JPH06505161A

JPH06505161A - 核酸翻訳の調節

Info

Publication number: JPH06505161A
Application number: JP50624292A
Authority: JP
Inventors: レチナー，ロバート・エル
Original assignee: ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイション
Priority date: 1991-01-25
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 1994-06-16
Also published as: EP0568641A4; WO1992013070A1; CA2100251A1; EP0568641A1; PT100052A; AU1341092A; IE920229A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ＲＮＡ翻訳の調節に関する。

アンチセンスＲＮＡは、その配列が特定のＲＮＡ分子のそれと相補性なＲＮＡである［（例えば、キメルマン（ＩＣｉｍｅＬｍａｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）旦９　：　６８７　；メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎｅｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、　８２　：１４４．１９８５参照）コ。１ｎｖｉｖｏにおいて、特定の遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡは、通常、選択された遺伝子の通常は転写されない鎖を転写するように設計された人工遺伝子によって産生される。かかる設計遺伝子は、通常の遺伝子における転写されたＤＮＡの向きを逆にすることによって容易に生成する。

アンチセンスＲＮＡは、その相補的なセンスＲＮＡによってコードされたポリペプチドの産生を阻止する。この翻訳の阻害は、翻訳され得ないＲＮＡ−ＲＮＡデュプレックスが形成されるので起こると考えられる。アンチセンスＲＮＡは、ヒト胚性腎臓細胞におけるマンガン系スーパーオキシドジスムターゼ［（ウオング（ｌｏｎｇ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）旦８　：　９２３．１９８９）コ、ヒト繊維芽細胞におけるアミロイドβ蛋白前駆体［（サイト−（Ｓａｉｔｏｈ）、セル（Ｃｅｌｌ）、旦旦：６１５．１９８９）］、およびタバコ植物におけるリブロースヒトホスフエートカルボキシラーゼ［（ロデールマル（ＲＯｄ６ｒｍａｌ）ら、セル（Ｃｅｕ）５５　：　６７３）　］の産生を制御するのに使用されてきた。ツメガエル卵細胞において、アンチセンスＲＮＡは、それがハイブリダイズするＲＮＡ分子の修飾を引き起こし、この修飾はＲＮＡの迅速な分解を引き起こすと考えられている［（キメルマン（Ｋｉ■ｅ１ｍａｎ）ら、前掲）］。アンチセンスＲＮＡおよび内因性ＲＮＡ５ｅ　Ｈはツメガエル卵細胞抽出物においてサイクリン産生を阻止するのに使用されてきた［（ミンシュル（Ｍｉｎｓｈｕｌｌ）発明の概要本発明は、細胞に存在する場合、他の核酸の存在に応答する応答性ＲＮＡ分子というＲＮＡ分子をその要旨とする。「応答する」とは、該応答性ＲＮＡ分子が、（該応答性ＲＮＡにハイブリダイズできる）ある種の核酸の存在下で１またはそれを超えるポリペプチドを形成するように翻訳され、かかる核酸の不存在下ではこれらのポリペプチドを形成するように有意には翻訳されないことを意味する。

かかる応答性ＲＮＡ分子は、一般に１またはそれを超えるポリペプチド分子をコードし、その産生はその応答性ＲＮＡ分子の翻訳に依存する。一般に、応答性ＲＮＡ分子の翻訳、かくしてポリペプチドの産生は、シグナル核酸という特異的核酸もまたその細胞内に存在するのでなければ、いずれの特定の細胞でも起こらない。

応答性ＲＮＡは、細胞集団内の特異的細胞を殺したり傷付けるのに使用できる。

例えば、応答性ＲＮＡは、所与の細胞内の応答性ＲＮＡ分子が、当該細胞が殺されるべきことを要求する条件（例えば、ＨＩＶ−Ｉのごとき有害ウィルスでの感染）を示すシグナル核酸に暴露された場合にのみ、該応答性ＲＮＡから産生されるトキシン分子をコードし得る。より詳しくは、応答性ＲＮＡ分子は、コレラトキシン、ジフテリアトキシン、リシンおよびイー・コリのｈｏｋＳｇｅｆ、　Ｒｅ１Ｆまたはｆ１１１遺伝子産物のごとき細胞毒蛋白をコードし得、応答性ＲＮＡ分子がＨＩＶ−■で感染した細胞内に存在する場合にのみ、応答性ＲＮＡ分子の翻訳および細胞毒蛋白の産生が起こる。ここに、ＨＩＶ−１に特異的なＲＮＡ分子はシグナル核酸として働き、応答性ＲＮＡ分子と相互反応して、応答性ＲＮＡ分子のトキシンコーディング配列の翻訳を可能とする。

応答性ＲＮＡ分子は、シグナル核酸分子の不存在下で翻訳を妨げる構造を有するポリペプチドをコードするＲＮＡを設計することによって産生される。応答性ＲＮＡ分子の１つのタイプは、折り畳まれて、塩基対合ドメイン、例えば、十分に安定な場合、細胞の翻訳装置がＲＮＡのヌクレオチド配列を解読するのを妨げることによって翻訳を妨げるドメインを形成できる。このタイプの応答性ＲＮＡ分子の特別の例は、所望のポリペプチドをコードするドメイン（または「蛋白コーディング領域」）および調節ドメイン（すなわち、インヒビター領域、インバーテツドリピートおよび核形成領域を含めた調節エレメントを包含するドメイン）を有する。調節ドメインは、該調節ドメインのエレメントの配列が、コードされたポリペプチドの活性に干渉しないように選択される限り、応答性ＲＮＡ分子のどこに位置させてもよい。インヒビター領域は、（蛋白コーディング領域および／または該蛋白コーディング領域の５′側にある翻訳されないＲＮＡであるリーダー領域いずれかの部分を包含できる）基質領域および抗−インヒビター領域というシグナル核酸の領域の双方に配列が相補的である。シグナル核酸の不存在下では、応答性ＲＮＡ分子の抑制性領域は、応答性ＲＮＡ分子の基質領域にハイブリダイズし、翻訳を妨げあるいは低下させる分子内塩基対合ドメインを形成する。

シグナル核酸が存在する場合、抗−インヒビター領域はインヒビター領域に結合する基質と競合する。シグナル核酸の抗−インヒビター領域と応答性ＲＮＡのインヒビター領域との間における分子間塩基対合ドメインの形成は、蛋白コーディング領域に関する塩基対合領域の形成を妨げ；これらの状況下において、蛋白コーディング領域は翻訳され得る。

第２のタイプの応答性ＲＮＡ分子は、介在する配列または「イントロン」を有し、その存在は１またはそれを超える「エクソン」の翻訳を妨げる。イントロンは、所望のポリペプチドにつきコードするものではない。所望のポリペプチドにつきコードするＲＮＡのセグメントは、スプライシング反応の後に残る非暗号配列（例えば、リーダー領域、分泌シグナル配列、ポリＡテール等）がそうであるように「エクソン」と呼ばれる。この第２のタイプの応答性ＲＮＡ分子は、イントロンを除去し、ＲＮＡ分子の２つのフランキング部分を連結させ、かくして、活性ポリペプチドについての適当な鋳型である分子を形成する所望の条件下（例えば、特異的ＲＮＡ分子の存在下）で、スプライシング反応を受けるように設計される。翻訳を調節するのはこのスプライシンド反応の調節である。この第２のタイプの応答性ＲＮＡ分子は、シグナル核酸の抗−インヒビター領域および応答性ＲＮＡ分子内の基質領域の双方に配列が相補的であるインヒビター領域を有する点で、第１のタイプの応答性ＲＮＡと同様である。この第２のタイプの応答性ＲＮＡにおいて、基質領域は必ずしもエクソンの一部である必要はなく、むしろ自己スプライシング反応に必須の領域を含有する。基質領域がインヒビター領域に対して塩基対合すると、自己スプライシング反応は起こり得す、かくして、翻訳が妨げられる。対照的に、シグナル核酸が存在すると、その抗−インヒビター領域が応答性ＲＮＡ分子のインヒビター領域にハイブリダイズし、分子間塩基対合ドメインを形成し、それはインヒビター領域と基質領域との間の分子内塩基対合を妨げる。これらの状況下で、基質領域はスプライシング反応に自生に参加し、イントロンは除去され、適当に連結されたエクソンの翻訳が起こり得る。

かくして、第１の態様において、本発明は、１またはそれを超える蛋白コーディング領域においてポリペプチドをコードし、調節ドメイン、基質領域、およびリポソーム認識配列、例えば、リポソーム結合部位、翻訳開始部位、およびＲＮＡの翻訳に必要なすべての非暗号領域を包含する応答性ＲＮＡ分子をその要旨とする。この応答性ＲＮＡ分子は、調節ドメインに、該応答性ＲＮＡ分子の基質領域およびシグナル核酸の抗−インヒビター領域の双方に相補的なインヒビター領域を有し、それにより、シグナル核酸の不存在下では、インヒビターおよび基質領域が、シグナル核酸の存在下で観察されるそのレベルと比較して応答性ＲＮＡ分子の翻訳レベルを低下させる塩基対合ドメインを形成する。

「調節ドメイン」は、シグナル核酸の存在に応じて応答性ＲＮＡ分子の翻訳のレベルを調節する応答性ＲＮＡ分子の領域である。該調節領域はインヒビター領域、インバーテツドリピートおよび核形成領域を包含する。「リポソーム認識配列」は、翻訳が所与の開始コドン（典型的にはＡＵＧ）で開始するのに必要なＲＮＡ分子の領域である。かかる部位はリポソームによって認識され、ＲＮＡの翻訳開始に先立ってリポソームが結合する。原核生物では、リポソーム認識配列はリポソーム結合部位であり、開始コドンから約１０ヌクレオチド５°側に中心を持つ富プリン配列を包含するしくシャインおよびダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ　ａｎｄ　Ｄａｌｇａｒｎｏ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、）７１　：１３４２．１９７４）］、真核生物では、コザク（Ｋｏｚａｋ）　［コザク（Ｋｏｚａｋ）、ジャニール・オブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）、１０８　：　２２９．１９８９）コによって記載されている配列Ａ／ＧＮＮＡＵＧＧは、翻訳の開始に必要な最小のリポソーム認識配列である。

「シグナル核酸」は、応答性ＲＭＡ分子によってコードされたポリペプチドを産生ずるのに望ましい条件を示す核酸（例えば、ウィルスＲＮＡ）である。

「塩基対合」ドメインは、それにわたって、核酸の２つの領域のヌクレオチドが相互に水素結合している領域である。該用語はかかる領域の近接ヌクレオチドすべてよりも少ない結合を包含する。

「基質領域」は、塩基対合すると、応答性ＲＮＡ分子における１またはそれを超える蛋白コーディング領域の翻訳レベルを低下させる応答性ＲＮＡ分子の領域である。

「インヒビター領域」は、基質領域に塩基対合すると、応答性ＲＮＡ分子における１またはそれを超える蛋白コーディング領域の翻訳レベルを低下させる応答性ＲＮＡ分子の領域である。

