CN113679723A - Egfr抑制剂制备治疗乳腺癌药物的用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了EGFR抑制剂制备治疗乳腺癌药物的用途。具体地，提供了一种式I化合物或其可药用盐在制备治疗乳腺癌药物中的用途。特别地，式I化合物或其可药用盐对于三阴性乳腺癌具有良好的疗效。

Description

EGFR抑制剂制备治疗乳腺癌药物的用途

技术领域

发明涉及临床医学领域、制药领域；具体而言，涉及表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗乳腺癌药物的用途。

背景技术

乳腺癌是全世界女性癌症相关死亡的主要原因，在2018年全球癌症统计中其发病率和死亡率位居第二位。随着对乳腺癌的认识不断深入，乳腺癌的治疗已经进入了综合治疗的时代。分子靶向治疗是近年来乳腺癌研究的热点之一，与化疗药物相比，它是一种具有多种作用机制的新型抗肿瘤药物。然而，三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌的一种类型，占所有乳腺癌的10％-20％，与其他类型的乳腺癌相比具有强侵袭力、缺乏有效药物靶点和临床治疗手段单一等特点。因此，寻找到新型有效的药物及治疗靶点是较为迫切的。在过去的几年中，通过靶向不同的信号途径，发现了潜在的TNBC治疗靶点，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)。EGFR是表皮生长因子参与细胞增殖和信号转导的受体。研究表明，EGFR在多种人类肿瘤中表现出异常，包括基因扩增和突变且在接近80％的肿瘤细胞中呈高表达。

研究表明，EGFR-TKI可对多种癌症发挥抗肿瘤作用，如肺癌，乳腺癌等。EGFR-TKI通过阻断EGFR分子内酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶的活化，抑制EGFR二聚体的形成，从而抑制EGFR激活，阻止下游信号转导，抑制细胞周期进程、诱导细胞自噬和加速细胞凋亡。式I化合物是具有自主知识产权的一种小分子抗肿瘤化合物，可靶向EGFR发挥抗肿瘤活性，属于EGFR-TKI:

式I化合物可用于治疗晚期非小细胞肺癌的疗效已经很明确，但是尚未研究其在乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌中的治疗效果。因此，本研究以新型EGFR-TKI抑制剂为研究对象，观察其对TNBC MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用以及对细胞凋亡和自噬的影响，并探讨相关可能机制，为开辟TNBC的临床治疗途径提供新的理论和实验依据。多年来，化疗一直是TNBC主要的系统治疗选择，以提高患者的总体生存率，但是化疗耐药性及不良反应等是TNBC患者治疗面临的诸多挑战。因此，多项研究检测了化疗前后的分子变化，以确定TNBC可能的靶向治疗，为疾病治疗提供新的方案。本研究中，我们发现式I化合物在体外对TNBC有着较好的抗肿瘤效果。三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞虽然不表达ER、PR、HER2等受体，但是存在EGFR的表达。本研究结果显示式I化合物作为一种EGFR-TKI可有效抑制MDA-MB-231细胞的生长增殖及诱导细胞发生自噬和凋亡。

本发明的研究结果表明式I化合物可以通过抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路，抑制TNBC MDA-MB-231细胞的增殖，诱导细胞自噬和凋亡，具有抗肿瘤作用，为靶向EGFR可能成为TNBC的一种有效的治疗策略提供实验依据，同时联合自噬抑制剂增强细胞对药物的敏感性或许是可行的附加方式。

发明内容

发明人惊奇地发现，式I化合物或其可药用盐对于乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌的治疗具有良好疗效。

本发明一方面的目的在于，提供一种式I化合物或其可药用盐在制备治疗乳腺癌药物的用途，

其中，所述可药用盐选自以下的一种或组合：甲磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述三阴性乳腺癌是指：使用多克隆抗HER2一级抗体进行半定量免疫组织化学分析时，所述癌细胞对于雌激素受体(ER)和孕酮受体的得分为阴性，并且产生了0、1+或2+的测试结果。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述癌细胞对于HER2基因扩增为FISH阴性。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述三阴性乳腺癌为HER3+或FISH-阳性乳腺癌。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述三阴性乳腺癌在组织病理学上的特征是具有基底样表型。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述乳腺癌伴有BRCA1、BRCA2、PALB2、FANCM或TP53中的一种或多种基因的突变。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述乳腺癌为发生肝转移、肺转移、淋巴结转移或骨转移的晚期乳腺癌。

