원되고, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 미국 임시출원 제60/751,924호에 기초해 우선권을 주장한다. 본 출원은 또한 2006년 12월 15일에 출원되고, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Mauro Ferrari 등에 의한 미국 임시 특허출원 "생물학적 유체의 분석을 위한 나노다공성 기판(Nanoporous substrates for the analysis of biological fluids)(Atty. Dkt. No. 066057- 0109)에 기초해 우선권을 주장한다.
연방정부 지원 연구에 대한 진술
본 발명의 일부 기초 연구는 계약 No. NOl-CO-12400 하에 국립 암 연구소(National Cancer Institute), 국립보건원(National Institute of Health)로부터 연방기금에 의해 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일부 권리를 갖는다.
본 발명은 전반적으로 분석 장치 및 시스템과 이들을 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로, 나노다공성(nanoporous) 물질을 이용한 분석 장치 및 시스템과 이들을 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다.
임상 시료 중의 물질을 분석하는 다양한 기법들이 이용가능하나, 가장 일반적인 기법은 시료 내에서 매우 풍부한 물질, 예를 들면, 혈액의 혈청의 경우 알부민으로부터의 간섭(interference)을 해결하기 위해 값비싼 해결책을 요구한다. 이 문제에 대한 하나의 해결책은 매우 풍부한 물질을 포획하여 시료에서 그 존재를 감소시켜서 상기 물질이 다른 목적 물질(substance of interest)의 분석을 간섭하지 않게 하는 항체의 이용을 포함한다. 시료에서 물질을 분석하는 보다 우수한 방법 및 시스템에 대한 요구가 존재한다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 시료를 제공하는 단계; (b) 나노다공성 물질(nanoporous material)을 포함하는 기판을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 노출시, 상기 나노다공성 물질은 상기 제1 성분을 잔류(retain)시키고 상기 제2 성분을 잔류시키지 않는 것인 분획 또는 분리 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 시료를 제공하는 단계; (b) 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 제공하는 단계; (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계; 및 (d) 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류된 상기 시료의 분획을 분석하는 단계를 포함하는, 시료를 분석하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 생리적 상태에 의해 영향받은 시료를 제공하는 단계; (b) 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 제공하는 단계; (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계; (d) 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류된 상기 시료의 분획을 분석하는 단계; 및 (e) 상기 생리적 상태의 마커를 검출하기 위해 상기 분석 결과를 대조구 시료의 분석 결과와 비교하는 단계를 포함하는, 생리적 상태의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 성분을 포함하는 시료를 수집하는 수단; 및 상기 하나 이상의 성분을 잔류시키도록 배열된 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분석 장치(analytical instrument) 및 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 포함하고, 상기 기판은 하나 이상의 분석물에 대한 상기 분석 장치의 감도(sensitivity)를 강화하도록 배열된 것인 분석 시스템을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 나노다공성 물질을 포함하고 질량 분석기(mass spectrometer)에 삽입되도록 형성된 기판을 포함하는 프로브를 제공한다.
발명의 상세한 설명
달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 관사 "하나의(a or an)"는 "하나 또는 그 이상"을 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명은 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 시료를 제공하는 단계, 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 제공하는 단계 및 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 노출시, 상기 나노다공성 물질은 상기 제1 성분을 잔류시키고 상기 제2 성분을 잔류시키지 않는다.
바람직하게는, 상기 시료는 생물학적 시료, 즉, 단백질, 펩티드, 항원, 항체, 단백질 단편, RNA 또는 DNA와 같은 생체분자를 함유한 시료이다. 생물학적 시료는 식물, 포유동물을 포함한 동물, 바람직하게는 인간 또는 세포 배양물로부터의 시료일 수 있다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 정장(seminal plasma), 흉수, 복수, 유두 흡인물(nipple aspirate), 분변 또는 타액과 같은 생물학적 유체(biological fluid)의 시료일 수 있다.
나노다공성 물질은 1000 nm 미만, 바람직하게는 100 nm 미만을 중심으로 한 세공(pore) 크기 분포를 갖는 임의의 물질일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘일 수 있다. 또한, 일부 구체예에서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리카 또는 나노다공성 알루미나와 같은 나노다공성 산화물 물질일 수 있다.
나노다공성 물질은 분자량에 의해 제1 성분과 제2 성분을 분리할 수 있고, 즉, 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류되는 제1 성분은 상기 제2 성분보다 더 낮은 평균 분자량을 가질 수 있다.
상기 나노다공성 물질에 의해 잔류되는 성분은 나노다공성 물질에 흡착될 수 있고, 즉, 탈이온수에 의한 세척과 같은 가벼운 세척에 의해 제거될 수 있는 성분이다.
상기 나노다공성 물질에 의해 잔류되는 제1 성분은 저 분자량 성분, 즉, 실질적으로 모든 분자가 20 kDa 이하의 분자량, 또는 15 kDa 이하의 분자량, 또는 10 kDa 이하의 분자량, 또는 5 kDa 이하의 분자량, 또는 4 kDa 이하의 분자량을 갖는 성분이다.
상기 나노다공성 물질은 분자 차단물(molecular cut off)로 작용하고, 즉, 상기 나노다공성 물질은 분자 차단 중량(molecular cut off weight)과 동일하거나 또는 분자 차단 중량보다 낮은 분자량을 갖는 모든 또는 실질적으로 모든 분자들을 잔류시킬 수 있고, 상기 분자 차단 중량을 초과하는 분자량을 갖는 모든 또는 실질적으로 모든 분자들을 잔류시키지 않는다. 나노다공성 물질의 분자 차단 중량은 나노다공성 물질의 세공 크기를 조정하는 것에 의해 변화될 수 있다.
상기 나노다공성 물질의 표면은 예를 들면, 표면에 침착(deposit)된 전하 또는 작용기에 의해 변형될 수 있다. 그와 같은 변형은 시료의 특정한 성분들을 잔류시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 표면을 아미노실란과 같은 아미노-함유 분자로 변형하는 것에 의해 양전하가 제공될 수 있다. 표면을 머캅토실란과 같은 머캅토 기 함유 분자로 변형시키는 것에 의해 음전하가 제공될 수 있다. 상기 표면은 또한 알킬 실란과 같은, 장쇄 알킬(C10보다 긴 알킬)을 침착시키는 것에 의해 소수성 기를 갖도록 변형될 수 있다.
상기 나노다공성 물질의 표면은 또한 시료 내의 특정 성분, 예를 들면, 인산화된 단백질과 같은 성분에 대한 상기 나노다공성 물질의 친화도를 증가시킬 수 있는, 구리 또는 철과 같은 금속에 의해 변형될 수 있다. 나노다공성 실리카와 같은, 나노다공성 산화물의 표면을 변형시키기 위해, 나노다공성 산화물의 합성 동안 금속염이 첨가될 수 있다. 예를 들면, 나노다공성 실리카의 경우, 상이한 양의 Cu(MeCO2)2H2O가 CTAB(세틸트리메틸암모늄 브로미드) 및 TEOS(테트라에틸오르토실리케이트) 및 Na2O 및 H2O에 첨가될 수 있다. 그 후, 약 200℃ 및 약 540℃에서 고온 처리(thigh temperature treatment)가 수행될 수 있다. 나노다공성 실리콘의 표면은 무전해 도금(electroless plating)을 이용하여 금속에 의해 변형될 수 있다.
상기 나노다공성 물질을 포함하는 기판은 필름, 웨이퍼(wafer), 입자 또는 마이크로칩을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 형태로 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 기판은 포토리소그래피, 전자 빔 리소그래피, X선 리소그래피, 딥 UV 리소그래피(deep UV lithography) 및 나노프린트(nanoprint) 리소그래피와 같은 톱-다운 기법(top-down technique)을 이용하여 가공될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류되는 시료의 성분은 예를 들면, 추가적인 분석 또는 시각화(visualization)를 위해 시료로부터 추출될 수 있다.
그러나, 일부 구체예에서, 상기 제1 성분의 추출 없이, 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류된 시료의 성분에 대해 추가적인 분석 또는 시각화가 수행될 수 있다.
상기 제1 성분의 추가적인 분석은 예를 들면, SDS-PAGE와 같은 겔 전기영동, 크로마토그래피, 생물학적 분석기법, 또는 MALDI-TOF 질량 분석법, LC/MS 질량 분석법, 전자분무 이온화 질량 분석법(electrospray ionization mass spectrometry), 이중 질량 분석법(tandem mass spectrometry) 또는 SELDI 질량 분석법과 같은 질량 분석법에 의해 수행될 수 있다.
분석 전에 시료를 상기 나노다공성 물질에 노출시키는 단계는 분석의 검출 수준을 강화할 수 있다. 예를 들면, 시료가 상기 나노다공성 물질에 노출되면, 질량 분석법은 1000 ng/ml 이하, 또는 200 ng/ml 이하, 100 ng/ml 이하, 또는 20 ng/ml 이하, 또는 10 ng/ml 이하, 또는 5 ng/ml 이하 또는 1 ng/ml 이하의 농도로 존재하는 저 분자량 분자를 검출할 수 있다.
상기 나노다공성 물질을 포함하는 기판이 질병 또는 질병의 진행과 같은 생리적 상태(physiological condition)의 바이오마커를 검출 및/또는 식별하기 위해 이용될 수 있다. 질병은 예를 들면, 유방암과 같은 암일 수 있다.
생리적 상태의 바이오 마커를 검출 및/또는 식별하기 위해, 생리적 상태에 의해 영향받은 시료를 나노다공성 물질을 포함하는 기판에 노출시키고, 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류(retain)되는 시료의 분획을 분석하고, 질량 스펙트럼과 같은 상기 분석의 결과를 대조구 시료, 즉, 생리적 상태에 의해 영향받지 않은 시료에 대한 유사한 분석의 결과와 비교할 수 있다.
상기 나노다공성 물질을 포함하는 기판은 또한 생물학적 시료의 수집 및/또는 보관을 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 나노다공성 물질을 포함하는 기판이 생물학적 시료를 수집하기 위해 적용가능한 도구를 포함하는 키트의 일부가 될 수 있다. 수집된 시료는 상기 나노다공성 물질에 노출되고 그 후 후속 분석 또는 시각화를 위해 보관될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 나노다공성 물질을 포함하는 기판은 특정한 분석 장치에 기반한 분석 시스템의 일부일 수 있다. 그와 같은 경우에, 상기 기판은 특히 저 분자량 생체분자와 같은 하나 이상의 분석물에 대한 감도(sensitivity)를 강화하도록 형성될 수 있다.
그와 같은 적용을 위해, 기판은 상기 나노다공성 물질을 포함하는 하나 이상의 영역을 가질 수 있다. 각각의 그와 같은 영역은 목적 분석물(analyte of interest)의 흡착에 저항성을 갖는 영역에 의해 둘러싸일 수 있다. 상기 둘러싸는 주변 영역은 바람직하게는 비-나노다공성(non-nanoporous) 영역이고, 즉, 상기 영역은 나노다공성 물질을 포함하지 않는다. 상기 주변 영역은 목적 분석물의 흡착에 대해 저항성을 갖는 작용기로 채워질 수 있다. 펩티드와 단백질의 경우, 상기 주변영역은 PEG 함유 중합체와 같은 친수성 작용기에 의해 변형될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 기판은 분석대상 시료를 상기 나노다공성 물질을 포함하는 하나 이상의 영역에 집중시키거나 농축시킬 수 있다. 그와 같은 집중(focusing) 또는 농축은 분석에 노출되는 시료의 양을 감소시키고, 이는 목적 분석물에 대한 감도를 강화시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 나노다공성 물질을 포함하는 영역의 크기는 그 크기가 분석 장치의 이온화 소스(ionization source)의 활성 영역(active area)의 크기와 일치하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 분석 장치가 이온화를 위한 레이저를 분석하는 경우, 상기 나노다공성 물질을 포함하는 영역의 크기는 상기 레이저의 빔의 크기(직경)와 대등할 수 있다. 그와 같은 기판은 특히 MALDI 질량 분석기 또는 SELDI 질량 분석기와 같은, 이온화를 위해 레이저를 이용하는 질량분석용 분석 장치를 위해 특히 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 나노다공성 물질을 포함하는 기판은 MALDI 질량 분석기 또는 SELDI 질량 분석기와 같은 질량 분석기에 삽입될 프로브로 형성될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예로 한정되지 않으나, 이에 의해 더 예시된다.
도 1은 실리카 A 및 B의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 보여준다.
도 2의 (A) 내지 (C)는 희석된 인간 혈장 시료(도 2A); 노출 후, 나노다공성 실리카 입자 타입 A 상에 잔류된 인간 혈장 단백질(도 2B); 및 노출 후, 나노다공성 실리카 입자 타입 B 상에 잔류된 인간 혈장 단백질(도 2C)의 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time Of Flight) 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 3의 (A) 내지 (C)는 노출 후, 나노다공성 실리카 입자 타입 A 상에 잔류된 인간 혈장 단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다. A, B 및 C는 일련의 세 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4의 (A) 내지 (C)는 노출 후, 나노다공성 실리카 입자 타입 B 상에 잔류된 인간 혈장 단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다. A, B 및 C는 일련의 세 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5의 (A) 내지 (D)는 4개의 상이한 농도의 인슐린에 의한 스파이킹(spiking) 실험의 질량 스펙트럼을 도시한다: A) 500 ng/mL; B) 200 ng/mL; C) 30 ng/mL; 및 D) 15 ng/mL.
도 6은 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 이용한 혈청의 부분적 고갈(partial depletion) 전략을 개략적으로 예시한다. 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 제조하여 혈청과 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 기간 후에, 상기 웨이퍼를 제거하고 남은 혈청 시료를 SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization) 질량 분석법(MS) 분석을 위해 약 양이온 교환 칩(weak cation exchange chip) 상에 스팟팅하고 상기 나노다공성 웨이퍼에 노출되지 않은 대조구 혈청으로부터의 MS 스펙트럼과 비교한다.
도 7은 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 이용하여 부분적으로 고갈시킨 혈청의 MS 분석의 결과를 보여준다. 도 6에 도시된 바와 같이, 혈청을 아미노프로필기로 코팅된 나노다공성 실리콘 웨이퍼와 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 상기 혈청을 약 양이온 교환 칩에 결합시키고 MS 분석을 수행하였다. MS 지문(fingerprint)을 수득하였다. 원형의(native) 혈청(나노다공성 웨이퍼에 노출되지 않은 혈청)을 웨이퍼 고갈(wafer depletion) 후 혈청과 비교하였다. 원형의 혈청의 경우, 유사한 m/z 범위 내에 있는 보다 작은 피크(청색/좌측 화살표)를 무색하게 하는 우세한 피크(적색/우측 화살표)가 존재했다. 나노다공성 웨이퍼와의 인큐베이션에 의해 그의 프로테옴 함량(proteomic content)이 부분적으로 고갈된 혈청에서, 청색/좌측 화살표에 의해 표시된 피크는 적색/우측 화살표로 표시된 피크에 비해 우세해졌다. 청색/좌측 피크와 적색/우측 피크 간에 상대적 피크 강도의 비를 비교하면, 원형의 혈청과 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 사용한 고갈 후의 혈청 간에 현저한 이동(shift)이 확인되었다.
도 8은 나노다공성 유리 비드를 이용하여 혈청으로부터 분자를 회수하는 전략을 개략적으로 도시한다. 아미노프로필 기로 코딩된 유리 비드를 혈청과 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후에, 상기 비드를 제거하여 세척하고, 결합된 분자들을 용리시키고 SELDI 분석을 위해 약 양이온 교환 칩 상에 스팟팅하고 상기 나노다공성 비드에 노출되지 않은 대조구 혈청으로부터의 MS 스펙트럼과 비교한다.
도 9는 나노다공성 유리 비드에 의해 회수된 분자의 MS 분석의 결과를 보여준다. 도 8에 기재된 바와 같이, 혈청을 아미노프로필기로 코팅된 유리 비드와 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 후에, 상기 혈청을 먼저 양 양이온 교환 칩에 결합시키고 MS 분석을 수행하였다. 원형의 혈청(상기 나노다공성 비드에 노출되지 않은 혈청)을 17 nm 비드를 이용하여 회수된 분자와 비교하였다. 원형의 혈청의 경우, 유사한 m/z 범위 내에 있는 보다 작은 피크(청색/좌측 화살표)를 무색하게 하는 우세한 피크(적색/우측 화살표)가 존재했다. 용리된 시료, 즉, 상기 나노다공성 유리 비드에 노출되었던 시료에서, 청색/좌측 화살표에 의해 표시된 피크는 적색/우측 화살표로 표시된 피크에 비해 우세해졌다. 청색/좌측 피크와 적색/우측 피크 간에 상대적 피크 강도의 비의 비교는 원형의 혈청과 상기 나노다공성 비드에 의해 회수되고 뒤이어 그로부터 용리된 분자 간의 현저한 이동을 보여주었다.
도 10은 70 nm 다공성 비드에 의해 수집된 분자에 대한 MS 분석의 결과를 보여준다. 도 8에 기재된 바와 같이, 혈청을 70 nm 세공을 가지며 아미노프로필기로 코팅된 유리 비드와 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 혈청을 약 양이온 교환 칩에 결합시키고 MS 분석을 수행하였다. 원형의 혈청(상기 나노다공성 비드에 노출되지 않은 혈청)을 70 nm 비드를 이용하여 수집된 분자와 비교하였다. 혈청의 경우, 우세한 피크(적색/우측 화살표)가 유사한 m/z 범위 내에 있는 보다 작은 피크(청색/좌측 화살표)를 무색하게 했다. 용리된 시료의 경우, 적색 화살표로 표시된 피크와 비교할 때, 청색 화살표로 표시된 피크가 우세한 프로파일을 보였다. 청색/좌측 피크와 적색/우측 피크 간에 상대적 피크 강도의 비의 비교는 원형의 혈청과 상기 비드에 의해 회수되고 뒤이어 그로부터 용리된 분자 간의 현저한 이동을 보여주었다.
도 11은 나노다공성 물질에 노출되지 않은 원형의 혈청과 17 nm 크기의 세공을 갖는 유리 비드 및 70 nm 크기의 세공을 갖는 유리 비드로부터 용리된 분자에 대한 소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석의 결과를 보여준다.
도 12는 17 nm 크기의 세공을 갖는 유리 비드 및 70 nm 크기의 세공을 갖는 유리 비드로부터의 용출액(elent)으로부터 수득된 단백질 서열을 보여주는 펩티드 서열분석 결과를 도시한다.
도 13의 A 내지 C는 병리학적 식별자(pathologic discriminator)를 규명하기 위해 나노다공성 물질을 이용한 혈청 분획(serological fractionation) 및 정제 개선(A)을 고전적인 조직화학적 기법(B, C)와 비교한다. 도 13(A)는 혈청의 나노다공성 표면으로의 노출은 일부 단백질 피크의 검출을 강화한다는 것을 보여준다. 도 13(B): 매손 트리크롬 염색(Masson's trichrome stain)(우측 패널)은 만성 C형 간염 바이러스 감염과 관련된 환자의 간 섬유증(hepatic fibrosis)의 병기에 관한 필요한 정보인 콜라겐 침착(collagen deposition)을 보여준다(좌측 패널, 통상적인 H&E 염색). 도 13(C): Bielchowsky 도은(silver impregnation)은 알쯔하이머병 뇌 신피질 조직에서 H&E 염색(좌측 패널)에 의해 검출되지 않는 주요한 병리적 징후인 신경반(neuritic plaque)(우측 패널)을 보여준다.
도 14는 투과 전자현미경(TEM)을 이용한 실리콘 옥시드 나노다공성 필름의 형태를 보여준다. 상세한 사항은 하기의 실시예 3을 참조한다.
