JPH07507931A - 細胞障害性誘導ｍＲＮＡを含有するウイルス抵抗性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞障害性誘導ｍＲＮＡを含有するウィルス抵抗性植物発明の背景 本発明はウィルス抵抗性植物を作成するのに有用な方法および組成物に関する。

植物の最も重要な防御機構は過敏応答である。これは、不適合な宿主−病原体（ 真菌、細菌、ウィルスまたは線虫）相互作用において細胞死を導く細胞の変化が 発生することである。発病した生体は、かかる壊死組織を即座に殺すことで封じ 込め、または感染が複製および拡散する能力を制限する。病変部分の壊死を導く 過敏応答には、細胞膜の浸透力の欠落、フェノール性化合物の蓄積および酸化、 およびフィトアレクノン（Ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ）の生成を含む。特定のフ ェノール性化合物のレベルの増加およびフィトアレクシンの誘導は真菌および多 くの細菌性および線虫性病原体に対して毒性である。ウィルス病において、過敏 応答は、ウィルスがその中でかなり低い濃度で、かなりの間生存し得る部分病変 と呼ばれるものとなるが、ウィルスはその病変部分内へ封じ込められる。

発明の要旨 本発明は特定のウィルスに感染した植物細胞を特異的に殺すリポザイムを提供す る。これはすなわ糺植物の過敏応答を人工的に生じさせることとなる。この種の 反応は容易に構築し得、多くのウィルス性感染を阻害するため応用できる。

例えば、タバコ植物におけるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）によるウィルス 感染の結果としての人工過敏応答を特に標的とすることができる。リボザイムは 、ウィルス染色体内シグナル配列が毒素、例えば植物細胞に毒性であるイー・コ リ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ポリペプチド、の細胞内産生を刺激するごとき方法によっ て構築される。これはウィルスに感染された細胞を殺すことによって植物の過敏 応答を生じる。Ｔ　ＭＶ陽陽性１鎮鎮ＲＮＡゲノム３゛末端の二次構造は非常に よく調べられており、したがってシグナル配列となる可能性のある非−塩基対生 成領域の決定を容易に行うことができる。

特に、本発明は応答性ＲＮＡと名付けた、植物細胞中に存在する場合に、他の核 酸の存在に応答するＲＮＡ分子を提供する。「応答」という語は、特定の核酸（ 応答性ＲＮＡとハイブリッドを形成し得る）の存在下において応答性ＲＮＡが１ または複数のポリペプチドを形成すべく翻訳され、かかる核酸の非存在下ではこ れらのポリペプチドを形成するように翻訳が実質的にされないことをいう。かか る応答性ＲＮＡ分子は一般に１または複数のポリペプチド分子をコード化し、そ の生成は応答性ＲＮＡ分子の翻訳に依存する。一般に、応答性ＲＮＡ分子の翻訳 、そしてすなわちポリペプチドの産生は、シグナル核酸と名付ける特定の核酸が 細胞内に存在しなければいずれの細胞内においても生じない。

応答性ＲＮＡは多くの細胞の中から特定の細胞を殺すもしくは障害するのに用い 得る。例えば、応答性ＲＮＡは特定の細胞内の応答性ＲＮＡ分子が、細胞が殺傷 されることが必要な状況（例えばＴＭＶのごとき有害なウィルスによる感染）毒 素分子をコード化してもよい。より詳しくは、応答性ＲＮＡ分子は、コレラ毒、 ジフテリア毒、リチン（ｒｉｃｉｎ）、大腸菌のホック（ｈｏｋ）、ゲフ（ｇｅ ｆ）、レルフ（ｒｅｌＦ）、もしくはフルム（ｆｌｍ）遺伝子産物である細胞障 害性蛋白質をコード化し、この応答性ＲＮＡ分子の翻訳および細胞障害性蛋白質 の産生は、応答性ＲＮＡがＴＭＶに感染した細胞内に存在する場合にのみ生じる 。この場合、ＴＭＶに特異的なＲＮＡ分子またはＴＭＶのＲＮＡゲノムの一部が シグナル核酸として提供され、この応答性ＲＮＡ分子と相互作用して応答性ＲＮ Ａ分子の毒素コード化配列の翻訳が起こる。

応答性ＲＮＡ分子は、シグナル核酸の非存在下においては翻訳を抑制する構造を 有するよう、ポリペプチドコード化ＲＮＡをデザインして製造される。応答性Ｒ ＮＡ分子のひとつのタイプとしては塩基対生成ドメインを形成するよう折り畳ま れているものがある；これによって例えば、十分安定な場合には、ＲＮＡ配列が 読み取られぬようにして細胞の翻訳機構を妨げて翻訳が防止される。このタイプ の応答性ＲＮＡの特定の例は、所望のポリペプチドをコード化するドメイン（ま たは「蛋白質コード領域」）および調節ドメイン（すなわち、インヒビター領域 、逆位反復配列およびヌクレーンヨン領域を含有する調節エレメント）を有する 。

調節ドメインは、この調節ドメインのエレメントがコードされたポリペプチドの 活性を妨害することがなければ、応答性ＲＮＡのどの部位に位置していてもよい 。

インヒビター領域は基質領域（これには蛋白質コード領域および／またはＲＮＡ ウィルスのＲＮＡゲノムの蛋白質コード領域もしくは部分の５°側の非翻訳ＲＮ Ａであるリーダー領域を含有してもよい）および抗インヒビター領域と呼ばれる シグナル核酸の領域の両方と配列が相補的である。シグナル核酸配列がなければ 、応答性ＲＮＡ分子の抑制領域は、応答性ＲＮＡの基質領域とハイブリッドを形 成して分子内塩基対生成ドメインを形成して、翻訳を停止または減少させる。シ グナル核酸が存在する場合には、抗インヒビター領域は基質領域と、インヒビタ ー領域へ結合すべく競合する。シグナル核酸の抗インヒビター領域と応答性ＲＮ Ａのインヒビター領域の細胞内塩基対形成ドメインは、蛋白質コード領域との塩 基対形成領域の生成を抑制する。このような環境の下では、蛋白質コード領域が 翻訳され得る。

応答性ＲＮＡ分子の第２のタイプは干渉配列もしくは「イントロン」を有し、こ の存在は１または複数の「エキソン」の翻訳を抑止する。イントロンは所望のポ リペプチドをコードしない。所望のポリペプチドをコードするＲＮＡのセグメン トを「エキソン」とよび、スプライシング反応の後に残る非コード配列（例えば リーダー領域、分泌シグナル配列、ポリ（Ａ）テイルおよび類似物）を非コード 領域と呼ぶ。この第２のタイプの応答性ＲＮＡ分子は、所望の条件下（例えば特 定のＲＮＡ分子の存在下）において、イントロンを除き、ＲＮＡ分子の２つの隣 接部分をつなげ、活性ポリペプチドの正確な鋳型となる分子形成するスプライシ ングが行われるよう、デザインされる。このスプライシングを調節することは翻 訳を調節することとなる。この第２のタイプの応答性ＲＮＡ分子は第１のタイプ の応答性ＲＮＡ分子と、シグナル核酸の抗インヒビター領域および応答性ＲＮＡ 分子の基質領域の両方に相補的なインヒビター領域を有するという点が同じであ る。この第２のタイプの応答性ＲＮＡにおいて、基質領域は必ずしもエキソンの 一部分ではなく、むしろ自己スプライシング反応に必要な領域を含む。基質領域 が、インヒビター領域と塩基対を形成する場合には、自己スプライシングは生じ ず、従って翻訳は抑制される。これに対して、シグナル核酸が存在する場合、そ の抗インヒビター領域は反応性ＲＮＡのインヒビター領域とハイブリッドを形成 し、分子内塩基対ドメインを形成し、これがインヒビター領域と基質領域の間の 分子内塩基対形成を妨げる。このような状況下において、基質領域はスプライシ ング反応に自由に関与でき、イントロンが除かれ、そして正しくつなげられたエ キソンの翻訳が生じ得る。

従って、本発明の第１の点は、１または複数の蛋白質コード領域においてポリペ プチドをコード化し、調節ドメイン、基質領域および、例えばリポソーム結合部 位、翻訳開始部位およびＲＮＡの翻訳に必要なすべての非コード領域のごときリ ポソーム認識配列を含有する応答性ＲＮＡ分子を提供することである。この応答 性ＲＮＡ分子は、応答性ＲＮＡ分子の基質領域およびシグナル核酸の抗インヒビ ター領域の両方に相補的であるインヒビター領域を調節ドメイン内に有し、この ためシグナル核酸の非存在下ではインヒビターと基質領域が塩基対を形成するド メインが形成され、これによってシグナル核酸配列の存在下と比べて、応答性Ｒ ＮＡ分子の翻訳のレベルが下がるようになっている。シグナルＲＮＡは選択的に 殺さなくてはならない植物細胞にのみ存在するものから選択される、例えばＴＭ ＶゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡである。

「調節ドメイン（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｄｏｍａｉｎ）Ｊは、シグナル核酸の 存在に応じて応答性ＲＮＡ分子の翻訳のレベルを調節する応答性ＲＮＡ分子の１ 領域である。調節領域にはインヒビター領域、逆位反復領域およびヌクリエイシ ョン（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）領域を含む。「リポソーム認識配列」は、所定の 開始コドン（典型的にはＡＵＧ）でＲＮＡ分子の翻訳が始まるためにはＲＮＡ分 子には必要な領域である。かかる部位はリポソームによって認識され、ＲＮＡの 翻訳の開始に先立ってリポソームが結合する。原核生物においては、リポソーム 認識配列がリポソーム結合部位であり、中心が開始コドンから約１０ヌクレオチ ド５゛側であるプリンに富む配列を含む（シン（Ｓｈｉｎｅ）とダルガルノ（Ｄ ａｌｇａｒｎｏ）、ブロック・ナチュール・アカド・真核生物では、配列Ａ／Ｇ 　ＮＮＡＵＧＧが翻訳の開始に必要な最低限のリポソーム認識配列であることが コザック（Ｋｏｚａｋ）（コザック、ジェイ・セル・ビオール（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 、　Ｂｉｏｌ、）１旦旦：２２９．１９８９）により記載されている。この配列 にはＡＵＧ開始コドンを含有する。

「シグナル核酸」は応答性ＲＮＡ分子によりコード化されるポリペプチドの産生 が所望される状況を表示する核酸（例えばウィルスのＲＮＡ）である。

「塩基対生成」ドメインは核酸の２つの領域のヌクレオチドがお互いに水素結合 した領域をいう。この言葉にはかかる領域の連続するヌクレオチドの全てが結合 するわけではでない場合の結合も含む。　゛「基質領域」は、塩基対を形成した 場合に、応答性ＲＮＡ分子の１または複数の蛋白質コード領域の翻訳のレベルを 低下させる、応答性ＲＮＡの１領域である。

「インヒビター領域」は、基質領域と塩基対を形成した場合に、応答性ＲＮＡ分 子における１または複数の蛋白質コード領域の翻訳のレベルを低下させる、応答 性ＲＮＡ分子の１領域である。

「抗インヒビクー頌域」は、インヒビター領域へ塩基対を生成した場合に、応答 性ＲＮＡの１または複数の蛋白質コード領域の翻訳レベルを、シグナル核酸分子 非存在下の場合のレベルと比べて増加させる、シグナル核酸内の領域である。

これらの３つの領域は相互に作用して応答性ＲＮＡ分子の翻訳のレベルを調節し 、シグナル核酸の存在に依存してポリペプチド産生を適当なレベルにするよう選 択される。

「インディケータ−遺伝子」は、発現したことを容易に同定し得るコード領域を 含有する。例えば、この遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−グルキュロニダーゼま たはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコード化する。

「適当なレベル」とは、シグナル配列の非存在下においては、細胞の生理に殆ど または全（影響を及ぼさない程にポリペプチドのレベルが十分低（、シグナル核 酸の存在下においては、ポリペプチドのレベルが細胞の生存性を低下させるのに 十分高いことを意味する。応答性ＲＮＡの翻訳のレベルは常法によって測定し得 る。一般に、低レベルの翻訳は、細胞によって合成されるポリペプチドの０゜１ ％未満が応答性ＲＮＡ分子によってコード化されるポリペプチドである。

