CN112105733A - 合成rig-i样受体激动剂 - Google Patents
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Abstract
本公开尤其涉及与RIG‑I样受体(RLR)结合并使所述RLR激动的RNA分子(例如,RNA发夹激动剂),并且涉及所述分子在用于治疗病症(例如,癌症)或改善所述病症的一种或多种症状的方法中的用途。
Description
相关申请
本申请要求于2018年4月19日提交的美国临时申请第62/659,999号的权益。上述申请的整个内容通过此引用并入本文。
背景技术
引入到细胞中的外源性核酸(尤其是病毒核酸)会诱导先天免疫应答,从而引起干扰素(IFN)产生和细胞死亡等事件。在感应到病毒RNA时,RIG-I样受体会诱导I型干扰素(IFN)分泌,从而导致感染的细胞和相邻细胞中抗病毒IFN诱导的蛋白质上调,这会抑制病毒复制。另外的下游事件吸引免疫细胞并触发适应性免疫应答。另外,据报道,RIG-I配体会诱导许多不同类型的肿瘤细胞的凋亡,但不会诱导正常细胞的凋亡。
仍然需要另外的且改进的组合物和方法来调节免疫调节蛋白的活性。此类药剂可以用于癌症免疫疗法和其它病状(如慢性感染)的治疗。需要开发用于多种治疗性免疫调节应用的改进的RIG-I样受体配体。
发明内容
本公开至少部分地基于充当RIG-I样受体激动剂的合成RNA分子的发现。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,并且其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性。在一些实施例中,所述第一多核苷酸包括所述序列基序。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括选自由以下组成的组的序列基序:
(i)GT重复基序;
(ii)GA重复基序;
(iii)AUCG重复基序;
(iv)AU重复基序;
(v)二嘧啶基序;
(vi)二嘌呤基序;
(vii)嘧啶三联体基序;
(viii)嘌呤三联体基序;
(ix)回文序列基序;以及
(x)(i)到(ix)中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序的组合。在一些实施例中,所述序列基序的组合为GT-重复基序和嘌呤三联体基序。在一些实施例中,所述序列基序的组合为AUCG重复基序和二嘧啶基序。在一些实施例中,所述序列基序的组合为AUGC重复基序和二嘌呤基序。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,其中所述至少一种提高的生物活性选自:
(i)RLR介导的细胞因子产生的增加;
(ii)干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;
(iii)RLR介导的细胞内信号传导的增加;
(iv)与RLR的结合亲和力的增加;以及
(v)(i)到(iv)中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂相对于不包括序列基序的激动剂,包括增加RLR介导的I型干扰素(例如,IFN-α、IFN-β)产生的所述序列基序。在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂相对于不包括序列基序的激动剂,包括增加RLR介导的IL-1β产生的所述序列基序。在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂相对于不包括序列基序的激动剂,包括增加RLR介导的IP-10产生的所述序列基序。在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂相对于不包括序列基序的激动剂,包括增加RLR介导的IL-6、IL-12p70、MCP-1和/或MIP-1β产生的所述序列基序。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GT-重复基序(例如,GTGTGT),所述GT-重复基序包括<19个、约15个到18个、约15个、约10个到15个、约10个、约5个到10个、约5个、约4个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括<19个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约15个到18个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约15个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约10个到15个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约5个到10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约5个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括约4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些方面,所述GT重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括18个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括16个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括14个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括12个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括8个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括6个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT-重复基序,所述GT-重复基序包括4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GT-重复基序,其中所述GT重复基序为[GT]n,其中n=2到9、3到7或4到8。在一些方面,所述GT重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接(可操作地连接)的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,其中所述第一多核苷酸包括所述序列基序,并且其中所述序列基序为GT重复基序,所述GT重复基序包括约14个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT重复基序,其中所述GT重复基序为[GT]7。在一些方面,所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,其中所述第一多核苷酸包括所述序列基序,并且其中所述序列基序为GT重复基序,所述GT重复基序包括6个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GT重复基序,其中所述GT重复基序为[GT]3。在一些实施例中,所述序列基序为GT重复基序,其中所述GT重复基序为[GT]3,并且其中GT重复序列之后分别是嘌呤三联体和UCG。在一些实施例中,所述嘌呤三联体为GGA。在一些方面,所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GA重复基序(例如,GAGAGA),所述GA重复基序包括<19个、约15个到18个、约15个、约10个到15个、约10个、约5个到10个、约5个、约4个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括<19个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约15个到18个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约15个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约10个到15个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约10个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约5个到10个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约5个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些方面,所述GA重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括序列基序,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括18个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括16个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括14个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括12个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括8个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括6个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GA重复基序,其中所述GA重复基序为[GA]n,其中n=2到9、3到7或4到8。在一些方面,所述GA重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,其中所述第一多核苷酸包括所述序列基序,并且其中所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括约14个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列。在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,其中所述GA重复基序为[GA]7。在一些方面,所述GA重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为AUCG重复基序(例如,AUCGAUCG),所述AUCG重复基序包括<19个、约16个、约12个到约16个、约12个、约8个到12个、约6个、约16个、12个、8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括<19个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约12个到16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约8个到12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约6个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些方面,所述AUCG重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]n,其中n=2到4或2、3或4。在一些方面,所述AUCG重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,其中所述第一多核苷酸包括所述序列基序,并且其中所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括约12个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3。在一些方面,所述AUCG重复基序在所述RLR激动剂中提供了提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述基序之前是CG或二嘧啶基序。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是CG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3并且之前是CG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3并且之前是所述二嘧啶基序CC。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述基序之前是二嘌呤基序。在一些实施例中,所述二嘌呤基序为GA。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3并且之前是所述二嘌呤基序GA。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是所述二嘌呤基序II。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代。在一些实施例中,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUGC重复基序的所述一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUCG重复基序的所述一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T),并且其中所述AUGC重复基序之前是GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中一个或多个鸟苷核苷(G)被经过修饰的核苷取代。在一些实施例中,所述经过修饰的核苷为肌苷(I)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUCG重复基序的所述一个或多个鸟苷核苷(G)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T),并且其中所述AUGC重复基序之前是GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述基序之前是IG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3并且之前是IG。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括AUCG重复序列,其中一个或多个鸟苷核苷(G)被肌苷(I)取代,其中所述AUCG重复序列之前是肌苷(I)。在一些实施例中,包括所述AUCG重复的所述鸟苷核苷(G)被肌苷(I)取代,其中所述AUCG重复之前是肌苷(I),其中所述第一多核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括肌苷(I)。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,并且其中所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,其中所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序,并且其中所述二嘌呤基序为GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,并且其中所述AUCG重复基序之前是嘌呤三联体基序。在一些实施例中,所述嘌呤三联体基序为GGG。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,其中所述AUCG重复基序之前是嘌呤三联体基序,并且其中所述嘌呤三联体基序为GGG。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,并且其中所述AUCG重复基序之前是CCCCCG。在一些实施例中,所述序列基序为AUCG重复基序,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2,并且其中所述AUCG重复基序之前是TCGUCG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、约18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的<19个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的约15-18个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的约15个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的约10-15个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的约10个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的18个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的序列17个核苷酸或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的16个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的15个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的14个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的13个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的12个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的11个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的10个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的9个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的8个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的7个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的6个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的5个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的4个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括接头,其中所述接头的侧翼是AU。在一些实施例中,所述接头的侧翼是AU重复基序,其中所述AU重复基序为[AU]n,其中n=2到3。在一些实施例中,所述AU重复基序为[AU]2。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,和/或X1和/或X2中的至少一个包括至少一个肌苷核苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,并且其中所述激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中如果存在的话,肌苷与胞苷碱基配对。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,N1包括肌苷,并且N4包括胞苷。在一些实施例中,N1包括肌苷,并且N4包括胞苷,并且X1和X2在长度上各自为12个核苷酸。在一些实施例中,N1包括胞苷,并且N4包括肌苷。在一些实施例中,N2包括肌苷,并且N3包括胞苷。在一些实施例中,N2包括胞苷,并且N3包括肌苷。在一些实施例中,N1包括鸟苷。在一些实施例中,N2包括鸟苷。在一些实施例中,N1包括胞苷。在一些实施例中,N2包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中如果存在的话,肌苷与胞苷碱基配对,并且其中N1包括肌苷,并且N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N2包括肌苷,并且N3包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,N3和N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,X1和X2各自包括至少一个肌苷,并且X1和X2在长度上各自为12个核苷酸。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,X1和X2各自包括至少一个肌苷,并且X1和X2在长度上各自为12个核苷酸。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中如果存在的话,肌苷与胞苷碱基配对,并且其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,X1和X2各自包括至少一个肌苷,并且X1和X2在长度上各自为12个核苷酸。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,X1和X2各自包括至少一个肌苷,并且X1和X2在长度上各自为12个核苷酸。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中X1和X2各自为12个核苷酸,并且包括1个、2个、3个或4个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为13个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个或5个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为14个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个或6个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为15个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为16个核苷酸并且各自包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为12个核苷酸并且包括至少10%、20%、30%或40%肌苷核苷。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1包括序列基序[AUCN5]x,其中N5为包括鸟苷或肌苷,其中x为值指示序列基序的数量的整数,并且其中x=3或4;
(viii)X2包括序列基序[CN6AU]y,其中N6包括鸟苷或肌苷,其中y为值指示序列基序的数量的整数,并且其中y=3或4;
(ix)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
任选地其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。
在一些实施例中,N5包括肌苷,并且N6包括肌苷。在一些实施例中,N5包括鸟苷,并且N6包括肌苷。在一些实施例中,N5包括肌苷,并且N6包括鸟苷。在一些实施例中,N5包括鸟苷(G),并且N6包括鸟苷(G)。在一些实施例中,x=3,并且y=3。在一些实施例中,x=4,并且y=4。在一些实施例中,N1包括肌苷(I),并且N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N2包括肌苷(I),并且N3包括胞苷(C)。在一些实施例中,N3包括肌苷(I),并且N2包括胞苷(C)。在一些实施例中,N4包括肌苷(I),并且N1包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N2包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N1包括胞苷(C)。在一些实施例中,N2包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷(G),并且N3和N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷(I),并且N3和N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括肌苷(I)。在一些方面,本公开的所述RLR激动剂具有提高的生物活性,其中所述提高的生物活性是RLR介导的细胞因子产生的增加;干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;RLR介导的细胞内信号传导的增加;与RLR的结合亲和力的增加;以及前述中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括接头,其中所述接头为核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施例中,所述接头为非核苷酸接头。在一些实施例中,所述接头为核苷酸接头。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括四元环,其中所述四元环的核苷酸序列选自由以下组成的组:
(a)UNCG,其中N=A、C、G或U;
(b)GNRA,其中N=A、C、G或U,并且其中R=A或G;
(c)ANYA,其中N=A、C、G或U,并且其中Y=C或T;
(d)CUYG,其中Y=C或T;
(e)UMAC,其中M=A或C;以及
(f)CUUG。
在一些实施例中,所述四元环的序列为UUCG。在一些实施例中,所述四元环的序列为GAUC。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括核苷酸接头,其中所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU或UGUUU。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UGUUU。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括非核苷酸接头,其中所述非核苷酸接头选自由以下组成的组:
(a)乙二醇接头;以及
(b)烷基接头。
在一些实施例中,所述非核苷酸接头为六乙二醇接头。在一些实施例中,所述非核苷酸接头为C9烷基接头。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括5′二磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述激动剂包括5′三磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述其衍生物或类似物包括选自以下的磷酸酯生物电子等排体:膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并硼唑、硼代磷酸酯、方酰胺。
在一些实施例中,所述激动剂包括经过修饰的核苷酸、经过修饰的核苷或经过修饰的核碱基或其组合。在一些实施例中,所述激动剂包括对核苷酸间键或对多核苷酸主链的修饰。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂展示出以下性质中的一种或多种性质:
