JP2013515479A - 炎症性障害を治療するための分子 - Google Patents

炎症性障害を治療するための分子 Download PDF

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Abstract

本発明は、炎症性障害を治療するための2種のオリゴヌクレオチド:C5aの量を減らすための、C5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができるオリゴヌクレオチド、および可溶性IL−1RAcPの量を増やすための、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、炎症性障害を予防または治療するための前記オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、炎症性障害を治療することができる2種のオリゴヌクレオチド:C5aの量を減らすための、C5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、および可溶性IL−1RAcPの量を増やすための、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を提供する。本発明は、さらに、炎症性障害を予防または治療するための前記分子の使用を提供する。

リウマチ様関節炎(RA)および皮膚炎を含む多数の炎症性疾患において、過剰且つ不適切な補体活性化並びにIL−1の過剰な血漿濃度が生じる。

補体系は先天的免疫系の一部であり、バクテリアのような微生物およびその他の異質で異常な細胞(例えばアポトーシス細胞)から宿主を保護するように作用する。しかしながら、本来保護的な補体活性化は、宿主に損傷をもたらす場合もある。補体系の5番目成分であるC5は、1679アミノ酸から成る糖タンパク質であり、2つのジスルフィド結合を有したポリペプチド鎖C5αおよびC5βから成る(2)。免疫複合体(IC)によって活性化されたC5転換酵素による活性化の後、C5はC5aとC5bとに分割される。C5aは、炎症をもたらす強力な生物学的活性を示す(1)(3)。それは、好中球、好酸球、単球およびTリンパ球といった炎症細胞の動員、食細胞の活性化並びに顆粒ベースの酵素の放出およびオキシダントの生成の誘導に関与する強力な誘引剤であり、全ての機構は、先天的免疫機能だけでなく、組織のダメージにも寄与する可能性がある。過度の補体活性化は、高い血漿濃度のC5aをもたらし、敗血症、成人型呼吸窮迫症候群、リウマチ様関節炎、アルツハイマー病(4)および虚血性心疾患を含む多くの臨床症状に関与することが知られている。

C5bは、他方、その多数の結合部位を通じて、細胞膜傷害複合体(MAC)の組み立てを開始させ、それを誘導する。C5bは、C6、C7、C8およびC9(C5b−9として知られている)の組み立てのためのアンカーとして作用し、病原体の細胞膜に挿入され、細胞溶解をもたらす。

したがって、C5aを特異的に標的化でき、C5bを標的化しない薬剤のニーズが存在する。抗C5モノクローナル抗体は、治療における使用のために開発された。この抗体は、コラーゲンに誘導される関節炎を予防し、確立された疾病を改善する(5)(6)。しかしながら、この抗体は、C5aおよびC5bの両方をブロックし、MACの形成に必要なC5b濃度の減少がこの抗体の欠点である。

それゆえ、C5aのみを標的化し、C5bをそのままに維持する、より特異的な治療のニーズがなおも存在する。ここに実証されるように、オリゴヌクレオチドベースの治療は、C5aを特異的に標的化する一方で、MACの形成に関するC5bの機能を損なわないと想定される。

炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン1(IL−1)は、広く様々な標的細胞に対する局所的および全身的効果を制御する重要な介在物質であり、それゆえ、免疫および炎症を制御する(7)。これは、好中球の動員、マクロファージの活性化ならびにTおよびB細胞の刺激によって炎症を仲介する。

IL−1はIL−1受容体タイプI(IL−1RI)に結合し、IL−1受容体アクセサリータンパク質(IL−1RAcP)の動員をもたらす(8)。IL−1RAcPは、リガンドを認識しないものの、IL−1RIに結合するIL−1を安定させる。更に、IL−1RAcPは、この複合体における重大な補助受容体であり、MyD88といった細胞内アダプタータンパク質およびIL−1R関連キナーゼといったキナーゼの動員および結合を可能にし、究極的にNF−κB活性化をもたらす。IL−1RAcPの膜貫通型の形態に加えて、3つの細胞外Ig領域および1つのユニークなC−ターミナルの領域を含む、より小さく可溶性のタンパク質が同定された。このsIL−1RAcPは、主に肝臓によって生産され(29)、全身を循環する。IL−1受容体ファミリーのもう1つのメンバーはIL−1RIIであり、これも、IL−1の結合によりIL−1RAcPと会合する;しかしながら、これは情報伝達をもたらさない。したがって、この受容体は、おとり受容体と見なされ、膜貫通の形態および可溶性の形態で確認される(9)。

IL−1濃度は、リウマチ様関節炎のようなある炎症性疾患にて増加する。したがって、IL−1の濃度および活性を低下させ且つ制御することが必要である。sIL−1RAcPは可溶性IL−1RIIと相互作用し、高い親和性のIL−1スカベンジャーを形成することができ(8)、マウスにおけるアデノウイルス発現ベクターによるsIL−1RAcPの系統の過剰発現は、コラーゲンに誘導される関節炎(CIA)を著しく回復させることが既に示されている(9)。したがって、循環するsIL−1RAcPの量を増加させる薬剤のニーズが存在する。sIL−1RAcPのアデノウイルスの過剰発現は魅力的ではない。というのは、ウイルスベクターは安全でないとみなされており、作製も容易ではないためである。ここに実証されるように、オリゴヌクレオチドベースの治療は、そのようなウイルスベースの治療と比較して、より特異的で、より安全で、より安いと考えられる。

いくつかの治療はRAのような炎症性疾患を治療することが既に知られている。しかしながら、これらの治療の各々には欠点がある。したがって、既存の治療法のすべての欠点を有さない、RAのような炎症性疾患のための新しい治療法を設計するニーズがなお存在する。

本発明者らは、2種の分子を設計した:1つめの種またはファミリーの分子は、C5aのレベルを特異的に減少させることができ、第2の分子は、可溶性IL−1RAcPのレベルを増大させることができる。

分子
第1の側面において、C5aの量を減らすための、C5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができるか、または変化させる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、C5aタンパク質の量を減らすために、C5 mRNA前駆体のスプライシングを特異的に変化させることができるか、または特異的に修飾することができる。C5 mRNA前駆体のスプライシングの前記変化は、好ましくは、ここで同定されるように、患者において、または前記患者の細胞において、または細胞株において、または無細胞インビトロ系において生じる。先に説明されるように、C5タンパク質は、C5aおよびC5bタンパク質に切断される。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるC5aの生成の低下は、mRNAのレベルで評価してよく、好ましくは、C5a mRNAの初期量の99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%またはそれ以下が、RT PCRによりなおも検出できることを意味する。これに関して、C5a mRNAは、C5aタンパク質の一部をコードするC5の標的化エキソンを意味する。好ましくは、C5a mRNAは検出されない。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるC5aの生成の低下は、mRNAのレベルで評価してよく、好ましくは、C5aの一部をコードするC5の標的化エキソンの初期量の99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%またはそれ以下が、RT PCRによりなおも検出できることを意味する。好ましくは、C5a mRNAの一部をコードする標的化エキソンは検出されない。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるC5aの生成の低下は、(免疫蛍光法および/またはウエスタンブロット分析法により)タンパク質レベルとして評価してよく、好ましくは、C5aタンパク質の初期量の99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%またはそれ以下が、免疫蛍光法またはウエスタンブロット分析法によりなおも検出できることを意味する。好ましくは、C5aタンパク質は標的化されない。

好ましくは、個体または患者の組織または細胞において、本発明の前記分子または組成物による治療の前に前記個体または患者に存在する量との比較により、減少が評価される。あるいは、治療が局所的である場合に前記分子または組成物による治療をまだ受けていない前記個体または患者の組織または細胞を用いて比較を行うことができる。比較は、好ましくは、C5が発現または生産されるあらゆる場所において行われる。C5は、本来、任意の対象の肝臓において発現または生産されるため、前記比較は、肝細胞、および/または肝組織および/または肝臓を使用して実行することが好ましい。好ましい実施形態において、組織は肝組織であり、細胞は肝細胞である。同じことが、後に定義されるIL−RAcPに当てはまる。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、C5bの量が変化しないものである。患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系におけるC5bの量は、先に定義されるように、mRNAレベルまたはタンパク質レベルにて評価してよい。好ましい実施形態において、C5bの量は、同じ系における(患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における)治療前のC5bの量と比較して変化しない。しかしながら、C5bの量は、治療前のC5bの初期量と比較して、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%減少してよい。好ましいアッセイは、機能的C5bタンパク質が製造されているかどうか評価するために設計されてよい。このアッセイは実施例の項目にて記載され、いわゆる溶血性補体アッセイである。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、C5をコードする前記mRNA前駆体のエキソン17のスキッピングを誘導することができる。このエキソンは、スキップされることが好ましい。なぜならば、これが、アナフィラトキシンドメインを欠く非機能的切断型C5aタンパク質の製造をもたらすためである。前記切断型且つ非機能的C5aタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系によって分解されると予想される。あるいは、未成熟な停止コドンがC5遺伝子に導入された場合、これは、C5aの残りの部分のナンセンス介在崩壊をもたらすだろう。

さらなる側面において、可溶性IL−1RAcPの量を増やすための、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、可溶性IL−1RAcPの量を増やすために、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを特異的に変化させまたは改変することができる。IL−1RAcPmRNA前駆体のスプライシングの前記変化は、好ましくは、ここに同定されるような患者において又は前記患者の細胞において又は細胞株において又は無細胞インビトロ系において生じる。

本発明に関して、可溶性IL−1RAcPは、好ましくは、前記IL−1RAcPの分泌型を意味する。分泌型または可溶性タンパク質とは、前記タンパク質が細胞膜に結合していないことを意味する。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを用いて細胞膜と相互作用していないと細胞画分において検出される場合、IL−1RAcPは前記可溶性または分泌型であるだろう。そのような細胞画分の例は、細胞上清または血清である。従来のアッセイの例は、ELISAまたはウエスタンブロット法である。

分泌型または可溶性タンパク質は、タンパク質の膜結合形態に相対するものとして定義される。膜結合形態タンパク質は、膜の両側にアミノ酸を有しつつ、細胞膜にまたがるアミノ酸配列を有するタンパク質である。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを使用して細胞膜と相互作用していると細胞画分において検出される場合、タンパク質は前記膜結合型であるだろう。そのような細胞画分の例は、膜結合タンパク質を含む細胞抽出物である。そのような抽出物は、Nonidet P40を使用して用意してよい。従来のアッセイの例は、ELISAまたはウエスタンブロット法である。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性IL−1RAcPの生産の増大は、mRNAレベルによって評価してよく、好ましくは、前記mRNAは、RT−PCRを用いて検出できる。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性IL−1RAcPの製造の増加は、(免疫蛍光法および/またはウエスタンブロット分析および/またはELISAによって)タンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、前記タンパク質が検出される。

可溶性IL−1RAcPタンパク質の製造の評価(タンパク質またはmRNAの評価)の代わりに、またはそれとの組み合わせで、非結合型または遊離型または可溶性IL−1の存在を評価してもよい。好ましい実施形態において、非結合型または遊離型IL−1の量を減少させて、それによりその生物学的活性を低下させるための、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができるオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

本発明に関して、非結合型または遊離型IL−1は、好ましくは、タンパク質に結合しないIL−1を意味する。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを使用して、細胞画分において、細胞膜と相互作用しないか、またはタンパク質もしくはタンパク質複合体と相互作用しないと検出できる場合、またはそのように検出された場合、IL−1は前記遊離型であるだろう。そのような細胞画分の例は細胞上清または血清である。従来のアッセイの例は、ELISAまたはウエスタンブロット法である。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性または遊離型または非結合型IL−1の量の減少は、(免疫蛍光法および/またはウエスタンブロット分析および/またはELISAによって)タンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、遊離型IL−1は、治療前における前記遊離型IL−1の初期量と比較して1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%減少していることを意味する。IL−1の量は、実施例の記載において例示されるようにウエスタンブロット法を使用して定量してよい。

可溶性IL−1RAcPタンパク質の製造の評価の代わりに、またはそれとの組み合わせで、IL−1によって誘導または活性化されることが既知の分子の存在または発現レベルまたは活性化レベルを評価してよい。例えば、IL−1は、NF−κBの活性化および/またはIL−6/ICAM−1といった複数のケモカインの製造または放出を誘導することが既知である。したがって、可溶性IL−1RAcPタンパク質の製造の評価の代わりに、またはそれとの組み合わせで、NF−κBの活性化および/またはIL−6/ICAM−1の放出を評価してもよい。好ましい実施形態において、NF−κBの活性化および/またはIL−6/ICAM−1の放出を減少させる目的で、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系におけるNF−κBの活性化および/またはIL−6/ICAM−1の放出の減少は、実施例の記載に例示されるようにタンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、活性化されたNF−κBおよび/または放出されたIL−6/ICAM−1は、治療前における前記活性化されたNF−κBおよび/または放出されたIL−6/ICAM−1の初期量と比較して、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%減少することを意味する。