「抗−インヒビター領域」は、抑制性領域に塩基対合すると、シグナル核酸の不存在下で観察されるのと比較して応答性ＲＮＡ分子の１またはそれを超える蛋白コーディング領域の翻訳レベルを増加させるシグナル核酸の領域である。これらの３つの領域は相互作用して応答性ＲＮＡ分子の翻訳レベルを調節するが、シグナル核酸の存在に応じてポリペプチド産生の適当なレベルを保証するように選択される。

「適当なレベル」とは、シグナル核酸の不存在下でポリペプチドのレベルが十分低くて細胞の生理学に影響をほとんであるいは全く与えないこと、およびシグナル核酸の存在下でポリペプチドのレベルが十分高くて細胞の活性を低下させることを意味する。応答性ＲＮＡの翻訳のレベルは、標準的な手法によって測定できる。一般に、翻訳の低いレベルは、細胞によって産生されたポリペプチドの０゜１％未満が応答性ＲＮＡ分子によってコードされたポリペプチドであるものである。

好ましい具体例において、基質領域はエクソンまたはリーダー領域の一部であるか、あるいは、（リポソーム認識配列、および開始コドンを包含する）２つの間の連結に重複し、あるいは自己スプライシング反応に必要な領域を包含する。

原核生物系においては、（例えば、リーダー領域と蛋白コーディング領域との間の連結に重複することによって）基質領域にリポソーム結合部位および開始コドンを包含させるのが好ましい。原核生物リポソームはこの部位が閉じ込められるのでなければ、リポソーム結合部位にて結合する。一旦結合すれば、リポソームは、プロセスにおいて、該エクソンを翻訳し、提供された基質−インヒビター領域を巻き戻す。リポソーム結合部位および開始コドンを基質−インヒビターハイブリッド領域で閉じ込めると、このタイプのモデルにおいて原核生物メツセージの翻訳を解除し得る（図ＩＤおよびＩＧ参照）。

真核生物においては、真核生物リポソームの４ＯＳサブユニツトがキャップ付加ｍＲＮＡの５°末端に結合し、第１の開始コドンを探してメツセージを下流方向に「走査」するしく一般に、コザク（Ｋｏｚａｋ）、ジャーナル・オブ・セリュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）、１０８　：　２２９．１９８９参照）］。このププロスでは、極度安定ハイブリッドを除いたすべて（すなわち、＜　−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの形成自由エネルギーを有するもの）が巻き戻され、全体を走査される［（コザク（Ｋｏｚａｋ）、プロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｅｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　８３　：　２５８０．１９８６）］、かくして、翻訳開始部位まで４ＯＳサブユニツトが走査するのを阻害するには、インヒビター領域が（リポソーム認識配列および／または開始コドンを包含し得る）基質領域と広範なハイブリッドを形成しなければならず、そこでは、塩基対合領域が −５０ｋｃａｌ／＋＋ｏｌまたはそれ未満の形成自由エネルギーを有する。かくして、（より低くはないにせよ同様の形成自由エネルギーを有する）インヒビター領域および抗−インヒビターシグナルＲＮＡ間の相互作用が４０Ｓリポソームサブユニツトの開始部位への移動も妨げないように（図ＩＦ、ＩＧ、およびＩＨ参照）、インヒビター領域は（エクソンにおける、あるいは恐らくはメツセージの３′末端近くの）リポソーム認識配列の下流（３°側）に位置させるのが好ましい。そういう訳で、真核生物系においては、自己スプライシングイントロンに蛋白コーディング領域を妨げさせるのが好ましい。

本明細書中で用いる「イントロン」は、エクソンとは別の応答性ＲＮＡ分子のドメインである。好ましくは、イントロンは、ＲＮＡの切断および連結の活性を含めた触媒活性を有するＲＮＡ分子である。かかるイントロンは自己スプライシングでき、か（して、テトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に存在するもののごときグループＩまたはグループ■イントロンから選択されるのが好ましい。

より好ましい具体例においては、応答性ＲＮＡ分子を精製し、該応答性ＲＮＡは、細胞活性、細胞増殖、ＤＮＡの転写、ＲＮＡの翻訳、またはＤＮＡの複製を修飾するポリペプチドをコードする。例えば、応答性ＲＮＡ分子はジフテリアトキシン活性またはりボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。

「精製されたＲＮＡＪは、それが天然に生じる環境の１またはそれを超える成分かり単離されたＲＮＡである。例えば、該ＲＮＡは天然に生じない細胞に存在する。好ましくは、それは核酸の均質溶液として供される。

他の好ましい具体例においては、基質領域はイントロンの５′　−スプライス連結を包含し；イントロンは該イントロンの不存在下における翻訳のレベルと比較してエクソンの翻訳のレベルを低下させ；該イントロンはリポソーム認識配列と最も５゛側のエクソンとの間、あるいは２つのエクソンの間に位置させる。より好ましくは、イントロンはその５°末端で５′スプライス連結に重複し、その３ ′末端で３′　スプライス連結に重複し；イントロンは２つの切断反応を触媒し、１つは５°−スプライス連結内にあり、１つは３′−スプライス連結内のあり；イントロンは自己スプライシングイントロンであり；基質領域は５°　−スプライス連結を包含し：インヒビター領域は５°−スプライス連結内の切断反応に干渉す「５°−スプライス連結」とは、スプライシング反応に要するイントロンの５゜末端に重複または隣接する配列をいう。「３゛−スプライス連結」とは、スプライシング反応に要するイントロンの３°　−末端の配列をいう。かかるスプライス連結は、テトラヒメナ・テルモフィラの介在配列と接するもののごとき自己スプライシングイントロンの末端と重複する。

「自己スプライシングイントロン」は、イントロンが、ＲＮＡのより大きいピースから自己を切り出したり、切り出し反応に先立ってイントロンを挟むＲＮＡの２ピースを連結するのに必要な隣接スプライス連結配列を除いて必要な配列のすべてを含有するＲＮＡ片である。すなわち、当該イントロンはＲＮＡ分子を切断し、また、その２部分を連結できる。

さらに好ましい具体例においては、シグナル核酸は一本鎖、例えば、ウィルスＲＮＡである。

応答性ＲＮＡの例は、５′−スプライス部位に対して−１４、−１９、−２１、 −２２、−２３および／または一２４位のヌクレオチド変化によって修飾されたテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のＲＮＡを包含する。

関連する態様において、本発明は、前記した応答性ＲＮＡ分子を細胞に導入することによって、シグナル核酸を担持する細胞の増殖に干渉する方法をその要旨とする。

関連する態様において、本発明は、前記応答性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子をその要旨とする。

本発明の他の要旨および利点は、その好ましい具体例の以下の記載および請求の範囲から明らかであろう。

好ましい具体例の記載まず、図面につき簡単に記載する。

図面の間車な記載図１、ＩＡおよびＩＢは応答性ＲＮＡ分子の模式図である。細い線はリーダー領域を表し、太い線は蛋白コーディング領域を表し、一連の短い垂直の線は塩基対合ドメインを示し、これらの線の上方および下方のボックスはＲＮＡの種々の特徴を示す。詳しくは、図ＩＡにおいて、応答性ＲＮＡは翻訳を妨げる分子内塩基対合を描くように書かれており；図ＩＢにおいて、応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸にハイブリダイズして描かれている。

図ＩＣにおいては、応答性ＲＮＡ分子のこのタイプの第２の変形を描き二図ＩＤにおいて、応答性ＲＮＡ分子は翻訳を妨げる分子内塩基対合を描くように書かれており；図ＩＥにおいて、応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸にハイブリダイズしている。

図ＩＦは応答性ＲＮＡ分子の第３の変形を描き；図ＩＧにおいて、この応答性ＲＮＡ分子は翻訳を妨げる分子内塩基対合を示すように描かれており：図ＩＨにおいて、応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸にハイブリダイズしている。

図２．２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは自己スプライシングイントロンを包含する応答性ＲＮＡ分子の模式図である。細い線はリーダー領域を表し、破線は自己スプライシングイントロンを表し、太い線はエクソンを表し、一連の短い垂直の線は塩基対合ドメインを示し、これらの線の上方および下方のボックスはＲＮＡの種々の特徴を示す。詳しくは、図２Ａにおいて、応答性ＲＮＡ分子は自己スプライシングを妨げる分子内塩基対合を描くように書かれており；図２Ｂにおいて、応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸にハイブリダイズして描かれており：図２０は自己スプライシング反応によって産生されたスプライス分子を描く。

図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆおよび２Ｇは、図２〜２Ｃに示した応答性ＲＮＡ分子のタイプの変形を示す。図２Ｄにおいて、自己スプライシングイントロンは、応答性ＲＮＡ分子において、ポリペプチド−コーディング配列を分離し：図２Ｅにおいて、応答性ＲＮＡ分子は自己スプライシングを妨げる分子内塩基対合を描くように書かれており７図２Ｆにおいて、応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸に／１イブリダイズしており：図２Ｇにおいて、自己スプライシング反応によって産生されたスプライス分子が描かれている。

図３はテトラヒメナ・テルモフィラの５′エクソン−介在配列（ＩＶＳ）連結部におけるおよびその丁度上流のＰ（１）およびＰ　（−）ステム−ループ構造を描く。ＩＶＳ（大文字）は、５゛ニクソン（小文字）の末端にハイブリダイズしてＰ（１）ステム−ループを形成できる内部ガイド配列（枠囲）、自己スプライシングについての５゛　−スプライス部位（塗り潰した三角形で示す）に必要なコンフォメーンヨンを含有する。自己スプライシングを支持しない別の構造Ｐ　（−）は、Ｐ（１）ステム（肉太活字）の一部と上流の５′工クンン配列（上線を施す）との間のハイブリダイゼーションによって形成される。頂部に示す配列は、親プラスミドｐＴＥＴＢＬＵからのＲＮＡについてものである。より低い３つのＲＮＡ構造は５′エクソンにおける配列変化（＃影を付す）によってつくられた３つの突然変異プラスミドからの修飾Ｐ　（−）ステム−ループを表す。これらの構造の各々につき３７℃での計算された自由エネルギーを示す。

図４は、親プラスミド（ｐＴＥＴＢＬＵ）および鋳型としての３つのスプライシング突然変異体（ｐＴＥＴ１４、ｐＴＥＴ１４１９、ｐＴＥＴ２１−２４）を用い、［α”ＰＩ　ＣＴＰの存在下で行ったｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応の結果を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。３レーンの各セットは、スプライシング条件への変化の前（０）および後（１５または６０分）の転写産物を表す。用いた鋳型はレーンの各セットの上方に示し、鋳型を線状化するのに使用した制限酵素は頂部に示す。この図および続いての２つの図については、ＦＬは全長前駆体ＲＮＡを示し、ＬＥは連結されたエクソンを示す。環状化反応（各々、Ｌ−１５およびＬ−１９）によって１５または１９ｎｔが５′末端から除去されたＬ− ＩＶＳの短い形態がそうであるごとく、線状ＩＶＳ　ＲＮＡ（Ｌ−ＩＶＳ）および環状ＩＶＳ　ＲＮＡ　（Ｃ−ＩＶＳ）の位置も示す。星印は３゛−スプライス部位加水分解の産物（すなわち、５′エクソン−ＩＶＳ断片）であると考えられるＲＮＡを示す。未だ同定されていない小ＲＮＡ産物も示す（＜）。