(a)与一种或多种RLR(例如,RIG-1、MDA5和/或LGP2)特异性结合;
(b)增加RLR介导的细胞因子产生;
(c)增加干扰素刺激的基因(ISG)的RLR介导的表达;
(d)增加RLR依赖性细胞内信号传导;
(e)增加所述双链体的稳定性;
(f)增加对RLR的结合亲和力;
(g)减少脱靶结合;
(h)增加生物半衰期;
(i)增加生物分布和生物利用度;
(j)增加和/或增强进入细胞和/或组织的摄取;
(k)降低免疫原性;以及
(l)(a)到(k)中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1和N2各自包括鸟苷,其中N3和N4各自包括胞苷,其中X1和X2在长度上各自为12个核苷酸,其中X1和X2各自包括至少一个肌苷核苷,其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对,并且其中L包括核苷酸接头,所述核苷酸接头包括四元环,其中所述四元环的核苷酸序列为UUCG。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1包括肌苷,并且N2包括鸟苷,其中N3和N4各自包括胞苷,其中X1和X2在长度上各自为12个核苷酸,其中X1和X2各自包括至少一个肌苷核苷,其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对,并且其中L包括核苷酸接头,所述核苷酸接头包括四元环,其中所述四元环的核苷酸序列为UUCG。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,其中X1和X2在长度上各自为12个核苷酸,其中X1和X2各自包括至少一个肌苷核苷,其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对,并且其中L包括核苷酸接头,所述核甘酸接头包括四元环,其中所述四元环的核苷酸序列为UUCG。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,并且其中所述激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中N1和N2包括鸟苷,其中N3和N4包括胞苷,其中X1和X2在长度上各自为12个核苷酸,并且其中所述非核苷酸接头为C9烷基接头。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,并且其中所述激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中N1和N2包括鸟苷,其中N3和N4包括胞苷,其中X1和X2在长度上各自为12个核苷酸,并且其中所述非核苷酸接头为六乙二醇接头。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,并且其中所述激动剂包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,并且其中所述激动剂包括选自由SEQ ID NO:22、23和25组成的组的核苷酸序列。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,其中所述激动剂包括式5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:58和89;
(ii)分别为SEQ ID NO:59和89;以及
(iii)分别为SEQ ID NO:61和91。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,其中所述激动剂包括式5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
在本公开所提供的所述RLR激动剂的一些实施例中,构成所述RLR激动剂的核苷酸序列不与基因组DNA序列或mRNA序列互补,其中所述RLR激动剂不参与RNA干扰,并且其中所述RLR激动剂不使基因表达沉默。
在一些方面,本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或减少或抑制所述受试者的肿瘤生长的药物组合物,所述药物组合物包括本公开所提供的RLR激动剂和药学上可接受的载剂。在一些实施例中,所述RLR激动剂调配于聚乙烯亚胺(PEI)载剂中。在一些实施例中,所述PEI载剂为
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中一种或多种细胞因子的RLR介导的产生的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述RLR激动剂增加细胞中RLR介导的细胞因子的产生。在一些实施例中,所述RLR激动剂增加细胞中RLR介导的I型干扰素(例如,IFN-α、IFN-β)的产生。在一些实施例中,所述RLR激动剂增加细胞中RLR介导的IL-1β的产生。在一些实施例中,所述RLR激动剂增加细胞中RLR介导的IP-10的产生。在一些实施例中,所述RLR激动剂增加细胞中RLR介导的IL-6、IL-12p70、MCP-1和/或MIP-1β的产生。
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述激动剂增加细胞中一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达。
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中的RLR依赖性细胞内信号传导的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述激动剂增加RLR依赖性细胞内信号传导。
在一些方面,本公开提供了一种刺激受试者体内的免疫应答的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种治疗或延迟受试者体内的癌症的进展的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种减少或抑制有需要的受试者体内的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物,其中所述激动剂或所述药物组合物增加细胞中的一种或多种细胞因子的RLR介导的产生、增加细胞中的一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达和/或增加细胞中的RLR依赖性细胞内信号传导,由此刺激所述免疫应答、治疗所述癌症或延迟所述癌症的进展或抑制肿瘤的生长。
在本公开所提供的所述方法的一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂或激动剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体7(TLR7)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂。在一些实施例中,所述PD-1/PD-L1拮抗剂选自由以下组成的组:PDR001、(派姆单抗(pembrolizumab))、(纳武单抗(nivolumab))、皮地利珠单抗(pidilizumab)、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591和AMP-224。在一些实施例中,所述PD-1/PD-L1拮抗剂选自由以下组成的组:FAZ053、(阿特朱单抗(atezolizumab))、(阿维鲁单抗(avelumab))、(度伐鲁单抗(durvalumab))和BMS-936559。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为TIM-3拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为VISTA拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为腺苷A2AR拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为B7-H3拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为B7-H4拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为BTLA拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为CTLA-4拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为IDO拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为KIR拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为LAG-3拮抗剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体3(TLR3)激动剂。在一些实施例中,所述TLR3激动剂为聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。在一些实施例中,所述TLR3激动剂为(聚ICLC)。在一些实施例中,所述TLR3激动剂为聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)。在一些实施例中,所述TLR3激动剂为在一些实施例中,所述TLR3激动剂为(生物缀合物)。在一些实施例中,所述TLR3激动剂为
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体7(TLR7)激动剂。在一些实施例中,所述TLR7激动剂为GS-9620(维沙莫德(Vesatolimod))。在一些实施例中,所述TLR7激动剂为咪喹莫特(imiquimod)(ALDARATM)。在一些实施例中,所述TLR7激动剂为瑞喹莫德(resiquimod)(R-848)。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体9(TLR9)激动剂。在一些实施例中,所述TLR9激动剂为CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在一些实施例中,所述CpGODN为A类CpG ODN(CpG-A ODN)。在一些实施例中,所述CpG ODN为B类CpG ODN(CpG-B ODN)。在一些实施例中,所述CpG ODN为C类CpG ODN(CpG-C ODN)。
在一些方面,本公开提供了一种本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的用途,所述激动剂或所述药物组合物任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。
在一些方面,本公开提供了一种本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物在制造用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的药剂中的用途,所述激动剂或所述药物组合物任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。
在一些方面,本公开提供了一种包括本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物以及说明书的试剂盒,所述试剂盒用于刺激受试者的免疫应答、或治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长,所述试剂盒任选地具有用于与一种或多种另外的治疗剂组合使用的说明书。
在本公开所提供的用途或试剂盒的一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
在本公开所提供的用途或试剂盒的一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
在本公开所提供的用途或试剂盒的一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体7(TLR7)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂。
在本公开所提供的用途或试剂盒的一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
在本公开所提供的用途或试剂盒的一些实施例中,本公开所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后,官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1提供了条形图,所述条形图描绘了从用3种不同浓度的包括各种修饰的RIG-I样受体激动剂处理的人PBMC的IFN-a分泌的定量。
具体实施方式
概述
RIG-I样受体(RLR)是胞质模式识别受体家族,其对于检测病毒RNA以及启动先天免疫应答至关重要。RLR家族包含三个成员:视黄酸诱导型基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)以及遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2)。这些受体在免疫细胞类型和非免疫细胞类型两者中表达并且调节促进I型和III型干扰素(IFN)的IRF3、IRF7依赖性表达和促炎细胞因子的NF-κB依赖性表达的信号传导途径。
所有三种RLR家族受体均具有带有ATPase活性的DExD/H盒RNA解旋酶结构域。此结构域连同相邻的C端结构域是RNA结合必需的。另外,RIG-I和LGP2的C端结构域已经被示出充当阻遏物结构域,从而确保受体在其由激活RNA结合之前保持非活性构象。
本公开提供了包括合成RNA分子的RLR激动剂,所述合成RNA分子折叠以形成双链dsRNA并且包括提供一种或多种提高的生物活性的一种或多种序列基序。
定义
权利要求书和说明书中使用的术语如以下所述的定义,除非另有说明。在与母临时专利申请中使用的术语直接冲突的情况下,以本申请中使用的术语为准。
必须注意的是,如在本说明书和所附权利要求中所使用的,单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物,除非上下文另外清楚地指明。另外,除非上下文另外要求,否则单数术语应该包含复数含义并且复数术语应该包含单数含义。
约:如本文所使用的,术语“约”(可替代地“大约”)将被普通技术人员理解,并且将根据其所使用的上下文而在一定程度上有所不同。如果存在普通技术人员不清楚的术语使用,则考虑到所述术语使用的上下文,“约”将意指高达特定值的±10%。
激动剂:如本文所用,术语“激动剂”以其最广泛的意义使用,并且涵盖部分或完全促进、诱导、增加和/或激活本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子或化合物。根据本公开的激动剂分子可以包含核酸(例如,寡核苷酸、多核苷酸)、抗体或抗原结合片段、天然多肽、肽、寡核苷酸、脂质、碳水化合物和小有机分子的片段或氨基酸序列变体。在一些实施例中,观察到在激动剂存在的情况下的激活呈剂量依赖性方式。在一些实施例中,测量到的信号(例如,生物活性)比在相当条件下用阴性对照测量的信号高至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约100%。本文还公开了标识适用于本公开的方法的激动剂的方法。例如,这些方法包含但不限于结合测定,如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Forte系统、荧光偏振(FP)测定和放射免疫测定(RIA)。这些测定确定激动剂结合所关注的多肽(例如,受体或配体)的能力,并且因此指示激动剂促进、增加或激活多肽活性的能力。还可以使用功能测定来确定激动剂的功效,如激动剂激活或促进多肽功能的能力。例如,功能测定可以包括使多肽与候选激动剂分子接触,并且测量通常与多肽相关联的一种或多种生物活性中的可检测变化。激动剂的效力通常由其EC50值(激活50%激动剂应答所需的浓度)来限定。EC50值越低,激动剂的效力越大,并且激活最大生物应答所需的浓度越低。
改善:如本文所用,术语“改善”是指在疾病状态(例如,癌症)的治疗中产生的任何治疗上有益的结果,包含预防、严重度或进程的减轻、缓解或治愈。
氨基酸:如本文所用,术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸,以及后来被修饰的那些氨基酸,例如,羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指基本化学结构与天然存在的氨基酸的基本化学结构相同的化合物,即与氢、羧基、氨基和R基结合的碳,例如,高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基(例如,正亮氨酸)或经过修饰的肽主链,但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样,核苷酸可以用其普遍接受的单字母代码来指代。
氨基酸取代:如本文所用,“氨基酸取代”是指用第二不同的“替代”氨基酸残基替代预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个另外的氨基酸并入到预定氨基酸序列中。虽然插入通常将由一个或两个氨基酸残基的插入组成,但是也可以进行更大的“肽插入”,例如插入约三个到约五个或甚至高达约十个、十五个或二十个氨基酸残基。如上所公开的,所插入的一个或多个残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。
碱基组成物:如本文所用,术语“碱基组成物”是指由鸟嘌呤(或次黄嘌呤)+胞嘧啶和/或尿嘧啶(或胸腺嘧啶)+腺嘌呤核碱基组成的核酸(例如,RNA)的总核苷酸的比例。
碱基对:如本文所用,术语“碱基对”是指相对互补的多核苷酸链上的两个核碱基,或同一链的通过特定氢键的形成相互作用的区。如本文所用,与“互补碱基配对”可互换使用的术语“沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对”是指一组碱基配对规则,其中嘌呤总是与嘧啶结合,使得核碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成互补碱基对,并且鸟嘌呤(G)与DNA分子中的胞嘧啶(C)形成互补碱基对。在RNA分子中,胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)替代,所述尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)类似,与腺嘌呤(A)形成互补碱基对。互补碱基对通过氢键结合在一起,并且氢键的数量在碱基对之间有所不同。如本领域已知的,鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)碱基对通过三(3)个氢键结合,并且腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基对通过两(2)个氢键结合。
不遵循这些规则的碱基配对相互作用可以发生在天然、非天然和合成核酸中,并且在本文中被称为“非沃森-克里克碱基配对”或可替代地“非典型碱基配对”。“摆动碱基对”是RNA分子中的两个核碱基之间的不遵循沃森-克里克碱基对规则的配对。例如,肌苷是结构上类似于鸟苷但缺少2-氨基的核苷。肌苷能够与四个天然核碱基中的每个形成两个氢键(Oda等人,(1991)《核酸研究(Nucleic Acids Res)》19:5263-5267),并且研究人员通常将其用作“通用”碱基,这意味着其可以与所有天然存在的或典型的碱基碱基配对。四个主要摆动碱基对是鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)碱基对、次黄嘌呤-尿嘧啶(I-U)碱基对、次黄嘌呤-腺嘌呤(I-A)碱基对和次黄嘌呤-胞嘧啶(I-C)碱基对。为了维持核酸命名法的一致性,将“I”用于次黄嘌呤,因为次黄嘌呤是肌苷的核碱基;命名法另外遵循核碱基以及其对应核苷的名称(例如“G”用于鸟嘌呤和鸟苷两者以及用于脱氧鸟苷)。摆动碱基对的热力学稳定性与沃森-克里克碱基对的热力学稳定性相当。摆动碱基对在RNA分子中的二级结构的形成中起作用。
在一方面,本公开提供了使一个或多个RIG-I样受体(RLR)激动或激活的合成RNA分子,其中肌苷仅可以插入在其将与胞苷碱基配对(I-C碱基对)的位置处;也就是说,肌苷可以取代鸟苷,但不能取代其它核苷。
生物活性的:如本文所用,短语“生物活性的”是指在生物系统和/或生物体中具有活性的任何物质的特性。例如,当施用于生物体时对所述生物体具有生物效应的物质被视为是生物活性的,并且因此具有“生物活性”。在特定实施例中,当核酸为生物活性的时,所述核酸的共享整个核酸的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。
共价连接的:如本文所用,术语“共价连接的”(可替代地“缀合的”、“连接的”、“附接的”、“稠合的”或“拴系的”)当相对于两个或更多个部分使用时,意指所述部分通过包含化学缀合、重组技术或酶活性的任何方式,直接或通过充当连接剂的一个或多个另外的部分彼此物理缔合或连接,以形成足够稳定的结构,使得所述部分在使用所述结构的条件下(例如生理条件下)保持物理缔合。
互补:如本文所用,术语“互补”或“互补性”是指包括两条多核苷酸链或同一多核苷酸链的区的核苷酸的序列与包括所述链或区的双链体的形成之间的关系,其中两条链或区之间的连续碱基配对的程度足以产生双链体结构。已知腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)形成特定的氢键或“碱基对”。类似地,已知胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)碱基配对。还已知非典型核碱基(例如,肌苷)可以与天然碱基氢键合。据称,如果当第一链和第二链以反平行方式布置时,两条链之间的碱基配对的程度在使用双链体结构的条件下(例如,细胞中的生理条件)维持双链体结构,则包括多核苷酸的第一链或其区、部分或片段的核苷酸的序列与包括相同或不同核酸的第二链或其区、部分或片段的核苷酸的序列“充分互补”。应当理解的是,多核苷酸的互补链或互补区可以包含一些非互补的碱基对。互补性可以是“部分的”,其中根据碱基配对规则,包括多核苷酸的核碱基中的仅一些核碱基是匹配的。或者,在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。尽管多核苷酸链或区之间的互补性的程度对链或区之间杂交的效率和强度有显著影响,但不要求两个互补的多核苷酸在每个核苷酸位置处都碱基配对。在一些实施例中,第一多核苷酸与第二多核苷酸100%或“完全”互补,并且因此在每个核苷酸位置处形成碱基对。在一些实施例中,第一多核苷酸不是100%互补的(例如,90%或80%或70%互补),并且在一个或多个核苷酸位置处含有错配的核苷酸。虽然通常期望完美的互补性,但是一些实施例可以包含一个或多个错配但优选地6个、5个、4个、3个、2个或1个错配。
接触:如本文所用,术语“接触”意指建立两个更或多个实体之间的物理连接。例如,使细胞与药剂(例如,本公开的RNA、脂质纳米颗粒组合物或其它药物组合物)接触意味着使细胞和药剂共享物理连接。使细胞与外部实体在体内、体外两者以及离体接触的方法在生物学领域是众所周知的。在本公开的示例性实施例中,使哺乳动物细胞与组合物(例如,本公开的分离的RNA、纳米颗粒或药物组合物)接触的步骤在体内执行。例如,使脂质纳米颗粒组合物与可以安置在生物体(例如,哺乳动物)内的细胞(例如,哺乳动物细胞)接触可以通过任何合适的施用途径(例如,对生物体的肠胃外施用,包含静脉内、肌内、皮内和皮下施用)执行。对于存在于体外的细胞,组合物(例如,脂质纳米颗粒或分离的RNA)和细胞可以例如,通过将组合物添加到细胞的培养基中接触,并且可以涉及或导致转染。此外,多于一个细胞可以通过药剂接触。
变性:如本文所用,术语“变性”是指核酸中碱基配对的核苷酸之间的氢键合被破坏,从而导致二级和/或三级核酸结构损失的过程(例如,先前退火的链的分离)。变性可以通过向核酸应用外部物质、能量或生化过程而发生。
抗原呈递细胞:术语“抗原呈递细胞”或“APC”是展示与其表面上的MHC络合的外来抗原的细胞。T细胞使用T细胞受体(TCR)识别此复合物。APC的实例包含但不限于树突状细胞(DC)、外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞(如THP-1)、B类淋巴母细胞(如C1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞衍生的树突状细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用对抗原进行内化。
细胞凋亡:如本文所用,术语“细胞凋亡”是指发生在多细胞生物体(例如人类)中的程序性细胞死亡的过程。导致细胞凋亡的高度调节的生化事件和分子事件可能导致细胞的可观察到的且特征性形态学变化,包含细胞膜起泡、细胞体积收缩、染色体DNA缩合和片段化以及mRNA衰变。用于标识经历细胞凋亡的细胞(包含T细胞)的常见方法是将细胞暴露于荧光团缀合蛋白(膜联蛋白V)。膜联蛋白V通常用于通过其与质膜的外小叶上的磷脂酰丝氨酸结合的能力来检测凋亡细胞,这是细胞经历细胞凋亡过程的早期指标。
平末端:如本文所用,术语“平末端”“平末端的”是指双链体核酸或双链核酸的末端的结构,其中包括双链体的两条互补的链至少在一个末端处终止于碱基对。因此,包括双链体的任何链都不比另一条链延伸得离末端更远。
癌症抗原:如本文所用,“癌症抗原”是指(i)肿瘤特异性抗原,如新抗原,(ii)肿瘤相关联的抗原,(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞,(iv)表达肿瘤相关联的抗原的细胞,(v)肿瘤上的胚胎抗原,(vi)自体肿瘤细胞,(vii)肿瘤特异性膜抗原,(viii)肿瘤相关联的膜抗原,(ix)生长因子受体,(x)生长因子配体,和(xi)与癌症相关联的任何其它类型的抗原或抗原呈递细胞或材料。
癌:如本文所用,术语“癌”是领域公认的,并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤,包含呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、和黑色素瘤。本文所述的RIG-I样受体(RLR)激动剂可以用于治疗患有、怀疑患有或可能具有患有任何类型的癌症(包括肾癌或黑色素瘤)的高风险的患者。示例性癌包含形成于子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈部、结肠和卵巢组织的癌。术语还包含癌肉瘤,所述癌肉瘤包含由癌性组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指衍生自腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答:如本文所用,术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+ T细胞介导。
双链体:如本文所用,术语“双链体”是指由双链多核苷酸的互补链形成的结构,或自身向后折叠的单链多核苷酸的互补区。核酸的双链体结构是互补核苷酸序列通过碱基配对相互作用结合在一起或杂交的结果。
EC50:如本文所用,术语“EC50”是指诱导体外或体内测定中的应答的激动剂的浓度,所述浓度为最大应答的50%,即,最大应答与基线之间的一半。
有效剂量:如本文所用,术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”被限定为足以实现或至少部分实现所期望的效果的量。