好ましくは、個体または患者の組織または細胞において、本発明の前記分子または組成物による治療の前に前記個体または患者に存在する量との比較により、増大または減少が評価される。あるいは、治療が局所的である場合に前記分子または組成物による治療をまだ受けていない前記個体または患者の組織または細胞を用いて比較を行うことができる。好ましい実施形態において、C5に関する限り、IL−1RAcPは、本来肝臓で発現されるか、または製造されるため、組織は肝組織であり、細胞は肝細胞である。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のエキソン9のスキッピングを誘導することができる。このエキソンはスキップされることが好ましい。これは、IL−1RAcPの膜貫通ドメインをコードするためであり、そのスキッピングはIL−1RAcPのオープンリーディングフレームを妨害しないと期待されるためである。我々は、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のエキソン9のスキッピングは、可溶性IL−1RAcPの生産をもたらすと予想する。

本発明の両タイプのオリゴヌクレオチドの一般的技術情報
ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴリボヌクレオチド(AONとも呼ばれる)を含む。好ましい実施形態において、エキソンスキッピング技術が適用される。エキソンスキッピングは、真核細胞内で生じる本来のスプライシングプロセスを妨げる。より高等な真核生物では、細胞のDNAにおけるタンパク質のための遺伝情報はエキソンにてコードされており、エキソンは、イントロン配列によって互いに分離されている。これらのイントロンは、ある場合には、非常に長い。真核生物の転写機構では、エキソンおよびイントロンの両方を含むmRNA前駆体が作られ、一方、しばしばmRNA前駆体の生産の際に行われるスプライシング機構では、スプライシングにより、mRNA前駆体に存在するエキソンが結合され、実際のコード領域が作られる。

エキソンスキッピングは、少なくとも1つのエキソンがスキップされて欠損した成熟mRNAをもたらす。このため、前記エキソンがアミノ酸をコードした場合、エキソンスキッピングは、変化したタンパク質の発現をもたらす。エキソンスキッピングのための技術は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の使用に方向づけられている。

エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライスサイトまたはエキソン内部配列の一方または両方を標的化するAONの結合により誘導される。エキソン内部配列に対するオリゴヌクレオチドは、典型的に、非エキソン配列と重複しない。これは、好ましくは、少なくともこれらがイントロンに存在しない限り、スプライスサイトと重複しない。エキソン内部配列に対するオリゴヌクレオチドは、好ましくは、隣接するイントロンに相補的な配列を含まない。本発明に係るオリゴヌクレオチド、またはその機能的等価物は、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンの包含を阻害し、前記エキソンを欠くC5またはIL−1RAcPタンパク質を製造する。

エキソンスキッピング技術は、好ましくは、C5遺伝子から製造されるmRNAまたはmRNA前駆体におけるエキソンの欠如が、非機能的C5aタンパク質のためのコード領域をもたらし、それが分解されると予想されるように適用される。したがって、C5bは変わりなく生産され、理論的に、C5aは生産されず、またはほとんど生産されず、一方、AONが無い場合、C5aおよびC5bは、同等の量にて生産される。

IL−1RAcPの場合、エキソンスキッピング技術は、好ましくは、前記mRNAからのエキソンの欠如により、膜結合形態の代わりに可溶性形態の生産されるように適用される。この文脈において、エキソンの包含の阻害とは、好ましくは、検出される全長もしくはオリジナルのC5a、または全長もしくは膜結合型IL−1RAcPのmRNAおよび/またはタンパク質の量が、前述のように減少することを意味する。

C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンは、生産されるmRNAに唯一包含されるため、両方のスプライスサイトがスプライソソーム複合体によって認識される場合、スプライスサイトはAONにとって明確な標的である。1つの実施形態は、したがって、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の非エキソン領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物を提供する。1つの実施形態において、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の非エキソン領域にもっぱら相補的なAONが使用される。しかしながら、このことは必須ではなく、イントロン特異的配列並びにエキソン特異的配列を含むAONを使用することも可能である。そのようなAONは、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の非エキソン領域に相補的な配列、並びに、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソン領域に相補的な配列を含む。当然、AONは、C5またはIL−1RAcPエキソンまたはイントロンの完全な配列に必ずしも相補的ではない。エキソンまたはイントロンの一部に相補的なAONが好ましい。AONは、好ましくはC5またはIL−1RAcPエキソンおよび/またはイントロンの少なくとも一部に相補的であり、前記一部は少なくとも8、9、10,11、12、13、14、15、16、17、18、19、20ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドを有する。

C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のスプライシングは、2つの連続したエステル転移反応により生じる。第1に、スプライソソームアッセンブリーの際に定義されるイントロン内の特異的な枝分かれ部位ヌクレオチドの2’OHは、5’スプライスサイトにおけるイントロンの第1のヌクレオチドに対して求核攻撃を行い、ラリアット中間産物を形成する。第2に、放出された5’エキソンの3’OHは、次に、3’スプライスサイトにおけるイントロンの最後のヌクレオチドにおいて求核攻撃を行い、エキソンを繋ぎ、イントロンラリアットを放出する。イントロンの枝分かれ部位およびスプライスサイトは、したがって、スプライシング現象に関与する。それゆえ、そのような枝分かれ部位および/またはスプライスサイトに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくはエキソンスキッピングに使用される。さらに、したがって、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のスプライスサイトおよび/または枝分かれ部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

スプライスサイトはコンセンサス配列を含むため、スプライスサイトに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物(ここではAONとも呼ばれる)の使用は、乱雑なハイブリダイゼーションの危険を伴う。スキップされるエキソンの部位以外のスプライスサイトへのAONのハイブリダイゼーションは、容易にスプライシングプロセスの精度を妨害し得る。これらの問題およびイントロン配列に相補的なAONの使用に関係するその他の潜在的な問題を克服するために、1つの好ましい実施形態として、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体エキソンに相補的の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。好ましくは、前記AONは、前記mRNA前駆体中の少なくとも1つのエキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる。エキソン包含シグナル(EIS)を妨害することは、そのような要素がエキソン内に位置しているという長所を持つ。スキップされるエキソンの内部についてのAONを供給することによって、エキソン包含シグナルを妨害し、これにより、スプライシング装置からエキソンを効果的に覆うことを可能にする。スプライシング装置のスキップされるエキソンの認識の失敗は、最終的なmRNAからのエキソンの排除をもたらす。この実施形態は、スプライシング機構の酵素的プロセス(エキソンの結合)を直接妨害しない。このことは、方法をより特異的でおよび/または信頼できるものにすると考えられる。EISは、スプライスアクセプターおよびドナーに特定の空間的構造をとらせるエキソンの特別な構造であると考えられる。この概念では、特定の空間的構造が、スプライシング機構によるエキソンの認識を可能にする。しかしながら、本発明は、必ずしもこのモデルに限定されない。好ましい実施形態において、エキソンに結合することができ、EISを阻害することができるオリゴヌクレオチドが利用される。AONは、任意のポイントで特異的に前記エキソンに接触してよく、それでもなお、特異的に前記EISを阻害することができる。

本発明に関して、この分子が、ここに同定されるような細胞、組織または個体において、C5aの量を減少させるために、C5をコードするmRNA前駆体のスプライシングの変更が可能であるか、またはそのように変更する限り、あるいは、可溶性IL−1RAcPの量を増加させるために、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングの変更が可能であるか、またはそのように変更する限り、分子は任意のタイプの分子を意味してよい。前記分子は、したがって、エキソン、C5aの場合好ましくはエキソン17、または、IL−1RAcPの場合エキソン9を欠いたmRNAの製造を誘導し、対応するmRNA前駆体のスプライシングを変更することによって、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム、すなわち、ここに同定されるような非機能的C5aタンパク質またはここに同定されるような可溶性IL−1RAcPタンパク質を生産することができる。したがって、好ましい実施形態において、タンパク質は前記mRNAから形成されるか、または生産されるため、前記分子は対応するmRNAの翻訳を阻止しない。好ましくは、前記分子は、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物である。オリゴヌクレオチドの機能的等価物は、好ましくは、ここに定義されたオリゴヌクレオチドを意味し、ここにおいて、1以上のヌクレオチドが置換され、前記機能的等価物の活性は、少なくともある程度まで保持される。好ましくは、前記機能的等価物の活性は、C5aの検出可能な減少を提供し、または可溶性IL−1RAcPの検出可能な製造を提供する。前記機能的等価物の前記活性は、したがって、好ましくは、C5aまたは可溶性IL−1RAcPタンパク質の量の定量によって、または対応するmRNAの量の定量によって評価される。オリゴヌクレオチドの前記活性の評価は、好ましくは、RT−PCR(m−RNA)によって、または免疫蛍光法もしくはウエスタンブロット分析(タンパク質)によって行われる。前記活性は、好ましくは、機能的等価物の由来となる前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%またはそれ以上を示した場合に、少なくともある程度まで保持されている。そのような活性は、機能的等価物の由来となる前記オリゴヌクレオチドの対応するオリゴヌクレオチドの活性と比較して、肝組織において、または個体の肝細胞において、またはインビトロの細胞において測定してよい。本願を通じて、オリゴヌクレオチドという用語が使用される場合、それはここに定義されるようなその機能的等価物と置き換えてもよい。

したがって、好ましくは治療結果を提供するC5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンに相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。1つの好ましい実施形態において、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体エキソンの連続したストレッチまたはその少なくとも一部に相補的な配列または結合する配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が使用され、前記部分は、少なくとも8ヌクレオチドを有するか、またはそれを含む。しかしながら、前記部分は、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50ヌクレオチドを有してよい。オリゴヌクレオチドが相補的となるC5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンの一部は、前記mRNA前駆体の連続したストレッチと呼ばれてよい。マウスまたはヒトC5について、好ましい連続したストレッチは、mRNA前駆体エキソン17のストレッチであり、より好ましくは前記エキソンの3’末端に近いmRNA前駆体エキソン17のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記エキソンの3’末端から1ヌクレオチドであるか、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヌクレオチドであることを意味してよい。エキソン17のマウスおよびヒトmRNA前駆体配列は、それぞれ、配列番号1および2に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1または2の少なくとも8ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、C5mRNA前駆体のイントロン17に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン17のマウスおよびヒトmRNA前駆体配列は、それぞれ、配列番号3および4に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号3または4の少なくとも8ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

「C5 mRNA前駆体のエキソンまたはイントロンに結合する」という表現は、この文脈において、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株におけるC5aの生産を減少させることができる。この文脈におけるC5aは、C5aタンパク質を意味してよい。「IL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンまたはイントロンに結合する」という表現は、この文脈において、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、可溶性IL−1RAcPの量を増やすために、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができるか、または無細胞インビトロ系において、mRNAレベルにて評価してよいことを意味する。マウスC5の好ましいmRNA配列は、配列番号7に示される。ヒトC5の好ましいmRNA配列は、配列番号8に示される。マウスのIL−1RAcPの好ましいmRNA配列は、配列番号9に示される。ヒトIL−1RAcPの好ましいmRNA配列は、配列番号10に示される。

マウスまたはヒトIL−1RAcPについて、好ましい連続したストレッチは、好ましくはESE部位を含む、より好ましくはエキソン9の5’末端に近いESE部位を含む、mRNA前駆体エキソン9のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記mRNA前駆体エキソンの5’末端から1ヌクレオチドであるか、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヌクレオチドであることを意味してよい。

マウスまたはヒトIL−1RAcPについて、別の好ましい連続したストレッチは、ESE部位を含むおよび/またはエキソン9の3’末端に近いmRNA前駆体エキソン9のストレッチである。さらにより好ましくは、ヒトIL−1RAcPについて、連続したストレッチは、ESE部位を含むおよび/またはエキソン9の3’末端に近いmRNA前駆体エキソン9のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記mRNA前駆体エキソンの3’末端からの1ヌクレオチドであるか、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヌクレオチドであることを意味してよい。mRNA前駆体エキソン9のマウスおよびヒト配列は、配列番号5および6に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号5または6の少なくとも8ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、または結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、IL−1RAcP mRNA前駆体のヒトイントロン8または9に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン8および9のヒトmRNA前駆体配列は、それぞれ配列番号62および63に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号62または63の少なくとも8ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、ヒトIL−1RAcPのイントロン8の一部およびエキソン9の一部を含むmRNA前駆体配列もしくはイントロン8およびエキソン9に重複する配列(すなわちイントロン8−エキソン9の境界)、またはヒトIL−1RAcPのエキソン9の一部およびイントロン9の一部を含む配列もしくはエキソン9およびイントロン9に重複する配列(すなわちエキソン9−イントロン9の境界)に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン8およびエキソン9に重複する好ましいヒトmRNA前駆体配列は、配列番号64に示される。エキソン9およびイントロン9に重複する好ましいヒトmRNA前駆体配列は、配列番号65に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号64または65の少なくとも8ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