在本发明进一步优选的实施方式中，乳腺癌患者的sMET的基线血浆浓度大于或等于795mg/ml中值。

在本发明进一步优选的实施方式中，式I化合物或其可药用盐是通过抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路来发挥治疗乳腺癌的作用。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述可药用盐选自甲磺酸盐。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述药物还任选包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

式I化合物或其可药用盐单位剂量(例如但不限于，每日单位剂量)以式I化合物计为50mg至300mg(含±10％)，例如但不限于45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330mg、以及上述任意两个数值之间的值(虽未一一列举，但视为明确指出)；更具体地可以是55mg、110mg、220mg或260mg。可以将其制备成相应日用量的单位剂量形式，每日施用一次，患者在施用前1小时至施用后2小时内应避免进食。

式I化合物或其可药用盐制备的药物适于口服施用。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述的式I化合物或其可药用盐单独施用，即无需与其它具有抗肿瘤作用的药物联合使用，但是不排除使用一些不具有抗肿瘤作用的辅助用药。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述的式I化合物或其可药用盐可以与其他治疗乳腺癌的药物或自噬相关抑制剂联用，其中其他治疗乳腺癌的药物或自噬相关抑制剂包括氯喹类、紫杉类药物、铂类药物、替尼类或单克隆抗体。

本发明另一目的在于，提供了一种治疗乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌药物的方法，包括步骤：

提供式I所示的化合物或其可药用盐

以治疗有效量向受试者施用式I所示的化合物或其可药用盐；

其中所述受试者患有乳腺癌；尤其是三阴性乳腺癌。

在一些实施方案中，所述施用的途径选自：肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、透皮、皮内、鼻内、眼内、口服、舌下、瘤内、瘤周。

在一些实施方案中，所述治疗方法按照选自以下的频率向患者施用组合物：两个月3次、两个月4次、两个月5次、一个月2次、三周1次、三周2次、每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每周7次、一天1次、两天1次、一天2次、一天3次的单元剂量。

附图说明

图1表示式I化合物对MDA-MB-231细胞存活率的CCK8实验；

图2表示式I化合物对MDA-MB-231细胞克隆形成的实验；

图3表示式I化合物对MDA-MB-231细胞形态上的影响；

图4-5表示式I化合物对MDA-MB-231细胞凋亡的流式细胞术实验；

图6-7表示式I化合物对MDA-MB-231细胞中凋亡相关蛋白表达的Westernblot检测结果；

图8表示式I化合物对MDA-MB-231细胞自噬实验结果；

图9-10表示式I化合物对MDA-MB-231细胞中自噬相关蛋白表达的Westernblot检测结果；

图11表示式I化合物、CQ单独使用或联合使用对MDA-MB-231细胞存活率的CCK8实验；

图12-13表示式I化合物、CQ单独使用或联合使用对MDA-MB-231细胞中自噬相关蛋白表达的Western blot检测结果；

图14-16表示式I化合物对MDA-MB-231细胞中EGFR/PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的Western blot检测结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本申请的实施方案进行详细描述。下面实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。

一、细胞实验研究

材料

人乳腺上皮癌细胞株MDA-MB-231购于北纳生物细胞库，于蚌埠医学院生化药理实验室冻存。式I化合物及其盐(江苏豪森药业有限公司)，DMEM高糖培养基(Hyclone)，胎牛血清(四季青)，CCK-8(Biosharp)，Annexin V-FITC/PI试剂盒(贝博生物)，JC-1检测试剂盒、胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，氯喹(CQ)购买自Sigma公司，β-actin、EGFR/p-EGFR、Akt/p-Akt、Caspase-3、PARP、LC3B抗体购于CST公司。

细胞培养

MDA-MB-231细胞培养于含有10％胎牛血清和青霉素1×10⁵U/L、链霉素100mg/L的DMEM高糖培养基中，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中。