도 15의 (i) 및 (ii)는 특정한 표면 상에서의 인큐베이션 후 인간 혈장의 MALDI-TOF 프로파일을 보여준다. (i) 나노다공성 실리콘 옥시드 칩과 인큐베이션된 혈장; (ii) 다공성이 아닌(solid) 실리콘 옥시드 칩과 인큐베이션된 혈장. 분석된 시료는 1 마이크로그램/mL 농도의 칼시토닌으로 스파이킹된 인간 혈장의 5 마이크로리터 분량(aliquot)이었다. 칼시토닌 피크는 별(*)로 표시하였다.
도 16은 나노다공성 실리콘 옥시드 칩에 의한 회수를 이용하여 수득된 MALDI-TOF 펩티드 프로파일의 반복성을 보여준다.
도 17의 (i) 내지 (iv)는 인간 칼시토닌에 의해 스파이킹된 혈장의 저 분자량(LMW) 회수를 보여준다. 감소되는 농도의 칼시토닌으로 스파이킹된 혈장에 대한 4개의 실험이 도시된다(칼시토닌 피크 주변의 m/z 창에 대한 줌): (i) 1000 ng/mL, (ii) 200 ng/mL, (iii) 50 ng/mL, (iv) 20 ng/mL. 인큐베이션 및 MS 조건은 하기 실시예 3의 실험 섹션에 기재된다.
도 18은 하기의 실시예 4에서 상세하게 검토된 저분자량 프로테옴(LMWP)의 감도를 강화하는 칩을 설계하기 위한 전략을 개략적으로 도시한다.
도 19는 세 개의 상이한 시료/매트릭스 MALDI 제조에 대한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 20은 대조구 마우스 혈청의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 21은 4개의 상이한 나노다공성 비드에 대한 마우스 대조구 혈청의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다. 좌측 상단 패널: 소공(small pore)을 갖는 실리카 나노다공성 비드; 우측 상단 패널: 대공(large pore)을 갖는 실리카 나노다공성 비드; 좌측 하단 패널: 3-머캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)으로 변형된 소공을 갖는 실리카 나노다공성 비드; 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)으로 변형된 소공을 갖는 실리카 나노다공성 비드.
도 22는 소공 실리카 비드 용출액 시료에 대한 1D 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 소공 실리카 비드와의 인큐베이션 후 혼주된(pooled) 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(Tris-glycine gradient gel)(8-16% 아크릴아미드). 최좌측 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 및 67에 해당한다(시료 식별에 대한 요소(key)에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 23은 대공 실리카 비드 용출액 시료에 대한 ID 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 대공 실리카 비드와의 인큐베이션 후 합쳐진 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(8-16% 아크릴아미드). 가장 좌측의 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 및 70에 해당한다(시료 식별에 대한 표시(key)에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 24는 소공 APTES 변형된 실리카 비드 용출액 시료에 대한 1D 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 소공 APTES 변형된 비드와의 인큐베이션 후 혼주된 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(8-16% 아크릴아미드). 가장 좌측의 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 및 68에 해당한다(시료 식별에 대한 표시에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 25는 대공 APTES 변형된 실리카 비드 용출액 시료에 대한 1D 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 대공 APTES 변형된 비드와의 인큐베이션 후 혼주된 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(8-16% 아크릴아미드). 최좌측 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 및 71에 해당한다(시료 식별에 대한 표시에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 26은 소공 MPTMS 변형된 실리카 비드 용출액 시료에 대한 1D 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 소공 MPTMS 변형된 비드와의 인큐베이션 후 합쳐진 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(8-16% 아크릴아미드). 가장 좌측의 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 및 69에 해당한다(시료 식별에 대한 표시에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 27은 대공 MPTMS 변형된 실리카 비드 용출액 시료에 대한 1D 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 대공 MPTMS 변형된 비드와의 인큐베이션 후 혼주된 혈청으로부터 수득된 비드 용출액의 트리스-글리신 구배 겔(8-16% 아크릴아미드). 가장 좌측의 래인은 분자량 표준이고, 좌측부터 우측으로의 나머지 래인들은 순서대로, 비드 용출액 시료 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 및 72에 해당한다(시료 식별에 대한 표시에 대해서는 하기 실시예 5의 표 4 참조).
도 28은 도 27의 겔의 단백질 밴드 절단 프로파일(protein band excision profile)을 보여준다. 겔 이미지는 이중 질량 분석법(tandem mass spectroscopy)을 위한 시료를 수득하기 위해 이용된 밴드 절단 패턴의 오버레이(overlay)를 덮은 도 27의 겔의 카피이다. 각 래인으로부터 저 분자량 밴드를 절단하고, 래인 8로부터 모든 단백질 밴드를 절단하였다. 시료의 번호 및 식별 표시는 하기와 같다. 좌측에서 래인 2로부터 시작해서((래인 1은 분자량 마커임) 래인 7까지 각 래인에서 상단부터 하단까지 밴드들을 절제하였다. 래인 8은 건너뛰고, 래인 9부터 래인 13까지 밴드 절단을 계속하였다. 각각의 상기 래인에서 4개의 밴드를 절단하였다. 래인 2부터 시작하여, 가장 상단 밴드는 웰 A1에 해당하고, 가장 하단 밴드는 웰 D1에 해당한다. 그 후, 래인 8로부터, 웰 E6에 해당하는 가장 상단 밴드부터 시작하여 가장 하단 밴드 G8까지 밴드를 절단하였다. 래인 2, 시료 웰 A1-D1; 래인 3, 시료 웰 E1-Hl; 래인 4, 시료 웰 A2-D2; 래인 5, 시료 웰 E2-H2; 래인 6, 시료 웰 A3-D3; 래인 7, 시료 웰 E3-H3, 래인 9, 시료 웰 A4-D4; 래인 10, 시료 웰 E4-H4; 래인 11, 시료 웰 A5-D5; 래인 12, 시료 웰 E5-H5; 래인 13, 시료 웰 A6-D6; 래인 7, 시료 웰 E6-G8.
도 29는 도 25의 겔의 단백질 밴드 절단 프로파일을 도시한다. 겔 이미지는 래인 12 및 13으로부터 이중 질량 분석법을 위한 시료를 수득하기 위해 이용된 밴드 절단 패턴의 오버레이를 덮은 래인 10부터 13까지의 도 25의 겔의 저 분자량 영역의 카피이다. 래인 12 및 13으로부터 저 분자량 밴드를 절단하였다. 시료 번호 및 식별 표시는 하기와 같다. 래인 12에서 좌측부터 시작해서 래인 13까지 각 래인에서 상단부터 하단까지 밴드들을 절단하였다. 이 래인들 각각으로부터 5개의 밴드를 절단하였다. 래인 12부터 시작하여, 가장 상단 밴드는 시료 웰 H8에 해당하고, 가장 하단 밴드는 웰 D9에 해당한다. 그 후, 래인 13으로부터 웰 E9에 해당하는 가장 상단 밴드부터 A10에 해당하는 가장 하단 밴드까지 밴드를 절단하였다.
도 30은 도 26의 겔의 단백질 밴드 절단 프로파일을 도시한다. 겔 이미지는 이중 질량 분석법을 위한 시료를 수득하기 위해 이용된 밴드 절단 패턴의 오버레이를 덮은 도 26의 겔의 카피이다. 래인 6에서만 모든 단백질 밴드들을 절단하였다. 시료 번호 및 식별 표시는 하기와 같다. 래인 6으로부터 상단부터 하단까지 밴드를 절단하였다. 이 래인으로부터 총 17개의 밴드를 절단하였다. 가장 상단 밴드부터 시작하여, 시료는 웰 B10에 해당하고, 웰 B12에 해당하는 가장 하단 밴드까지 식별되었다. 겔의 상단으로부터 밴드들은 시료 웰 B1O, C1O, D1O, E1O, F1O, G1O, H1O, A11, B11, Cㅍ, D11, E11, F11, G11, H11, A12, 및 마지막으로 B12에 해당한다.
도 31은 혼주혈청(pooled sera)의 SELDI 질량 스펙트럼을 보여준다. 혼주되 고 희석된 정제되지 않은 혈청(pooled and diluted raw sera)의 WCX2 칩으로부터 수득된 SELDI 스펙트럼이 제시된다. 각 시료는 중복 스펙트럼(duplicate spectra)으로 표시된다. 상단부터: 스펙트럼 1 및 2, 28일차-클론 8 혈청; 스펙트럼 3 및 4, 28일차-클론 10; 스펙트럼 5 및 6, 42일차-클론 8; 및 스펙트럼 7 및 8, 42일차-클론 10.
도 32는 혼주혈청의 SELDI 질량 스펙트럼을 보여준다. 혼주되고 희석된 정제되지 않은 혈청의 WCX2 칩으로부터 수득된 SELDI 스펙트럼이 제시된다. 각 시료는 중복 스펙트럼으로 표시된다. 상단부터: 스펙트럼 1 및 2, 60일차-매트리겔(matrigel) 대조구 혈청; 스펙트럼 3 및 4, 60일차-BT474 대조구; 스펙트럼 5 및 6, 60일차-MCF7 대조 세포주; 및 스펙트럼 7 및 8, 60일차-클론 8.
도 33은 혼주혈청의 SELDI 질량 스펙트럼을 보여준다. 혼주되고 희석된 정제되지 않은 혈청의 WCX2 칩으로부터 수득된 SELDI 스펙트럼이 제시된다. 각 시료는 중복 스펙트럼으로 표시된다. 상단부터: 스펙트럼 1 및 2, 60일차-클론 10 혈청; 스펙트럼 3 및 4, 대조구 풀(control pool) A; 스펙트럼 5 및 6, 대조구 풀 B; 및 스펙트럼 7 및 8, 대조구 풀 C.
도 34a 내지 34c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
도 35a 내지 35c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
도 36a 내지 36c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
도 37a 내지 37c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
도 38a 내지 38c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
도 39a 내지 39c는 비드 용출액의 SELDI 스펙트럼을 보여준다.
실시예 1
본 실시예에서 괄호 안의 인용은 실시예 1의 끝에 있는 참조문헌의 목록을 참조한다.
1. 개요.
암 및 기타 질병의 조기 검출을 위한 인간 혈장/혈청의 프로테옴 분석은 다수의 연구 그룹에서 관심이 증가되고 있는 분야이다[1, 2 및 상기 문헌 내의 참조문헌]. 훨씬 더 많은 관심이 특히 바이오마커 발견을 위해 이용되는 개별적인 MS 프로파일로 구성되는, 대부분의 이온을 생성하고 형성하는 것으로 알려진 담체 단백질-결합 저 분자량 분자에 집중되고 있다[3-5]. 따라서, 담체 단백질(예를 들면, 알부민) 결합을 닮고 저 분자량 프로테옴(LMWP) 수집을 수행하도록 조작된 입자의 설계 및 개발이 바이오마커 발견에서 큰 효과를 가질 수 있다[6-8]. SELDI-TOF 질량 분석법에 기반한 Ciphergen의 ProteinChip Array System이 "분자 서명(molecular siganture)"의 발견을 위한 가장 널리 이용되는 플랫폼이 될 수 있다 [9, 10]. 이 분야에서의 최근 기술적 진보 중에서, 유망한 신생 분야는 소형 펩티드의 자기학-기반, 자동 고체상 추출(magnetics-based, automated solid-phase extraction)을 MALDI-TOF 질량 분석 판독[11, 12]과 결합하는 새로운 펩티도믹스 플랫폼(peptidomics platform), DIOS(Desorption/Ionization on Silicon) 변형 표면[13] 및 SiNW(Desorption/Ionization on Silicon Nanowire)[14]를 포함한다. 프 로테옴-기반 바이오마커 발견을 위해, 나노기술이 기회 및 도전을 제공할 수 있다[15]. 나노기술의 잠재력을 프로테오믹스로 실현시키기 위해, 보다 효과적으로 및 효율적으로 혈장 LMWP를 수집할 목적으로 혈장 단백질을 분리(sieve)하기 위한 나노다공성 실리카의 적용이 연구되고 있다.
두 개의 상이한 나노다공성 실리카 표면으로부터 추출된 혈장 단백질의 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 질량분석법에 의한 분석을 수행하였다. 수득된 질량 스펙트럼은 나노크기의 실리카 입자가 수백 개의 펩티드 및 저 분자량 단백질을 잔류시킬 수 있는 능력을 입증한다.
2. 재료 및 방법.
2.1 재료 및 장치.
겔 합성용 시약은 소디움 실리케이트 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA), 건식 실리카(fumed silica)(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 폴리옥시에틸렌(10) 이소노닐페닐에테르(NonfixlO, Condea, Houston, TX, USA), 및 세틸트리메틸암모늄 브로미드(CTABr, Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함했다. MALDI 매트릭스 α-시아노-4-히드록시신남산(CHCA)은 시그마(Sigma)(St. Louis, MO, USA)사로부터 구입했다. 단백질분해효소 억제제 칵테일(PIC: 리튬 헤파린, EDTA, AEBSF, 베스타틴, E-64, 류펩틴 및 아프로티닌)은 시그마(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구입했다. 소 췌장으로부터의 인슐린은 시그마(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구했다.
모든 시료를 질소 레이저로부터의 337-nm 광을 이용하여 Applied Biosystems Voyager-DE™ STR 질량 분석기(Frarmingham, MA, USA)로 분석하였다. 선형 모드로 분석을 수행하였다.
2.2 합성 절차.
개시된, 예를 들면, [16, 17]에 개시된 두 개의 상이한 합성 절차에 따라 실리카 시료 A 및 B를 수득하였다. 요약하면, 하기의 몰 조성을 갖는 겔로부터 출발하여 실리카 시료 A 및 B를 수득하였다: 실리카 A SiO2:0.064 NonfixlO:0.6 NaOH: 0.8 HCl:58 H2O; 실리카 B: SiO2:0.2 CTABr:0.2 NaOH:0.04 Al(OH)3:40 H2O.
실리카 A를 위해, 계면활성제 용액(57.4 g의 H2O에 용해된 2.9 g Nonfix 10 및 4.05 g NaOH)의 완전한 용해 후에, 14.6 g의 소디움 실리케이트를 첨가하였다. 최종적으로, 5.33 g의 37 중량% HCl을 첨가하고, 겔을 실온에서 24시간 동안 숙성(age)시키고, 그 후, 오븐에서 24시간 동안 10O ℃에서 가열하였다.
1O g의 건식 실리카를 130 g의 H2O에 용해된 0.52 g의 Al(OH)3 및 1.35 g의 NaOH로 구성된 용액에 첨가하여 실리카 B를 수득하였다. 겔을 실온에서 2시간 동안 숙성시키고, 그 후, 오븐에서 24시간 동안 14O ℃에서 가열하였다. 상기 합성 겔을 여과시키고 탈이온수로 세척하고 80 ℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
Micrometritics Asap 2010 장치에서 77 K에서 질소 흡착 탈착 부피 등온선(nitrogen adsorption desorption volumetric isothems)을 측정하였다. 시료를 진공에서 300℃에서 밤새 소성(bake)시키고 벤질화된 시료를 230 ℃에서 동일한 잔류 압력으로 처리하였다. 0.005 내지 0.2p/P0의 범위에서 Brunauer-Emmet and Teller (BET) 선형화에 의해 시료의 표면적을 구했다[16].
2.3 혈장 채취.
[18]에 제안된 가이드라인에 따라 인간 혈장을 수득하였다. 요약하면, 혈액을 300 ㎕의 PIC가 사전에 적재된 8.0 mL 리튬 헤파린 혈장 분리 튜브(PST™ Vacutainer® 367965, Becton Dickinson . Franklin Lakes, NJ, USA)에 채취하고 채취 후 15분 이내에 4℃에서 2500g로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 30분 이내에 1.0 mL 부피로 혈장 층의 분량(aliquot)을 준비하고 드라이 아이스/알코올 용액조(bath)를 이용하여 즉시 동결시켰다.
2.4 실험 절차.
실리카 입자의 분량(5 mg)을 500 ㎕의 인간 혈장 희석 시료(1:5)와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 상기 현탁액을 2000xg로 2분간 원심분리하고, 실리카 입자들을 상층액으로부터 분리하고 탈이온수로 세척하였다(4x100 ㎕). 실리카 표면 상에 잔류된 혈장 단백질을 하기와 같이 추출하였다: 실리카 입자를 100 ㎕의 용액(4.95:4.95:0.1의 물/메탄올/0.1% TFA)에 현탁시키고 즉시 2000xg에서 5분간 원심분리하였다. 추출된 단백질을 포함하는 상층액을 MALDI-TOF-MS에 의해 분석하였다. 1 ㎕의 상층액을 4 ㎕의 CHCA 매트릭스와 혼합하고, 수득된 용액 1 ㎕를 MALDI 플레이트 상에 스팟팅하고 자연건조시켰다.
2.5 스파이킹 실험( Spiking experiment ).
혈장 시료에 4개의 상이한 농도로 인슐린을 첨가(spike)시켰다: 500 ng/mL, 200 ng/mL, 30 ng/mL 및 15 ng/mL. 그 후, 상기 시료를 섹션 2.3에 기재된 바와 같이 실리카 A에 노출시켰다. 마지막으로 혈장에서 추출된 단백질 5 ㎕를 3 ㎕의 CHCA 매트릭스에서 용리시키고, 수득된 용액 1 ㎕를 MALDI 플레이트 상에 스팟팅하고 자연건조시켰다.
3-4 결과 및 검토
본 연구에서, 신규한 나노다공성 실리카 입자가 인간 혈장으로부터 저 분자량 펩티드 및 단백질을 포획하고 농축시키는 능력을 연구하였다. 이 보관(archive)은 잠재적인 질병-특이적 바이오마커에 대한 미개발 보고(reservoir)를 포함하는 것으로 추정된다[3-5]. 이 정보 보관(information archive)에 대해 신속하게 서열을 결정하고 농축하는 효율적인 방법은 바이오마커 발견에 대해 현저한 효과를 가질 수 있다.
도 1은 실리카 A 및 B의 형태를 보여준다. 질소 흡착-탈착 등온선(nitrogen adsorption-desorption isotherm)은 실리카 A의 표면적은 406 m2/g이고 세공 용 적(pore volume)은 0.3 cm3/g라는 것을 시사한다. 등온선의 탈착 부분에 적용된 Barret-Joyner-Halenda (BJH) 모델은 26.8 and 38Å를 중심으로 하는 세공 크기 분포를 나타내는 다공성 시스템의 이중형태(bimodality)를 입증했다. 실리카 B의 경우, 표면적은 848m2/g이고 세공 용적은 1.21 cm3/g이다. BJH 세공 크기 분포는 25 및 390 Å에 중심이 있다.
나노다공성 실리카의 혈장 단백질 및 특히 저 분자량 프로테옴 단백질에 대한 포획 능력을 평가하기 위한 탐색적 실험을 설계하였다.
MS 비드 분석 전 시료의 예비 농축(preconcentration)을 위한 신속하고 용이한 절차를 개발하였고, 이는 생물학적 시료의 잠재적 분해를 최소화할 수 있게 하였다. 미처리(untreated) 시료에 비해, 실리카 입자로 처리된 인간 혈장 시료의 질량 스펙트럼은 특정한 나노다공성 실리카 기판에 의존하는, LMWP의 명백하게 가시적인 농축(enrichment)을 보였다. 도 2를 참조한다.