最も好ましくは、C5 mRNA前駆体の少なくとも一部、またはIL−1RAcP mRNA前駆体の少なくとも一部に相補的な配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドであって、前記部分は少なくとも8ヌクレオチドを有するか、または含むオリゴヌクレオチドが使用される。しかしながら、前記部分は、さらに、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50ヌクレオチドを有していてよい。

C5のためのより好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列番号11から配列番号24の配列の各々を含むか、またはそれから成る配列である:
−配列番号11、12、16、17、18、19、20、22、23および24(すなわちPS295、PS296、PS349、PS350、PS351、PS352、PS353、377、378および379)はC5のエキソン17の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号13、14および21(すなわちPS329、PS330およびPS354)は、C5のエキソン17−イントロン17境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号15(すなわちPS348)は、C5のイントロン16−エキソン17境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する。

より好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号13(PS329)および配列番号22(377)を含むか、またはそれらから成る。

IL−1RAcPのためのより好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列番号25から配列番号42の配列の各々を含むか、またはそれから成る配列に示される。
−配列番号25、26、28、33、34、35、36、39、40、41(すなわちPS299、PS300、PS326、PS357、PS358、PS359、PS360、373、374および375)は、IL−1RAcPのエキソン9の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号27、31、32および42(すなわちPS325、PS355、PS356および376)は、IL−1RAcPのイントロン8−エキソン9境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号29、30、37および38(すなわちPS327、PS328、PS361および372)は、IL−1RAcPのエキソン9−イントロン9境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する。

より好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号26(PS300)および配列番号39(373)を含むか、またはそれらから成る。

オリゴヌクレオチドの各々は表3に示される。表5には、各オリゴヌクレオチドによって標的化された領域が示される。

好ましい実施形態において、先に記載される本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに、少なくとも1つのイノシンおよび/または前記配列に存在するゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含む。好ましくは、イノシンは、グアニン、アデニンまたはウラシルの1つに導入され、これと置き換えられる。イノシンおよび/また本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドの使用は、以下に説明されるように非常に魅力的である。イノシンは、例えば、3つの塩基ウラシル、アデニンおよびシトシンと対になることができる既知の改変された塩基である。イノシンは、ヒポキサンチンがβ−N9−グリコシド結合を介してリボース環(リボフラノースとしても知られる)に結合したときに形成されるヌクレオシドである。イノシンは、一般にtRNAにて見つかり、ゆらぎ塩基対における遺伝暗号の適切な翻訳にとって不可欠である。ゆらぎ塩基対は、RNA二次構造において基本的なG−UおよびI−U/I−A/I−Cの対である。その熱力学的安定性は、ワトソンクリック塩基対のそれに匹敵する。ゆらぎ塩基対は遺伝暗号の適切な翻訳に重要である。遺伝暗号は、アンチコドンの第1塩基において改変された塩基対を使用することにより、トリプレットコドン(64)のためのアミノ酸の数(20)における不均衡を補う。同様に、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーを設計する場合、イノシンは、アデニン、チミンまたはシトシンでそれが無差別的に対となる点で有用である。

そのような塩基を使用するという第1の利点は、多型がプライマーのアニーリング効率を混乱させることを心配することなく、一塩基多型(SNP)にまたがるプライマーを設計できることである。したがって、本発明において、そのような塩基の使用は、本発明のオリゴヌクレオチドによって標的化されるmRNA前駆体ストレッチ内にSNPを有する個体に使用してよいオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。

イノシンおよび/または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの別の利点は、ここに示されるmRNA前駆体ストレッチに相補的に設計した場合に、前記オリゴヌクレオチドが通常CpGを含むことである。オリゴヌクレオチドにおけるCpGの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチド(10)の増加した免疫原性に関係している。この増加した免疫原性は望ましくない。対応するイノシンおよび/または前記オリゴヌクレオチドにおけるゆらぎ塩基対を形成することができる塩基による1つ、2つまたはそれ以上のCpGの置換は、減少したおよび/または許容できるレベルの免疫原性を有するオリゴヌクレオチドを供給すると期待される。免疫原性は、動物のバイオプシーにおけるCD4および/またはCD8T細胞および/または炎症性骨髄性細胞の存在の評価により、動物モデルにおいて評価してよい。免疫原性は、本発明のオリゴヌクレオチドで治療された動物またはヒトの血液において、ELISAのような当業者に既知の標準的イムノアッセイを使用して、中和抗体および/または前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することによって、評価してもよい。

免疫原性の増大は、好ましくはイノシンおよび/またはゆらぎ塩基対を形成することができる少なくとも1つの塩基を有する対応するオリゴヌクレオチドで治療する前後の動物の対応するバイオプシーにおける、各々の細胞種の量の比較における、少なくとも1つのこれらの細胞種の検出可能な増大に対応する。あるいは、免疫原性の増大は、標準的イムノアッセイを使用して、前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在または増加量を検出して評価してよい。

免疫原性の減少は、好ましくは、イノシンおよび/またはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を有さない対応するオリゴヌクレオチドによって治療する前後の動物の対応するバイオプシーにおける、対応する細胞種の数との比較における、少なくとも1つのこれらの細胞種の検出可能な減少に対応する。あるいは、免疫原性の減少は、標準的イムノアッセイを使用して、前記抗体の欠如または減少量によって評価してよい。

イノシンおよび/または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第3の利点は、オリゴヌクレオチドの潜在的な多量体化または凝集を回避または低減することである。例えば、G−カルテットモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、4つの一本鎖オリゴヌクレオチドのHoogsteen塩基対合により形成される4重体、多量体または凝集体を形成する傾向を有することが知られており(11)、このことは当然望ましくなく、結果として、オリゴヌクレオチドの効率は減少すると予想される。多量体化または凝集は、好ましくは、当業者に既知の標準的ポリアクリルアミド非変性ゲル電気泳動技術によって評価される。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの合計量の20%未満、15%未満、10%未満、7%未満もしくは5%未満またはそれ以下が、上述のアッセイを使用した評価により、多量体化または凝集する能力を有する。

さらに、イノシンおよび/または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第4の利点は、抗トロンビン活性に関係し(12)並びにマクロファージ・スカベンジャー受容体との結合およびその阻害に関係する(13)4重構造を回避することである。

イノシンおよび/または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第5の利点は、改善されたRNA結合速度論および/または熱力学的性質を有するオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることである。RNA結合速度論および/または熱力学的性質は、オリゴヌクレオチドの融解温度によって(Tm;基礎的なTmおよび最も近い隣接モデルを使用して一本鎖RNAについて、オリゴヌクレオチド特性計算器で計算される(http://www.unc.edu/ ̄cail/biotool/oligo/index.html))および/またはAON−標的エキソン複合体の自由エネルギーによって(RNA構造バージョン4.5を使用して)、少なくとも部分的に決定される。Tmが高すぎる場合、オリゴヌクレオチドがそれほど特異的でないと予想される。許容できるTmおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメータの各々に好ましい範囲を与えることは難しい。許容できるTmは、少なくとも35℃且つ65℃以下であってよく、許容できる自由エネルギーは、少なくとも15kcal/mol且つ45kcal/mol以下であってよい。

当業者は、したがって、最初にオリゴヌクレオチドを潜在的な治療の化合物として選択してよい。第2のステップにおいて、その免疫原性を減少させおよび/または凝集および/または4重形成を回避することによって、および/またはそのTmおよび/またはAON−標的複合体の自由エネルギーを最適化することによって、さらに前記オリゴヌクレオチドを最適化するために本発明を使用してよい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、ゆらぎ塩基対を形成することができる少なくとも1つのイノシンおよび/または塩基を適切な位置に導入し、免疫原性および/または凝集および/または4重形成および/またはTmおよび/またはAON−標的複合体の自由エネルギーが、前記イノシンおよび/またはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基の存在によってどのように変化したかを評価しようとしてよい。変化によって、免疫原性および/または凝集および/または4重形成および/またはそのTmおよび/またはAON−標的複合体の自由エネルギーの好ましい変化または減少が生じない場合、更なるイノシンおよび/または前記オリゴヌクレオチドにゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を導入すること、および/または所定のイノシンおよび/または前記オリゴヌクレオチド内の異なる適切な位置にゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を導入することを選択してよい。

好ましい実施形態において、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の一部に相補的な配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的な部分は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも50%であり、より好ましくは少なくとも60%であり、さらにより好ましくは少なくとも70%であり、さらにより好ましくは少なくとも80%であり、さらにより好ましくは少なくとも90%でありまたはさらにより好ましくは少なくとも95%であり、またはさらにより好ましくは98%でありまたはさらにより好ましくは少なくとも99%であり、またはさらにより好ましくは100%であるオリゴヌクレオチドである。最も好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ここに定義されるようなC5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の一部に相補的な配列から成る。例として、オリゴヌクレオチドは、ここに定義されるようなC5またはIL−1RAcP mRNA前駆体および付加的なフランキング配列の一部に相補的な配列を含んでよい。より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記の相補的な部分の長さは、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50ヌクレオチドである。好ましくは、付加的なフランキング配列は、オリゴヌクレオチドに対するタンパク質の結合を改変するために、またはオリゴヌクレオチドの熱力学的性質を改変するために、より好ましくは標的RNA結合親和性を改変するために使用される。

1つの好ましい実施形態は、次のものを含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物を提供する:
−C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体エキソンの領域に相補的な配列であって、C5またはIL−1RAcPエキソンの別の部分とハイブリダイズするもの(閉じた構造)、および
−C5またはIL−1RAcPmRNA前駆体エキソンの領域に相補的な配列であって、前記C5またはIL−1RAcPmRNA前駆体とハイブリダイズしないもの(開いた構造)。

この実施形態については、WO2004/083432が言及され、その全体は本願に援用される。RNA分子は、主として、同じRNA内の相補的なまたは部分的に相補的なストレッチの塩基対合により、強い二次構造を示す。RNA中の構造はRNAの機能に役割を果たすと以前から考えられている。理論に拘束されることなく、エキソンのRNAの二次構造はスプライシングプロセスの組み立ての際に役割を果たすと信じられている。エキソンの構造は、mRNAにその包含を導くと考えられているパラメータの1つである。しかしながら、他のパラメータがさらにそこに役割を果たす可能性がある。ここにおいて、このシグナリング機能は、エキソン包含シグナルと呼ばれる。この実施形態の相補的オリゴヌクレオチドは、エキソンの構造を妨害し、それによりエキソンのエキソン包含シグナルを妨害することができる。多くの相補的オリゴヌクレオチドは、確かにこの能力を含み、その他のものより多少効率的であることがわかった。この好ましい実施形態のオリゴヌクレオチド、すなわち本来のエキソンRNAにおける開いたまたは閉じた構造に導かれる前記重複を備えたものは、あらゆる可能性のあるオリゴヌクレオチドから選択されたものである。選択は、エキソン包含シグナルを効率的に妨害することができるオリゴヌクレオチドを包含する。理論に拘束されることなく、開いた構造との重複は、オリゴヌクレオチドの侵入効率を改善し、スプライシング要素の結合を防ぎ(すなわち、オリゴヌクレオチドが構造に入ることができる効率を増加させる)、一方で、閉じた構造との重複は、続いて、エキソンのRNAの二次構造を妨害する効率を増加させ、それにより、エキソン包含シグナルを妨害すると考えられる。閉じたおよび開いた構造の両方に対する部分的相補性の長さは極端に制限されないことがわかっている。我々は、いずれかの構造における可変長の相補性を有するオリゴヌクレオチドによる高い効率を観察した。相補性という用語は、生理学的条件下で核酸のその他のストレッチにハイブリダイズすることができる核酸のストレッチを意味するものとしてここに使用される。相補性の領域の全ての塩基は、相対する鎖における塩基と対になることができることが必ずしも要求されない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する場合、例えば、相補鎖における塩基との塩基対を形成しない残基を組込んでもよい。ミスマッチはある程度まで許容されてよく、細胞における環境下では、ヌクレオチドのストレッチは、相補的部分に十分にハイブリダイズすることができる。この文脈において、「十分に」とは、好ましくは、EP1 619 249の例1に記述されるようなゲル易動度シフトアッセイを使用して、オリゴヌクレオチドの結合を検出することが可能であることを意味する。任意に、前記オリゴヌクレオチドは、さらに、ヒト肝細胞へのトランスフェクションによって試験してよい。標的化されたエキソンのスキッピングは、(EP1 619 249に記述されるような)RT−PCRによって評価してよい。相補的領域は、好ましくは、組み合わせられた場合に、mRNA前駆体におけるエキソンに特異的であるように設計される。そのような特異性は相補的領域の様々な長さで作製してよく、これはシステムにおいて他のmRNA(前駆体)における実際の配列に依存する。1以上のその他のmRNA前駆体がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるというリスクは、オリゴヌクレオチドのサイズを増大することで低下する。相補性の領域にミスマッチを含むが、mRNA前駆体における標的化された領域とハイブリダイズする能力を保持するオリゴヌクレオチドを本発明にて使用できることが明らかである。しかしながら、好ましくは、少なくとも相補的部分は、そのようなミスマッチを含まない。というのも、これらは、典型的に、1以上の相補的領域にそのようなミスマッチを有しているオリゴヌクレオチドよりも高い効率および高い特異性を有しているためである。より高いハイブリダイゼーションの強さ(すなわち相対する鎖との相互作用の数の増大)は、システムのスプライシング機構を妨害する過程の効率を増大させることにおいて都合がよいと考えられる。好ましくは、相補性は90〜100%である。一般に、これは20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに1つまたは2つのミスマッチを許容する。

