JP2018503377A - コアモチーフを備えた核酸ナノ構造 - Google Patents

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Abstract

最適化された阻害性核酸が提供される。当該核酸は、ＧＧＧなどの最適な阻害性モチーフを含む配列を有する。関連する方法も記載されている。この核酸は、脂質化脂質付加された構造の周囲に放射状半径方向に位置するオリゴヌクレオチドの高密度配置密集構成を含む球状核酸（ＳＮＡ）であり得、上記オリゴヌクレオチドは、８〜２００ヌクレオチドの長さを有し、かつ、少なくとも１つのＧＧＧを含み得る。このオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。

Description

（関連出願）
本出願は、２０１５年１月１４日に出願された「ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＮＡＮＯＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＷＩＴＨ ＣＯＲＥ ＭＯＴＩＦＳ」と題する米国仮出願番号第６２／１０３，３０３号に対し、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
（発明の背景）
阻害性核酸は、種々の機構を通じて遺伝子発現を下方制御する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、選択された標的配列と少なくとも部分的に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖であり、特定のメッセンジャーＲＮＡ鎖のタンパク質翻訳を妨げることによって機能する。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスにより、多くの生物体において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することが可能な、別の型の阻害性核酸である。これらの機能性ＲＮＡは、少なくとも２つの型の低分子ＲＮＡ分子、（１）ｍＲＮＡ分解を誘導するｓｉＲＮＡ分子および（２）翻訳の阻害を誘導するｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を含む。他の低分子ＲＮＡは、転写レベルで、ＤＮＡおよびヒストンのメチル化に影響を及ぼすことによって機能する。
（発明の要旨）
一部の態様では、本発明は、脂質付加された構造の周囲に半径方向に位置するオリゴヌクレオチドの密集構成を有する球状核酸（ＳＮＡ）であって、前記オリゴヌクレオチドが、８〜２００ヌクレオチドの長さを有し、かつ、少なくとも１つのＧＧＧを含む、球状核酸（ＳＮＡ）である。
一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、以下の構造：
５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
（式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドであり、必要に応じて、Ｘ１は、ＧおよびＡからなる群から選択される）を有する。他の実施形態では、５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’は、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される。他の実施形態では、少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの５’末端において、最初の１０ヌクレオチド内に位置する。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの３’末端において、３’末端における１０ヌクレオチド内に位置するか、または、少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの中央に位置する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜５個のＧＧＧモチーフを含む。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜１０，０００オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、５００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、１，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、５，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、６，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、７，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、８，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチド、９，０００〜１０，０００オリゴヌクレオチドまたは９，５００〜１０，０００オリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ＳＮＡは、デンドリマーではない。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオリピドである。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドで構成される。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドで構成される。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドで構成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドヘテロ二本鎖で構成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの組合せで構成される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、かつ突出部を有さない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、直鎖状である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、構造およびヌクレオチド配列が同一のオリゴヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの、構造およびヌクレオチド配列が異なるオリゴヌクレオチドを有する。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜１０個の異なるヌクレオチド配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、修飾されたオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも５０％が、修飾されたオリゴヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てが、修飾されたオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を有さない。
別の実施形態では、ナノ構造は、脂質二重層を有するリポソームコアを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ナノ構造の外表面に露出している５’末端を有する。他の実施形態では、全てのオリゴヌクレオチドは、ナノ構造の外表面に露出している５’末端を有する。他の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ナノ構造の外表面に露出している３’末端を有する。他の実施形態では、全てのオリゴヌクレオチドは、ナノ構造の外表面に露出している３’末端を有する。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コアに直接連結している。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コアにリンカーを通じて間接的に連結している。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コアに１つ超のリンカーを通じて間接的に連結している。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コアに可逆的にまたは不可逆的にカップリングしている。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コアにリンカーを通じて連結している。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のチオール基、例えば種々の鎖長のアルカンチオール、環状ジチオール、リポ酸、ＰＥＧ−チオール、およびチオール基を含有する他のリンカー、を含有する化学構造である。必要に応じて、オリゴヌクレオチドは、リポソームコアに連結しており、リンカーは、以下のリンカーのうちの１つまたは複数である：トコフェロール、種々の長さおよび飽和状態のスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、スフィンゴシンリン酸、メチル化スフィンゴシンおよびメチル化スフィンガニン、セラミド、セラミドリン酸、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、およびフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体など、種々の長さ、飽和状態のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールリン酸、ＬＰＩ、カルジオリピン、リゾカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸、（ジアシルグリセロ）リン酸、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、およびプラスマロゲン、およびそれらの誘導体など、異なる長さ、飽和状態のステロール、例えば、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラソステロール、ジオスゲニン、シトステロール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン性脂質、エーテルカチオン性脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、および多価不飽和ステロール、およびそれらの誘導体など。
一部の実施形態では、前記コアは、中実または中空コアであり、そして不活性、常磁性または超常磁性であり得る。実施形態では、前記中実コアは、貴金属、例えば金および銀、遷移金属、例えば鉄およびコバルト、金属酸化物、例えばシリカ、ポリマーまたはこれらの組合せで構成される。他の実施形態では、前記コアはポリマーコアであり、前記ポリマーコアは、両親媒性ブロック共重合体、疎水性ポリマー、例えばポリスチレン、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および他の生体適合性ポリマーで構成される。