나노다공성 실리카로 처리된 두 시료의 MALDI-TOF 스펙트럼은 수백 개의 피크를 보였고, 특히, 800 내지 5000 달톤의 LMW 범위에 있는 피크를 보였다. 실리카의 각 배치에 대해, 분석법의 재현성을 평가하기 위해 실험을 삼배수로 수행하였다. 데이터는 상기 방법이 고 강도 신호의 재현가능한 전체 스펙트럼을 생성한다는 것을 나타냈다(도 3의 A-B-C 및 도 4의 A-B-C 참조). 고 품질의 스펙트럼은 클린업(cleanup) 절차의 생성물일 수 있다. (포획된 단백질의 추출 전에) 실리카 기판을 세척하는 것은 잠재적으로 심각한 신호 억제를 유발할 수 있는 염, 비휘발 성이고 친수성인 오염물을 제거할 수 있다. 실리카 입자에 의해 잔류되는 분자의 재현가능한 프로파일을 효과적으로 생성하는 능력은(도 3 및 4) 또한 실리카 기판의 내재적인 화학적 안정성으로부터 유래될 수 있다[16,17].
본 명세서에 기재된 방법의 검출 한계(LOD)를 수립하기 위해 혈장 시료를 상이한 농도의 인슐린(분자량 5733.5 Da)으로 스파이킹(spiking)하는 단계를 수행하였다. 최저 15 ng/mL 농도로 인간 혈장에 포함된 인슐린의 MALDI-TOF 신호를 검출하였다(도 5).
MALDI-TOF 기술과 결합된 본 발명의 방법은 밀리리터당 낮은 나노그램 범위에 있는 혈장 펩티드를 검출할 정도로 충분히 민감하다. 현재까지 MS에 의해 식별된 서브유닛인, 합토글로빈(Haptoglobin)-α 서브유닛과 같은 바이오마커에 대한 최저 농도가 1000 nmol/L 라는 것을 고려할 때[22, 23], 본 발명의 LMWP 혈장 농축 방법은 LOD를 대략 400-배 정도 낮췄다.
MS 프로파일에 따르면, 상이한 세공 크기를 갖는 두 개의 실리카 기판 각각 동일한 혈장 시료와 함께 인큐베이션된 후, 펩티드/단백질의 상이한 레퍼토리를 잔류시켰다(도 2 참조). 본 발명은 작동 원리에 한정되지 않더라도, 본 발명은 관찰된 차이점이 단백질의 정전기적 인력을 통한 친수성 표면으로의 흡착에 대한 성향 및 하층 표면 특성(substratum surface propoerty)에 의해 뒷받침되는 것으로 가정될 수 있다. LMWP 결합은 실리카 기판의 표면 특성을 추가적인 화학적 및 구조적 변형을 통해 맞춤화시키는 것에 의해 개선될 수 있다.
5. 결론.
나노다공성 실리카 입자가 담체 단백질-유사 물질로 작용하고 혈장/혈청 또는 기타 생물학적 시료 내의 저 분자량 분자를 농축시키기 위해 성공적으로 이용될 수 있다는 것이 입증되었다. 상기 결과는 LMWP를 선택적으로 결합하는 나노다공성 실리카 입자의 분자 식별 특성 및 분자의 잠재적 선택성을 보여주었다. 따라서, 질량 분석법용 표면(mass spectrometry surface)과 결합된 이 신규한 기판은 바이오마커 성분 자체의 서열을 신속하게 결정하는 수단 및 LMWP-기반 예측용 기계(LMWP-based predictive medicine)에 대한 잠재적인 플랫폼을 제공할 수 있다.
6. 참조문헌 목록.
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실시예 2
나노다공성 기판을 이용한 혈청 성분의 분획화
저 분자량의 순환 프로테옴(circulatory proteome) 내에 존재하는 다수의 이전에 규명되지 않은 분자들이 개체의 진행 중인 병리 생리(pathophysiology)의 진행 상태 정보를 제공할 수 있다. 최근에, 저 분자량 분자를 포함하는 프로테옴 서명(proteomic signature)이 생물정보학 알고리즘과 결합된 질량 분석법을 이용하여 확인되었다. 이 증거들은 풍부한 진단 정보의 원천을 포함할 수 있는 정보 보 관(information archive)의 존재를 시사한다. 지문(fingerprint)을 뒷받침하는 분자를 서열분석하고 식별하기 위한 시도가 현재 진행되고 있다. 다수의 그와 같은 저 분자량 분자가 순환성 담체 단백질에 결합되어 존재할 수 있다는 발견은 질량분석법 기반 분석 전에 분획 및 분리 기법을 위한 새로운 기회를 제공할 수 있다.
나노다공성 기판은 저 분자량 바이오마커 물질의 편리하고 재현가능한 분획 및 선택적 결합을 위한 새로운 접근방식을 나타낸다. 혈청에 노출되면, 아미노프로필-코팅된 나노다공성 실리콘은 혈청에서 단백질을 고갈시키고 명확한, 변화된 MS 프로파일을 갖는 혈청을 생성할 수 있다. 또한, 제어된 세공 크기를 갖는 아미노프로필-코팅된 나노다공성 유리 비드는 일부(subset) 혈청 단백질을 결합하고 엄격한 용리에 의해 그들을 방출시킬 수 있다. 용리된 단백질은 독특한 MS 프로파일, 겔 전기영동 프로파일 및 차별적인 펩티드 서열 특성(differential peptide sequence identity)을 가지며, 이들은 나노세공의 크기에 따라 변한다. 난소암에 대한 두개의 잠재적 바이오마커인, 트랜스티레틴(transthyretin) 및 아포리포프로테인 A-I을 비드의 세공 크기에 의해 기반하여 차등적으로 격리시켰다. 생물정보학 분석과 결합된, 이 신규한 혈청 분획 전략의 조직적인 이용은 질병 조직의 평가 동안 병리학자의 다수의 조직화학적 염색의 이용에 유사하게, 진단 정보에 대한 접근을 증가시킬 수 있다. 나노다공성 물질 표면은 혈액에서 불안정한 담체-단백질 결합 분자의 회수 및 보존에서 이용될 수 있다. 또한, 나노다공성 기판을 이용한 연구에서 수득된 지식은 조기-단계 질병 관련-서명(signature)에 대해 순환을 모니터링할 수 있는 불용해성(infusible) 나노-회수 작용제(nano-harvesting agent)를 이용하는 것에 기여할 수 있다.
개요
병리학은 본질적으로, 정상 조직과 질병 조직 변이체의 철저한 비교를 통해 발견된, 질병 징후에 대한 세심한 체계적 검사에 근거하여 수립된 의학 분야이다. 모든 의학도들에서 알려진, 병리학적 진단 분야의 원형(ancestral) 상태는 근원적인 조직 병리학의 4가지 주요한 징후의 물리적 검사에 근거한 인식이었다: 종양(tumor), 통증(dolor), 열(calor), 및 발적(rubor). 마찬가지로, 조직의 초기 검사는 육안 및 촉진 검사로 시작할 수 있다. 그러나, 이는 완전한 병리적 평가를 위한 조직의 현대적 평가의 개시에 불과하다. 현미경 및 실험 방법(laboratory method)의 도입이 현대 의학적 병리 진료를 탄생시킨 이래로, 기술적 진보가 질병 과정의 보다 민감하고 통찰력 있는 이해를 밝혀냈다. 현대의 임상 검사 테스트 및 조직 처리를 통해, 다수의 테스트가 현대의 병리학자에게, 그들에게 의뢰한 의사들에게 중요한 진단을 제공하기 위한 수단을 제공한다. 모든 그와 같은 테스트로, 징후 및 징후의 패턴을 파악하고 해석하는 능력이 병리학자의 기능의 핵심이다. 주어진 조직의 헤마톡실린과 에오신(H&E)의 차등적 흡수와 같은 특정한 조직학적 패턴과 특정 질병 상태 및 예후적 결과의 상관 관계는 병리적 진찰의 기초가 되는 지속적으로 진화되는 과정이다. 조직의 조직화학적 방법은 상이한 염료, 항체, 프로브 등을 위한 조직 분획 방법으로 간주될 수 있다. 그러나, 조직화학적 방법은 선택적인 조직의 서브성분(subcomponent)만을 보여주므로, 다른 서브성분은 검출을 피할 수 있게 한다.
지속적으로 새로운 기술을 그 실행에 통합하는 병리학의 풍부한 전통을 통해, 현대 병리학은 신규한 테스팅 플랫폼의 환자-기반 진단학으로의 적응성을 평가한다. 한 예로서, 새로운, 보다 민감한 질량 분석 장치가 잠재적인 진단적 서명에 대해 환자의 체액과 조직 시료를 조사하기 위해 이용된다(Rosenblatt et al., 2004, 실시예 2의 끝에 있는 참조문헌의 목록 참조). 그와 같은 노력은 환자 조직 내의 분자의 다중 조합(multiplexed combination)의 측정값이 생성되고 질병 상태 및 결과와 상관되는 것인 새로운 분야, 즉, 조직 프로테오믹스의 일부이다. 조합 마커 접근방법을 이용한 특이성 및 민감도의 잠재적 증가 때문에, 치명적 질병을 조기에, 그 자체가 종양, 통증, 열 또는 발적으로 나타나기 전에 검출하고 파악하는 것이 가능할 수 있다.
생물정보학 분석과 결합된 질량분석법을 이용한 프로테옴 지문분석(proteomic fingerprinting) 방법은 혈액 및 조직 프로테옴의 저 분자량 범위 내에 잠재적인 진단 정보 컨텐트의 존재에 관한 단서(clue)를 가져왔다(Chaurand and Caprioli, 2002; Hingorani et al., 2003; Paweletz et al., 2000; Petricoin et al., 2002a; Petricoin et al., 2002b; Schwartz et al., 2004; Stoeckli et al., 2001; Yanagisawa et al., 2003). 그와 같은 정보 보존이 이 연구들에 포함되었기 때문에, 질병-관련 지문의 근원적인 성분을 서열분석하고 규명하려는 노력이 진행되고 있다.
진단 상태도(diagnostic portrait)를 형성하기 위해 합쳐지는 분자들은 혈관 내 구획(intravascular compartment)과 수립된 평형 하에 다수의 조직에 의해 간질액(interstitial fluid)으로 흘려지는 다양한 소형 단백질, 및 단백질 단편일 수 있다. 신체 내에서 세포들에 의한 지속적인 단백질의 합성 및 분해는 전체적인 건강 상태를 반영할 수 있다. 숙주 내에서 발현된 프로테옴은 모든 세포들(정상 세포 및 질병상태의 세포) 간의 복잡한 상호작용(interplay)을 반영하고, 따라서, 혈청과 같은 체액은 질병의 바이오마커의 발견 및 진단 검사의 개발을 위한 정보의 풍부한 원천일 수 있다. 최근의 연구는 질병 지문을 갖는 저 분자량 분자들이 보다 큰 담체 분자에 결합되어 있다는 것을 보여준다(Mehta et al., 2003). 따라서, 그와 같은 저 분자량 분자 및 그들을 품고 신장 청정(renal clearance)으로부터 보호하는 상재 담체 단백질(resident carrier protein)의 분리가 신규한 바이오마커의 발견 및 서열분석을 위한 MS-기반 조직 프로테오믹스의 목적이다.
담체 단백질에 결합된 저 분자량 프로테옴의 보다 포괄적이고 광범위한 분석은 현재의 양식(modality)을 이용하여 입수가능하지 않은 잠재적으로 유용한 진단 정보를 밝힐 수 있는, 신규한 분획화 방법의 개발을 필요로 할 수 있다. 나노다공성 물질 표면의 가공은 순환 내에 존재하는 다양한 서브세트의 단백질 및 단백질 단편을 체계적으로 분석하는 하나의 전략일 수 있다. 나노다공성 물질은 선택적이고 맞춤화된 결합 및 분획화가 일어날 수 있도록 특정한 화학적 유도체화를 통해 변형되고 작용기가 조작될 수 있는(functionally manipulated) 능력을 갖는다. 더욱이, 나노다공성은 표면적을 크게 증가시켜서 선택적 분획화 및 결합이 잠재적으로 보다 높은 효율성 및 속도로 일어날 수 있게 한다. 선택적 분획화 방법 및 물 질은 임상 화학자가 전세계적으로 병리학 연구실에서 매일 이용되는 조직 고정제(tissue fixative) 및 조직화학 시약의 보고(arsenal)를 창출을 위해 이룬 혁신과 유사한 방식으로 조직 프로테오믹스 분야에 기여할 수 있다.
본 실시예에서, 혈청 기반 분석 및 바이오마커 발견을 위한 분획화 도구로서 나노다공성 물질 표면의 용도가 입증되었다. 하나의 실험에서, 다량으로 존재하는 단백질(high abundance protein)을 혈청으로부터 선택적으로 고갈시키기 위해 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 사용하였다. 또 다른 방법은 후속 용리 및 평가를 위해 혈청으로부터 상이한 프로테옴 프로파일을 수집하기 위해 나노다공성 제어-다공성 유리 비드(nanoporous controlled-pore glass bead)를 이용했다.
재료 및 방법.
혈청 시료.
혈청 시료는 -80℃에 보관되었던, 정상 공여자로부터 수득된 단일 풀(single pool)이었다.
화학물질.
화학물질: 아세토니트릴(ACN)(HPLC 등급), 탄산수소암모늄(NH4HCO3), 요오도아세트아미드(97%), 메탄올(99+%) 및 디티오트레이톨(DTT)은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 포름산(88%), 아세트산(glacial)은 Mallinckrodt Baker(Phillipsburg, NJ)로부터 구입하였다. H2O는 자체적으로 Kontes High Purity Water System을 이용하여 2회 증류시켰다. 시퀀싱 등급 변형된 돼지 트립신(Porcine sequencing grade modified trypsin)은 Promega (Madison, WI)로부터 구입하였다.
기타 재료: 소 혈청 알부민은 Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO로부터 구입하였다. SYPRO® Ruby 단백질 겔 염색은 Molecular Probes-Eugene, OR로부터 구입하였다. 사전 제조된(pre-cast) 4-12% 비스-트리스 1D 겔, LDS 시료 및 전개 완충액(running buffer), 항산화제, 및 미리 염색된(prestained) 벤치마크 단백질 래더(Benchmark protein ladder)는 Invitrogen Co로부터 구입하였다. 건식 실리카(fused silica)는 Polymicro Technologies Phoenix, AZ로부터 구입하였다.
나노다공성 실리콘 웨이퍼 가공( Nanoporous silicon wafer fabrication ).
0.005 ohm-cm 미만의 고유 저항(restivity)을 갖는, Silicon Quest, Inc.의 붕소가 도핑된(Boron-doped) (100) 배향된 실리콘 웨이퍼를 기판으로 이용하였다. 웨이퍼를 120℃에서 30분 동안 피란하 용액(piranha solution)(H2SO4:H2O=1:1)으로 세척하고, 뒤이어, HF:H2O=l:10에서 산화물을 제거하고, 탈이온수로 헹구었다. 자체제작한 테플론 셀(homemade Teflon cell)에서 전기화학적 에칭(electrochemical etching)에 의해 다공성 실리콘 표면을 제조하였다. 웨이퍼를 전기적 접촉(electrical contact)을 제공하기 위해 하부에 알루미늄 호일(0.1 mm 두께)을 갖는 테플론 셀의 기부 상에 배치했다. 상기 셀의 공동에 상대 전극(counter electrode)으로 백금 메쉬(platinum mesh)를 배치했다. 전해질은 49% HF와 에탄올의 부피기준 1:1 혼합물이었다. 72 mA/cm2의 일정한 전류 밀도를 65초 동안 제공했다. 다공성 실리콘 형성 직후에, 시료를 탈이온수로 세정하고 진공 하에 배치하여 수분을 제거하였다. 상기 다공성 실리콘을 톨루엔에 담긴 10% APTES(아미노프로필트리에톡시 실란)에서 실란화시켰다. 나노세공으로부터 기포를 제거하기 위해, 상기 다공성 실리콘을 진공 하에 3분 동안 방치하였다. 밀봉된 디쉬에서 실온에서 3시간 동안 반응 용액을 환류시켰다. 상기 다공성 실리콘을 톨루엔, 아세톤으로 수회 세정하고 N2 흐름으로 건조시켰다. 등온선의 질소 탈착 부분에 적용된 BJH(Barret-Joyner-Halenda) 모델은 2-20 nm를 중심으로 한 세공 크기 분포를 나타냈다.
나노다공성 실리콘 웨이퍼를 이용한 혈청의 부분적 고갈.
아미노프로필-코팅된 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 1.5 ml 튜브에 넣고 탈이온수로 4회 세척하였다. 탈이온수로 1:5의 비율로 희석한 혼주 혈청(pooled serum) 시료 500 ㎕를 상기 웨이퍼에 적용하고 상기 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 상기 희석된 혈청 상층액을 제거하고 추후의 MS 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 대조구를 위해, 희석된 혈청 시료도 동결시켰다. 또 다른 대조구로서, 상기 웨이퍼를 또한 희석된 혈청 대신에 탈이온수와 인큐베이션시켰다.
나노다공성 제어-다공성 유리 비드를 이용한 프로테옴 회수.
70 nm 또는 17 nm의 세공 크기를 갖는, 아미노프로필-코팅된 제어-다공성 유리 비드(aminopropyl-coated controlled pore glass bead)를 Sigma, St. Louis, MO로부터 구입하였다. 질소 흡착-탈착 등온선 데이터는 17 nm 비드의 표면적은 30.8 m2/g이고, 세공 용적은 0.032 cm3/g이라는 것을 나타냈다. 70nm 비드의 경우, 표면적은 130.5m2/g이고, 세공 용적은 0.93 cm3/g였다.
각 실험을 위해, 10 mg의 비드를 정량하여 1.5 ml 튜브에 넣었다. 상기 비드를 탈이온수로 4회 세척하였다. 탈이온수에 의해 1:5의 비율로 희석시킨 혼주 혈청을 상기 비드 시료에 적용하고 그 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 희석된 혈청 상층액을 제거하여 보관하였다. 그 후, 상기 비드를 1 ml의 탈이온수를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후에, 500 ㎕의 용리 완충액(5 ml의 아세토니트릴, 5 ml의 물, 10 ㎕의 트리플루오로아세트산)을 시료에 적용하고, 실온에서 1/2 시간 동안 회전시켰다. 그 후, 용출액(eluant)을 회수하고, 추후의 MS 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.
질량 분석법.
분획 성능을 평가하기 위해 저 해상도 질량 분석법에 의해 생성된 스펙트럼 프로파일(low resolution mass spectrometry generated spectral profile)을 일반 화된 불편 판독물(generalized unbiased readout)로 이용하였다. 약 양이온 교환 SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization) 칩을 Biomek 2000 바이오프로세서(WCX2 ProteinChip®, Ciphergen Biosystems, Inc.)를 이용하여 가공하였다. 10 mM HCl 100 ㎕를 상기 칩에 적용하고 뒤이어 5분간 인큐베이션시켰다. 흡입(aspiration)을 통해 HCl을 제거하고 100 ㎕의 물과 1분간 인큐베이션시켰다. 상기 물을 흡입하고 신선한 물을 1분간 적용하였다. 그 후, 0.1% 트리톤 X를 포함하는 10 mM 아세트산 암모늄 100 ㎕를 첨가하고, 상기 칩에 적용하여 5분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 아세트산 암모늄 혼합물을 흡입하여 제거하고 다시 아세트산 암모늄 혼합물을 적용하여 5분간 인큐베이션시켰다. 이 제조 단계들 후에, 상기 칩을 진공을 이용하여 건조시켰다. 혈청과 같은 시료 5 ㎕를 칩 스팟에 적용하고 55분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 칩을 150 ㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척하고, 뒤이어 150 ㎕의 물로 세척하였다. 그 후, 상기 칩을 진공 건조시키고 50%(v/v) 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 담긴 30% 신남산 용액 1.0 ㎕를 각 단백질 스팟에, 적용들 사이에 건조시키면서 2회 적용하였다. 그 후, PBS-II 질량 분석기(Ciphergen Biosystems, Inc.)를 이용하여 상기 칩을 분석하였다. 하기 셋팅을 이용하여 각 스팟에 대한 스펙트럼을 수집하였다: 검출기 전합은 1,800 V이고; 포커스 질량(focus mass)은 6,000 Da이며; 질량 상한(hi mass limit)은 20,000 Da이며; 감도 증분(sensitivity gain)은 5로 설정하고; 레이저 강도(laser intensity)는 145였고; 위치(position)당 15개의 레이저 샷(laser shot)을 취하였고; 위치의 갯수는 20 내지 80개로, 5개의 위치 간격으로 증가하였다. 모든 시료들을 동일하게 처리하기 위해 프로토콜을 수립하였다.