好ましい態様においては、基質領域はエキソンもしくはリーダー領域、またはこ の２つの連結部のオーバーラツプ部分（リポソーム認識配列および開始コドンを 含有する）の一部であるか、または自己スプライシング反応に必要な領域を含有 する。

真核生物の細胞においては、真核生物のリポソームの４ＯＳサブユニツトが、ｍ ＲＮＡのキャップ構造の５゛−末端に結合し、最初の開始コドンをさがしてメツ セージを「走査（ｓｃａｎｎｉｎｊ）Ｊする（一般的な事項はコザックのジエイ ・セル・除くほかは皆、無傷でありスキャンされる（コザック、ブロック・ナチ ュール・アカド・サイ・ニーニスニー、旦３　：　２８５０．１９８６）。従っ て、４０Ｓサブユニツトの翻訳開始部位を探すスキャニングを抑制するためには 、インヒビター領域と基質領域（リポソーム認識配列および／または開始コドン を有する）のハイブリッドは強くなくてはならず、塩基対生成領域の生成自由エ ネルギーは一５０ｋｃａｌ／ｍｏｌまたはそれ以下でなくてはならない。従って 、インヒビター領域はリポソーム認識部位の下流（３゛側）（エキソン内または 多分メツセージの３°末端により近い）箇所に位置して、インヒビター領域と抗 インヒビターングナルＲＮＡの間の相互作用（同じ低い形成フリーエネルギーを 有してもよい）が４ＯＳリポソームのサブユニットのイニンエーション部位への 移動を妨げることはないようにするのが好ましい（図ＩＦ、ＩＧおよびＩＨ参照 ）。従って、植物の真核系においては蛋白質コード領域を分断する自己スプライ ジングイシトロンを有するものが好ましい。

ここで「イントロン」の語はエキソンから分離された応答性ＲＮＡ分子のドメイ ンである。イントロンは好ましくはＲＮＡの分断および接続活性を含む触媒的活 性を有するＲＮＡ分子である。イントロンは、自己スプライスが可能であり、き 、グループ■またはグループＩＩイントロンから選択されることが好ましい。

より好ましい態様においては、応答性ＲＮＡ分子を精製し、この応答性ＲＮＡが 細胞の生存性、細胞増殖、ＤＮＡの転写、ＲＮＡの翻訳またはＤＮＡの複製を変 化させるポリペプチドをコード化する（例えば応答性ＲＮＡ分子はジフテリア毒 素活性またはりボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコード化する）「精 製したＲＮＡＪとは、ＲＮＡが天然において存在する環境の下に存在する１また は複数の成分から単離したＲＮＡをいう。例えば、異種遺伝子を遺伝子組換植物 内へ発現させる場合には、細胞内に存在させるＲ、ＮＡは天然の発生したもので はない。好ましくは、核酸のホモジナイズ溶液として提供される。

他の好ましい態様において、基質領域にはイントロンの５゛−スプライス接合部 を含有する：イントロンはエキソンの翻訳レベルをイントロンが無い場合の翻訳 レベルに比して減少させる。イントロンはリポソーム認識配列とほとんどのエキ ソンの５°　との間、または２つのエキソンの間に位置する。より好ましくはイ ントロンはその５°末端において、５゛スプライス接部とオーバーラツプしてお り、その３゛末端が３°スプライス接合部とオーバーラツプしており；イントロ ンは１つは５°スプライス接合部、もう一つは３°　スプライス接合部内に生じ る２つの切断反応を触媒する。イントロンは自己スプライシングイントロンであ る：基質領域に５°スプライス接合部を含有する。およびインヒビター領域が５ °スプライス接合部内の切断反応を妨害する。

「５゛　スプライス接合部」は、あるイントロンの５′末端にオーバーラツプし ているかまたは隣接している配列であってスプライシング反応に必要であるもの を意味する。「３°スプライス接合部」は、スプライシング反応に必要なイント ロンの３°末端の配列をいう。かかるスプライス接合部は、テトラヒメナ・サー モフィラの介在配列の境界となっているごとき自己スプライシングイントロンの 末端とオーバーラツプしている。

「自己スプライシングイントロン」は、スプライス接合部に隣接することが必要 な配列を除いて、より大きなＲＮＡ断片よりそれ自身を切除し、そしてこの切除 反応の前にはイントロンと隣接していた２つのＲＮＡ断片をつなげるイントロン に必要とされるすべての配列を含有するＲＮＡ断片をいう。

さらにより好ましい態様としては、シグナル核酸は一本鎖の、例えばウィルスＲ ＮＡである。

応答性ＲＮＡの例としては改変テトラヒメナＲＮＡを含み、これは例えば５゜ス プライス部位に対して−１４，−１９、−２１、−２２、−２３および／または 一２４位のヌクレオチドが変わっている。

本発明に関連して、シグナル核酸を隠している細胞の増殖を、上述のごとき応答 性ＲＮＡ分子をその細胞内へ導入することによって抑制する方法を提供する。

他の関連する観点において、本発明は上述の応答性ＲＮＡ分子をコード化するＤ ＮＡ分子を提供する。

本発明は特異的ＲＮＡ配列の存在に依存するＲＮＡ自己スプライシングを伴う過 敏反応の人工的応用に関する。リボザイムは唯一のウィルス配列とハイブリッド を形成した場合にのみ自己プロセシングが生じるようにデザインされており、こ れによって毒性ペプチドの翻訳が植物が特定のウィルスに感染するまではブロッ クされているという高度に選択性のあるスイッチを提供する。かかるＲＮＡをコ ード化するトランスジェニック植物は、外来のまたは致死蛋白質が、ウィルス感 染と戦うのに必要となるまでは産生し、ない。毒性ポリペプチドが産生されてい る場合ですら、その産生は特定のウィルスに感染している細胞にのみ限定され、 感染細胞の死によりその毒性蛋白質の産生が終了する。このようなＲＮＡプロセ シング技術を適応することにより植物の天然の防御機構を有意に上昇させるが、 高レベルの外来蛋白質は産生しない。毒素をコードする低いレベルの自己スプラ イシングＲＮＡのみが必要とされ、結果として植物の抗ウイルス反応を生じさせ るのに必要とされる植物資源が少ない。

本発明によりウィルス抵抗性のトランスジェニック植物を作成することができ、 これによって収穫のダメージを減少し得、高い収穫率を得ることができる。本発 明は、ウィルスの遺伝子配列が既知であるか解読されており、感染された植物が 形質転換し得る全ての植物ウィルス系に適用することができる。

本発明の他の点および有用性を、以下の好ましい態様および請求の範囲の記載に よりさらに明らかにする。

好ましい態様の記載 図面に関しまず簡単に説明する。

図面の簡単な説明 図１．　ＩＡおよびＩＢは応答性ＲＮＡ分子の模式図である。細い線はリーダー 領域、および太い線は蛋白質コード領域を表し、一連の短い垂線は塩基対ドメイ ンを、およびこれらのラインの上および下のボックスはＲＮＡの種々の特徴を示 す。特に図ＩＡにおいて応答性ＲＮＡは翻訳を妨害する分子内塩基対を表現する ように描かれており：　図ＩＢにおいて応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸とハイ ブリッド化されたごとく描かれている。

図ＩＣはこの種の応答性ＲＮＡ分子の第２の変形を示している。図ＩＤにおいて 応答性ＲＮＡ分子は翻訳を妨害する分子内塩基対を描いている。図ＩＥでは応答 性ＲＮＡ分子をシグナル核酸に対してハイブリッド化している。

図ＩＦは応答性ＲＮＡ分子の第３の変形を描いている。図ＩＧにおいてこの応答 性ＲＮＡ分子は翻訳を妨害する分子内塩基対を示している。図ＩＨにおいては応 答性ＲＮＡ分子をシグナル核酸に対しハイブリッド化している。

図２．２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは自己スプライング・イントロンを含む応答性Ｒ ＮＡ分子の模式図である。細い線はリーダー領域、破線は自己スプライング・イ ントロン、太い線、はエキソン、一連の短い垂線は塩基対ドメインおよびこれら の線の上および下のボックスはＲＮＡの種々の特徴を表す。特に図２Ａは応答性 ＲＮＡ分子を自己スプライングを妨害する分子内塩基対を表すように描いである 。

図２Ｂにおいて応答性ＲＮＡ分子はシグナル核酸にハイブリッド化されているよ うに表されている。図２０は自己スプライシグ反応によって製造されたスプライ ス化された分子を表す。

図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆおよび２Ｇは図２−２０に示した応答性ＲＮＡ分子の変形を 示す。図２Ｄでは自己スプライジグ・イントロンが応答性ＲＮＡ分子中のポリペ プチド・コード化配列を分離している。図２Ｅでは応答性ＲＮＡ分子を、自己ス プライングを妨害する分子内塩基対を表すように描いである。図２Ｆでは応答性 ＲＮＡ分子をシグナル核酸にハイブリッド化している。図２Ｇでは自己スプライ ジグ反応によって製造したスプライス化分子を表している。

図３はテトラヒメラ・サーモフィラの５′−エキフン・インターペニング配列（ ＩＶＳ）結合におけるまたはそのすぐ上流のＰ（１）およびＰ（−１）ステム− ループ構造を表す。このＩＶＳ（上方のケース）は、５°−エキフン（下方のケ ース）の端部でハイブリッド化してＰ（１）ステム−ループ、自己スプライジグ のための５゜−スプライス部位（黒塗三角で示す）において必要とされる配座を 形成することのできる内部ガイド配列を含む。別の構造Ｐ（−１）、これは自己 スプライジグを支持していない、はＰ（１）ステム部分（肉太活字）と上流の５ °−エキフン配列（上線）との間のハイブリッド化によって形成される。頂部に 示された配列は親プラスミドｐＴＥＴＢＬＵからのＲＮＡに対するそれである。

より低い三つのＲＮＡ構造は５゛−エキフンでの配列変化（陰影をつけた）によ って作られた３種の突然変位プラスミドからの修飾されたＰ（−１）ステム−ル ープを表す。これらの構造のそれぞれに対して計算した３７℃での自由エネルギ ーを示している。

図４は鋳型として親プラスミド（ｐＴ　Ｅ　Ｔ　Ｂ　Ｌ　Ｕ）と３種のスプライ シング突然変位種（ｐＴＥＰ１４．ｐＴＥＴ１４１９．ｐＴＥＴ２１−２４）を 用いて［α３２Ｐ］ＣＴＰの存在下に実施したイン・ビトロ転写反応の結果を芥 子ポリアクリルアミド・ゲルの写真のコピーである。３種のレーンのセットはそ れぞれスプライシング状態に変化する前（０）と後（１５または６０分）の転写 生成物を表す。使用される鋳型をレーンの各セットの上に示しており、鋳型を直 線化する為に使用される制限酵素を頂部に示しである。この、および以下の２つ の図面、ＦＬは前駆体ＲＮＡの全長およびＬＥはりゲイテッド・エキフンを示す 。直線状のＩＶＳ　ＲＮＡ（Ｌ−ＩＶＳ）、！＝環状（７）ＩＶＳ　ＲＮＡ（Ｃ −ＩＶＳ）の位置はまた、１５または１９ｎｔが環化反応（それぞれＬ−１５お よびＬ−１９）によって５゛−エンドから除かれたＬ−ＩＶＳの短縮形態として 示されている。星印は３′−スプライス部位の加水分解生成物（即ち、５°−エ キソンーＩＶＳフラグメント）であると考えられるＲＮＡを示している。未確認 小ＲＮＡ生成物はまた（〈）で示されている。

図５はゲル精製ｐＴＥＴ１４１９　ＲＮＡを１５から６０分間、２種類のシグナ ルＲＮＡ（４Ｓまたは４Ｓ３）のいずれかをその不存在下（０）または所定濃度 で、スプライソング条件下でインキュベートした実験結果を示すポリアクリルア ミド・ゲルの写真のコピーである。得られた精製物を４％変性ポリアクリルアミ ド・ゲル上で分析し、その結果を図５に示す。