发夹RNA:如本文所用,术语“发夹RNA”或“RNA发夹”是指包括双链RNA(dsRNA)茎的自身互补RNA,所述双链RNA茎由碱基配对以形成双链体的互补核苷酸链构成,所述双链体在一个末端处终止于核苷酸接头,所述核苷酸接头包括未配对的核苷酸的环(例如,四元环),所述环包括未配对的核苷酸或终止于非核苷酸接头,所述非核苷酸接头包括柔性化学部分(例如,乙二醇),所述接头中的任一个连接互补核苷酸链。RNA发夹可以在茎的长度、环和/或接头的大小和/或组合物、茎内的碱基对错配的数量以及实际的核苷酸序列方面有所不同。RNA发夹可以提供一种或多种功能,包含但不限于指导包括发夹的RNA分子的整体折叠、确定核酶中的相互作用、保护信使RNA(例如,mRNA)免受降解的影响、充当RNA结合蛋白的识别基序或结构以及充当酶促反应的底物。对RNA发夹结构和功能的进一步描述可以在Svoboda和Di Cara(2006)《细胞与分子生命科学(Cell Mol Life Sci.)》63(7-8):901-908和其中含有的参考文献中找到。在一些实施例中,包括由本公开所提供的RLR激动剂的发夹RNA的茎区终止于具有5′三磷酸酯或二磷酸酯的平末端。
需要:如本文所用,“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指通过适当的医疗从业者(例如,在人类的情况下,医生、护士或执业护士;在非人类哺乳动物的情况下,兽医)的判断将合理地受益于给定治疗(如用包括RIG-I样受体激动剂的组合物进行的治疗)的受试者。
接头:如本文所用,术语“接头”(可替代地为“系绳”或“间隔子”)是指将两条多核苷酸链或区共价连接、附接或偶联在一起的部分。如本文所用,包括核苷酸的接头被称为“核苷酸接头”(例如四元环)。如本文所用,术语“非核苷酸接头”是指包括化学部分并且不包括核苷酸的接头。非核苷酸接头的非限制性实例包含包括乙二醇(例如六乙二醇)、烷基链(例如C9烷基接头)和二苯乙烯二醚的接头。对接头的进一步描述可以在Paredes等人,(2011)《方法(Methods)》54:251-259中找到,所述文献通过引用以其整体并入本文。
LGP2:如本文所用,术语“LGP2”是指遗传学和生理学实验室蛋白2多肽(RIG-I样受体家族的特定成员)并且由人体内的DHX58基因编码。LGP2在本领域中的替代名称和首字母缩略词包含DHX58、D11LGP2、D11Igp2e和RLR-3。全长人LGP2的示例性氨基酸序列在表4(SEQID NO:100)中和这里列示:
MELRSYQWEVIMPALEGKNIIIWLPTGAGKTRAAAYVAKRHLETVDGAKVVVLVNRVHLVTQHGEEFRRMLDGRWTVTTLSGDMGPRAGFGHLARCHDLLICTAELLQMALTSPEEEEHVELTVFSLIVVDECHHTHKDTVYNVIMSQYLELKLQRAQPLPQVLGLTASPGTGGASKLDGAINHVLQLCANLDTWCIMSPQNCCPQLQEHSQQPCKQYNLCHRRSQDPFGDLLKKLMDQIHDHLEMPELSRKFGTQMYEQQVVKLSEAAALAGLQEQRVYALHLRRYNDALLIHDTVRAVDALAALQDFYHREHVTKTQILCAERRLLALFDDRKNELAHLATHGPENPKLEMLEKILQRQFSSSNSPRGIIFTRTRQSAHSLLLWLQQQQGLQTVDIRAQLLIGAGNSSQSTHMTQRDQQEVIQKFQDGTLNLLVATSVAEEGLDIPHCNVVVRYGLLTNEISMVQARGRARADQSVYAFVATEGSRELKRELINEALETLMEQAVAAVQKMDQAEYQAKIRDLQQAALTKRAAQAAQRENQRQQFPVEHVQLLCINCMVAVGHGSDLRKVEGTHHVNVNPNFSNYYNVSRDPVVINKVFKDWKPGGVISCRNCGEVWGLQMIYKSVKLPVLKVRSMLLETPQGRIQAKKWSRVPFSVPDFDFLQHCAENLSDLSLD
(NCBP登录号:NP_077024.2)
局部施用:如本文所用,“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于组合物或药剂通过血管系统传输到其预期靶组织或位点的递送。例如,可以通过注射或植入组合物或药剂或通过注射或植入含有组合物或药剂的装置来递送组合物。在靶组织或位点附近局部施用之后,组合物或药剂或其一种或多种组分可以扩散到预期的靶组织或位点。
MDA5:如本文所用,术语“MDA5”是指黑色素瘤分化相关蛋白5多肽(RIG-I样受体家族的特定成员)并且由人体内的IFIH1基因编码。MDA5在本领域的替代名称和首字母缩略词包含AGS7、Hlcd、IDDM19、MDA-5、RLR-2、SGMRT1和用解旋酶C结构域1诱导的干扰素。全长人MDA5的示例性氨基酸序列在表4(SEQ ID NO:99)中和这里列示:
MSNGYSTDENFRYLISCFRARVKMYIQVEPVLDYLTFLPAEVKEQIQRTVATSGNMQAVELLLSTLEKGVWHLGWTREFVEALRRTGSPLAARYMNPELTDLPSPSFENAHDEYLQLLNLLQPTLVDKLLVRDVLDKCMEEELLTIEDRNRIAAAENNGNESGVRELLKRIVQKENWFSAFLNVLRQTGNNELVQELTGSDCSESNAEIENLSQVDGPQVEEQLLSTTVQPNLEKEVWGMENNSSESSFADSSVVSESDTSLAEGSVSCLDESLGHNSNMGSDSGTMGSDSDEENVAARASPEPELQLRPYQMEVAQPALEGKNIIICLPTGSGKTRVAVYIAKDHLDKKKKASEPGKVIVLVNKVLLVEQLFRKEFQPFLKKWYRVIGLSGDTQLKISFPEVVKSCDIIISTAQILENSLLNLENGEDAGVQLSDFSLIIIDECHHTNKEAVYNNIMRHYLMQKLKNNRLKKENKPVIPLPQILGLTASPGVGGATKQAKAEEHILKLCANLDAFTIKTVKENLDQLKNQIQEPCKKFAIADATREDPFKEKLLEIMTRIQTYCQMSPMSDFGTQPYEQWAIQMEKKAAKEGNRKERVCAEHLRKYNEALQINDTIRMIDAYTHLETFYNEEKDKKFAVIEDDSDEGGDDEYCDGDEDEDDLKKPLKLDETDRFLMTLFFENNKMLKRLAENPEYENEKLTKLRNTIMEQYTRTEESARGIIFTKTRQSAYALSQWITENEKFAEVGVKAHHLIGAGHSSEFKPMTQNEQKEVISKFRTGKINLLIATTVAEEGLDIKECNIVIRYGLVTNEIAMVQARGRARADESTYVLVAHSGSGVIEHETVNDFREKMMYKAIHCVQNMKPEEYAHKILELQMQSIMEKKMKTKRNIAKHYKNNPSLITFLCKNCSVLACSGEDIHVIEKMHHVNMTPEFKELYIVRENKALQKKCADYQINGEIICKCGQAWGTMMVHKGLDLPCLKIRNFVVVFKNNSTKKQYKKWVELPITFPNLDYSECCLFSDED
(NCBI登录号:NP_071451.2)
经过修饰的:如本文所用,“经过修饰的”或“修饰”是指的由多核苷酸(例如,RNA)的修饰引起的改变的状态或结构改变。可以以各种方式对多核苷酸进行修饰,包含化学上、结构上、和/或功能上。例如,可以通过掺入包括功能序列或二级结构的提供生物活性的非天然碱基或序列基序来对本公开的RNA分子进行修饰。在一个实施例中,通过引入非天然或经过化学修饰的碱基、核苷和/或核苷酸对RNA进行修饰,例如,因为其涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C。
天然存在的:如本文所用,术语“天然存在的”在应用于对象时是指可以在自然界中找到对象的事实。例如,存在于生物体(包含病毒)中,可以从自然界中的来源中分离出来,并且其在实验室中未经人有意修饰的多肽或多核苷酸序列或其组分,如氨基酸或核苷酸,是天然存在的。
核酸:如本文所用,术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物或寡聚物。除非具体限制,否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。核苷酸的聚合物被称为“多核苷酸”。本公开的示例性核酸或多核苷酸包含但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、DNA-RNA杂交体、RNAi诱导剂、RNAi试剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA,包含具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA以及具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)或其杂交体。
本文使用的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成,其可以是未经修饰的RNA或DNA或经过修饰的RNA或DNA。例如,多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链区和双链区的混合物的RNA、包括可以是单链或更典型地双链或单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子构成。另外,多核苷酸可以由包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区构成。多核苷酸还可以含有一个或多个经过修饰的碱基或出于稳定性或出于其它原因而进行修饰的DNA或RNA主链。“经过修饰的”碱基包含例如三苯甲基化的碱基。“经过修饰的核苷”包含例如肌苷和胸腺嘧啶,当后者存在于RNA中或包括RNA时。可以对DNA和RNA进行各种修饰;因此,“多核苷酸”包括经过化学、酶或代谢修饰的形式。
核酸结构:如本文所用,术语“核酸结构”是指包括核酸(例如RNA)的原子、化学成分、元素、基序和/或核碱基序列的布置或组织,和/或可以指代核酸的二维或三维状态。因此,术语“RNA结构”是指包括RNA分子(例如mRNA)的原子、化学成分、元素、基序和/或核碱基序列的布置或组织,和/或可以指代RNA分子的二维和/或三维状态。核酸结构可以基于增加的组织复杂度被进一步划分为四个组织类别,所述组织类别在本文中被称为“分子结构”、“一级结构”、“二级结构”和“三级结构”。
核碱基:如本文所用,术语“核碱基”(可替代地“核苷酸碱基”或“含氮碱基”)是指在核酸中发现的嘌呤或嘧啶杂环化合物,其包含赋予核酸或其部分或片段提高的性质(例如结合亲和力、核酸酶抗性、化学稳定性)的天然存在的嘌呤和嘧啶的任何衍生物或类似物。腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶是在天然核酸中发现的主要或典型核碱基。也可以将其它天然的、非天然的、非典型的和/或合成的核碱基掺入到核酸中,如本文公开的那些核酸。
核苷/核苷酸:如本文所用,术语“核苷”是指含有糖分子(例如,RNA中的核糖或DNA中的脱氧核糖)、或其与核碱基(例如,嘌呤或嘧啶)共价连接的衍生物或类似物、或其衍生物或类似物(在本文中也被称为“核碱基”)的化合物。如本文所用,术语“核苷酸”是指与磷酸酯基团共价连接的核苷。如本文所用,术语“核糖核苷”是指包括核糖和核碱基(例如腺苷(A)、胞苷(C)、鸟苷(G)、5-甲基尿苷(m5U)、尿苷(U)或肌苷(I))的核苷。
可操作地连接:如本文所用,当核酸或其片段或部分(如多核苷酸或寡核苷酸)被放置成与另一核酸序列或其片段或部分处于功能关系时,其“可操作地连接”。
多核苷酸/寡核苷酸:如本文所用,术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用,并且是指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷酸或核苷单体的单链或双链聚合物或寡聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包含包括以类似方式起作用的非天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键或其部分的聚合物和寡聚物。多核苷酸不限于任何特定长度的核苷酸序列,因为术语“多核苷酸”涵盖任何长度的核苷酸的聚合形式。短多核苷酸在本领域中通常被称为“寡核苷酸”。在本公开的上下文中,此类经过修饰的或取代的多核苷酸和寡核苷酸通常优于天然形式,因为所述修饰增加了一种或多种期望的或有益的生物性质或活性,所述期望的或有益的生物性质或活性包含但不限于在核酸酶存在的情况下增加的细胞因子产生、增强的细胞摄取和/或增加的稳定性。在一些实施例中,本公开的激动剂包括含有经过修饰的核苷酸的至少一个区的多核苷酸和寡核苷酸,所述经过修饰的核苷酸赋予一种或多种有益的性质或增加生物活性(例如,增加的核酸酶抗性、增加的进入细胞的摄取、增加的双链体稳定性、增加的对靶多肽的结合亲和力)。
回文序列:如本文所用,术语“回文序列”(可替代地为“回文”)是指自身互补的核苷酸序列;其中当沿5′到3′阅读时,处于5′到3′方向上的核苷酸序列与包括互补链的核苷酸序列相同。例如,序列5′-ACCTAGGT-3′是回文序列,因为当沿5′到3′的方向阅读时,其互补序列3′-TGGATCCA-5′与原始序列相同。相比之下,序列5′-AGTGGCTG-3′不是回文序列,因为当沿5′到3′的方向阅读时,其互补序列3′-TCACCGAC-5′与原始序列不相同。
在一个实施例中,激动剂由第一寡核苷酸构成,其中所述第一寡核苷酸的序列是回文序列。在另一个实施例中,激动剂由第一寡核苷酸构成,其中所述第一寡核苷酸包括回文序列。
本发明的优选寡核苷酸中的回文序列优选地包含寡核苷酸的5′末端和寡核苷酸的3′末端,从而形成平末端。在本发明的一个实施例中,寡核苷酸包括单个回文序列,并且在本发明的另一个更优选的实施例中,寡核苷酸包括被连接1个或2个不同的寡核苷酸内的2个回文的间插序列、间隔子或接头中断,从而形成具有平末端的发夹双链体的两个互补的回文。
肠胃外施用:如本文所用,“肠胃外施用”、“肠胃外施用的”和其它语法上等效的短语是指除了肠内施用和局部施用之外的、通常通过注射进行的施用模式,并且包含但不限于静脉内、鼻内、眼内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内以及胸骨内注射和输注。
患者:如本文所用,术语“患者”包含接受预防性或治疗性治疗的人类和其它哺乳动物受试者。
同一性百分比:如本文所用,在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,术语“同一性百分比”是指当针对最大对应性进行比较和比对时,如使用下述序列比较算法(例如BLASTP和BLASTN或技术人员可获得的其它算法)中的一种算法或通过视觉检查测量的,具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。根据应用,“同一性百分比”可以超过被比较的序列的区存在,例如,高于功能结构域,或可替代地,超过待比较的两个序列的全长存在。为了进行序列比较,通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入到计算机,指定子序列坐标(如有必要),并且指定序列算法程序参数。然后,序列比较算法基于所指定的程序参数,计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列所共有的相同位置的数量的函数(即,同源性%=相同位置的#/位置的总#×100),所述函数考虑了需要针对两个序列的最佳比对而引入的空位的数量和每个空位的长度。两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可以使用如以下非限制性实例中所描述的数学算法来完成。
用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行:例如,通过Smith和Waterman,《高等应用数学(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)的局部同源算法;通过Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443(1970)的同源对准算法;通过Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)》,85:2444(1988)的相似性搜索法;通过这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或通过视觉检查(通常参见Ausubel等人,下文)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法,所述BLAST算法描述于Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)网站公开获得。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》,4:11-17,1989)的已并入到ALIGN程序(版本2.0)的算法,使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分来确定。另外,两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入到GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》(48):444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵,16、14、12、10、8、6或4的空位权重,1、2、3、4、5或6的长度权重确定。
本公开的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索,以例如标识相关序列。此类搜索可以使用Altschul等人,(1990,《分子生物学杂志》215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来执行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(得分=100,字长=12)执行,以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序(得分=50,字长=3)执行,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目标的有空位的比对,可以利用如在Altschul等人,(1997)《核酸研究》25(17):3389-3402中所述的有空位的BLAST。当利用BLAST程序和有空位的BLAST程序时,可以使用相应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
药学上可接受的:如本文所用,术语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症,与合理的益处/风险比相称。
药学上可接受的载剂:如本文所使用的,术语“药学上可接受的载剂”是指并且包含生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物可以包含药学上可接受的盐,例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如,Berge等人(1977)《药物科学杂志(J Pharm Sci)》66:1-19)。
磷酸酯:如本文所使用的术语“磷酸酯”意指磷酸的盐或酯。多磷酸酯是由通过共享氧原子连接在一起的四面体PO4(磷酸酯)结构单元形成的聚合含氧阴离子的盐或酯。如本文所用,术语“二磷酸酯”是指包括两个磷酸酯结构单元的多磷酸酯。如本文所用,术语“三磷酸酯”是指包括三个磷酸酯结构单元的多磷酸酯。在一些实施例中,本公开提供了一种包括与5′端连接的二磷酸酯部分或其衍生物或类似物的RIG-I样受体激动剂。在一些实施例中,本公开提供了一种包括与5′端连接的三磷酸酯部分或其衍生物或类似物的RIG-I样受体激动剂。在一些实施例中,所述其衍生物或类似物是磷酸酯生物电子等排体。
磷酸酯生物电子等排体:如本文所用,术语“磷酸酯生物电子等排体”(可替代地“磷酸酯模拟物”)是指具有与磷酸酯类似的物理或化学性质,并且产生与包含二磷酸酯和三磷酸酯部分的磷酸酯大致类似的生物性质的化学取代基或基团。在药物设计中,将一个生物电子等排体与另一个生物电子等排体交换的目的是在不显著改变化学结构的情况下增强化合物的所期望的生物性质或物理性质。生物电子等排体广泛用于药物开发,并且用于例如,降低毒性、改变生物利用度或修饰亲本化合物或先导化合物的活性或代谢(参见例如,Rye和Baell(2005)《当代医学化学进展(Curr Med Chem)》12(26):3127-3141;Elliot等人,(2012)《医学化学通讯(MedChemCom)》3(7):735-751,所述文献通过引用以其整体并入本文。
多肽:如本文所用,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地使用,以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
防止:如本文所用,术语“预防”当关于病状使用时,是指相对于未接受组合物的受试者,施用降低受试者体内的医学病状的症状的频率或延迟其发作的组合物。
经过纯化的:如本文所用,术语“经过纯化的”或“分离的”当应用于本文所述的任何蛋白质(抗体或片段)时,是指已经从天然伴随其的组分(例如,蛋白质或其它天然存在的生物分子或有机分子)中分离或纯化的多肽,例如,其它蛋白质、脂质和表达蛋白质的原核生物中的核酸。通常,多肽在其构成样品中总蛋白质的至少60(例如,至少65、70、75、80、85、90、92、95、97或99)重量%时被纯化。
参考配体:如本文所用,术语“参考配体”(与“参考激动剂”可互换地使用)或“参考分子”是指RIG-I样受体配体,并且用于建立其自身与一种或多种不同的RIG-I样受体配体之间的关系,其中所述关系是参考配体与一种或多种不同的RIG-I样受体配体的相对激动效应。如本文所用,所述术语意指在测试或测定,如本文所述的那些测试或测定(例如,IFN诱导测定)中用作竞争物的RIG-I样受体配体或激动剂,其中所述测定可用于发现、标识或开发与RIG-I样受体结合的一种或多种不同的激动剂。
RIG-I:如本文所用,术语“RIG-I”是指视黄酸诱导型基因I多肽(RIG-I样受体家族的特定成员)并且由人体内的DDX58基因编码。RIG-I在本领域中的替代名称和首字母缩略词包含DEAD盒多肽58、RIGI、RLR-1、SGMRT2和DEXD/H盒解旋酶58。全长人RIG-I的示例性氨基酸序列在表4(SEQ ID NO:98)中和这里列示:
MTTEQRRSLQAFQDYIRKTLDPTYILSYMAPWFREEEVQYIQAEKNNKGPMEAATLFLKFLLELQEEGWFRGFLDALDHAGYSGLYEAIESWDFKKIEKLEEYRLLLKRLQPEFKTRIIPTDIISDLSECLINQECEEILQICSTKGMMAGAEKLVECLLRSDKENWPKTLKLALEKERNKFSELWIVEKGIKDVETEDLEDKMETSDIQIFYQEDPECQNLSENSCPPSEVSDTNLYSPFKPRNYQLELALPAMKGKNTIICAPTGCGKTFVSLLICEHHLKKFPQGQKGKVVFFANQIPVYEQQKSVFSKYFERHGYRVTGISGATAENVPVEQIVENNDIIILTPQILVNNLKKGTIPSLSIFTLMIFDECHNTSKQHPYNMIMFNYLDQKLGGSSGPLPQVIGLTASVGVGDAKNTDEALDYICKLCASLDASVIATVKHNLEELEQVVYKPQKFFRKVESRISDKFKYIIAQLMRDTESLAKRICKDLENLSQIQNREFGTQKYEQWIVTVQKACMVFQMPDKDEESRICKALFLYTSHLRKYNDALIISEHARMKDALDYLKDFFSNVRAAGFDEIEQDLTQRFEEKLQELESVSRDPSNENPKLEDLCFILQEEYHLNPETITILFVKTRALVDALKNWIEGNPKLSFLKPGILTGRGKTNQNTGMTLPAQKCILDAFKASGDHNILIATSVADEGIDIAQCNLVILYEYVGNVIKMIQTRGRGRARGSKCFLLTSNAGVIEKEQINMYKEKMMNDSILRLQTWDEAVFREKILHIQTHEKFIRDSQEKPKPVPDKENKKLLCRKCKALACYTADVRVIEECHYTVLGDAFKECFVSRPHPKPKQFSSFEKRAKIFCARQNCSHDWGIHVKYKTFEIPVIKIESFVVEDIATGVQTLYSKWKDFHFEKIPFDPAEMSK
(NCBI登录号:NP_055129.2)
RIG-I样受体:如本文所用,术语“RIG-I样受体”(缩写为“RLR”)是指充当通常在病毒RNA中发现的病原体相关分子模式(PAMP)的细胞质模式识别传感器的DExD/H盒RNA解旋酶家族的任何成员。在配体结合时,RLR向下游转录因子激活传导信号,以驱动1型干扰素(IFN)产生和抗病毒基因表达,其会引发细胞内免疫应答以控制病毒感染。已经标识了三个RLR成员:RIG-I(视黄酸诱导型基因I)、MDA5(黑色素瘤分化相关因子5)和LGP2(遗传学和生理学实验室蛋白2和小鼠D111gp2的同源物)(Loo和Gale(2011)《免疫学(Immunity)》34(5):680-692)。
RIG-I样受体激动剂:如本文所用,术语“RIG-I样受体激动剂”(与术语“RLR激动剂”可互换地使用)是指与RIG-I样受体(RLR)结合并且部分或完全促进、诱导、增加和/或激活由RLR信号传导或其它RLR介导的功能介导的生物活性、应答和/或一个或多个下游途径的核酸(例如,RNA)。本文提供了RIG-I受体激动剂的实例。
稳定的RNA二级结构:如本文所用,术语“稳定的RNA二级结构”是指由RNA分子或其局部片段或部分采用的,在生理条件下持续维持并且表征为低自由能状态的结构、折叠或构象。稳定的RNA二级结构的典型实例包含双链体、发夹和茎环。本领域中已知的是,稳定的RNA二级结构表现出各种生物活性。如关于多核苷酸双链体使用的术语“稳定”意指双链体在生理条件下或在核酸诊断性或治疗性应用中使用的典型盐和温度条件下,基本上排他地以双链体的形式保持杂交、结构化或退火。
受试者:如本文所用,术语“受试者”包含任何人或非人动物。例如,本发明的方法和组合物可以用于治疗患有免疫病症的受试者。术语“非人动物”包含所有脊椎动物,例如,哺乳动物和非哺乳动物,如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
T细胞:术语“T细胞”是指一种类型的白血细胞,其可以通过细胞表面存在T细胞受体与其它白血细胞区分开来。存在T细胞的若干个亚群,包含但不限于T辅助细胞(也被称为TH细胞或CD4+ T细胞)和亚型(包含TH1、TH2、TH3、TH17、TH9和TFH细胞)、细胞毒性T细胞(也被称为TC细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T-杀伤细胞、杀伤T细胞)、记忆性T细胞和亚型(包含中枢记忆性T细胞(TCM细胞)、效应子记忆性T细胞(TEM和TEMRA细胞)和驻留记忆性T细胞(TRM细胞))、调节性T细胞(也被称为Treg细胞或抑制性T细胞)和亚型(包含CD4+FOXP3+ Treg细胞、CD4+FOXP3-Treg细胞、Tr1细胞、Th3细胞和Treg17细胞)、自然杀伤T细胞(也被称为NKT细胞)、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞(γδT细胞)(包含Vγ9/Vδ2T细胞)。前述或未提及的T细胞中的任何一种或多种可以是针对本发明的使用方法的靶细胞类型。