단백질 서열분석 연구.
단백질 분석: 17 nm 및 70 nm-세공 비드로부터의 비드 분획화 시료를, UV-VIS 분광분석기(Spectramax® Plus 384, Molecular Devices) 상에서 595 nm에서 모니터링된 200 ㎍/mL 내지 1 mg/mL 범위의 우혈청 알부민(BSA)을 이용한 전통적인 브래드포드(Bradford) 분석법으로 분석하였다.
1D 겔 분리 및 소화(digestion): 15 g의 각 비드 분획화 시료 및 3 ㎕의 정제되지 않은(raw) 혈청을 30 ㎕의 LDS 시료 완충액으로 희석하고 95℃에서 5분 동안 끓였다. 복잡한 단백질 혼합물의 원하는 분자량 영역을 분리하기 위해 상기 분획들을 1D 사전-제작된(pre-cast) 겔(4-12% Bis-tris) 상에서 전개시켰다. 상기 겔을 ddH2O로 철저하게 세척하고, 50% 메탄올/10 % 아세트산 용액에서 30분 동안 고정시키고, Sypro® ruby 염색으로 밤새 염색시키고, UV 여기(excitation) 및 시각화 전에 3시간 동안 ddH2O로 탈색시켰다. 상기 겔을 1 mm2 겔 영역으로 잘라내고, 겔 밴드를 50% 메탄올에서 탈색시켰다. 겔 밴드를 10 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 55 mM 요오도아세트아미드로 환원 및 알킬화시키고, 4℃에서 1시간 동안 트립신(20 ng/㎕)에서 인큐베이션시키고, 37℃에서 25 mM NH4HCO3에서 밤새(16시간) 처리하였다. 다음날 아침, 상기 겔을 70% ACN/5% 포름산 용액과 반복적으로 인큐베이션시 켜서 단백질을 추출하였다.
μLC/MS/MS 분석: 질량 분석법 분석을 위해 시료를 건조상태에 가까운 상태까지 동결건조시키고 6.5 ㎕의 HPLC 완충액 A(95% H2O, 5% ACN, 0.1% FA)로 재구성시켰다. 변형된 나노스프레이 원(modified nanospray source)을 갖는 ThermoFinnigan LCQ Classic 이온 트랩 질량 분석기(San Jose, CA)에 온라인으로 결합된 Dionex's LC Packings 액체 크로마토그래피 시스템으로 미세모세관 역상(microcapillary reverse phase) LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 자체-제작한(in-house), 슬러리 충진된 모세관 컬럼으로 역상 분리를 수행하였다. C18 실리카-결합 컬럼(C18 silica-bonded column)은 300 옹스르롬 세공을 갖는 5 ㎛ 비드로 충진된 75 ㎛ i.d., 360 ㎛ o.d., 10 cm 길이의 건식 실리카였다(Vydac, Hesperia, CA). μ-전치컬럼(precolumn) PepMap, 5 mm, C18 카트리지(Dionex)는 탈염(desalting) 컬럼으로 작용한다. 시료를 ㎕ 픽-업(pick-up) 모드로 주입하고 완충액 A로 5분간 세척하고 뒤이어 200 nL/분의 유속으로 95분 동안 85%까지 완충액 B(95% ACN/5% H2O/0.1% 포름산)로 선형 구배로 용리시켰다(linear gradient elution). 완전한 MS 스캔 후에 뒤이어 가장 풍부한 펩티드 이온의 4회의 MS/MS 스캔을 수행하고(데이터-의존적 모드) CID(Collision induced dissociation)를 2.00 kV의 이온 분무 전압 설정, 22.80 V의 모세관 전압 및 180℃의 온도로 38%의 충돌 에너지에서 수행하였다.
데이터 분석: Sequest Bioworks Browser(ThermoFinnigan)를 통해, Swiss- Prot, TrEMBL 및 Ensembl 엔트리의 비-중첩(non-redundant) 프로테옴 세트의 MS/MS 스펙트럼을 European Bioinformatics Institute에서 검색하는 것에 의해 데이터 분석을 수행하였다. MS/MS 데이터의 수동 검사 및 상관 점수(correlation score)(표 1)를 필터링한 후, 펩티드를 정당한 히트(legitimate hit)로 간주하였다. 데이터를 필터링하기 위해 이용된 기준은 적어도 대부분의 인용 문헌만큼 엄격했다.
표 1
Figure 112008051246460-PCT00001
수용된 펩티드 히트는 데이터베이스에서 모든 다른 펩티드에 대해 Xcorr랭킹(ranking)= 1이어야 했다.
결과.
나노다공성 실리콘을 이용한 혈청 고갈.
혈청을 분획화하는 하나의 전략은 혈청에서 그의 단백질 함량의 일부를 고갈시키고, 뒤이어 남은 단백질 종들을 분석하는 것이다. 도 6을 참조한다. 이 방식을 시도하기 위해, 실리콘으로부터 나노다공성 기판을 제조하였다. 비대칭 표면을 갖는 나노다공성 실리콘 웨이퍼를 혼주 혈청 시료와 인큐베이션시켰다. 1.5시간의 인큐베이션 후에, 상기 웨이퍼를 제거하고 혈청 내의 남은 단백질을 대상으로 MS 평가를 실시하였다. 도 7을 참조한다. SELDI(surface enhanced laser desorption ionization) 질량 분석법에서 새로운 이온 피크 패턴의 등장은 분획화 기법으로부터 기인되었다. 전체 스펙트럼은 분획화되지 않은 혈청과 비교할 때 현저하게 다르게 보였다. 고갈 실험의 경우, MS 스펙트럼 내의 두 개의 피크가 크게 변했다. 고갈시킨 시료에서, 8122 m/z에서의 피크가 원형의 혈청 시료, 즉, 분획화되지 않은 혈청 시료에 비해, 유의성 있게 강화되었다. 반면에, 고갈시킨 시료에서, 8927 m/z 피크는 원형 혈청에서의 우세(dominance)에 비교할 때, 현저하게 감소되었다. 따라서, 인큐베이션 및 뒤이은 나노다공성 입자의 제거는 혈청의 스펙트럼 특성을 변화시키고, 이전의 작은(minor) 피크의 프로파일을 우세한 강도 영역으로 강화시켰다.
나노다공성 제어-세공 유리를 이용한 분자 회수.
프로테옴 서명(proteomic signature)을 위해 고갈시킨 혈청을 측정하는 대안으로서, 추후의 용리 및 프로파일링을 위해 분자 종(molecular species)을 분리하기 위한 비드 회수 전략(bead harvesting strategy)을 개발하였다. 도 8을 참조한다. 상이한 세공 크기(17 nm 대 70 nm)를 갖는 아미노프로필-코팅된 유리 비드를 선택적인 분자 분리 및 방출을 위해 혈청과 인큐베이션시켰다. 상기 혈청과의 인큐베이션 후에, 상기 비드를 물로 가볍게 세척하고 결합된 분자들을 강한 용액(harsh solution)을 이용하여 용리시켰다. 그 후, 용리된 종들을 SELDI MS를 통해 분석하고 분획화되지 않은 혈청의 스펙트럼과 비교하였다. 도 9를 참조한다. 17 nm 비드 용출액의 육안 검사는 분획화되지 않은 혈청과 비교할 때 독특한 MS 스 펙트럼 양상을 보여주었다. 또한, 육안 검사는 수집된 시료와 원형의(가공되지 않은) 혈청의 비교에서 7762의 m/z에서 현저한 차이를 검출하기에 충분했다. 정상 혈청에서, 8927 m/z 피크가 스펙트럼 양상을 지배했으나, 수집된 서브세트에서 우세한 역할을 하는 것은 7762 m/z 피크였다.
독특한 스펙트럼 서명의 생성에서 발휘되는 나노세공 크기의 효과를 평가하기 위해, 동일한 실험에서 70 nm 세공-크기의 제어된 다공성 유리 비드를 이용하였다. 놀랍게도, 보다 큰 세공의 제어된 다공성 유리 비드를 이용하여 현저하게 상이한 SELDI MS 스펙트럼을 얻었다. 도 10을 참조한다. 6629 m/z에서, 새로운 주요한 피크가 상기 비드로부터 용리된 스펙트럼 패턴을 지배했다. 동일한 m/z에서의 정상 혈청 피크는 겨우 식별가능한 정도였다. 대조적으로, 정상 혈청에서 8927 피크는 보다 큰 세공의 비드로부터 용리된 일련의 단백질 내에서 낮은 지위(minor status)를 차지했다.
17-nm 크기의 세공을 갖는 비드 또는 70-nm 크기의 세공을 갖는 비드로부터 용리된 분자 성분들을 더 규명하기 위해, 각 시료로부터의 단백질 15 ㎍을 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔에서 전개시키고 뒤이어 Sypro® Ruby Red로 염색시켰다. 도 11을 참조한다. 분자량 스펙트럼 전체에 걸쳐, 상기 두 종류의 비드로부터 유래된 용출액 간에 명확한 차이가 관찰되었다. 이 결과는 SELDI-기반 분석에서 파악된 현저한 차이와 일치했다. 일차원 전기영동을 통한 용출물의 분자 함량 분석은 상기 비드들이 혈청의 분자 함량을 상이하게 분획시킨다는 추가적인 확인을 제공했다.
17-nm 크기의 세공을 갖는 비드와 70-nm 크기의 세공을 갖는 비드로부터 유래된 용출액 간의 차이를 더 규명하기 위해, SDS-PAGE 겔로부터의 밴드를 절단하고 상기 겔 조각의 단백질 함량을 트립신을 이용하여 소화시켰다. 결과적으로 수득된 펩티드 단편들을 전자분무 질량 분석법(electrospray ionization mass spectrometry)을 이용하여 분석하였다. 스펙트럼 데이터의 조사 후에, 펩티드 명칭(peptide identity)을 상기 겔의 프로테옴 함량에 부여하였다. 도 12를 참조한다. 70 nm 크기의 세공을 갖는 비드로부터 유래된 용출물에서 25종의 펩티드를 확인하였고, 반면에, 17 nm 크기의 세공을 갖는 비드의 용출물 내에서 13종의 펩티드를 확인하였다. 확인된 펩티드 종들 간에 일부 중복이 있었으나(6개의 펩티드가 공유됨), 상당한 분획화가 일어났다는 것을 보여주는 차이를 관찰하였다. 따라서, 세 개의 개별적인 분석은 상이한 세공 크기를 갖는 유리 비드가 혈청 성분들을 분획화하는 수단을 제공한다는 것을 보여준다.
검토.
생물정보학 데이터 마이닝(data mining) 방법과 결합된 질량 분석법을 이용한 프로테옴 프로파일링(proteomic profiling)은 순환 프로테옴(circulatory proteom)의 저 분자량 범위 내에 담긴, 복잡하고 흥미로운 정보의 보고(archive)를 밝혔고, 이는 중요한 진단 정보를 포함할 수 있다. 실리콘 웨이퍼 및 제어된 다공성 유리 비드(controlled pore glass bead)와 같은 나노다공성 물질 표면은 혈청과 같은 체액 내에 담긴 저 분자량 생물학적 정보를 분획화하고 다루기 위한 전략적인 새로운 수단을 제공한다. MS 분석을 생물정보 조사(bioinformatic interrogation)와 결합시키는 나노다공성 물질 표면의 체계적인 평가는 강화된 검출 특성을 갖는 특정한 분획화 체계(scheme)를 밝히고, 워크-업을 위한 분자들의 확장된 범위(expanded set of molecules)를 파악하게 하며, 분자 자체의 정제, 분획화 및 펩티드/단백질 서열분석을 위한 보다 편리하고 강건한 수단을 제공할 수 있다.
이를 위해, 본 연구에서, 나노세공을 갖는 물질 표면을 이용한 혈청의 분획화는 유의성있게 변화된 스펙트럼 프로파일, 변화된 1-D 전기영동 프로파일 및 차별적 서열 양상(differential sequence identity)을 초래할 수 있다. 이 파라미터들 각각은 17 nm 크기의 세공을 갖는 비드 또는 70 nm 크기의 세공을 갖는 비드를 이용하여 유의성 있는 독특한 분획화가 일어났다는 것을 시사한다. 상기 두 개의 비드 종류를 이용하여 ESI MS에 의해 확인된 6개의 펩티드를 회수하였으나, 상기 비드들 중 단 한 종류만을 이용하여 분리된 상이한 펩티드들이 있었다. 서열분석된 펩티드는 매우 풍부한 혈장 단백질 및 보다 소량으로 존재하는 종(lower abundance)을 포함했다. 예를 들면, 70 nm 크기의 세공을 갖는 비드에서, RNA 폴리머라아제 II 전사 서브유닛 8 동족체(homologue)의 매개체(mediator)로 명명된 단백질이 분리되었다. 17 nm 크기의 세공을 갖는 비드 분획에서, 히스톤 4 및 골지 자가항원(golgi autoantigen)을 회수하였다. 전통적으로 혈청 단백질로 간주되지 않았던 이 분자 종들의 존재는 개체 단백질(organismal protein)의 단편들이 혈청으로 이동하여 개체의 전체 상태의 전반적인 반영(portrait)을 제공한다는 가설을 지지할 수 있다. 70 nm 크기의 세공을 갖는 비드를 이용하여 분리된 하나의 단 백질인 아포리포프로테인 A-I은 최근에 난소암의 잠재적 마커로 보고되었다(Zhang et al., 2004). 또한, 상기에서 언급된 연구에서 역시 잠재적인 난소암 마커로 보고된, 트랜스티레틴(transthyretin)은 17 nm 크기의 세공을 갖는 비드를 이용하여 수집되었다.
혈액으로부터 바이오마커 정보 회수를 강화하기 위한 특별한 기법의 이용은 해부 병리 진단에서 특별한 조직화학적 연구의 이용과 유사할 수 있다. 해부 병리학은 그 식별자(discriminator)가 질병 표본과 정상 표본 간의 차이점 분석에 의해 생성되는 것인 증후학(seminology)이다. 통상적으로 염색된 조직 절편의 힘든 육안 비교(laborious visual comparison) 및 신규한 조직화학적 기법의 적용 후에 질병 지표(indicator)들을 발견한다. 병리학/조직 정보 마이닝을 조사하기 위한 후자의 방식은 매우 효과적이어서 다수의 질병 및 상태들의 반복적인 재분류를 유발시켰다; 따라서, 다수의 질병 상태들의 진단이 특별한 조직화학적 연구 후에 본질적으로 밝혀진 정보에 의존하게 되었다. 도 13을 참조한다. H&E 슬라이드와 같은 통상적인 연구를 벗어나는 특화된 조직 분석은 조직의 정보량을 증가시키지 않으나, 회수가능한 정보를 상당히 증가시켜서, 질병 분류 및 예측(prognostication)의 새로운 개선을 가져오, 질병의 기원 및 기초 생물학에 추가적인 단서를 제공할 수 있다.
혈청 및 순환 프로테옴은 다량(high abundance) 분자와 소량(low abundance) 분자의 혼합물일 수 있고, 중요한 진단 정보를 갖는 대부분의 바이오마커는 농도 범위의 보다 낮은 양 영역(lower abundnace region)에 위치할 수 있다. 임상 프로 테오믹스에 대한 과제는 복잡한 생물학적 시료에서 이와 같은 저량 분자들을 신속하게 식별하는 도구를 개발하는 것이다. 하나의 방식은 신속하고, 강건하며, 편리한 분획화 및 선택적 정제를 위한 유통(flow through) 표면 또는 고갈 아키텍쳐(depletion architecture)를 개발하는 것이다. 나노다공성 물질은 물리적변형(physicomodification)이 가능하여 독특한 세공 크기 및 전하 특성이 상기 세공 표면에 첨가될 수 있다. 이와 같은 식별 특성은 혈청 내 단백질의 분획의 미세조정(fine-tuning)을 가능하게 할 수 있다. 추가적으로, 기판의 분획화 특성을 보다 개선하기 위해 친화성 단백질(affinity protein)이 상기 물질 표면에 첨가될 수 있다.
전술된 실험들은 분획화 방법의 효과를 나타내는, 나노세공을 갖는 물질 표면을 이용한 혈청의 분획이 상당히 변화된 스펙트럼 프로파일을 초래할 수 있다는 것을 보여준다. 나노다공성 물질의 하나의 용도는 혈청 시료용 회수 장치일 수 있다. 혈청 내의 불안정한 분자들이 점차 바이오마커로서 관심을 모으면서, 표준화된 회수 절차들이 개시될 수 있다. 나노다공성 기판은 불안정한 소형 분자들을 혈청 회수 절차를 위해 개조될 수 있는 포맷으로 격리시키는 하나의 수단을 제공할 수 있다. 이 유형의 적용에서, 특화된 나노다공성 기판은 후속 분석 및/또는 시각화를 위해 특이적 조직 특성을 보존하기 위해 선별된 경우들에서 선택되는, 특화된 조직 고정제와 유사해질 수 있다.
실리콘은 마이크론-크기 입자로 제조될 수 있기 때문에, 혈액 세포 크기 범위에 있는 나노다공성 기판이 개발될 수 있다. 그와 같은 입자들은 풍부한 혈청 단백질 및 그들이 운반하는 저 분자량 적하물(cargo)의 분획화를 위해 다양한 세공 크기 및 다른 물리화학적 특성을 갖도록 설계될 수 있다. 추가된 특징으로서, 마이크론-크기의 입자들은 금속 태그(metallic tag) 또는 양자 점(quantum dot)와 같은 식별 태그로 코드화될 수 있다. 그와 같은 전략은 Bruchez et al., 1998; Han et al., 2001; Nicewarner-Pena et al., 2001에 기재된 방법과 유사한, 분류(sorting) 또는 농축(enrichment) 방법을 통해 혈액을 채취하고 혈액 세포로부터 입자들을 분리할 수 있게 한다.
본 연구는 순환 프로테옴을 선택적으로 분획하고 정제하며, 분석하는 수단으 로서 나노다공성 기반 저 분자량 분자의 분리 및 분획의 실행가능성(feasibility)을 입증한다.
참조문헌
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실시예 3
본 실시예에서 윗첨자 인용은 실시예 3의 끝에 있는 참조문헌의 목록을 참조한다.
요약
혈청/혈장 프로테옴의 저-분자량 영역(LMWP)이 질환 진단 마커의 잠재적인 원(source)로서 관심을 받고 있다1 -3. 질량 분석법(MS)에 의한 혈청 LMW 단백질 프 로파일링4은 일반적으로 이전에 특이적 칩 표면6 -9 상에 흡착된 분석물의 MS 프로파일링을 포함하는, SELDI-TOF(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight)5에 의존했다. 그러나, 생체 유체(biofluid)에 존재하는 고-분자량의 다량 단백질의 간섭이 분석의 민감도를 제한하고 분석의 재현성에 영향을 미칠 수 있다1 0. MS 분석 전에 LMW 폴리펩티드의 특이적 포착(entrapment)을 가능하게 하는 장치를 이용하여 MS-기반 프로파일링의 민감도를 제고하는 것이 그와 같은 간섭을 최소화할 수 있다. 본 보고에서는, 인간 혈장으로부터 LMW 펩티드(< 15,000 Da)를 선택적으로 포획하기 위해 나노다공성 표면을 이용하였다. 수집된 펩티드의 질량 분석법(MS) 분석은 결합된 분자를 검출하고 평가하는 수단으로서 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight)를 이용하여 수행하였다. 상기 분석의 강화된 선택성 때문에, 인간 혈장에 ng/mL 농도 수준으로 존재하는 소형(< 4,000 Da) 펩티드의 검출이 달성되었다.