別の実施形態では、コアは、リポソームコアであり、１つの型の脂質で構成されるか、あるいは、２〜１０種の異なる脂質で構成される。一部の実施形態では、リポソームコアは、以下から選択される１種または複数の脂質で構成される：種々の長さおよび飽和状態のスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、スフィンゴシンリン酸、メチル化スフィンゴシンおよびメチル化スフィンガニン、セラミド、セラミドリン酸、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、およびフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体など、種々の長さ、飽和状態のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールリン酸、ＬＰＩ、カルジオリピン、リゾカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸、（ジアシルグリセロ）リン酸、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、およびプラスマロゲン、およびそれらの誘導体など、異なる長さ、飽和状態のステロール、例えば、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラソステロール、ジオスゲニン、シトステロール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン性脂質、エーテルカチオン性脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、および多価不飽和ステロール、およびそれらの誘導体など。
別の実施形態では、ＳＮＡは、活性薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、活性薬剤をＳＮＡと混合する。他の実施形態では、活性薬剤をオリゴヌクレオチド殻に直接連結する。一部の実施形態では、活性薬剤をオリゴヌクレオチド殻にリンカーを通じて間接的に連結する。他の実施形態では、活性薬剤をコアに直接連結する。さらに別の実施形態では、活性薬剤をコアにリンカーを通じて間接的に連結する。別の実施形態では、活性薬剤−オリゴヌクレオチドコンジュゲートとコアをオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって連結する。一部の実施形態では、活性薬剤を、コア、必要に応じてリポソームコア内に埋め込むことによってコアに付随させる。一部の実施形態では、活性薬剤を内部水層内のリポソームコア内に封入する。
一部の実施形態では、ＳＮＡは、自己組織化ナノ構造である。
細胞を、少なくとも１つのＧＧＧモチーフを有する阻害性オリゴヌクレオチドを有するヌクレオチド両親媒性物質を含むナノ構造と接触させることによって遺伝子発現を低減させるための方法であって、遺伝子発現が、前記細胞を遊離の阻害性オリゴヌクレオチドと接触させた場合よりも大きな程度低減される方法が、本発明の他の局面において提供される。前記ヌクレオチド両親媒性物質は、本明細書中に記載のとおりの球状核酸（ＳＮＡ）であり得る。
一部の実施形態では、前記阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、前記阻害性オリゴヌクレオチドは、以下の構造：
５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
（式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドであり、ここで必要に応じて、Ｘ１は、ＧおよびＡからなる群から選択される）を有する。一部の実施形態では、５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’は、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、前記阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＮＦ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびそれらの受容体、成長因子または分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）、癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３およびＷＴ１）、酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ（hycroxylase）、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehycrogenase）、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ（peptidease）、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）、およびＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９）からなる群から選択される標的配列と相補的である。
前記阻害性オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、および遺伝性障害を処置するための薬剤からなる群から選択される治療剤であり得る。
一部の実施形態では、前記方法は、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶反応または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と組み合わさった乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎、および慢性尋常性乾癬からなる群から選択される障害を処置するための方法である。
別の態様では、疾患の処置に使用するための組成物は、ＳＮＡおよびその具体物を含む。
本発明の限定のそれぞれは、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを伴う本発明の限定のそれぞれが本発明の各態様に含まれ得ることが予測される。本発明は、その適用に関して、以下の説明に記載されているまたは図に例示されている構成成分の構築および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態にすることができ、また、種々のやり方で実践または実行することができる。本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、付随する詳細な説明、実施例、特許請求の範囲、および図面に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書から、および特許請求の範囲から明らかである。
付属図は、スケール通りで描かれるよう意図されたものではない。図中、種々の図面に例示されている同一またはほぼ同一の構成成分のそれぞれは同様の数字で表されている。明瞭にするために、図ごとに全ての構成成分が標識されているのではない場合がある。
図１は、ＳＮＡ配合オリゴヌクレオチド内にＧＧＧモチーフが存在することが、ヒトケラチノサイトにおける遺伝子ノックダウンがより大きいことと相関することを示すデータを示すグラフである。ＧＧＧモチーフがゼロであるのと、モチーフが１つあることとの間（ｐ＝０．００３４）およびモチーフが２つあることとの間（ｐ＝０．０２１６）のいずれにも統計的に有意な差異が存在する。
（詳細な説明）
遺伝子発現を阻害するための方法および製品が本明細書において提供される。阻害性核酸を使用して遺伝子発現を阻害するための最適な配列モチーフが本明細書において見いだされた。特に、少なくとも１つのＧＧＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の低減に関してＧＧＧモチーフを欠く同様のオリゴヌクレオチドよりも有効であることが見いだされた。
本発明の阻害性オリゴヌクレオチドまたは阻害性核酸は、以下の構造を有することが好ましい：
５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
（式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドである）。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｇ、ＡまたはＴである。他の実施形態では、５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’は、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される。
オリゴヌクレオチドは、単一のＧＧＧモチーフを有してもよく、複数のＧＧＧモチーフを有してもよい。一部の例では、オリゴヌクレオチドは、２〜１０個のＧＧＧモチーフおよび／またはＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣ ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧまたはＧＧＧＣモチーフを任意の組合せで含む。
少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチド内のどこに位置していてもよい。例えば、少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの、最初の１０ヌクレオチド内にある５’末端に位置していてもよい。あるいは、少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの３’末端において、３’末端における１０ヌクレオチド内に位置していてもよい。少なくとも１つのＧＧＧは、オリゴヌクレオチドの中央に位置していてもよい。
オリゴヌクレオチドとは、本明細書で使用される場合、任意の、核酸を含有する分子を指す。「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用されて、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基、および、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基と連結した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。この用語は、オリゴヌクレオシド（すなわち、オリゴヌクレオチドからリン酸を抜いたもの）およびポリマーを含有する任意の他の有機塩基も含むものとする。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ヌクレオリピドまたはそれらの組合せもしくは修飾されたものであってよい。核酸はまた、一本鎖、二本鎖または三本鎖であってよい。したがって、オリゴヌクレオチドは、一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および当業者に公知の１つまたは複数の修飾が組み入れられた他の一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および当業者に公知の１つまたは複数の修飾が組み入れられた他の二本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない多種多様の分子であってよい。
阻害性オリゴヌクレオチドは、本明細書では阻害性核酸とも称され、それらとしては、遺伝子内の標的配列、ＲＮＡ転写物、またはタンパク質を対象とするアンチセンス核酸（一本鎖または二本鎖）、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重へリックス形成オリゴヌクレオチド、およびアプタマーならびにその修飾された形態（単数または複数）が挙げられるがこれらに限定されない
アンチセンス核酸は、修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合型ポリマー核酸を包含し、マッチする配列に特異的に結合し、その結果、ペプチド合成の調節をもたらすことによって主に機能する。アンチセンス核酸は、標的ＲＮＡにワトソン・クリック塩基対合によって結合し、結合した配列のリボソームでの翻訳を立体的に遮断することによってまたはＲＮａｓｅ Ｈ酵素を活性化することによって妨げることにより、遺伝子発現を遮断する。アンチセンス分子はまた、ＲＮＡプロセシングまたは核から細胞質内への輸送に干渉することによってもタンパク質合成を変化させ得る。
本明細書で使用される場合、「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、生理的条件下で特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズし、それにより、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド、または修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドである核酸を記載するものである。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とハイブリダイズすると標的遺伝子の転写または翻訳に干渉するように設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性の程度は、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含めた、選択される特定の標的に依存することが当業者には理解されよう。