T细胞活化:如本文所用,术语“T细胞活化”或“T细胞的活化”是指其中在其表面上表达抗原特异性T细胞受体的成熟T细胞识别其同源抗原并且通过进入细胞周期、分泌细胞因子或裂解酶以及启动或变得有能力执行基于细胞的效应子功能来进行应答的细胞过程。T细胞活化需要至少两个信号才能变得完全活化。第一信号在T细胞抗原特异性受体(TCR)接合之后通过抗原主要组织相容性复合体(MHC)发生,并且第二信号通过共刺激分子(例如,CD28)的随后接合发生。这些信号被传输到细胞核,并且导致T细胞的克隆扩增、细胞表面上的活化标记物上调、分化到效应子细胞、诱导细胞毒性或细胞因子分泌、诱导凋亡或其组合。
T细胞介导的应答:如本文所用,术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞介导的任何应答,包含但不限于效应子T细胞(例如,CD8+细胞)和辅助T细胞(例如,CD4+细胞)。T细胞介导的应答包含例如T细胞细胞毒性和增殖。
四元环:如本文所用,术语“四元环”是指在发夹或茎环RNA二级结构中发现的在一个末端处覆盖双链体从而连接包括双链体的两条链并且为发夹结构提供稳定性的一种类型的四碱基环基序。
治疗剂:如本文所使用的,术语“治疗剂”是指在施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发期望的生物作用和/或药理作用的任何药剂。
治疗有效量:如本文所用,术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或本文所用的类似术语旨在意指将引发期望的生物反应或医学反应,例如,治愈或至少部分抑制已经患有疾病的患者体内的病状或疾病以及其并发症(例如,癌症的一种或多种症状的改善)的药剂(例如,合成RIG-I样受体激动剂)的量。对于此用途有效的量将取决于所治疗的病症的严重程度和患者的自身免疫系统的一般状态。
治疗:如本文所用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指本文中所描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法采用向需要此类治疗的受试者,例如,需要针对特定抗原的增强的免疫应答的受试者或最终可能获得此病症的受试者施用本公开的人抗体,以预防、治愈、延迟、降低病症或复发性病症的一种或多种症状的严重程度或改善一种或多种症状,或将受试者的存活期延长到超出在不存在此类治疗的情况下所预期的存活期。
肿瘤微环境:如本文所用,术语“肿瘤微环境”(可替代地“癌症微环境”;缩写为TME)是指细胞环境或其中存在肿瘤或赘生物的环境,包含周围血管以及非癌细胞,包含但不限于免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎症细胞和淋巴细胞。信号传导分子和细胞外基质还包括TME。肿瘤和周围微环境是密切相关的并不断相互作用。肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成以及诱导外周免疫耐性来影响微环境,而微环境中的免疫细胞可以影响肿瘤细胞的生长和进化。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开所述的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。下文中描述了优选方法和材料,但是也可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料来实践或测试目前所公开的方法和组合物。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入本文。
等同物和范围
仅使用常规实验,本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等效物。本公开的范围不旨在限于以上描述,而是如所附权利要求中所阐述的。
在权利要求中,冠词如“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”可以意指一个或多个,除非指明与上下文相反或另外地根据上下文是显而易见的。如果基团成员中的一个、多于一个或全部存在于、使用于或以其它方式相关于给出的产品或流程,则在所述基团的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求书或说明书被认为是满意的,除非指明与上下文相反或另外地根据上下文是显而易见的。本公开包含其中所述基团中的恰好一个成员存在于、使用于或以其它方式相关于给出的产品或流程的实施例。本公开包含其中所述基团成员中的多于一个或所有存在于、使用于或以其它方式相关于给出的产品或流程的实施例。此外,应理解,本公开涵盖其中将来自所列示的权利要求中的一个或多个的一个或多个限制、元素、条款或描述性术语等引入到另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如,可以对附属于另一权利要求的任何权利要求加以修改,以使其包含在附属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或多个限制。此外,在权利要求叙述组合物的情况下,应当理解,除非另外指示或者除非对于本领域的普通技术人员来说明显将出现矛盾或不一致,否则包含将组合物用于本文公开的任何目的的方法,并且包含根据本文公开的任何制备方法或本领域已知的其它方法制备组合物的方法。
在元素是以例如马库什基团(Markush group)格式等列表形式呈现的情况下,应理解,也公开了所述元素的每个亚基团,并且可以从所述基团中去除任何一种或多种元素。应当理解,通常,在本发明或本发明的方面被称为包括特定元素、特征等的情况下,本发明或本发明的某些方面的某些实施例由此类元素、特征等组成或基本上由此类元素、特征等组成。为了简单起见,这些实施例没有在本文中具体阐述。
还应注意,术语“包括”旨在开放式的,并且允许但不需要包含另外的元素或步骤。因此,当在本文中使用术语“包括”时,还涵盖并且公开了术语“由......组成”。
在给出范围时,端点被包含在内。此外,应当理解的是,除非另有指明或以其它方式根据上下文以及本领域的普通技术人员的理解而变得显而易见,否则被表达为范围的值可以假定在本发明的不同实施例中所说明的范围内的任何特定值或子范围为该范围的下限单位的十分之一(除非另外地在上下文中清楚地指出)。
另外,应当理解的是,落入现有技术内的本发明的任何特定实施例都可以明确地从权利要求中的任何一个或多个中排除。因为此类实施例被视为对于本领域的普通技术人员是已知的,所以即使没有在此明确地提出这种排除,其也可以被排除。本发明的组合物的任何特定实施例(例如,由此编码的任何核酸或蛋白质;任何生产方法;任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一个或多个权利要求中排除,无论是否与现有技术的存在有关。
所有引用的来源,例如,参考文献、出版物、数据库、数据库条目和在本文中引用的技术均通过引用并入本申请中,即使在引文中没有明确说明。在引用的来源和本申请的说明冲突的情况下,应以本申请中的说明为准。
RIG-I样受体和其配体
本公开提供了与RIG-I样受体(RLR)特异性结合并且使RLR(RLR激动剂)激动的合成RNA配体。在一些方面,本公开提供了可用于治疗癌症的RLR激动剂。在一些方面,本公开提供了可用于治疗感染性疾病的RLR激动剂。在一些实施例中,RLR激动剂诱导细胞因子产生。在一些实施例中,RLR激动剂增加肿瘤微环境中CD8+ T细胞的数量。在一些实施例中,RLR激动剂诱导保护性抗肿瘤免疫。
RIG-I样受体(RLR)包括充当胞质模式识别受体(PRR)的DExD/H盒RNA解旋酶的家族,所述胞质模式识别受体通过识别病原体相关分子模式(PAMP)来感应病原体剂的存在。特别地,非自身(例如,病毒)RNA的细胞内存在由感染的细胞通过RNA与RLR的结合来感应,并且会引起抗病毒免疫的启动和调节。类似于大多数病毒RNA,内源性mRNA和RNA聚合酶III转录物也是5′-三磷酸酯化的,但是真核mRNA具有与在N7处甲基化的鸟苷连接的防止RIG-I激活的5′端帽结构。病毒RNA与自身RNA之间的这些结构差异与细胞内定位中的差异一起被视为能够通过优先检测病毒RNA来实现RIG-I抵御病毒感染的有效功能。非自身RNA配体与RLR的分子识别和结合会传播特定的细胞内信号事件,最终激活驱动1型干扰素(IFN)产生和抗病毒基因表达的转录因子。IFN和炎性细胞因子产生以及抗病毒基因表达的RLR介导的诱导引发用于控制病毒感染的免疫应答(Yoneyama等人,(2015)《当前免疫学观点(CurrOpin Immunol)》32:48-53)。
已经标识了三个RLR家庭成员:RIG-I(视黄酸诱导型基因I)-RLR家族的创始成员和最佳特性、MDA5(黑色素瘤分化相关因子5)和LGP2(遗传学和生理学实验室蛋白2和小鼠D111gp2的同源物)。RIG-I是先天免疫系统的重要组分,并且在防御RNA病毒引起的感染方面起着关键作用。与检测免疫细胞亚群的核内体中的核酸的Toll样受体TLR3、TLR7、TLR8和TLR9相反,RIG-I是在所有细胞类型中表达的胞质先天免疫受体(Kato等人,(2006)《自然(Nature)》441(7089):101-105;Loo等人,(2008)《病毒学杂志(J Virol)》82(1):335-345)。两项早期研究独立地确立RIG-I特异性检测病毒RNA并被病毒RNA激活(Hornung等人,(2006)《科学(Science)》314(5801):994-997;Pichlmair等人,(2006)《科学》314(5801):997-1001)。
RIG-I/配体复合物的高分辨率结构提供了RIG-I与RNA配体结合的分子细节,特别是与活化配体、双链5′-三磷酸酯化的RNA(ppp-dsRNA)结合的分子细节(Civril等人,(2011)《欧洲分子生物学组织报告(EMBO Reports)》12(11):1127-1134;Jiang等人,(2011)《自然》479(7373):423-427;Kowalinski等人,(2011)《细胞(Cell)》147(2):423-435;Lu等人,(2010)《结构(Structure)》18(8):1032-1043;Luo等人,(2011)《细胞》147(2)409-422;Wang等人,(2010)《自然结构&分子生物学(Nature Structural&Molecular Biology)》17(7):781-787;Hornung等人,(2006)《科学》314(5801):994-997;Pichlmair等人,(2006)《科学》314(5801):997-1001;Schlee等人,(2009)《免疫学》31(1):25-34)。)。RIG-I/RNA复合物的晶体结构示出了蛋白质与主链而不是与碱基的结合,这表明RNA序列可能不影响RIG-I结合,或RNA序列可能展现为具有尚未表征的作用果或活性。迄今为止,与RIG-I样受体的序列依赖性差异相互作用或亲和力以及激活的证据未在本领域中进行描述(Schlee和Hartmann(2010)《分子疗法(Molecular Therapy)》18(7):1254-1262)。
因此,本公开提供了包括非天然存在的、合成的和/或工程化的RLR RNA配体的RIG-I样受体(RLR)激动剂。在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,并且其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序选自由以下组成的组:
(i)GT重复基序;
(ii)GA重复基序;
(iii)AUCG重复基序;
(iv)AU重复基序;
(v)二嘧啶基序;
(vi)二嘌呤基序;
(vii)嘧啶三联体基序;
(viii)嘌呤三联体基序;
(ix)回文序列基序;以及
(x)(i)到(ix)中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括至少一种提高的生物活性,其中所述提高的生物活性选自:
(i)RLR介导的细胞因子产生的增加;
(ii)干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;
(iii)RLR介导的细胞内信号传导的增加;
(iv)与RLR的结合亲和力的增加;以及
(v)(i)到(iv)中任一项的组合。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为GT重复基序,所述GT重复基序包括<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、约5到10个、约5个、约4个、约18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述GT重复基序为[GT]n,其中n=2到9。在一些实施例中,所述GT重复基序为[GT]7。在一些实施例中,所述GT重复基序为[GT]3,并且其中所述GT重复基序之后分别是嘌呤三联体和UCG。在一些实施例中,所述嘌呤三联体为GGA。
在一些实施例中,所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括<19个、约15个到18个、约15个、约10个到15个、约10个、约5个到10个、约5个、约4个、约18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。在一些实施例中,所述GA重复基序为[GA]n,其中n=2到9。在一些实施例中,所述GA重复基序为[GA]7。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括序列基序,其中所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括<19个、约16个、约12个到约16个、约12个、约8个到12个、约6个、约16个、12个、8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]n,其中n=2到4。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3。
在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是CG或二嘧啶基序。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是CG。在一些实施例中,所述二嘧啶基序为CC。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序。在一些实施例中,所述二嘌呤基序为GA。在一些实施例中,所述二嘌呤基序为GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代。在一些实施例中,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUCG重复基序的所述一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUCG重复基序的所述一个或多个尿苷核苷(U)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T),并且其中所述AUGC重复基序之前是GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中一个或多个鸟苷核苷(G)被经过修饰的核苷取代。在一些实施例中,所述经过修饰的核苷为肌苷(I)。在一些实施例中,所述AUGC重复基序为[AUCG]3,其中包括所述AUCG重复基序的所述一个或多个鸟苷核苷(G)被经过修饰的核苷取代,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T),并且其中所述AUGC重复基序之前是GG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括AUCG重复基序,其中所述基序之前是IG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序为[AUCG]3并且之前是IG。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括AUCG重复序列,其中一个或多个鸟苷核苷(G)被肌苷(I)取代,其中所述AUCG重复序列之前是肌苷(I)。在一些实施例中,包括所述AUCG重复的所述鸟苷核苷(G)被肌苷(I)取代,其中所述AUCG重复之前是肌苷(I),其中所述第一多核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括肌苷(I)。
在一些实施例中,所述第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括肌苷(I)。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括AUCG重复序列基序,其中AUCG重复基序为[AUCG]2。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序。在一些实施例中,所述二嘌呤基序为GG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是嘌呤三联体。在一些实施例中,嘌呤三联体为GGG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是CCCCCG。在一些实施例中,所述AUCG重复基序之前是TCGUCG。
在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括回文序列,其中所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、约18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
在一些实施例中,所述接头的侧翼是AU。在一些实施例中,所述接头的侧翼是AU重复基序,其中所述AU重复基序为[AU]n,其中n=2到3。在一些实施例中,所述AU重复基序为[AU]2。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,并且其中所述激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头。
在其它方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,并且其中所述激动剂包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头。
在一些实施例中,肌苷(如果存在于所述RLR激动剂中)与胞苷碱基配对。
在一些实施例中,所述接头(L)为核苷酸接头或非核苷酸接头。
在一些方面,本公开提供了一种RLR激动剂,其与RLR特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括核苷酸接头或非核苷酸接头。RNA发夹是最常见的RNA二级结构元素中的一种,其中发夹的杂交的部分或“茎”经常被RNA四元环覆盖。RNA四元环由形成紧凑且稳定的结构的特征性四元环核苷酸构成。虽然其可以由许多不同的核苷酸序列形成,但是UNCG(N=A、C、G或U)、GNRA(R=A或G)和CUUG四元环是最常见的。四元环通常帮助启动RNA折叠过程,并且提供用于RNA内或之间的三级接触以及用于蛋白质结合的位点,从而促进核糖核蛋白颗粒的组装。对四元环的另外的描述可以在以下中找到:Cheong,H.、Kim,N.和Cheong,C.(2015)《RNA结构:四元环(RNA Structure:Tetraloops.)》《生命科学百科全书(eLS)》约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Ltd)(编),其通过引用以其整体并入本文。
因此,在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括核苷酸接头,所述核甘酸接头包括四元环。在一些实施例中,所述四元环的核苷酸序列选自由以下组成的组:
(a)UNCG,其中N=A、C、G或U;
(b)GNRA,其中N=A、C、G或U,并且其中R=A或G;
(c)ANYA,其中N=A、C、G或U,并且其中Y=C或T;
(d)CUYG,其中Y=C或T;
(e)UMAC,其中M=A或C;以及
(f)CUUG。
在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU或UGUUU。在一些实施例中,所述四元环的序列为UUCG。在一些实施例中,所述四元环的序列为GAUC。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UGUUU。
在其它方面,本公开的RLR激动剂包括非核苷酸接头。如本文所述,核酸环(例如,四元环)是在核酸二级结构中发现的常见元素。核苷酸环出现在存在于链内双链体中的折叠的结构域中。设计成含有包括非核苷酸连接基团(例如,非核苷酸接头)的发夹环的合成核酸可以替代桥接折叠的双链体结构的若干个核苷酸。非核苷酸基团也已经被用作非折叠的结构中的接头。此类连接基团可以是天然核苷酸接头(例如,四元环)的有用替代物。例如,其可以通过若干个步骤缩短具有期望的二级结构的核酸的合成,因为一个相对长的非核苷酸连接基团替代了通常可以构成环的若干个单个核苷酸。此类非天然环或接头(例如,非核苷酸接头)可以赋予对核酸酶引起的降解的抗性,所述核酸酶通常在生物学上下文中(例如,在施用时在细胞中或受试者的循环中)作用于天然环结构。相比核苷酸环和/或接头,非核苷酸连接基团还有可能提供更稳定的折叠结构。对非核苷酸接头的另外描述可以在Rumney和Kool(1995)《美国化学会志(J Am Chem Soc.)》117:5635-5646中找到,所述文献通过引用以其整体并入本文。
因此,在一些实施例中,本公开的所述RLR激动剂包括选自由以下组成的组的非核苷酸接头:
(a)乙二醇接头;以及
(b)烷基接头。
在一些实施例中,所述非核苷酸接头为六乙二醇接头。在一些实施例中,所述非核苷酸接头为C9烷基接头。
在一些实施例中,所述RLR激动剂包括5′二磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述激动剂包括5′三磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述其衍生物或类似物包括选自以下的磷酸酯生物电子等排体:膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并硼唑、硼代磷酸酯、方酰胺。
在一些实施例中,所述激动剂包括经过修饰的核苷酸、经过修饰的核苷或经过修饰的核碱基或其组合。在一些实施例中,所述激动剂包括对核苷酸间键或对多核苷酸主链的修饰。
在一些方面,本公开的RLR激动剂表现出以下性质中的至少一种或多种性质:
(a)与一种或多种RLR(例如,RIG-1、MDA5和/或LGP2)特异性结合;
(b)增加RLR介导的细胞因子产生;
(c)增加干扰素刺激的基因(ISG)的RLR介导的表达;
(d)增加RLR依赖性细胞内信号传导;
(e)增加所述双链体的稳定性;
(f)增加对RLR的结合亲和力;
(g)减少脱靶结合;
(h)增加生物半衰期;
(i)增加生物分布和生物利用度;
(j)增加和/或增强进入细胞和/或组织的摄取;
(k)降低免疫原性;以及
(l)(a)到(k)中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,和/或X1和/或X2中的至少一个包括至少一个肌苷核苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。
在一些实施例中,N1包括肌苷,并且N4包括胞苷。在一些实施例中,N1包括胞苷,并且N4包括肌苷。在一些实施例中,N2包括肌苷,并且N3包括胞苷。在一些实施例中,N2包括胞苷,并且N3包括肌苷。在一些实施例中,N1包括鸟苷。在一些实施例中,N2包括鸟苷。在一些实施例中,N1包括胞苷。在一些实施例中,N2包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷。在一些实施例中,N1包括肌苷,并且N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N2包括肌苷,并且N3包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,N3和N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为12个核苷酸并且包括1个、2个、3个或4个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为13个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个或5个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为14个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个或6个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为15个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为16个核苷酸并且各自包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个肌苷核苷。在一些实施例中,X1和X2各自为12个核苷酸并且包括至少10%、20%、30%或40%肌苷核苷。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1包括序列基序[AUCN5]x,其中N5为包括鸟苷或肌苷,其中x为值指示序列基序的数量的整数,并且其中x=3或4;
(viii)X2包括序列基序[CN6AU]y,其中N6包括鸟苷或肌苷,其中y为值指示序列基序的数量的整数,并且其中y=3或4;
(ix)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
任选地其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。在一些实施例中,N5包括肌苷,并且N6包括肌苷。在一些实施例中,N5包括鸟苷,并且N6包括肌苷。在一些实施例中,N5包括肌苷,并且N6包括鸟苷。在一些实施例中,N5包括鸟苷(G),并且N6包括鸟苷(G)。在一些实施例中,x=3,并且y=3。在一些实施例中,x=4,并且y=4。在一些实施例中,N1包括肌苷(I),并且N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N2包括肌苷(I),并且N3包括胞苷(C)。在一些实施例中,N3包括肌苷(I),并且N2包括胞苷(C)。在一些实施例中,N4包括肌苷(I),并且N1包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N2包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N1包括胞苷(C)。在一些实施例中,N2包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括鸟苷(G),并且N3和N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括鸟苷(G)。在一些实施例中,N1和N2包括肌苷(I),并且N3和N4包括胞苷(C)。在一些实施例中,N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括肌苷(I)。
在一些实施例中,所述接头(L)为核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施例中,所述接头(L)包括四元环的核苷酸接头,其中所述四元环的核苷酸序列选自由以下组成的组:
(a)UNCG,其中N=A、C、G或U;
(b)GNRA,其中N=A、C、G或U,并且其中R=A或G;
(c)ANYA,其中N=A、C、G或U,并且其中Y=C或T;
(d)CUYG,其中Y=C或T;
(e)UMAC,其中M=A或C;以及
(f)CUUG。
在一些实施例中,所述接头(L)为包括核苷酸序列UUUGAU或UGUUU的核苷酸接头。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU。在一些实施例中,所述核苷酸接头包括核苷酸序列UGUUU。