二次構造は、エキソンが存在するmRNA前駆体の状況において最も分析される。そのような構造は実際のRNAにおいて分析してよい。しかしながら、構造−モデル化プログラムを頻繁に使用して、RNA分子(最低のエネルギーコスト)の二次構造を予測することが現在可能である。適切なプログラムの非限定的な例は、RNA mfoldバージョン3.1サーバーである(14)。当業者は、ヌクレオチド配列が与えられた場合、適切な再現性で、エキソンの有望な構造を予測することができるだろう。エキソンおよびフランキングイントロン配列の両方にそのようなモデル化プログラムを提供する場合、最良の予測が得られる。それは、典型的に、全てのmRNA前駆体の構造をモデル化するためには必要ない。

オリゴヌクレオチドが導かれる、開いたおよび閉じた構造は、好ましくは互いに隣接している。このように、開いた構造に対するオリゴヌクレオチドのアニーリングは、アニーリングがこの閉じた構造に進むとすぐに、閉じた構造の開放を引き起こすと考えられる。この作用を通じて、以前に閉じた構造は、異なる高次構造をとる。異なる高次構造はエキソン包含シグナルの崩壊をもたらす。しかしながら、潜在的(隠れた)スプライスアクセプターおよび/またはドナー配列が標的化されたエキソン内に存在する場合、たまに、新しいエキソン包含シグナルが作られ、異なる(新たな)エキソン、すなわち異なる5’末端、異なる3’末端またはそれらの両方を有したエキソンが生成される。標的化されたエキソンは、mRNAから除外されるため、C5aタンパク質が減少し、または可溶性IL−1RAcPが生産される限り、この種の活性は本発明の範囲内である。

さらに、mRNA前駆体のエキソンのRNAにおけるセリン−アルギニン(SR)タンパク質のための結合部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。WO2006/112705において、我々は、エキソンスキッピングの誘導におけるエキソン−内部アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の有効性と、前記AONの標的mRNA前駆体部位における(例えばESEファインダーによって)予測されたSR結合部位の存在との間の相関性の存在を開示した。したがって、1つの実施形態においてオリゴヌクレオチドは、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の標的化されたエキソンのRNAにおけるSR(Ser−Arg)タンパク質のための(推定上の)結合部位を決定すること、および前記RNAに相補的であり、少なくとも部分的に前記(推定上の)結合部位に重複するオリゴヌクレオチドを製造することを含んで製造される。ここにおいて、「少なくとも部分的に重複」という用語は、SR結合部位の単一ヌクレオチドのみ並びに前記結合部位の複数のヌクレオチドの重複並びに前記結合部位の完全な重複を含むと定義される。この実施形態は、好ましくは、前記RNAの二次構造から、前記RNAの別の部分とハイブリダイズする領域(閉じた構造)および前記構造とハイブリダイズしない領域(開いた構造)を決定すること、および続いて、少なくとも部分的に前記(推定上の)結合部位と重複し、前記閉じた構造の少なくとも一部と重複しおよび前記開いた構造の少なくとも一部と重複するオリゴヌクレオチドを生成することをさらに含む。この方法で、我々は、エキソンの、mRNA前駆体からmRNAへの包含を妨害できるオリゴヌクレオチドを得る可能性を増加させる。第1の選択されたSR−結合領域は、開いた―閉じた構造を有さない可能性があり、この場合、別の(第2の)SRタンパク質結合部位が選択され、その後、開いた−閉じた構造の存在について試験される。このプロセスは、SRタンパク質結合部位並びに(部分的に重複する)開いた−閉じた構造を含む配列が同定されるまで続けられる。その後、この配列は、前記配列に相補的なオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。

オリゴヌクレオチドを生成するためのそのような方法は、記述された順序、すなわち最初にオリゴヌクレオチドを生成するという順序を逆にすることによって実行され、C5またはIL−1RAcPエキソンからのRNAの二次構造から、前記RNAの別の部分にハイブリダイズする構造が想定される領域(閉じた構造)および前記構造においてハイブリダイズしない領域(開いた構造)を決定すること、および続いて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの一部が前記閉じた構造に相補的であり、少なくとも前記オリゴヌクレオチドの別の部分が前記開いた構造に相補的であるオリゴヌクレオチドを生成することを含む。その後、SRタンパク質結合部位が前記開いた/閉じた構造で少なくとも重複するかどうか判断される。このように、WO2004/083432の方法は改良される。さらに別の実施形態において、選択は同時に行なわれる。

任意の理論に束縛されることを期待することなく、SRタンパク質結合部位に向けられたオリゴヌクレオチドの使用は、SRタンパク質の結合部位に対するSRタンパク質の結合を(少なくとも部分的に)妨害し、スプライシングを崩壊させるかまたは妨害すると現在考えられている。

好ましくは、開いた/閉じた構造とSRタンパク質結合部位とは部分的に重複し、さらにより好ましくは、開いた/閉じた構造は完全にSRタンパク質結合部位と重複し、またはSRタンパク質結合部位は完全に開いた/閉じた構造と重複する。このことは、エキソン包含の崩壊を向上させる。

コンセンサススプライスサイト配列に加えて、多くの(しかしすべてではない)エキソンは、エキソンスプライシングエンハンサー(エキソンスプライシングエンハンサー、ESE)配列のようなスプライシング調節配列を含み、スプライソソームによる真正なスプライスサイトの認識が促進される(15、16)。SRタンパク質と呼ばれるスプライシング要素のサブグループは、これらのESEに結合することができ、U1およびU2AFといったその他のスプライシング要素を(弱く定義される)スプライスサイトにリクルートすることができる。4つの最も豊富なSRタンパク質(SF2/ASF、SC35、SRp40およびSRp55)の結合部位が詳細に分析され、これらの結果は、ESEファインダー(これらのSRタンパク質のための潜在的結合部位を予測するウェブソース)において実行される(15、16)。オリゴヌクレオチドの有効性と、SF2/ASF、SC35およびSRp40結合部位の存在/非存在との間に相関性がある。好ましい実施形態において、したがって、本発明は、上記のような組み合わせを提供し、ここにおいて前記SRタンパク質はSF2/ASFまたはSC35またはSRp40である。

1つの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、転写物におけるエキソンの正確なスプライシングに必要な調節性RNA配列に特異的に結合することができる。いくつかのシス作用性RNA配列は、転写物におけるエキソンの正確なスプライシングに必要である。特に、イントロンスプライシングエンハンサー(intronic splicing enhancer)もしくはエキソンスプライシングエンハンサー(ISEおよびESE)またはイントロンスプライシングサイレンサー(intronic splicing silencer)もしくはエキソンスプライシングサイレンサー(exonic splicing silencer)(ISSおよびESE)のような補足の要素は、構成的および代替性のエキソンの特異的且つ効率的なスプライシングを制御するように識別される。要素に結合する配列特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を使用して、DMDに示されるように、エキソンがスキップされるように、それらの制御的機能は妨害される。したがって、1つの好ましい実施形態において、イントロンスプライシングエンハンサー(ISE)、エキソンスプライシングエンハンサー(ESE)、イントロンスプライシングサイレンサー(ISS)および/またはエキソンスプライシングサイレンサー(ESS)に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が使用される。先に記載されたように、C5またはIL−1RAcPエキソンは、1つの好ましい実施形態において、前記エキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる薬剤によりスキップされ、それにより、前記エキソンは、mRNAに含める必要のある部分としてスプライシング機構に認識されない。その結果、前記エキソンを欠いたmRNAが形成される。

ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、C5またはIL−1RAcPエキソンRNAまたはC5またはIL−1RAcPイントロンRNAの8および50ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。1つの実施形態において、ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、C5またはIL−1RAcPエキソンRNAまたはC5またはIL−1RAcPイントロンRNAの14および50ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、前記エキソンRNAの14および25ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。より好ましくは、C5またはIL−1RAcPエキソンRNAまたはC5またはIL−1RAcPイントロンRNAの20および25ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが使用される。したがって、C5またはIL−1RAcPエキソンmRNA前駆体の8および50ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的なそのような好ましいオリゴヌクレオチドは、前記エキソンによってコードされた領域を欠いたC5aタンパク質、または前記エキソンによってコードされた領域を欠いたIL−1RAcPタンパク質を誘導する。

異なるタイプの核酸モノマーを、オリゴヌクレオチドを生成するために使用してよい。

核酸は、RNAベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および/または塩基が修飾されていてよい。

好ましい骨格の修飾は、ホスホロジチオネート、ホスホロチオネート、キラルに純粋なホスホロチオネート、ホスホン酸メチル、および/またはH−ホスホン酸塩を含むが、これらに限定されない。

骨格の修飾の代わりに、またはそれとの組み合わせで、核酸は、糖の修飾および/または塩基の修飾を有してよい。

好ましい糖の修飾は、ミックスマー(mixmer)を含むカルバ糖および/またはアザ糖を含む。その他の糖の修飾は、ロックされた核酸(LNA)、エチレン架橋核酸(ENA)および/またはミックスマーを含むそれらの変形を含む。その他の糖の修飾は、2’−ハライドおよび/または2’−O−アルキルおよび/または2’−O−(置換)アルキルの修飾、例えば、2’−O−メチル、2’−F、2’−O−(2−メトキシ)エチル、2’−O−エチル、2’−O−アリル、2’−O−ブチニル、2’−O−プロパルギル、2’−O−(2−アミノ)エチルを含む。当業者は、それぞれの糖は同様に修飾する必要はないと理解するだろう。いくつかの異なる修飾された糖は、1つの単一核酸と組み合わせられてよい。

好ましい塩基の修飾は、5−ハロゲン化ウラシルおよび/またはシトシン、5−アミノメチル−ウラシル、2,6−ジアミノプリン、5−プロパルギル−シトシン、5−プロパルギル−ウラシル、G−クランプおよびその誘導体)、5−メチル−シトシン−および/または5−メチル−ウラシルを含む。当業者は、それぞれの塩基は同様に修飾する必要はないと理解するだろう。いくつかの異なる修飾された塩基は、1つの単一核酸と組み合わせられてよい。

好ましくは、RNA/RNA二重鎖が非常に安定しているため、前記オリゴヌクレオチドはRNAを含む。エキソンスキッピング技術の目的のうちの1つは、対象におけるスプライシングを導くことであるため、RNAオリゴヌクレオチドは、付加的な特性、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよびRNaseHに対する抵抗性、付加的なハイブリダイゼーションの強さ、増大した安定性(例えば体液における)、増大または低下した柔軟性、低減された毒性、増大した細胞内輸送、組織特異性等を有したRNAを提供する修飾を含むことが好ましい。好ましい修飾は上に示されている。

好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオネート骨格を通して接続された2’−OメチルRNAモノマーを含むか、またはそれから成る。1つの実施形態は、したがって、修飾、好ましくは、2’−Oメチル修飾リボース(RNA)、より好ましくは、2’−O−メチルホスホロチオネートRNAをさらに含むRNAを含むオリゴヌクレオチドを提供する。