결과 및 검토
본 연구의 목표는 크기-배제 원칙(size-exclusion principle)에 근거하여 체액에 포함된 LMW 펩티드를 분류하는 방법을 개발하는 것이었다. 상기 목표를 달성하기 위해, 적합한 다공성을 갖는 나노다공성 표면을 분자 차단물(molecular cut-off)로 이용하였다. 실리콘 칩을 500 nm 두께의 실리콘 산화물 나노다공성 필름으로 코팅하는 것에 의에 장치를 제조하였다. Lorentz-Lorenz 모델을 이용하여, 타 원분광기(ellipsometry)에 의해 필름의 다공성을 결정하기 위해 굴절률을 측정하였다. 추정된 다공성은 57%였다. 질소 흡착-흡착 등온선 측정값을 이용하여 결정된 필름의 BET(Brunauer-Emmett-Teller) 표면적은 670m2/g이었다. 평균 세공 크기는 7 nm 정도였다. 도 14는 투과 전자 현미경(TEM)을 이용한 실리콘 산화물 다공성 필름의 형태를 보여준다.
제조된 칩을 인간 혈장으로부터 LMW 펩티드를 회수하기 위해 이용하였다. 나노다공성 표면을 이소프로판올 및 탈이온수에 의한 순차적인 세척으로 적신 후에, 인간 혈장 1방울(5 ㎕)을 직접 칩 표면에 적용하고 뒤이어 펩티드/단백질 종의 포획을 위해 인큐베이션시켰다. 탈이온수에 의한 일련의 순차적인 세척 후에, 결합된 종들을 높은 백분율의 유기 용액(50% v/v)를 포함하는 산성 MALDI 매트릭스 용액(α-시아노-4-히드록시 신남산, CHCA)의 첨가에 의해 표면에서 방출시켰다. 추출 용액 1 ㎕의 분량을 MALDI 플레이트 상에 침착시키고 MS 분석을 위해 이용하였다. 도 15에서, 나노다공성 실리카 표면 및 솔리드 비-나노다공성 실리카(solid non-nanoporous silica)의 대조 표면을 이용하여 수득된 MALDI-TOF 스펙트럼이 비교된다. 전자에서, 1 ㎍/mL의 농도로 인큐베이션된 혈장 내에 스파이킹되었던, 인간 칼시토닌을 포함한 약 70개의 저분자량 펩티드가 검출되었다. 대조적으로, 대조구 표면의 분석에서 수득된 MS 스펙트럼에서는 펩티드가 검출되지 않았다. 큰 단백질에 대해 보다 특이적인 매트릭스인 시나핀산(sinapinic acid)을 이용하여 동일한 나노다공성 시료 상에서 보완적인 MALDI-TOF 분석도 수행하였다. 이 경우, 다른 상태로 MALDI-TOF 스펙트럼을 지배했을, 알부민 및 일부 다른 풍부한 혈장 단 백질의 추출 미량을 검출하였으나, 모든 다른 MS 신호는 15,000 m/z 미만의 영역에 집중되었다. 따라서, 15 kDa은 실제의 실험 조건 및 이용된 표면의 나노다공성에 의해 달성된 근사한 차단 질량 값(cut-off mass value)일 수 있다.
본 발명은 이론에 의해 한정되지 않으나, 도 15에 도시된 바와 같이 혈장으로부터 LMW 펩티드의 분리 및 검출은 아마도 칩 표면의 특이적 나노미터-크기의 다공성 때문일 것이다. 상기 세공을 용이하게 통과할 수 있을 정도로 작은 분석물만이 상기 칩 표면에 정량적으로 흡착될 수 있다. 따라서, 이 방식은 LMW 농축 및 분석을 위해 선택적으로 이용될 수 있다.
칩 표면으로의 분석물의 흡착은 인큐베이션 단계 동안 포획 후 칩의 강력한 세척을 견딜 수 있을 정도로 강해야 한다. 이와 같은 특정한 경우에, LMW 분석물과 실리카 나노다공성 층 상에 존재하는 실라놀기 간의 이온성 상호작용이 분석물 결합을 설명할 수 있다.
생성된 프로파일의 반복성을 평가하기 위해, 동일한 혈장 시료에 대해 5회의 반복 분석을 수행하였다. 수득된 MALDI-TOF 스펙트럼은 도 16에 보고되며, 상기 도면에서 LMW 프로파일의 반복성을 알 수 있다.
상기 방법의 검출 한계(DL)는 상업적으로 이용가능한 펩티드, 칼시토닌을 상이한 농도로 인간 혈장에 첨가하는 것에 의해 추정될 수 있다. 인 비보(in vivo) 조건을 모방하기 위해, 분석 전에 인간 칼시토닌을 혈장으로 스파이킹시켰다. 상기 스파이킹된 혈장을 나노다공성 실리카 표면 상에서 인큐베이션시키고 뒤이어 MALDI-TOF 프로파일링을 수득하여 상기 분석을 수행하였다. 도 17은 최저 20 ng/mL까지의 4개의 상이한 농도 수준에서 칼리토닌 양성자화(protonated) 분자(이론적 m/z= 3421.0)에 해당하는 피크의 강도를 보여준다. 이 농도 DL은 유사한 접근방식을 이용하여 문헌11에서 보고된 최근의 데이터 대비 현저한 개선을 나타낸다.
최저 칼시토닌 농도, 20 ng/mL를 갖는 스파이킹된 혈장 1 방울은 100 pg 칼시토닌의 절대량을 포함했다(5 ㎕를 상기 나노다공성 표면에 적용함). 추출 용액의 1/3이 분석을 위해 MALDI 플레이트 상에 침착되었다는 것을 고려할 때, 최대 33 pg의 칼시토닌이 MALDI-TOF 검출을 위해 이용가능했다. 그와 같은 양은 표준 조건에서 MALDI-TOF에 의해 분석된 칼시토닌에 대한 실제의 DL에 해당한다(CHCA 매트릭스와 혼합된 표준 펩티드 용액, 1 ㎕를 분석을 위해 MALDI 표적 상에 침착시킴). 이는 스파이킹된 칼시토닌의 상당한 부분이 분석된 최저 농도에서도 나노다공성 표면에 의해 혈장으로부터 효율적으로 수집되고, LMW 펩티드 추출 후 MS 검출을 위해 이용가능하게 된다는 것을 의미한다.
실리콘-기반 나노다공성 표면은 또한 그와 같은 분자 차단제를 형성할 수 있었다. 전기화학적 에칭에 의해 나노다공성 실리콘을 제조하고, 중시적 토포그래피(mesoscopic topography)(실리콘의 마이크로크기 공간(microzied caves)을 덮는, 나노다공성 실리카와 유사한 나노다공성 필름(nanosized pores film))를 생성했다. 상기 나노다공성 실리콘은 전술된 프로토콜에서 실리카 코팅된 칩 대신에 수집제(harvesting agent)로서 이용되었다. 큰 단백질인 알부민의 과량의 존재 하에 두 개의 낮은 분자량 표준 펩티드의 격리를 질량 분석법에 의해 관찰하였다.
방법
나노다공성 표면 제조
산화물의 나노다공성 필름을 하기와 같이 제조하였다. 8.71g의 계면활성제 EO106PO70EO106(Pluronic F127, BASF)를 23g의 에탄올에 첨가하였다. 그 후, 10 g의 테트라에틸오르토실리케이트(TEOS, Aldrich), 0.1006g의 염산염(20%), 1Og의 에탄올 및 10.629 g의 물의 혼합물을 강한 교반 하에 첨가하였다18. 실온에서 3-6시간 동안 숙성시킨 후, 실리콘 웨이퍼 상에 전구체 용액을 30초 동안 1900 rpm으로 스핀-코팅시켰다. 스핀-코팅 후에, 상기 필름을 노(furnace)에서 100℃로 12시간 및 뒤이어 400℃로 2시간 동안 소성시켰다.
시료 제조
이소프로판올을 이용하여 칩 표면을 습윤시켰다. 물로 세척한 후, 동의(consent) 및 인간 개체 보호에 관한 Institutional Review Board 모니터링 하에 건강한 지원자로부터 채취된 5 ㎕의 인간 혈장(공표된 가이드라인에 따라 채취됨19)을 상기 칩 표면에 적용하고 100% 습도 및 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 피펫(pippetor)을 이용하여 시료를 제거하였다. 그 후, 상기 표면을 5 ㎕ 분량의 물로 5회 순차적으로 세척하고, 매 경우 액적(droplet)이 상기 표면상에 1분 동안 존재하게 하였다. 마지막 세척 후에, 아세토니트릴과 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v)의 1:1 혼합물에 담긴 3 mg/mL α-시아노-4-히드록시신남산(CHCA, Sigma)으로 구성된 MALDI 매트릭스 용액 3 ㎕를 이용하여 상기 칩 표면상에 결합된 분석물을 추출하였다. 상기 추출액 1 ㎕를 MALDI 시료 플레이트 상에 침착시키고 질량 분석법 분석 전에 건조시켰다.
질량 분석법
337 nm에서 방사되는 질소 레이저가 장착된 Voyager-DE™ STR MALDI-TOF(Applied Biosystems) 질량 분석기 상에서 MALDI-TOF를 수행하였다. 700 나노세컨드의 지연 추출 시간(delayed extraction time) 및 20 kV의 가속 전압을 이용하여 선형 포지티브 모드(linear positive mode)로 스펙트럼을 수득하였다. 최종 시료 스펙트럼을 생성하기 위해 통상적으로 500-600개의 레이저 샷(laser shot)을 평균했다.
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실시예 4
혈관형성 단백질(angiogenic protein)의 수집 및 표적화를 위한 프로테옴 나노칩
본 실시예에서 괄호 안의 인용번호는 실시예 4의 끝에 기재된 참조문헌의 목록을 참조한다.
질량 분석법(MS)은 20 kDa 미만의 분자량을 갖는 펩티드의 정량적 및 정성적 특성 규명을 위한 강력한 기술이다. 민감도의 측면에서, 레이저 탈착 MS는 최근에 낮은 아타몰(attamole) 수준의 민감도 내에서 펩티드를 검출할 수 있는 것으로 입증되었다(7). 따라서, 원칙적으로, MS는 단지 수 마이크로리터의 시료를 이용하여 pg/mL 수준으로 용액 내에 존재하는 펩티드에 대한 분석적 접근을 가능하게 한다. 인간 혈청 및 조직에서 그와 같이 낮은 수준의 펩티드 종들을 검출하는 것은 바이오마커 발견을 위해 매우 강력한 도구가 된다. 그럼에도 불구하고, 그와 같은 수준의 민감도는 인간 혈청 또는 조직의 통상적인 MS 분석에 의해 아직 달성되지 않았다. 이는 주로 MS 분석의 한정된 동적 범위(limited dynamic range) 때문이고, MS 분석은 최상의 경우, 최대 10,000 배 과량의 다른 단백질/펩티드와 같은 간섭 종들의 존재 하에 펩티드 분석물을 검출할 수 있다. mg/mL 수준으로 존재하는 고 분자량 담체 단백질의 간섭은 최대 103-104배 낮은 양(maximum of 3-4 orders of magnitude lower)의 농도, 즉, 낮은 ㎍/mL 범위 내에 있는 농도로 존재하는 펩티드의 검출을 가능하게 한다.
최근에는 진단 마커의 잠재적인 원(source)으로서 인간 혈청 내의 저 분자량 프로테옴(LMWP)에 관심이 모아지고 있다(3, 8-11). 혈청 및 조직 내에 매우 낮은 수준으로 존재하는 LMWP의 분석을 위한 MS의 이용은 이 중요한 정보 원을 검출하는 능력을 제고하기 위해 광범위한 시료 분획화가 필요할 수 있다는 것을 시사한다. 분석대상 펩티드의 복잡성을 감소시킬 수 있는 하나의 방법은 특정한 물리화학적 특성을 갖는 전체 프로테옴의 분획의 분리, 예를 들면, 크기에 근거한 펩티드의 분획화이다.
특정한 세공 크기 및 다공성을 갖는 나노다공성 실리카/실리콘-기반 표면은 혈청 시료 내의 저 분자량 펩티드의 흡착을 가능하게 한다. 정의된 특성을 갖는 그와 같은 표면의 이용은 분자 차단제(molecular cut-off) 또는 분자체(molecular sieve)를 생성한다. 따라서, 수 마이크로리터의 혈청이 LMWP의 수집을 위해 나노다공성 표면에 직접 적용될 수 있다. 나노다공성 표면의 세척 후에, 결합된 분석물을 수집하고 MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS)에 의해 프로파일링할 수 있다. 이 방법에 의해 제공된 나노다공성 표면을 이용한 특정 크기의 단백질 검출의 민감도 개선은 혈청 및 조직에 ng/mL 농도로 존재하는 LMWP의 탐색을 가능하게 한다.
혈청 및 종양 조직에 존재하는 펩티드의 포획 및 식별의 민감도를 강화하는 수단으로서 나노다공성 입자를 개발하는 것 외에, 본 실시예는 민감도를 제고하기 위해 통합된 실리카/실리콘 칩의 개발 및 개선에 중점을 둔다. 상기 칩의 표면은 비활성, 비-다공성, 비-흡착성(inert, non-porous, non-adsorbant) 칩 표면 전체에 분포된, 여러 개의 패턴화된 "활성의(active)" 나노다공성 스팟을 갖도록 구축하였다. 실리카/실리콘 칩의 표면 특성의 변형은 상기 칩 상에 침착시킨 혈청 또는 조직 추출물의 시료 5-10 ㎕에 함유된 LMW 펩티드가 상기 "스팟" 영역에 흡착되고, 농축되고, 한정될 수 있게 한다. MS 분석 전에 결합된 분석물을 최소 부피(100-200 nL)에 추출하는 것은 민감도를 강화시킬 수 있다. 또한, 나노다공성 스팟 표면을 갖는 칩으로부터 직접적인 MS 이온화는 추가적인 시료의 희석을 방지한다. 칩상 농축 방식(on-chip up-concentration approach)을 직접적인 "스팟" 이온화와 결합시키는 것에 의해, 민감도의 개선은 현재 존재하는 pg/mL 범위의 분석 한계를 초월할 수 있다.
표준 조건(예를 들면, 1 ㎕의 시료/매트릭스 용액을 표적에 적용함)에서, 생성된 결정의 작은 분획에만 실제로 레이저를 적용하고 MS 데이터를 수득하기 위해 이용하였다(일반적으로 0.1-1%). 칩의 표면 특성을 조정하는 것에 의해 목적 펩티드 분석물의 표면상 예비-농축(on-surface pre-concentration)에 대한 민감도 개선을 달성할 수 있다. 레이저 이온화를 위한 여러 패턴화된 "활성의" 나노다공성 스팟 및 비-다공성, 비활성(따라서, 흡착하지 않는) 칩 표면을 제시하도록 실리콘 칩 표면을 구축할 수 있다. 그와 같은 방식은 최초 시료 방울이 비활성 표면에 의해 둘러싸인 나노다공성 "스팟" 상의 중심에 배치되면, 칩 상에 침착된 5-10 uL의 혈 청 시료에 포함된 LMW 펩티드가 한정된 영역(즉, 나노다공성 "스팟")에 흡착되고 농축될 수 있게 한다. MS 분석 전에 결합된 분석물을 최소 부피(100-200 nL)로 추출하는 것은 또한 분석물 검출의 민감도를 강화하기 위해 유용할 수 있다. 또한, 나노다공성 스팟 표면으로부터의 직접적인 MS 이온화는 추가적인 시료 가공/매트릭스에 의한 희석을 방지할 수 있다. 나노다공성 스팟의 직경은 결합된 펩티드가 나노다공성 표면으로부터 추출되어 MALDI 시료대(sample stage) 상에 침착되는 경우, 마이크로피펫에 의해 처리될 수 있는 최소 부피; 또는 ii) 칩으로부터의 직접적인 이온화가 시도되는 경우, 레이저 스팟의 직경에 의해 한정될 수 있다. 제1 옵션에서, 0.5-1 mm 직경 범위의 나노다공성 스팟이 테스트될 수 있고, 이는 수백 나노리터 범위의 추출 용액 부피를 요구할 수 있다. 제2 옵션에서, 최소 0.1-0.2 mm까지의 스팟 직경이 테스트될 수 있다. 칩-상 농축(on-chip up-concentration)과 직접적인 "스팟" 이온화를 결합시키는 것은 혈청 또는 조직 시료에서 LMWP의 분석에 대한 분석물 검출의 민감도의 큰 개선(ordrs-of-magnitude improvement)을 제공할 수 있고, 그와 같은 분석물의 MS 분석의 한계를 ng/mL 범위 미만으로 낮출 수 있다.
실험 방법.
나노다공성 표면의 제조: 산화물의 나노다공성 필름을 하기와 같이 제조하였다. 8.71g의 계면활성제 EO106PO70EO106(Pluronic® F127)를 23g의 에탄올에 첨가하였다. 그 후, 10 g의 테트라에틸오르토실리케이트(TEOS), 0.1006g의 염산염(20%), 1Og의 에탄올 및 10.629 g의 물의 혼합물을 강한 교반 하에 첨가하였다. 실온에서 3-6시간 동안 숙성시킨 후, 실리콘 웨이퍼 상에 전구체 용액을 30초 동안 1900 rpm으로 스핀-코팅시켰다. 스핀-코팅 후에, 상기 필름을 노(furnace)에서 100℃로 12시간 및 뒤이어 400℃로 2시간 동안 소성시켰다. 상기 필름의 두께는 약 500 nm였다. 다공성은 57%로 추정되었고 평균 세공 크기는 7nm였다. 질소 흡착-흡착 등온선 측정값을 이용하여, BET(Brunauer-Emmett-Teller) 표면적은 670 m2/g로 추정되었다.
프로테옴 칩의 제조; 실리콘 칩 제조 방법은 4개의 포토리소그래피(photolithography) 단계 및 1개의 소프트 콘택트(soft contact)를 이용한 표면 처리 단계를 포함할 수 있다. 표준 세정 단계 후에, 레이저 스팟팅 영역을 패턴화하고, RIE(Reactive Ion Etching, Lam Cl2:He=180:400sccm 1OOW 30OmT)를 이용하여 에칭시켰다. e-빔 증발기(Denton Vacuum, 전류 100mA, 침착 속도(deposition rate) O.lnm/분)를 이용하여 10nm/50nm의 티타늄/골드 박층을 침착시키고 감광제(photoresist)의 박리(lift-off)에 의해 패턴화시켰다. 전술된 섹션에 기재된 프로토콜을 이용하여 나노다공성 표면을 스핀-코팅하고, 400℃에서 어닐링시켰다. 상기 나노다공성 표면을 리소그래피에 의해 한정하고, BOE(buffer oxide etchant) 를 이용하여 식각시켰다. 진한 음성 감광성 레지스트(thick negative, photosensitive resist) SU-8(MicroChem Inc)을 이용하여 시료 스팟팅을 위한 칩의 웰을 제조하였다. 제조사에 의해 제안된 프로토콜을 이용한, 노광(exposure), 성(baking), 노광후 소성(post exposure baking), 및 현상(developing) 후에, 25 ㎛ SU-8 미세구조(microstructure)가 형성되었다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 처리 전에 산소 플라즈마(MicroRIE 100W, O2 100 sscm)를 이용하여 세정하였다. 예비-농축(pre-concentration) 단계에서 비-다공성 실리콘 표면 상으로의 단백질 흡착을 감소시키기 위해 PEG를 이용하였다. 실리카 표면 상에 공유결합을 형성하기 위해 상기 웨이퍼를 트리에틸아민 및 실리콘 테트라클로라이드의 첨가제를 포함한 1% PEG(Mw1OOODa, 톨루엔에 담김)에 담궜다(dip). 폴리(디메틸실록산)(PDMS, Dow Corning)을 릴리프 패턴(pattern relief)을 갖는 매스터(master)에 대해 탄성중합체 스탬프로 주조하였다. 상기 스탬프를 톨루엔에 담긴 5% 클로로(디메틸)옥타데실실란 용액에 담그고, 건조시켜 기판과 접촉시켰다. 5O℃로 밤새 가열하고, 상기 스탬프를 제거하였다. 선형 옥타데실 탄화수소 사슬(C18)이 레이저 스팟팅 영역에 탁월한 결합 능력을 제공한다.