図６はゲル精製ｐＴＥＴＢＬＵ　ＲＮＡまたはｐＴＥＴ２１−２４　ＲＮＡ（１ ０ｎＭ）を４または３７℃のスプライシング・バッファー中でインキュベートし た実験結果を示すポリアクリルアミド・ゲルの写真のコピーである。これはＭｇ トを５部Ｍまで添加しスプライシング反応を開始した事を示している。ｐＴＥＴ ２１−２４に対シテスプライシングはｐＴＥＴ２１−２４配列（８ｓ゛４または １２ｓ）に対して特異的な２種類のシグナルＲＮＡのいずれがの存在または不存 在下に開始した。存在時のシグナルＲＮＡの濃度は１部Ｍである。得られた生成 物は４％変性ポリアクリルアミド・ゲル上で分析し、図４におけるごとくラベル した。複写に使用した鋳型は頂部において示したごと（旦ｃｏＲＩまたは旦ａｍ ＨＩのいずれかで直線化されている。シグナルＲＮＡ存在下でのスプライシング 条件でＥｃｏＲ■−ランオフ前駆体をインキュベートしたときに見られる別の生 成物を点で示す。

シグナルＲＮＡ不存在下でのスプライシング条件下でｐＴＥＴ２１−２４をイン キュベートしたとき見られる短いＲＮＡ生成物（＜）を矢印で示す。これと同じ ＲＮＡ生成物を図４に示した。

トランスジェニック植物 ＲＮＡ中のターゲット配列がＲＮＡシグナル配列に対して対となる塩基であると き自己スプライジグ反応を受ける応答性ＲＮＡ分子、例えばリボザイムを開発ト ロン配列の放出を引き起こすシグナル配列を可能にする。ＲＮＡスプライシング を引き起こすシグナル配列はこうして毒素ポリペプチドを選択的に発現するため に使用できる。この種のＲＮＡまたは１キラー・リボザイム”は特定の植物細胞 の選択的死滅に有用である。このようなりボザイムは所望のりボザイムをコード 化するＤＮＡとして標準ベクターに乗せて植物中に導入することができる。

”キラー・リボザイム”は植物中に人工的な超感受性応答を発生する機会を提供 する。”キラー・リボザイム”はウィルス中のシグナル配列を転写するかまたは ウィルスＲＮＡゲノムが植物細胞に対して毒性であるイー・コリ・ポリペプチド の細胞内生産を刺激するごとき方法で構成される。これはウィルスに感染した細 胞を殺すことによってトランスジェニック植物中に超感受性応答を創造する。超 感受性応答がウィルス感染によって引き起こされると、壊死損傷が形成されるか 、あるいは応答が極端に能率的であるときは単一の感染細胞は隣接細胞への感染 が広がる前に死滅するであろう。

こうして、ウィルス感染の結果として超感受性応答に似たトランスジェニック植 物を生産することができる。その結果植物中でのウィルスのまん延および複写が 阻害され、ウィルス抵抗性の植物を生産することができる。

このようなりボザイムを設計するために、異なったシグナル配列、リボザイムの 非シグナル誘導スプライソングおよび適当なポリペプチドの毒性を、例えばタバ コのプロトプラスト・システム中でアッセイすることができる。プロトプラスト はリポザ、イｔ、・フンストラクトを含む発現ベクターとウィルス粒子の両方を 取り上げるために誘導しつる。毒性のペプチド配列の代わりに、発現時に、シグ ナル配列（ウィルス・ジェノミックＲＮＡ）がリポザイムのスプライシングを誘 導した後に翻訳されるであろう指示遺伝子でリボザイムを構成してもよい。これ は、異なったシグナル配列を容易に試験し、かつ非シグナル誘導スプライソング を生じる程度を測定する能力を提供するであろう。

プロトプラスト・アッセイから引き出される情報はシグナル配列および似非シグ ナル誘導スプライシングに適合する”キラー・リボザイム”を開発するために使 用できる。この情報を利用して、人工的な超感受性応答を有するＴＭＶ感染に応 答する構成をトランスジェニック・タバコ植物の生産のために開発できる。

応答性ＲＮＡ分子 一般に応答性ＲＮＡ分子は上記のごとくである。以下に特異的な例を挙げて当業 者にこれらの分子について説明する。これらの例は本発明を限定するものではな い。

書旗男　１・　イントロンのない応答性ＲＮＡ分子応答性ＲＮＡ分子の第１の型 は、図１に示したものである。この分子の１部分である蛋白質コード領域は、シ グナル核酸が存在する時のみ生産されて欲しいポリペプチドをコードしている。

この分子の別の部分である調節ドメインは、インヒビター領域を含んでおり、蛋 白質コード領域内の基質領域と塩基配列の上で相補的である。インヒビター領域 は基質領域と塩基対を形成して、蛋白質コード領域の翻訳を阻止する様な塩基対 ドメインを作る事ができる。基質領域はリーダー領域である蛋白質コード領域の １部であるが、両者間の接続部を重複しているがである。

図１に示す如く応答性ＲＮＡ分子１０は、５°末端１２と３゛末端１４を持って いる。５°末端１？に隣接してリーダー領域２６と調節ドメイン１６があり、蛋 白質コード領域１８が３゛末端１４に隣接している。調節ドメイン１６の内部に インヒビター領域２０があり、蛋白質コード領域１８の内部に基質領域２２が存 在している。蛋白質コード領域１８の５°末　端部分にリボゾーム認識配列２１ と開始コドン２３がある。

図ＩＡに示す如く、インヒビター領域２ｏは基質領域２２とハイブリッド形成し ていて、塩基対ドメイン２８を作っている。応答性ＲＮＡ分子１ｏの内部にある この塩基対は、蛋白質コーディング領域の翻訳を阻害する。翻訳の阻害はシグナ ル核酸の存在により軽減されるが、抗インヒビターと呼ばれる領域は応答性ＲＮ Ａのインヒビター領域と相補的である。

このシグナル核酸の抗インヒビター領域は、応答性ＲＮＡ分子のインヒビター領 域との塩基対形成を応答性ＲＮＡ分子の基質領域と争うことになる。この様な環 境下では、基質領域との塩基対形成は起らないし翻訳もされないので目的ペプチ ドは作られない。

例えばＩＫＩＢの如（シグナル核酸３ｏは、３゛末端３２と５゛末端３４とがら で構成されておりまた抗インヒビター領域３６は応答性ＲＮＡ分子１ｏのインヒ ビター領域２０と配列上相補的である。インヒビター領域２ｏと抗インヒビター 領域３６のハイブリッドは塩基対ドメイン３８を形成して、インヒビター領域２ ０と基質領域２２とのハイブリッド形成を阻止している。この条件下では蛋白コ ーディング領域１８の翻訳は行われる。

この型の応答性ＲＮＡ分子変形体（ｖｒｉａｔｉｏｎ）では、基質領域は蛋白コ ーディング領域内には包含されず蛋白コーディング領域の上流にあるリーダー領 域へと伸びている。特別な例では、図ＩＣに描かれている応答性ＲＮＡ分子は基 質領域２２を持っており、この２２はリボゾーム認識配列２１と開始コドン２３ を包含している。図ＩＤの如く、基質領域２２はインヒビター領域２０と塩基対 を作っており、その結果分子内塩基対領域２８が形成される。原核生物ではこの 配置は、リボゾーム結合部位と開始部位との相互作用がらりポゾームを物理的に 封鎖する事になり、翻訳は阻害される事になる。図ＩＥではシグナル核酸３０の 抗インヒビター領域３６は、インヒビター領域２０とハイブリツドされて塩基対 領域３８が形成される。この配置では原核生物のりボゾームは翻訳を開始して目 的ポリペプチドが合成される。

この型の今一つの変形体では、インヒビター領域は基質領域の下流に位置してい る。このインヒビター領域は図の如く蛋白コーディング領域自身の内部か、また は蛋白コーディング領域の３°領域内に位置する事が出来る。図ＩＦでは、応答 性ＲＮＡ分子はりポゾーム認識配列２１と開始コドン２３を含む基質領域２２を 有するように画かれてあり、また基質領域の３゛側に位置しているインヒビター 領域２０を持っている。図ＩＧにす如く、インヒビター領域２０は基質領域２２ と塩基対を作り、その結果分子内塩基対領域２８が形成される。この配置では走 査中（ｓｃａｎｎｉｎｇ）の真核生物リボゾームサブユニットが、もし塩基対の 相互作は結合したりする事は、不可能になってしまう。図ＩＨでは、シグナル核 酸３０の抗インヒビター領域３６はインヒビター領域２０とハイブリッドし、塩 基対領域３８を形成している。真核生物のりポゾームは、例え他の上流に開始コ ドンが存在していない場合でも、本来の開始コドンを走査して翻訳を開始する事 が出来る。翻訳中のりボゾームにより塩基対領域３８の破壊を伴ってポリペプチ ドの翻訳が行なわれる。

応答性ＲＮＡのインヒビター領域は、応答性ＲＮＡの基質領域と標的核酸の抗イ ンヒビター領域の両者に対して相補的でなければならないので、これ等の３領域 の配列は応答性ＲＮＡの翻訳を正しく調節できる様に０択されなければならない 。この事は基質領域の配列が、抗インヒビター領域の配列と同一でなければなら ない事を意味するものではない。形成可能な二つの塩基対ドメインが、完全な塩 基対を作る事（即ち、ドメイン上で隣接しているすべての塩基が塩基対を形成す る事）の必要はなく、また上記ドメインが同じ長さの塩基鎖である必要もない。

翻訳の必要性が生じた時には特異的に提示し得る限り、抗インヒビター領域の０ 択には柔軟性がある。例えば、もし応答性ＲＮＡが反応するシグナルがＴＭＶゲ ノムに存在しているか細胞の中へ転写されたとしても、ＴＭＶのいかなる特異的 核酸配列をも０択され得る。なおＴＭＶに存在する核酸配列を０択する時には勿 論制限がかかる。基質領域の配列は、応答性ＲＮＡ分子が生成される様に選ばれ ているので、生物活性のあるポリペプチドが作られる。基質領域は蛋白コーディ ング領域部分を含む事ができるので、その配列を修飾する時にはコードされてい るポリペプチドの活性量が十分保持される様に行なわねばならない。遺伝暗号の 退化は、コードされているポリペプチドの配列に影響を与えない範囲で、蛋白コ ーディング領域の配列内の変更を許している。グアノ７ンはントシンと同様にウ リジンと塩基対を作る事が出来るので、使用可能な配列に柔軟性が付加される事 になる。その上、蛋白質の１ケ所或いはそれ以上の所での保存（ｃｏｎｓｅｒｖ ａｔｉｖｅ）アミノ酸の変更は蛋白質の活性を消失する事は殆んどないので、使 用可能な配列の数は実質的に増大する事になる。

インヒビター領域と基質領域との間に架かるハイブリッドにより形成される塩基 対は、シグナル核酸以外の細胞内に存在する核酸によって破壊されない様に十分 安定でなければならない。例えば、もしもインヒビター領域と基質領域とが、わ ずか４つの連続塩基が相補性であるだけであるならば、その４塩基配列を含む一 本鎖核酸はインヒビター領域とのハイブリッド形成を基質領域と競合する事にな る。もしもこの配列を含む核酸が十二分に高濃度である時は翻訳の阻害は解除さ れる。一般的には、基質領域とインヒビター領域とのハイブリッド形成により出 来る塩基対ドメインは、その分子がシグナル核酸のみに応答する様にする為所な くとも１２、出来れば１５塩基を連続して含んでいなければならない。