阻害性オリゴヌクレオチドとしては、細胞における遺伝子の発現を阻害するために有用な広範囲のＲＮＡｉに基づく様式、例えば、ｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドおよび／または変化させたｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドなども挙げられる。変化させたｓｉＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドは、効力、標的親和性、安全性プロファイルおよび／または安定性が変化するように、例えば、細胞内分解に対して抵抗性または部分的に抵抗性になるように、修飾されたものである。例えば、ホスホロチオエートなどの修飾をオリゴヌクレオチドに対して行って、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性、結合親和性および／または取り込みを増大させることができる。さらに、ｓｉＲＮＡの２’糖の位置における修飾およびホスホジエステル結合により、有効性を損なうことなく血清の安定性の改善が付与される。
リボザイムは、突然変異遺伝子の遺伝子発現を阻害する手段および標的化トランス−スプライシングにより突然変異体を補正する手段の両方としても提唱されている。リボザイム活性は、例えば、非特異的な核酸結合性タンパク質または促進因子オリゴヌクレオチドを使用することによって増強することができる。多標的リボザイム（連結またはショットガン）は、遺伝子抑制に関するリボザイムの効率を改善する手段として提案されている。三重へリックス手法が配列特異的な遺伝子抑制に関して調査されている。一部の場合において、三重へリックス形成オリゴヌクレオチドは、配列特異的に結合することが見いだされている。同様に、ペプチド核酸は、遺伝子発現を阻害することが示されている（Hanveyら、Antisense Res. Dev.、１巻（４号）：３０７〜１７頁、１９９１年；KnudsenおよびNielson Nucleic Acids Res.、２４巻（３号）：４９４〜５００頁、１９９６年；Taylorら、Arch. Surg.、１３２巻（１１号）：１１７７〜８３頁、１９９７年）。副溝結合性ポリアミドは、ＤＮＡ標的に配列特異的に結合し得、したがって、ＤＮＡレベルでの抑制に有用な小分子であり得る。使用することができる抑制戦略の多様なアレイとして、目的のタンパク質を標的とするように選択することができるＤＮＡおよび／またはＲＮＡアプタマーの使用が挙げられる。
一部の実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、核酸標的と１００％同一である。他の実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、核酸標的と少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または５０％同一である。「パーセント同一」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。パーセント同一性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。同一性の百分率としての表示は、比較される配列により共有される位置における同一のアミノ酸または核酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺ−ＦＡＳＴＡを含めた種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができ、ＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えば初期設定を用いて使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ.を通じて入手可能である。
アラインメントのための他の技法は、Methods in Enzymology、２６６巻：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis（１９９６年）、Doolittle編、Academic Press, Inc.、a division of Harcourt Brace & Co.、San Diego、Calif.、USAに記載されている。配列内のギャップが許容されるアラインメントプログラムを利用して配列をアラインメントすることが好ましい。配列内のギャップアラインメントが許容されるアルゴリズムの１つの型は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎである。Meth. Mol. Biol.、７０巻：１７３〜１８７頁（１９９７年）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列をアラインメントすることができる。代替の検索戦略では、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用し、それをＭＡＳＰＡＲコンピュータで実行する。ＭＰＳＲＣＨでは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して大規模並列処理コンピュータにおいて配列をスコア化する。この手法は、関連性が遠いマッチを拾い上げる能力を改善するものであり、また、小さなギャップおよびヌクレオチド配列の誤差に対して特に寛容性がある。核酸によりコードされるアミノ酸配列を使用してタンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースの両方を検索することができる。
阻害性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の標的遺伝子に対して部分的なまたは完全な相補性を有するように設計することができる。特定の標的遺伝子、阻害性オリゴヌクレオチドの性質および阻害性オリゴヌクレオチドの発現レベル（例えば、コピー数、プロモーターの強度に応じて）に応じて、手順により、標的遺伝子の部分的なまたは完全な機能喪失をもたらすことができる。細胞における遺伝子発現の定量化により、標的ｍＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルで同様の量の阻害が示され得る。
「遺伝子発現の阻害」とは、標的遺伝子に由来するタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物が存在しないことまたはそのレベルの観察可能な低下を指す。「特異性」とは、細胞の他の遺伝子に対する影響を顕在化させることなく標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞または生物体の表面的な性質の検査によって、または、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）などの生化学的技法によって確認することができる。アッセイに応じて、遺伝子発現の量の定量化により、本発明に従って処理していない細胞と比較して１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％を超える阻害の程度を決定することが可能になる。例として、阻害の効率は、細胞における遺伝子産物の量を評価することによって決定することができる。
一部の例では、阻害性オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡオリゴマーは、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖の形成において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖と比較してより大きな結合強度および特異性を有する。ＰＮＡはまた、広いｐＨ範囲にわたって、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する安定性も増大し、それにより、酵素による分解に対して抵抗性になる。
オリゴヌクレオチドは、二重鎖であってよい。本明細書で使用される場合、「二重鎖」とは、相補配列または部分相補配列が互いに水素結合した二本鎖核酸分子（単数または複数）を包含する。相補配列は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であり、これは、突出した一本鎖配列を有さず、したがって、平滑末端であることを意味する。他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの鎖は、異なる長さを有してよく、１つまたは複数の一本鎖突出部が生じる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループもしくはバルジを含有し得る。一部の実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にわたって二本鎖である。一部の実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、または１５カ所のミスマッチを含有する。
本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、例えば、糖部分、ホスホジエステル結合、および／または塩基においてなどで修飾することができる。本明細書で使用される場合、「糖部分」は、天然の修飾されていない糖、例えばペントース、リボースおよびデオキシリボース、修飾された糖および糖類似体を包含する。糖部分の修飾は、ヒドロキシル基のハロゲン、ヘテロ原子、または脂肪族基での置き換えを含んでよく、また、ヒドロキシル基の、例えば、エーテル、アミンまたはチオールとしての官能化を含んでよい。
糖部分の修飾は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでよく、これは、「メチル化」と称される。一部の例では、本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分のみまたは修飾されていない糖部分のみを含有し得、他の場合では、オリゴヌクレオチドは、いくつかの修飾された糖部分といくつかの修飾されていない糖部分を含有する。
一部の例では、修飾されたヌクレオモノマーは、糖が修飾されたまたは骨格が修飾されたリボヌクレオチドを含む。修飾されたリボヌクレオチドは、５’位において修飾された、ウリジンまたはシチジンなどの天然に存在しない塩基、例えば、５’−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５’−ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；およびＮ−アルキル化されたヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含有してよい。また、糖が修飾されたリボヌクレオチドでは、２’−ＯＨ基がＨ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（例えば、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）、またはＣＮ基で置き換えられていてよく、ここで、Ｒは、低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の実施形態では、修飾されたリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート基などの修飾された基によって置き換えられた隣接するリボヌクレオチドと接続するリン酸ジエステル基を有してよい。