实施例1细胞存活率实验研究

1、实验方法

将MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，7×10³/孔，置于恒温37℃，5％CO₂培养箱中，待细胞贴壁后，更换孔中培养液为单用式I化合物(0、1、2、4、6、8、10、12μmol/L)，每组5个复孔，并设置溶剂对照组。在培养箱中继续培养24、48、72h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，放置于培养箱中孵育2h，酶标仪设置450nm，检测此波长下各个孔的吸光度值(A)，重复实验3次。计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组A/对照组A)×100％。

2、实验结果

CCK-8结果显示，随着药物浓度增加和时间延长，式I化合物对MDA-MB-231细胞的抑制作用逐渐增强(图1)，48和72h的IC₅₀值分别为2.777μmol/L和2.016μmol/L。

实施例2细胞增殖抑制实验研究

1、实验方法

将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，5×10³/孔，细胞贴壁后，将细胞培养液更换为含有式I化合物(0、0.4、0.6、0.8μmol/L)的新鲜培养液，再将细胞置于培养箱。5d后移除培养液并使用预冷PBS清洗两次，然后加入多聚甲醛，放置在-20℃，10min后加入结晶紫，室温放置10min，然后使用双蒸水清洗，室温放置干燥后拍照。实验重复3次。

2、实验结果

集落克隆实验结果显示(图2)，式I化合物呈剂量依赖性的抑制集落的形成。

实施例3细胞形态学实验研究

1、实验方法

将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，2×10⁵/孔，待细胞于培养箱中贴壁良好，弃去孔中培养液，将细胞分为四组：式I化合物(0、4、6、8μmol/L)组，继续培养24h后使用倒置显微镜拍照。

2、实验结果

通过倒置显微镜观察到给予式I化合物组细胞的形态与密度与对照组相比均出现不同程度的变化，8μmol/L式I化合物处理后，可明显看出细胞萎缩加剧，折光性增加，悬浮细胞明显增多(图3)。

实施例4细胞凋亡实验研究

1、实验方法

将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，2×10⁵/孔，置于培养箱中，细胞贴壁后更换培养液为含有式I化合物(0、4、6、8μmol/L)的培养液，继续培养24h，使用离心机600g收集细胞，加入Annexin-V-FITC/PI双染试剂染色，上流式细胞仪检测，实验重复3次。

2、实验结果

流式细胞术检测结果显示，8μmol/L式I化合物能显著诱导细胞凋亡(P<0.01，图4，图5)。图6-7的Western blot实验结果显示，随着药物浓度增加，与对照组相比，剪切的Caspase-3表达逐渐升高，8μmol/L式I化合物处理组PARP剪切带增加较为显著，差异具有统计学意义(P<0.01)。

实施例5细胞自噬实验研究

1、实验方法

MDA-MB-231细胞种于60mm皿中，待细胞密度合适，贴壁良好，加入式I化合物(8μmol/L)作用24h，使用4℃离心机，600g条件下收集细胞，PBS洗3次，用3％戊二醛和2％多聚甲醛在0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)中固定，4℃状态下保存。最后使用透射电子显微镜采集图片。

2、实验结果

倒置显微镜(图8A)观察到给予式I化合物(8μmol/L)药物组细胞内出现大量空泡，电镜(图8B)观察到药物组细胞内存在自噬囊泡。图9-10中的Western blot结果显示，自噬标志蛋白LC3B出现大量切割，LC3B/Ⅱ呈剂量依赖性增加。

实施例6自噬抑制剂CQ对式I化合物治疗三阴性乳腺癌的敏感性影响。

1、实验方法

(1)细胞存活率实验

将MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，7×10³/孔，置于恒温37℃，5％CO₂培养箱中，待细胞贴壁后，更换孔中培养液为单用式I化合物(0、1、2、4、6、8、10、12μmol/L)、单用CQ(40μmol/L)以及式I化合物(4、6μmol/L)与CQ联合的DMEM培养液，每组5个复孔，并设置溶剂对照组。在培养箱中继续培养24、48、72h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，放置于培养箱中孵育2h，酶标仪设置450nm，检测此波长下各个孔的吸光度值(A)，重复实验3次。计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组A/对照组A)×100％。