図５は、所与の濃度の２つのシグナルＲＮＡ　（４Ｓまたは４ｓ３）のうちいずれかの不存在（０）または存在において、スプライシング条件下でゲル精製したｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡを１５または６０分間インキュベートした実験の結果を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。得られた産物を４％変性ポリアクリルアミドゲルで分析し、図５に示す。

図６は、４または３７℃にて、スプライシング緩衝液中、ゲル精製したｐＴＥＴＢＬＵまたはｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡ　（１０ｎＭ）をインキュベートした実験の結果を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。示した場合、Ｍ　ｇ２− を５ｍＭに添加してスプライシング反応を開始した。ｐＴＥＴ２１−２４については、ｐＴＥＴ２１−２４配列について特異的な２つのシグナルＲＮＡ（８Ｓ４または１２Ｓ）のうちいずれかの不存在下または存在下でスプライシングを開始した。

存在する場合、シグナルＲＮＡの濃度は１μＭである。４％変性ポリアクリルアミドゲルで分析した得られた産物を図４におけるごとに標識する。頂部に示すこと（、転写に用いた鋳型をＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩいずれかで線状化した。

ＥｃｏＲＩ−ランオフ前駆体をシグナルＲＮＡの存在においてスプライシング条件下でインキュベートした場合に観察される追加の産物を点印で示す。ｐＴＥＴ２１−２４をシグナルＲＮＡの不存在においてスプライシング条件下でインキュベートした場合に観察される短いＲＮＡ産物（＜）には矢印を付する。この同一のＲＮＡ産物もまた図４で可視化されている。

応答性ＲＮＡ分子応答性ＲＮＡ分子は一般的に前記した。以下に、当業者にこれらの分子を説明するための特別の実施例を掲げる。これらの実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１：無イントロンの応答性ＲＮＡ分子第１のタイプの応答性ＲＮＡ分子を図１に示す。この分子の１の部分、蛋白コーディング領域はその産生がシグナル核酸の存在下においてのみ望ましいポリペプチドをコードする。該分子のもう１つの部分、調節ドメインは、蛋白コーディング領域内の基質領域に配列が相補的なインヒビター領域を包含する。インヒビター領域は基質領域と塩基対合して、蛋白コーディング領域の翻訳を阻止する塩基対合ドメインを形成できる。基質領域は蛋白コーディング領域の一部、リーダー領域の一部であり得るか、あるいは該２つの間の連結に重複し得る。

図１を参照し、応答性ＲＮＡ分子１０は５′−末端１２、および３°−末端１４を有する。５゛−末端１２に隣接してリーダー領域２６および調節ドメイン１６があり；３°−末端１４に隣接して蛋白コーディング領域１８がある。調節ドメイン１６内にはインヒビター領域２０があり；蛋白コーディング領域１８内には基質領域２２がある。蛋白コーディング領域１８の５′側にはリポソーム認識配列２１および開始コドン２３がある。

図ＩＡを参照し、インヒビター領域２０は基質領域２２にハイブリダイズして塩基対合ドメイン２８を形成する。応答性ＲＮＡ分子１０内のかがる塩基対合は応答性ＲＮＡ分子の蛋白コーディング領域の翻訳を阻害する。

翻訳の阻害は、シグナル核酸の存在によって解除され、抗−インヒビターというそのうちの領域は応答性ＲＮＡのインヒビター領域に相補的である。シグナル核酸の抗−インヒビター領域は、応答性ＲＮＡ分子のインヒビター領域とのハイブリダイゼーション（塩基対合）につき応答性ＲＮＡ分子の基質領域と競合する。

基質領域との塩基対形成のないこれらの状況下で、翻訳が起こり、所望のポリペプチドが産生される。

例えば、図ＩＢを参照し、シグナル核酸３０は３′−末端３２．５゛−末端３４、および応答性ＲＮＡ分子１０のインヒビター領域２０に配列が相補的な抗−インヒビター領域を有する。抗−インヒビター領域３６とインヒビター領域２０とのハイブリダイゼーションは塩基対合ドメイン３８を形成し、インヒビター領域２０の基質領域２２へのハイブリダイゼーションを妨げる。これらの状況下で、蛋白コーディング領域１８の翻訳が起こる。

応答性ＲＮＡ分子のこのタイプの変形において、基質領域は蛋白コーディング領域内に必ずしも含有されず、リーダー領域へと蛋白コーディング領域の上流に伸びる。特に、図ＩＣに描かれた応答性ＲＮＡ分子は、リポソーム認識配列２１および開始コドン２３を包含する基質領域２２を有する。図ＩＤを参照し、基質領域２２はインヒビター領域２０と塩基対合し、分子内塩基対合領域２８を形成する。原核生物系において、このコンフィギユレーションはリポソームがリポソーム結合部位および開始コドンと相互反応するのを阻止し、翻訳が阻止される。

図ＩＥを参照し、シグナル核酸３０の抗−インヒビター領域３６はインヒビター領域２０にハイブリダイズして塩基対合領域３８を形成する。このコンフィギユレーションにおいて、原核生物リポソームは翻訳を開始し、所望のポリペプチドが産生される。

応答性ＲＮＡ分子のこのタイプのもう１つの変形において、インヒビター領域は基質領域の下流に位置する。この図に示すように、インヒビター領域は蛋白コーディング領域自体内にあり得るか、あるいは蛋白コーディング領域の３°側の領域中に位置し得る。図ＩＦにおいて、応答性ＲＮＡ分子は、リポソーム認識配列２１および開始コドン２３を包含する基質領域２２を有するものとして描かれ、基質領域の３゛側に位置するインヒビター領域２０を有する。図ＩＧを参照し、インヒビター領域２０は基質領域２２と塩基対合し、分子内塩基対合領域２８を形成する。このコンフィギユレーションにおいて、走査する真核生物リポソームサブユニットは、この塩基対合相互作用が十分に強力であるならば、翻訳を開始する塩基対合ドメインを侵したり、あるいはそれに結合できない。図ＩＨにおいて、シグナル核酸３０の抗−インヒビター領域３６はインヒビター領域２０にハイブリダイズし、塩基対合領域３８を形成する。真核生物リポソームは（他の上流開始コドンがないならば）適当な開始コドンまで走査でき、翻訳を開始する。

ポリペプチドの翻訳が起こり、翻訳するリポソームによって塩基対合領域３８が破壊される。

応答性ＲＮＡのインヒビター領域は応答性ＲＮＡの基質領域とターゲット核酸の抗−インヒビター領域の双方に相補的でなければならないので、これらの３つの領域の配列は応答性ＲＮＡの翻訳の適当な調節を可能とするように選択されなければならない。これは、基質領域の配列が抗−インヒビター領域の配列と同一でなければならないことを意味するのではない。形成できる２つの塩基対合のいずれも完全に塩基対合される（すなわち、当該ドメインに沿ったすべての近接塩基が塩基対合する）必要はなく、また、それらは同一の長さである必要はない。

当該領域がいつ翻訳が起こらなければならないかを示すのに十分なほど特異的である限り、抗−インヒビター領域の選択には柔軟性がある。例えば、応答性ＲＮＡの応答が細胞内のＨＩＶ−Ｉの存在であるというシグナルである場合、ＨＩＶ −Ｉのいずれの特異的核酸配列も選択でき、勿論、ＨＩＶ−１に存在する核酸配列を選択するのは限定される。基質領域の配列は、生物学的活性ポリペプチドを産生ずる応答性ＲＮＡ分子を生じるように選択される。該基質領域は蛋白コーディング領域の部分を包含し得るので、その配列のいずれの修飾もコードされたポリペプチドの有意量の活性を保持しなければならない。遺伝暗号の縮重は、コードされたポリペプチドの配列に影響しない蛋白コーディング領域の配列の変化を可能とする。グアノシンはウリジンと、ならびにシトシンと塩基対合できるので、用いることができる配列にはさらに柔軟性がある。加えて、蛋白におけるｌまたはそれを超える位置における保存的アミノ酸の変化は蛋白の活性を除去しないので、有用な配列の数は実質的に増大する。　１基質領域に対するインヒビター領域のハイブリダイゼーションによって形成された塩基対合ドメインは、当該細胞内にやはり存在し得るシグナル核酸以外の核酸によって破壊されないように、十分に安定でなければならない。例えば、インヒビター領域および基質領域が４つの近接ヌクレオチドのみにわたって相補的であるならば、その４つの塩基の配列を包含するいずれの一本鎖核酸もインヒビター領域へのハイブリダイゼーションにつき基質領域と競合でき、この配列を含めた核酸が十分高い濃度で存在するならば、翻訳の阻害は解除されるであろう。一般に、インヒビター領域への基質領域のハイブリダイゼーションによって形成された塩基対合ドメインは、少なくとも１２、好ましくは１５の近接ヌクレオチドを、当該分子がシグナル核酸のみに応答するために包含すべきである。

応答性ＲＮＡ分子は、シグナル核酸がインヒビター領域により容易にハイブリダイズするのを可能とするための領域を包含できる。この追加の領域は核形成領域と呼ばれ、インヒビター領域に直ぐ隣接し、かつシグナル核酸の配列に相補的な多数のヌクレオチドよりなり、それにより、核形成領域およびインヒビターは一緒にシグナル核酸との拡大された相補性の領域を形成する。核形成領域はシグナル核酸へのハイブリダイゼーションに容易に利用できる一本鎖領域を提供する。

この領域にわたる塩基対合形成は、抗−インヒビター領域をインヒビター領域へのハイブリダイゼーションのため正しく位置付けることによって、インヒビター領域からの基質領域の置き換えを好都合のものとする傾向がある。加えて、かかる核形成領域はシグナル核酸とで形成された塩基対合領域の安定性を増大させるであろう。

調節ドメインはインヒビタードメインに直ぐ隣接する領域への非特異的核酸（すなわち、シグナル核酸以外の核酸）のハイブリダイゼーションを不都合のものとする領域も包含し得る。この領域はインバーテツドリピートといい、折り畳まれてヘアピン構造を形成できる。

インヒビター領域、基質領域および抗−インヒビター領域の詳細な性質は、いかに厳密に翻訳が調節されるべきかに部分的に依存するであろう。基質領域へのインヒビター領域のハイブリダイゼーションによって形成された分子内塩基対合ドメインが安定なはと、翻訳はよけいに阻止される。ＲＮＡ−ＲＮＡデュプレックスについては、塩基対合ドメインの安定性は、ヌクレオチドの近接領域内の現実に塩基対合したヌクレオチドの数、一般的に塩基対合したドメイン内の誤対合の数、および塩基対合ドメインのヌクレオチド組成に依存する。分子内塩基対合形成は塩基対合されるべき２つの領域の間の距離に依存する。例えば、２つの領域間のヌクレオチドが余りにも少ないと、トーション型の束縛が塩基対合を妨げ得る。当業者ならば、多かれ少なかれ安定な塩基対合ドメインを作成するためにこれらのパラメーターをいかにして調整できるかをよく認識しているであろう。