在一些实施例中,所述接头(L)为包括四元环的核苷酸接头,其中所述四元环的序列为UUCG。在一些实施例中,所述四元环的序列为GAUC。
在一些实施例中,所述接头(L)为选自由以下组成的组的非核苷酸接头:
(a)乙二醇接头;以及
(b)烷基接头。
在一些实施例中,所述非核苷酸接头为六乙二醇接头。在一些实施例中,所述非核苷酸接头为C9烷基接头。
在一些实施例中,所述RLR激动剂包括5′二磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述激动剂包括5′三磷酸酯部分或其衍生物或类似物。在一些实施例中,所述其衍生物或类似物包括选自以下的磷酸酯生物电子等排体:膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并硼唑、硼代磷酸酯、方酰胺。
在一些实施例中,所述RLR激动剂包括经过修饰的核苷酸、经过修饰的核苷或经过修饰的核碱基或其组合。在一些实施例中,所述激动剂包括对核苷酸间键或对多核苷酸主链的修饰。
在一些方面,所述RLR激动剂表现出以下性质中的至少一种或多种性质:
(a)与一种或多种RLR(例如,RIG-1、MDA5和/或LGP2)特异性结合;
(b)增加RLR介导的细胞因子产生;
(c)增加干扰素刺激的基因(ISG)的RLR介导的表达;
(d)增加RLR依赖性细胞内信号传导;
(e)增加所述双链体的稳定性;
(f)增加对RLR的结合亲和力;
(g)减少脱靶结合;
(h)增加生物半衰期;
(i)增加生物分布和生物利用度;
(j)增加和/或增强进入细胞和/或组织的摄取;
(k)降低免疫原性;以及
(l)(a)到(k)中任一项的组合。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,并且其中所述激动剂包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5′的核苷酸包括5′二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括某一序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,并且其中所述激动剂包括选自由SEQ ID NO:22、23和25组成的组的核苷酸序列。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,其中所述激动剂包括式5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:58和89;
(ii)分别为SEQ ID NO:59和89;以及
(iii)分别为SEQ ID NO:61和91。
在一些方面,本公开提供了一种合成RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,其中所述激动剂包括式5′-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3′,其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
在一些方面,本公开提供了RLR激动剂,其中构成所述激动剂的核苷酸序列不与基因组DNA序列或mRNA序列互补,其中所述RLR激动剂不参与RNA干扰,并且其中所述RLR激动剂不使基因表达沉默。
包括经过修饰的核碱基、核苷或核苷酸的RLR激动剂
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包括一种或多种经过修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施例中,与参考的未经修饰的RLR激动剂相比,经过修饰的RLR激动剂可以具有有用的性质,包含增强的稳定性、细胞内保留、增强的靶结合和/或引入RLR激动剂的细胞的先天免疫应答的诱导的增加。因此,经过修饰的RLR激动剂的用途可以增强靶结合的效率、核酸的细胞内保留以及具有降低的免疫原性。在一个实施例中,本公开所提供的激动剂由一种或多种寡核苷酸构成,所述一种或多种寡核苷酸包括被修饰成增加靶结合亲和力的至少一个区。寡核苷酸对其靶多肽(例如RLR受体)的亲和力可以通过例如测量在荧光标记的寡核苷酸与其靶结合时荧光偏振(FP)的程度来确定(Moerke(2009)《化学生物学当前协议(Curr Protoc Chem Biol)》1(1):1-15)。
在另一个实施例中,本公开所提供的RLR激动剂由至少一种寡核苷酸构成,所述至少一种寡核苷酸包括至少一个区,所述至少一个区包括增加双链体的稳定性的至少一种经过修饰的核碱基、核苷或核苷酸。双链体的稳定性常规可以通过测量双链体的Tm来确定,所述Tm是包括双链体的两条寡核苷酸链解离时的温度;解离以分光光度法检测。Tm越高,双链体的稳定性越大。
在一个实施例中,被修饰成增加双链体稳定性的寡核苷酸的区包括在糖的2′位置处修饰的至少一个核苷酸,最优选地为经过2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在另一个实施例中,包括RLR激动剂的寡核苷酸也被修饰成增强核酸酶抗性。细胞含有可以使核酸降解的多种外核酸酶和内核酸酶。许多核苷酸和核苷修饰已经被示出为使其所并入的寡核苷酸相比于未经修饰的寡核苷酸对核酸酶消化更具抗性。核酸酶抗性常规通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起温育,并且通常通过凝胶电泳测量随时间的推移完整寡核苷酸保留的程度来测量。相比于未经修饰的寡核苷酸,被修饰成增强其核酸酶抗性的寡核苷酸完整存活更长的时间。多种寡核苷酸修饰已经被证明可增强或赋予核酸酶抗性。含有至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸目前是更优选的。在一些情况下,增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能够独立地增强核酸酶抗性(De Mesmaeker等人,1995,《化学研究述评(Acc.Chem.Res.)》28:366-374)。
本发明设想的一些优选寡核苷酸的具体实例包含含有经过修饰的主链的寡核苷酸,例如,硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸(包含以立体特异性方式合成的寡核苷酸)和具有杂原子主链的寡核苷酸,特别是CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2[被称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI主链]、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链,其中天然磷酸二酯主链表示为O-P-O-CH2)。由De Mesmaeker等人(1995,《化学研究述评》28:366-374)公开的酰胺主链也是优选的。寡核苷酸还可以含有一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸包括位于2′位置处的以下之一:OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3,其中n为1到约10;C1到C10低级烷基、烷氧基烷氧基(在本领域中也被称为O-烷基-O-烷基)、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基;Cl;Br;CN;CF3;OCF3;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;杂环烷基;杂环烷芳基;氨烷基氨基;聚烷基氨基;取代的甲硅烷基;RNA切割基团;报告基团;插层剂;用于改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团;或者用于改进寡核苷酸的药效性质的基团以及具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包含2′-甲氧基乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3,也被称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE](Martin(马丁等人,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》,1995,78,486)。其它优选的修饰包含2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)以及2′-氟(2′-F)。类似修饰还可以在寡核苷酸上的其它位置处进行,特别是糖的3′末端核苷酸上的3′位置处以及5′末端核苷酸的5′位置处。寡核苷酸还可以具有糖模拟物,如替代戊呋喃糖基的环丁基。
另外或可替代地,寡核苷酸还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用,“未经修饰的”或“天然”核碱基包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核碱基包含仅很少或瞬时发现于天然核酸中的核碱基,例如,次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-me嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶(也被称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中通常被称为5-me-C))、5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC以及合成核碱基,例如,2-氨基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基脲嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,《DNA复制(DNA Replication)》,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),旧金山(San Francisco),1980,第75到77页;Gebeyehu,G.等人,1987,《核酸研究》15:4513)。还可以包含本领域中已知的“通用”碱基,例如,肌苷。5-me-C取代已经被示出将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,《反义研究和应用(Antisense Research and Applications)》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),1993,第276到278页),并且是目前优选的碱基取代。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的一种或多种部分或缀合物化学连接到所述寡核苷酸。此类部分包含但不限于脂质部分,如胆固醇部分、胆固醇基部分(Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》1989,86,6553)、胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Let.)》,1994,4,1053)、硫醚,例如,己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660,306;Manoharan等人,《生物有机与医药化学快报》,1993,3,2765)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20,533)、脂肪链,例如,十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)》,1991,10,111;Kabanov等人,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》,1990,259,327;Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》,1993,75,49)、磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14,969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36,3651)。包括脂质部分的寡核苷酸以及用于制备此类寡核苷酸的方法在本领域是已知的,例如美国专利第5,138,045号、第5,218,105号和第5,459,255号。
本发明的寡核苷酸可以以前药形式提供,其包括通常在体内被切割以得到活性寡核苷酸的一个或多个部分。前药方法的一个实例由Imbach等人在WO公开94/26764中进行了描述。
对于给定寡核苷酸中的所有位置而言,不需要进行统一修饰,并且事实上可以将上述修饰中的多于一种修饰并入单个寡核苷酸中或甚至寡核苷酸内的单个核苷内。
根据本发明的寡核苷酸在长度上优选地为约8个到约50个核苷酸。在本发明的上下文中,应当理解的是,这涵盖了如上文所述的具有8个到50个单体的非天然存在的寡聚物。
根据本发明使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便地且常规地制备。用于此合成的设备由包含应用生物系统公司(Applied Biosystems)的若干个供应商销售。也可以采用用于此合成的任何其它装置;寡核苷酸的实际合成完全处于本领域的普通技术人员的知识和能力范围内。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是众所周知的。还众所周知的是,使用类似技术和可商购获得的经过修饰的亚酰胺和可控孔度玻璃(CPG)产品,如经过生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的亚酰胺和/或CPG(可从弗吉尼亚州斯特林市的格伦研究公司(Glen Research,Sterling Va.)获得)来合成荧光标记的、生物素化的或其它经过修饰的寡核苷酸,如经过胆固醇修饰的寡核苷酸。
在一些实施例中,RLR激动剂包含一种或多种(例如,1种、2种、3种或4种)不同的经过修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施例中,RLR激动剂包含一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种或更多种)不同的经过修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施例中,相对于对应的未经修饰的RLR激动剂,经过修饰的RLR激动剂在引入RLR激动剂的细胞中具有降低的降解。
在一些实施例中,经过修饰的核碱基为经过修饰的尿嘧啶。具有经过修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包含假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如,5-碘代-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺甲基-假尿苷、5-牛磺甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U,即,具有核碱基脱氧胸苷)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-ara-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施例中,经过修饰的核碱基为经过修饰的胞嘧啶。具有经过修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包含5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如,5-碘代-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖氨酸(k2C)、α-硫代-胞苷、2′-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2′-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2′-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2′-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2′-F-阿糖-胞苷、2′-F-胞苷以及2′-OH-阿糖-胞苷。
在一些实施例中,经过修饰的核碱基为经过修饰的腺嘌呤。具有经过修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包含α-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如,2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如,6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2′-F-阿糖-腺苷、2′-F-腺苷、2′-OH-阿糖-腺苷以及N6-(19-氨基-五氧杂十九基)-腺苷。
在一些实施例中,经过修饰的核碱基为经过修饰的鸟嘌呤。具有经过修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包含α-硫代-鸟苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧基怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧基辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2′-O-甲基鸟苷(m2, 7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1,2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2′-F-阿糖-鸟苷以及2′-F-鸟苷。
在一些实施例中,本公开的RLR激动剂包含前述经过修饰的核碱基中的一种或多种的组合(例如,前述经过修饰的核碱基中的2种、3种或4种的组合)。
在某些实施例中,本公开的RLR激动剂被统一修饰(即,完全修饰,贯穿整个序列修饰)成用于特定修饰。例如,RLR激动剂可以用5-甲基-胞苷(m5C)统一修饰,这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都用5-甲基-胞苷(m5C)替代。类似地,本公开的RLR激动剂可以通过用如以上所示的那些经过修饰的残基进行替代而被修饰成用于存在于序列中的任何类型的核苷残基。
可以存在于本公开的RLR激动剂中的核苷修饰和其组合的实例包含但不限于在PCT专利申请公开:WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253和WO2014159813中描述的那些。
本公开的RLR激动剂可以包含对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可以包含本文中所描述的任何一个或多个修饰。
经过修饰的核苷和经过修饰的核苷组合的实例在以下表1和表2中提供。经过修饰核苷酸的这些组合可以用于形成本公开的RLR激动剂。在某些实施例中,经过修饰的核苷可以部分或完全取代本公开的RLR激动剂的天然核苷酸。作为非限制性实例,天然核苷酸尿苷可以被本文所述的经过修饰的核苷取代。在另一个非限制性实例中,天然核苷尿苷可以用本文公开的经过修饰的核苷中的至少一种部分地取代(例如,天然尿苷的约0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99.9%)。
表1.核苷修饰的组合
表2.经过修饰的核苷和其组合
根据本公开,本公开的多核苷酸可以被合成为包括表1或表2的组合修饰或单个修饰。
在列示了单个修饰的情况下,所列示的核苷或核苷酸表示已经被修饰的A、U、G或C核苷酸或核苷的100%。在列示了百分比的情况下,这些百分比表示A、U、G或C三磷酸酯的总量中的特定A、U、G或C核碱基三磷酸酯所存在的百分比。例如,组合:25%5-氨基烯丙基-CTP+75%CTP/25%5-甲氧基-UTP+75%UTP是指以下多核苷酸:其中25%的胞嘧啶三磷酸酯是5-氨基烯丙基-CTP而75%的胞嘧啶是CTP;然而25%的尿嘧啶是5-甲氧基UTP而75%的尿嘧啶是UTP。在未列示出经过修饰的UTP的情况下,则在多核苷酸中发现的那些核苷酸的100%位点处使用天然存在的ATP、UTP、GTP和/或CTP。在此实例中,所有GTP和ATP核苷酸均保持未经修饰。
制备RLR激动剂的方法
本公开的RLR激动剂可以通过本领域可用的方式生产,所述方法包含但不限于体外转录(IVT)和合成方法。可以利用酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区合成和连接方法。在一个实施例中,RLR激动剂使用IVT酶促合成方法制备。通过IVT制备多核苷酸的方法在本领域是已知的,并且在国际申请PCT/US2013/30062中进行了描述,其内容通过引用以其整体并入本文。因此,本公开还包含可以用于体外转录本文所述的RLR激动剂的多核苷酸,例如,DNA、构建体和载体。
在合成期间或合成后,可以将非天然的经过修饰的核碱基引入到多核苷酸中,例如RNA。在某些实施例中,修饰可以在核苷间键、嘌呤碱基或嘧啶碱基或糖上。在特定实施例中,修饰可以在多核苷酸链的末端处或多核苷酸链中的任何其它地方;用化学合成或用聚合酶酶引入。经过修饰的核酸和其合成的实例在PCT申请第PCT/US2012/058519号中进行了公开。经过修饰的多核苷酸的合成也在Verma和Eckstein《生物化学年度评论(AnnualReview of Biochemistry)》第76卷,99-134(1998)中进行了描述。
可以使用酶促方法或化学连接方法将多核苷酸或其区与如靶向剂或递送剂、荧光标记、液体、纳米颗粒等不同的功能部分缀合。多核苷酸和经过修饰的多核苷酸的缀合物在Goodchild,《生物缀合化学(Bioconjugate Chemistry)》,第1(3)卷,165-187(1990)中进行了综述。寡核苷酸、多核苷酸以及其缀合物和连接的合成在以下中进行了进一步描述:Taskova等人,(2017)《化学生物化学(Chembiochem)》18(17):1671-1682;Gooding等人,(2016)《欧洲制药学与生物制药学杂志(Eur J Pharm Biopharm)》107:321-40;Menzi等人,(2015)未来药物化学《Future Med Chem》7(13):1733-49;Winkler J.,(2013)《治疗性递送(Ther Deliv.)》(7):791-809;Singh等人,(2010)《化学学会评论(Chem Soc Rev)》39(6):2054-70;以及Lu等人,(2010)《生物共轭化学(Bioconjug Chem)》21(2):187-202。
药物组合物以及调配物
在某些实施例中,本发明提供了包括RLR激动剂以及药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
在某些实施例中,可接受的调配物材料在所采用的剂量和浓度下优选地对受体是无毒的。在某些实施例中,一种或多种调配物材料用于s.c.和/或I.V.施用。在某些实施例中,药物组合物可以含有用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、清晰度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放的速率、吸附性或渗透性的调配物材料。在某些实施例中,合适的调配物材料包含但不限于:氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸);抗菌剂;抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠);缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸酯或其它有机酸);填充剂(如甘露醇或甘氨酸);螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA));络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精);填充剂;单糖;二糖;和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精);蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白);着色剂、调味剂和稀释剂;乳化剂;亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮);低分子量多肽;成盐抗衡离子(如钠);防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢);溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇);糖醇(如甘露醇或山梨醇);悬浮剂;表面活性剂或润湿剂(如普郎尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨醇酯、如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、氚核(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊);稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇);紧张性增强剂(如碱金属卤化物,优选地氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨醇);递送媒剂;稀释剂;赋形剂和/或药物佐剂。(《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》,第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company),1995)。在某些实施例中,调配物包括PBS;pH 5.2的20mM NaOAC、50mM NaCl;和/或pH 5.2的10mM NAOAC、9%蔗糖。在某些实施例中,将由本领域的技术人员根据例如预期施用途径、递送格式以及所期望的剂量确定最佳药物组合物。参见例如《雷明顿药物科学》,见上文。在某些实施例中,此类组合物可以影响RLR激动剂的物理状态、稳定性、体内释放的速率和/或体内清除的速率。
在某些实施例中,药物组合物中的主要媒剂或载剂在性质上可以是水性的或非水性的。例如,在某些实施例中,合适的媒剂或载剂可以是可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其它材料的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液。在某些实施例中,盐水包括等渗磷酸酯缓冲盐水。在某些实施例中,中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒剂。在某些实施例中,药物组合物包括约pH 7.0到8.5的Tris缓冲液,或约pH4.0到5.5的醋酸盐缓冲液,因此所述药物组合物可以进一步包含山梨醇或适合的替代物。在某些实施例中,包括RLR激动剂的组合物可以通过将具有期望的纯度水平的所选组合物与呈冻干饼或水性溶液形式的任选调配剂(《雷明顿药学科学》,见上文)混合来制备以进行储存。另外地,在某些实施例中,包括RLR激动剂的组合物可以使用如蔗糖等适当的赋形剂而被调配成冻干物。