(2)Western blot实验

MDA-MB-231细胞种于60mm皿中，分别单独用CQ(40μmol/L)或式I化合物(4μmol/L)处理，或者用CQ(40μmol/L)和式I化合物(4μmol/L)共同处理细胞，药物作用24h，收集细胞并加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃低温离心机12 000r/mim离心30min，提取蛋白上清，使用BCA法进行蛋白定量，使各组蛋白至等浓度。各组取30μg蛋白，SDS-PAGE电泳，然后转膜至PVDF膜，使用5％脱脂牛奶封闭4h；TPBS洗膜3次，5min/次；4℃一抗孵育过夜，TPBS洗膜3次；室温二抗孵育2h，TPBS洗膜3次；ECL试剂盒发光显影，使用凝胶成像系统获取图像。Image J测定各显色条带的灰度值，以目的条带与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2、实验结果

CQ预处理细胞1h后，CCK-8检测显示，与对照组和单用式I化合物(4、6μmol/L)相比，式I化合物联合CQ组细胞存活率显著降低(P<0.01)(图11)。同时观察到式I化合物(4μmol/L)联合CQ组中，LC3B/Ⅱ表达高于单用CQ组与单用式I化合物(4μmol/L)组，提示CQ阻断细胞自噬，增加了LC3B/Ⅱ积累(图12和图13)。

实施例7式I化合物治疗三阴性乳腺癌的机理研究

1、实验方法

MDA-MB-231细胞种于60mm皿中，分别用0、4、6、8μmol/L的式I化合物处理细胞，药物作用24h，收集细胞并加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃低温离心机12 000r/mim，离心30min，提取蛋白上清，使用BCA法进行蛋白定量，使各组蛋白至等浓度。各组取30μg蛋白，SDS-PAGE电泳，然后转膜至PVDF膜，使用5％脱脂牛奶封闭4h；TPBS洗膜3次，5min/次；4℃一抗孵育过夜，TPBS洗膜3次；室温二抗孵育2h，TPBS洗膜3次；ECL试剂盒发光显影，使用凝胶成像系统获取图像。Image J测定各显色条带的灰度值，以目的条带与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2、实验结果

通过Western blot检测发现，随着式I化合物浓度的增加，细胞内磷酸化的EGFR和AKT蛋白表达逐渐减少，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结果表明式I化合物可以抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路(图14-16)。

二、动物模型试验

在裸鼠肿瘤模型中，式I化合物强效抑制乳腺癌细胞株的肿瘤生长。在高剂量20mg/kg组，式I化合物或其可药用盐可使肿瘤几乎完全消退。

实验目的：

通过体内药效实验证实化合物对乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌，具有良好的治疗作用。

实验主要仪器和材料：

仪器：

1、生物安全柜(BSC-1300II A2，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)

2、超净工作台(CJ-2F，苏州市冯氏实验动物设备有限公司)

3、CO₂培养箱(Thermo-311)

4、离心机(Centrifuge 5702R，Eppendorf)

5、全自动细胞计数仪(Countess II，Life)

6、移液器(10-20μL，Eppendorf)

7、显微镜(TS2，尼康)

8、游标卡尺(CD-6”AX，日本三丰)

9、细胞培养瓶(T75/T225，Corning)

10、电子天平(CPA2202S，赛多利斯)

试剂：

1、RPMI-1640和DMEM培养基(22400-089，Gibco)

2、胎牛血清(FBS)(10091-148，Gibco)

3、0.25％胰蛋白酶(25200-056，Gibco)

4、青链霉素双抗(15140-122，Gibco)

5、磷酸盐缓冲液(PBS)(10010-023，Gibco)

6、基质胶Matrigel Matrix(356234，Corning)

动物：

BALB/c裸小鼠，6-8周，♀，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司。

实验步骤

细胞培养及细胞悬液制备

a,从细胞库中取出乳腺癌细胞并进行复苏，复苏后的细胞置细胞培养瓶中(在瓶壁标记好细胞种类、日期、培养人名字等)置于CO₂培养箱中培养(培养箱温度为37℃，CO₂浓度为5％)。