応答性ＲＮＡ分子は、インヒビター領域との７−イブリッドが極めて容易に形成 されるシグナル核酸を持つ領域を含む事が出来る。この付加された領域はヌクリ エイノヨン（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）領域と呼ばれているが、インヒビター領域 に直接隣接する多数のヌクレオチドから成っており、シグナル核酸の配列と相補 的であるため、ヌクリエイン３ン領域とインヒビター領域がどちらもシグナル核 酸と長鎖範囲に亘って相補性のある領域を形成している。ヌクリエイション領域 には、シグナル核酸と容易にハイブリッド形成され得る一本鎖領域がある。抗イ ンヒビター領域がインヒビター領域と正しくハイブリッド形成される位置にくる 様にしてやると、この領域上にある塩基対はインヒビター領域から基質領域の置 換を促進する傾向ができる。しかも、この様なヌクリエイション（ｎｕｃｌｅａ ｔｉｏｎ）領域は　シグナル核酸と形成する塩基対領域の安定性を増加する。

調節ドメインはまた、非特異的な核酸、即ち／グナル核酸以外の核酸が、インヒ ビタードメインに直接隣接する領域とハイブリッドを形成するのを好まない領域 を包含していても構わない。この領域は、逆位反復配列として知られているが、 ヘアピン構造を形成する様に折り畳む事が出来る。

インヒビター領域、基質領域および抗インヒビター領域の詳細な性質は一部分、 翻訳が調節されている範囲に依存する。インヒビター領域が基質領域と／１イブ リッド形成する事により出来る分子内塩基対ドメインが、より安定になればなる 程、翻訳は益々阻害される事になる。ヌクレオチドの隣接する領域内で実際に塩 基対を形成しているヌクレオチドの数と、一般的な塩基対ドメイン内のミスマツ チの数および塩基対ドメインのヌクレオチドの組成によって、ＲＮＡ−ＲＮＡ二 本鎖（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）の塩基対ドメインの安定性が決まる。分子間の塩基対 形成は、塩基対を作っている両領域間の距離によって決まる。例えば、面領域の 間にヌクレオチド数が少な過ぎると、ねじれ型の拘束が塩基対形成を妨害する事 になる。塩基対ドメインを多少とも安定なものにする為に、これらのパラメータ ーをどの様な方法で調節すべきかは、周知の通りである。ある一定のシグナル核 酸のレベルに依存して希望する翻訳の範囲に従って、分子間塩基対ドメインの安 定性を調節する事力咄来る。翻訳の程度は、インヒビター領域と基質領域とがハ イブリッドしている応答性ＲＮＡ分子の割合に依存している。シグナル核酸が存 在する時の上記の割合は、インヒビター領域がシグナル核酸の抗インヒビター領 域とハイブリッドしている応答性ＲＮＡ分子の割合に依存する。これ等の技法は 、ある細胞の中に存在するシグナル核酸と応答性ＲＮＡの量と同様に、形成され る夫々の二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）の量はこの二つの二重鎖の相対的な安定性に依 存していると言う事を評価するだろう。もしも毒性の強い分子が応答性ＲＮＡに よりコードされる場合は、高度な調節が要求される。例えば、もしもコレラ毒素 の活性サブユニットがコードされても、細胞を殺してしまうにはご（僅かの分子 さえあれば良いのである。

この様な場合では、翻訳はソゲナル核酸が無い場合には完全に阻害されるに違い ない。この事は、基質とインヒビター領域が殆んど完全に相補的になる様に、例 えば２０ヌクレオチド領域での相補性は８５％になる様にすれば保証される。。

発現は相補性の程度が高いシグナルＲＮＡが存在する時にのみ起るのである。例 えば、相補性の領域が２５ヌクレオチド以上あれば、インヒビター領域とは１０ ０％相補的になる。

インヒビター領域は蛋白コーディング領域の５°または３°側の上か、或いは蛋 白コーディング領域自身内に存在していれば良い。もしも、応答性ＲＮＡ分子が エキソヌクレアーゼにより分解され易い時には分子を設計する時点で十分にこの 事を考慮する必要がある。もしも、３′末端から分解が起る場合はインヒビター 領域を欠いている以外翻訳に必要な配列をすべて含んでいる分子が出来るのを避 ける為に、インヒビター領域を分子の５°末端へ持ってくる様にするのが最適第 ２型の応答性ＲＮ＾分子は、目的のポリペプチドの合成を妨げる自己スプライン ングイントロンを持っている。イントロンは、スプライソング反応によって取り 除かれ、切り出された分子は、目的のポリペプチド合成のための鋳型として機能 する。この型の調節が機能するために、応答性ＲＮ八へ子は、シグナル核酸配列 の無い場合に、スプライシングを保護する分子内塩基対領域を形成するような構 造を取っている。シグナル核酸配列存在下では、代替の分子内塩基対ドメインが 形成され、スプライシングが起こる。

この第２型応答性分子の例が図２に示されている。この分子は、リポソーム認識 配列と目的のポリペプチドをコードする翻訳領域の開始コドンとの間にイントロ ンが存在する。このイントロンが、リポソーム認識配列を開始コドンからかなり 遠ざけているために、翻訳を妨げている。この例で用いているイントロンは、テ トラヒメナの前駆体ｒＲＮＡ由来の自己スプライ７ングイントロンである。この 型のイントロンは、イントロンの両側で１回ずつの２回の切断反応、およびイン トロンの両側のＲＮＡ分子の端を結合する結合反応を行う構造を取りうる。その ようなイントロンの自己スプライシング反応における必須段階は、５°−スプラ イス接合部と呼ばれるイントロン上の部位と内部ガイド配列と呼ばれるイントロ ン上の第２の領域とのハイブリダイゼーションである。この桑うに、ひとつの方 法として、イントロンの自己スプライシング活性を５°−スプライス接合部と内 部ガイド配列とのハイブリダイゼーションを妨げることによって調節することが できる。図２に示した応答性　ＲＮＡ分子は、イントロンや蛋白質コード領域と は異なる調節ドメインを持っている。この調節領域は、この分子中の自己スプラ イシングイントロンの５°−スプライス接合部を含む基質領域に対して相補的な インヒビター領域を持っている。インヒビター領域と基質領域との間の分子内塩 基対形成が、内部ガイド配列に対する５°−スプライス接合部のハイプリダーゼ −ジョンを妨げ、スプライシングが阻害される。この応答性ＲＮＡ分子は、阻害 領域がシグナル核酸配列の抗インヒビター領域に対しても相補的になるようにデ ザインされている。このように、シグナル核酸の存在下で、インヒビター領域が 抗インヒビター領域に対してハイブリダイズし、自己スプライシング反応に関与 する５°一スプライス接合部が自由になる。

図２のとおり、応答性ＲＮＡ分子４０は、５゛末端４２．３゛末端４４を持つ。

５゜末端４２に隣接して、自己スプライシングイントロン４８に隣接したリーダ ー領域４９が存在し、さらにポリペプチドをコードするエキフン５０がある。調 節領域４６は、リーダー領域４９の中に位置する。自己スプライシングイントロ ン４８は、このように、調節領域４６とエキフン　５０の間にあり、その５゛末 端がリポソーム認識配列５６．３°末端がへ〇Ｇコドン６６となっている。調節 領域４６の中に存在するインヒビター領域５２は、リーダー領域　４９と自己ス プライシングイントロン４８の間の接合部にある基質領域５４に対して相補的で ある。インヒビター領域の３゛末側の調節領域内が、ヌクリエインヨン領域４５ で、インヒビター領域５２に隣接しており、抗インヒビター拡張と呼ばれている 抗インヒビター領域に速やかに近接するシグナル核酸の領域に対して相補的な構 造をとっている。調節領域は、インヒビター領域の５°末側に逆向き繰り返し配 列　４７も含んでいてもよい。基質領域５４は、リポソーム認識配列５６．５− スプライス接合部　５８、安定化領域６０を含んでいる。自己スプライシングイ ントロン４８の端は、それぞれ５′−スプライス接合部５８と、ＡＵＧコドン６ ６に隣接した３゛−スプライス接合部６４であり、内部ガイド配列６２を含んで いる。

図２Ａに示すように、インヒビター領域５２が、基質領域５４とハイブリダイズ すると、５゛　スプライス接合部５８が内部ガイド配列６２と相互作用すること を妨げる塩基対領域７０が形成される。逆位反復配列は折り畳まれて安定なヘア ピン６３が形成される。

シグナル核酸配列の存在下で、抗インヒビター領域、およびシグナル核酸配列の 抗インヒビター拡張領域と応答性ＲＮＡ分子のヌクリエイション領域との間に分 子間塩基対領域が形成される。この相互作用のために、５′−スプライス接合部 ５８が自由になり、内部ガイド配列６２と相互作用できるようになる。このよう な環境下で、自己スプライソング反応が起こる。図２Ｂに示すように、３°末端 ７２と５°末端７３を持つシグナル核酸配列７１は、塩基対領域７５を形成する インヒビター領域５２、およびヌクリエイション領域４５とハイブリダイズする 抗インヒビター領域７４と抗インヒビター拡張領域７７を含んでいる。

自己スプライシング反応は、自己スプライシングイントロンのすべてを取り除（ 。切り出された分子は、エキフン５０にコードされたポリペプチドを合成できる ようになる。なぜならば、リポソーム認識配列が、ポリペプチドをコードしてい るエキフンの開始コドンに対して近接した位置となり、その開始コドンがポリペ プチドの第１コドンとして利用できるようになるからである。

図２０に示すように、切り出された分子９０は、５゛末端４２．３°末端４４、 リーダー領域４９、エキフン５０、リポソーム認識配列５６、開始コドン６６、 そして５゛スプライス接部の一部分と３゛スプライス接部６４の一部分を含む融 合スプライス接合部９５を含んでいる。

どのイントロンも自己スプライシング活性を持つことが知られており、応答性Ｒ ＮＡ分子としての使用に適合しうる。適応する自己スプライシングｌ？Ｎ＾とじ ては、テトラヒメナの前駆体リポソームＲＮ＾、サツカロミセスとノイロスポラ のミトコンドリア前駆体ｒＲＮＡ、アグロバクテリウムとアゾアルカスのイント ロン、サツカロミセスのミドフンドリア前駆体＋ｍＲＮ＾、あるいは、他の同等 のグループ■自己スプライシングＲＮ＾である。グループＩＩイントロンもまた 、少なくともＲＮ＾切断活性を持つＲＮＡであれば、本発明に使用可能である。

ＲＮ＾結合活性は他のＲＮＡ分子、または、これらと同等のものによって供給す ることができる。

ひとたび自己スプライシングＲＮ＾が選択されれば、リポソーム認識配列とコー ドされているポリペプチドの開始コドンの間が正しい位置関係となる。即ち、リ ポソーム認識配列が開始コドンに対して正しい位置になるように、自己スブラ従 って、応答性ＲＮＡ分子は、スプライシングが起こった後にのみ、この配列が現 れるようにデザインしなければならない。さらに、本来のＡＵＧ配列の前後に存 在するＡＵＧや他のコドンが、イントロンの中でも認識され得るし、最も５゛側 の翻訳開始部位として使われ得る。下流部位での翻訳開始の上で、このような上 流ＡＵＧの阻害効果は、自己スプライシングによるイントロンの除去によっての み抑えることが可能であり、走査中のリポソーム複合体が下流の翻訳開始部位に 到達することをなくし、毒性タンパク質の翻訳が起こるようなことを防いでいる 。

この型の応答性ＲＮＡ分子の一種として、自己スプライノンゲイントロンがポリ ペプチドコーディング配列を分断して存在するものもある。図２Ｄに示すように 、この分子では、目的ポリペプチドを一緒にコードする２つのエキフンの間にイ ントロンが位置している。もし、イントロンが終止コドンを含んでいれば、翻訳 が妨げられる。イントロンが終止コドンを持っていなくても、イントロンの翻訳 は下流のエキフンに対して読み枠がずれ、ポリペプチドに活性を失わせるような アミノ酸を付加することになる。イントロンの除去は、２つのエキフンを融合し 、要求される活性を持つポリペプチドに翻訳可能な（塩基）配列を形成する。