1つの実施形態において、本発明は、2’−O−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾およびロックされた核酸モノマーを含むハイブリッド・オリゴヌクレオチドを提供する。この特定のオリゴヌクレオチドは、ロックされた核酸のみから成る等価物と比較して、よりよい配列特異性を含み、2’−O−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾から成るオリゴヌクレオチドと比較して有効性が改善されている。

したがって好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドはRNAを含み、好ましくは、前記RNAは、修飾、より好ましくは、2’−O−メチル修飾リボース(RNA)あるいはデオキシリボース(DNA)修飾を含み、ここにおいて、前記オリゴヌクレオチドの前記機能的等価物は、PNA、カルバボラン含有ペプチド核酸、(LNA)、(ENA)、ロックされていない核酸(UNA)、グリコール核酸(GNA)、モルホリノホスホロジアミデートまたはそれらの任意の組み合わせを含み、最も好ましくはモルホリノホスホロジアミデートを含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、RNAベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および/または塩基の修飾を有し、好ましくは、ここにおいて、オリゴヌクレオチドは、1以上の2’−O−メチルホスホロチオネートおよび/またはモルホリノホスホロジアミデートヌクレオチドを含むか、またはそれから成る。

確認された各々の骨格、糖、塩基の修飾は、増大するか、標的化されたエキソンのスキッピングを誘導する、オリゴヌクレオチドの能力を増強すると考えられる。

核酸を模倣する技術の出現により、必ずしも量ではなく、核酸自体として同様の、好ましくは同一のハイブリダイゼーション特性を有する分子を製造することが可能になった。そのような機能的等価物は、当然、本発明における使用にも適している。オリゴヌクレオチドの機能的等価物の好ましい例は、PNAおよび/またはLNAである。最も好ましくは、モルホリノホスホロジアミデートが使用される。本発明のオリゴヌクレオチドの等価物の適しているが、非限定的な例は、17−23に見つけることができる。互いに形成するおよび/または核酸とともに形成する1以上の等価物のハイブリッドも当然適している。好ましい実施形態において、LNAは、より高い標的親和性および低減された毒性を示すため、LNAはオリゴヌクレオチドの機能的等価物として使用される。LNAは、さらにエキソンスキッピングのより高い効率を示す。

C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の第1のエキソンに相補的な少なくとも8、好ましくは16から80の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが提供され、ここにおいて、前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の第2のエキソンに相補的な少なくとも8、好ましくは16から80の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドが使用される。

1つの好ましい実施形態において、前記第1および前記第2エキソンは、前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体において、前記オリゴヌクレオチドが相補的でない少なくとも1つのエキソンによって分離されている。あるいは、前記第1および前記第2エキソンは隣接している。

2つの相補的オリゴヌクレオチドの間の結合を提供することにより、介在するエキソンのスキッピングを特異的に促進することができる。従って、1つの実施形態において、少なくとも2つのC5またはIL−1RAcPエキソンに相補的なヌクレオチドのストレッチは結合成分によって分離される。ヌクレオチドの少なくとも2つのストレッチは、したがって、この実施形態において、単一の分子を形成するように結合される。したがって、さらに、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体における2つのエキソンの少なくとも2つの部分に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物であって、前記オリゴヌクレオチドまたは機能的等価物は、少なくとも2つの部分を含み、第1の部分は、前記少なくとも2つのエキソンの1つ目に相補的な少なくとも8、好ましくは16から80の連続したヌクレオチドが有するオリゴヌクレオチドを含み、第2の部分は、前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体における第2のエキソンに相補的な少なくとも8、好ましくは16から80の連続したヌクレオチドが有するオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。結合は任意の手段によるものであってよいが、好ましくは、ヌクレオチド結合によって達成される。後者の場合、1つまたはその他の相補的なエキソンの間の重複を含まないヌクレオチドの数は、0、1、2、3または4から40ヌクレオチドであってよい。結合成分はオリゴヌクレオチドを繋げることができる任意のタイプの成分でありえる。好ましくは、前記結合成分は少なくとも4ウラシルヌクレオチドを含む。現在、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を模倣する様々な化合物が利用可能である。ここではオリゴヌクレオチドの機能的等価物とよばれるそのような化合物もまた、そのような等価物が、量に限らず同様のハイブリダイゼーション特性を含む場合、本発明に適している。適切な機能的等価物は、本明細書に前述される。言及されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的化されたエキソンとのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドのみから成る必要はない。付加的な材料および/またはヌクレオチドが付加されてよい。

本発明によるオリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは、厳格なプロトコル必要条件が存在する臨床試験(インビボ使用)における、増大する用量の研究に基づいて設計される。ここに定義された分子またはオリゴヌクレオチドは、0.1〜60mg/kg、好ましくは0.5から55mg/kgまでの用量にて使用してよい。

好ましい実施形態において、0.1nMから1Mまでの、ここに定義されたオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、肝細胞または肝組織のような細胞モデルにおけるインビトロの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、0.3から700nM、さらにより好ましくは1から600nM、さらにより好ましくは50から550nMまでである。いくつかのオリゴヌクレオチドが使用される場合、この濃度または用量は、オリゴヌクレオチドの全濃度または全用量を意味してよく、または添加されるオリゴヌクレオチドの各々の濃度または用量を意味してよい。

上記のようなオリゴヌクレオチドの濃度または用量の範囲は、インビトロまたはエクスビボの用途のための好ましい濃度または用量である。当業者は、使用されるオリゴヌクレオチド、扱われる標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用される培地およびトランスフェクションおよびインキュベーション条件に依存して、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度または用量は、更に変化してよく、さらに最適化されてよいということを理解するだろう。

好ましい実施形態において、そのような分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、薬物であり、または薬物としての使用のためのものである。より好ましくは、前記薬物は、その必要のある対象において、炎症性障害を予防または治療するためのものである。本発明に関して、炎症性障害は、任意の炎症性疾患または状態であり、好ましくは、少なくとも部分的にC5aタンパク質またはIL−1シグナリングによってもたらされまたは悪化する疾病、障害またはその他の症状を意味する。炎症性疾患または状態の例は、リウマチ様関節炎(RA)、若年性リウマチ様関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患(クローン病または潰瘍性大腸炎を含む)、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、および非アルコール性脂肪症、腎炎、例えば糸球体腎炎、喘息、心内膜炎、重症筋無力症を含むがこれらに限定されない。

ここに使用される「肝炎」という用語は、少なくとも部分的に肝臓の炎症によって特徴づけられる消化器病学の疾病、症状または障害を意味する。肝炎の例は、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスに関連した肝炎または虚血/再灌流に関連した肝炎を含むが、これらに限定されない。

さらにより好ましくは、前記薬物は、先に定義されるように、C5aの量を減少させることができ、または可溶性IL−1RAcPの量を増加させることができる。

より好ましい実施形態において、前記薬物は、治療した患者からの1以上の症状を緩和することができ、および/または、本発明の分子または組成物を使用して、治療した患者からの細胞または組織の1以上の特徴またはパラメータを改善することができる。各々の炎症性疾患について、当業者は、少なくとも1つの症状、パラメータまたは特徴、前記疾病が関与する前記パラメータまたは特徴の値およびそれらの各々を評価する方法を知っている。以下に、リウマチ様関節炎に特異的なパラメータを示す。リウマチ様関節炎は、好ましくは、対象のいくつかのパラメータおよび症状の測定を含む、疾病活性スコア(DAS)の指数または関連するDAS28(van Riel P.L.C.M., (2001), Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76)を評価した後に診断された疾病である。前記指数の評価は対象を検査する臨床医によって実行されてよい。より好ましい実施形態において、前記薬物がDASまたはDAS28における重要な変化を引き起こすことができる場合、前記薬物は、治療した患者からの1以上の症状を緩和することができ、および/または治療した患者からの細胞または組織の1以上の特徴またはパラメータは、本発明の分子または組成物を使用して改善される。リウマチ様関節炎を評価する他の方法も、van Riel P. L.C.M., (2001), Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76 and in Gester A.M., (1999), Bailliere’s Clinical Immunology, 13: 629-644に記述される。C5aの量を減らすためのC5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができ、および/または可溶性IL−1RAcPの量を増やすためのIL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を使用した、少なくとも1週間、1か月、6か月、1年またはそれ以上の期間の治療の後に、前記パラメータの値が、治療の開始前の前記パラメータの値との比較において少なくとも1%、2%、5%、10%またはそれ以上改善した場合に、ここに定義されるような薬物は1つのパラメータを改善することができる。

ここに定義される薬物は、C5aの量を減らすためのC5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができ、および/または可溶性IL−1RAcPの量を増やすためのIL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を使用した、少なくとも1週間、1か月、6か月、1年またはそれ以上の期間の治療の後に、前記症状または特徴がもはや検出されない場合に、患者の、または前記患者の細胞、組織または臓器の1つの症状または1つの特徴を緩和することができる。

本発明による使用のためのここに定義されたオリゴヌクレオチドは、炎症性障害に冒されたまたはそれを発症するリスクのある個体のインビボの細胞、組織および/または臓器への投与に適していてよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロの投与に適していてよい。前記オリゴヌクレオチドは、炎症性障害に冒されたまたはそれを発症するリスクのある個体のインビボの細胞、組織および/または臓器に直接的または間接的に投与してよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロで直接的または間接的に投与してよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、C5、IL−1RAcPが発現または製造されるあらゆる部位に送達され得るに違いない。C5および可溶性IL−1RAcPは、本来、任意の対象の肝臓において発現または製造されるため、本発明のオリゴヌクレオチドは、肝細胞に、および/または肝組織におよび/または肝臓に送達することができることが好ましい。好ましくは、前記細胞は炎症性障害を患う個体の細胞である。好ましくは、前記組織は炎症性障害を患う個体の組織である。好ましくは、前記肝臓は炎症性障害を患う個体の肝臓である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において既知の適切な手段を使用して、間接的に投与されてよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、発現ベクターの形態で、個体、または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に提供されてよく、ここにおいて、発現ベクターは、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達ベヒクルによって細胞、組織、器官または個体に導入される。好ましい実施形態において、ここに定義される分子の発現または転写を推進する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。好ましい送達ベヒクルは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)またはレトロウイルスベクター例えばレンチウイルスベクター(24−26)等である。プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的化された相同組換えおよび組み込みに適したプラスミドもまた、ここに定義されたオリゴヌクレオチドの送達に適切に適用してよい。転写はPolIIIプロモーターにより推進され、および/または転写物は、小さな転写物の送達のために良好な結果をもたらすU1またはU7転写物との融合の形態である、これらのベクターが、本発明に好ましい。適切な転写物を設計することは当業者の技術的範囲に属す。PolIIIで駆動される転写物が好ましい。好ましくは、U1またはU7転写物との融合転写物の形態を有する(24−26)。そのような融合は、(27,28)に記述されるように、生成してよい。オリゴヌクレオチドはそのまま送達されてよい。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターによってコードされてよい。典型的に、これは、転写物の一部にオリゴヌクレオチドの配列を含むRNA転写物の形態である。

個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器にオリゴヌクレオチドおよび/またはその等価物を供給するための手段における改良は、これまで成し遂げられた進歩を考慮して予測される。そのような将来の改良は、当然、本発明の方法を使用して、mRNAの再構築における言及された影響を達成するために組込まれてよい。オリゴヌクレオチドおよび/またはその等価物は、個体、前記個体の細胞、組織または臓器にそのまま送達することができる。オリゴヌクレオチドおよび/またはその等価物を投与する場合、オリゴヌクレオチドおよび/またはその等価物は、送達方法に適合する溶液に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、鞘内および/または脳室内の投与については、溶液は生理的食塩水であることが好ましい。本発明において、細胞へのおよび/または細胞内、好ましくは肝細胞内への、ここに定義されるような構成分子の各々の送達を援助する賦形剤の使用は特に好ましい。ここに定義されるような各々の構成分子を送達し、細胞膜を通して小胞またはリポソームにて複合化されまたはトラップされる、複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞および/またはリポソームを形成できる賦形剤が好ましい。これらの賦形剤の多くは当該分野において知られている。適切な賦形剤は、ポリエチレンイミン(PEI)、またはポリプロピレンイミンまたはポリエチレンイミンの共重合体(PEC)および誘導体を含む、同様のカチオンポリマー、合成両親媒性物質(SAINT−18)、リポフェクチンTM、DOTAPおよび/または、ここに定義されるような各々の構成分子を細胞、好ましくは肝細胞に送達することができる粒子中に自己構築できるウイルスキャプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、肝細胞を含む種々の培養細胞に対して、アンチセンス核酸のようなオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクションの可能性は、全細胞の生存の観点で低から中程度の毒性の除外と組み合わせられる。構造の修飾の容易さは、さらなる改良、およびさらなる(インビボ)核酸の送達の特徴および毒性の分析を可能にするために使用できる。