分子内塩基対合ドメインの安定性は、シグナル核酸のいずれかの所与のレベルにおいて望まれる翻訳のレベルに依存して調整できる。翻訳のレベルは、インヒビター領域が基質領域にハイブリダイズした応答性ＲＮＡ分子の割合に依存する。

シグナル核酸の存在下におけるこの割合は、インヒビター領域がシグナル核酸の抗−インヒビター領域にハイブリダイズした応答性ＲＮＡ分子の割合に依存する。

当業者ならば、形成される各デュプレックスの量は２つのデュプレックスの相対的安定性ならびに所与の細胞に存在するシグナル核酸および応答性ＲＮＡの量に依存することを認識するであろう。高毒性分子が応答性ＲＮＡによってコードされているならば、高度の調節が必要である。例えば、コレラトキシンの活性サブユニットがコードされているならば、数個の分子のみが細胞を殺すのに必要である。この場合、シグナル核酸の不存在下で翻訳は完全に阻止されなければならない。これは、基質およびインヒビター領域のほとんど完全な相補性、例えば、２０ヌクレオチド領域の８５％相補性を有することによって最善に保証される。発現は、例えば、２５ヌクレオチド領域にわたってインヒビター領域に１００％の相補性を有する高相補的シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ起こる。

インヒビター領域は蛋白コーディング領域の５゛−側または３゛−側、あるいは蛋白コーディング領域自体内にあり得る。応答性ＲＮＡ分子がエキンヌクレオティック分解に付されるならば、これは、分子を設計する場合に考慮に入れるべきである。かくして、分子が３゛−末端で開始して分解されるならば、翻訳に必要な配列のすべてを含有するがインヒビター領域を欠く分子の形成を妨げるためには、インヒビター領域を当該分子の５“−末端に位置させるのが最良であろう。

実施例２・自己スブライシンドイントロンをもつ応答性ＲＮＡ分子応答性ＲＮＡ分子の第２のタイプは所望のポリペプチドの産生を妨げる自己スプライシングイントロンを包含する。該イントロンはスプライシング反応によって除去でき、スプライスされた分子は所望のポリペプチドの産生用鋳型として働く。シグナル核酸はこのタイプの応答性ＲＮＡ分子の翻訳を調節するが、調節は、スプライシング反応を調節するシグナル核酸を用いることによって間接的に達成される。このタイプのＩＪＩｗＩを働かせるためには、シグナル核酸の不存在において、応答性ＲＮＡ分子はスプライシングを妨げる分子内塩基対合ドメインを形成するように折り畳まれなければならない。シグナル核酸の存在下で、別の分子間塩基対合ドメインが形成され、スプライシングが起こる。

この第２のタイプの応答性分子の例を図２に示す。この分子は所望のポリペプチドをコードする単一の蛋白コーディング領域のリポソーム認識配列と開始コドンの間に位置するイントロンを有する。このイントロンは翻訳を妨げる。何故ならば、それはリポソーム認識配列を開始コドンから遠くに離すからである。本実施例においては、イントロンはテトラヒメナのブレーｒＲＮＡに由来する自己スプライシングイントロンである。このタイプのイントロンは、２つの切断反応を引き起こす構造に折り畳まれ得るのであり、１つの切断反応はイントロンのいずれか側、およびイントロンを挟むＲＮＡ分子の部分を接合する連結反応である。

かかるイントロンの自己スプライシングにおける必須の工程は、５°−スプライス結合と呼ばれるイントロンの領域の、内部ガイド配列と呼ばれるイントロンの箪２の領域へのハイブリダイゼーションである。かくして、イントロンの自己スプライシング活性が調節され得る１の方法は、内部ガイド配列への５゛−スプライス結合のハイブリダイゼーションを妨げることによる。図２に描かれた応答性ＲＮＡ分子は、イントロンおよび蛋白コーディング領域とは区別される調節ドメインを有する。この調節ドメインは、この分子中に自己スプライシングイントロンの５′−スプライス連結を包含する基質領域に相補的なインヒビター領域を有する。インヒビター領域と基質領域との間の分子内塩基対形成は、５゛−スプライス連結の内部ガイド配列へのハイブリダイゼーションを妨げ、スプライシングは妨げられる。この応答性ＲＮＡ分子は、インヒビター領域もシグナル核酸の抗〜インヒビター領域に相補的なように設計される。かくして、シグナル核酸の存在において、インヒビター領域は抗−インヒビター領域にハイブリダイズし、自己スプライシング反応への参加のために５′−スプライス連結を解放する。

図２を参照し、応答性ＲＮＡ分子４ｏは５′−末端４２、および３°−末端４４を有する。５′−末端４２に隣接して、リーダー領域４９があり、それに隣接して自己スプライシングイントロン４８があり、次いで、ポリペプチド−コーディングエクソン５０がある。調節ドメイン４６はリーダー領域４９内にある。がくして、自己スプライシングイントロン４８は調節ドメイン４６とエクソン５０との間にあり、その５′側にはリポソーム認識配列５６があり、その３゛側はＡＵＧコドン６６がある。調節ドメイン４６内のインヒビター領域５２は、リーダー領域４９と自己スプライシングイントロン４８との間の連結における基質領域５４に相補的である。調節ドメイン内では、インヒビター領域の３′−側には、インヒビター領域５２に近接し、抗−インヒビター伸長という抗−インヒビター領域に直ぐ隣接するシグナル核酸のうちの領域に相補的な核形成領域４５がある。

また、調節領域はインヒビター領域の５°　−側にインバーテツドリピート４７を包含してもよい。基質領域５４はリポソーム認識配列５６．５°　−スプライス連結５８、および安定化領域６０を包含する。自己スプライシングイントロン４８は５゛　−スプライス連結５８と、ＡＵＧコドン６６に隣接する３′　−スプライス連結６４によって重複され、内部ガイド配列６２を包含する。

図２Ａを参照し、インヒビター領域５２が基質領域５４にハイブリダイズすると、塩基対合ドメイン７０が形成され、５′　−スプライス連結５８が内部ガイド配列６２と相互作用するのを妨げる。インバーテツドリピートは安定化ヘアピン６３を生成するように折り畳まれ得る。

シグナル核酸の配列において、分子間塩基対合ドＺインが、シグナル核酸の抗− インヒビターおよび抗−インヒビター伸長領域と応答性ＲＮＡ分子のインヒビターおよび核形成領域との間に形成される。この相互作用は５°　−スプライス連結５８を自由にして内部ガイド配列６２と相互作用するのを可能とする。これらの状況下で、自己スプライシング反応が起こる。かくして、図２Ｂを参照して、３°−末端７２および５゛−末端７３を有するシグナル核酸７１は抗−インヒビター領域７４およびインヒビター領域５２および核形成領域４５にハイブリダイズする抗−インヒビター伸長７７を包含し、塩基対合ドメイン７５を形成する。

自己スプライシング反応は、すべての自己スプライシングイントロンを除去する。今や、スプライスされた分子はエクソン５０からコードされたポリペブトを産生ずることができる。何故ならば、今や、リポソーム認識配列はポリペプチドをコードするエクソンの開始コドンと密接に近接し、ポリペプチドの第１のコドンとして開始配列を利用するのが可能となるからである。

図２０を参照し、スプライスされた分子９０は、５°−末端４２．３゛−末端４４、リーダー領域４９、エクソン５０．リポソーム認識配列５６、開始コドン６６、ならびに５°　スプライス連結５８の少しの部分および３′　スプライス連結６４の少しの部分を含有する融合スプライス連結９５を包含する。

自己スプライシング活性を有することが知られているいずれのイントロンも、応答性ＲＮＡ分子として用いるのに適合させることができる。適当な自己スプライシングＲＮＡはテトラヒメナの核プレーｒＲＮＡ、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）および二ニーロスボラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）のミトコンドリア・プレーｒＲＮＡ、アグロバタテリウムまたはアゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）のイントロン、およびサツカロミセスのミトコンドリア・プレーｍＲＮＡまたは他の同等のグループ■自己スプライシングＲＮＡから得られる。グループ■イントロンも、あるいは少なくともＲＮＡ切断活性を有するいずれのＲＮＡも本発明で用いることができる。ＲＮＡリガーゼ活性は他のＲＮＡ分子またはそれらの同等物によって提供され得る。

一旦自己スライジングＲＮＡが選択されたならば、それは、自己スプライシング反応が起こった後にリポソーム認識配列がスタートコドンに対して正しく位置されるように、リポソーム認識配列部位とコードされるポリペプチドのスタートコドンとの間に正しく位置されなければならない。真核生物において、翻訳は一般にキャップ付きＲＮＡの最も５′側のＡＵＧで始まり、ＡＵＧを囲む配列がＡ／ＧＮＮＡＵＧＧに適合することを提供する。従って、応答性ＲＮＡ分子は、この配列がスプライシングが起こった後にのみ現れるように設計されなければならない。さらに、認識され、最も５′側の翻訳開始部位として用いるように、好都合な配列文脈におけるＡＵＧまたは他のコドンを該イントロンに包含させることができる。下流部位の翻訳開始に与えるこの上流ＡＵＧの抑制的影響は、自己スプライシングによってイントロンが除去されるに際してのみ解除され、かくして、捜査するリポソームサブユニットが、毒性蛋白の翻訳がそこから起こる下流の開始部位に到達しないことを保証する。

このタイプの応答性ＲＮＡ分子についての変形において、自己スプライシングイントロンはポリペプチド−コーディング配列を邪魔するように位置される。図２Ｄに示すように、この分子は、−緒になって所望のポリペプチドをコードする２つのエクソンの間に位置するイントロンを有する。該イントロンが停止コドンを包含するならば、翻訳は阻止されるであろう。該イントロンが停止コドンをコードしない場合においてさえ、該イントロンの翻訳は下流のエクソンとは解読枠外に置かれたり、および／または活性を破壊するようなアミノ酸をポリペプチドに添加するであろう。該イントロンの除去の結果、２つのエクソンが融合され、所望の活性を有するポリペプチドについてコードする翻訳可能なヌクレオチド配列が形成される。

図２Ｄを参照し、応答性ＲＮＡ分子４０は、５°−末端４２および３゛−末端４４を有する。該ポリペプチドは、自己スプライシングイントロン４８によって離された２つの領域５０および５１にコードされる。イントロン４８は５′−スプライス連結５８、および３′−スプライス連結６４によって重複され、内部ガイド配列６２を包含する。蛋白コーディング領域５０には、リポソーム認識配列５６および翻訳開始コドンが先行する。インヒビター領域５２はエクソン５０内にあり、領域５０の３゛　−末端および５°　−スプライス連結５８に重複し、安定化領域６０を包含する基質領域５４に相補的である。その５′側のインヒビター領域の傍らには、インヒビター領域と近接し、抗−インヒビター領域に直ぐ隣接するシグナル核酸中の領域に相補的な核形成領域４５がある。