在某些实施例中,药物组合物可以被选择用于肠胃外递送。在某些实施例中,组合物可以被选择用于吸入或用于通过消化道(如口服)递送。此类药学上可接受的组合物的制备处于本领域的技术人员的能力内。
在某些实施例中,调配物组分以对于施用部位可接受的浓度存在。在某些实施例中,使用缓冲液以将组合物维持在生理pH或略低的pH,通常维持在约5到约8的pH范围内。
在某些实施例中,当设想肠胃外施用时,在药学上可接受的媒剂中,治疗组合物可以呈包括RLR激动剂的无热原的、肠胃外可接受的水性溶液的形式。在某些实施例中,用于肠胃外注射的媒剂是无菌蒸馏水,其中RLR激动剂被调配为无菌等渗溶液并且被适当保存。在某些实施例中,所述制备可以涉及将所期望的分子与可以提供然后可以通过长效注射剂递送的产品的受控或持续释放的递送媒剂或试剂(如可注射微球、生物可蚀性颗粒、聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸或聚乙烯亚胺(例如))、珠粒或脂质体)一起调配。在某些实施例中,也可以使用透明质酸,并且所述透明质酸可以具有促进循环中持续的持续时间的作用。在某些实施例中,可以使用可植入药物递送装置来引入所期望的分子。
在某些实施例中,药物组合物可以被调配成用于吸入。在某些实施例中,RLR激动剂可以被调配为用于吸入的干粉。在某些实施例中,包括RLR激动剂的吸入溶液可以与用于气溶胶递送的推进剂一起调配。在某些实施例中,溶液可以被雾化。肺部施用在PCT申请第PCT/US94/001875号中进行了进一步描述,所述申请描述了经过化学修饰的蛋白质的肺部递送。
在某些实施例中,设想了调配物可以口服施用。在某些实施例中,以此方式施用的RLR激动剂可以调配有或未调配有习惯上用于如片剂和胶囊等固体剂型的复合的那些载剂。在某些实施例中,胶囊可以被设计成当生物利用度被最大化并且预先系统降解(pre-systemic degradation)被最小化时,在胃肠道中的某个点处释放调配物的活性部分。在某些实施例中,可以包含至少一种另外的试剂以促进RLR激动剂的吸收。在某些实施例中,还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
在某些实施例中,药物组合物可以涉及RLR激动剂在与适用于片剂的制造的无毒赋形剂的混合物中的有效量。在某些实施例中,通过将片剂溶解在无菌水或另一种适合的媒剂中,可以将溶剂制备成呈单位-剂量形式。在某些实施例中,适合的赋形剂包含但不限于:惰性稀释剂,如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢盐、乳糖或磷酸钙;或结合剂,如淀粉、明胶或阿拉伯胶;或润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
另外的药物组合物对本领域的技术人员将是显而易见的,其包含呈持续或受控递送的调配物形式的涉及RLR激动剂的调配物。在某些实施例中,用于调配各种其它持续或受控递送方式,如脂质体载剂、生物可蚀性微粒或多孔珠粒和长效注射剂的技术对于本领域的技术人员也是已知的。参见例如PCT申请第PCT/US93/00829号,其描述了用于药物组合物的递送的多孔聚合物微粒的受控释放。在某些实施例中,持续释放制剂可以包含呈成型物品(例如薄膜或微胶囊)形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质可以包含聚酯、水凝胶、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号和EP 058,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,《生物聚合物(Biopolymers)》22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)(Langer等人,《生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)》,15:167-277(1981)和Langer,《化学技术(Chem.Tech.)》,12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在某些实施例中,缓慢释放组合物还可以包含脂质体,所述脂质体可以通过本领域已知的若干种方法中的任一种来制备。参见例如,Eppstein等人,《美国国家科学院院刊》,82:3688-3692(1985);EP 036,676;EP 088,046和EP 143,949。
用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施例中,这可以借助于通过无菌过滤膜的过滤来完成。在某些实施例中,在将组合物冻干的情况下,使用此方法进行的灭菌可以在冻干和重组之前或之后执行。在某些实施例中,用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施例中,肠胃外组合物通常放置在具有无菌进入端口的容器中,例如,静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
在某些实施例中,一旦已经调配了药物组合物,就可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体的形式或以脱水粉或冻干粉的形式将其储存在无菌小瓶中。在某些实施例中,此类调配物可以以即用形式或以在施用前重组的形式(例如,冻干)储存。
在某些实施例中,提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在某些实施例中,试剂盒可以含有具有经过干燥的蛋白质的第一容器和具有水性调配物的第二容器两者。在某些实施例中,包含含有单室和多室预填充式注射器(例如,液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringes))的试剂盒。
在某些实施例中,要在治疗上采用的包括RLR激动剂的药物组合物的有效量将取决于例如治疗上下文和治疗目标。本领域的技术人员将理解的是,根据某些实施例的用于治疗的适当剂量水平因此将部分地根据所递送的分子、使用RLR激动剂的指示、施用途径和患者的尺寸(身体重量、身体表面或器官尺寸)和/或状况(年龄和总体健康状况)而变化。在某些实施例中,临床医生可以滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。
在某些实施例中,给药的频率将考虑所使用的调配物中的RLR激动剂的药代动力学参数。在某些实施例中,临床医生将在达到实现期望的效果的剂量之前施用组合物。在某些实施例中,组合物因此可以随时间推移以单剂量或以两个或更多个剂量(其可以含有或可以不含有相同量的所期望的分子)的形式施用,或通过植入装置或导管以连续输注的形式施用。适当剂量的进一步细化由本领域的普通技术人员常规进行,并且处于其常规执行的任务的范围内。在某些实施例中,适当剂量可以通过使用适当剂量-应答数据来确定。
在某些实施例中,药物组合物的施用途径符合已知方法,例如口服、借助于以下的注射:通过静脉内、腹膜内、脑内(器官实质内)、侧脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径;通过缓释系统或植入装置。在某些实施例中,组合物可以通过团注施用或通过输注连续施用,或通过植入装置施用。在某些实施例中,组合疗法的单个元素可以通过不同的途径施用。
在某些实施例中,组合物可以通过植入膜、海绵或已经吸收或包封所期望的分子的另一种适当的材料局部施用。在某些实施例中,在使用植入装置的情况下,可以将所述装置植入到任何合适的组织或器官中,并且所期望的分子的递送可以通过扩散、定时释放的集团或连续施用。在某些实施例中,可能期望的是以离体方式使用包括RLR激动剂的药物组合物。在此类情况下,将已经从患者体内移除的细胞、组织和/或器官暴露于包括RLR激动剂的药物组合物,在这之后随后将细胞、组织和/或器官植入回到患者体内。
在某些实施例中,RLR激动剂可以通过植入已经使用如本文所述的方法被基因工程化以表达和分泌激动剂的某些细胞来递送。在某些实施例中,此类细胞可以是动物细胞或人细胞,并且可以是自体的、异源的或异种的。在其它实施例中,细胞可以是永生化的。在某些实施例中,为了减少免疫应答的机会,可以对细胞进行包封以避免周围组织的渗透。在某些实施例中,包封材料通常是允许一种或多种蛋白质产品释放,但防止细胞被患者的免疫系统或来自周围组织的其它有害因素破坏的生物可相容的、半渗透聚合物壳体或膜。
在一些方面,本公开提供了一种包括根据本公开的RLR激动剂的用于刺激有需要的受试者体内的免疫应答、治疗或延迟有需要的受试者体内的癌症的进展或减少或抑制有需要的受试者体内的肿瘤生长的药物组合物和药学上可接受的载剂。在一些实施例中,所述RLR激动剂调配于聚乙烯亚胺(PEI)载剂中。在一些实施例中,所述PEI载剂为
应用
本文所述的组合物可以用于诊断性和治疗性应用。例如,可以在测定中使用可检测地标记的RLR激动剂来检测样品(例如生物样品)中靶蛋白的存在或量。可以在体外测定中使用所述组合物来研究靶功能(例如RLR介导的细胞信号传导或应答)的抑制。在例如,其中组合物与靶(例如,蛋白质或多肽)结合并激活靶的一些实施例中,在测定中可以将组合物用作阳性对照,所述测定被设计成标识也诱导靶蛋白或多肽的活性和/或以其它方式用于治疗与靶蛋白或多肽相关联的病症的另外的新颖化合物。例如,在测定中可以将RLR活化组合物用作阳性对照,以标识诱导、增加或刺激RLR功能的另外的化合物(例如,小分子、适体或抗体)。也可以在以下详述的治疗方法中使用所述组合物。
试剂盒
试剂盒可以包含如本文公开的RLR激动剂和使用说明书。在合适的容器中,试剂盒可以包括RLR激动剂、一种或多种对照以及各种缓冲剂、试剂、酶和本领域众所周知的其它标准成分。
所述容器可以包含可以将RLR激动剂放置到其中并且在一些情况下可以适当地等份分装到其中的至少一个小瓶、孔、测试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。在提供了另外的组分的情况下,试剂盒可以含有可以将此组分放置到其中的另外的容器。试剂盒还可以包含用于容纳RLR激动剂的装置和紧密约束以进行商业销售的试剂容器。此类容器可以包含将期望的小瓶保留在其中的注射或吹气模制的塑料容器。容器和/或试剂盒可以包含带有使用说明书和/或警告的标签。
在一些方面,本公开提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括由本公开所提供的RLR激动剂,或包括由本公开所提供的药物组合物以及用于在刺激受试者体内的免疫应答、或治疗或延迟癌症的进展、或抑制受试者体内的肿瘤生长中使用的说明书与任选地用于与一种或多种另外的治疗剂组合使用的说明书。
在一些实施例中,所述激动剂或所述药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
在一些实施例中,所述RLR激动剂或所述药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述RLR激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
使用方法
本发明的组合物具有多种体外和体内效用,所述效用涉及对RLR进行检测和/或定量和/或使RLR功能激动。
上述组合物尤其可用于用于治疗或预防受试者体内的多种癌症或感染性疾病的方法。可以使用多种方法将组合物施用于受试者,例如人类受试者,所述方法部分取决于施用途径。所述途径可以是例如静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、皮内注射(ID)、腹膜内注射(IP)、肌内注射(IM)、瘤内注射(IT)或鞘内注射。注射可以呈团注或连续输注的形式。
可以通过例如局部输注、注射或通过植入物的方式来实现施用。植入物可以具有多孔材料、无孔材料或胶状材料,所述材料包含膜(如硅橡胶膜)或纤维。植入物可以被配置成向受试者持续或定期释放组合物。参见例如美国专利申请公开第20080241223号;美国专利第5,501,856号;第4,863,457号;以及第3,710,795号;第EP488401号;以及第EP 430539号,所述申请中的每一个的公开内容均通过引用以其整体并入本文。所述组合物可以通过基于例如扩散、可蚀性或对流系统(例如渗透泵、可生物降解的植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸汽压泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于侵蚀的系统或机电系统)的可植入装置的方式递送给受试者。
在一些实施例中,RLR激动剂通过局部施用的方式治疗性地递送给受试者。
本文所述的RLR激动剂的其剂量能够治疗或预防受试者体内的癌症的合适的剂量可以取决于多种因素,所述因素包含例如待治疗的受试者的年龄、性别和重量以及所使用的特定抑制剂化合物。影响施用于受试者的剂量的其它因素包含例如癌症或感染性疾病的类型或严重程度。例如,患有转移性黑色素瘤的受试者可能需要施用与患有胶质母细胞瘤的受试者相比不同剂量的RLR激动剂。其它因素可以包含例如同时或先前影响受试者的其它医学病症、受试者的总体健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄率、药物组合以及施用于受试者的任何其它另外的治疗剂。还应当理解的是,针对任何特定受试者的具体剂量和治疗方案也将取决于治疗医疗从业者(例如,医生或护士)的判断。本文描述了合适的剂量。
药物组合物可以包含本文所述的其治疗有效量的RLR激动剂。此类有效量可以由本领域的普通技术人员部分地基于施用的RLR激动剂的或RLR激动剂与一种或多种另外的活性剂(如果使用了多于一种药剂)的组合效果来容易地确定。本文所述的RLR激动剂的治疗有效量也可以根据以下因素而变化:如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及激动剂(和一种或多种另外的活性剂)在个体中引发期望的应答(例如肿瘤生长的减少)的能力。例如,治疗有效量的RLR激动剂可以抑制(减轻其严重程度或消除其发生)和/或预防特定病症,和/或本领域已知或本文所述的特定病症的症状中的任何一种。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过组合物的任何毒性或有害作用的量。
本文所述的任何RLR激动剂的合适的人剂量可以在例如I期剂量递增研究中进一步评估。参见例如,van Gurp等人(2008)《美国移植杂志(Am J Transplantation)》8(8):1711-1718;Hanouska等人(2007)《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》13(2,第1部分):523-531;以及Hetherington等人(2006)《抗微生物药剂和化学治疗(Antimicrobial Agentsand Chemotherapy)》50(10):3499-3500。
在一些实施例中,所述组合物含有本文所述的任何RLR激动剂和一种或多种(例如,两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种或11种或更多种)另外的治疗剂,使得所述组合物整体上是治疗有效的。例如,组合物可以含有本文所述的RLR激动剂和烷化剂,其中激动剂和药剂各自处于在组合时对于治疗或预防受试者体内的癌症(例如,黑色素瘤)是治疗有效的浓度。
可以通过已知药物程序来确定此类组合物在细胞培养物或实验动物(例如,本文所述的癌症中的任何癌症的动物模型)中的毒性和治疗功效。这些程序可以用于例如确定LD50(对50%人群致死的剂量)和ED50(对50%人群治疗有效的剂量)。在毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数,并且其可以表示为LD50/ED50。表现出高治疗指数的RLR激动剂是优选的。尽管可以使用展示出毒副作用的组合物,但应当注意设计一种将此类化合物靶向到受影响的组织的部位,并且用于最小化对正常细胞的潜在损伤并且由此减少副作用的递送系统。
可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配一系列用于在人类中使用的剂量。对于本文所述的RLR激动剂,治疗有效的剂量可以最初根据细胞培养测定估计。可以将动物模型中的剂量调配为实现包含如在细胞培养中确定的EC50(即,实现症状的半数最大抑制的激动剂的浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用这种信息来更精确地确定人类中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。在一些实施例中,例如在期望局部施用(例如,对眼睛或关节)的情况下,可以使用细胞培养或动物模型来确定在局部部位内实现治疗有效浓度所需的剂量。
在一些实施例中,所述方法可以与用于癌症或感染性疾病的其它疗法结合执行。例如,可以在放射、外科手术、靶向或细胞毒性化学疗法、化学放射疗法、激素疗法、免疫疗法、基因疗法、细胞移植疗法、精准医学、基因组编辑疗法或其它药物疗法的同时、之前或之后向受试者施用所述组合物。
如上所述,可以使用本文所述的组合物(例如,RLR激动剂组合物)来治疗多种癌症,所述癌症如但不限于:卡波西肉瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞单核细胞红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症、霍奇金氏病(Hodgkin′s disease)、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、重链病、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤(Wilm′s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤变、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、黑色素瘤、神经母细胞瘤;口腔癌(例如嘴唇、舌头、口腔和咽部)、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌;呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌症。
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中一种或多种细胞因子的RLR介导的产生的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述激动剂增加细胞中RLR介导的细胞因子的产生。
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述激动剂增加细胞中一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达。
在一些方面,本公开提供了一种用于增加细胞中RLR依赖性细胞内信号传导的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开所提供的RLR激动剂接触,其中所述激动剂增加RLR依赖性细胞内信号传导。
在一些方面,本公开提供了一种刺激受试者体内的免疫应答的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或本公开所提供的药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种治疗或延迟受试者体内的癌症的进展的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或本公开所提供的药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种减少或抑制有需要的受试者体内的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或本公开所提供的药物组合物。
在一些方面,本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所提供的RLR激动剂或本公开所提供的药物组合物,其中所述激动剂或所述药物组合物增加细胞中的一种或多种细胞因子的RLR介导的产生、增加细胞中的一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达和/或增加细胞中的RLR依赖性细胞内信号传导,由此刺激所述免疫应答、治疗所述癌症或延迟所述癌症的进展或抑制肿瘤的生长。
RLR激动剂与另外的治疗剂的组合
在一些实施例中,本文所述的RLR激动剂可以以单一疗法的形式施用于受试者。可替代地,所述RLR激动剂可以以与另一种治疗(例如,针对癌症的另一种治疗)的组合疗法的形式施用于受试者。例如,组合疗法可以包含向受试者(例如人类患者)施用为患有癌症或有患癌症风险的受试者提供治疗益处的一种或多种另外的药剂。
在本公开所提供的所述方法的一些实施例中,RLR激动剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂或激动剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
在一些实施例中,所述RLR激动剂或所述药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
在一些实施例中,所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、toll样受体3(TLR3)激动剂、toll样受体7(TLR7)激动剂、toll样受体9(TLR9)激动剂。
与化学治疗剂的组合
适用于与本发明的组合物组合和/或共同施用的化学治疗剂包含,例如:紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthrancindione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。另外的药剂包含例如:抗代谢物(例如,甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、马法兰、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺基铂(II)(DDP)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、赛特铂或四硝酸三铂)、蒽环类(例如,柔红霉素(原名道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)和替莫唑胺。
与PD-1/PD-L1拮抗剂的组合
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与一种或多种PD-1/PD-L1拮抗剂组合(例如,组合施用),所述一种或多种PD-1/PD-L1拮抗剂与人PD-1或PD-L1特异性结合并且抑制由人PD-1/PD-L1信号传导介导的PD-1/PD-L1生物活性和/或一个或多个下游途径和/或细胞过程或其它人PD-1/PD-L1介导的功能。
因此,本文提供了直接地或变构地阻断、拮抗、遏制、抑制或降低PD-1/PD-L1生物活性的PD-1/PD-L1拮抗剂,所述PD-1/PD-L1拮抗剂包含由PD-1/PD-L1信号传导介导的下游途径和/或细胞过程,如受体结合和/或引发对PD-1/PD-L1的细胞应答。本文还提供了减少细胞或受试者所产生的人PD-1或PD-L1的数量或量的PD-1/PD-L1拮抗剂。
在一些实施例中,本公开提供了与人PD-1结合并且防止、抑制或减少PD-L1与PD-1的结合的PD-1/PD-L1拮抗剂。在一些方面,PD-1/PD-L1拮抗剂与编码PD-1或PD-L1的mRNA结合并阻止翻译。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂与编码PD-1或PD-L1的mRNA结合,并且引起降解和/或转换。
在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂抑制PD-1信号传导或功能。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1、PD-L2或与PD-L1和PD-L2两者的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂阻断PD-1与PD-L2的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂与PD-1特异性结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂与PD-L1特异性结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂与PD-L2特异性结合。
在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂抑制PD-1与其同源配体的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂抑制PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2或PD-1与PD-L1和PD-L2两者的结合。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂不抑制PD-1与其同源配体的结合。
在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与PD-1或PD-L1特异性结合的分离的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与人PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与人PD-L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与人PD-L1结合并且抑制PD-L1与PD-1的结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与人PD-1结合并且抑制PD-L1与PD-1的结合的抗体或抗原结合片段。
抑制或破坏PD-1与其配体PD-L1和PD-L2中的一种或两种之间相互作用的若干种免疫检查点拮抗剂正在临床开发中,或目前对于临床医生来说可用于治疗癌症。
在本公开所提供的任何组合物、方法和用途中可以包括PD-1/PD-L1拮抗剂的抗人PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包含但不限于:(派姆单抗,MK-3475,h409A11;参见US8952136、US8354509、US8900587和EP2170959,所有专利申请通过引用以其整体并入本文;默克(Merck))、(纳武单抗,BMS-936558,MDX-1106,ONO-4538;参见US7595048、US8728474、US9073994、US9067999、EP1537878、US8008449、US8779105和EP2161336,所有专利申请通过引用以其整体并入本文;百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、MEDI0680(AMP-514)、BGB-A317和BGB-108(百济神州公司(BeiGene))、244C8和388D4(参见WO2016106159,所述专利申请通过引用以其整体并入本文;Enumeral Biomedical)、PDR001(诺华(Novartis))以及REGN2810(再生元(Regeneron))。因此,在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为派姆单抗。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为纳武单抗。