一部の態様では、２’−Ｏ−メチル修飾は、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答などの望ましくない細胞ストレス応答を低減するために有益であり得る。修飾された糖としては、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルが挙げられる）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロが挙げられる）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、およびシアノなどが挙げられる。糖部分は、ヘキソースであってもよい。
「アルキル」という用語は、飽和型脂肪族基を包含し、例えば、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基が挙げられる。一部の実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ６）内に６個またはそれ未満の炭素原子、より好ましくは４個またはそれ未満の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造内に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくは、環構造内に５個または６個の炭素を有する。Ｃ１〜Ｃ６という用語は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を包含する。
別段の指定がない限り、アルキルという用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を包含し、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素がそれぞれ独立に選択される置換基で置き換えられたアルキル部分を指す。「アルケニル」という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能性のある置換が類似しているが、少なくとも１つの二重結合を含有する不飽和脂肪族基を包含する。別段の指定がない限り、アルケニルという用語は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を包含し、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素がそれぞれ独立に選択される置換基で置き換えられたアルケニル部分を指す。
「塩基」という用語は、公知のプリンおよびピリミジン複素環式塩基、デアザプリン、および類似体（複素環置換類似体、例えば、アミノエトキシフェノキサジンが挙げられる）、その誘導体（例えば、１−アルキル誘導体、１−アルケニル誘導体、複素環式芳香族誘導体および１−アルキニル誘導体）および互変異性体を包含する。プリンの例としては、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリン、およびキサンチンおよび類似体（例えば、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）およびそれらの誘導体が挙げられる。ピリミジンとしては、例えば、チミン、ウラシル、およびシトシン、およびそれらの類似体（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）が挙げられる。他の適切な塩基の例としては、２−アミノピリジンおよびトリアジンなどの非プリニル塩基および非ピリミジニル塩基が挙げられる。
「ヌクレオシド」という用語は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合により付加した塩基を包含する。好ましいヌクレオシドの例としては、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドとしては、遊離のカルボキシ基、遊離のアミノ基、または保護基を含み得るアミノ酸またはアミノ酸類似体と連結した塩基も挙げられる。適切な保護基は当技術分野で周知である（P. G. M. WutsおよびT. W. Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、Wiley-Interscience、New York、１９９９年を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド間結合に関して使用される「連結」という用語は、隣接するヌクレオモノマーと共有結合によりカップリングした天然に存在する修飾されていないリン酸ジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を包含する。本明細書で使用される場合、「代替の連結」または「修飾された連結」または「修飾されたヌクレオチド間結合」という用語は、隣接するヌクレオモノマーと共有結合によりカップリングしたネイティブなリン酸ジエステル基の任意の類似体または誘導体を包含する。代替の連結としては、リン酸ジエステル類似体、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびＰ−エチオキシホスホジエステル、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および非リン含有連結、例えば、アセタールおよびアミドが挙げられる。そのような代替の連結は当技術分野で公知である（例えば、Bjergardeら、１９９１年、Nucleic Acids Res.、１９巻：５８４３頁；Caruthersら、１９９１年、Nucleosides Nucleotides.、１０巻：４７頁）。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエート連結などの非加水分解性連結が好ましい。
一部の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’末端および５’末端を含む（環状オリゴヌクレオチド以外）。オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端は、例えば、３’連結または５’連結を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号およびＷＯ９８／１３５２６）。オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」を含めることによって抵抗性にすることができる。「ブロッキング基」という用語は、本明細書で使用される場合、合成（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）リン酸（ＰＯ３ ２−）、水素ホスホネート、またはホスホラミダイト）のための保護基またはカップリング基のいずれかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに付加することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す。「ブロッキング基」としては、オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エキソヌクレアーゼブロッキング基」、例えば修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造も挙げられる。
例示的な末端ブロッキング基としては、キャップ構造（例えば、７−メチルグアノシンキャップ）、例えば３’−３’または５’−５’末端反転を伴う反転ヌクレオモノマー（例えば、Ortiagaoら、１９９２年、Antisense Res. Dev.、２巻：１２９頁を参照されたい）、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、コンジュゲート）などが挙げられる。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾された糖部分を含んでよい。３’末端ヌクレオモノマーは、必要に応じてオリゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ分解を防止するブロッキング基により置換することができる３’−Ｏを含む。例えば、３’−ヒドロキシルを、３’→３’ヌクレオチド間結合を通じてヌクレオチドにエステル化することができる。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシ、および好ましくは、エトキシであってよい。必要に応じて、３’末端において３’→３’連結したヌクレオチドは代替の連結によって連結していてよい。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’にある３’→５’連結を、修飾された連結、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル連結にすることができる。最も５’にある２つの３’→５’連結が修飾された連結であることが好ましい。必要に応じて、５’末端ヒドロキシ部分を、リン含有部分、例えば、リン酸、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシホスフェートを用いてエステル化することができる。
一部の態様では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡの両方またはＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖もしくはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を含むキメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってよい。
オリゴヌクレオチドは、２〜１０００、２〜５００、２〜１００、５〜５００、５〜１００、１０〜５００、１０〜１００、８〜１００、８〜２００、１０〜５０、１５〜５００、１５〜１００、１５〜５０、２０〜５００、２０〜１００、２０〜５０、または２０〜４０塩基またはヌクレオチドの範囲の長さであることが好ましい。しかし、他のサイズの核酸も有用である。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格などの修飾された骨格を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル（ＰＯ）骨格を有する。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは混合型またはキメラＰＯおよびＰＳ骨格を有する。
本発明の阻害性核酸は、ナノ構造として製剤化することができる。ナノ構造は、代表的には、球状核酸（ＳＮＡ）である。ＳＮＡとは、本明細書で使用される場合、脂質付加された構造の周囲に半径方向に位置するオリゴヌクレオチドの密集構成を指す。一部の態様では、本発明は、脂質付加された構造の周囲に半径方向に位置するオリゴヌクレオチドの密集構成で構成されるＳＮＡであって、オリゴヌクレオチドが８〜２００ヌクレオチドの長さを有し、かつ少なくとも１つのＧＧＧを含む、ＳＮＡである。
脂質付加された構造は、少なくとも部分的に脂質で構成される球状構造である。一部の例では、脂質付加された構造は、全体が脂質で構成される。脂質は、例えば、脂質単分子層または脂質二重層に配置することができる。脂質は、中空の中央の周囲に配置することができ、したがって、中空コアを形成することができる。あるいは、脂質は、コアを形成する非脂質材料の周囲に配置することができる。コアは、中空であっても中実（多孔質コアが挙げられる）であってもよい。中空コアは、例えば、脂質で囲まれた空の空間、すなわちリポソームコア、または非脂質材料で囲まれた空洞であってよい。中実コアは、中空の中央を有さない球状材料である。中実コアは、多孔質材料または内部に１つまたは複数の割れ目を有する他の材料を含む。
球状という用語は、本明細書で使用される場合は、概略的な形状を指し、完全な球体または丸い形状を意味するものではなく、それに限定されない。球状とは、不完全なものを含む。
中実コアは、貴金属（金、銀）、遷移金属（鉄、コバルト）および金属酸化物（シリカ）が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知の多種多様な材料から構築することができる。さらに、これらのコアは、不活性、常磁性、または超常磁性であってよい。これらの中実コアは、記載されている材料の純粋な組成物、または任意の数の材料の混合物の組合せ、または材料の層状組成物としてのいずれかから構築することができる。さらに、中実コアは、両親媒性ブロック共重合体、ポリスチレンなどの疎水性ポリマー、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および当業者に公知の他の生体適合性ポリマーなどのポリマーコアで構成されるものであってよい。