표면 변형: 칩은 각각 특이한 표면 조성을 갖는 두 개의 상이한 영역을 갖는, 여러 개의 웰로 구성될 수 있다. 표면을 산소 플라즈마(O2 lOO sccm, 50W)에서 히드록실화시켰다. 이소프로판올(IPA)에 담긴 0.5% v/v 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)에 의한 실온에서 30분 동안의 실란화(silanization)에 의해 상기 표면에 양 전하, 아민기를 도입하였다. IPA에 담긴 0.5% v/v 3-머캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS) 및 0.5% v/v H2O을 이용하여 상기 표면 상에 음전하, 티올 기를 코팅하였다. 트리에틸아민 및 실리콘 테트라클로라이드의 첨가제를 포함한 1% 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)로 친수성의 히드록시기를 처리하였다. 소수성 표면을 5% 클로로(디메틸)옥타데실실란(C18)에 의해 유도체화시켰다. 실란화 후에, 입자들을 용매에서 5회 세척하고 110℃에서 2시간 동안 건조시킬 수 있었다. 물리적 기(전하) 및 작용기를 측정할 수 있다. 예를 들면, APTES 처리 표면상의 전하의 양이 제타 전위 측정(zeta potential measurement)에 의해 결정될 수 있고, 기능성 아미노기 밀도가 예를 들면, 0.4 ml 피페리딘(peperidine), 0.4 ml DCM, 및 1.6 ml MeOH를 이용하여 Fmoc방법에 의해 결정될 수 있다. 무처리(non-treated) 표면과 소수성 다공성 표면이 농축(enrichment) LMWP 상에 있는 작용기의 기여를 연구하기 위한 대조구로서 이용될 수 있다.
재조합 단백질의 생산: 이 실험들은 마우스 시스템에서 VEGF 전사체의 차등적 발현의 최초의 식별(identification)이었기 때문에, 서열 VEGF144 및 VEGF205 *를 클로닝하여 확인하였다. 새로 식별된 VEGF144 및 VEGF205 * 스플라이스 변이체(splice variant)의 기능적 활성을 분석하기 위해 재조합 단백질을 제조하였다.
저 분자량 단백질의 분획화 : 이소프로판올을 이용하여 칩 표면을 습윤시켰다. 물로 세척한 후, 5 ㎕의 혈청/종양 시료를 상기 칩 표면에 적용하고 100% 습도 및 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 과량의 시료를 마이크로피펫을 이용하여 제거할 수 있었다. 그 후, 표면을 5 ㎕ 분량의 멸균되고, 탈이온화되고, 계면활성제를 포함하지 않는 HPLC 등급의 물로 5회 순차적으로 세척하고, 매 경우 액 적이 상기 표면상에 1분 동안 존재하게 하였다. 마지막 세척 후에, 아세토니트릴과 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v)의 1:1 혼합물에 담긴 3 mg/mL α-시아노-4-히드록시신남산(CHCA, Sigma)으로 구성된 MALDI 매트릭스 용액 3 ㎕를 이용하여 상기 칩 표면상에 결합된 분석물을 추출하였다. 상기 추출액 1 ㎕를 MALDI 시료 플레이트 상에 침착시키고 질량 분석법 분석 전에 건조시켰다.
질량 분석법: 337 nm에서 방사되는 질소 레이저가 장착된 Voyager-DE™ STR MALDI-TOF(Applied Biosystems) 질량 분석기 상에서 MALDI-TOF를 수행하였다. 700 나노세컨드의 지연 추출 시간 및 20 kV의 가속 전압을 이용하여 선형 포지티브 모드로 스펙트럼을 수득하였다. 최종 시료 스펙트럼을 생성하기 위해 통상적으로 500-600개의 레이저 샷을 평균했다.
단백질 서열 연구: 단백질 분석: 분획화된 시료를, UV-VIS 분광분석기(Spectramax® Plus 384, Molecular Devices) 상에서 595 nm에서 모니터링된 200 ㎍/mL 내지 1 mg/mL 범위의 우혈청 알부민(BSA) 표준을 이용한 전통적인 브래드포드(Bradford) 분석법으로 분석하였다.
ID 겔 분리 및 소화(digestion): 15 g의 각 비드 분획화 시료 및 3 ㎕의 정제되지 않은(raw) 혈청을 30 ㎕의 LDS 시료 완충액으로 희석하고 95℃에서 5분 동안 끓였다. 복잡한 단백질 혼합물의 원하는 분자량 영역을 분리하기 위해 상기 분획들을 ID 사전-제작된(pre-cast) 겔(4-12% Bis-tris) 상에서 전개시켰다. 상기 젤을 ddH2O로 철저하게 세척하고, 50% 메탄올/10 % 아세트산 용액에서 30분 동안 고 정시키고, Sypro® ruby 염색으로 밤새 염색시키고, UV 여기(excitation) 및 시각화 전에 3시간 동안 ddH2O로 탈색시켰다. 상기 겔을 1 mm2 겔 영역으로 잘라내고, 겔 밴드를 50% 메탄올에서 탈색시켰다. 겔 밴드를 10 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 55 mM 요오도아세트아미드로 환원 및 알킬화시키고, 4℃에서 1시간 동안 트립신(20 ng/㎕)에서 인큐베이션시키고, 37℃에서 25 mM NH4HCO3에서 밤새(16시간) 처리하였다. 다음날 아침, 상기 겔을 70% ACN/5% 포름산 용액과 반복적으로 인큐베이션시켜서 단백질을 추출하였다.
LC/MS/MS 분석: 질량 분석법 분석을 위해 시료를 건조상태에 가까운 상태까지 동결건조시키고 6.5 ㎕의 HPLC 완충액 A(95% H2O, 5% ACN, 0.1% FA)로 재구성시켰다. 변형된 나노스프레이 원을 갖는 ThermoFinnigan LCQ Classic 이온 트랩 질량 분석기(San Jose, CA)에 온라인으로 결합된 Dionex's LC Packings 액체 크로마토그래피 시스템으로 미세모세관 역상 LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 자체-제작한(in-house), 슬러리 충진된 모세관 컬럼으로 역상 분리를 수행하였다. C18 실리카-결합 컬럼(C18 silica-bonded column)은 300 옹스르롬 세공을 갖는 5 ㎛ 비드로 충진된 75 ㎛ i.d., 360 ㎛ o.d., 10 cm 길이의 건식 실리카였다(Vydac, Hesperia, CA). μ-전치컬럼(precolumn) PepMap, 5 mm, C18 카트리지(Dionex)는 탈염(desalting) 컬럼으로 작용한다. 시료를 ㎕ 픽-업(pick-up) 모드로 주입하고 완충액 A로 세척하고 뒤이어 200 nL/분의 유속으로 95분 동안 85%까지 완충액 B(95% ACN/5% H2O/0.1% 포름산)로 선형 구배로 용리시켰다(linear gradient elution). 완전한 MS 스캔 후에 뒤이어 가장 풍부한 펩티드 이온의 4회의 MS/MS 스캔을 수행하고(데이터-의존적 모드) CID(Collision induced dissociation)를 2.00 kV의 이온 분무 전압 설정, 22.80 V의 모세관 전압 및 180℃의 온도로 38%의 충돌 에너지에서 수행하였다.
데이터 분석: Sequest Bioworks Browser(ThermoFinnigan)를 통해, Swiss-Prot, TrEMBL 및 Ensembl 엔트리의 비-중첩 프로테옴 세트의 MS/MS 스펙트럼을 European Bioinformatics Institute에서 검색하는 것에 의해 데이터 분석을 수행하였다. MS/MS 데이터의 수동 검사 및 상관 점수(표 2 참조)를 필터링한 후, 펩티드를 정당한 히트로 간주하였다. 데이터를 필터링하기 위해 이용된 기준은 적어도 대부분의 인용 문헌만큼 엄격했다.
표 2
전하 Xcorr DeltaCN 이온 Rsp
+1 >1.9 >0.1 >50% =1
+2 >2.5 >0.1 >50% =1
+3 >3.5 >0.1 >50% =1
수용된 펩티드 히트는 데이터베이스에서 모든 다른 펩티드에 대해 Xcorr랭킹(ranking)= 1이어야 했다.
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실시예 5
단백질분해 단편 수집을 위한 나노다공성 입자
나노기술과 질량 분석법(MS)의 조합을 이용한 방법의 개발은 유방암 환자의 혈청에 존재하는 저-분자량 프로테옴(LMWP; < 20 kDa 또는 < 15 kDa) 내에서 공지된 단백질 및 신규한 단백질을 신속하게 식별할 가능성을 가져온다. 그와 같은 작업의 도전은 개별 환자의 상이한 종류의 치료법에 대한 반응의 예후 또는 평가의 예측자로서, 유방암과 같은 질병의 검출 및 진단을 위해 유용할 수 있는 보다 낮은 분자량, 보다 소량(lower abundance)의 단백질의 농도를 증가시키면서, 알부민과 같은 보다 큰 혈청 담체 단백질의 차폐(masking) 효과를 감소시키는 것일 수 있다. 이 연구에서, 특정한 세공 크기를 가지며 양성 전하 또는 음성 전하 또는 소수성과 같은, 특정한 표면 특성을 가지며, 인간 유방 종양 이종이식편(xenograft)을 갖는 누드 마우스로부터 분리된 혈청에 존재하는 상이한 분자량 범위 내의 단백질의 흡착을 차등적으로 강화시킬 수 있는, 나노텍스쳐(nanotextured) 실리카/실리콘 기반 칩을 개발하였다. MCF-7/벡터 대조구 세포에 비해 50배 높은 수준의 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 5배 증가된 수준의 에스트라디올 수준을 생성하는 인간 MCF-7/시클로옥시게나아제-2(MCF-7/Cox-2) 유방 종양 이종이식편으로부터 혈청을 분리하였다. 베타-에스트라디올의 지속 방출형 펠릿(sustained release pellet)을 이식시킨 8-10주령의 난소절제된 암컷 누드 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)로 MCF-7/Cox-2 인간 유방 종양 세포를 주사하였다. 종양 세포 주사 후 15일, 28일, 42일 및 69일 차에, 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 혈액을 분리하고 가공하여 혈청 시료를 분리하고, 나노칩 상으로 용리시키고, 그 후, MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time of Flight) 프로테옴 분석 및 MS/MS(Mass Spectrometry/Microsequencing)와 결합시켰다. 동일한 시점에, 유방 종양 이종이식편을 측정하고 프로테옴 분석 및 조직학적 평가를 위해 분리하였다. 이 연구들은 인간 유방 종양 이종이식편을 갖는 마우스의 혈청 내에 있는 저 분자량 단백질의 재현가능하고 민감한 스펙트럼 반영(portrait)을 제공하고 유방 종양의 발달, 침윤(invasion), 및 전이의 초기 단계 동안 유방 종양에 의해 생성되는 단백질의 민감한 검출을 위한 MS 방법과 조합된, 특이적 표면 특성을 갖는 실리카/실리콘 나노칩의 유용성을 보여주었다. 따라서, 현재까지 인간 종양 이종이식편을 갖는 마우스로부터 분리된 혈청의 LMWP 내에서 79개의 독특한 단백질을 식별하였다.
실험 설계 및 방법
실험 동물
종양 발달에 대해 정립된 하기의 일정에 따라 마우스로부터 혈액을 채취하였다.
시료는 하기를 포함했다:
15마리의 대조구 마우스 - 0.8-1.5 ml 혈액(0.4-0.75 ml 혈청)
28일 동안 인간 유방 종양 이종이식편을 가진 15 마리의 마우스 - 0.8-1.5 ml 혈액(0.4-0.74 ml 혈청)
42일 동안 인간 유방 종양 이종이식편을 가진 15 마리의 마우스 - 0.8-1.5 ml 혈액 (0.4-0.74 ml 혈청)
60일 동안 인간 유방 종양 이종이식편을 가진 15 마리의 마우스 - 0.8-1.5 ml 혈액 (0.4-0.74 ml 혈청)
모든 분석은 상기 혈액 시료로부터 수득된 혈청을 대상으로 수행할 수 있었다.
혈청 수집 및 보관
심장 천자에 의해 혈액을 수득하여 레드 탑 튜브(red top tube)에 채취하고, 4℃에서 2시간 동안 응고되게 하고, 혈병을 제거하였다.
원심분리 후 각 마우스로부터의 혈청을 회수하고 하기와 같이 -80℃에서의 보관을 위해 동결용 바이알(cryovile)로 분주하였다. 매 시점으로부터의 마우스를 각각 5마리씩 포함하는 A, B 및 C의 세 개의 그룹으로 무작위로 분리하였다. 혈청 채취 후, 그룹 A(Al, A2, A3, A4, 및 A5)의 각 마우스로부터 채취된 혈청의 동일 부피를 혼주하고(pool), 100 ㎕ 분량으로 보관하였다. 그룹 B 및 C의 동물로부터 유사한 세트의 시료들을 수득했다. 그룹 A, B 및 C로부터의 혼주 혈청(pooled sera)을 분석 및 나노비드와의 인큐베이션을 위해 이용했다. 모든 분석은 동결된 스톡으로부터 직접 해동된 시료에 대해 수행될 수 있고, 제2 또는 반복된 동결 해동 사이클을 거친 시료는 이 연구의 일부로 간주될 수 없다.
시료 분배 및 처리.
수집된 혼주 혈청 중 400 ㎕를 실험을 위해 사용하였다. 남은 혼주 혈청은 -80℃에 보관하고, 추후의 분석을 위해 이용할 수 있다.
시료 보관.
원심분리 후 각 마우스로부터의 혈청을 수집하고 하기와 같이 -8O℃에서의 보관을 위해 동결용 바이알에 분주하였다. 모든 분석은 동결된 스톡으로부터 직접 해동시킨 시료에 대해 수행하였다. 가공 및 분석용으로 지정된 시료는 드라이 아이스에 넣어 이동시킬 수 있다.
나노다공성 비드와의 인큐베이션(차단 분자량( MW cut off ) 16 kDa )
정제되지 않은 혈청의 분량(20 ㎕)을 해동시키고 80 ㎕의 탈이온수를 첨가하여 희석시켰다(1:5)(총 시료 부피 100 ㎕). 상기 희석된 혈청을 실온(RT)에서 1시간 동안 탈이온수로 4회 예비 세척시킨
1 mg의 나노비드와 함께 인큐베이션시켰다(인큐베이션 동안 비드 현탁에 대해 시료를 모니터링하고, 필요한 경우, 나노비드를 인큐베이션 동안 15분 간격으로 희석된 혈청에 재현탁시켰다). 상기 인큐베이션 후에, 비드를 미세원심분리기(microfuge)를 이용한 원심분리(30초, 10,000 rpm)에 의해 혈청으로부터 분리하고, 비드에 의해 고갈된 희석된 혈청(bead depleted diluted serum)을 분석 및/또는 -8O℃에서의 보관을 위해 제거하고, 상기 비드를 탈이온수에 담긴 0.1% TFA 100 ㎕로 3회 세척하였다(각각 실온에서 5분씩). 최종 세척 후에, 비드를 실온에서 80 ㎕의 아세토니트릴/0.1% TFA(75:25)와 30분간 인큐베이션시키고, 용출액을 제거하고, 분주하여 -80℃에 보관하였다. 조사대상인 상이한 나노비드 각각에 대해 상기 절차를 수행하였다.
수집된 각각의 혈청 시료를 하기를 포함하는 총 12종의 상이한 나노비드 제제와 인큐베이션시켰다: 7 nm 또는 20 nm 크기의 세공을 갖는 입자; 상이한 화학적 특성의 산화물(different chemistry oxide), NH2, PEG-NHS를 갖는 입자; 및 직경 5 ㎛ 또는 20 ㎛의 입자. 전체 종류의 나노비드에 의한 단일 혈청 시료의 완전한 분석은 약 300 ㎕의 혈청을 필요로 할 수 있다(12종의 비드 x 25 ㎕ 혈청/인큐베이션).
시료의 SELDI 분석
각각의 혼주 혈청 시료에 대해 SELDI-TOF 질량 스펙트럼을 수득하고 나노비드로 고갈시킨 혈청 및 나노비드 용출액의 스펙트럼과 비교하였다. 결합된 단백질의 프로파일을 수득하기 위해 약 양이온 교환 칩(WCX2 ProteinChips, Ciphergen Biosystems, Inc.)을 이용하였다. 칩을 하기와 같이 가공하였다. 생물반응기에 배치된 칩을 실온(RT)에서 100 ㎕의 10 mM HCl과 5분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 HCl의 흡인 후에, 칩 스팟을 실온에서 100 ㎕의 탈이온수로 1분씩 2회 세척했다. 그 후, 상기 칩을 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 100 ㎕의 10 mM 암모늄 아세테이트와 5분씩 2회 인큐베이션시켰다. 마지막 암모늄 아세테이트 세정액을 흡인한 후, 상기 칩을 건조시켰다. 그 후, 5 ㎕의 시료를 칩 스팟에 적용하고 실온의 가습된 챔버에서 55분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 칩을 인산염 완충 식염수를 3회 교체하면서 세척하고(각 150 ㎕), 뒤이어 150 ㎕의 탈이온수로 1회 세정하였다. 건조 후에, 50% (v/v) 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 담긴 30% 신남산 용액 1.0 ㎕를 각 스팟에 적용 후 건조시키면서 2회 적용하였다. 건조 후에, 상기 칩을 PBS-II 질량 분석기(Ciphergen Biosystems, Inc.)로 검사하였다. 비교 목적을 위해 동일한 조건 하에서 스펙트럼을 얻을 수 있다. 하기의 기기 설정 조건을 이용하여 스펙트럼을 수집하였다: 1,800 V의 검출기 전압, 6,000 Da의 포커스 질량, 20,000 Da의 상한, 5로 설정된 민감도 증분, 및 145의 레이저 강도. 5개의 위치씩 증가시키면서, 위치(20 내지 80)당 15개의 레이저 샷을 수득했다.
또한, 비드 인큐베이션 전과 후의 혈청 단백질 피크의 강도 및 프로파일을 직접 비교하기 위해, 나노비드 인큐베이션 전 혈청과 유사한, 희석된 정제되지 않은 혈청(탈이온수에 의한 1:5 희석) 5 ㎕, 및 각 나노비드와의 인큐베이션 후의 희석된 혈청(나노비드에 의해 고갈시킨 혈청) 5 ㎕를 스팟팅한 후 SELDI 스펙트럼을 수득하였다. 이 스펙트럼들을 각각의 나노비드 추출물(총 4 ㎕)의 동일한 양으로부터 수득된 SELDI 스펙트럼과 비교하였다.