図２Ｄに示すように、応答性ＲＮＡ分子４０は、５゛末端４２．３°末端４４を 持つ。ポリペプチドは、自己スプライシングイントロン４８によつて分けられた 、２つの領域５０と５１にコードされている。イントロン４８の端は、５°−ス プライス接合部５８と３′−スプライス接合部６４からなり、内部ガイド配列６ ２を含んでいる。蛋白質コーディング領域　５０の前部にリポソーム認識配列５ ６と翻訳開始コドン６６が存在する。インヒビター領域５２は、エキフン５０の 内部にあり、領域５０の３′末端に存在して５゛スプライス接部５８と安定化領 域６０を含む基質領域５４に対して相補的である。その５′側のインヒビター領 域周辺は、インヒビター領域に隣接するヌクリエインヨン領域４５であり、抗イ ンヒビター頌域に対して速やかに近接するシグナル核酸配列における領域と相補 的である。

図２Ｅに示すように、インヒビター領域５２が基質領域５４とハイブリダイズす ると、塩基対領域７０が形成され、５°−スプライス接合部５８が内部ガイド配 列６２と相互作用できるようになる。

図２Ｆに示すように、３°末端７２と５°末端７３、および、抗インヒビター領 域７４と抗インヒビター拡張領域７７を持つシグナル核酸配列７１が、インヒビ ター領域５２とヌクリエインヨン領域４５に対してハイブリダイズする。分子間 塩基対ドメイン７５が形成される。これらの環境下で、５°−スプライス接合部 ５８は、内部ガイド配列６２と自由に相互作用し、自己スプライシングが起こる 。

図２Ｇに示すように、自己スプライシング反応は、５°−スプライス接合部と３ ゜−スプライス接合部６４の一部を含む融合スプライス接合部９５を残して、自 己スプライシングイントロンのすべてを除去する。

例えば別の手段として、基質領域とインヒビター領域の両方または片方がイント ロンの中に含まれるようなものは、これらの要素が完全に取り除かれるようなス プライ／フグを経て使用可能となる。蛋白質コーディング領域の中に基質領域、 あるいはインヒビター領域が残る場合、これらの配列は、目的タン、（り質の生 物学的な活性を保つように注意深く選ばれなければならない。遺伝的コードの退 化、即ち、グアノンンーウリジン塩基対の可能性や蛋白質の活性を消失しないよ うな保存アミノ酸変化は、すべて考えられる。さらに、多くの蛋白質が、本来の 活性に対して必須でない領域を含んでおり、これらの領域におけるアミノ酸変化 および／または付加は生物学的活性の際だった消失を招かないことが知られてい る。

そのような領域に基質ドメインおよび／またはインヒビタードメインを置くこと は、蛋白質コーディング配列に対する変化がより簡単に黙許され得るために、シ グナルＲＮ＾を含む抗インヒビター領域の選択を簡単にする。　阻害領域が、抗 インヒビター領域と基質領域の両方に対して相補的である必要性は、これらの領 域の配列において一定の束縛を持っている。上でも述べたように、まず、基質領 域は、シグナル核酸配列の抗インヒビター領域と同じ配列を持っていてはいけな い。抗インヒビター領域は選択可能であるが、可変的ではないために、抗インヒ ビター領域は、５−スプライス接合部の配列と同一の配列を含んでいなければな らない。テトラヒメナのｒＲＮ＾イントロンの最小５°−スプライス接合部の長 さは、わずかに４塩基である。

インヒビター領域が抗インヒビター領域と基質領域の両者と相補的になる為には これ等の領域の配列上に一定の拘束が必要である。先ず、上述した如く基質領域 はシグナル核酸の抗インヒビター領域と同一の配列を持つ必要はない。抗インヒ ビター領域は撰択されるが改変されないので、抗インヒビター領域は５′　スプ ライス接合部の配列と同一の配列を含んでいなければならない。テトラヒメナの ｒＲＮＡイントロン中の最小限の５゛接合部は、わずか４残基のヌクレオチドの 長さである。４ヌクレオチド配列は、１７６４の確率で生成するから活性の強い 抗インヒビター領域は５゛接合部の配列を含む事になる。内部ガイド領域の配列 が５゛接合部中の変化を適切に調節される様になっておれば、多くの違った４塩 基配列が５゛接合部として役立つ事は多分間違いないだろう（ツオー等、ネイチ ャー３２４巻、４３０ページ、１９８６年）。最小限の５゛接合部が内部ガイド 配列と塩基対を作るのに適している限り一つだけミスマツチしている様な複合体 は、活性を発揮出来るのである（ツオー等、バイオケミストリー２７巻、８９２ ４ページ、１９８８年）。

インヒビター領域と基質領域との間のハイブリッド形成により出来る塩基対ドメ インは、スプライス反応中に５゛接合部と内部ガイド配列との間に作られる塩基 対よりも、より安定でなければならない。この事は５゛接合部と内部ガイド配列 とのハイブリッド形成による塩基対ドメインよりも長いハイブリッドになる様に インヒビター領域と基質領域を撰択すれば完成する。インヒビター領域と基質領 域間の相同的配列を５゛接合部をはさんで拡張している安定化（ｓｔａｂｉｌｉ ｚｅｒ）領域を含む様に、基質領域が設計されている。リボゾーム認識配列と開 始コドンの間にある自己スプライシングイントロンの場合には、５゛接合部の丁 度３°側にこの安定化領域を位置づける事ができる。この様に配列すると安定化 ドメインがスプライス反応の役割から解放され、且つリボゾーム認識配列と開始 コドンの関係を妨害しない事が保証される。リボゾーム認識配列はまた、インヒ ビター領域と塩基対を作る領域内に包含できるが、これは必要条件ではない。自 己スプライシングイントロンが同じポリペプチド部分をコードしているエキフン の間に挿入されている時には、安定化領域はイントロン内部に位置している事が 望ましい。

即ち、５゛接合部の３°側で残りのイントロンと一緒に離脱されるからである。

インヒビター／基質間の塩基対ドメインがシグナル核酸によってのみ開裂されて 、細胞に存在する他の核酸では開裂されないと言う事は大事な問題である。上記 に考察した如く、第１型の応答性ＲＮＡ分子にとっては、独特の核酸によっての み開裂される様に分子間塩基対が広い範囲で形成されなければならない事を意味 するものである。この条件がシグナル核酸による分子間二重鎖の開裂を困難にす ることが出来る。上述の通りインヒビター領域に隣接してヌクリエイション領域 を包含する事は、インヒビター領域と抗インヒビター領域のハイブリッド形成を 促進する。自己スプライシングイントロンとエキフンの調節ドメインを数多く準 備する事は大切である。上述の如く、自己スプライシングイントロンは、二つの エキフンの間に位置する事ができる。即ちこの環境下ではスプライシングされて いない分子の５°側エキソンの大部分は翻訳されるが、機能が完全なポリペプチ ドは作られない。インヒビター領域は自己スプライシングイントロンの５゛また は３°側に位置づけるか、或いはイントロン自身の中に入れる事もできる。ＲＮ Ａは５゛から３′方向へ合成されるので、内部のガイド配列が生成される前にイ ンヒビターが合成されて５°スプライス接合部とハイブリッドする機会が出来る 様に５°側にインヒビター領域を位置づける事が望ましい。もしもインヒビター のＲＮＡが折畳まれてスプライシング複合体を形成する速度が、インヒビター領 域の合成速度に比して遅い時には、インヒビターは自己スプライシングイントロ ンの３°側に位置すけでも構わない。

自己スプライシング反応は特異的で且つ正確であるという事が大事である。何故 なら、もしもスプライシングが悪い個所で起る場合には、リボゾーム結合部位が 誤った位置づけになるからである。二つのエキフンの間に位置している自己スプ ライシングイントロンの場合は、誤ったスプライシングが起ってコードされてい る配列以外の融合ポリペプチドができるという結果になるかもしれない。内部ガ イド配列と５゛スプライス接部との距離が比較的短い自己スプライシングイント ロンは、より正確にスプライシング反応を触媒する傾向がある。別の５°スプラ イス接合部として認識する様な配列を作らない事が重要である。

上述の応答性ＲＮＡ分子は、標準的な方法で作る事が出来る。例えば、ＤＮＡ分 子をイン・ビポかイン・ビトロでの転写により、ＲＮＡを作る事ができる。一般 的にはＲＮＡ分子は、応答分子をコードする配列や応答性ＲＮＡ分子の調節され た転写にとって適切な配列、更にＤＮＡの複製にとって適切な配列を含んでいる プラスミドかウィルスＤＮＡを構築する事により作製される。ＲＮＡ分子を構築 する時の一般的に注意すべき点は、上述した通りである。実際的な見地からする と、ＲＮＡ分子が自己或いは他のＲＮＡ分子を切断する事が出来て、なお且つ好 ましくはこれら両方のＲＮＡ分子を一緒にスプライスする事が出来る様な酵素活 性を有している事を同定しておく方が良い。例としては自己スプライシングＲＮ Ａ分子がある。このＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは修飾されると、コードされ ている５°スプライス接合部と内部ガイド配列を上述の制限内で目的通りに変化 する結果、コードされている５゛スプライス接部は応答性ＲＮＡ分子のインヒビ ター領域と部分的に相補性ができる。転写されたＲＮＡ分子は次に調節ドメイン を含むＲＮＡと目的ポリペプチドをコードするＲＮＡとを連結させる。もし必要 なら、ヌクリエインヨン部位と逆向き繰り返しは調節ドメインの中に組こむ様に 設計できる。

゛後述の実施例３−７において考察される実験は、特異的なシグナルＲＮＡの存 在により再活性化される所の不活性なイントロンを含んでいる応答性ＲＮＡ分子 の製法を述べる。応答性ＲＮＡ分子は自己スプライシングイントロンか或いは、 テトラヒメナ・サーモフイリアのｒＲＮＡ中にある介在配列（ＩＶＳ）から調製 される。ＩＶＳが自己スプライスする為には、ＩＶＳＲＮＡのコア構造が正しく 折り畳まれる必要がある。この様にめられているコンホーメーンヨンの中には５ °スプライス部位を包含しているＰ（１）として知られている塩基対領域が含ま れる（図３）。Ｐ（１）ではＩＶＳの内部ガイド配列が５°エキソンに隣接して いる部分と塩基対を形成して、安定な幹ループ構造を作っている。５゛スプライ ス位はこの幹構造内にある。ＩＶＳＲＮＡの自己スプライス能力はＰ（１）幹が 形成される能かによって決まる。

５゛スプライス位のすぐ上流にある天然の配列はまた、５°スプライス部位に隣 接するエキフン配列とヘアピン構造を形成する事も出来る（図３）。スプライス 部位に隣接する５゛工キソン配列は両方の構造中に包含されているので、自己ス プライシングＰ（１）を必要とする幹ループとＰ（−１）と言う他の幹ループと が互いに排他的になっている。幹ループ構造Ｐ（−１）は、その幹領域を拡長す る事によって、より安定なものになる。ウソドフン、チェック、バイオケミスト リー３０巻、２０４２ページ（１９９１年）を参照すると、５゛エキソン中にた だ一つのヌクレオチドを変えた（５°　スプライス部位の−１４の位置でＡとＣ を交換）時の結果を報告している。この変異体では、自己スプライシングは減退 すると報告されている。逆にＰ（−１）の相対的な強さを減衰させるか或いは、 それを完全に消失させる様な５゛エキソンの中が変異しているＲＮＡは、自己ス プライシングの増加が認められている。他の構造のＰ（−１）を強化する事が期 待される５°エキソンの配列を変えた三つの変異体が作製された。これ等３種の 変異体では、イン・ビトロ自己スプライシングのレベル（連結されたエキランの 形成により判定する）は天然の５°工キラン配列が存在している親の組立てに比 して低下していた。５塩基対を付加してＰ（−１）の幹が長くなった変異体は、 イン・ビトロ自己スプライシング活性は検出されなかった。

この強力でスプライシングが起らない変異体でも、別の構造にある５°上流のエ キラン配列（インヒビター領域）に相補的なシグナルＲＮＡを付加する事で自己 スプライシング活性を回復出来る事を申請人は出張するものである。Ｐ（−１） 幹の５゛部分に結合する事により、これ等のシグナルＲＮＡはＰ（−１）を分裂 させるし、またＰ（１）を含む活性な自己スプライシングのコンホーメーンヨン では内部ガイド配列と十二分にハイブリッド形成し得る一本鎖型の５°スプライ ス部位に隣接する配列を残したままにする。