あるいは、コアは、殻材料の中央領域内に少なくともいくらかの空間を有する中空コアであってよい。中空コアとしては、リポソームコアが挙げられる。リポソームコアは、本明細書で使用される場合、脂質二重層を形成する脂質またはリン脂質の構成成分によって形成される、中央に位置するコア区画を指す。「リポソーム」は、人工的な、種々のサイズおよび構造の自己閉鎖型小胞構造であり、１つまたはいくつかの膜に水性コアが封入されている。最も代表的には、リポソーム膜は、親水性頭部基が水性環境側に配向し、脂質鎖が親油性コアに埋まった脂質二重層膜から形成される。リポソームは、同様に、他の両親媒性単量体分子およびポリマー分子、例えば、ブロック共重合体のようなポリマーなど、またはポリペプチドもしくは脂質単分子層から形成することもできる。単層小胞は、水性空間が単一の膜に封入されていることにより定義されるリポソームである。対照的に、オリゴ−または多重膜小胞は、いくつかの膜でできている。代表的には、膜は、厚さおよそ４ｎｍであり、天然起源または合成起源のリン脂質などの両親媒性脂質で構成される。必要に応じて、膜の性質は、ステロールまたはコール酸誘導体などの他の脂質を組み入れることによって改変することができる。
脂質二重層は脂質分子の層２つで構成され、脂質単分子層は脂質分子の層１つで構成される。層内の各脂質分子は、隣接する脂質二重層に対して実質的に並行に配向しており、二重層を形成する２つの層の分子の極性末端は水相に露出しており、非極性末端は互いに隣接している。リポソームコアの中心の水性領域は、空であってもよく、水、水性エマルション、オリゴヌクレオチド、または他の治療剤もしくは診断剤で完全にまたは部分的に満たされていてもよい。
「脂質」とは、水に不溶性の脂肪、脂質、原形質のアルコール−エーテル可溶性構成物を包含する一般的な用語である。脂質は、通常、親水性部分および疎水性部分からなる。水中では、脂質は、自己組織化して、親水性部分（頭部基）が水相側に配向し、親油性部分（アシル鎖）が二重層コアに埋まった二重層膜を形成することができる。脂質は、２つの親水性部分も含んでよい（ボラ両親媒性物質（ｂｏｌａ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ））。その場合、膜は、単一の脂質層から形成されていてよく、二重層ではなくてよい。現状での脂質の典型的な例は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、硫脂質、アミノ脂質、色素脂質、および脂肪酸である。この用語は、天然に存在する脂質および合成脂質の両方を包含する。本発明に関連して好ましい脂質は、ステロイドおよびステロール、特に、コレステロール、リン脂質、例えばホスファチジル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ならびにスフィンゴミエリンである。脂肪酸が存在する場合、その脂肪酸は、最大６つの二重結合を含有する約１２〜２４炭素鎖の長さになり得る。脂肪酸は、グリセロール由来であり得る骨格に連結している。１つの脂質内の脂肪酸は、異なる（非対称の）ものであってもよく、１つの脂肪酸鎖、例えば、リゾレシチンのみが存在してもよい。特に、非カチオン性脂質が、卵黄、ウシ心臓、脳、肝臓または大豆から精製されたレシチン（ホスファチジルコリン）などの天然の供給源に由来するものである場合、混合製剤も可能である。
リポソームコアは、当業者に公知の１種または複数の脂質、例えば、種々の長さおよび飽和状態の、スフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、スフィンゴシンリン酸、メチル化スフィンゴシンおよびメチル化スフィンガニン、セラミド、セラミドリン酸、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、およびフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体など、種々の長さ、飽和状態のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールリン酸、ＬＰＩ、カルジオリピン、リゾカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸、（ジアシルグリセロ）リン酸、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、およびプラスマロゲン、およびそれらの誘導体など、異なる長さ、飽和状態のステロール、例えば、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラソステロール、ジオスゲニン、シトステロール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン性脂質、エーテルカチオン性脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、および多価不飽和ステロール、およびそれらの誘導体などが挙げられるがこれらに限定されないものから構築することができる。
オリゴヌクレオチドは、脂質付加された構造の外側に位置するか、またはカップリングする。カップリングは、直接的であっても間接的であってもよいか、または可逆的であっても不可逆的であってもよい。可逆的にカップリングした化合物は、感受性連結を使用して互いに会合させてある。感受性連結とは、生理的条件下で分離しやすい連結である。例えば、ワトソン・クリック塩基対合は、感受性連結である。切断可能なリンカーも、感受性連結である。
オリゴヌクレオチドの密集構成は、互いに極めて近傍にあるオリゴヌクレオチドの集合である。少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、脂質付加された構造の外側に位置する。一部の実施形態では、少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００オリゴヌクレオチドまたはその任意の範囲の組合せが、脂質付加された構造の外側にある。一部の実施形態では、１〜１０００、２〜１０，０００、１０〜５００、５０〜２５０、５０〜３００、１，０００〜１０，０００、２，０００〜１０，０００、３，０００〜１０，０００、４，０００〜１０，０００、５，０００〜１０，０００、６，０００〜１０，０００、７，０００〜１０，０００、８，０００〜１０，０００、９，０００〜１０，０００、または９，５００〜１０，０００オリゴヌクレオチドが表面上に存在する。
一部の例では、阻害性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド殻を形成する。オリゴヌクレオチド殻は、脂質付加された構造の外部表面の利用可能な表面積の少なくとも５０％がオリゴヌクレオチドを含む場合に形成される。一部の実施形態では、脂質付加された構造の外部表面の利用可能な表面積の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％ ９８％または９９％がオリゴヌクレオチドを含む。
オリゴヌクレオチド殻のオリゴヌクレオチドは、種々の方向に配向することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを半径方向に外側に配向する。これらのオリゴヌクレオチドの方向は、コアに対して５’遠位／３’末端、またはコアに対して３’遠位／５’末端のいずれであってもよい。一実施形態では、１つまたは複数の異なるオリゴヌクレオチドが単一のＳＮＡの同じ表面上に存在する。全ての場合において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが表面上に存在するが、最大１０，０００個存在し得る。
オリゴヌクレオチドは、コアに、または互いに、および／または活性薬剤などの他の分子に、直接またはリンカーを通じて間接的に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、リンカーと５’末端または３’末端を介してコンジュゲートすることができ、例えば、［配列、５’−３’］−リンカーまたはリンカー−［配列、５’−３’］である。ナノ構造のオリゴヌクレオチドの一部または全部を互いに共有結合または非共有結合を通じて直接または間接的に連結することができる。１つのオリゴヌクレオチドと別のオリゴヌクレオチドの連結は、そのオリゴヌクレオチドとリポソームコアの連結に加えたものであってもそれに代わるものであってもよい。オリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数はまた、代替治療剤などの他の分子と連結することもできる。オリゴヌクレオチドと治療薬は、共有結合または非共有結合を通じて直接または間接的に連結することができる。
少なくとも阻害性オリゴヌクレオチドで形成されるオリゴヌクレオチド殻は、脂質付加された構造の表面またはコアに、１つまたは複数のリンカー分子、例えば１つまたは複数のチオールを含有する任意の化学構造、例えば、種々の鎖長のアルカンチオール、環状ジチオール、リポ酸、または当業者に公知の他のチオールリンカーなどが挙げられるがこれらに限定されないもの、を通じて繋ぎ止めることができる。
リポソームコアを含有する実施形態では、前記オリゴヌクレオチド殻は、以下が挙げられるがこれらに限定されない１つまたは複数のリンカー分子とのコンジュゲーションを通じて前記リポソームコアの表面に繋ぎ止めることができる：トコフェロール、種々の長さおよび飽和状態のスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、スフィンゴシンリン酸、メチル化スフィンゴシンおよびスフィンガニン、セラミド、セラミドリン酸、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、およびフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体など、種々の長さ、飽和状態のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールリン酸、ＬＰＩ、カルジオリピン、リゾカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸、（ジアシルグリセロ）リン酸、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、およびプラスマロゲン、およびそれらの誘導体など、異なる長さ、飽和状態のステロール、例えば、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラソステロール、ジオスゲニン、シトステロール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン性脂質、エーテルカチオン性脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、および多価不飽和ステロールおよびそれらの誘導体など。
一部の実施形態では、異なるサイズのＰＥＧを構造に組み入れて、１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａまでのサイズが挙げられるがこれらに限定されない、ｉｎ ｖｉｖｏにおける性質を変化させる。
ナノ構造はまた、活性薬剤も含んでよい。活性薬剤とは、本明細書で使用される場合、細胞または被験体にいくらかの治療的または診断的利点をもたらすことが可能な分子である。活性薬剤は、構造に、外に面するオリゴヌクレオチドにより、共有結合性または非共有結合性の、例えば、ワトソン／クリックハイブリダイゼーションを通じて付加することができる。その代わりにまたはそれに加えて、活性薬剤は、リポソーム二重層に、疎水性部分とのコンジュゲーションによって組み入れることができる。さらに別の実施形態では、活性薬剤は、リポソームの内部水層の内側に組み入れることができる。