リポフェクチンは、リポソームのトランスフェクション剤の例である。これは、2つの脂質成分、陽イオン性脂質N−[1−(2,3ジオレオイロキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウム塩化物(DOTMA)(cp.硫酸メチル塩であるDOTAP)と、中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)とから成る。中性成分は細胞内放出を媒介する。送達システムの別のグループは重合体のナノ粒子である。

DNAトランスフェクション剤として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル(DEAE)−デキストランといったポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート(PBCA)およびヘキシルシアノアクリレート(PHCA)と組み合わせて、ここに定義されるような各々の構成分子を、好ましくはオリゴヌクレオチドを、細胞膜を横切って細胞中に送達することができる陽イオン性ナノ粒子を調製することができる。

これらの通常のナノ粒子材料に加えて、陽イオン性ペプチドであるプロタミンは、コロイドによるオリゴヌクレオチドの調製のための代替的なアプローチを提供する。このコロイド性のナノ粒子システムはプロティクル(proticle)と呼ばれ、単純な自己組み立てプロセスによって、オリゴヌクレオチドを包装し、細胞内放出を媒介するように用意することができる。当業者は、ヒトにおける炎症性障害の治療のためにそれを送達する本発明において使用するために、オリゴヌクレオチドを包装し、送達するために、上記の何れかまたはその他の市販の代替となる賦形剤および送達システムを選択してよい。

別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、分子に対して共有結合または非共有結合できる。好ましい分子は、下に定義されるようなリガンドおよび/または前記オリゴヌクレオチドの安定性および/または薬物動態学および/または薬物動力学を変化することができる分子である。これらのパラメータ(すなわち安定性および/または薬物動態学および/または薬物動力学)の各々は、当業者に既知のアッセイを使用して評価することができる。

オリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質および/またはその核への取り込みを促進するように特異的に設計されたリガンドに共有結合または非共有結合することができる。そのようなリガンドは(i)細胞取り込みを促進する、細胞、組織または臓器に特異的な要素を認識する化合物(ペプチド(様)構造を含むが、これらに限定されない)および/または(ii)エンドソームまたはリソソームといった小胞からのオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みおよび/または細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含む。

したがって、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、組成物または薬物にて調製され、あるいは送達および/またはその細胞への送達装置および/またはその細胞内送達の増強のために、少なくとも賦形剤および/またはリガンドとともに提供される組成物にて調製される。したがって、本発明は、送達および/またはその細胞への送達装置および/またはその細胞内送達の増強のための、オリゴヌクレオチドを含み、少なくとも1つの賦形剤および/またはリガンドをさらに含む医薬的に許容可能な組成物をさらに包含する。

それらのアイデンティティーに依存して、当業者は、どの種の調製がここに定義されるような構成成分の各々にとって最も適切であるかを知るだろう。好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドおよび後に定義されるようなさらなる補助的化合物を含む部分のキットの形態である組成物または調製物を提供する。

ここに定義された好ましいオリゴヌクレオチドは、個体における炎症性障害を防ぐまたは治療するためのものである。本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療してよい個体は、既に炎症性障害を有していると診断されていてよい。あるいは本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療してよい個体は、まだ炎症性障害を有していると診断されていないものの、将来の所定の彼または彼女の遺伝的背景において炎症性障害の発症リスクが大きな個体であってよい。好ましい個体はヒトである。

組成物
さらなる側面において、ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、ここに定義されるような少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドを含む;一方は、C5aの量を減少させるために、C5のmRNA前駆体のスプライシングを変更することができるように設計されており、他方は、可溶性IL−1RAcPの量を増加させるために、および/またはNF−κBの活性を減少させるために、および/またはIL−6/ICAM−1の放出を減少させるために、および/または遊離型IL−1の量を減少させるために、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変更できる。あるいは、これらの異なる2つのオリゴヌクレオチドは、マルチエキソンスキッピングのために、先に定義されるようなC5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の異なる2以上のエキソンをスキップするように設計されている。好ましい実施形態において、前記組成物は、好ましくは、医薬組成物であり、前記医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、希釈剤および/または賦形剤を含む。

そのような医薬組成物は、任意の医薬的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、希釈剤および/または賦形剤を含んでよい。そのような医薬的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、希釈剤および/または賦形剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000にて見つけられてよい。前記組成物の特徴はそれぞれ先に定義されている。

いくつかのオリゴヌクレオチドを使用する場合、既にここに定義された濃度または用量は、使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの全濃度または用量を意味し、または使用されるまたは添加される各々のオリゴヌクレオチドの濃度または用量を意味する。したがって、1つの実施形態において、使用されるオリゴヌクレオチドの各々または合計の量が0.5mg/kgから60mg/kgの量とされる組成物が提供される。

使用
さらなる側面において、個体における炎症性障害を予防しまたは治療するための薬物の製造のための、ここに定義されるオリゴヌクレオチドまたは組成物の使用が提供される。前記使用の特徴はそれぞれ先に定義されている。

本発明による使用または方法における治療は、少なくとも1週間、少なくとも1か月、少なくとも1年、少なくとも2、3、4、5、6年またはそれ以上である。本発明による使用のための、ここに定義される分子またはオリゴヌクレオチドまたはその等価物の各々は、炎症性障害を患うか、またはその発症のリスクがある個体の細胞、組織および/または臓器にインビボでの直接の投与に適していてよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロで直接投与されてよい。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物の投与の頻度は、患者の年齢、患者の変異、分子の数(すなわち用量)、前記分子の調製といった複数のパラメータに依存してよい。頻度は、毎日、毎週であってよく、または少なくとも2週、3週、4週、5週またはそれより長い期間に一度であってよい。

方法
さらなる側面において、個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器において炎症性障害の1以上の症状を緩和する方法、または前記個体の細胞、組織または臓器の1以上の特徴または症状を緩和する方法であって、前記個体にここに定義されるようなオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。

さらに、炎症性障害を患う個体における前記mRNA前駆体を発現する細胞において、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体からのエキソンのスキッピングを増強、誘導または促進する方法であって、前記個体にここに定義されるようなオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。

さらに、IL−1RAcPまたはC5をコードするmRNA前駆体を含む細胞において可溶性IL−1RAcPの製造を増加させるためのおよび/またはC5aの製造を減少させるための方法であって、前記細胞に本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を供給すること、および前記mRNA前駆体のスプライシングから製造されるmRNAの翻訳を可能にすることを含む方法が提供される。1つの実施形態において、前記方法は、例えば細胞培養を使用してインビトロで行なわれる。好ましくは、前記方法はインビボである。これらの方法の特徴はそれぞれ既にここに定義されている。本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、個体において炎症性障害の治療のために使用されることが既知の付加的な化合物と組み合わされてよい。そのような化合物は、抗体、DMARD(疾病改変抗リューマチ薬)、NSAID(非ステロイド性抗炎症剤)および/または異なるかまたは別のAONであってよい。可溶性IL−1RAcPの製造の増大の代わりに、またはそれとの組み合わせで、AONは、NF−κBの活性化を減少させてよく、および/またはIL−6/ICAM−1の放出を減少させてよく、および/または先に定義されるような遊離型IL−1の量を減少させてよい。

本願を通して、IL−1、IL−1RAcP、C5、C5a、IL−6と呼ばれた場合、特に記載されない限りタンパク質またはペプチドを指す。したがって、IL−1は、IL−1タンパク質と置き換えてよい。特に記載されない限り、ここに記述される実施形態はそれぞれここに記述される別の実施形態と組み合わせてよい。

この書面および特許請求の範囲において、「含む」という動詞およびその語形変化は、非限定的な意味で、単語に続く事項を含むが、特に言及されていない事項を除外しないことを意味するものとして使用される。さらに「から成る」とう動詞は、「から本質的に成る」と置換することができ、ここに定義された分子またはオリゴヌクレオチドは、特異的に同定されたもの以外の、本発明の固有の特徴を変化させない付加的な成分を含んでよいことを意味する。

さらに、不定冠詞「a」または「an」による要素への言及は、文脈が、1つおよびただ1つの要素が存在することを明確に要求しない限り、1つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「a」または「an」は、したがって、通常「少なくとも1つ」を意味する。

「ほぼ」または「約」という単語が、数値に関して使用された場合(ほぼ10、約10)、好ましくは、その値は、所定値10の1%前後の値であることを意味する。

本願明細書にて引用された全ての特許文献および参考文献は、その全体が本願に援用される。特に記載されない限り、ここに定義されるそれぞれの実施形態は、ともに組み合わせてよい。

本発明は、下記の例においてさらに説明される。これらの例は、本発明の範囲を制限せず、単に本発明を明確化するためのものである。

フランキングイントロンを有するマウスC5 mRNA前駆体エキソン17を標的化するAON。 L929細胞に、表示されるAONを終濃度500nMでトランスフェクトした。24時間後、RNAを、エキソンスキッピングのために単離し、RT−PCRにより分析した。 フランキングイントロンを有するマウスIL−1RAcP mRNA前駆体エキソン9を標的化するAON。 NIH/3T3細胞に、表示されるAONを終濃度500nMでトランスフェクトした。24時間後、RNAを、エキソンスキッピングのために単離し、RT−PCRにより分析した。 ヒトC5 mRNA前駆体エキソン17を標的化するAON。 フランキングイントロンを有するヒトIL−1RAcP mRNA前駆体エキソン9を標的化するAON。 HEP−G2細胞に、表示されるAONを終濃度500nMでトランスフェクトした。24時間後、RNAを、エキソンスキッピングのために単離し、RT−PCRにより分析した。 1−30; IL−1RAcPエキソン9スキッピングのための種々の濃度の種々のAONで治療したNIH−3T3細胞のRT−PCR結果。

1: 300−21mer 20nM
2: 300−21mer 50nM
3: 300−21mer 100nM
4: 300−21mer 200nM
5: 300−21mer 500nM
6: 300−25mer 20nM
7: 300−25mer 50nM
8: 300−25mer 100nM
9: 300−25mer 200nM
10: 300−25mer 500nM
11: 327−21mer 20nM
12: 327−21mer 50nM
13: 327−21mer 100nM
14: 327−21mer 200nM
15: 327−21mer 500nM
16: 327−25mer 20nM
17: 327−25mer 50nM
18: 327−25mer 100nM
19: 327−25mer 200nM
20: 327−25mer 500nM
21: 300−LNA 10nM
22: 300−LNA 20nM
23: 300−LNA 50nM
24: 300−LNA 100nM
25: 300−LNA 200nM
26: 300−LNA 500nM
27: ポジティブコントロール
28: ネガティブコントロール
29: トランスフェクトせず
30: 疑似的トランスフェクト
M マーカー
31−55; C5エキソン17スキッピングのための種々の濃度の種々のAONで治療したL929細胞のRT−PCR結果。