b,待细胞铺满培养瓶底部80-90％后传代，传代后细胞继续置于CO₂培养箱中培养。重复该过程直到细胞数满足体内药效需求。

c,收集培养好的细胞，用全自动细胞计数仪计数，根据计数结果用PBS和基质胶重悬细胞，制成细胞悬液(密度10×10⁷/mL)，置于冰盒中待用。

细胞接种

a,接种前用一次性大小鼠通用耳标标记裸鼠

b,接种时混匀细胞悬液，用1mL注射器抽取0.1～1mL细胞悬液、排除气泡，然后将注射器置于冰袋上待用。

c,左手保定好裸鼠，用75％酒精消毒裸鼠右侧背部靠右肩位置(接种部位)，30秒后开始接种。

d,依次给试验裸鼠接种(每只小鼠接种0.1mL细胞悬液)。

荷瘤鼠量瘤、分组、给药：

a,根据肿瘤生长情况，在接种后若干天量瘤、并计算肿瘤大小。肿瘤体积计算：肿瘤体积(mm³)＝长(mm)×宽(mm)×宽(mm)/2，当肿瘤体积达到一定程度，并观察裸鼠的精神状态和进食情况，当裸鼠精神萎靡或进食较少时可随机抽取一只裸鼠进行解剖，对其肿瘤、脑、心脏、肝脏、肾脏、骨组织和肺组织进行切片并作HE染色观察肿瘤转移及进展情况，确认荷瘤鼠模型处于晚期或是已出现转移。

b,根据荷瘤鼠体重和肿瘤大小，采用随机分组的方法进行分组。

c,根据分组结果，开始给予测试药物(给药方式：口服给药；给药剂量：5、10、20mg/kg；给药体积：10mL/kg；给药频率：1次/天；给药周期：14或21天；溶媒：pH4.1乙酸缓冲液)。

d,开始给予测试药物后每周两次量瘤、称重。

e,实验结束后安乐死动物。

f,用Excel等软件处理数据。化合物抑瘤率TGI(％)的计算：当肿瘤无消退时，TGI(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。当肿瘤有消退时，TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/该处理组开始给药时平均瘤体积]×100％。

结果可知，本化合物可高效抑制乳腺癌裸小鼠移植瘤的生长，并引起裸小鼠移植瘤的消退，且化合物的活性具有剂量依赖性。

三、临床试验研究

在一项开放、多中心临床试验，用于评价每日一次口服式I化合物甲磺酸盐在患有乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌患者中进行，该项研究中患者接受每日一次口服含有式I化合物甲磺酸盐的药物，评价其安全性、耐受性、药代动力学(PK)和抗肿瘤活性。

1.整个研究包含3个阶段：

(1)剂量递增群组(2)剂量扩展群组和(3)剂量延伸群组。

2.受试人群：

符合剂量递增条件的患者年龄18岁或以上，患有乳腺癌或三阴性乳腺癌，经组织学或细胞学证实。

3.治疗持续时间：

一个研究治疗周期定义为21天连续施用。患者持续接受治疗直到疾病恶化或达到终止标准。

结果表明，从临床疗效趋势表明该产品具有良好的开发价值，经式I化合物或其盐治疗后的乳腺癌患者，特别是三阴性乳腺癌患者的中位生存期明显提高，肝肺转移和淋巴结转移率显著下降，完全缓解率和部分缓解率达到90％以上。

Claims (10)

1.式I化合物或其可药用盐在制备治疗乳腺癌药物的用途，

其中，所述可药用盐选自以下的一种或组合：甲磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述三阴性乳腺癌是指：使用多克隆抗HER2一级抗体进行半定量免疫组织化学分析时，所述癌细胞对于雌激素受体(ER)和孕酮受体的得分为阴性，并且产生了0、1+或2+的测试结果。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述癌细胞对于HER2基因扩增为FISH阴性。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述三阴性乳腺癌为HER3+或FISH-阳性乳腺癌。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述三阴性乳腺癌在组织病理学上的特征是具有基底样表型。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌伴有BRCA1、BRCA2、PALB2、FANCM或TP53中的一种或多种基因的突变。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌为发生肝转移、肺转移、淋巴结转移或骨转移的晚期乳腺癌。

9.根据权利要求1-8任一项所述的用途，其特征在于，乳腺癌患者的sMET的基线血浆浓度大于或等于795mg/ml中值。

10.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其特征在于，式I化合物或其可药用盐是通过抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路来发挥治疗乳腺癌的作用。

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