一実施形態では、活性薬剤とリポソームナノ構造を、オリゴヌクレオチド殻との相互作用を介してコンジュゲートする。一部の例では、活性薬剤−オリゴヌクレオチドコンジュゲートとコアをオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって連結する。言い換えれば、このオリゴヌクレオチドを相補的なまたは部分的に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、二重鎖または部分的な二重鎖を形成する。二重鎖のオリゴヌクレオチドの一方または両方をコアに直接連結し、外に面する（脂質二重層の外側にある）かまたは内部にある（内部水層にある）コアに直接連結していない活性薬剤を二重鎖のオリゴヌクレオチドの一方または両方に連結する。別の実施形態では、活性薬剤とリポソームナノ構造を、コアとの直接相互作用によってコンジュゲートする。活性薬剤は、以下が挙げられるがこれらに限定されない１つまたは複数のリンカー分子とのコンジュゲーションを通じて前記リポソームコアの表面に繋ぎ止めることができる：トコフェロール、種々の長さおよび飽和状態のスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴシン、スフィンゴシンリン酸、メチル化スフィンゴシンおよびスフィンガニン、セラミド、セラミドリン酸、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、およびフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体など、種々の長さ、飽和状態のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールリン酸、ＬＰＩ、カルジオリピン、リゾカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸、（ジアシルグリセロ）リン酸、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、およびプラスマロゲン、およびそれらの誘導体など、異なる長さ、飽和状態のステロール、例えば、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラソステロール、ジオスゲニン、シトステロール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン性脂質、エーテルカチオン性脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、および多価不飽和ステロール、およびそれらの誘導体など。
本発明はまた、細胞における遺伝子発現を低減するための阻害性オリゴヌクレオチドの使用も包含する。本方法は、遺伝子発現を低減するために、細胞を本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドまたはナノ構造のいずれかと接触させることによって実現される。例えば、遺伝子発現を低減させるために、少なくとも１つのＧＧＧモチーフを有する阻害性オリゴヌクレオチドを有するヌクレオチド両親媒性物質を含むナノ構造を細胞に送達することができる。
ヌクレオチド両親媒性物質とは、本明細書で使用される場合、最小限においては、弱い非共有結合性の化学結合を含めた相互作用を通じて互いに会合した阻害性オリゴヌクレオチドと脂質とで構成される超分子構造である。脂質は、オリゴヌクレオチドの末端を捕捉するリポソーム構造に組み立てることができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド両親媒性物質は、本明細書に記載の球状核酸（ＳＮＡ）である。
ヌクレオチド両親媒性物質は、全体的にまたは部分的に、ヌクレオリピドで構成され得る。核酸構成成分と親油性鎖構成成分の両方を有するヌクレオリピドは、特異的な塩基−塩基認識と組み合わせて協同的な非共有結合性の相互作用をなすことが可能な官能基の多様性を含むので、これらの超分子構造を構築するための構築ブロックとして有用である。ヌクレオリピドは、プリン塩基（アデニンまたはグアニン）またはピリミジン塩基（シトシン、チミンまたはウラシル）のいずれかに由来する極性頭部を有し得る。これらの塩基は、πスタッキングおよび水素結合を通じて相互作用し得、各塩基−塩基モチーフは異なる結合特性を示す。核酸内に存在する塩基対は、ＤＮＡ二本鎖ではアデニン−チミンおよびグアニン−シトシン、またはＲＮＡ二本鎖ではアデニン−ウラシルおよびグアニン−シトシンである。ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の各鎖は、相補的な塩基配列により形成される他の鎖とＨ結合を通じてカップリングする。
遺伝子発現は、細胞をナノ構造の形態の阻害性オリゴヌクレオチドと接触させた場合に、細胞を遊離の阻害性オリゴヌクレオチドと接触させた場合よりも大きな程度低減され得る。遺伝子発現の相対レベルは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。例えば、いくつかの方法が本明細書に記載されている。当業者には他の方法が知られている。
阻害性オリゴヌクレオチドは、標的配列と相補的である。多数の標的が利用可能であり、公知である。一部の実施形態では、標的は、ＴＮＦ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびそれらの受容体、成長または分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）、癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３およびＷＴ１）、酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ（hycroxylase）、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（dehycrogenase）、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ（peptidease）、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）、およびＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９）からなる群から選択される。一部の実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、および遺伝性障害を処置するための薬剤からなる群から選択される治療剤である。
阻害性オリゴヌクレオチドで構成されるナノ構造は、同じオリゴヌクレオチドの複数のコピーを有してよい。あるいは、この構造は、異なる配列を有する複数の阻害性オリゴヌクレオチドを含んでよい。これらの異なる阻害性オリゴヌクレオチドは、試験または療法の目的に応じて、同じ標的を対象とするものであってもよく、異なる標的を対象とするものであってもよい。
本発明はまた、症状または疾患を有する被験体を処置するための方法も包含する。障害は、例えば、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶反応または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と組み合わさった乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎、および慢性尋常性乾癬であってよい。
ナノ構造は、障害を処置するための他の関連しない治療剤と組み合わせることができる。ナノ構造および／または他の治療剤は、同時にまたは逐次的に投与することができる。他の治療剤を同時に投与する場合、同じ製剤として投与することもでき、別々の製剤としてだが同時に投与することもできる。他の治療剤は、他の治療剤とナノ構造および治療剤の投与が時間的に離れている場合には、互いと、およびナノ構造と逐次的に投与する。これらの化合物の投与間の時間の分離は、わずか数分間であってもよく、より長く、例えば、数日間、数週間、数カ月間であってもよい。
阻害性オリゴヌクレオチドまたは阻害性オリゴヌクレオチドを含有するナノ構造の「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量を指す。例えば、疾患を処置または防止するための、阻害性オリゴヌクレオチドまたは阻害性オリゴヌクレオチドを含有するナノ構造の有効量は、疾患の進行もしくはさらなる悪化を防止するために必要な量、または、阻害性オリゴヌクレオチドもしくは阻害性オリゴヌクレオチドを含有するナノ構造が存在しなければ生じる疾患の重症度もしくは持続時間の量を減少させるために必要な量である。本明細書において提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物の中で選択を行い、効力、相対的な生物学的利用能、患者の体重、有害な副作用の重症度および好ましい投与形式などの因子の重み付けを行うことにより、実質的な毒性を引き起こさず、それでも特定の被験体を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。任意の特定の適用に関する有効量は、処置される疾患または症状、投与される特定のナノ構造、被験体のサイズ、または疾患もしくは症状の重症度などの因子に応じて変動し得る。当業者は、特定のナノ構造の有効量を、過度な試行錯誤を必要とせずに実験により決定することができる。
本明細書に記載の化合物の被験体用量は、代表的には、約０．１μｇから１０，０００ｍｇまで、より代表的には、１日当たり約１μｇから８０００ｍｇまで、最も代表的には、約１０μｇから１００μｇまでにわたる。被験体の体重に関して規定すると、代表的な投与量は、１日当たり約０．１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで、より代表的には、１日当たり約１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで、最も代表的には、１日当たり約１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでにわたる。
本発明の阻害性オリゴヌクレオチドまたは阻害性オリゴヌクレオチドを含有するナノ構造（集合的にＳＮＡと称する）は、治療および／または診断への使用のために被験体にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて送達することもでき、または研究目的のためにｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用することもできる。ＳＮＡは、単独で、または、ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与のための、液体、例えば生理食塩水、もしくは散剤などの任意の適切な医薬担体中で投与することができる。ＳＮＡはまた、より大きな担体粒子と、または投与デバイス内に入れて同時送達することもできる。ＳＮＡは、製剤化してもよく製剤化しなくてもよい。本発明の製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、アジュバント、および必要に応じて、他の治療用成分を常套的に含有し得る、薬学的に許容される溶液中に入れて投与することができる。一部の実施形態では、ＳＮＡをローション剤（例えば、ａｑｕａｐｈｏｒ）などの物質と混合して被験体の皮膚に投与し、それにより、ＳＮＡが被験体の皮膚を通して送達される。ＳＮＡは滅菌することもできる。
本発明の他の実施形態では、ＳＮＡを常套的なスケジュールで投与する。「常套的なスケジュール」とは、本明細書で使用される場合、所定の指定された期間を指す。常套的なスケジュールは、スケジュールが所定のものである限りは、長さが同一の期間も異なる期間も包含し得る。例えば、常套的なスケジュールは、ＳＮＡを毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、月に１回または任意の設定された日数または週数に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、７カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、１０カ月に１回、１１カ月に１回、１２カ月に１回などで投与することを含み得る。あるいは、所定の常套的なスケジュールは、ＳＮＡを、最初の週は毎日、その後、数カ月にわたって月に１回、次いで、その後は３カ月に１回投与することを含み得る。適切なスケジュールがある特定の日の投与を伴うことが前もって決定される限りは、任意の特定の組合せが常套的なスケジュールに包含される。
治療における使用に関しては、有効量のＳＮＡを、ＳＮＡを所望の細胞に送達する任意の方式によって被験体に投与することができる。医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって実現することができる。投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、粘膜、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、皮膚、直腸、および直接注射によるものが挙げられるがこれらに限定されない。