実施例３．プラスミドの構成およびＤＮＡの調製応答ＤＮＡ分子を調製するため に用いるＩＶＳ−含有フラグメントのソースはプラスミドｐＴＴＩＡ３Ｔ７　［ エイ・ザウグ博士（Ａ、Ｚａｕｇ）によって得られた。このようなプラスミド等 何物は容易に構成でき、このプラスミドは本発明を例示する目的でのみ使用され る］であり、そしてこれはＨｉｎｄｌｌｌリンカ−上のｐＴ７−２　（ユナイテ ッド・ステーブ・バイオケミカル・コーポレーション、クリーブランド、オハイ オ（Ｕ、　Ｓ、　Ｂｊｏｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒｒａｔｉｏｎ、　Ｃ１ ｅｖｅｌａｎｄ。

ランの３２ｎｔ、４１３ｎｔｌＶＳおよび３°エキソンの３７ｎｔに相当するｒ ＤＮＡ配列を含む。ｐＴＴＩＡ３Ｔ７の旦±ｎｄｌｌＩフラグメントを単離し、 これをｐＴＺ１９ＲＣユナイテノド・ステーブ・バイオケミカル・コーポレーシ ョン、クリーブランド、オハイオ〕の且工ｎｄ１１１部位に挿入して、ＴＶＳと 、ラックＺ°遺伝子の最初の数個のコドン、すなわちβ−ガラクト／ダーゼ遺伝 子のα−相補、に挿入した天然のｒＤＮＡ配列の小部分とを含むプラスミドを作 った。

イー・コリ中のβ−ガラクト／ダーゼ活性は、ＩＶＳ　ＲＮＡがそれ自身切り放 し、翻訳可能なｍＲＮＡ生成物を作るためにフレーム中にラックＺ°コード領域 を結合する能力に依存することは、以前に他のところ〔ビーン（Ｂｅｅｎ）およ びチェツバ（ＣｅＣｈ）著、セル（Ｃｅｌｌ）　、第４７巻、第２０７頁、１９ ８６年；プライス（Ｐｒｉｃｅ）およびチェツバ著、サイエンス、第２２８巻、 第７１９頁、１９８５年：ウエイリング他（Ｗａｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）著 、セル、第４０巻、第３７１頁、１９８５年〕で報告されている。イン・ビトロ で、相当するラックＺ’ＲＮＡが自己−スプライスし、正確な読み枠を維持する であろうクローンを作るために、ｒＤＮＡ挿入物を含むｐＴＺ１９Ｒ上で変異誘 発を行った。それに加えて、潜在的に有用な５ａ１１部位を３−エキラン中に作 り、３゛−エキラン中のイン−フレームＡｔＪＧを破壊し、それが確かに翻訳の 開始位置として用いられないようにした。最終的に得られたＤＮＡ配列およびベ クター配列中の３−スプライス部位かｐＴＥＴＢＬＵ ムＴ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＣＡＧＣＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＡＡＴＴ　 ＡＧＴ　ＧＡＣＧＣＡ　ＡＧＣＴＴそれからｐＴＥＴＢＬＵ　ＤＮＡを、一連の スプライシング変異体の親として使用し、その変化を、イン・ビトロで、別のＰ （−１）ステップ−ループ（ｓｔｅｐ−１ｏｏｐ）構造中の塩基対合能を改善す るために５−エキラン配列中で変異誘発して変化を行った。スプライスしたＲＮ Ａ生成物中の正確な読み枠を維持するためおよび翻訳開始コドンまたは終止コド ンの生成を避けるためにケアを行った。作られることが予想され、５°−エキラ ンおよびＲＮＡ代替構造中で作られた結果の配列変化を図３に示しである。

すべての部位特定変異をイン・ビトロでユナイテド・ステーブ・バイオケミカル ・コーポレーション社製のムタゲネンス・キット（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋ ｉｔ）を用いて生成した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドをホスホラミダイト・ケミ ストリー（ｐｈｏｓｈｏｒａｍｉｄｊｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてアプ ライド・パイオンステムズ−３９４・ＤＮＡ／ＲＮＡ／ンセサイザ−（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚ ｅｒ）上で作り、変異性オリゴヌクレオチドとして使用するのに先立ってオリゴ クリーン（商標・０ＬＴＧＯＣＬＥＡＮ”）カラム（ユナイテド・ステーブ・バ イオケミカル・コーポレーション社製）を用いて精製した。プラスミドはスティ ン（Ｓｔａｉｎ）　ＭＶ１１９０（イー・コリム（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）　３０６ ：：ＴＮＩＯム　（Ｉａｃ−ｐｒｏ）　ｔｈｉ−ｓｕｐＥ　（Ｆ’　ｐｒｏ　Ａ ＋Ｂ＋　１ａｃＴ０１ａｃＺ　ＡＭｉ５　ｔｒａＤ３６）の中に保持した。

イン・ビトロで転写鋳型として使用するためのプラスミドは、できあがったＤＮ Ａ標品（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（４００μ＋）を等体積のフェノールで２回 、クロロホルムで１回、そして０２５モルのトリス−塩酸、ｐＨ７，５中でメタ ノール沈殿する点を除いて、そのメーカーが記載しているキアゲン（Ｑｕｉｇｅ ｎ）〔キアゲン・インコーポレーション（Ｑｕｉｇｅｎ　Ｉｎｃ、　、　）　、 キャッツワース、カリフォルニア〕マツクシ−カラム（ｍａｘ　１−ｃｏ　ｌ　 ｕｍｎ標品によって精製する。ランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）　Ｔ　７転写により５ ４８または５２７ｎｔの全長ＲＮ　、’ｌｌを生成するであろう鋳型を作るため に、プラスミドをそれぞれ旦ｃｏＲＩまたは旦ａｍＨ■によって開裂して線状化 した。（Ｔ７プロモーターの配列はポリクローニングのすぐ上方に位置しており 、β−ガラクトシダーゼのコード化した配列内にある）。

実施例４　シグナルＲＮＡ類 短シグナルＲＮＡ５　（１１−２６ｎｔ）をホスホラミダイト・ケミストリーを 用いてアプライド・バイオンステムズ・３８０　Ｂ　−ＤＮＡ・シンセザイザー 上で化学的に合成した。使用に先立って、シグナルＲＮＡ５はＣ１０ニス・イー ・ピー・バック（ＳＥＰ−ＰＡＣ）（登録商標）カートリッジ〔ミリボア・コー ポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて脱塩 し、ゲル−精製し、２６０ｎｍの光の吸収により定量した。シグナルＲＮＡ５は １ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，５）中に一２０℃で保管 した。ｐＴＥＴ１４１９とｐＴＥＴ２１−２４　（図３参照）からのプレカーサ ーＲＮＡに特有のシグナルＲＮＡの配列は次の通りである： ｐＴＥＴ１４１９　４Ｓ　３’　ＧＣＣＧ甲ｙ耳５゛４Ｓ３３’　ＧＣＣＧＣＵ Ｃ１ｌＣ＾ＧＵＧＡＵ　５’ｐＴＥＴ２１−２４８Ｓ４３’　ＣＧＣＣＣＡＵＵ Ｕ＾＾＾ＵＣＵＣＵＣＡＧＵＧＡＵ＾５゛１２Ｓ３°ＣＧＧ＾＾＾ＣＧＣＣＣＡ ＵＵＵ＾＾＾ＵＣＵＣＵＣＡＧ　５゜これらのシグナルＲＮＡ５は与えられた構 造中のＰ（−１）幹の５°側を形成する上方エキラン配列に対して相補的である 。アンダーラインを付したヌクレオチドは、幹Ｐ（−１）に含まれる５°工キラ ン配列と塩基対を形成するであろうシグナル配列の部分に相当し、残りのヌクレ オチドは幹の塩基のところのヌクレオチドとあるいはループの中かどちらかで塩 基対を形成する。例えば、シグナルＲＮＡ４Ｓ３は、ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡ中 の幹の塩基に付いた４　ｎｔ　５°、即ち幹Ｐ（−１）の５°側に含まれるすべ てのヌクレオチドおよびループ中の３つのヌクレオチドと塩基対を形成する。

ｐＴＥＴ１４ＲＮＡでは（図３参照）、５−スプライス部位に対して−１４のと ころにあるＵがＣに変化することにより、エキストラＣ−Ｇ塩基対を形成して幹 Ｐ（−１）を長くすることができる。この特定の配列変化はウッドラン（Ｗｏ。

ｄｓｏｎ）およびチェツバ（Ｃｅｃｈ）［ウッドフンおよびチェツバ著、バイオ ケミストリー、第３０巻、笥２０４２頁、１９９１年］により報告されており短 プレカーサーＲＮＡの自己スプライシング活性を減する。ｐＴＥＴ１４１９ＲＮ Ａは、Ｐ（−１）が安定性の低いＧ−Ｕ塩基対の代わりにＡ−Ｕ塩基対を作り出 すことによってより安定な幹を形成することができる更なるヌクレオチド変化（ −１９のところでの６からＡへの変化）を行う。最終的に、ｐＴＥＴ２１−２４ ＲＮＡは、４個所の更なるヌクレオチド変化（スプライス部位に対して−２１か ら−２４の部位）によって生成した非常に安定な幹Ｐ（−１）を有する。最も最 近の文献値〔フライアー他（Ｆｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）著、プロン−ディ ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・オブ・ユナイテド・ス テーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＩ ｓ＾）、第８３巻、第９３７３頁、１９８６年二ジェガー他（Ｊａｅｇｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　）著、プロノーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・サ イエンス・オブ・ユナイテド・ステーブ・オブ・アメリカ、第８６巻、第７７０ ６頁、１９８９年〕に基づいて計算したこれらの構造に対する３７℃での自由エ ネルギーも図３に記載しである。これらの構成体のすべてに於いて、ヌクレオチ ドの変化は、ＩＶＳまたは５°エキソンの３°末端の１３ｎｔは変えることなく 、５゛エキソンの上方においてのみ行われる。

ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩによって線状化された鋳型上で、Ｔ７プロモーター から全長転写することによってそれぞれ５４８および５２７の転写物が得られる 。これらはその３°エキソン（９２対７１ｎｔ）の長さだけが異なっているが、 等伍長さの５°エキソン（４３ｎｔ）とＩＶＳ　（４１３ｎｔ）を有している。

ＩＶＳの切り放しくｅｘｃｉｓｉｏｎ）による５′エキソンへの３°エキソンの 正確得た。結合エキフンの発生は、特別のＩＶＳ含有構成体によって維持された 自己スプライソングのレベルの指檀となる。

実施例５：Ｐ（−１）の安定性の増加による低下した自己スプライシングイン・ ビトロでの転写を次のように行った。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応 を５００μＭの各ＮＴＰと約１０μＣ４［α３２Ｐ］　ＣＰＴとを含む転写緩衝 液（４０ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ７，５，５ｍＭのＭｇＣ］、、１０ｍＭのジチ オスレイトート（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、４ｍＭスパーミジン（ｓｐ ｅｒｍｉｄｉｎｅ））中で行った。それぞれの反応（全容積１０μｌ）には０． １Ｍｇの線状化プラスミド鋳型と２Ｏ−３ＯＵ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含 めた。３０℃で３０分後に、各サンプルの２μｌを取り出し、キンレンンアノー ルＦＦとブロムフェノールブルー（フォルムアミド／染料混合物）を含む２μｍ の緩衝したフォルムアミドと混合した。残りのサンプルは３７℃まで加熱し、ス プライシングをよりよく維持するために反応条件を調整すべくこれにＩＭのＮａ Ｃ］、２０ｍＭのＭｇＣ＋２．１ｍＭのＧＴＰの２μｍを加えた。ノートされて いるように１５分または６０分後に、サンプルの２．５μＩを取り出し、フォル ムアミド／染料混合物の２．５μｍと混合した。サンプルは０．４Ｘ　ＴＢＥ　 （ＴＨＥは８９ｍＭのトリス、８９ｍＭの硼酸、０．０２５ｍＭのＥＤＴＡ）中 の４％のアクリルアミド　ビスアクリルアミド（１９：１）および７Ｍ尿素を含 む変成ゲル上で分析した。ランニング緩衝液として０．４Ｘ　ＴＢＥを用いて３ ０−６０ワツトで電気泳動を行った。ゲルはコダックＸＯＭＡＴ　ＸＡＲ−５フ イルムに露光した。