31: 329−21mer 20nM
32: 329−21mer 50nM
33: 329−21mer 100nM
34: 329−21mer 200nM
35: 329−21mer 500nM
36: 329−25mer 20nM
37: 329−25mer 50nM
38: 329−25mer 100nM
39: 329−25mer 200nM
40: 329−25mer 500nM
41: 329−LNA 10nM
42: 329−LNA 20nM
43: 329−LNA 50nM
44: 329−LNA 100nM
45: 329−LNA 200nM
46: 329−LNA 500nM
47: 354−25mer 20nM
48: 354−25mer 50nM
49: 354−25mer 100nM
50: 354−25mer 200nM
51: 354−25mer 500nM
52: トランスフェクトせず
53: 疑似的トランスフェクト
54: ポジティブコントロール
55: ネガティブコントロール
種々の濃度におけるIL−1RAcPのための種々のAONのスキッピング効率の、qPCRを用いた比較。 種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−300およびシーケンシングの結果。

a)IL−1RAcP AONを8日間、50mg/kgでIP注入。注入後1日において犠牲にした。

b)4または3日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。

c)より低いバンドの配列分析。
種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−300およびシーケンシングの結果。

a)IL−1RAcP AONを8日間、50mg/kgでIP注入。注入後1日において犠牲にした。

b)4または3日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。

c)より低いバンドの配列分析。
種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−300およびシーケンシングの結果。

a)IL−1RAcP AONを8日間、50mg/kgでIP注入。注入後1日において犠牲にした。

b)4または3日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。

c)より低いバンドの配列分析。
種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−329およびシーケンシングの結果。

a)C5−AONの4日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。コントロールAON(4日間、50mg/kg)。

b)C5−AONの3日間の100mg/kgAONでのIV注入。m1は、注入後1日において犠牲にした。m2は、中入後5日において犠牲にした。

c)シーケンシングの結果。
種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−329およびシーケンシングの結果。

a)C5−AONの4日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。コントロールAON(4日間、50mg/kg)。

b)C5−AONの3日間の100mg/kgAONでのIV注入。m1は、注入後1日において犠牲にした。m2は、中入後5日において犠牲にした。

c)シーケンシングの結果。
種々のAON量で治療した肝臓サンプルのRT−PCR結果。PS−329およびシーケンシングの結果。

a)C5−AONの4日間の100mg/kgでのIV注入。注入後1日において犠牲にした。コントロールAON(4日間、50mg/kg)。

b)C5−AONの3日間の100mg/kgAONでのIV注入。m1は、注入後1日において犠牲にした。m2は、中入後5日において犠牲にした。

c)シーケンシングの結果。

発明の詳細な説明

[実施例]
溶血性補体アッセイ
C5およびC5Δ17(エキソン17を欠く)のcDNAを合成し、ベクターpcDNA3.1(−)に結紮する。ヒト胚性腎細胞(HEK293)に、C5またはC5Δ17のいずれかを含む発現ベクターをトランスフェクトし、G−418を含む培地で培養しポジティブコロニーを選択する。その後、ポジティブコロニーを無血清条件にて培養し、培養培地を回収し、精製し、ウエスタンブロット法によりC5およびC5Δ17の存在を試験する。その後、精製した上清を、無処置のC5bが存在するかどうか示す溶血性補体アッセイに供する。この機能アッセイにおいて、両方の上清を、C5を欠く血清で処理し、この溶液を赤血球とともにインキュベートする。C5b−9を介した溶解の程度を、415nmにてODを測定することにより決定する。

材料および方法(全ての例について)
AONの設計および化学
AONは、Aartsma-Rus et al., 2009にて以前に議論された基準に基づいて設計した(Aartsma-Rus et al., Guidelines for antisense oligonucleotide design and insight in splice modulating mechanisms, Mol Ther. 2009 Mar; 17(3):548-53)。潜在的なエキソンスプライスエンハンサー(ESE)の位置、または5’/3’スプライスサイト配列に対する位置は、ESEファインダー3.0を使用して予測した(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/)。M−FOLD(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)によって予測されるmRNA前駆体の二次構造を、さらに考慮に入れた。AONは、2’O−メチルリボース分子および完全なホスホロチオネート骨格(Prosensa)を備えた21−25merだった。AONの配列は配列表にて提供される。5’FAM標識コントロールAONを、標的細胞へのトランスフェクションの効率を試験するために使用した。さらに、標的に対するそれらの効率を増加させるために、それらの長さを25merに増加させることによっておよび/またはいくつかのロックされた核酸(LNA)の改変の組み込みによって、選択したAONを改変した。これらのAONの設計のために、http://www.exiqon.com/custom-antisense-oligonucleotidesの基準を使用した。

細胞培養:
L929(マウス結合組織)、NIH−3T3(マウス胚性繊維芽細胞)およびHEPG2(ヒト肝細胞性肝臓癌)細胞株を、37℃、5%のCO下で、DMEM+2mMのL−グルタミン+10%のFCS+1xPen−Strepに維持した。それらを、それぞれmIL−1RAcP、mC5およびhIL−1RAcP/hC5についてのAONを使用してエキソンスキッピングを試験するために使用した。

細胞培養におけるAON送達:
L929およびNIH3T3細胞を、DMEM+10%のFBS+1%Pen−Strepを含む培地で培養し、6ウェルプレートにおける実験培養のために、0.25%のトリプシンとともに備えたコンフルエントの状態になるまで培養した。トランスフェクションの日に、細胞(0.5−1×10細胞/ウェルの6ウェルプレート)を、DMEM+10%のFCS(抗生物質を含まない)にて培養した。3−4から5−6時間後、細胞において、製造者(Invitrogen)の手順に従って準備したリポフェクタミン2000+AON混合物を用いてトランスフェクトした。AONの終濃度は、種々の実験において、500nM、200nMまたは100nMに調節した。それぞれのAONは3回試験し、スキッピング効率を決定した。6ウェルプレートの1ウェルのためのトランスフェクション溶液は次のように準備した:AONを、250μlのOptimem血清低減培地に希釈した(細胞に添加したときのAONの終濃度は、実験の目的に応じて、100nM、200nM、100nM、50nM、20nMまたは10nMとした)。さらに、5μlのリポフェクタミンを250μlのOptimemに希釈し、両希釈物を室温にて5分間インキュベートした。その後、2つの希釈物を混合し(全容量500μl)、20分間インキュベートし、細胞プレートに添加し、前後に数回振動させ、5%のCOの下37℃でインキュベートした。6−8時間後、トランスフェクション培地をDMEM+10%のFBSに交換し、18−24時間後、RNA単離のために細胞の用意が整った。

RNA単離および逆転写PCR:
10細胞からのAONのトランスフェクションの24時間後、Trizol試薬(Invitrogen)を使用して、全RNAを単離した。cDNAは、任意のヘキサマープライマーを使用して、製造者(Roche)の手順に従って、トランスクリプター一本鎖cDNA合成キットにて合成した。2μLのcDNAを、50μLの終濃度でPCR反応に使用した。プライマー配列は、5’から3’の方向で、mC5 F(フォワード):aaacgcagatgactcccatt、mC5 R(リバース):acgcgatgaatttcccatag、mIL−1RAcP F:gaggatctcaggcgcaacta、mIL−1RAcP R:tcagcagcacaaattcctctt、hC5 F:ttctcaggccaagaagaacg、hC5 R:gggcaaactgcaactgtttt、hIL−1RAcP F:caagcgcagctatgtctgtc、hIL−1RAcP R:tctcggtcaaagatgcacagである。ベータアクチン遺伝子(ACTB)をポジティブコントロールとして使用した:ACTB F:actgctctggctcctagcac、ACTB R:ccaccgatccacacagagta。これらのプライマーは配列表において配列番号43−52として示されている。PCR産物を、EtBrで染色した1,5%のアガロースゲルで分析した。シーケンシグのために、PCR産物をNucleoSpin抽出IIキット(Macherey−Nagel)にて精製した。産物の配列分析はLGTC(Leiden)で行った。肝臓からのRNA単離のために、15−30mgのマウス肝臓を、MagnaLyzer Green Beads(Roche)チューブに移した。5ulの2−メルカプトエタノールを含む500ulのPBSを添加し、氷上にて、サンプルを、MagnaLyzerにて7000rpmで20秒間ホモジネートし、その後、さらに10秒間、7000rpmでホモジネートした。200μlのホモジネートした組織を、800μlのTrizol試薬に添加し、RNA単離を、製造者の手順に従って行った。

リアルタイムPCR分析:
2.5μLのcDNA(20倍希釈)、5μLの2xFastStart Universal SYBR Green Master(ROX.,Roche)、0,25μLの10pmoleプライマーを、全10μLの反応混合物にて使用した。プライマー配列は、5’から3’の方向で、mIL−1RAcP F:tggtagtggttctcattgtggt、mIL−RAcP R:tccaaagtgagctcggtaaaa、mC5 F:aaagcccccataaacctgtc、mC5 R:tcggatatctgccttcatcaである。全ての定量的PCRデータは、ハウスキーピング遺伝子ACTBおよびシトクロムc−1(Cyc1)の発現にて標準化した:ACTB F:actgctctggctcctagcac、ACTB R:ccaccgatccacacagagta、Cyc1 F:tgctacacggaggaagaagc、Cyc1 R:catcatcattagggccatcc。LightCycler480リアルタイムPCRシステム(Roche)を、反応を実行するために使用し、データをソフトウェアプログラムqBase(Biogazelle NV, Belgium)によって分析した。これらのプライマーは配列表において配列番号53−60として示されている。

mRNAレベルでのスキッピングのインビボ検出
オスの6週齢のC57BL/6マウスをJackson Laboratoryから購入し、3または4日間連続で、インシュリンMyjector U−100インスリンシリンジを使用して、IBまたはIPで、50または100mg/kgのAONを注射した。注射から1日後または5日後に、肝臓を採取し、RNAの分解を防ぐためにRNA単離まで液体窒素に維持した。RNA単離およびRT−PCR処置を先に記載した通りに行った。

細胞からのタンパク質の単離
培養培地を細胞から取り除き、1mlの冷却したRIPAバッファー(Rocheの完全ミニプロテアーゼ阻害剤を含む)を、75cm2フラスコにて5x10細胞に対して添加し、揺らしながら5分間氷上に維持した。細胞溶解物を、細胞スクレーパーを使用して集め、マイクロ遠心分離チューブに移した。サンプルは15分間14.000xgで遠心分離し、細胞デブリスを沈殿させた。上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度うぃQuanti−itタンパク質アッセイキットを使用して決定した。

SDS−PAGE
7.9mlの水、5mlの1.5MTris−Hcl(pH8.8)、6.70mlのアクリルアミド、200μlの10%SDS、8μlのTEMEDおよび200μlの10%APSを混合して、10%ゲルの分離ゲルを作製した。TEMEDおよびAPSを添加した直後、ゲルを注ぎ(7.2ml/ゲル)、1mlのイソプロピルアルコール/Miliq(50/50)をゲルの上部に置き、重合させた。ゲルは約30分間重合させた。その後、5.5mlの水、1mlの1MのTris−HCl(pH6.8)、1.33mlのアクリルアミド、80μlの10%SDS、8μlのTEMEDおよび80μlの10%APSを混合して、スタッキングゲルを準備し、分離ゲルの上にピペットで移し、コームを設置し、重合させた。タンパク質サンプルを準備し(フード下において、15μlサンプル+5μlローディングバッファー)、サンプルを5分間95℃で煮沸し、氷上で冷却した。スタッキングゲルの準備を整えて、ランニングバッファーをゲルユニットのチャンバーの上部および下部に添加し、それぞれのスロットに15μl充填した。サンプルが分離ゲルに達するまで、ゲルに80Vの電圧をかけ、その後、青い色がゲルを離れるまで120Vの電圧をかけた。

ウエスタンブロッティング法
2つの繊維パッドおよび3枚のプリカットされたWhatman3MM紙を用意し、トランスファーバッファーに浸した。PVDF膜を100%メタノールに短時間浸し、蒸留水で2度洗浄し、PBSにてインキュベートした。システムをカセットにて以下の順番で組み立てた:1つの繊維パッド、3つのWhatman紙、ゲル、PVDF膜、3つのWhatman紙、1つの繊維パッド。カセットを電極モジュールに挿入し、膜がゲルと陽極との間に位置するようにトランスファータンクに入れ、冷却室(4℃)にて1時間、サンプルに100Vの電圧をかけた。緩やかに振動する振動プラットフォームにて、室温で1時間または4℃で一晩、膜をOdysseyブロッキングバッファーにてブロッキングした。一次抗体をOdysseyブロッキングバッファーにて希釈し、バックグラウンドを低下させるために、0.2%のTween−20を希釈した抗体に添加し、振動プラットフォームにて一晩穏やかに揺らしながらインキュベートした(最適なインキュベーション時間は、一次抗体ごとに異なる)。ウサギ抗ヒトIL−1RAcP抗体(AbD serotec、製品番号AHP549)およびチキンポリクローナルベータアクチン抗体(Abcam、製品番号Ab 13822)を使用した。膜を、穏やかに振動させながらPBS+0.1%Tween−20で室温にて5分間の洗浄を4回行い、Odysseyブロッキングバッファー(0.2%のTween−20および0.01%−0.02%のSDSを添加)に希釈した蛍光標識二次抗体とともに1時間室温で、光を遮りながらインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギAb(Licor、製品番号926−32211)およびロバ抗チキンAb(Licor、製品番号926−32228)を使用した。膜に対して、穏やかに振動しながら(光を遮断)、PBS+0.1%のTween−20にて室温における5分間の洗浄を4回行い、その後、膜を、Li−cor Odysseyイメージングシステムにてスキャンした。