図２Ｅを参照し、インヒビター領域５２が基質領域５４にハイブリダイズすると、塩基対合ドメイン７０が形成され、かくして、５゛−スプライス連結５８が内部ガイド配列６２と相互反応するのを妨げる。

図２Ｆを参照し、３°−末端７２および５“−末端７３を有し、抗−インヒビター領域７４および抗−インヒビター伸長７７を包含するシグナル核酸７１は、インヒビター領域５２および核形成領域４５にハイブリダイズする。分子間塩基対合ドメイン７５が形成される。これらの状況下において、５′−スプライス連結５８は解放され、内部ガイド配列６２と相互反応し、自己スプライシングが起こる。

図２Ｇを参照し、自己スプライシング反応はすべての自己スプライシングイントロン４８を除去し、５°　−スプライス連結５８および３′−スプライス連結６４の部分を含有する融合したスプライス連結９５を残す。

スプライシングに際してこれらのエレメントが完全に除去されるように、例えば、基質および／またはインヒビター領域がイントロン内に含有される他の戦略を用いることもできる。基質またはインヒビタードメインが蛋白コーディング領域に止まる場合、それらの配列はコードされた蛋白の生物学的活性を保持するように慎重に選択されなければならない。遺伝暗号の縮重、すなわち、グアノシン− ウリジンの塩基対および蛋白の活性をなくさない保存的アミノ酸変化の可能性すべてが考えられる。さらに、多くの蛋白はその固有の活性に必須でない領域を含有すること、およびこれらの領域におけるアミノ酸の変化および／または付加は生物学的活性の劇的な喪失をもたらすものではないことは公知である。かかる領域における基質および／またはインヒビタードメインの置き換えは、シグナルＲＮＡを含有する抗−インヒビターの選択を単純化する。というのは、蛋白コーディング配列の変化はより容易に許容され得るからである。

インヒビター領域が抗−インヒビター領域と基質領域の双方に対して相補的である要件は、これらの領域の配列にある種の束縛を課すものである。まず、前記したごとく、基質領域はシグナル核酸の抗−インヒビター領域と同一の配列を有する必要がない。抗−インヒビター領域は選択できるが変更できないので、抗−インヒビター領域は５′−スプライス連結の配列と同一の配列を包含しなければならない。テトラヒメナｒＲＮＡイントロンにおける最小の５゛−スプライス連結は４ヌクレオチド長に過ぎない。いずれの４ヌクレオチド配列も１／６４の確立で起こるはずであるので、多くの可能な抗−インヒビター領域は５°−スブライス連結の配列を包含するであろう。多くの異なる４塩基配列は５°−スプライス連結として働き得るようである。ただし、内部ガイド領域の配列が５゛　−スプライス連結における変化を収容するように適合されているものとする［（リング（Ｚａｎｇ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４　：　４３０，１９８６）コ。内部ガイド配列と塩基対合できるのは最小の５′−スプライス連結にとって適当である一方、単一の誤対合での複合体は機能的であり得る［（リング（Ｚａｎｇ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２ユニ　８９２４．１９８８）］。

インヒビター領域および基質領域のハイブリダイゼーションによって形成された塩基対合ドメインは、スプライシング反応の間、５′−スプライス連結と内部ガイド配列との間に起こる塩基対合よりも安定でなければならない。これは、ハイブリダイズして、５°　−スプライス連結の内部ガイド配列に対するハイブリダイゼーションによって形成されたものよりも長い塩基対合ドメインを形成するであろうインヒビター領域および基質領域を選択することによって達成できる。基質領域は、５゛−スプライス連結を超えて、基質領域とインヒビター領域配列との間の相同性を拡大する安定化領域を包含するように設計される。この安定化領域は、リポソーム認識配列と開始コドンとの間に位置した自己スプライシングイントロンの場合、５゛−スプライス連結の丁度３゛側に位置させることができる。

この配置は、安定化ドメインが、スプライシング反応の一部として除去され、リポソーム認識配列と開始コドンとの間の相互関係に干渉しないことを保証する。

また、リポソーム認識配列はインヒビター領域と塩基対合する領域内に包含され得るが、これが当てはまる要件はない。同一のポリペプチドの部分をコードするエクソン間に挿入された自己スプライソングイントロンの場合、安定化領域は、好ましくは、該イントロン内、すなわち、イントロンの残りと共に除去されるように５°−スプライス連結の３′−側に位置させるべきである。

インヒビター／基質塩基対合ドメインは、シグナル核酸によってのみ破壊され、細胞に存在する他の核酸によっては破壊されないことが重要である。前記にて議論したごと（、第１のタイプの応答性ＲＮＡ分子については、これは、分子内塩基対合形成は唯一の核酸によってのみ破壊されるのに十分なほど広範囲でなければならないことを意味する。この要件は、シグナル核酸が分子内デュプレックスを破壌するのを困難とし得る。概略を前記したごとく、インヒビター領域に隣接して核形成領域を含ませるのは、抗−インヒビター領域へのインヒビター領域のハイブリダイゼーションを好都合とする。

自己スプライシングイントロンおよびエクソンの調節ドメインの多くの配置が有用である。前記したごとく、自己スプライシングイントロンは２つのエクソン間に位置させることができ；非スプライス分子の最も５゛側エクソンが翻訳され得る状況下で、完全に機能的なポリペプチドは産生され得ない。インヒビター領域は自己スプライシングイントロンの５゛−または３′−側に、あるいは恐ら（は、イントロン自体の中に位置させることができる。ＲＮＡは５′から３°の方向に合成されるので、インヒビターが合成され、内部ガイド配列の産生前に５′− スプライス連結にハイブリダイズする機会を有するように、インヒビター領域は５゛　−側に位置させるのが好ましい。スプライシング複合体を形成するためのＲＮＡの折り畳みがインヒビター領域の合成速度と比較して遅いならば、インヒビターは自己スプライシングイントロンの３゛　−側に位置させることができるであろう。

自己スプライソング反応は特異的かつ正確であるのが好ましく；スプライシングが間違った位置で起こるならば、リポソーム結合部位は誤って位置することになろう。２つのエクソンの間に位置した自己スプライシングイントロンの場合、誤ったスプライシングの結果、ポリペプチドをコードする配列の解読枠をはずれた融合が起こる。内部ガイド配列と５°−スプライス連結との間の距離が比較的短い自己スプライジングイシトロンはより正確なスプライシング反応を触媒する傾向がある。また、別の５°　−スプライス連結として認識される配列がないのを保証することが重要である。

前記した応答性ＲＮＡ分子はいずれの標準的な方法によって製造することもできる。例えば、ＲＮＡはｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏいずれかでＤＮＡ分子の転写によって産生され得る。一般に、ＲＮＡ分子は、応答性分子をコードする配列、応答性ＲＮＡ分子の調節された転写のための適当な配列、およびＤＮＡの複製のための適当な配列を包含するプラスミドまたはウィルスＤＮＡの構築によって産生されるであろう。ＲＮＡ分子の構築において、一般的な考慮事項は以下の通りである。現実的な見地より、それ自身または他のＲＮＡ分子を切断でき、また、好ましくは、それらの２つのＲＮＡ分子を一緒にスプライシングできる酵素的活性を有する適当なＲＮＡ分子、例えば、自己スプライシングＲＮＡ分子を同定するのが一般的に好ましい。次いで、このＲＮＡ分子を修飾して、５゛　−スプライス連結が応答性ＲＮＡ分子のインヒビター領域の一部と相補的となるように、前記した制限内で要求されるように５°−スプライス連結および内部ガイド配列を変化させる。次いで、このＲＮＡ分子を、所望のポリペプチドをコードするＲＮＡ。

および適当な調節ドメインを包含するＲＮＡに結ぶ。要すれば、核形成部位およびインバーテツドリピートを調節ドメイン中に設計する。

以下の実施例３〜７で議論する実験は、特異的シグナルＲＮＡの存在によって再活性化できる不活性イントロンを含有する応答性ＲＮＡ分子の調製を記載する。

該応答性ＲＮＡ分子は、テトラヒメナ・テルモフィラのｒＲＮＡ中の自己スプライシングイントロンまたは介在配列（ＩＶＳ）から調製した。ＩＶＳが自己スプライシングするには、ＩＶＳ　ＲＮＡのコア構造の適当な折り畳みが必要である。

この必要なコンフォメーンヨンには、５°−スプライス部位を含むＰ（１）として公知の塩基対合領域が包含される（図３）。Ｐ（１）において、ＩＶＳにおける内部ガイド配列は５°エクソンの隣接部分と塩基対合して安定なステム−ループ構造を形成する。５゛−スプライス部位はこのステム内に位置する。ＩＶＳＲＮＡが自己スプライソングする能力はＰ（１）ステムが形成される能力にかかっている。

５°−スプライス部位の丁度上流の天然配列もまた、５゛−スプライス部位に直ぐ隣接するエクソン配列とでヘアピン構造を形成できる（図３）。自己スプライシングに必要なステム−ループ、Ｐ　（１）　、およびＰ　（−）というこの別のステム−ループは相互に相反的である。というのは、該スプライス部位に直ぐ隣接する５゛工クソン配列は双方の構造に包含されるからである。別のステム− ループ構造、Ｐ（１）はそのステム領域を拡大することによってより安定とできる。

５°エクソンにおけるｌのヌクレオチドの変化（５°−スプライス部位に対して一１４位におけるＡからＣの変化）の結果を報告するウッドソンおよびセヒＵｏｏｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）　［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３０　：　２０４２．１９９１１参照。その突然変異体において、自己スプライシングは減少したと報告されている。逆に、Ｐ（−１）の相対的強度を低下させるか、あるいはそれを完全になくす５゛エクソンにおける突然変異を含有するＲＮＡは、自己スプライシング活性の増加を示したと報告されている。

別の構造Ｐ（−１）を強化すると予測された５゛エクソンにおける配列変化を含有する３つの突然変異体を作成した。すべての３つの突然変異体において、（連結したエクソンの形成によって判断して）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ自己スプライシングのレベルは、天然の５゛工クソン配列が存在する親構築体に対し低下した。Ｐ（−１）のステムが５つの追加の塩基対によって長くされた１の突然変異体は、検出可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏ自己スプライシング活性を呈さなかった。

出願人は、自己スプライシング活性は、別の構築体に含まれる上流の５゛工クソン配列に相補的なシグナルＲＮＡ　（インヒビター領域）の付加によってこの強力な非スプライシング突然変異体においてさえ回復され得ることを証明した。Ｐ（−１）ステムの５゛部分への結合によって、これらのシグナルＲＮＡは、Ｐ（ −１）を破壊し、Ｐ（１）を含有する活性な自己スプライシング・コンフォメートヨンにおける内部ガイド配列に十分ハイブリダイズできる、−重鎖形態中の５ ′−スプライス部位に直ぐ隣接する配列を残した。