在本公开所提供的任何组合物、方法和用途中可以包括PD-1/PD-L1拮抗剂的抗人PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包含但不限于:(阿维鲁单抗,MSB0010718C,参见WO2013/79174,所述专利申请通过引用以其整体并入本文;默克/辉瑞(Pfizer))、(度伐鲁单抗,MEDI4736)、(阿特朱单抗,MPDL3280A,RG7446;参见WO2010/077634,所述专利申请通过引用以其整体并入本文;罗氏公司(Roche))、MDX-1105(BMS-936559,12A4;参见US7943743和WO2013/173223,所述两个专利申请通过引用以其整体并入本文;梅德雷克斯(Medarex)/BMS公司)和FAZ053(诺华(Novartis))。因此,在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为阿维鲁单抗。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为度伐鲁单抗。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为阿特朱单抗。
在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是与人PD-1或人PD-L1特异性结合的免疫粘附素,例如,含有与如免疫球蛋白分子的Fc区等恒定区融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的融合蛋白。与PD-1特异性结合的免疫粘附分子的实例在WO2010/027827和WO2011/066342中进行了描述,两者均通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂为AMP-224(也被称为B7-DCIg),其为与人PD-1特异性结合的PD-L2-FC融合蛋白。
普通技术人员将理解的是,与PD-1或PD-L1结合并破坏PD-1/PD-L1信号传导途径的任何PD-1/PD-L1拮抗剂均适用于本文所公开的组合物、方法和用途。
在一些实施例中,PD-1/PD-L1拮抗剂是小分子、核酸、肽、肽模拟物、蛋白质、碳水化合物、碳水化合物衍生物或糖聚合物。示例性小分子PD-1抑制剂在Zhan等人(2016)《今日药物发现(Drug Discov Today)》21(6):1027-1036中进行了描述。
在本公开所提供的方法的一些实施例中,所述RLR激动剂与PD-1/PD-L1拮抗剂组合,其中所述PD-1/PD-L1拮抗剂选自由以下组成的组:PDR001、(派姆单抗)、(纳武单抗)、皮地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591和AMP-224。在一些实施例中,所述PD-1/PD-L1拮抗剂选自由以下组成的组:FAZ053、(阿特朱单抗)、(阿维鲁单抗)、(度伐鲁单抗)和BMS-936559。
与TIM-3拮抗剂的组合
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与TIM-3拮抗剂组合(例如,组合施用)。TIM-3拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施例中,TIM-3拮抗剂选自MGB453(诺华)、TSR-022(特萨罗(Tesaro))或LY3321367(礼来(Eli Lilly))。
与LAG-3拮抗剂的组合
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与LAG-3拮抗剂组合(例如,组合施用)。LAG-3拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施例中,LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华)、BMS-986016(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、TSR-033(特萨罗)、MK-4280(默克公司(Merck&Co))或REGN3767(再生元)。
与Toll样受体(TLR)激动剂的组合
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与TLR激动剂组合(例如,组合施用)。
Toll样受体(TLR)是促进病原体识别和先天免疫系统的激活的种系编码的跨膜蛋白的家族。(Hoffmann等人,(1999)《科学》284:1313-1318;Rock等人,(1998)《美国国家科学院院刊》95:588-593)。TLRs是模式识别受体(PRR),并且由先天免疫系统的细胞表达。TLR的已知配体的实例包含革兰氏阳性菌(TLR-2)、细菌内毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白蛋白质(TLR-5)、细菌DNA(TLR-9)、双链RNA和聚I:C(TLR-3)以及酵母(TLR-2)。TLR的体内激活启动了涉及特定细胞因子、趋化因子和生长因子的先天免疫应答。虽然所有TLR都可以激活某些细胞内信号传导分子,如核因子κβ(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶),但是所释放的特定组细胞因子和趋化因子对于每种TLR而言似乎都是独特的。TLR7、8和9包括位于如树突状细胞和单核细胞等免疫细胞的核内体区室或溶酶体区室的TLR的亚家族。与在浆细胞样树突状细胞(pDC)上高度表达的TLR7和9相反,TLR8主要在髓样DC(mDC)和单核细胞上表达。此亚家族介导如单链RNA等微生物核酸的识别。
类似于嘌呤核苷酸腺苷和鸟苷的小、低分子量(小于400道尔顿)合成咪唑喹啉化合物为要标识的第一TLR7和TLR8激动剂。许多这些化合物已经展示出抗病毒和抗癌性质。例如,TLR7激动剂咪喹莫特(ALDARATM)被美国食品和药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准为用于治疗由人乳头瘤病毒的某些菌株引起的皮肤性病变的局部药剂。咪喹莫特还可以用于治疗原发性皮肤癌和皮肤肿瘤,如基底细胞癌、角化棘皮瘤、光化性角化病和博文氏病(Bowen′s disease)。TLR7/8激动剂瑞喹莫德(R-848)正被评估为用于治疗人类生殖器疱疹的局部药剂。
根据本公开的TLR激动剂可以是任何TLR激动剂。例如,TLR激动剂可以涵盖天然或合成TLR配体、TLR配体的突变蛋白或衍生物、TLR配体的肽模拟物、模拟TLR配体生物功能的小分子或刺激TLR受体的抗体。TLR配体是与TLR结合的任何分子。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与TLR激动剂组合,其中所述TLR激动剂选自由以下组成的组:TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR10激动剂和TLR11激动剂。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与TLR3激动剂组合。TLR3激动剂是通过TLR3引起信号传导应答的激动剂。示例性TLR3激动剂包含但不限于聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、(聚ICLC)、聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)、(生物缀合物)和
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与聚胞苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与(聚ICLC)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与组合。在一些实施例中,RLR激动剂与(生物缀合物)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与组合。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与TLR7激动剂组合。TLR7激动剂是通过TLR7引起信号传导应答的激动剂。TLR7激动剂的非限制性实例包含单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(在位置N7和C8处衍生的鸟苷类似物)、咪唑喹啉化合物(例如,咪喹莫特和瑞喹莫德)或其衍生物。另外的示例性TLR7激动剂包含但不限于GS-9620(维沙莫德)、咪喹莫特(ALDARATM)和瑞喹莫德(R-848)。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与GS-9620(维沙莫德)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与咪喹莫特(ALDARATM)组合。在一些实施例中,RLR激动剂与瑞喹莫德(R-848)组合。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与TLR9激动剂组合。TLR9激动剂是通过TLR9引起信号传导应答的激动剂。示例性TLR9激动剂包含但不限于CpG寡脱氧核苷酸(GpG ODN)。在一些实施例中,CpG ODN是A类CpG ODN(CpG-AODN)、B类CpG ODN(CpG-B ODN)或C类CpG ODN(CpG-B ODN)。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂与CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)组合。在一些实施例中,所述CpG ODN为A类CpG ODN(CpG-AODN)。在一些实施例中,所述CpG ODN为B类CpG ODN(CpG-B ODN)。在一些实施例中,所述CpG ODN为C类CpG ODN(CpG-C ODN)。
其它组合
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂或KIR拮抗剂组合(例如,组合施用)。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂组合(例如,组合施用)。
在一些实施例中,本公开所提供的RLR激动剂或其药物组合物与包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂组合(例如,组合施用)。
本文所述的RLR激动剂可以替代或增强先前或当前施用的疗法。例如,在用RLR激动剂治疗时,一种或多种另外的活性剂的施用可以停止或减少,例如以较低水平或剂量施用。在一些实施例中,可以维持先前疗法的施用。在一些实施例中,将维持先前的疗法,直到RLR激动剂的水平达到足以提供治疗效果的水平。所述两种疗法可以组合施用。
如本文所限定的,监测受试者(例如,人类患者)癌症的改善意味着评估受试者疾病参数的改变,例如肿瘤生长的减少。在一些实施例中,评估在施用后至少一(1)小时,例如,至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时或48小时或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更多天或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更多周执行。可以在以下时间段中的一个或多个期间段内对受试者进行评估:治疗开始之前;治疗期间;或已经施用的治疗的一种或多种元素之后。评估可以包含评估对进一步治疗的需要,例如,评估是否应当改变剂量、施用的频率或治疗的持续时间。其还可以包含评估对添加或减少所选治疗方式的需要,例如,添加或减少针对本文所述的癌症的任何治疗。
在一些实施例中,施用本文所述的RLR激动剂以例如,通过增加T细胞活化和/或增殖来调节患者体内的T细胞应答。T细胞增殖、IFN产生和分泌和/或T细胞的溶细胞活性的增强对于需要其来治疗疾病或病状的患者来说可能是有益的。因此,在一些实施例中,向有需要的患者施用本公开的RLR激动剂,以诱导或增加T细胞活化、增强T细胞增殖、诱导IFN的产生和/或分泌和/或诱导溶细胞性T细胞应答。
在一些实施例中,本文所述的RLR激动剂可以用于对生物样品中的人RLR进行检测和/或定量的方法中。因此,如本文所述的RLR激动剂用于诊断、预测和/或确定患者体内疾病(例如,癌症)的进展。
虽然已经参考具体实施例对本公开进行了描述,但是本领域的技术人员应当理解的是,在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下可以作出各种改变并且可以取代等效物。另外,可以作出许多修改以使特定情形、材料、物质的组合、过程、一个或多个处理步骤适应本公开的目的、精神和范围。所有此类修改均旨在落入本公开的范围内。
实例
通过参考以下实例,可以更全面地理解本公开。然而,所述实例不应当被解释为限制本公开的范围。应理解,本文所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的,并且根据其进行的各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。
实例1:用RLR激动剂进行的HuPBMC的转染诱导体外细胞因子产生
为了确定包括各种修饰的RLR激动剂对细胞因子诱导的作用,评定了RLR激动剂诱导体外细胞因子产生的能力。由两个健康供体制备了人外周血单核细胞(huPBMC),并且在补充有胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺和Pen/Strep的100μL的RPMI 1640细胞培养基中,以2×105细胞/孔的密度将其接种在标准96孔组织培养板中。使用Lipofectamine2000作为转染试剂(除了G10和ODN2216之外,其中应用了直接孵育,数据未示出)执行了如图1中所指示的利用RLR激动剂进行的huPBMC的转染。将细胞在37℃下在加湿培养箱中温育24小时,然后收获细胞培养上清液。将上清液立即冷冻并在-20℃下储存。对样品解冻一次,以根据制造商的说明书使用U-Plex MSD平台对细胞因子IFN-α2a(图1)以及IL-1β、IP-10、IL-6、IL-12p70、MCP-1和MIP-1β进行分析(数据未示出)。图1示出了由用包括各种修饰和/或序列基序的新颖候选RLR激动剂处理的人PBMC的IFN-a分泌的剂量依赖性诱导。以10nM、2nM或0.4nM添加RLR激动剂。由细胞响应于RLR激动剂转染而释放的IFN-α2a的量以pg/mL给出。
表3和4示出了每种RLR激动剂的序列。表3还示出了与图1中测试的每种化合物相对应的序列和编号。例如,图1中的化合物X25224对应于“RIG7”,所述RIG7包括包含SEQ IDNO:42的通过接头“UUCG”与包括SEQ ID NO:73的第二寡核苷酸连接的第一寡核苷酸并且具有5′二磷酸酯部分。RIG7的序列也如表4中的SEQ ID NO:6所列示的。
表3:寡核苷酸组合表
(-)指示无5′磷酸酯;(pp)指示5′二磷酸酯;(ppp)指示5′三磷酸酯
表4:序列表
Claims (195)
1.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5'的核苷酸包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,并且其中所述激动剂包括序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性。
2.根据权利要求1所述的激动剂,其中所述序列基序选自由以下组成的组:
(i)GT重复基序;
(ii)GA重复基序;
(iii)AUCG重复基序;
(iv)AU重复基序;
(v)二嘧啶基序;
(vi)二嘌呤基序;
(vii)嘧啶三联体基序;
(viii)嘌呤三联体基序;
(ix)回文序列基序;以及
(x)(i)到(ix)的任意组合。
3.根据权利要求1和2所述的激动剂,其中所述至少一种提高的生物活性选自:
(i)RLR介导的细胞因子产生的增加;
(ii)干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的增加;
(iii)RLR介导的细胞内信号传导的增加;
(iv)与RLR的结合亲和力的增加;以及
(v)(i)到(iv)的任意组合。
4.根据权利要求1到3所述的激动剂,其中所述序列基序为GT重复基序,所述GT重复基序包括<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、约5到10个、约5个、约4个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
5.根据权利要求4所述的激动剂,其中所述GT重复基序为[GT]n,其中n=2到9。
6.根据权利要求4和5所述的激动剂,其中所述GT重复基序为[GT]7。
7.根据权利要求4和5所述的激动剂,其中所述GT重复基序为[GT]3,并且其中所述GT重复基序之后分别为嘌呤三联体基序和UCG。
8.根据权利要求7所述的激动剂,其中所述嘌呤三联体基序为GGA。
9.根据权利要求1到3所述的激动剂,其中所述序列基序为GA重复基序,所述GA重复基序包括<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、约5到10个、约5个、约4个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
10.根据权利要求9所述的激动剂,其中所述GA重复基序为[GA]n,其中n=2到9。
11.根据权利要求10所述的激动剂,其中所述GA重复基序为[GA]7。
12.根据权利要求1到3所述的激动剂,其中所述序列基序为AUCG重复基序,所述AUCG重复基序包括<19个、约16个、约12到16个、约12个、约8到12个、约6个、16个、12个、8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
13.根据权利要求12所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]n,其中n=2到4。
14.根据权利要求13所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]3。
15.根据权利要求12到14所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是CG或二嘧啶基序。
16.根据权利要求15所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是CG。
17.根据权利要求15所述的激动剂,其中所述二嘧啶基序为CC。
18.根据权利要求12到14所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序。
19.根据权利要求18所述的激动剂,其中所述二嘌呤基序为GA。
20.根据权利要求18所述的激动剂,其中所述二嘌呤基序为II。
21.根据权利要求12到20中任一项所述的激动剂,其中构成所述AUCG重复基序的U被经过修饰的核苷取代。
22.根据权利要求21所述的激动剂,其中所述经过修饰的核苷为核糖胸苷(T)。
23.根据权利要求12到20中任一项所述的激动剂,其中构成所述AUCG重复基序的G被经过修饰的核苷取代。
24.根据权利要求23所述的激动剂,其中所述经过修饰的核苷为肌苷(I)。
25.根据权利要求12到14所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是IG。
26.根据权利要求12到14所述的激动剂,其中构成所述AUCG重复序列的G被肌苷(I)取代,并且其中所述AUCG重复序列之前是肌苷(I)。
27.根据权利要求26所述的激动剂,其中所述第一多核苷酸的最靠近5'的核苷酸是肌苷(I)。
28.根据权利要求12和13所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序为[AUCG]2。
29.根据权利要求28所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是二嘌呤基序。
30.根据权利要求29所述的激动剂,其中所述二嘌呤基序为GG。
31.根据权利要求28所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是嘌呤三联体。
32.根据权利要求31所述的激动剂,其中所述嘌呤三联体为GGG。
33.根据权利要求28所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是CCCCCG。
34.根据权利要求28所述的激动剂,其中所述AUCG重复基序之前是TCGUCG。
35.根据权利要求1到3所述的激动剂,其中所述序列基序为回文序列,所述回文序列包括以产生回文的任何顺序连接的<19个、约15到18个、约15个、约10到15个、约10个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个核苷酸或其衍生物或类似物的序列。
36.根据前述权利要求中任一项所述的激动剂,其中所述接头的侧翼是AU。
37.根据前述权利要求中任一项所述的激动剂,其中所述接头的侧翼是AU重复基序,其中所述AU重复基序为[AU]n,其中n=2到3。
38.根据权利要求37所述的激动剂,其中所述AU重复基序为[AU]2。
39.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5'-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3',其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,和/或X1和/或X2中的至少一个包括至少一个肌苷核苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。
40.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1包括肌苷,并且N4包括胞苷。
41.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1包括胞苷,并且N4包括肌苷。
42.根据权利要求39所述的激动剂,其中N2包括肌苷,并且N3包括胞苷。
43.根据权利要求39所述的激动剂,其中N2包括胞苷,并且N3包括肌苷。
44.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1包括鸟苷。
45.根据权利要求39所述的激动剂,其中N2包括鸟苷。
46.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1包括胞苷。
47.根据权利要求39所述的激动剂,其中N2包括胞苷。
48.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷。
49.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷。
50.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷。
51.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷。
52.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1包括肌苷,并且N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
53.根据权利要求39所述的激动剂,其中N2包括肌苷,并且N3包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
54.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,N3和N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
55.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
56.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
57.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
58.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且其中X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
59.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
60.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
61.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
62.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
63.根据权利要求39所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且其中X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
64.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为12个核苷酸并且包括1个、2个、3个或4个肌苷核苷。
65.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为13个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个或5个肌苷核苷。
66.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为14个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个或6个肌苷核苷。
67.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为15个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个肌苷核苷。
68.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为16个核苷酸并且各自包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个肌苷核苷。
69.根据权利要求39所述的激动剂,其中X1和X2各自为12个核苷酸并且包括至少10%、20%、30%或40%肌苷核苷。
70.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括式:
5'-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3',其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1包括序列基序[AUCN5]x,其中N5为包括鸟苷或肌苷,其中x为值指示序列基序的数量的整数,并且其中x=3或4;
(viii)X2包括序列基序[CN6AU]y,其中N6包括鸟苷或肌苷,其中y为值指示序列基序的数量的整数,并且其中y=3或4;
(ix)L为可操作地连接所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸的接头,
任选地其中N1、N2、N3和N4中的至少一个为肌苷,并且其中所述肌苷核苷与所述发夹RNA中的胞苷碱基配对。
71.根据权利要求70所述的激动剂,其中N5包括肌苷,并且N6包括肌苷。
72.根据权利要求71所述的激动剂,其中N5包括鸟苷,并且N6包括肌苷。
73.根据权利要求72所述的激动剂,其中N5包括肌苷,并且N6包括鸟苷。
74.根据权利要求73所述的激动剂,其中N5包括鸟苷(G),并且N6包括鸟苷(G)。