NF−κB活性アッセイ
NIH−3T3細胞を、24ウェルプレートに40.000細胞/ウェルで播種した。翌日、細胞に、上記の手順によってコントロールおよび試験されるAONをトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、リポフェクタミン2000によりpNFκB−LucおよびpRL−CMVプラスミドをトランスフェクトした。翌朝、細胞を4時間、mIL−1βで刺激した。デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ(Promega)の試薬を、製造者の手順にそって準備した。培養培地を除去し、細胞を1mlのPBSで洗浄した。250μlの1X Passive Lysisバッファーを細胞に添加し、細胞を採取した。細胞溶解物をマイクロ遠心分離チューブに移し、4℃で、13,000gにて5分間遠心分離することで、デブリスを除去した。30μlの溶解物を、96ウェルプレートのウェルの各々に添加した。100μlのLARIIをウェルの各々に添加し、ホタルルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。その後、100μlの1XStop&Glo試薬をウェルの各々に添加し、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。pNFκB−Luc活性はpRL−CMVにて標準化した。

IL−1誘導型サイトカイン産生アッセイ
NIH−3T3細胞を、10%FBSを補ったDMEMにおいて、6ウェル培養ディッシュにて、0、5x10細胞/ウェルの密度で、培養した。細胞に対して、先に記載するように、50nMのAON PS−300LNAをトランスフェクトした。16時間後、細胞を1ng/mlのマウスIL−1βで4−5時間刺激した。その後、先に記述するように、全RNAの単離およびcDNA合成を行った。IL−1に誘導される、IL−6およびICAM−1といったサイトカインの誘導を、以下のプライマーセットを使用して、先に記述されるようなqPCRアッセイを行なうことで決定した:マウスIL−6フォワードプライマーCCGGAGAGGAGACTTCACAG、IL−6リバースプライマーTCCACGATTTCCCAGAGAAC;マウスICAM−1フォワードプライマーGGCATTGTTCTCTAATGTCTCCGを進める、ICAM−1リバースプライマーGCTCCAGGTATATCCGAGCTTC。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンの発現で標準化した;マウスのベータアクチンフォワードプライマーACTGGGACGACATGGAGAAG、リバースプライマーGGTCATCTTTTCACGGTTGG。これらのプライマーは配列番号66−71として配列表に示される。

例1:炎症性疾患を治療するための、C5aタンパク質のエキソン17のスキッピングまたはsIl−1RAcPタンパク質のエキソン9のスキッピング
炎症性疾患を治療するためのC5aタンパク質のエキソン17のスキッピング
目的は、C5aの量を減少させ、C5bをそのままの状態に維持することである。C5は肝臓によって生産されるため、C5特異的AONの標的器官は肝臓である。

マウスC5エキソン17を標的エキソンとして選択した。それは、C5aのアナフィラトキシンドメインをコードする。IVまたはIP注射後、大部分のAONは肝臓に行き、肝細胞によって容易に取り込まれる。そこで、それらはRNaseHによる標的の分解を生じることなく、標的RNAとハイブリダイズする。エキソン17との結合により、このエキソンは、スプライシング機構によって認識されず、オープンリーディングフレームをそのままに維持しながら、フランキングイントロンとともに除去されるだろう。生じる切断型タンパク質C5Δ17は、C5転換酵素によってC5bに転換され、C5bは、なおMACに取り込まれることが可能であり、C5aの残る、小さな、非機能的部分は恐らく分解されるだろう。機能的C5b分子が生産されたか否かを明らかにするために、機能アッセイを設計し、実行した。

種々のESE結合部位または5’−3’スプライスサイトをカバーするAONを設計し(図1)、試験し(表1)、結果を図2に示す。我々は、エキソン17のスキッピングに使用できるエキソン(およびフランキングイントロン)の可能な部位をすべてカバーするAONを設計し、qPCR分析によってさらに試験して効率的なものを選択した。選択されたAONのスキッピング効率を増大するために、それらの長さを25merまで延長し、限定された数の5−6LNA修飾を付加した。ハイブリダイゼーション特性が増強されたかどうかは、インビトロで試験した(図8、31−55)。

炎症性疾患を治療するためのsIl−1RAcPタンパク質のエキソン9のスキッピング
目的は、可溶性IL−1RAcPの量について、その膜結合形態から可溶性形態に変化させることで増大させることである。それは肝臓によって生産されるため、可溶性IL−1RAcPに特異的なAONのための標的器官は肝臓である。

マウスIL−1RAcPエキソン9は、IL−1RAcPの膜貫通ドメインをコードするため、それを標的エキソンに選択した。エキソン9のスキッピングがオープンリーディングフレームを妨害しないため、我々は、IL−1RAcPΔ9と呼ばれる可溶性形態の取得を提案する。IVまたはIP注射後、AONは肝臓に行き、肝細胞によって容易に取り込まれる。そこで、それらはRNaseHによる標的の分解を生じることなく、標的RNAとハイブリダイズする。エキソン9との結合により、このエキソンは、スプライシング機構によって認識されず、フランキングイントロンとともに除去されるだろう。

異なるESE結合部位または5'−3'スプライスサイトをカバーするAONを設計し(図3)、試験し(表2)、結果を図4に示す。我々は、エキソン9のスキッピングに使用できるエキソン(およびフランキングイントロン)の可能な部位をすべてカバーするAONを設計し、qPCR分析によってさらに試験して効率的なものを選択した。選択されたAONのスキッピング効率を増大するために、それらの長さを25merまで延長し、限定された数の5−6LNA修飾を付加した。ハイブリダイゼーション特性が増強されたかどうかは、インビトロで試験した結果を図8に示す(1−31)。異なる濃度における異なるAONのスキッピング効率もqPCRと比較した(図9)。

例2:細胞株におけるオリゴヌクレオチドの機能性の確認
結果:
C5エキソン−17スキッピング
C5aの濃度を減少させるために、一連のAONをマウスまたはヒトエキソン17を標的化するように設計した(例1を参照)。それらは、L929およびHepG2細胞株それぞれでスクリーニングした。細胞株はリポフェクタミン2000にてAONをトランスフェクトし、平均トランスフェクション効率を、蛍光性AONを使用して決定した。マウス標的エキソンについての11AONおよびヒト標的エキソンについての3AONのスクリーニングから、AON PS329およびPS377は、スキッピングエキソン17において最も成功したAONとして選択された。有効なAONは、マウスおよびヒト標的について、それぞれ約178bpおよび約155bpのサイズで、より短い転写物断片を作ると予想された(図2および7)。配列分析は、さらにより短い断片は欠いているエキソン17であることを示した。AON PS−329,329−25mer,354,329−LNAは、異なる濃度において広範囲に試験し、スキッピングにおける効率と比較した。より短い断片のアガロースゲルにおけるバンドの密度の比較に基づいて、PS−329−LNAはその他のものよりも少し有効であった(図8、31−55)。AON PS−329も試験し、パイロット実験において機能的インビボを見出した。100mg/kgのAONを、IVで3または4日間注射し、肝臓試料をRT−PCRで分析し、エキソンスキッピングを検出した。スキップされた産物は正確なサイズを有しており、配列分析から、それが正確な産物であることが確認された。

IL−1RAcPエキソン9−スキッピング
可溶性IL−1RAcPの産生(IL−1RAcPΔ9)を誘導するために、一連のAONをマウスおよびヒトエキソン9を標的化するように設計した(例2を参照)。それらは、NIH−3T3およびHepG2細胞株にてそれぞれスクリーニングした。細胞株はリポフェクタミン2000にてAONをトランスフェクトし、平均トランスフェクション効率を、蛍光性AONを使用して決定した。マウス標的エキソンについての13AONおよびヒト標的エキソンについての5AONのスクリーニングから、AON PS300およびPS373は、スキッピングエキソン9において最も成功したAONとして選択された。有効なAONは、マウスおよびヒト標的について、それぞれ約150bpおよび約200bpのサイズで、より短い転写物断片を作ると予想された(図4および7)。配列分析は、さらにより短い破片がエキソン9を欠くことを示した。AON PS−300,300−25mer,300−LNA,327および327−25merは、異なる濃度において広範囲に試験し、スキッピングにおける効率と比較した。PS−300−LNAは、特に50nMの濃度での他のAONよりも、スキッピングにおいてはるかに有効だった(約85%)(図8、1−31)。qPCR分析によって結果を確認した(図9)。AON PS−300も、パイロット実験においてインビボで試験した。50−100mg/kgのAONを3または4日間IPまたはIVで注射し、肝臓試料を、エキソンスキッピングのためにRT−PCRで分析した。スキップされた産物は正確なサイズを有していることが、配列分析で確認された。インビボスキッピング効率は、インビトロスキッピング効率と比較可能だった(図10)。

例3:本発明のオリゴヌクレオチドの機能性を試験するその他の方法
本発明のオリゴヌクレオチドの有効性を、さらに、ウエスタンブロッティング法により、sIL−1RAcP、IL−1、C5aまたはC5bを定量することによって、タンパク質レベルで試験してよい:例えば、可溶性sIL−1RAcPの増加および/または遊離型IL−1の減少および/またはC5aの減少。本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、分子の活性の存在もしくは濃度またはIL−1によって誘導または活性化された経路を評価することによる、Il−1RAcPのための機能アッセイによって試験してよい。Il−1はNF−κB活性化を誘導する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、NF−Κbの活性化、NF−Κbの活性の低下を評価することで試験してよい。

IL−1は、IL−6またはICAM−1のような細胞からのあるケモカインおよび炎症誘発性サイトカインの産生を誘導する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、IL−6またはICAM−1の存在、IL−6および/またはICAM−1の減少を評価することで試験してよい。

本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、Van Dijk H. Et al, (1980), J. Immunol. Meth. 39: 257-268に記載されるように、溶血性アッセイのようなC5のための機能アッセイによって試験してよい。

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Claims (19)

  1. 可溶性IL−1RAcPの量を増やすために、IL−1RAcPをコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物。
  2. 前記オリゴヌクレオチドは、IL−1RAcPをコードする前記mRNA前駆体のエキソン9のスキッピングを誘導することができる、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. C5aの量を減らすために、C5をコードするmRNA前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物。
  4. C5bの量は変化しない、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記オリゴヌクレオチドは、C5をコードする前記mRNA前駆体のエキソン17のスキッピングを誘導することができる、請求項3または4に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 前記オリゴヌクレオチドは、IL−1RAcPをコードする前記mRNA前駆体のエキソン9またはC5をコードする前記mRNA前駆体のエキソン17の包含を阻害する、請求項2または5に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 前記オリゴヌクレオチドは、前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンの少なくとも一部または前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部に相補的な配列またはそれに結合する配列を含み、前記一部は、少なくとも8ヌクレオチドを含む連続したストレッチである、請求項1から5の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記オリゴヌクレオチドは、C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のスプライスサイトまたはイントロン配列に相補的な配列またはそれ結合する配列を含む、請求項1から6の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 前記連続したストレッチは、前記C5またはIL−1RAcP mRNA前駆体のエキソンのRNAの8−50ヌクレオチド、好ましくは14−25ヌクレオチドを含む、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号1または2に示されるC5 mRNA前駆体のエキソンおよび/または配列番号3または4に示されるIL−1RAcPのエキソンに相補的であるか、または結合する、請求項7または9に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号11−42の配列を含むか、またはそれから成る、請求項1から10の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 前記オリゴヌクレオチドは、RNAベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および/または塩基の修飾を有し、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、1以上の2’−O−メチルホスホロチオネートを含むか、またはそれから成る、請求項1から11の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 前記オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾およびロックされた核酸モノマーを含む、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 前記オリゴヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対を形成することができる、少なくとも1つのイノシンおよび/または塩基を含む、請求項1から13の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 薬物として使用するための、好ましくは、個体における炎症性障害を予防または治療するための、より好ましくは、リウマチ様関節炎(RA)、若年性リウマチ様関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病または潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症を予防または治療するための、請求項1から14の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. 請求項1から15の何れか1項に少なくとも1つの分子を含む組成物であって、前記組成物は好ましくは医薬組成物であり、前記医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤および/または賦形剤を含む組成物。
  17. 少なくとも2つのオリゴヌクレオチドが存在し、1つ目は請求項1から3の何れか1項に記載のものであり、2つ目は請求項4または5に記載されたものである、請求項16に記載の組成物。
  18. 個体における炎症性障害を予防または治療するための薬物の製造のための、請求項1から15の何れか1項に記載の前記分子の、好ましくはオリゴヌクレオチドの、または請求項16から17の何れか1項に記載の組成物の使用。
  19. 個体における、1以上の症状および/または特徴を軽減するための、および/または炎症性障害のパラメータを改善するための方法であって、前記方法は、請求項1から15の何れか1項に記載の分子、好ましくはオリゴヌクレオチド、または請求項16から18の何れか1項に記載の組成物を前記個体に投与することを含む方法。
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