実施例３ニブラスミドの構築およびＤＮＡの調製応答性ＲＮＡ分子を調製するのに使用する含ＩＶＳ断片の源はプラスミドｐＴＴＩＡ３Ｔ７　［（エイ・ザウグ（Ａ、　Ｚａｕｇ）博士から入手；同等のかかるプラスミドは容易に構築され、このプラスミドは本発明の説明の目的のためだけに用いる）コであり、それは、Ｈｉｎｄｍリンカ−上のｐＴ７−２　［（ニー・ニス・バイオケミカル・コーポレーション（Ｕ、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クリーブランド、オハイオ州）］のＨｉｎｄｍ部位に挿入されたテトラヒメナ・テルモフィラｒＲＮＡの４８２−ｂｐ　Ｔｈａｉ断片を含有する。この断片は、５°エクソンの３２ｎｔ、４１３ｎｔ　ＩＶＳｌおよび３′−エクソンの３７ｎｔに対応するｒＤＮＡ配列を含有する。ｐＴＴＩＡ３Ｔ７のＨｉｎｄｍ断片を単離し、ｐ’ｒｚ１９Ｒ［（！−４ス・バイオケミカル・コーポレーション（Ｕ、　Ｓ、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クリーブランド、オハイオ州）コのＨｉｎｄｎ［部位に挿入して、ＩＶＳ、およびＩａｃＺ’遺伝子の最初の数コドン、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−補充断片に挿入された天然ｒＤＮＡ配列の少しの部分を含有するプラスミドを得た。イー・コリにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、それ自身を切り出し、１ａｃＺ’コドン領域に枠内連結して翻訳可能なｍＲＮＡ産物を生成するＩＶＳ　ＲＮＡの能力によることは他の者によって以前報告されている（ビーンおよびセヒ（Ｂｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）、セル（Ｃｅｌｌ）、土ヱ：２０７．１９８６　；プライスおよびセヒ（Ｐｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２８　：　７１９．１９８５：ワリングＱａｒｉｎｇ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、４０：３７１．１９８５）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、ｒＤＮＡインサートを含有するｐＴＺ１９Ｒ誘導体について行い、対応する１ａｃＺ’ＲＮＡが自己スプライシングし、正しい解読枠を維持するクローンを得た。加えて、可能性として有用である５ａｌＩ部位を３′−エクソンに生成させ、３゛　−エクソン中の枠内ＡＵＧを破壊して、翻訳スタート部位として使用されないことを保証した。ベクター配列における、最終のＤＮＡ配列および３゛−スプライス部位（ム）ないしＨｉｎｄｍ部位（下線）の３′−エクソンの正しい解読枠は以下に示す。

ｐＴＥＴＢＬＵム　Ｔ＾ＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＣＡＧＣＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＡＧＴ　にＡＣＧＣＡ　ＡにＣＴ’ｒ次いで、５゛工クソン配列においてｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって変化を起こして別のＰ（−１）ステム−ループ構造における塩基対合能力を改良する一連のスプライシング突然変異体用の親としてｐＴＥＴＢＬＵ　ＤＮＡを用いた。スプライシングしたＲＮＡ産物において正しい解読枠を維持し、翻訳スタートまたは停止コドンの生成を回避することに注意を払った。５′エクソンＲＮＡでなした得られた配列変化および形成が予測されるＲＮＡの別の構造を図３に示す。

すべての部位特異的突然変異は、ユナイテッド・スティン・バイオケミカル・コーポレイション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）からのｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いて生じさせた。ＤＮＡオリゴは、ホスホアミダイト化学を用い、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ）　３９４　Ｄ　ＮＡ／ＲＮＡ合成器で作成し、突然変異誘発オリゴとしての使用に先立ち、０ＬＩＧＯＣＬＥＡＮ１カラム（ユナイテッテド・スティン・バイオケミカル・コーポレイション）を用いて精製した。プラスミドを株ＭＶＩＬ９０中で維持した（イー・コリム（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）　３０６　：　：　ＴＮ　１０　ム（ｌａｃ−ｐｒｏ）　ｔｈｉ−ｓｕｐＥ　（Ｆ’ブＯＡ＋Ｂ＋１ａｃＩｏ１ａｃＺ　Ａ　Ｍｉ５　ｔｒａＤ３６）　ｏ各プラスミドをＤＮＡ配列決定［（ターボ−およびリチャードソン（Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　８ま：４７６７．１９８７）］によって確認した。

最終ＤＮＡｍ製（４００μｍ）を等容量のフェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、０．２５Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５の存在下で沈殿させる以外は、製造業者によって記載されているごとくに、＝ｎ　ｖｉｔｒｏ転写鋳型として用いるプラスミドをＱｉａｇｅｎ　［（キアゲン・インコーホレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ、　）、シャスワーッ（Ｃｈａｔｓｖｏｒｔｈ）、カリフォルニア州）コマキシ（ｍａｘｉ）−カラム調製によって精製した。該プラスミドをＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩいずれかでの切断によって線状化して鋳型を生成し、その上で、ランオフエフ転写により各々５４８または５２７ｎｔの全長ＲＮＡが得られた（Ｔ７プロモーター配列はポリクローニング部位の直ぐ上流に位置し、β−ガラクトシダーゼの暗号配列内にある）。

実施例４・シグナルＲＮＡホスホルアミダイト化学を用い、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅＩＩｌｓ）　３８０　Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成器で、短いシグナルＲＮＡ　（１１−２６ｎ　ｔ）を化学的に合成した。使用に先立ち、ＣｌｇＳＥＰ−ＰＡＣカートリッジ［（ミリボア・コーポレイション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））］を用いてシグナルＲＮＡを脱塩し、ゲル精製し、２６０ｎｍにおける吸光度によって定量した。シグナルＲＮＡは１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）中、−２０℃で保存した。ＰＴＥＴ１４１９およびｐＴＥＴ２１−２４からの前駆体ＲＮＡに特異的なシグナルＲＮＡの配列（図３）は以下の通りである。

ｐＴＥＴ１４１９　４５　３’　ＧＣＣＧ；＆ｖ２直５’４５３　３’　ＧＣＣＧｑ史；バーコリＧＡＵ　５’これらのシグナルＲＮＡは、所与の構築体におけるＰ（−１）ステムの５°側を形成する上流エクソン配列に相補的である。下線を施したヌクレオチドは、該Ｐ（−１）ステムに含まれる５°工クソン配列と塩基対合するシグナル配列の部分に対応し、残りのヌクレオチドはステムの、またはループにおける塩基におけるヌクレオチドいずれかと塩基対合する。例えば、シグナルＲＮＡ　４Ｓ３は、ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡにおけるステムの塩基に対して５°側の４ｎｔと塩基対合し、すべてのヌクレオチドはＰＣ−１）ステムの５′側に包含され、および３個のヌクレオチドはループに包含される。

ｐＴＥＴ１４　ＲＮＡにおいて（図３）、５’　−スプライス部位に対して−１４でＵをＣに変化させると、過剰Ｃ−Ｇ塩基対を形成してＰ（−１）ステムを長くするのを可能とする。この特別の配列変化は、ウソドソンおよびセヒ（Ｗｏｏｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）　［（ウッドソンおよびセヒ、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３０　：　２０４２．１９９１）コにより、短前駆体ＲＮＡの自己スプライシング活性を減少させることが報告されている。

ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡは、安定でないＧ−Ｕ塩基対の代わりにＡ−Ｕ塩基対を生成させることによりて、より安定なステムをＰ（−１）が形成するのを可能とする追加のヌクレオチド変化（−１９におけるＧからＡ）を有する。最終的に、ｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡは、４個の追加のヌクレオチド変化（スプライス部位に対して−２１〜−２４位）によりて生成した非常に安定なＰ（−１）ステムを有する。文献［フライエル（Ｆｒｅｉｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、旦旦：　９３７３．１９８６；ジェガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　ｓ旦旦＋　７７０６．１９８９コ中の最も最近の値に基づき、これらの構造につき３７℃における計算した自由エネルギーを図３に示す。これらの構築体すべてにおいて、ヌクレオチド変化は、ＩＶＳまたは５°エクソンの３″末端におけるｌ　３１１　ｔを変更することなく、上流の５°エクソンのみでなされた。

ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで線状化した鋳型で、Ｔ７プロモーターからの全長転写は、各々、５４８および５２７ｎｔの転写体を生じさせた。これらは、同等長の５゛エクソン（４３ｎｔ）およびＩＶＳ　ＲＮＡ　（４１３ｎｔ）を有することを除き、その３゛−エクソン（９２ｖｓ、７１ｎｔ）の長さのみが異なっていた。ＩＶＳを切り出し、５′エクソンに３′　−エクソンを正しく連結すると、ＥｃｏＲＩランオフ転写体についての１３５ｎｔおよび対応するＢａｍＨ１転写体についての１１４ｎｔのＲＮＡが得られた。連結したエクソンの様子は、個々の含ＩＶＳ構築体によって支持される自己スプライシングのレベルを示す。

実施例５：Ｐ（−１）の安定性の増大による自己スプライシングの減少ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写は以下のごとくに行った。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応は、５００μＭの各ＮＴＰおよび〜１０μＣｉの［α３！Ｐ］　ＣＴＰを含有する転写緩衝液（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ））中で行った。

個々の反応（合計容量１０μｍ）は、０．１μｇの線状化プラスミド鋳型および２０〜３０Ｕ　Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含有していた。３０℃で３０分経過後、各試料２μｍを取り出し、キシレンシアツールＦＦおよびブロモフェノールブルー（ホルムアミド／染料ミックス）を含有する２μｌの緩衝化ホルムアミドと混合した。試料の残りを３７℃まで加温し、ＩＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭＭｇＣ１，，１ｍＭ　ＧＴＰの２μｍを添加してスプライシングを良好に支持する反応条件に調整した。０．４ｘＴＢＥ　（ＴＢＥは８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、０．０２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に４％（１９：１）アクリルアミド：ビスアシルアミドおよび７Ｍ尿素を含有する変性ゲルで試料を分析した。電気泳動は０．４ＸＴＢＥを泳動緩衝液として用い３０〜６０ワツトで行った。ゲルをコダック（Ｋｉｄａｋ）ＸＯＭＡＴ　ＸＡＲ−５フイルムに暴露した。

３！Ｐ標識の前駆体ＲＮＡのゲル精製については、転写反応を２．５−１０倍にスケールアップし、３７℃で１〜２時間インキュベートした。いくつかの場合において、各ＮＴＰの濃度を２．５〜３ｍＭまで増加させ、転写反応間に自己スプライシングを減少させ、それにより、全長転写体の回収を最小化することを試みた。等容量のホルムアミド／染料を完了した反応に添加し、全反応を前記したごとく変性ゲルに負荷した。ラジオオートグラフィーによる可視化の後、全長転写体を含有するゲルを切り出し、０．５−１ｍ１の０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡに入れた。４℃での１２〜１６時間経過後、溶出物を取り出し、２．５倍容量のエタノールの添加によってＲＮＡを沈殿させた。最終ＲＮＡペレットを１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭｔ−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）に再懸濁し、−２０℃で保存した。