ｓｘｐでラベルしたプレカーサーＲＮＡ５をゲルにより精製するために、転写反 応を２．５−１０倍にスケールアップし、３７℃で１−２時間培養した。いくつ かのケースでは、転写反応中の自己スプライシングを減らし、それにより全長転 写の回収率を最大にするための試みとして、それぞれのＮＴＰの濃度を２．５− ３ｍＭに増加した。反応完了物に等容積のフォルムアミド／染料を加え、全反応 物を上記と同じ変成ゲルにかけた。オートラジオグラフィーにより可視化したの ち、全長転写物を含むゲルの領域を切り放し、０．５Ｍの酢酸アンモニウムと１ ｍＭのＥＤＴＡの０．５−１ｍ１中に入れた。４℃で１２−１６時間後溶離液を 除き、２．５倍容積のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させた。得られたＲＮＡ を１ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，５）中に再度懸濁し、 −２０℃で保管した。

鋳型として親のプラスミドと修飾した構成体を用いて、［α”Ｐ］　ＣＴＰの存 在で転写を行い、その自己スプライス能が解析できるような３２ｐをラベルした 転写物を生成した（図４．０分）。いずれの鋳型についても全長転写物（Ｆ　Ｌ ）、少量のＩＶＳ　ＲＮＡ　（ＩＶＳ　）、それにＲＮＡ　ｒ中間」生成物（＊ ）が存在し転写物（１３５ｎｔ）からの結合エキフン（ＬＥ）である少量の適度 の長さのＲＮＡ生成物も可視化することができて、これらの転写条件下で限られ た量のスプライスを起こすことができた。この弱いバンドはｐＴＥＴＢＬＵ＞ｐ ＴＥＴ１４＞ｐＴＥＴ１４１９の順に強度が減少しており、ｐＴＥＴ２１−２４ の場合は可視化することができなかった。

得られたＲＮＡ生成物の解析から、親プラスミドｐＴＥＴＢＬＵの転写により充 分に自己スプライシングすることのできる転写物が生成できることが明らかであ る。これはスプライシングを維持するにより良い条件に調節した後１５分と６０ 分のところで結合したエキフンの量が増加していることにより証明される。

生成した結合エキフンの量を比較することにより、ｐＴＥＴ１４およびｐＴＥＴ １４１９からの転写物は、親ｐＴＥＴＢＬＵからの転写物よりは効率は落ちるけ れども、自己スプライシング能を有していたことが明らかである。スプライシン グ条件に移したときｐＴＥＴ１４とｐＴＥＴ１４１９はいずれもｐＴＥＴＢＬＵ はど結合エキフンを生成せず、このふたつの変異体のうち、ｐＴＥＴ１４１９の 効率がもっとも低かった。しかし、同じ条件下でｐＴＥＴ２１−２４からの転写 物は自己転写しそうにはなかった。条件をスプライシングを維持するように変え たのちは、どの結合エキフンもｐＴＥＴ２１−２４プレカーサーに対して可視化 できなかった。これらの３つの変異体構成物について観察されたそれらの自己ス プライス能の相対値は、幹Ｐ（−１）安定性が増加すると期待される順序に従う 、即ち幹Ｐ（−１）の強度とＲＮＡの自己スプライス能との間には負の相関があ る。

更に、ｐＴＥＴ２１−２４中に高度の安定化したＰ（−１）が存在するとイン・ ビトロでのスプライシングが検出できないレベルに低下する。

スプライシング条件下で、結合エキフンに加えて多くのＲＮＡ生成物を可視化し た。期待したように、ｐＴＥＴＢＬＵ転写物のスプライシングにより種々の形の （環状および直線状のＩＶＳおよび５°の１５または１９ｎｔの欠けた短い形） 切り放されたＩＶＳ　ＲＮＡが相当量生成した。これらの生成物のいくつかは、 結合エキフンが可視化できないｐＴＥＴ２１−２４に対してさえ、同様に変異体 転写物に対して可視化できた。これらのＩＶＳ生成物の存在はこれらの変異体Ｒ ＮＡ５の能力を反映しているのかもしれず、これらの変異体ＲＮＡ５は、通常よ りも強い幹Ｐ（−１）により５′スプライス部位のところで種々の程度に誤って 組み合わされ（ｓｉｓｆｏｌｄｅｄ）、なおもその３′スプライト部位で加水分 解を維持する〔ウソドフン（ｆｏｏｄｓｏｎ）およびチェツバ（Ｃｅｃｈ）著、 バイオケミストリー、第３０巻、゛第２０４２頁、１９９１年参照〕。放出され た３°エキソンは可視化できないが、変異体ＲＮＡレーン（ｌａｎｅ）　（図４ 中でアステリスクで示しである）中で著しく強化されたひとつのＲＮＡ生成物は ５°エキソン−ＩＶＳ　ＲＮＡを代表するには適当な大きさであった。この５′ エキソン−ＩＶＳ　ＲＮＡは、ゲル上で見られる線状ＩＶＳ生成物（Ｌ−１５お よびＬ−１９）を生成して、なお環化反応を引き起こすことが期待されよう。矢 印の頭で示した短鎖ＲＮＡは同定されていない。このＲＮＡはスプライシング条 件に変換した後強度が増加した。これはまたプレカーサーＲＮＡの自己スプライ ス能が減少するにつれて豊富に増加するように見え、このようにｐＴＥＴ２１− ２４ＲＮＡレーン中で最も顕著であった。

ｐＴＥＴ２１−２４レーン中には結合したエキフンが欠乏していることから、こ の変異体はふたつのエキフン生成物を正確に結合できないことが明らかである。

正確なスプライシング反応を起こすことができない場合、変異体ＩＶＳ含有ＲＮ Ａ５（例えば、アステリスクの印を付けたＲＮＡ生成物の形成）の見かけの副反 応を都合よく用いることができるかもしれない。例えば、メツセージの速やかな 移動（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）により、適当なシグナルがない場合であればある毒素 が生成される可能性を更にす（なくするであろう毒素をコード化しているＩＶＳ 含有ｍＲＮＡ５にとってこの「自己崩壊」は好ましいものであるかもしれない。

実施例６　シグナルＲＮＡによるスプライシング反応の活性化５゛の上方のエキ フン配列に相補的な短ＲＮＡ５がＰ（−１）構造を崩壊し、それにより活性Ｐ（ −１）構造が形成されるようになる可能性を試験するために、ソグナルＲＮＡ５ が存在しないまたは存在するケースで、ゲル精製した全長ＲＮＡプレカーサーを スプライシング条件にかけた。

ゲル精製したプレカーサーＲＮＡ５を用いるスプライシング反応を、モルで０か ら１０００倍の過剰のシグナルＲＮＡ５の存在で、３２ｐでラベルした転写１０ μｌスプライノングバｙ７ｙ　（２００ｍＭのＮａＣ］、２０（ｂｚＭのＧＴＰ 。

３０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７，５）の０．１−０．２５ピコモルを培養して 行った。３７℃に加熱後、スプライシング反応を開始するためにＭｇＣ］□を５ ｍ１Ｍまで加えた。培養時間は３７℃で１０分から１２０分とし、その各時間に サンプルを取り出し、等容積のホルムアミド／染料を加えた。サンプル類は上記 のように変成ゲル上で解析した。

自己スプライシングが再活性化すれば、これらのシグナルＲＮＡ５が存在しない 場合よりも存在する場合の方がより多くの結合したエキフン生成物が生成される ことが期待できるであろう。スプライシング反応の再活性化を証明する実験結果 を図５のｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡおよび図６のｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡについ て示しである。

先に図５で見たように、全くノブナルＲＮ’Ａが存在しないスプライソング条件 下でのｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡの培養により少量の結合したエキフン生成物が生 成した。ゲル転写物についても同様であった（図５）。ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡ 中の幹Ｐ（−１）は安定でなくてＰ（−１）の形成を完全には妨害できないかも しれないので、その場合はなお少量のスプライシングが起こる。しかし、二つの 特定のシグナルＲＮＡ５のどちらかが培養中に存在する場合は結合エキフンの生 成量は増加した。シグナル−転写物比が非常に低い（０，１：　１）場合でさえ 、結合エキソン量のわずかな増加が見られた。シグナル−転写物比が増加した場 合（１０００・１まで）に、結合エキフンの生成もまた増加した。これらの実験 は、ｐＴＥＴ１４１９ＲＮＡが正確に自己スプライスする能力および結合エキフ ンを作る能力は直接特定のシグナルＲＮＡの存在に対応することおよび相当なレ ベルの自己スプライシングが回復することを示した。

／グチルＲＮＡ５に対する同様の応答はゲル精製したｐＴＥＴ２１−２４ＲＮて の中に存在する終止コードが遺伝子の下方部分への翻訳を許さないであろう。

Ａに関しても見られた。先に注目したように、ｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡに関し ては、転写物のみが培養されたときは結合エキフンは見えなかった（やはり図４ 参照）。このことはｐＴＥＴ２１−２４ＲＮＡ中の幹Ｐ（−１）が十分安定でＰ （−１）の形成を完全に妨害することを示している。しかしながら、この転写物 に対する特定のふたつのノブナルＲＮＡ５　（８Ｓ４または１２Ｓ）のどちらか を添加した際には結合エキフンが生成した。ｓｘｐラベルしたＲＮＡの生成物が 結合したエキフンであるということはその長さをｐＴＥＴＢＬＵＲＮＡから生成 した結合エキフンの長さと比較すればわかる。ＥｃｏＲＩを消化した鋳型から生 成した転写物をスプライスすることにより長さ１３５ｎｔの結合エキフンが生成 した。旦ａｍＡＨによって直線化した鋳型からの転写物によってそれに相当して より短い（１１４ｎｔ）結合エキフンが生成した。このように、ｐＴＥＴ２１− ２４ＲＮＡそれ自身の中ではスプライシング反応が完全に「オフ」となった場合 でさえ、特定のノブナルＲＮＡによるスプライシング反応を再活性化することは なお可能多量の生成物ができ（点線で示しである）、これもまたシグナルＲＮＡ ５の存在に応答するように見えた。このＲＮＡは正確に結合したエキフンよりも 短く、今の所その由来は明らかでない。それに代わる部位でのスプライシングま たは特定のＲＮＡの切断の可能性がある。

実施例７・コロニーカラーアッセイ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトサイド（Ｘ−ガむ ＬＢまたはＢ寒天プレート上で成長させた場合、ｐＴＥＴＢＬＵ含有コロニーは β−ガラクトンダーゼを生産するコロニーに対して期待される通りのダークブル ーである。ｐＴＥＴＢＬＵ上のβ−ガラクトンダーゼのα−相補性断片のコード 化領域はテトラヒメナＩＶＳによって切断されるから、このＲＮＡは、活性なα 断片を生成するためには正確に自己スプライシングしていなければならない。

もし自己スプライシングが生起していなければ、■ｖＳ中の３つの読み枠のすべ 比較のため、ｐＴＥＴＢＬＵからのイントロン含有旦±ｎｄｌ１１断片を逆配向 中のｐＴＺ１９Ｒ中へ挿入したコントロールプラスミド（ｐＴＥＴＢＬＵ）を構 成した。このコントロールに対しては、不適性な配向のためにスプライシングが 起こり得なかった所ではどこも得られたコロニーが白色であった。