75.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中x=3,并且y=3。
76.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中x=4,并且y=4。
77.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1包括肌苷(I),并且N4包括胞苷(C)。
78.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N2包括肌苷(I),并且N3包括胞苷(C)。
79.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N3包括肌苷(I),并且N2包括胞苷(C)。
80.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N4包括肌苷(I),并且N1包括胞苷(C)。
81.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1包括鸟苷(G)。
82.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N2包括鸟苷(G)。
83.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1包括胞苷(C)。
84.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N2包括胞苷(C)。
85.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷(G),并且N3和N4包括胞苷(C)。
86.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括鸟苷(G)。
87.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷(I),并且N3和N4包括胞苷(C)。
88.根据权利要求70到74中任一项所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷(C),并且N3和N4包括肌苷(I)。
89.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,并且其中所述激动剂包括式:
5'-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3',其中
(i)(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,所述第一多核苷酸包括连接的核苷酸N1、N2和X1;
(ii)(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,所述第二多核苷酸包括连接的核苷酸X2、N3和N4;
(iii)N1、N2、N3和N4各自包括单个核苷酸,所述单个核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(iv)N1与N4碱基配对;
(v)N2与N3碱基配对;
(vi)N1包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物;
(vii)X1和X2各自为包括选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸:腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷;
(viii)X1与X2互补;
(ix)X1和X2各自的长度为12个核苷酸到16个核苷酸,并且长度相同;并且
(x)L为共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的非核苷酸接头,
其中如果存在的话,肌苷与胞苷碱基配对。
90.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1包括肌苷,并且N4包括胞苷。
91.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1包括胞苷,并且N4包括肌苷。
92.根据权利要求89所述的激动剂,其中N2包括肌苷,并且N3包括胞苷。
93.根据权利要求89所述的激动剂,其中N2包括胞苷,并且N3包括肌苷。
94.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1包括鸟苷。
95.根据权利要求89所述的激动剂,其中N2包括鸟苷。
96.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1包括胞苷。
97.根据权利要求89所述的激动剂,其中N2包括胞苷。
98.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷。
99.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷。
100.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷。
101.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷。
102.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1包括肌苷,并且N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
103.根据权利要求89所述的激动剂,其中N2包括肌苷,并且N3包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
104.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,N3和N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
105.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
106.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
107.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括鸟苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
108.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括鸟苷,并且其中X1和X2各自包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
109.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
110.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2各自包括至少一个肌苷。
111.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且其中X1和/或X2各自包括至少一个肌苷。
112.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括肌苷,并且N3和N4包括胞苷,并且其中X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
113.根据权利要求89所述的激动剂,其中N1和N2包括胞苷,并且N3和N4包括肌苷,并且其中X1和X2包括肌苷并且不包括鸟苷核苷。
114.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为12个核苷酸并且包括1个、2个、3个或4个肌苷核苷。
115.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为13个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个或5个肌苷核苷。
116.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为14个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个或6个肌苷核苷。
117.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为15个核苷酸并且包括1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个肌苷核苷。
118.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为16个核苷酸并且各自包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个肌苷核苷。
119.根据权利要求89所述的激动剂,其中X1和X2各自为12个核苷酸并且包括至少10%、20%、30%或40%肌苷核苷。
120.根据权利要求1到88中任一项所述的激动剂,其中所述接头为核苷酸接头或非核苷酸接头。
121.根据权利要求120所述的激动剂,其中所述接头为非核苷酸接头。
122.根据权利要求120所述的激动剂,其中所述接头为核苷酸接头。
123.根据权利要求122所述的激动剂,其中所述核苷酸接头包括四元环,其中所述四元环的核苷酸序列选自由以下组成的组:
(a)UNCG,其中N=A、C、G或U;
(b)GNRA,其中N=A、C、G或U,并且其中R=A或G;
(c)ANYA,其中N=A、C、G或U,并且其中Y=C或T;
(d)CUYG,其中Y=C或T;
(e)UMAC,其中M=A或C;以及
(f)CUUG。
124.根据权利要求122所述的激动剂,其中所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU或UGUUU。
125.根据权利要求123所述的激动剂,其中所述四元环的序列为UUCG。
126.根据权利要求123所述的激动剂,其中所述四元环的序列为GAUC。
127.根据权利要求124所述的激动剂,其中所述核苷酸接头包括核苷酸序列UUUGAU。
128.根据权利要求124所述的激动剂,其中所述核苷酸接头包括核苷酸序列UGUUU。
129.根据权利要求121或权利要求89到119中任一项所述的激动剂,其中所述非核苷酸接头选自由以下组成的组:
(a)乙二醇接头;以及
(b)烷基接头。
130.根据权利要求129所述的激动剂,其中所述非核苷酸接头为六乙二醇接头。
131.根据权利要求129所述的激动剂,其中所述非核苷酸接头为C9烷基接头。
132.根据权利要求1到131中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂包括5'二磷酸酯部分或其衍生物或类似物。
133.根据权利要求1到131中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂包括5'三磷酸酯部分或其衍生物或类似物。
134.根据权利要求132或133所述的激动剂,其中所述其衍生物或类似物包括选自以下的磷酸酯生物电子等排体:膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并硼唑、硼代磷酸酯、方酰胺。
135.根据权利要求1到134中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂包括经过修饰的核苷酸、经过修饰的核苷或经过修饰的核碱基或其组合。
136.根据权利要求1到135中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂包括对核苷酸间键或对多核苷酸主链的修饰。
137.根据权利要求1到136中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂表现出以下性质中的至少一种或多种性质:
(a)与一种或多种RLR(例如,RIG-1、MDA5和/或LGP2)特异性结合;
(b)增加RLR介导的细胞因子产生;
(c)增加干扰素刺激的基因(ISG)的RLR介导的表达;
(d)增加RLR依赖性细胞内信号传导;
(e)增加所述双链体的稳定性;
(f)增加对RLR的结合亲和力;
(g)减少脱靶结合;
(h)增加生物半衰期;
(i)增加生物分布和生物利用度;
(j)增加和/或增强进入细胞和/或组织的摄取;
(k)降低免疫原性;以及
(l)(a)到(k)的任意组合。
138.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂的最靠近5'的核苷酸包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,并且其中所述激动剂包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
139.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括通过接头与第二多核苷酸连接的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体,其中所述双链体包括少于19个碱基对,其中第一寡核苷酸的最靠近5'的核苷酸包括5'二磷酸酯或三磷酸酯部分或其衍生物或类似物,其中所述激动剂包括序列基序,所述序列基序相对于不包括所述序列基序的激动剂提供由所述RLR介导的至少一种提高的生物活性,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
140.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,并且其中所述激动剂包括选自由SEQ ID NO:22、23和25组成的组的核苷酸序列。
141.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括至少一个或多个核苷酸,所述至少一个或多个核苷酸包括与胞苷碱基配对的肌苷,其中所述激动剂包括式5'-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3',其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:58和89;
(ii)分别为SEQ ID NO:59和89;以及
(iii)分别为SEQ ID NO:61和91。
142.一种合成的RIG-I样受体(RLR)激动剂,其与RIG-I样受体(RLR)特异性结合,其中所述激动剂包括平末端的发夹RNA,所述平末端的发夹RNA包括非核苷酸接头,其中所述激动剂包括式5'-(N1-N2-X1)-L-(X2-N3-N4)-3',其中(N1-N2-X1)包括第一多核苷酸,并且(X2-N3-N4)包括第二多核苷酸,并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸序列:
(i)分别为SEQ ID NO:37和68;
(ii)分别为SEQ ID NO:38和69;
(iii)分别为SEQ ID NO:39和70;
(iv)分别为SEQ ID NO:40和71;
(v)分别为SEQ ID NO:41和72;
(vi)分别为SEQ ID NO:42和73;
(vii)分别为SEQ ID NO:43和74;
(viii)分别为SEQ ID NO:44和75;
(ix)分别为SEQ ID NO:45和76;
(x)分别为SEQ ID NO:46和77;
(xi)分别为SEQ ID NO:47和78;
(xii)分别为SEQ ID NO:48和79;
(xiii)分别为SEQ ID NO:49和80;
(xiv)分别为SEQ ID NO:50和81;
(xv)分别为SEQ ID NO:51和82;
(xvi)分别为SEQ ID NO:52和83;
(xvii)分别为SEQ ID NO:53和84;
(xviii)分别为SEQ ID NO:54和85;
(xix)分别为SEQ ID NO:55和86;
(xx)分别为SEQ ID NO:56和87;
(xxi)分别为SEQ ID NO:57和88;
(xxii)分别为SEQ ID NO:58和89;
(xxiii)分别为SEQ ID NO:59和89;
(xxiv)分别为SEQ ID NO:60和90;
(xxv)分别为SEQ ID NO:61和91;
(xxvi)分别为SEQ ID NO:62和92;
(xxvii)分别为SEQ ID NO:63和91;
(xxviii)分别为SEQ ID NO:64和93;
(xxix)分别为SEQ ID NO:65和94;
(xxx)分别为SEQ ID NO:66和95;
(xxxi)分别为SEQ ID NO:67和96;以及
(xxxii)分别为SEQ ID NO:63和97。
143.根据前述权利要求中任一项所述的激动剂,其中所述激动剂,其中构成所述激动剂的核苷酸序列不与基因组DNA序列或mRNA序列互补,其中所述RLR激动剂不参与RNA干扰,并且其中所述RLR激动剂不使基因表达沉默。
144.一种用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或减少或抑制所述受试者的肿瘤生长的药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂和药学上可接受的载剂。
145.根据权利要求144所述的药物组合物,其中所述激动剂调配于聚乙烯亚胺(PEI)载剂中。
147.一种用于增加细胞中的一种或多种细胞因子的RLR介导的产生的方法,所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂接触,其中所述激动剂增加细胞中的RLR介导的细胞因子产生。
148.一种用于增加细胞中的一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达的方法,所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂接触,其中所述激动剂增加细胞中的一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达。
149.一种用于增加细胞中的RLR依赖性细胞内信号传导的方法,所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂接触,其中所述激动剂增加RLR依赖性细胞内信号传导。
150.一种刺激受试者的免疫应答的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物。
151.一种治疗受试者的癌症或延迟所述癌症的进展的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物。
152.一种减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物。
153.一种用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物,其中所述激动剂或所述药物组合物增加细胞中的一种或多种细胞因子的RLR介导的产生、增加细胞中的一种或多种干扰素刺激的基因的RLR介导的表达和/或增加细胞中的RLR依赖性细胞内信号传导,由此刺激所述免疫应答、治疗所述癌症或延迟所述癌症的进展或抑制肿瘤的生长。
154.根据权利要求150到153中任一项所述的方法,其中所述激动剂或所述药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂或激动剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
155.根据权利要求154所述的方法,其中所述激动剂或所述药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
156.根据权利要求154或155所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体7(TLR7)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂。
157.根据权利要求154或155所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
158.根据权利要求154或155所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
159.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂。
162.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为TIM-3拮抗剂。
163.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为VISTA拮抗剂。
164.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为腺苷A2AR拮抗剂。
165.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为B7-H3拮抗剂。
166.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为B7-H4拮抗剂。
167.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为BTLA拮抗剂。
168.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为CTLA-4拮抗剂。
169.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为IDO拮抗剂。
170.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为KIR拮抗剂。
171.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为LAG-3拮抗剂。
172.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体3(TLR3)激动剂。
173.根据权利要求172所述的方法,其中所述TLR3激动剂为聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。
175.根据权利要求172所述的方法,其中所述TLR3激动剂为聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)。
179.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体7(TLR7)激动剂。
180.根据权利要求179所述的方法,其中所述TLR7激动剂为GS-9620(维沙莫德(Vesatolimod))。
181.根据权利要求179所述的方法,其中所述TLR7激动剂为咪喹莫特(imiquimod)(ALDARATM)。
182.根据权利要求179所述的方法,其中所述TLR7激动剂为瑞喹莫德(resiquimod)(R-848)。
183.根据权利要求156所述的方法,其中所述一种或多种另外的治疗剂为Toll样受体9(TLR9)激动剂。
184.根据权利要求183所述的方法,其中所述TLR9激动剂为CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)。
185.根据权利要求184所述的方法,其中所述CpG ODN为A类CpG ODN(CpG-AODN)。
186.根据权利要求184所述的方法,其中所述CpG ODN为B类CpG ODN(CpG-B ODN)。
187.根据权利要求184所述的方法,其中所述CpG ODN为C类CpG ODN(CpG-C ODN)。
188.一种根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的用途,所述激动剂或所述药物组合物任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。
189.一种根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物在制造用于刺激有需要的受试者的免疫应答、治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长的药剂中的用途,所述激动剂或所述药物组合物任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。
190.一种包括根据权利要求1到143中任一项所述的激动剂或根据权利要求144到146中任一项所述的药物组合物以及说明书的试剂盒,所述试剂盒用于刺激受试者的免疫应答、或治疗所述受试者的癌症或延迟所述癌症的进展或抑制所述受试者的肿瘤生长,所述试剂盒任选地具有用于与一种或多种另外的治疗剂组合使用的说明书。
191.根据权利要求188所述的用途或根据权利要求190所述的试剂盒,其中所述激动剂或所述药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用,其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组:化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如,调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
192.根据权利要求191所述的用途或试剂盒,其中所述激动剂或所述药物组合物在施用所述一种或多种另外的治疗剂之前或之后施用,或其中所述一种或多种另外的治疗剂在施用所述激动剂或所述药物组合物的同时、之前或之后施用。
193.根据权利要求188、189、191或192中任一项所述的用途或根据权利要求190到192所述的试剂盒,其中所述一种或多种另外的治疗剂为PD-1/PD-L1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、腺苷A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG-3拮抗剂、Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体7(TLR7)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂。
194.根据权利要求188、189、191或192中任一项所述的用途或根据权利要求190到192所述的试剂盒,其中所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD137(4-1BB)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
195.根据权利要求188、189、191或192中任一项所述的用途或根据权利要求190到192所述的试剂盒,其中所述一种或多种另外的治疗剂为包括与CD134(OX40)特异性结合的多肽(例如,抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
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MARIE-LINE GOULET ET AL.: "Systems analysis of a RIG-I agonist inducing broad spectrum inhibition of virus infectivity", PLOS PATHOGENS, vol. 9, no. 4, pages 1 - 19 * |
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