親プラスミドおよび修飾構築体を鋳型として用いる転写を［α３２ＰコＣＴＰの存在下で行って、自己スプライシングするその能力を分析できる３２Ｐ−標識転写体を得た（図４．０分）。全長転写体（ＦＬ）、わずかな量のＩＶＳ　ＲＮＡ（ＩＶＳ）、および追加の「中間体Ｊ　ＲＮＡ産物（＊）がすべての鋳型につき存在した。ＥｃｏＲＩランオフ転写体（１３５ｎｔ）ならびにＢａｍＨ１ランオフ転写体（１１４ｎｔ）からの連結エクソン（ＬＥ）であるべき適当な長さの少量のＲＮＡ産物も目に見え、限定量のスプライシングがこれらの転写条件下で起こり得ることが示された。このかすかなバンドは、ｐＴＥＴＢＬＵ＞ｐＴＥＴ１４＞ｐＴＥＴ１４１９の順で強度が減少し、ｐＴＥＴ２１−２４では目で見えなかった。

得られたＲＮＡ産物の分析から、親プラスミドｐＴＥＴＢＬＵの転写は十分に自己スプライシングできる転写体を生じることが明らかである。これは、良好にスプライシングを支持する条件に調整した１５および６０分後における連結エクソンの増加量によって証明される。

産生された連接エクソンの量を比較することによって、親ｐＴＥＴＢＬＵからの転写体よりも不十分であるにも拘わらず、ｐＴＥＴ１４およびｐＴＥＴ１４１９からの転写体はなお自己スプライシングできたことが明らかである。スプライシング条件にシストすると、ｐＴＥＴ１４およびｐＴＥＴ１４１９はｐＴＥＴＢＬＵよりも少量の連結エクソンを生じ、これらの２つの突然変異体のうちｐＴＥＴ１４１９が最も効率が低かった。しかしながら、同一の条件下で、ｐＴＥＴ２１ −２４からの転写体は自己スプライシングしないようであった。スプライシングを支持するように条件を変更した後、ｐＴＥＴ２１−２４については、目に見える連結エクソンはなかった。次いで、これらの３つの突然変異構築体が自己スプライシングする観察された相対的能力は、Ｐ（−１）ステムの増大する安定性に基づいて予想される桁に従う、すなわち、Ｐ　（−１）ステムの強さとＲＮＡが自己スプライシングする能力の間には負の相関関係がある。さらに、ｐＴＥＴ２１−２４における高安定化Ｐ　（−１）　７．テムの存在はｉｎ　ｖｉｔｒｏスプライシングを検出できないレベルまで減少させた。

スプライシング条件下、連結エクソンに加えて多数のＲＮＱＡ産物が可視化された。予期されるごと（、ｐＴＥＴＢＬＵ転写体のスプライシングは、その種々の形態の有意量の切出ＩＶＳ　ＲＮＡを生じた（環状および線状ＩＶＳおよび短（された形態で、５°の１５または１９ｎｔを欠く）。これらの産物のいくつかは、同様に突然変異転写体につき目に見え、目に見える連結エクソンがなかったｐＴＥＴ２１−２４もそうであった。これらのＩＶＳ産物の存在は、通常よりも強力なＰ（−１）ステムによる５°　−スプライス部位において種々の程度誤って折り畳まれたこれらの突然変異体ＲＮＡの能力に影響を与えて、その３′−スプライス部位における加水分解をなお支持し得る［ウッドソンおよびセヒ（Ｗｏｏｄｓｏｎａｎｄ　Ｃｅｃｈ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３０：２０４２．１９９１コ。

放出された３°−エクソンは目に見えなかったにも拘わらず、（図４に星印で表示した）突然変異体ＲＮＡのレーンで大いに増強された１のＲＮＡ産物は５°エクソン−ＩＶＳ　ＲＮＡを表すの適当なサイズのものであった。この５′エクソン−ＩＶＳ　ＲＮＡは、環化反応を受け、ゲル上で観察される線状ＩＶＳ産物（Ｌ−１５およびＬ−１９）を産生ずることがなおも予測される。短いＲＮＡは、スプライシング条件に移行させた後、強度が増大した。また、自己スプライシングする前駆体の能力が減少するにつれ、それは、量が増大するようであり、かくして、ｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡレーンで最も支配的であった。

ｐＴＥＴ２１−２４レーンで連結エクソンが欠けていることから、この突然変異体は、２つのエクソン産物の正しい連結を受け得ることが明らかである。正しいスプライシング反応を受けることができない場合、突然変異体ＩＶＳを含有するＲＮＡの明らかな副反応（例えば、星印で標識したＲＮＡ産物の形成）は有利に用いることができるであろう。例えば、この「自己破壊」は、メツセージの迅速な転換が、トキシンが適当なシグナルの不存在下で産生される可能性をさらに減少させる状況にて、トキシンをコードするＩＶＳ含有ｍＲＮＡに有用であり得る。

実施例６：シグナルＲＮＡによるスプライシング反応の反応性ゲル精製した全長ＲＮＡ前駆体をシグナルＲＮＡの不存在下および存在下にてスプライシング条件に付して、上流の５°工クソン配列に相補的な短いＲＮＡがＰ（−１）構造を破壊し、それにより、活性なＰ（１）構造が形成されるのを可能とする能力をテストした。

０ないし１０００倍モル過剰のシグナルＲＮＡの存在下、０．１〜０．２５ピコモルの３２Ｐ−標識転写１０μｌスプライシング緩衝液（２００ｍＭ　ＮａＣ１゜２００μＭ　ＧＴＰ、３０ｍＭ　ｈリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５）をインキュベートすることにより、ゲル精製した前駆体ＲＮＡを用いるスプライシング反応を行った。３７℃まで加温した後、ＭｇＣｌ２を５ｍＭに添加してスプライシング反応を開始した。インキュベーション周期は３７℃における１０ないし１２０分の範囲であり、それらの時点で、試料を取り出し、等容量のホルムアミド／染料と混合した。試料を前記したごとく変性ゲルで分析した。

自己スプライシングを再活性化すれば、より多くの連結エクソン産物が、これらのシグナルＲＮＡの不存在下よりも存在下で産生されることが予測される。スプライシング反応の再活性化を示す実験結果を図５でｐＴＥＴ１４１９につき、図６でｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡにつき示す。

図５で既に見られたごとく、いずれものシグナルＲＮＡの不存在におけるスプライシング条件下でのｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡのインキュベーションにより、少量の連結エクソン産物が生成された。ゲル精製転写体に関しては、これは再度該当する（図５）。ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡにおけるＰ（−１）は、Ｐ（１）の形成を完全に阻止するほど十分に安定でなく、従って、少量のスプライシングがなお起った。しかしながら、２つの特異的シグナルＲＮＡいずれかをインキュベーションで存在させると、産生される連結エクソンの量は減少した。極端に低いシグナル一対−転写体の比（０，１：　１）でさえ、連結エクソンの量のわずかな上昇が観察された。シグナル一対−転写体の比が（１０００：　１まで）増加するにつれ、連結エクソンの産生も増加した。これらの実験は、ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡが正しく自己スプライシングし、連結エクソンを産生ずる能力は、特異的シグナルＲＮＡの存在に直接対応し、有意なレベルの自己スプライシングが回復されることを示した。

シグナルＲＮＡに対する同様の応答がゲル精製ｐＴＥＴ２１−２４で観察された（図６）。前記したごとく、ｐＴＥＴ２１−２４　ＲＮＡに関しては、転写体を単独でインキュベートした場合、目に見える連結エクソンはなかった（図４も参照）。これは、ｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡにおけるＰ（−１）はＰ（１）の形成を完全に阻止するのに十分安定であることを示す。しかしながら、この転写体につき特異的な２つのシグナルＲＮＡ（８Ｓ４または１２Ｓ）いずれかを添加すると、連結エクソンが産生される。３２Ｐ−標識ＲＮＡ産物は連結エクソンであることは、その長さをｐＴＥＴＢＬＵ　ＲＮＡから産生された連結エクソンの長さと比較することによって観察できた。ＥｃｏＲＩ消化した鋳型から産生された転写体のスプライシングにより、１３５ｎｔ長の連結エクソンが生じた。ＢａｍＨＩで線状化した鋳型からの転写体は、対応して、より短い連結エクソンを生じた（１１４ｎｔ）。かくして、スプライシング反応がｐＴＥＴ２１−２４　ＲＮＡ自体にて完全に「オフ」とされた場合であっても、特異的シグナルＲＮＡでのスプライシング反応を再活性化するのがなお可能であった。

図６の左側で示したＥｃｏＲＩランオフ転写体については、シグナルＲＮＡの存在に対応するらしい（点で示した）第２の主要な産物があった。このＲＮＡは正しく連結されたエクソンよりも短（、現時点では、その起源は分からない。別の部位におけるスプライシングまたはＲＮＡの特異的分解は可能性がある。

実施例７．クロニー発色アッセイ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、β−ガラクトシダーゼの発色基質を含有するＬＢまたはＢ寒天平板上で増殖させると、ｐＴＥＴＢＬＵを含有するコロニーは、β−ガラクトシダーゼを産生ずるコロニーに予測されるように暗青色である。ｐＴＥＴＢＬＵについてのβ− ガラクトシダーゼのα−補充断片の暗号領域はテトラヒメナＩＶＳにより妨げられるので、このＲＮＡは活性なα−断片を産生させるには正しく自己スプライシングしなければならない。自己スプライシングが起こらないと、ＩＶＳにおけるすべての３つの解読枠に存在する停止コドンは遺伝子の下流部分への翻訳を可能としないであろう。比較のため、ｐＴＥＴＢＬＵからのＨｉｎｄｍ断片を含有するイントロンが逆向きにｐＴＺ１９Ｒに挿入された対照プラスミド（ｐＴＥＴＩＪＬＢ）を構築した。この対照については、誤った向きによりスプライシングが起こり得ない場合、得られるコロニーは白色である。

よって、理論的には、スプライシングを欠く突然変異体を含有する細胞は明るい青色コロニーを生じるはずであり、一方、非スプライシング突然変異体のコロニーは白色であろう。標準的な増殖条件下、ｐＴＥＴ１４１９およびＤＴＥＴ２１ −２４突然変異体を含有する細胞は、親プラスミドｐＴＥＴＮＬＵを含有する細胞よりもかなり明る（、白色ではないコロニーとして増殖した。これより、（ｉｎ　ｖｉｔｒｏで連結エクソンを形成しないその能力によって判断して）最も強力な非スプライシング突然変異体ｐＴＥＴ２１−２４でさえ、コロニーに青色を与え得るβ−ガラクトシダーゼのα−断片のレベルの翻訳を支持するのに必要なスプライスメツセージの最小量をなお形成できるようである。他の科学者は、自己スプライシングが翻訳不可能枠中にβ−ガラクトシダーゼメツセージを残す含ＩＶＳ構築体でのβ−ガラクトシダーゼ活性（青色のコロニー色）を注記している［（ビーンおよびセヒ（Ｂｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）、セル（Ｃｅｌｌ）、４７　：　２０７．１９８６：プライスおよびセヒ（Ｐｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｃｅｃｈ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）λλ旦＝７１９．１９８５）］。別のスプライス部位が存在する可能性がある。