理論的には、スプライシングに於いて欠陥を有する変異体を含む細胞はより明る い色のコロニーを生成するはずであり、一方非スプライシング性の変異体のコロ ニーは白色であろう。標準成長条件下では、ｐＴＥＴ１４１９およびｐＴＥＴ２ １−２４を含む細胞は、親のプラスミドｐＴＥＴＢＬＵを含む細胞よりも色がか なり明るいコロニーとして成長したが、白色ではなかった。このことは、最も強 い非スプライシング性変異体であるｐＴＥＴ２１−２４　（イン・ビトロで結合 エキフンを形成する能力がないことから判断して）でさえなお、コロニーをブル ー色にすることのできるであろうβ−ガラクトンターゼのα断片のレベルの翻訳 を維持するに必要な最小量のスプライスされたメツセージを作ることができる。

他の科学者たちは、翻訳能のない枠中にβ−ガラクトシターゼのメツセージを残 すはずであるＩＶＳ含有構成体によるβ−ガラクトシターゼ活性（ブルーのコロ ニー色）に注目してきている〔ビーン（Ｂｅｅｎ）およびチェツバ（Ｃｅｃｈ） ！、セル、第４７巻、第２０７頁、１９８６年、プライス（Ｐｒｉｃｅ）および チＬ’ｌｌ’著、サイエンス、第２２８巻、第７１９頁、１９８５年〕。それに 変わりうるスプライス部位が存在するのかもしれない。

より定量的な評価のために、培養中で成長しているプラスミド含有細胞について β−ガラクトノターゼアッセイを実施した〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）著、エタス ペリメンツーイン・モレキュラー・ゲネティノクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　 ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリングＨハーバ −・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９７２年）〕。〕β βタガクトンターによる開裂後の生成物は分光光度計により測定できるため、こ のアンセイ用にタロモーゲン基質としてＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト ／ド（ＯＮＰＧ）を用いた。その中でｐＴＥＴＵＬＢからのイン自発的破壊のバ ックグランドレベルを決定するために用いるコントロールプラスミド（ｐＴＥＴ ＵＬＢ）を構成した。これらの実験では、親のプラスミドまたはスプライシング 変異体のどちらかを含む細胞を誘導条件下で成長させた（すなわち、ＩＰＴＧの 存在下では、ラクトース同族体）。ｐＴＥＴ１４１９およびｐＴＥＴ２１−２４ スプライシング変異体を含む細胞中でのβ−ガラクトンターゼの製造は親の数値 の数％に低下した。したがってＲＮＡ中の変化はイン・ビトロでの自己スプライ シングの量の減少によるだけでなく、それに付随したイー・コリ細胞中で生成さ れる活性蛋白質の量の減少によっても反映されることを示した。

黒塗 本発明の応答性ＲＮＡ分子は与えられたウィルスの存在に応答する植物細胞を製 造するのに有用である。このような細胞のウィルス感染を予防するための方法は 多くの例で見当たらない。本発明の分子は、どのような与えられたウィルスにも 抵抗性がある植物系統を創造することができ、それにより感染を受けた植物細胞 は、ウィルスが他の細胞に広がる前に破壊されてしまう。

この欄は応答性ＲＮＡが特定の細胞タイプの生理的状態または生存性に影響を与 えるために用いることができる方法を記載している。蛋白質コード化領域内の塩 基対合領域の形成によって調節される応答性ＲＮＡ分子の場合には、本方法は応 答性ＲＮＡの構成が、細胞の生理または生存性に影響を与える蛋白質をコード化 するものであること：および細胞タイプに特定的であるシグナルＲＮＡ、即ち影 響を受けるべき細胞タイプのＲＮＡ集団中に存在しまたは許容し得るヌクレオチ ド配列をもつＲＮＡ分子、の同定とが必要とされる。自己スプライシングイント ロンによって調節される応答性ＲＮＡ分子のためには、本方法は細胞の生理また は生存性に影響を与えるであろう蛋白質をコード化している応答性ＲＮＡの構造 を必要とする。活性蛋白質はスプライスされたメツセージから翻訳されねばなら ず、スプライスされていないメツセージからではない。またこれは細胞タイプに 特定のノブナルＲＮＡ、即ち影響を受けるべき細胞タイプのＲＮＡ集団中に存在 するかまたは許容し得るヌクレオチド配列をもつＲＮＡ分子の同定を必要とす例 えば、応答性ＲＮＡは、次のものを特定的に殺すように設計することができる： ウイルスＲＮＡを含み未感染細胞を含まないウィルス感染植物感染細胞：変異体 細胞を含む細胞であって、野生タイプのＲＮＡを含む細胞ではない；植物中の特 定組織の細胞であって他の種類の細胞ではない。

このような応答性ＲＮＡが細胞の生理状態を変える効率は、細胞中のシグナル核 酸が存在する位置へ送られてくる応答性ＲＮＡに依存するであろう：応答性ＲＮ Ａはスプライシング、ポリーＡ付加、キャップ形成、核層を通っての輸送、およ び翻訳開始を含むコード化蛋白質の生成に導くすべてのプロセスに必要なヌクレ オシド配列をすべて有する；そして応答性ＲＮＡはまた核および細胞質中のＲＮ Ａに安定性を与える配列要素を有してもよい。

応答性ＲＮＡ分子は、ＲＮＡの形またはＤＮＡまたはＲＮＡから作られた遺伝子 の形で細胞中に送り込まれる。細胞中へのＲＮＡの送り込みにはニードル・イン ノエクンヨン法、エレクトロボレージョン法、ポリエチレングリコール沈殿法を 用いることもできるし、またはカチオン脂質から作られたリポソームを含むリポ ソーム類を使用することも可能である。遺伝子の形での応答性ＲＮＡの送り込み には非毒性のウィルスまたはバクテリアを使用しても良い。これには転写性また は複製可能なノブナル要素と共に応答性ＲＮＡをコード化した遺伝子をウィルス のゲノムに挿入することが必要である。送り込むことのできるレトロウィルス類 、ポリオーマウィルス類およびワクンニアウイルス類は工業技術化されてきてお り、発現遺伝子、および他のウィルス類はこの目的のために開発され、使用する ことができる。

応答性ＲＮＡを生物体または特定の細胞タイプの生理を制御するために使用する 他の一般的方法としては任意の植物形質転換技術、例えばアグロバクテリウム・ ツミファ７エンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）に よって細胞ゲノムへ積分された応答性ＲＮＡ遺伝子が含まれる。応答性ＲＮＡの スプライシングの活性化は外因的に加えられたポリヌクレオチドによって引き起 こすこともできる。

他の実施態様も次の請求の範囲の内である。

Ｅσ〈 −＜ ＦＩＧ　５゜ 亀、、＋−−ｊ＋ｊ−ｍ　−一へ　−−一　・−−Ｃ−ＩＶＳ　、　−−−−ｄ 　−

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．リボザイム認識配列、調節ドメイン、基質領域を有し、および−またはそれ 以上の蛋白質コード領域においてポリペプチドをコード化しており；この調節ド メインがインヒビター領域を含み、かつこの基質領域に対して相補的であり；こ のインヒビターと基質領域がシグナル核酸の不存在下に塩基対ドメインを形成す ることができ；この塩基対ドメインがこの塩基対ドメインの不存在下に観察され るレベルに比較して翻訳のレベルを減少させ；このシグナル核酸は、これがイン ヒビター領域と塩基対を形成するときはシグナル核酸の不存在下に観察される応 答性ＲＮＡの翻訳のレベルに比較して応答性ＲＮＡの翻訳レベルを増加するイン ヒビター領域に相補的である抗インヒビター領域を有し；このシグナル核酸が植 物細胞感染有機体の核酸の部分を含む、応答性ＲＮＡ分子。
2. ２．この蛋白質コード領域がエキソンである請求項１の応答性ＲＮＡ。
3. ３．この基質領域が一つの蛋白質コード領域部分を含む請求項１記載の応答性Ｒ ＮＡ。
4. ４．この基質領域がイントロン部分を含む請求項２記載の応答性ＲＮＡ。
5. ５．この基質領域がこのエキソンの５′−エンドに隣接するイントロン部分を含 む請求項２の応答性ＲＮＡ。
6. ６．基質領域がリボザイム認識配列部分である請求項１記載の応答性ＲＮＡ。
7. ７．リボザイム認識配列がリボザイム結合部位である請求項６記載のの応答性Ｒ ＮＡ。
8. ８．応答性ＲＮＡが精製されている請求項１記載の応答性ＲＮＡ。
9. ９．ポリペプチドが細胞生存率、細胞増殖、ＤＮＡの転写、ＲＮＡの翻訳または ＤＮＡの複製を修飾している請求項１の応答性ＲＮＡ。
10. １０．ポリペプチドが細胞障害活性またはりボヌクレアーゼ活性を有する請求項 ９記載の応答性ＲＮＡ。
11. １１．ポリペプチドがジフテリア毒素の活性サブユニット、コレラ毒素の活性サ ブユニット、リシン、およびイー・コリのｈｏｋ，ｇｅｆ．ＲｅｌＦ．またはｆ ｌｍ遺伝子産物からなる群から選ばれる請求項１０記載の応答性ＲＮＡ。
12. １２．このイントロンがその１またはそれ以上のエキソンの完全な翻訳を妨げる 請求項１４記載の応答性ＲＮＡ。
13. １３．このイントロンがこのイントロンの不存在下にこのエキソンの翻訳のレベ ルに比較して１またはそれ以上の翻訳のレベルを減少させる請求項４記載の応答 性ＲＮＡ。
14. １４．このイントロンがリボザイム認識領域とタンパク質コード領域との間にあ る請求項４記載の応答性ＲＮＡ。
15. １５．この最初のイントロンがこの２つのエキソンの間にある請求項４記載の応 答性ＲＮＡ。
16. １６．このイントロンが５′−スプライス部位によりその５′−エンドに、およ び３′−スプライス部位によりその３′−エンド臨接している請求項４記載の応 答性ＲＮＡ。
17. １７．基質領域がこのイントロンと臨接する５′−スプライス部位を含んでいる 請求項１５記載の応答性ＲＮＡ。
18. １８．このイントロンが２つのＲＮＡ開裂反応を、１つは５′−スプライス部位 内で、他の１つは３′−スプライス部位内で触媒する請求項１６記載のＲＮＡ。
19. １９．この基質領域がこのイントロンの５′−スプライス部位を含む請求項１８ 記載の応答性ＲＮＡ。
20. ２０．このインヒビター領域が５′−スプライス部位内での開裂反応の発生レベ ルを減少させている請求項１９記載の応答性ＲＮＡ。
21. ２１．シグナル核酸が単一−ストランド化されている請求項１記載の応答性ＲＮ Ａ。
22. ２２．シグナル核酸がウイルスＲＮＡである請求項１０記載の応答性ＲＮＡ。
23. ２３．請求項１の応答性ＲＮＡをコード化したＤＮＡ分子。
24. ２４．応答性ＲＮＡが天然の５′−スプライス部位に対比して修飾された少なく とも一種の塩基を有するテトラヒメナ・サーモフィラの５′−スプライス部位Ｒ ＮＡを含む請求項１９記載の応答性ＲＮＡ。
25. ２５．この応答性ＲＮＡが、リボザイム認識配列、調節ドメイン、基質領域を有 し、および１またはそれ以上のエキソンにおいてポリペプチドをコード化し；こ の調節ドメインがこの基質領域に対して相補的であるインヒビター領域を含み； このインヒビターと基質領域がシグナル核酸の不存在下に塩基対ドメインを形成 することができ；この塩基対ドメインがこの塩基対ドメインの不存在下での翻訳 のレベルに比較してこの応答性ＲＮＡ分子の翻訳のレベルを減少させ；このシグ ナル核酸はこれがインヒビター領域と塩基対を形成するときはシグナル核酸の不 存在下に槻察される応答性ＲＮＡの翻訳のレベルに比較してこの応答性ＲＮＡの 翻訳レベルを増加するインヒビター領域に相補的である抗インヒビター領域を含 み；このシグナル核酸が植物細胞感染有機体の核酸部分を含む事を特徴とする応 答性ＲＮＡを細胞中に導入することによりシグナル核酸を宿す植物細胞の成育を 特異的に干渉する方法。
26. ２６．トランスジェニック植物中に発現される請求項１の応答性ＲＮＡ。
27. ２７．請求項１の応答性ＲＮＡを含む植物。