비드 용출액의 단백질 분석
나노비드 용출액의 단백질 농도는 소혈청 알부민(BSA)를 단백질 표준으로 이용한 표준 미세단백질 분석법(strandard microprotein assay)(브래드포드 또는 BCA 분석법)을 이용하여 결정될 수 있다.
1D 겔 분리
단백질 측정 후에, 시료를 1D 겔 분리로 분석하였다. 각각의 나노비드 용출액 분획 15 ㎍을 30 ㎕의 SDS 시료 완충액에서 인큐베이션시키고 95℃에서 5분간 끓였다. 그 후, 분획들을 미리 제조된 겔(4-12% Bis-Tris)을 이용한 1D 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 후에, 상기 겔을 탈이온수로 세척하고, 50% 메탄올/10% 아세트산 용액에서 30분간 고정시키고, Sypro® ruby 염색으로 밤새 염색시켰다. 상기 겔을 Versadoc 3000 이미지 분석 시스템을 이용한 이미징 전에 탈이온수에서 3시간 동안 탈색시켰다. 상기 겔의 20 kDa 미만의 영역을 조사하고 BioRad 겔 스팟컷터(spotcutter)를 이용하여 코어링(coring)을 위해 밴드들을 선택하였다. 절단된 겔 조작들을 96-웰 멀티플레이트에 배치시켰다. 겔 조각들을 가공 및 LC/MS/MS에 의한 분석을 위해 CCC Proteomics Core로 옮겼다.
LC / MS / MS
겔 조각들을 1시간 동안 50% 메탄올/5% 아세트산으로 세척하였다. 겔 조각들을 아세토니트릴에서 탈수시키기 전에 상기 세척 단계를 1회 반복하였다. 상기 겔 조각들을 0.1 M 중탄산암모늄에 담긴 10 mM 디티오트레이톨(DTT)에서 재수화시키고 실온에서 0.5 시간 동안 환원시켰다. 상기 DTT 용액을 제거하고, 시료를 0.1 M 중탄산암모늄에 담긴 50 mM 요오도아세트아미드로 실온에서 0.5 시간 동안 알킬화시켰다. 요오도아세트아미드 시약을 제거하고 상기 겔 조각들을 아세토니트릴에서 5분 증분(5 minute increment)으로 건조시키기 전에 100 mM 중탄산암모늄으로 세척하였다. 상기 겔을 아세토니트릴로 5분 동안 탈수시키기 전에 다시 100 mM 중탄산암모늄으로 5분 동안 세척하였다. 상기 겔을 5분 동안 건조시켰다. 그 후, 상기 겔을 20 ㎕의 50 mM 중탄산암모늄을 첨가하기 전에, 50 mM 중탄산암모늄에 담긴 20 ㎍/mL 농도의 시퀀싱 등급 변형 트립신에서 재수화시켜 단백질효소를 겔 내로 침투시켰다. 상기 시료를 40℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 형성된 펩티드를 50% 아세토니트릴/5% 포름산에 의한 20분 세척을 2회 수행하여 폴리아크릴아미드로부터 추출하였다. 이 추출물을 깨끗한 96-웰 멀티플레이트에서 합치고 90분 동안 건조시켰다.
양이온 모드(positive ion mode)로 작동되는 나노분무 원(nanospray source)이 장착된 Thermo Finnigan LTQ 질량 분석기에서 모세관-액체 크로마토그래피-나노분무 이중 질량 분석법(capillary-liquid chromatography-nanospray tandem mass spectrometry)(Nano-LC/MS/MS)을 수행할 수 있다. LC 시스템은 LC-Packings A Dionex Co (Sunnyvale, CA)의 Famous 오토샘플러 및 Switchos 컬럼 스위쳐(column switcher)를 갖춘 UltiMate™ Plus 시스템일 수 있다. 용매 A는 50 mM 아세트산을 포함하는 물일 수 있고, 용매 B는 아세토니트릴일 수 있다. 5 마이크로리터의 각 시료를 먼저 포착 컬럼(trapping column)(LC-Packings A Dionex Co, Sunnyvale, CA)에 주입하고 50 mM 아세트산으로 세척하였다. 주입을 위해 주입기 포트(injector port)의 스위치를 켜고 펩티드를 트랩으로부터 컬럼으로 용리시켰다. 나노분무 팁에 직접 충진된 5 cm 75 mm ID ProteoPep II Cl8 컬럼(New Objective, Inc. Woburn, MA)을 크로마토그래피에 의한 분리를 위해 이용할 수 있다. 300 nl/분의 유속으로, 30분 동안 2-80%B의 구배(gradient)를 이용하여 펩티드를 직접 컬럼으로부터 LTQ 시스템으로 용리시켰다. 전체 운전 시간은 58분이었다. 완전한 스캔(full scan), 펩티드의 전하를 결정하기 위한 줌 스캔(zoom scan) 및 스펙트럼에서 가장 풍부한 피크의 MS/MS 스캔을 위해 질량 분석기의 스캔 순서를 프로그래밍할 수 있다. 동적 배제(dynamic exlusion)를 이용하여 동일한 펩티드의 복수 개의 MS/MS를 배제시킬 수 있다.
피크 목록(peaklist)을 작성하는 Mascot Distiller 및 Bio Works 3.1 Software에 있는 Turbo SEQUEST 알고리즘을 이용하여 MS/MS 데이터로부터의 서열 정보를 가공할 수 있다. Molec. Cell. Proteomics의 가이드라인에 따라 데이터 가공을 수행할 수 있다. 지정된 피크(assigned peak)는 최소 10개의 계수를 가졌다(3의 S/N). C13 이온의 우연한 선택(accidental selection)을 수용하기 위해 전 구체 이온의 질량 정확도(mass accuracy)를 1.5 Da로 설정하고, 단편 질량 정확도를 0.5 Da로 설정할 수 있다. 고려된 변형(변수)은 메티오닌 산화 및 카르바미도메틸 시스테인이었다.
실험 결과
I MASS SPECTROMETRY MALDI - TOF
이 실험들을 위해 이용된 비드는 나노다공성이었다.
4 X 12 분량의 실리카 비드를 이용할 수 있었다(4종의 상이한 표면 화학: 실리카 소공(small pore) 및 대공(large pore), APTES 소공 및 MPTMS 소공)
MALDI - TOF 분석 프로토콜
추출된 펩티드를 50%(v/v) 아세토니트릴, 0.1% TFA에 담긴 α-시아노-4-히드록시신남산(CHCA) 용액과 혼합하였다. 각각의 단일 실험에 대해 매트릭스/시료 비를 특정하였다. 스테인레스 스틸 MALAI 표적 플레이트 상에 1 ㎕의 시료/매트릭스 용액을 스팟팅하고 자연건조시켰다. 하기의 설정을 이용한, 지연된 추출, 선형 양이온 모드(linear positive ion mode)의 Voyager-DE® STR 질량 분석기(Applied Biosystems, Framingham, MA) 상에서 MALDI-TOF 스펙트럼을 수득하였다: 가속 전압 20,000 V, 그리드 전압(grid voltage) 91.5%, 추출 지연 시간 200 nsec, 수득 질량 범위(acquisition mass range) 800-20,000 m/z, 레이저 강도 범위 2100-2300. 각각의 스펙트럼은 일련의 100개의 연속적인 샷에서 수득된 400-1000 개의 개별적인 레이저 샷의 평균이었다. 표준 펩티드의 혼합물(Applied Biosystems calmix 2 + calmix 3)을 이용하여 매일 외부 장치 보정(external instrument calibration)을 수행하였다. 선형 6-포인트 보정(linear 6-point calibration)을 이용하였다(개략적인 Mw: 1300, 2090, 3600, 5700, 8100, 11000 Da).
MS MALDI 스팟팅을 위한 프로토콜의 최적화
세 개의 상이한 시료/매트릭스 비를 테스트하였다: (i) 1:8; (ii) 1:4; 및 (iii) 5:3. 두 개의 표준 펩티드, 레닌과 칼시토닌 200 ng/mL로 스파이킹된 마우스 대조구 혈청을 분석하였다. 도 19에 도시된 세 개의 스펙트럼은 하기의 인자들을 고려할 때 5:3이 최상의 실험 셋팅일 수 있다는 것을 보여준다: (i) 마우스 혈청으로부터의 스펙트럼에서 검출가능한 피크의 갯수; (ii) 피크의 전체 절대 강도; 및 (iii) 스파이킹된 펩티드(칼시토닌 및 레닌)의 신호-대-잡음(signal-to-noise) 비.
민감도 제고를 목적으로 하는 대안적인 프로토콜도 테스트하였다. 실리카 소공 비드를 이용하였다. 마지막 세척 후에, 4 ㎕의 MALDI 매트릭스 용액을 비드에 첨가하고, 결과적으로 수득된 현탁액 1.5 ㎕를 MALDI 표적 플레이트 상에 스팟팅하였다. 결과적으로 수득된 MALDI-TOF 스펙트럼은 표준 건조된 액적 제제(standard dried droplet preparation)에 대해 탁월한 신호 강도를 보였다.
(i) 매트릭스 현탁액에서 비드의 존재가 매트릭스 결정화의 균일성(uniformity)에 영향을 미치고 측정의 질량 정확도를 악화시킬 수 있으며; (ii) 질량 분석기에 실리카 입자들을 도입하는 것은 질량 분석기 내부에서 이와 같은 입 자들의 침착 때문에 시간의 경과에 따라 일부 성능 상실을 유발할 수 있기 때문에(전압 그리드, 등), 마우스 혈청의 후속 분석에서 표준 추출 조건 및 5:3 시료/매트릭스 비를 이용하기로 결정하였다.
하기에서, 전술된 방법으로 수득된 대조구 마우스 혈청의 MALDI-TOF 스펙트럼이 보고된다. 다른 MALDI 제제와의 비교를 위한 추가적인 기준 피크(reference peak)를 갖기 위해, 두 개의 상이한 펩티드 스파이킹을 수행하였다. 예를 들면, 도 20을 참조한다. 칼시토닌(마우스 혈청에 스파이킹된 100 ng/mL)으로부터의 신호 강도는 표준 제조 방법에 의한 것보다 더 높았다.
대조구 혈청 시료와 나노다공성 비드의 인큐베이션
마우스 혈청 분석을 위해 하기의 프로토콜을 채택하였다.
비드 예비-세척(pre-washing): 4 x 100 ㎕ H2O.
인큐베이션: 100 ㎕의 희석된 혈청과 1 mg 비드를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함.
비드 세척: 100 ㎕ H2O에 의한 2회 세척, 및 뒤이은 100 ㎕ 0.1% TFA에 의한 1회의 세척.
추출: 80 ㎕의 75/25 CH3CN/0.1% TFA, 실온에서 30분 인큐베이션.
MALDI 제제: 5:3의 시료/매트릭스 비.
본 실시예에서 전술된 바와 같은 MALDI-TOF 분석.
도 21에 도시된 스펙트럼은 4개의 상이한 비드를 이용하여 마우스 대조구 혈청으로부터 수득하였다(실리카 소공 및 실리카 대공, APTES 소공 및 MPTMS 소공).
재현성에 관한 실험.
비드 제조의 재현성을 평가하기 위해, 5개의 대공(large pore) 실리카 비드 키트를 이용하여 마우스 대조구 혈청의 5회의 반복적 인큐베이션을 수행하였다. 각 인큐베이션에 대한 중복 MALDI-TOF 분석은 10개의 스펙트럼을 생성했다. 피크 선별 소프트웨어(peak picking software)(Applied Biosystems)에 의해 자동으로 검출된 28개의 가장 높은 강도의 피크를 통계 분석을 위해 이용하였고, 상기 피크들은 상기 10개의 스펙트럼 모두에서 공통되었다. 총 신호 강도(피크 높이)에 대한 정규화(normlaization) 후에, 정규화된 강도에 대한 변동계수(coefficient of variation)를 계산하였다(28개의 피크, 10개의 반복물(replicate)). 수득된 전형적인 MS 스펙트럼과 함께, 결과가 표 3에 보고된다. m/z 결정에 대한 평균 CV는 0.02 %였다. 피크 높이에 대한 평균 CV는 21.8이었다.
표 3. 실리카 비드 LMWP 수집의 10개의 반복 실험에 대한 피크 높이(5개의 반복 인큐베이션, 중복 MALDI-TOF 분석) 및 MS 분석.
Figure 112008051246460-PCT00002
II 질량 분석법 SELDI
종양을 갖는 동물로부터의 혈청의 가공: 하기와 같이 12 세트의 동물로부터 혼주 혈청 시료가 제공되었다:
1. 대조구 혈청 풀(Control serum pool) A
2. 대조구 혈청 풀 B
3. 대조구 혈청 풀 C
4. 28일차 종양 혈청(Day 28 tumor bearing serum)(MCF7 세포 클론 8로부터 유래된 종양)
5. 28일차 종양 혈청 (MCF7 세포 클론 10으로부터 유래된 종양)
6. 42일차 종양 혈청 (MCF7 세포 클론 8로부터 유래된 종양)
7. 42일차 종양 혈청 (MCF7 세포 클론 10으로부터 유래된 종양)
8. 60일차 혈청 음성 대조구(매트리겔(matrigel)이 주사된 동물)
9. 60일차 종양 혈청 대조구 1 (세포주 BT-474로부터 유래된 종양)
10. 60일차 종양 혈청 대조구 2 (기준(baseline) MCF7 세포주로부터 유래된 종양)
11. 60일차 종양 혈청 대조구 (MCF7 세포 클론 8로부터 유래된 종양)
12. 60일차 종양 혈청 대조구 (MCF7 세포 클론 10으로부터 유래된 종양)
상기 혼주 혈청 시료와의 인큐베이션을 위해 6개의 비드 셋트를 이용하였다. 각 세트의 비드는 12개의 혈청 풀 각각에 대한 하나의 키트로, 12개의 개별적인 비드 키트를 포함했다. 사용된 비드 세트는 하기와 같았다:
세트 A. 10 ㎛ 직경, 소공, 실리카
세트 B. 10 ㎛ 직경, 소공, APTES 유도체화, (+) 하전
세트 C. lO ㎛ 직경, 소공, MPTMS 유도체화, (-) 하전
세트 D. 10 ㎛ 직경, 대공, 실리카
세트 E. 10 ㎛ 직경, 대공, APTES 유도체화, (+) 하전
세트 F. 10 ㎛ 직경, 대공, MPTMS 유도체화, (-) 하전
혈청 시료를 하기와 같이 비드 키트와 인큐베이션하였다. 먼저, 모든 비드 키트를 혈청과의 인큐베이션 전에 HPLC 등급 물로 4회 세척하였다. 혈청 시료를 해동시키고 HPLC 등급 물로 1:5로 희석하고, 100 ㎕의 희석된 혈청을 비드 키트와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 예를 들면, 상기 희석된 혈청 시료 1(혼주 대조구 혈청 A) 100 ㎕를 6개의 비드 타입 A 내지 F의 각각과 인큐베이션하여 각각 시료 1 내지 시료 6을 생성하였다(표 4 참조). 마찬가지로, 남은 12개의 혈 청 시료 각각을 별개의 비드 세트 각각과 인큐베이션하여, 총 72개의 시료를 생성하였다(표 4 참조).
혈청과의 인큐베이션 후에, 비드를 펠릿화하고, 고갈된 혈청(depleted serum)을 제거하였다. 그 후, 실온에서 0.1 % TFA/아세토니트릴(25:75)로 30분간 용리시키기 전에, 상기 비드를 HPLC 등급 물로 2회 세척하고, 0.1% TFA로 1회 세척하였다. 최종 용출액(~80 ㎕)을 수집하고(총 72개의 시료, 표 4 참조) 추가적인 가공 때까지 -80℃에 보관하였다.
표 4
혈청 시료 비드
소공 (small pore) 실리카 소공 APTES 소공 MPTMS 대공 (large pore) 실리카 대공 APTES 대공 MPTMS
대조구 풀 A 1 2 3 4 5 6
대조구 풀 B 7 8 9 10 11 12
대조구 풀 C 13 14 15 16 17 18
28일차 풀, MCF7 클론 8 19 20 21 22 23 24
28일차 풀, MCF7 클론 10 25 26 27 28 29 30
42일차 풀, MCF7 클론 8 31 32 33 34 35 36
42일차 풀, MCF7 클론 10 37 38 39 40 41 42
60일차 풀, 매트리겔 대조구 43 44 45 46 47 48
60일차 풀, BT-474 대조구 49 50 51 52 53 54
60일차 풀, MCF 대조구 세포주 55 56 57 58 59 60
60일차 풀, MCF7 클론 8 61 62 63 64 65 66
60일차 풀, MCF7 클론 10 67 68 69 70 71 72
용출액을 상기 인큐베이션 5일 후에 해동시키고 60 ㎕의 용출액을 취하여 1D 겔 분석을 위해 SpeedVav에서 ~25 ㎕의 총 부피로 농축시켰다. 농축시킨 용출액 및 남은 원래의 용출액을 각각 1D 겔 분석 및 SELDI 분석을 위해 더 가공할 때까지 -8O℃에 보관하였다.
농축시킨 비드 용출액을 모두 ASDS-PAGE 시료 완충액과 혼합하고, 8-16% 트리스-글리신 구배 겔 상에서 분리시키고 Sypro ruby로 염색하였다. 탈색(destaining) 후에, BioRad Versadoc 시스템을 이용하여 겔을 이미징하였다. 겔 결과가 도 22 내지 도 30에 도시된다.
이중 질량 분석법( tandem mass spectroscopy )을 위한 용출액 겔 단백질 밴드 절단.
비드 용출액의 1D SDS-PAGE 겔은 유사한 단백질 밴드 패턴을 보였다. 도 22-27을 참조한다. 상기 겔의 분석은 세 개의 대조구 동물 시료로부터의 혼주 혈청과 비교하여, 종양 동물(tumor bearing animal)로부터의 혈청의 것으로 판단할 수 있는 단백질 밴드의 새로운 패턴을 보이지 않았다. 또한, 단백질 적재량(protein load)은 시료 간에 달라서, 일부 개별적인 래인들은 훨씬 더 많은 양의 단백질을 포함했다(겔 6의 래인 8 참조(표 4의 시료 42)). 이 결과들에 근거하여, 이중 질량 분석법에 의한 확인을 위한 절단 및 적용을 위해 90개의 밴드를 식별하였다.
대공 MPTMS 비드로부터 수득된 용출물 시료를 분리한, 겔 6을 가장 완전한 분석용으로 선택하였다. 4개의 저 분자량 밴드를 각 래인으로부터 절단하여 밴드의 단백질 조성이 비드에 따라 변했는지 여부를 결정하였고, 모든 주요한 밴드들이 래인 8에 존재했다(시료 번호 42는 42일차 클론 10 종양 동물로부터 수집된 혼주 혈청에 해당함). 대공 APTES 변형 비드에 해당하는 겔 4에서, 각각 클론 8 및 10으로부터의 60일차 종양 동물로부터 수집된 혼주 혈청에 해당하는 래인 12 및 13에서 추가적인 저 분자량 밴드들을 절단하였다. 마지막으로, 소공 MPTMS 비드로부터 수득된 용출액, 시료 번호 27(28일차 클론 10 동물로부터 수집된 혈청)에 해당하는, 겔 5의 래인 6에서, 겔의 상단부터 하단까지, 추가적인 밴드들을 절단하였다. BioRad Gel 컷팅 로보트를 이용하여 밴드들을 확인하고 절단하였다. 절단된 시료를 96웰 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)의 웰에 침착시키고 이중 질량 분석법을 위해 CCIC 프로테오믹스 코어(proteomics core)로 전달하였다. 겔 절단의 패턴이 표 4의 표시(key)와 함께 도 28, 29 및 30에 도시된다.
이 시료들의 이중 질량 분석법 분석으로부터 수득된 단백질 식별 결과들이 본 실시예의 다른 부분에서 CCIC 프로테오믹스 코어에 의해 보고된다.