より定量的な測定のため、β−ガラクトシダーゼアッセイを培地で増殖する含プラスミド細胞につき行った［（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング−ハーバ−研究所、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州、（１９７２）］。このアッセイでは、０−ニトロフェニル−β −Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を発色基質として用いた。何故ならば、β−ガラクトシダーゼでの切断後、その産物は分光学的に測定できるからである。ｐＴＥＴＢＬＵからのＨ４ｎｄｍ断片を含有イントロンを逆向きにｐＺＴ１９Ｒに挿入した対照プラスミド（ｐＴＥＴＵＬＢ）を構築し、それを用いて０ＮＰＧの自然分解のバックグラウンドレベルを測定した。これらの実験において、親プラスミドまたはスプライシング突然変異体いずれかを含有する細胞を誘導条件下で（すなわち、ＩＰＴＧ、ラクトースアナログの存在下で）増殖させた。ｐＴＥＴ１４１９およびｐＴＥＴ２１−２４スプライシング突然変異を含有する細胞における活性β−ガラクトシダーゼの産生は親の値の数％まで減少し、かくして、これは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ自己スプライシングの量の減少のみならず、イー・コリ細胞で産生された活性蛋白の量における汚染物の減少により、ＲＮＡの変化が反映されたことを示す。

里塗本発明の応答性ＲＮＡ分子は、所与のウィルスの存在に対応する細胞を産生ずるのに有用である。特に、生物学的化合物の商業的生産のための大規模ｉｎ　ｖｉｔｒ。

細胞培養の場合、ウィルス汚染は、全培養を台なしにしかねない深刻な問題である。多くの例において、かかる細胞のウィルス汚染を防止する手だてはない。本発明の分子は、いずれの細胞ｗｈｉＨＰ　Ｌａ５ｅｒＪｅｔ　５ｅｒｉｅｓ　ＩＩＨＰＬＡＳＥＩＩ、　ＰＨ１も、特定の細胞タイプの生理学的状態または活性に影響する点で、いずれの所与のウィルスに対しても耐性の細胞系の生成を可能にするであろう。蛋白暗号領域内の塩基対合ドメインの形成によって調製される応答性ＲＮＡ分子の場合、該方法は、細胞の生理学または活性に影響するであろう蛋白をコードする応答性ＲＮＡの構築：および細胞のタイプに特異的なシグナルＲＮＡ、すなわち、影響を受けるべき細胞タイプのＲＮＡ集団に存在するか、あるいはそこで得られるのみのヌクレオチド配列を担持するＲＮＡ分子の同定を必要とする。自己スプライシングイントロンによって調節される応答性ＲＮＡ分子については、該方法は、細胞の生理学または活性に影響するであろう蛋白をコードする応答性ＲＮＡの構築を必要とする。

活性蛋白はスプライスされていないメツセージからではなくスプライスされたメツセージから翻訳されなければならない。また、それは、細胞タイプに特異的なシグナルＲＮＡ、すなわち、影響を受けるべき細胞のタイプのＲＮＡ集団に存在するか、あるいはそこで得られるのみのヌクレオチド配列を担持するＲＮＡ分子の同定を必要とする。

例えば、非感染細胞ではなくウィルスＲＮＡを含有するウィルス感染細胞；野生型ＲＮＡ含有する細胞ではなく突然変異体ＲＮＡを含有する細胞；生物体における他の種類の細胞ではなく特定の組織または器官中の細胞：および通常の細胞ＲＮＡを含有する細胞ではなく細胞集団内の異常ＲＮＡを含有する新生物または癌を引き起こす細胞を特異的に殺すように応答性ＲＮＡを設計できる。

細胞の生理学的状態の変更におけるかかる応答性ＲＮＡの効果は、シグナル核酸が存在する細胞中の場所に送達されるべき応答性ＲＮＡ、スプライシング、ポリーＡ付加、キャッピング、核層を横切っての輸送、および翻訳開始を含めたコード蛋白の産生に至るすべてのプロセスに必要なすべてのヌクレオチド配列を有する応答性ＲＮＡに依存し：応答性ＲＮＡは核ならびに細胞質におけるＲＮＡＩ：安定性を付与する配列エレメントを担持しなければならない。

応答性ＲＮＡ分子はＲＮＡの形態であるいはＤＮＡまたはＲＮＡでつ（られた遺伝子の形態で細胞に送達され得る。ＲＮＡの細胞への送達は針でのインジェクションによって、またはカチオン性脂質でつくられたものを含めたリポソームの使用によって達成することができる。遺伝子の形態での応答性ＲＮＡの送達は、非毒性ウィルスの使用によって達成できる。これには、転写または複製シグナルエレメントと共に応答性ＲＮＡ−コーディング遺伝子をウィルスゲノムへ挿入することが必要である。レトロウィルス、ポリオーマウィルスおよびワクシニアウィルスが、遺伝子を送達し、それを発現できるものとして設計されており、他のウィルスをこの目的で開発し、それを使用することもできる。

特定の細胞タイプの生理学を制御するための応答性ＲＮＡを使用するもう１つの一般的方法は、細胞ゲノムへの応答性ＲＮＡ遺伝子の組み込みを含む。応答性ＲＮＡのスプライシングの活性化は外因的に付加したポリヌクレオチドによって引き起こされ得る。

他の具体例も以下の請求の範囲内のものである。

ｈＣ−１ｖＳ−ｍ−・−ｍ−−−―Ｃ−１ｖＳ・　−しＥ −−−−＜んσ、４゜Ｆ／Ｇ、　５゜Ｌｒｌ＋Ｒ１ｌＪｕｍＩＩＩＣ−ＩＶＳ　、、　−−−−−− Ｆ／Ｇ　６゜国際調査報告フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】

１．リボソーム認識配列、調節ドメイン、基質領域を有し、１またはそれを超える蛋白コーディング領域においてポリペプチドをコードする応答性ＲＮＡ分子であって；該調節ドメインはインヒビター領域よりなり、かつ該基質領域に相補的であり：該インヒビターおよび基質領域はシグナル核酸の不存在下において塩基対合ドメインを形成でき；該塩基対合ドメインは該塩基対合ドメインの不存在下で観察される翻訳レベルと比較してそのレベルを低下させ；該シグナル核酸は、該インヒビター領域と塩基対合した場合に、該シグナル核酸の不存在下で観察される該応答性ＲＮＡの翻訳レベルと比較して該応答性ＲＮＡの翻訳レベルを増加させる該インヒビター領域に相補的な抗−インヒビター領域を有する該応答性ＲＮＡ分子。
２．該蛋白コーディング領域がエクソンである請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
３．該基質領域が１の該蛋白コーディング領域の部分よりなる請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
４．該基質領域がイントロンの部分よりなる請求の範囲第２項記載の応答性ＲＮＡ。
５．該基質領域が該エクソンの５′−末端に隣接するイントロンの部分よりなる請求の範囲第２項記載の応答性ＲＮＡ。
６．該基質領域が該リボソーム認識配列の部分を包含する請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
７．該リボソーム認識配列がリボソーム結合部位である請求の範囲第６項記載の応答性ＲＮＡ。
８．該応答性ＲＮＡが精製されたものである請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
９．該ポリペプチドが細胞活性、細胞増殖、ＤＮＡの転写、ＲＮＡの翻訳、またはＤＮＡの複製を修飾する請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
１０．該ポリペプチドが細胞毒活性またはリボヌクレアーゼ活性を有する請求の範囲第９項記載の応答性ＲＮＡ。
１１．該ポリペプチドがジフテリアトキシンの活性サブユニット、コレラトキシンの活性サブユニット、リシン、およびイー・コリのｈｏｋ、ｇｅｆ、ＲｅｌＦまたはｆｌｍ遺伝子産物よりなる群から選択される請求の範囲第１０項記載の応答性ＲＮＡ。
１２．該イントロンが該１またはそれを超えるエクソンの完全な翻訳を妨げる請求の範囲第１４項記載の応答性ＲＮＡ。
１３．該イントロンが該イントロンの不存在下における該エクソンの翻訳のレベルと比較して該１またはそれを超えるエクソンの翻訳のレベルを減少させる請求の範囲第４項記載の応答性ＲＮＡ。
１４．該イントロンがリボソーム認識配列と蛋白コーディング領域との間に位置する請求の範囲第４項記載の応答性ＲＮＡ。
１５．該第１のイントロンが２つの該エクソンの間に位置する請求の範囲第４項記載の応答性ＲＮＡ。
１６．該イントロンがその５′−末端において５′−スプライト連結と接し、その３′−末端において３′−スプライス連結と接する請求の範囲第４項記載の応答性ＲＮＡ。
１７．該基質領域が該イントロンと接する５′−スプライス連結よりなる請求の範囲第１５項記載の応答性ＲＮＡ。
１８．該イントロンが２つのＲＮＡの切断反応を触媒し、１つは該５′−スプライス連結にあり、１つは該３′−スプライス連結内にある請求の範囲第１６項記載の応答性ＲＮＡ。
１９．該基質領域が該イントロンの５′−スプライス連結よりなる請求の範囲第１８項記載の応答性ＲＮＡ。
２０．該インヒビター領域が該５′−スプライス連結内の該切断反応の生起レベルを低下させる請求の範囲第１９項記載の応答性ＲＮＡ。
２１．該シグナル核酸が−本鎖である請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡ。
２２．該シグナル核酸がウイルスＲＮＡである請求の範囲第１０項記載の応答性ＲＮＡ。
２３．請求の範囲第１項記載の応答性ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子。
２４．該応答性ＲＮＡが天然５′−スプライス連結と比較して少なくとも１の修飾された塩基を有するテトラヒメナ・テルモフィラの５′−スプライス連結ＲＮＡよりなる請求の範囲第１９項記載の応答性ＲＮＡ。
２５．応答性ＲＮＡを細胞に導入することよりなり、ここに、該応答性ＲＮＡはリボソーム認識配列、調節ドメイン、基質領域よりなり、かつ１またはそれを超えるエクソンにおいてポリペプチドをコードし；該調節ドメインは該基質領域に相補的なインヒビター領域よりなり；該インヒビターおよび基質領域はシグナル核酸の不存在下において塩基対合ドメインを形成でき；該塩基対合ドメインは該塩基対合ドメインの不存在下における観察される翻訳レベルと比較して該応答性ＲＮＡ分子の翻訳レベルを低下させ；該シグナル核酸は、該インヒビター領域と塩基対合した場合に、該シグナル核酸の不存在下で観察される該応答性ＲＮＡの翻訳レベルと比較して該応答性ＲＮＡの翻訳レベルを増加させる該インヒビターに相補的な抗−インヒビター領域を有することを特徴とするシグナル核酸を担持する細胞の増殖に特異的に干渉する方法。