被験体とは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、霊長類、例えば、サル、および、魚（水産養殖種）、例えば、サケが挙げられるがこれらに限定されない、ヒトまたは脊椎動物を意味するものとする。したがって、本発明は、非ヒト被験体における疾患を処置するために使用することもできる。
本明細書で使用される場合、障害に関して使用される、処置する（ｔｒｅａｔ）、処置した（ｔｒｅａｔｅｄ）、または処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、被験体の疾患の発症に対する抵抗性を増大させる、または、言い換えれば、被験体が疾患を発症する可能性を低下させる予防的処置、ならびに、被験体が疾患を発症した後に疾患と闘うためまたは疾患が悪化するのを防止するための処置を指す。
別の態様では、本発明は、前に考察した組成物のうちの１つまたは複数を含むキットに関する。「キット」とは、本明細書で使用される場合、一般には、本発明の組成物のうちの１つまたは複数、および／または、例えば、以前に記載されている、本発明に関連する他の組成物を含むパッケージまたは組み立て品を定義するものである。キットの組成物のそれぞれは、存在する場合、液体の形態で（例えば、溶液中）、または固体の形態で（例えば、乾燥粉末）もたらすことができる。ある場合では、組成物のいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもよくされなくてもよい適切な溶媒または他の種を添加することにより、構成可能であり得る、またはそうでなければ、加工可能であり得る（例えば、活性な形態に）。例えば、本発明に関連する他の組成物の例としては、例えば試料および／または被験体への特定の使用のための、組成物構成成分の使用、投与、改変、組み立て、保管、包装、調製、混合、希釈、および／または保存のための溶媒、界面活性物質、希釈剤、塩、緩衝液、乳化剤、キレート化剤、充填剤、抗酸化剤、結合剤、増量剤、防腐剤、乾燥剤、抗菌薬、針、シリンジ、包装材料、チューブ、ビン、フラスコ、ビーカー、ディッシュ、フリット、フィルター、リング、クランプ、ラップ、パッチ、容器、テープ、接着剤などが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明に関連するキットは、ＳＮＡの１つまたは複数の構成成分を包含する。例えば、キットは、リポソームコアを形成するためのリポソームまたは中実コアを形成するための金属、およびまたはナノ構造の外面用の阻害性オリゴヌクレオチドを含んでよい。キットは、１つまたは複数の他の治療剤も含んでよい。
本発明のキットは、一部の場合では、説明書が本発明の組成物に関連することが当業者に理解されるような方式で本発明の組成物に関連して提供される任意の形態の説明書を含む。例えば、説明書は、組成物および／またはキットに付随する他の組成物の使用、改変、混合、希釈、保存、投与、組み立て、保管、包装、および／または調製に関する説明書を含んでよい。一部の場合では、説明書は、組成物の使用、例えば、例えば試料への特定の使用に関する説明書も含んでよい。説明書は、そのような説明書を含有する適切なビヒクルとして当業者が理解できる任意の形態、例えば、任意の方式で提供される、書面もしくは公表物、口頭、可聴（例えば、電話による）、デジタル、光学的、視覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）または電子的伝達（インターネットまたはウェブに基づく伝達を含む）で提供されてよい。
本発明は、さらなる限定とは決して解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本出願全体を通して引用されている全ての参考文献（参考論文、発行された特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の全内容は、これにより明白に参照により組み込まれる。
（均等物）
当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を理解するか、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本明細書に開示されている特許文書を含めた全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書に記載されている本発明をより詳細に理解することができるように、以下の実施例を記載する。本出願に記載されている実施例は、本明細書において提供される化合物、医薬組成物、および方法を例示するために提供され、いかなる形でもそれらの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
（配列の特徴とアンチセンスＳＮＡの効力の相関）
（方法）
Ｉ．リポソーム球状核酸の合成
直径およそ５０ｎｍのジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）リポソームを押出しによって合成した。ＲＮＡｓｅフリーおよび滅菌条件下で、活性対照および陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドにリポソームを添加し、一晩静置した。オリゴヌクレオチドの３’末端における脂質がＤＯＰＣ二重層に挿入され、それにより、リポソームの外側が核酸により官能化された。最終的にリポソーム当たり１００個のアンチセンス鎖をローディングすることでこれらのＳＮＡを官能化した。リポソームＳＮＡは、核酸を基本的に定量的に組み入れることが見いだされている。ＳＮＡをトランスフェクションの日まで４℃で保管し、トランスフェクションの日に使用する前に室温まで温めた。
ＩＩ．細胞培養およびトランスフェクション
初代ヒト胎児ケラチノサイト（ＨＫＦ）を、７０μＭの塩化カルシウムおよび１％ヒトケラチノサイト成長補充剤（ＨＫＧＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ−００１−Ｋ）を補充したＭｅｄｉｕｍ １５４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍ−１５４ＣＦ−５００）中で維持した。初代新生児ヒト表皮メラノサイト（ＨＥＭｎ）を、１％ヒトメラノサイト成長補充剤（ＨＭＧＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ−００２−５）を補充したＭｅｄｉｕｍ ２５４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍ−２５４−５００）中で維持した。ＨＦＫ実験に関しては、細胞を５回継代した時点で、１ウェル当たり細胞１５，０００個の密度で９６ウェル組織培養処理プレートに播種した。ＨＥＭｎ実験に関しては、細胞を、７〜１２回継代した時点で、ＨＦＫと同様に播種した。ＨＦＫ細胞は、核因子−カッパＢ１（ＮＦ−κＢ１）、インターロイキン−２２受容体Ａ１（ＩＬ−２２ＲＡ１）、インターロイキン−１７受容体Ａ１（ＩＬ−１７ＲＡ１）、または糖化反応終末産物の受容体（ＲＡＧＥ）を標的とする阻害性ＳＮＡおよび非標的対照ＳＮＡを用いて４連で処理した。全ての実験において、ＳＮＡ濃度は、新鮮な維持培地中５ｎＭ（対応するアンチセンス濃度は５００ｎＭ）であった。ＨＥＭｎ細胞は、チロシナーゼ（ＴＹＲ）を標的とする阻害性ＳＮＡおよび非標的対照ＳＮＡを、新鮮な維持培地中５ｎＭ（アンチセンス濃度５００ｎＭ）の最終的なＳＮＡ濃度を用いて４連で処理した。ＳＮＡを細胞と一緒に２４時間インキュベートした。
ＩＩＩ．ＲＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ
２４時間のＳＮＡトランスフェクション後に細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解させた。ＲＮＡを溶解物からＲＮＥａｓｙ ９６ウェルキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して単離した。次いで、ｃＤＮＡをＲＮＡ単離物からｃＤＮＡ大容量逆転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。ＲＮＡ単離物をサーモサイクラーにおいて２５℃で１０分、３７℃で９０分、８５℃で５分処理し、４℃で保持してｃＤＮＡを生成した。３８４ウェル光学反応プレート（Ｒｏｃｈｅ）の反応ウェル当たり６μＬの合成ｃＤＮＡ、４．６６μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）、０．４７μＬの遺伝子特異的ＦＡＭ標識プローブおよびプライマー、ならびに０．３７μＬのヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）特異的ＨＥＸ標識プローブおよびプライマーを含有する混合物を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＮＦ−κＢ１、ＩＬ２２ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＲＡＧＥ、ＴＹＲおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーおよびプローブセットを、公知のヒトゲノム配列（それぞれＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３９９８．３、ＮＭ＿０２１２５８．３、ＮＭ＿０１４３３９．６、ＮＭ＿００１１３６．４、ＮＭ＿０００３７２．４およびＮＭ＿００２０４６．４）を使用して設計し、「ｂｌａｓｔｎ」分析（ＮＣＢＩ）により特異的であることが見いだされた。使用したオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、下記の表に見いだすことができる。ＲＴ−ＰＣＲ反応をＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０において以下のサイクルプログラミング：９５℃で１０分間の最初の変性、次いで、９５℃で１０秒間の変性を５０サイクル、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１秒間の伸長を用いて２連で行った。第２の誘導体法を用いた分析によってＣｐ値を得た。相対的な遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）およびΔΔ−Ｃｐ法を用いた正規化によって決定した。活性なＳＮＡのそれぞれをその対照ＳＮＡと比較した。
Figure 2018503377
ＳＮＡノックダウンデータを以下のアンチセンス鎖の特徴に応じて解析した：Ｇ含有量、Ｇダブレット、トリプレット、およびクアドラプレットの数、ならびに鎖自己二量体化ΔＧ（表１）。この解析では、５つの異なる遺伝子（表２〜６）に対するノックダウンデータを統合した。
（結果）
データセットの配列にＧＧＧモチーフが存在することにより、特異的なモチーフを伴わないような配列に対してノックダウンの統計的に有意な増大が生じる。
Figure 2018503377
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Figure 2018503377
本出願は、種々の発行された特許、公開特許出願、学術論文、および他の刊行物を参照し、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書の間に矛盾がある場合には、本明細書を優先するものとする。さらに、先行技術の範囲内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１つまたは複数から明確に排除され得る。そのような実施形態は当業者に公知であるとみなされるので、排除について本明細書に明確に記載されていなくとも排除され得る。任意の理由で、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の特定の本発明の実施形態が任意の請求項から排除され得る。
当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を理解するまたは確認することができる。本明細書に記載されている実施形態の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。以下の特許請求の範囲において定義されている本発明の主旨または範囲から逸脱することなく、本記載に対する種々の変化および改変を行うことができることが当業者には理解されよう。