혼주 혈청의 SELDI 분석.
혼주 혈청 시료를 -80℃ 보관에서 꺼내어 해동시키고 150 ㎕ 정제되지 않은 혈청을 꺼내어 600 ㎕의 HPLC 등급 물로 희석하여 스톡 1:5 희석 혈청 시료를 생성하였다. 25㎕의 상기 희석된 정제되지 않은 혈청을 꺼내어 액체 질소로 급속 동결시키고 SELDI 분석을 위해 가공할 때까지 -80℃에 보관하였다. WCX2 칩을 Bioreactor에 적재하고, 시료 스팟을 실온(RT)에서 100 ㎕의 10 mM HCl로 5분 동안 세척하였다. 용액의 흡인 후에, 스팟을 100 ㎕의 HPLC 등급 물로 1분씩 2회 세척했다. 그 후, 상기 스팟을 0.1% 트리톤 X-100 + 10 mM 암모늄 아세테이트 100 ㎕ 로 5분씩 2회 세정하였다. 마지막 완충액을 흡인한 후, 건조된 WCX2 칩을 Bioreactor에서 꺼내어 실온에서 자연건조시켰다. 건조된 WCX2 칩을 Bioreactor에 넣고 5 ㎕의 희석된 혈청 시료를 시료 스팟에 적용하고 상기 칩을 실온의 가습된(humidified) 챔버에서 55분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 혈청 시료와의 55분 인큐베이션 후에, 상기 WCX2 칩을 150 ㎕의 PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 각 스팟을 150 ㎕의 HPLC 등급 물로 1회 세정하고, 상기 칩을 Bioreactor로부터 꺼내어 실온에서 자연건조되게 하였다. 매트릭스(50% 아세토니트릴 및 0.5% TFA에 담긴 알파-CHCA 1㎕)를 각 스팟에 적용하고 건조시켰다. 매트릭스의 적용을 반복하고, 상기 칩을 PBSII 질량 분석기로 분석하였다. 결과적으로 수득된 SELDI 스펙트럼이 도 31 내지 도 33에 도시된다.
비드 용출액의 SELDI 분석.
각각의 비드 인큐베이션으로부터 회수된 용출 물질을 SELDI GoldChip을 이용하여 검사하였다. 용출액 시료(1 ㎕)를 칩 스팟에 적용하고 자연건조시켰다. 전술된 바와 같이 매트릭스를 첨가하고 하기의 장치 파라미터를 이용하여 시료를 분석하였다. LMW 범위에서 용출물 AU 칩 판독 파라미터는 WCX2 칩 분석을 위한 프로토콜에서 표시된 것과 동일했다. 전술된 1D SDS-PAGE 구배 겔에 적용된 것과 동일한 순서로 시료 세트를 분석하였다. 모두 72개의 용출물 시료를 분석하였고, 중복 스펙트럼(duplicate spectrum)을 수득하였다.
비드 용출액의 SELDI 스펩트럼에 대한 표시( key ).
스펙트럼의 우측으로부터 표시된, 시료 번호는 표 4에 표시된 것들에 해당하 는 시료 번호들을 의미한다. 각각의 비드 용출액을 스펙트럼에서 시료 번호 x-1 및 시료 번호 x-2로 표시된 바와 같이, 중복으로 분석하였다. 개별적인 1D 겔에 적용된 시료의 개별적인 세트(도 22 내지 27 참조)는 겔에 적용된 순서로 분석하였다. 따라서, 도 34A, 34B, 및 34C는 겔 1에 적용된 용출물 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 22); 도 35A, 35B, 및 35C는 겔 번호 2에 적용된 용출액 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 23); 도 36A, 36B, 및 36C는 겔 번호 3에 적용된 용출액 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 24); 도 37A, 37B, 및 37C는 겔 번호 4에 적용된 용출액 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 25); 도 38A, 38B, 및 38C는 겔 번호 5에 적용된 용출액 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 26); 및 도 39A, 39B, 및 39C는 겔 번호 6에 적용된 용출액 시료로부터의 SELDI 스펙트럼을 나타낸다(도 27).
III 질량분석 LC / MS ( OSU CCIC )
인 겔 소화( In Gel Digestion ) 및 나노 LC / MS / MS 단백질 확인.
1D SDS-PAGE로부터의 총 100개의 밴드를 소화시키고(digest) 나노 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 상세한 결과가 표 5에 요약된다. 조사된 100개의 밴드로부터 707개의 단백질을 식별하였다. 그들 중에, 225개의 케라틴 또는 케라틴 관련 단백질을 식별하였다. 소화를 위해 트립신을 이용하였고, 따라서, 트립신 및 트립신 관련 단백질이 상기 시료에서 확인되었고, 총 145개의 트립신 또는 트립신 관련 단백질을 확인하였다. 마지막으로, 장비 성능을 보증하기 위한 내부 표준으로 리 소자임을 이용하고 80회 식별하였다(표 6). 케라틴, 리소자임 및 트립신에 대한 일치(match)를 제거한 후, 100개의 겔 밴드로부터 식별된 유의성 있는 단백질의 총 갯수는 257이었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 대부분의 단백질은 상이한 래인/밴드 내에서 복수 회 식별되었다. 예를 들면, 헤모글로빈 베타-1 사슬은 상이한 래인/밴드에서 여러 차례 식별된다. 각 단백질 ID를 한번씩 계수한 후, 154개의 고유한 단백질을 식별하였다(표 6 참조). 그들 중에서, 64개는 케라틴 또는 케라틴 관련 단백질로 식별되었고, 5개는 트립신 또는 트립신 관련 단백질로 식별되었으며, 6개는 리소자임으로 식별되었다. 따라서, 79개의 고유한 혈청 단백질을 유의성있게 식별하였다(표 7).
제조사가 추천한 프로토콜에 따라, Millipore(Bedford, MA)의 Montage In-GeI Digestion Kit를 이용하여 Promega의 시퀀싱 등급 트립신으로 겔을 처리하였다. 요약하면, 백그라운드 폴리아크릴아미드 물질을 최소화하기 위해 가능한 한 가깝게 밴드를 잘라내고 2mm*2mm 조각으로 절단했다. 겔 조각들을 50% 메탄올/5% 아세트산에서 1시간 동안 세척하였다. 겔 조각들을 아세토니트릴에서 탈수시키기 전에 상기 세척 단계를 1회 반복하였다. 상기 겔 조각들을 100 mM 중탄산암모늄 용액에 담긴 15mg/ml의 요오도아세트아미드의 첨가 전에 재수화시키고 30분 동안 디티오트레이톨(DTT) 용액(100 mM 중탄산암모늄에 담긴 5mg/ml)과 인큐베이션시켰다. 제거하기 전에, 요오도아세트아미드를 상기 겔 밴드들과 암기에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 겔 밴드들을 아세토니트릴과 중탄산암모늄(100 mM)의 사 이클로 5분 증분(5 minute increment)으로 다시 세척하였다. 상기 겔을 스피드 백(speed vac)에서 건조시킨 후, 50 mM 중탄산암모늄에 담긴 20 ㎍/mL 농도의 시퀀싱 등급 변형 트립신 50㎕에서 10분간 재수화시켜 상기 단백질효소를 겔 내로 침투시켰다. 그 후, 20㎕의 50 mM 중탄산암모늄을 상기 겔 밴드에 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 펩티드를 50% 아세토니트릴 및 5% 포름산에 의해 수차례 상기 폴리아크릴아미드 겔로부터 추출하여 혼주(pool)하였다. 이 추출된 풀(extracted pool)을 나노 LC/MS/MS 분석을 위해 스피드 백에서 ~25㎕로 농축시켰다.
양이온 모드로 작동되는 나노분무 원이 장착된 Thermo Finnigan LTQ 질량 분석기에서 모세관-액체 크로마토그래피-나노분무 이중 질량 분석법(Nano-LC/MS/MS)을 수행하였다. LC 시스템은 LC-Packings A Dionex Co (Sunnyvale, CA)의 Famous 오토샘플러 및 Switchos 컬럼 스위쳐를 갖춘 UltiMate™ Plus 시스템이었다. 5 마이크로리터의 각 시료를 먼저 포착 컬럼(LC-Packings A Dionex Co, Sunnyvale, CA)에 주입하고 50 mM 아세트산으로 세척하였다. 주입을 위해 주입기 포트의 스위치를 켜고 펩티드를 트랩으로부터 컬럼으로 용리시켰다. 5 cm 75 ㎛ ID ProteoPep II Cl8 컬럼(New Objective, Inc. Woburn, MA)을 크로마토그래피에 의한 분리를 위해 이용하였다. 용매 A는 50 mM 아세트산을 포함하는 물이고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 300 nl/분의 유속으로, 30분 동안 펩티드를 직접 컬럼으로부터 LTQ 시스템으로 용리시켰다. 구배는 2% B로 개시하였고 B는 최초 3분 동안 2%로 유지시켰다. 그 후, B를 3-30분 동안 50%까지 증가시키고 30-45분 동안 80%까지 더 증가 시켰다. B를 0.1 분 내에 2%로 다시 변경하기 전에, 다시 5분 동안 80%로 유지하였다. 그 후, 상기 컬럼을 다음 주입 전에 14.9분 동안 98% A로 세척하였다. 전체 운전 시간은 65분이었다. 완전한 스캔(full scan) 및 스펙트럼에서 가장 풍부한 10개의 펩티드 피크의 MS/MS 스캔을 위해 질량 분석기의 스캔 순서를 프로그래밍하였다. MS/MS를 3회 검출하고 수행한 후, 동적 배제를 이용하여 동일한 펩티드의 복수 개의 MS/MS를 배제시켰다.
피크목록(peaklist)(.mgf 파일)을 작성하는 Mascot Batch 및 Mascot MS/MS 검색을 이용하여 MS/MS 데이터로부터의 서열 정보를 가공하였다. Molec. Cell. Proteomics의 가이드라인을 따라 데이터 가공을 수행하였다. 지정된 피크(assigned peak)는 최소 10개의 계수를 가졌다(3의 S/N). C13 이온의 우연한 선택(accidental selection)을 수용하기 위해 전구체 이온(precursor ion)의 질량 정확도를 1.8 Da로 설정하고, 단편 질량 정확도를 0.5 Da로 설정하였다. 고려된 변형(변수)은 메티오닌 산화 및 카르바미도메틸 시스테인이었다.
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Claims (86)

  1. (a) 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 시료를 제공하는 단계;
    (b) 나노다공성 물질(nanoporous material)을 포함하는 기판을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 노출시, 상기 나노다공성 물질은 상기 제1 성분을 잔류시키고 상기 제2 성분을 잔류시키지 않는 것인 분획 또는 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 유체(biological fluid)의 시료인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 정액, 정장(seminal plasma), 흉수, 복수, 유두 흡인물(nipple aspirate), 분변 또는 타액인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분 및 상기 제2 성분은 펩티드, 항원, 항체, 단백질, 단백질 단편, RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분의 분자량은 상기 제2 성분의 분자량보다 더 작은 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 산화물 물질(nanoporous oxide material)인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나노다공성 산화물 물질은 나노다공성 실리카인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 분자 차단물(molecular cut-off)인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 변형된 표면을 갖는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 전기적으로 하전된 표면을 갖는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 작용기(funtional group)로 변형된 표면을 갖는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 기판은 필름, 웨이퍼(wafer), 입자 또는 마이크로칩인 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 기판을 제공하는 단계는 상기 기판을 톱-다운 기법(top-down technique)에 의해 가공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 톱-다운 기법은 포토리소그래피, 전자 빔 리소그래피, X선 리소그래피, 딥 UV 리소그래피(deep UV lithography) 및 나노프린트(nanoprint) 리소그래피로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분을 상기 나노다공성 물질로부터 추출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 노출 후 상기 나노다공성 물질을 세척하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 나노다공성 물질이 상기 제1 성분을 흡착하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 질량 분석법(MS), 겔 전기영동, 크로마토그래피, 생물학적 분석법(bioassay) 또는 이들의 조합에 의해 분석하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 질량 분석법은 MALDI-TOF 질량 분석법, LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 이중 질량 분석법(tandem mass-spectrometry) 또는 SELDI 질량 분석법인 것인 방법.
  22. (a) 시료를 제공하는 단계;
    (b) 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 제공하는 단계;
    (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계; 및
    (d) 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류된 상기 시료의 분획을 분석하는 단계를 포함하는, 시료를 분석하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 유체의 시료인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 정액, 정장, 흉수, 복수, 유두 흡인물, 분변 또는 타액인 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 펩티드, 항원, 항체, 단백질, 단백질 단편, RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 상기 나노다공성 물질에 흡착된 분획인 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 상기 물질의 보다 낮은 분자량 분획인 것인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘인 것인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 산화물 물질인 것인 방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 나노다공성 물질의 표면은 변형된 표면인 것인 방법.
  31. 제22항에 있어서, 상기 표면은 필름, 웨이퍼, 입자 또는 마이크로칩인 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 기판을 제공하는 단계는 상기 기판을 톱-다운 기법에 의해 가공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제22항에 있어서, 상기 기판은 제1 영역 및 상기 제1 영역을 둘러싸는 제2 영역을 포함하고, 상기 제1 영역은 상기 나노다공성 물질을 포함하고 상기 제2 영역은 상기 나노다공성 물질을 포함하지 않는 것인 방법.
  34. 제22항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 20 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 15 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 10 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 잔류된 분획은 4 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 방 법.
  39. 제22항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 상기 나노다공성 물질로부터 상기 잔류된 분획을 추출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  40. 제22항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 질량 분석법(MS), 겔 전기영동, 크로마토그래피, 생물학적 분석법(bioassay) 또는 이들의 조합에 의해 분석하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 질량 분석법은 MALDI-TOF 질량 분석법, LC/MS 질량 분석법, ESI-MS 질량 분석법, 이중 질량 분석법 또는 SELDI 질량 분석법인 것인 방법.
  42. 제22항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 20 ng/ml 이상의 저분자량 검출 한계(low molecular weight limit of detection)를 갖는 것인 방법.
  43. 제22항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 5 ng/ml 이상의 저분자량 검출 한계를 갖는 것인 방법.
  44. (a) 생리적 상태에 의해 영향받은 시료를 제공하는 단계;
    (b) 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 제공하는 단계;
    (c) 상기 나노다공성 물질을 상기 시료에 노출시키는 단계;
    (d) 상기 나노다공성 물질에 의해 잔류된 상기 시료의 분획을 분석하는 단계; 및
    (e) 상기 생리적 상태의 마커를 검출하기 위해 상기 분석 결과를 대조구 시료의 분석 결과와 비교하는 단계를 포함하는, 생리적 상태의 마커를 검출하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 생리적 상태는 질병 또는 질병의 단계인 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 질병은 암인 것인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 유체의 시료인 것인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 시료는 포유동물로부터의 시료인 것인 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 시료는 인간으로부터의 시료인 것인 방법.
  50. 제44항에 있어서, 상기 기판은 필름, 웨이퍼, 입자 또는 마이크로칩인 것인 방법.
  51. 제44항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 산화물 또는 나노다공성 실리콘인 것인 방법.
  52. 제44항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 질량 분석법(MS), 겔 전기영동, 크로마토그래피, 생물학적 분석법 또는 이들의 조합에 의해 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  53. 하나 이상의 성분을 포함하는 시료를 수집하는 수단; 및 상기 하나 이상의 성분을 잔류시키도록 배열된 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 포함하는 키트.
  54. 제53항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 유체의 시료인 것인 키트.
  55. 제53항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘 또는 나노다공성 산화물 물질인 것인 키트.
  56. 제53항에 있어서, 상기 하나 이상의 성분은 상기 시료의 저분자량 분획인 것인 키트.
  57. 분석 장치 및 나노다공성 물질을 포함하는 기판을 포함하고, 상기 기판은 하 나 이상의 분석물에 대한 상기 분석 장치의 감도(sensitivity)를 강화하도록 배열된 것인 분석 시스템.
  58. 제57항에 있어서, 상기 기판은 상기 나노다공성 물질을 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 제1 영역은 상기 하나 이상의 분석물을 흡착할 수 있고, 상기 제1 영역은 상기 하나 이상의 분석물의 흡착에 저항하는 제2 영역에 의해 둘러싸인 것인 분석 시스템.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제2 영역은 비-나노다공성(non-nanoporous) 영역인 것인 분석 시스템.
  60. 제58항에 있어서, 상기 제2 영역의 표면은 친수성 작용기로 변형된 것인 분석 시스템.
  61. 제58항에 있어서, 상기 제1 영역의 표면은 전기적으로 하전된 것인 분석 시스템.
  62. 제58항에 있어서, 상기 제1 영역의 표면은 작용기로 변형된 것인 분석 시스템.
  63. 제58항에 있어서, 상기 분석 장치는 이온화 소스(ionization source)를 포함하고, 상기 제1 영역의 크기는 상기 이온화 소스의 활성 영역(active area)의 크기와 일치(match)하는 것인 분석 시스템.
  64. 제63항에 있어서, 상기 이온화 소스는 레이저이고 상기 제1 영역의 크기는 상기 레이저의 빔의 크기와 일치하는 것인 분석 시스템.
  65. 제57항에 있어서, 상기 분석 장치는 질량 분석기인 것인 분석 시스템.
  66. 제65항에 있어서, 상기 질량 분석기는 레이저 탈착(desorption)/이온화 질량 분석기인 것인 분석 시스템.
  67. 제57항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘인 것인 분석 시스템.
  68. 제57항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 산화물 물질인 것인 분석 시스템.
  69. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 펩티드, 항원, 항체, 단백질, 단백질 단편, RNA 및 DNA로부터 선택되는 것인 분석 시스템.
  70. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 20 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 분석 시스템.
  71. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 15 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 분석 시스템.
  72. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 10 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 분석 시스템.
  73. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 4 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 분석 시스템.
  74. 나노다공성 물질을 포함하고 질량 분석기에 삽입되도록 형성된 기판을 포함하는 프로브.
  75. 제74항에 있어서, 상기 기판은 제1 영역 및 상기 제1 영역을 둘러싸는 제2 영역을 포함하고, 상기 제1 영역은 상기 나노다공성 물질을 포함하고 하나 이상의 분석물을 흡착할 수 있으며, 상기 제2 영역은 상기 하나 이상의 분석물의 흡착에 저항하는 것인 프로브.
  76. 제75항에 있어서, 상기 제2 영역은 비-나노다공성 영역인 것인 프로브.
  77. 제75항에 있어서, 상기 제2 영역의 표면은 친수성 작용기로 변형된 것인 프로브.
  78. 제75항에 있어서, 상기 제1 영역의 표면은 전기적으로 하전된 것인 프로브.
  79. 제75항에 있어서, 상기 제1 영역의 표면은 상기 하나 이상의 분석물을 잔류시키기 위해 작용기로 변형된 것인 프로브.
  80. 제75항에 있어서, 상기 질량 분석기는 이온화 소스를 포함하고, 상기 제1 영역의 크기는 상기 이온화 소스의 활성 영역의 크기와 일치하는 것인 프로브.
  81. 제80항에 있어서, 상기 이온화 소스는 레이저이고 상기 제1 영역의 크기는 상기 레이저의 빔의 크기와 일치하는 것인 프로브.
  82. 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 펩티드, 항원, 항체, 단백질, 단백질 단편, RNA 및 DNA로부터 선택되는 것인 프로브.
  83. 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 20 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 프로브.
  84. 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석물은 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 것인 프로브.
  85. 제74항에 있어서, 상기 나노다공성 물질은 나노다공성 실리콘 또는 나노다공성 산화물인 것인 프로브.
  86. 제74항에 있어서, 상기 질량 분석기는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석기(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometer)인 것인 프로브.
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