Claims (51)

  1. 脂質付加された構造の周囲に半径方向に位置するオリゴヌクレオチドの密集構成を含む球状核酸（ＳＮＡ）であって、前記オリゴヌクレオチドが、８〜２００ヌクレオチドの長さを有し、かつ、少なくとも１つのＧＧＧを含む、球状核酸（ＳＮＡ）。
  2. 前記オリゴヌクレオチドが、以下の構造：
    ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
    （式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドである）を有する、請求項１に記載のＳＮＡ。
  3. Ｘ１が、ＧおよびＡからなる群から選択される、請求項２に記載のＳＮＡ。
  4. ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’が、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される、請求項２または３に記載のＳＮＡ。
  5. 前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  6. 前記オリゴヌクレオチドが、２〜５個のＧＧＧモチーフを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  7. 前記ＳＮＡ構造が、２〜１０，０００オリゴヌクレオチドを含有する、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  8. デンドリマーではない、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  9. 前記オリゴヌクレオチドが、コアに連結している、請求項１から８までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  10. 前記コアが、前記脂質付加された構造であり、かつリポソームコアである、請求項９に記載のＳＮＡ。
  11. 前記リポソームコアが、１つの型の脂質で構成される、請求項１０に記載のＳＮＡ。
  12. 前記リポソームコアが、２〜１０種の異なる脂質で構成される、請求項１０に記載のＳＮＡ。
  13. 前記コアが、中実または中空コアである、請求項９に記載のＳＮＡ。
  14. 前記コアが、不活性、常磁性または超常磁性である、請求項９に記載のＳＮＡ。
  15. 前記コアが、中実コアである、請求項９に記載のＳＮＡ。
  16. 前記中実コアが、貴金属、例えば金および銀、遷移金属、例えば鉄およびコバルト、金属酸化物、例えばシリカ、ポリマーまたはこれらの組合せで構成される、請求項１５に記載のＳＮＡ。
  17. 前記コアがポリマーコアであり、前記ポリマーコアが、両親媒性ブロック共重合体、疎水性ポリマー、例えばポリスチレン、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および他の生体適合性ポリマーで構成される、請求項１６に記載のＳＮＡ。
  18. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＳＮＡの外表面に露出している５’末端を有する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  19. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＳＮＡの外表面に露出している３’末端を有する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  20. 前記オリゴヌクレオチドが前記コアに直接連結している、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  21. 前記オリゴヌクレオチドが前記コアにリンカーを通じて間接的に連結している、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  22. 前記オリゴヌクレオチドがヌクレオリピドである、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  23. 前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１から４までまたは請求項６から１７までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  24. 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  25. 前記オリゴヌクレオチドが直鎖状である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  26. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖であり、かつ突出部を有さない、請求項１から２４までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  27. 前記少なくとも１つのＧＧＧが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端において、最初の１０ヌクレオチド内に位置する、請求項１から２６までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  28. 前記少なくとも１つのＧＧＧが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端において、３’末端における１０ヌクレオチド内に位置する、請求項１から２６までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  29. 前記少なくとも１つのＧＧＧが、前記オリゴヌクレオチドの中央に位置する、請求項１から２６までのいずれか一項に記載のＳＮＡ。
  30. 遺伝子発現を低減させるための方法であって、
    細胞を、少なくとも１つのＧＧＧモチーフを有する阻害性オリゴヌクレオチドを有するヌクレオチド両親媒性物質を含むナノ構造と接触させるステップを含み、遺伝子発現が、前記細胞を遊離の阻害性オリゴヌクレオチドと接触させた場合よりも大きな程度低減される、方法。
  31. 前記ヌクレオチド両親媒性物質が、球状核酸（ＳＮＡ）である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＳＮＡが、請求項１から２９までのいずれかに記載のＳＮＡである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３０または３１に記載の方法。
  34. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、以下の構造：
    ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
    （式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドである）を有する、請求項３０または３１に記載の方法。
  35. Ｘ１が、ＧおよびＡからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’が、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、ＴＮＦ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびそれらの受容体、成長因子または分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）、癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３およびＷＴ１）、酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）、およびＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９）からなる群から選択される標的配列と相補的である、請求項３０から３６までのいずれかに記載の方法。
  38. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、および遺伝性障害を処置するための薬剤からなる群から選択される治療剤である、請求項３０から３６までのいずれかに記載の方法。
  39. 自己免疫疾患、感染症、移植拒絶反応または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と組み合わさった乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎、および慢性尋常性乾癬からなる群から選択される障害を処置するための方法である、請求項３０から３６までのいずれかに記載の方法。
  40. 少なくとも１つのＧＧＧを含むヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドと連結した脂質を含むヌクレオリピドを含む阻害性オリゴヌクレオチドであって、８〜２００ヌクレオチドの長さを有し、前記ヌクレオチドの３０％〜９０％が修飾されている、阻害性オリゴヌクレオチド。
  41. 以下の構造：
    ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’
    （式中、Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、任意のヌクレオチドである）を有する、請求項４０に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  42. Ｘ１が、ＧおよびＡからなる群から選択される、請求項４１に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  43. ５’Ｘ１ＧＧＧＸ２３’が、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＴ、ＡＧＧＧおよびＧＧＧＣからなる群から選択される、請求項４１または請求項４２に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  44. アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４０から４３までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  45. ２〜５個のＧＧＧモチーフを含む、請求項４０から４４までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  46. 前記脂質が、ステアリルまたはコレステロールである、請求項４０から４５までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  47. 前記ヌクレオチド修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項４０から４６までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  48. 前記ヌクレオチド修飾が、２’Ｏメチル修飾である、請求項４０から４６までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  49. 前記ヌクレオチドの４０％〜７０％が修飾されている、請求項４０から４６までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  50. 少なくとも４０％のＧで構成される、請求項４０から４９までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
  51. 少なくとも５０％のＧで構成される、請求項４０から４９までのいずれか一項に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
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